JPH10507771A

JPH10507771A - Ｌ−エリトロシルヌクレオシド

Info

Publication number: JPH10507771A
Application number: JP8514685A
Authority: JP
Inventors: エルウェイス，アレクサンダー; ティーグッドヒュー，チャールズ; ベイコス，タマス
Original assignee: ジェネンコアインターナショナルインコーポレーテッド; リピテックインコーポレーテッド
Priority date: 1994-10-24
Filing date: 1995-10-24
Publication date: 1998-07-28
Also published as: EP0788495A2; WO1996013498A2; US5672594A; MX9702926A; WO1996013498A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、αおよびβ−Ｌ−エリトロシルヌクレオシド、その調製方法、それを含有する製剤組成物およびそれを使用して哺乳動物内の様々な病気を治療する方法に関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】Ｌ−エリトロシルヌクレオシ発明の属する技術分野本発明は、Ｌ−エリトロシルヌクレオシド、その製造方法、それを含有する製剤組成物、および抗癌薬、抗ウイルス薬、抗真菌薬、駆虫薬および／または抗菌性物質のような化合物を哺乳動物に使用する方法に関するものである。従来の技術 Periguad，c.，等の「Nucleosides and Nucleotides，11(2-4),903-945,(1992)」には、化学療法薬（抗癌薬、抗ウイルス薬および抗真菌薬を含む）としてのヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドの使用に関する従来技術の有用な大要が記載されている。この文献に記載されているように、「ヌクレオシド」という用語は、塩基により区別される自然に生じるヌクレオシドに関する。例えば、アデニンおよびグアニン（それぞれ、ＡおよびＧ）はプリン塩基を有し、一方、シトシン、ウラシル、チミンおよびヒポキサンチン（それぞれ、Ｃ、Ｕ、ＴおよびＨ）はピリミジン塩基を有している。 Genu-Dellac,C.,等の「Nucleotides & Nucleosides，10(6),1345-1376,(1991)」には、自然に生じるヌクレオシドの２′−デオキシ−α−Ｌ−エリトロ−ペントフラノシルアナログおよびその抗ウイルス性化合物としての使用が記載されている。ナガサワ，N.等の「J．Org．Chem.,32,251-252,(1967)」には、あるＤ−リボピラノシルヌクレオシド（特に、９−（２′−デオキシ−β−Ｄ−リボピラノシル）アデノシン）の製造が記載されている。Fucik，V.,等の「Nucleic Acid Res earch,Vol.1,No.4,(1974),639-644」には、あるリボピラノシルヌクレオシドを含む一連の修飾誘導体を用いた、枯草菌内のシチジン輸送系に対するプリンヌクレオシドの親和性への化学修飾の構造効果が記載されている。よく知られているように、自然の核酸中に発見される糖は、ほとんど全ての場合において、Ｄ−リボースおよびＤ−デオキシリボースである。リボヌクレオチドおよびリボヌクレオシドのＤ−異性体の化学的および生物学的活性を調査する研究がかなり行なわれているが、Ｌ−異性体に関する研究はほとんど行なわれていない。これは主に、微生物および酵素を用いたヌクレオシドのＤＬ−異性体の光学分割をしばしば伴なう、Ｌ−異性体の合成が非常に困難であるという事実によるものである（概して、アサイ,M.,等の「Chem Pharm．Bull.,15(12),1863-18 70,(1967)を参照のこと）。Ｄ−ヌクレオシド化合物の既知の活性、およびいくつかのＤ−糖−ヌクレオシド化合物の成功した商業化（商業的に受け入れられたＤ−ヌクレオシドアナログについて検討した前出のPerigaud，C.等の文献を参照のこと）の一部が、あるヌクレオシドアナログのＬ−異性体に関する現在の研究に至った。おそらく、最もよく知られた市販の核塩基（nucleobase）アナログは、以下に構造を示した５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）である：５−ＦＵは、ロシュから市販されている抗代謝剤であり、ある種の癌を治療するために最も一般的に用いられる薬物のうちの１つである。この薬物の高い許容性は、一部はその極度の細胞障害効果によるものである。しかしながら、この高度に毒性のある化合物は、安全性が低く、例えば、吐き気、嘔吐、下痢、白血球減少、血小板減少、脱毛等を含む多くの副作用がある。さらに、５−ＦＵは主に、静脈製剤のみに用いられている。したがって、おそらく５−ＦＵと同じくらい細胞障害性であるか、またはそれほど細胞障害性ではないが５−ＦＵよりも特異的であり、かつ、好ましくは経口投与できるヌクレオシドアナログが必要とされている。５−ＦＵは現在、正常な細胞に与える損傷のために、短い間隔で投与されている。患者は、治療の細胞障害効果から回復する期間に亘り化学療法から外される。健康な細胞に対して細胞障害性の少ない薬物が開発されれば、もはや、定期的な間隔で患者を治療する必要はない。このことは、治療された癌細胞内にしばしば見られる多数の薬物抵抗性の発達に関連しているかもしれないと考えられる。特に、腫瘍が殺されたときに、薬物に対して最も抵抗性の強い細胞はより遅く死亡し、したがって、治療が停止されたときには（しばしば、正常な細胞に対する細胞障害性のために）、より抵抗性の強い腫瘍細胞が残されて増殖してしまう。市販の重要なヌクレオシドアナログは、ブラウスウェルカム(Burroughs Wellc ome)からレトロウィル(Retrovir)として市販されている、アジドチミジン（ＡＺＴ）である。下記の化学式：を有するβ−Ｄ−デオキシ−リボフラノシル誘導体であるＡＺＴは、特に後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に応答するウイルスに対する、抗ウイルス薬として有用である。５−ＦＵのようなこの化合物は、顆粒球減少および／または重症貧血のような血液内毒性を含む多数の望ましくない副作用と関連している。限定を意図するものではないが、Ｌ−ヌクレオシド（クレームされている）は傷ついた細胞（compromised cells）に対して選択的な透過性を有すると考えられるので、本発明においてクレームされているＬ−ヌクレオシド化合物は、５− ＦＵおよびＡＺＴのような化合物よりも有益かもしれない。傷付いた細胞は、癌細胞または感染が細菌性、真菌性、ウイルス性または寄生性である他の感染細胞を意味するものである。本発明のＬ−ヌクレオシドをこれらの傷付いた細胞中に移送するかまたはこの細胞に透過させてもよいが、正常な細胞においては、Ｌ− ヌクレオシドは透過しないと考えられる（例えば、Lin，T.S.,等のJ．Med．Chem .,37,(1994),p.798-803の「Synthesis and Biological Evaluation of 2',3'-Di deoxy-L-Pymidine Nucleosides as Potential Antiviral Agents Against HIV a nd HBV」の要約；およびSpadari,S.，等のJ．Med．Chem.,35,(1992),p.4214-422 0 を参照のこと）。したがって、傷付いた細胞に関してこれらのＬ−ヌクレオシドが選択的となる点で、正常な細胞に対して、５−ＦＵのような化合物よりもこれらのＬ−ヌクレオシドのほうが有害ではない。この選択的透過性の概念に加えて、治療化合物がしばしば細胞のＲＮＡに関連する抑制機構を有するウイルス性関連細胞において、そのようなウイルス性感染細胞の酵素が、正常な細胞におけるよりも特異的ではなく、したがって、ある酵素がＬ−ヌクレオシドにより細胞に透過できる場合には、より原始的な酵素（有機ホスホリラーゼ、キナーゼまたはチミジル酸シンターゼのような）も抑制を生じるような様式でこの化合物を認識するかもしれない。本発明は、抗癌薬、抗ウイルス薬、駆虫薬、抗真菌薬および／または抗菌性物質のような関心のある活性を有する新しい群のＬ−エリトロシルヌクレオシドに関するものである。これらの化合物は一般的に水溶性である。このことは、経口投与を行なってもよいことを示唆している。このことは、５−ＦＵおよび類似の抗癌薬に対して特に有利である。また、これらの化合物の活性は、正常な細胞に対するものと比較して、傷ついた細胞に関してより選択的であり、本発明の化合物には副作用がより少なくなることを示唆している。発明の詳細な説明本発明により、化学式(I)：を有するエリトロシルヌクレオシド化合物またはその製剤的に容認される塩であって、Ｂは自然に生じるヌクレオシド（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、ヒポキサンチンまたはＴ）またはＨ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキルＣ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルオキシ、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルチオ、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ、置換アミノ基、アリール、アラルキル、アリールオキシ、アラルコキシ、アリールチオ、アラルキルチオ、複素環およびアミノ基からなる群より選択される１つ以上の置換基からなる修飾核塩基であり、塩基がビリミジンである場合には、塩基の位置４での原子が硫黄であって差支えなく、塩基がプリンである場合には、塩基の位置６の原子が硫黄であってもよく；Ｒ₁およびＲ₂が独立してＨ、モノまたはジハロゲン、ＯＲ₅、またはＢであり（ここでＲ₅がＨ、ＣＯＲ₆、Ｐ（Ｏ）_nＲ₇Ｒ₈（ここでＲ₆が１−５の炭素原子の置換または末置換アルキルまたは置換または末置換芳香族環であり、Ｒ₇およびＲ₈が各々Ｈまたは１−５の炭素原子のアルキルでｎが２または３である））；Ｒ₃およびＲ₄が独立してＢ、ＨまたはＯＲ₉（ここでＲ₉はＨ、ＣＯＲ₁₀、Ｐ（Ｏ）ｍＲ₁₁Ｒ₁₂であり（ここでＲ₁₀が１−５の炭素原子の置換または未置換アルキルまたは置換または未置換芳香族環構造であり、Ｒ₁₁およびＲ₁₂が１−５の炭素原子のアルキルであり、ｍは２または３であり））、Ｒ₁−Ｒ₄のうちの１つのみがＢであり；Ｒ₄がＢであり、Ｂが５−フルオロウラシルである場合には、Ｒ₁ およびＲ₂が両者ともＨではなく；Ｒ₁およびＲ₂がＯＨであり、Ｒ₃がＨであり、Ｒ₄がＢである場合には、ＢはＡではなく；Ｒ₁およびＲ₂がＯＨであり、Ｒ₄がＨであり、Ｒ₃がＢである場合には、ＢはＡではない化合物を提供する。本発明の好ましい化合物の例としては、化学式(I)の化合物であって、Ｒ₃またはＲ₄のうち一方がＢであり、他方がＨであり、Ｒ₃がＢである場合には系列はαであり、Ｒ₄がＢである場合には系列はβであり；ＢがＣ、Ｔ、Ｕ、Ｇ、Ａ、ヒポキサンチン、および５−フルオロウラシルであり；Ｒ₁およびＲ₂の各々がＯＨである化合物が挙げられる。本発明の特に好ましい化合物の例としては： β−Ｌ−エリトロフラノシル−５−フルオロウラシル；β−Ｌ−エリトロフラノシルウラシル；β−Ｌ−エリトロフラノシルシストシン；β−Ｌ−エリトロフラノシルヒポキサンチン；β−Ｌ−エリトロフラノシルグアニン；α−Ｌ−エリトロフラノシル−５−フルオロウラシル；および３′−アジド−２′，３′−ジデオキシ−β−Ｌ−エリトロフラノシルチミン並びにその薬剤的に許容される塩が挙げられる。本発明はまた、化学式(I)の化合物、化学式(I)の化合物を含有する製剤組成物の調製方法；および哺乳動物の癌（特に固体腫瘍癌）の治療に化学式(I)の化合物を使用する方法、並びに哺乳動物に抗ウイルス薬、抗真菌薬、駆虫薬および／または抗菌性物質として化学式(I)の化合物を使用する方法を提供する。合成本発明は、様々な病気（癌を含む）を治療するのに有用な一連のＬ−エリトロヌクレオシドを記載する。本発明の化合物は、水溶性に基づく経口活性であってもよい。本発明の化学式Ｉのある化合物は、一般式Ａにより調製することができる。この式はクロロ−ベンゼンジオール（アセトニドとして保護される）から出発する化合物５の製造に特異的であるが、当業者には、本発明の範囲内の他の化合物も、Leroy B．Townsend およびR．Stuart Tipson，(1987)により編集されたNuclei c Acid Chemistry ，Improved and New Synthetic Procedures，Methods and Tec hniques ；およびニューヨークのプレナムプレスのLeroy B．Townsend，(1988-19 91)により編集されたChemistry of Nucleosides and Nucleotidesに記載された方法のような既知の方法を用いて同様の経路により調製してもよいことが容易に分かる。プリンヌクレオシド上で様々に置換を行なう適切な方法が国際特許出願ＷＯ90/08147号に記載されている。ピリミジンヌクレオシド上で置換を行なう適切な方法が国際特許出願ＷＯ88/04662号に記載されている。このような出願および文献の開示は、当業者にとって容易に入手でき、背景情報としてここに引用する。現在クレームされている化合物の糖部位内で置換を行なう適切な方法が当業者に知られており、米国特許第4,880,782 号；国際特許出願ＷＯ88/00050号；ヨーロッパ特許出願第199451A2号；米国特許第3,817,982 号；Lange，P.,等のProgress in Antimicrobial and Anticancer Chemotherapy，Proceedings of the 6th In ternational Congress of Chemotherapy，Univ．Park Press，England，1970，V ol.11,394-397 頁；および前出のTownsend等の文献を含む、様々な出版物に記載されている。実施例１ α−Ｌ−エリトロフラノシル−５−フルオロウラシル（５）工程Ａ（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−１−クロロシクロヘキサ− ４，６−ジエン１（22.2ｇ）のＭｅＯＨ−ＣＨ₂Ｃｌ₂（８：２）溶液を−78℃ まで冷却し、青色が持続するまでＯ₃／Ｏ₂の蒸気を通過させた。この溶液中にアルゴンを泡立たせて、過剰のオゾンを除去した。Ａｒ雰囲気の−78℃で、撹拌している溶液中にＮａＢＨ₄（4.39ｇ）を分割して加えた。添加後、１時間に亘り撹拌を続けた。温度を０℃まで上昇させ、この溶液をさらに１時間に亘り撹拌した。次いで、210 ｍｌの飽和塩化アンモニウムを加えた。溶剤を真空内で除去した。半固体の残留物をＥｔｏＡｃ（150 ｍｌ）中に溶解させて濾過した。この操作を２回繰り返した。蒸発後、複合有機抽出物である18.8ｇの黄色の液体が得られた。フラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル−酢酸エチル、50：50）による精製によって、薄黄色のオイルとして8.8 ｇの２を生成した（Ｒ_f＝0.34、ｐＥ−ＥｔｏＡｃ 50：50）。工程Ｂ室温で、２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｌ−エリトロース２（４ｇ）をピリジン（５ｍｌ）および無水酢酸（15ｍｌ）中に溶解させた。１時間後、ＴＬＣにより、３に完全に転化したことが分かった。ＣＨ₂Ｃｌ₂との反応混合物（100 ｍｌ）を飽和ＮａＨＣＯ₃溶液および水により連続して洗浄した。有機相をＮａ₂ＳＯ₄上で乾燥させ、乾燥状態まで蒸発させて、黄色のオイルとして３（5.05ｇ、9 8％）を得た（Ｒ_f＝0.63、ＰＥ−ＥｔｏＡｃ 50:50）。工程Ｃ３（2.5ｇ）および５−フルオロウラシル（1.6ｇ）のアセトニトリル溶液（50 ｍｌ）に、ヘキサメチルジシラザン（2.1 ｍｌ）、クロロトリメチルシラン（1. 3 ｍｌ）およびトリメチルシリルトリフレート（3.0 ｍｌ）を加えた。室温で60 時間に亘り撹拌した後、ＴＬＣにより、反応が完了したことが分かった。次いで、ＣＨ₂Ｃｌ₂（100 ｍｌ）を加えて、混合物を50ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ₃溶液で３回抽出した。有機相をＮａ₂ＳＯ₄上で乾燥させ、蒸発させて、2.2 ｇの粗物質を得た。この粗物質を精製して、0.88ｇの白色の結晶性生成物４を得た（Ｒ_f＝0 .17、ＰＥ−ＥｔｏＡｃ 50：50）。工程Ｄ１ＮのＨＣｌ溶液中で４を加水分解して、白色の結晶性物質として５（0.55ｇ）を得た。（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ 3.75(dd,1H,H-4'a)3,90(dd,1H,H-4'b) 4.15 & 4.30(m,2H,H-2' & 3") 5.40 & 5.55(br s,2H,2' & 3"-OH) 6.0(dd,1H,H-1') 11.80 (s,1H,NH)有用性あるヒト腫瘍細胞系に対する生体外活性細胞系：８つの異なる株化ヒト細胞系ＣＡＬＵ（肺）、ＣＯＬＯ３２０（結腸）Ｈ５７８Ｓｔ（乳房）、ＨＴ−２９（結腸）、ＭＣＦ−７（乳房）、ＯＭ−１（結腸）、ＳＫＬＵ（肺）およびＳＫＭＥＳ（肺）、並びに２種類の対照細胞系（骨髄および／または繊維芽細胞）を用いた。全ての細胞系は、テキサス州、サンアントニオの癌治療および研究センター、薬物開発研究所、腫瘍クローニング研究室（Cancer Therapy and Research Cent er，Institute for Drug Development，Tumor Cloning Laboratory）から得た。全ての細胞系は、熱不活化子ウシ血清を補給した適切な培地内で単層として成長した。全ての試薬は、ニューヨーク州、グランドアイランドのグランドアイランドバイオロジカル社から得た。化合物への腫瘍細胞の生体外露出：本発明の化合物（下記の表Ｉに示したような）のある静脈内（ｉｖ）製剤の株溶液、並びに５−ＦＵ（対照）の静脈内製剤を用いた。本発明の化合物のｉｖ製剤を無菌緩衝生理食塩水により調製し、試験に必要とされるまで、−70℃で貯蔵した。５−ＦＵ対照製剤を市販の製品文献に提示されているように調製した。トリプシナイゼーション（trypsinization）後に、腫瘍細胞を組織培地中に懸濁させ、３つの異なる濃度：10、１および0.1 μｇ／ｍｌで連続的に抗腫瘍物質にさらした。成長阻害の放射測定：２μＣｉ／ｍｌの最終濃度で¹⁴Ｃ−グルコースを含有するそれそれの成長培地内に抗腫瘍物質を加えた後、ＢＡＣＴＥＣシステム４６０（メアリーランド州、トウソン、ジョンストンラボラトリーズ）により成長阻害を評価した（一般的に、C．Arteaga，等のA Radiometric Method for Evaluatio n of Chemotherapy Sensitivity: Results of Screening a Panel of Human B reast Cancer Cell Lines ，Cancer Research，47,6248-6253,(1987)を参照のこと）。放射性グルコースを含有する腫瘍細胞懸濁液２ｍｌを自己密封性ラバー−アルミニウムキャップを通して注射することにより、無菌の使い捨て15ｍｌバイアル中に接種した。各々の細胞系に関して、この放射測定システムにおいて測定可能な著しい成長を示すために、バイアルごとに必要とされる腫瘍細胞の最適数を変更した。次いで、接種したバイアルを37℃で保温した。¹⁴Ｃ−グルコースの代謝により生じた¹⁴ＣＯ₂の放出測定を、ＢＡＣＴＥＣ装置内で６、９、12および15 日目に行なった。この装置は、¹⁴ＣＯ₂含有空気をバイアルから、ｄｐｍを成長指数値に変換するイオン化チャンバ中に流す。薬物処理バイアルの成長指数値を対照バイアル内で観察された成長指数値と比較することにより、化学療法感度を計算した。各々のデータ点は、三重値を示している。結果が下記の表Ｉに示されている。表Ｉに示されているデータを、対照としての５−ＦＵにより得られた結果と比較する。全ての化合物は、等しいミリモルを基準として供給した。阻害濃度（ＩＣ５０）は、50％の未処理癌細胞を殺すのに必要な濃度として定義されている。表Ｉに列記したある化合物のＩＣ５０は、５−ＦＵ（対照）に関するＩＣ５０よりも大きいかもしれないが、本発明の化合物は、骨髄または繊維芽細胞のような正常な細胞に対して一般的に毒性が弱い。このことは、クレームされた化合物がそれほど毒性ではなくおよび／または腫瘍細胞に関してより選択的であり、それによって、副作用がそれほど重大ではなくなるので、本発明の化合物が既知の癌治療よりも優れた利点を有することを意味する。さらに、正常な細胞に対する毒性が低いために、本発明の化合物をより高い比率で供給して、癌細胞に対する毒性を選択的に増大させてもよい。この点に関して、所定の化合物に関する治療比率は、以下の計算により典型的に求められる。生存する骨髄の％生存する腫瘍の％＜80％の治療比率が活性であると考えられている。生体内評価本発明の代表的な化合物を、臨床的有用性を示す抗癌活性の様々な前臨床試験で試験する。例えば、ある化合物は、ヌードマウスに異種移植されたヒト腫瘍、特にＢ１６、ＭＸ−１およびＰ３８８白血病腫瘍系に対して生体内で試験する。Ｂ１６黒色腫マウス内でＢ１６腫瘍を成長させているｓ．ｃ．から調製したＢ１６マウス黒色腫ブライのｉ．ｐ．接種物をＢ６Ｄ２Ｆ１マウスに接種する（０日目）。１日目に、腫瘍を接触したマウスを薬物またはビヒクル対照で処理する。薬物、薬物投与の経路およびスケジュールを問題の研究に適切に選択する。試薬に関する供与量情報が入手できない場合には、腫瘍を接種していないマウスにおいて、最初の供与量を求める実験で最大許容供与量（ＭＴＤ）を求める。典型的な実験において、薬物はそのＭＴＤおよび１／２のＭＴＤの供与量のｉ．ｐ．で１日の５回のスケジュールで与えられる。全ての群の平均生存時間を計算し、その結果を処理マウスの平均生存体／対照マウスの平均生存体（Ｔ／Ｃ）×100 として表す。150 のＴ／Ｃ値は、処理された群のマウスが対照群のマウスよりも50％長生きしたことを意味する。これはときには、寿命の増加、またはＩＬＳ値と称される。 60日に亘り生存したマウスは、Ｂ１６モデルにおいて、長期生存体、または治癒体と考えられる。ＮＣＩに長年に亘り使用されている、このモデルにおける活性に関する全般的に容認されたカットオフ（cut-off）はＴ／Ｃ＝125 である。長年に亘るＢ１６の従来の使用は、以下の活性レベルを設けている；Ｔ／Ｃ＝12 5 −150、弱い活性；Ｔ／Ｃ＝150 −200、適度の活性；Ｔ／Ｃ＝200 −300、高い活性；Ｔ／Ｃ＞300、長期間生存体の優れた治癒力のある活性。主にログランクｐ−値試験を用いて、データの統計をとる。Ｐ３８８白血病この試験は、Ｂ１６試験と同様の方法で正確に行なう。腫瘍ＤＢＡ／２マウスからＰ３８８細胞を含有する腹水流体を除去し、この細胞を遠心分離し、次いで生理食塩水中に白血病細胞を再懸濁させることにより、腫瘍接種物を調製する。０日目にマウスに10⁵のＰ３８８細胞をｉ．ｐ．で接種する。ＭＸ−１ヒト乳房腫傷異種移植ヌードマウス宿主内のＭＸ−１腫瘍を成長させている脾臓細胞から採取したＭＸ−１哺乳動物癌腫の断片をトロカールによりヌードマウスの脾臓細胞に移植する。腫瘍が約５ｍｍ×５ｍｍのサイズとなったときに（通常、接種から約10日後）、動物を処理した群と対照群に対にして分ける。各々の群は10匹の腫瘍マウスからなり、その各々には耳にタグを付けて、実験期間中個々に追跡する。薬物またはビヒクルの投与を、動物を対に分けた日に開始する（１日目）。供与量、薬物投与の経路およびスケジュールを問題の研究について適切に選択する。試薬のＭＴＤ供給量が知られていない場合には、腫瘍が接種されていないマウスにおいて、最初に供与量を求める実験でその供給量を求める。典型的な実験においては、薬物をそのＭＴＤおよび１／２のＭＴＤの供給量のｉ．ｐ．で１日に５回のスケジュールで与える。実験は、対照腫瘍のサイズが２−３ｇに達したときに通常終了する。マウスの体重を週に２回測定し、腫瘍の測定を週に２回カリパスにより行なう。これを１日目に開始する。これらの腫瘍測定値をよく知られた公式によりｍｇの腫瘍の重量に換算し、これらの計算した腫瘍重量から終了する日を求めることができる。終了する際に、全てのマウスの体重を測定し、マウスを犠牲にして、それらの腫瘍を切除する。腫瘍の重量を測定し、群ごとの平均腫瘍重量を計算する。このモデルにおいて、平均対照腫瘍重量／平均処理腫瘍重量×100 ％（Ｃ／Ｔ）を、10 0 ％から引いて、各々の群に関して、腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）を得る。ＭＸ−１モデルにおいて、いくつかの薬物により腫瘍が収縮する。これらの試薬により、所定の腫瘍の最終重量は、１日目の最初の処理の時点の重量から減っている。最初の腫瘍の重量で割ったこの差が収縮％である。平均腫瘍収縮％を、ＭＸ−１退行を経験した群のマウスからのデータより計算することができる。マウスから腫瘍が完全に消えた場合には、これは、完全な退行または完全な腫瘍収縮と考えられる。所望であれば、部分的または全体的に腫瘍の退行したマウスを、終了日を過ぎても生かしたままにして、それらのマウスが長期間の腫瘍のない生存体となるか否かを観察しても差支えない。主にログランクｐ−値試験を用いて、データの統計をとる。ＨＩＶ−１不活化研究に関するプロトコル生体外の抗ウイルススクリーンにおける化合物を試験する一般的なプロトコルが以下の文献に開示されている：１．無細胞ＨＩＶ−１の不活化ＨＩＶ−１のＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ株に慢性感染したＨ−９ヒトＴ細胞の培養上清から無細胞ＨＩＶ−１株を派生させる。ＭＮを含む他のＨＩＶ−１株およびいくつかのアフリカ株を確認の目的として後に使用してもよい。ａ）無細胞ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ：無細胞ＨＩＶ−１（５×10⁵から１×10⁶ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌ、または中央組織培養感染供与量）を未処理のままか、またはＲＰＭＩ１６４０培地、または異なる濃度の抗ウイルス体により、様々な期間に亘り、37℃または測定すべき温度で処理する。保温後、処理したものと未処理ものを、５×10⁵の洗浄しペレット化した標的ＭＴ−４細胞に加える。37℃で１時間保温した後、ＭＴ−４細胞をＲＰＭＩ１６０４で３回洗浄し、15％の胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を補ったＲＰＭＩ１６４０中に再懸濁させ、５％のＣＯ₂の加湿恒温器内において37℃で培養する。生きているミトコンドリアが存在する場合に色が変化する、３−（４，５−ジメチル−チアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）染料を加えることにより、７日目の培養について、細胞生存度を求める。全ての測定を三重に行なう。ｂ）無細胞ＪＲ−ＣＳＦ：ＨＩＶ−１のラープ酵素株への抗ウイルス薬の効果を評価することに加えて、ＨＩＶ−１の主要分離株（ＪＲ−ＣＳＦ）への抗ウイルス薬の効果を求めることも重要である。この分離株は主要なヒト末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）のみに感染する。フィトヘムアグルチニンＡ（ＰＨＡ、シグマケミカル社）により活性化したヒトＰＢＭＣを、感染性研究に使用する前に１日に亘り、10％のＦＢＳ（完全培地）および2.0 μｇのＰＨＡ／ｍｌを補ったＲＰＭＩ１６４０培地内でＰＢＭＣを培養することにより調製する。上述したように処理したかまたは末処理のＨＩＶ−１（ＪＲ−ＣＳＦ）をＰＨＡ−活性化ヒトＰＢＭＣに加えて、37℃で１時間に亘り保温する。保温後、1.0 ｍｌの完全ＲＰＭＩ１６４０培地を細胞に加える。培養上清を培養の３、６および９日目に採取して、ＨＩＶ−１ｐ２４コア蛋白質の量をＨＩＶ−２４ｐ２４抗原捕獲アッセイにより三重に求める（フロリダ州、コウルターイミュノロジー、またはデラウェア州、ウィルミントンのＮＥＮデュポン）。２．細胞関連ＨＩＶ−１の不活化使用すべきＨＩＶ−１感染ヒト細胞には、慢性感染Ｈ−９細胞（ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢまたはＭＮ株）およびＨＴＬＶ−ＩＩＩＢまたはＪＲ−ＣＳＦに感染したヒトＰＢＭＣが含まれる。ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ−およびＭＮ−感染Ｈ−９細胞系は様々な研究所から得られる。感染ヒトＰＢＭＣに関しては、新鮮なヒトＰＢＭＣが正常なボランティアから得られ、ＰＨＡにより刺激を受け、上述したように、ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢまたはＪＲ−ＣＳＦにより感染される。生体外感染後から７日目に、培養上清内でＨＩＶ−１ｐ２４の存在に関して試験することにより感染性を調べる。感染した培地を等しい部分標本に分ける。次いで、ある組を様々な時間間隔に亘り異なる濃度で抗ウイルス薬で処理し、一方で、他の組を未処理のままにしておく。培養の３、６および９日目に採取した培地上清を、ｐ２４抗原捕捉測定キットによりＨＩＶ−１ｐ２４のレベルについて評価する。これらの培地からの細胞を、免疫蛍光（ＩＦ）研究に用いて、ＨＩＶ−１抗原を発現する細胞の百分率を求めても差支えない。３．ＨＩＶ−１潜伏感染細胞の不活化ＨＩＶ−１潜伏感染細胞への抗ウイルス薬の効果を研究するように、これらの測定法を設計する。以下の１種類以上のＨＩＶ−１潜伏感染ヒト細胞系を用いても差支えない（メアリーランド州、ロックビル、NIH AIDS Research and Reagen t Reference Program から得たＪ１−１、Ｕ１／ＨＩＶ、およびＡＣＨ−２）。これらの細胞は、ＨＩＶ−１複製において10−100倍に増大する異なるサイトキン（cytokines）により刺激されるまで、著しいＨＩＶ−１ウイルス複製のないＨＩＶ−１感染により特徴付けられている。Ｊ１−１、またはＵ１／ＨＩＶ、またはＡＣＨ−２細胞が96−ウェル丸底組織培養プレートに接種され、15％の胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）が補われたＲＰＭＩ１６４０内で５×10⁵／ウェルとなる。細胞を未処理のままにするかまたは様々な時間間隔に亘り異なる濃度の抗ウイルス薬で処理する。処理に続いて、処理細胞および未処理細胞をＲＰＭＩ１６４０内で３回洗浄し、以下のように刺激する。前述したように（参照文献１）、Ｊ１−１細胞を48時間に亘り37℃で1000Ｕの α腫瘍ネクロシス要因（α−ＴＮＦ、ゲンザイム）により刺激する。Ｕ１／ＨＩＶ−１細胞を48時間に亘り37℃で20％−40％のＰＨＡ−培地上清（エレクトロヌクレオニクス）により刺激する（参照文献２）。ＰＨＡ−上清は、エレクトロヌクレオニクスから購入するか、または研究所で調製する。ＰＨＡ− 上清を調製するために、正常なヒトＰＢＭＣを、15％のＦＢＳおよび10μｇ／ｍｌのフォトヘマグルチニンＡ（シグマケミカル社、ＰＨＳ）が補われたＲＰＭＩ１６４０内において10⁶細胞／ｍｌの細胞密度で培養する。培地上清を収穫し、２μｍフィルタに通して濾過し、上述したようにＵ１／ＨＩＶ細胞を刺激するのに用いる。上述したように（参照文献３および４）、48時間に亘り37℃で1.0 μＭのフォルバル１２−ミリステート１３アセテート（シグマケミカル社、ＰＭＡ）を添加することにより、ＡＣＨ−２細胞を刺激する。刺激期間の最後に、培地上清を採取し、ＨＩＶ−１発現を、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原捕捉ＥＬＩＳＡ（デュポン）および逆転写酵素（ＲＴ）により評価する。細胞関連ＨＩＶ−１実験の不活化において、処理細胞および未処理細胞にＰＣＲ分析を行なっても差支えない。４．ＨＩＶ−１誘発融合細胞形成の阻害ＨＩＶ−１感染Ｈ−９細胞を未処理のままにするか、または上述したように抗ウイルス薬で処理する。未処理細胞および処理細胞（５×10⁴細胞／ウェル）を、完全ＲＰＭＩ１６４０培地内に１×10⁵インジケータＳｕｐＴ１ヒトＴ細胞／ウェルを含有する96−ウェルの平底マイクロタイタ組織培地プレートに加える。 37℃での一晩の保温後、倒立顕微鏡を用いて２人の個人が融合細胞の形成を評価する。５．細胞障害作用の研究抗ウイルス薬の細胞障害作用を様々な細胞の種類について試験することができる。上述した細胞系および正常なヒトＰＢＭＣの全てを、上述したように、様々な時間に亘り異なる抗ウイルス薬濃度で保温する。ＭＴＴ染料法（上記参照）および［³Ｈ］チミジン接種およびシンチレーション計数により細胞障害作用を決定する。供給量および製剤本発明の抗腫瘍化合物（活性成分）を投与して、哺乳動物の体内の薬の作用部位に活性成分を接触させる手段により腫瘍を阻害することができる。それらの化合物は、薬剤に関して使用できる従来の手段によるか、または個々の治療活性成分としてまたは治療活性成分と組み合わせて投与しても差支えない。それらを単体で投与しても差支えないが、一般的には、選択した投与経路および標準的な治療法に基づいて選択された治療担体とともに投与される。投与量は、活性成分の腫瘍を阻害する量であり、もちろん、特定の活性成分の薬力学特性およびその投与様式並びに経路；投与される人の年齢、健康状態および体重；症状の性質および程度；並存する治療の種類、治療の頻度および所望の効果のような既知の要因に依存して変わる。通常、活性成分の１日の投与量（治療効果的な量または癌阻害量）は、体重１ｋｇ当たり約５から約400 ミリグラムまでである。普通は、１日に２−４回の投与に分けて与えられるか、または持続放出形態で、１日当たり、１ｋｇ当たり、10から200、好ましくは10から50ミリグラムが所望の結果を達成するのに効果的である。内部投与に適した供給形態（組成物）は、ユニット当たり約1.0 ミリグラムから約500 ミリグラムの活性成分を含有している。これらの製剤組成物において、活性成分は通常、組成物の合計重量に基づいて、約0.05−95重量％の量で存在する。活性成分は、カプセル、錠剤および粉末のような固体供給形態か、またはエリキシル、シロップおよび懸濁液のような液体供給形態で経口により投与しても差支えない。活性成分はまた、無菌液体供給形態で、非経口投与しても差支えない。ゼラチンカプセルは、活性成分と、乳糖、ショ糖、マンニトール、澱粉、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸等のような粉末担体とを含んでいる。類似の希釈剤を用いて、圧縮錠剤を作成しても差支えない。錠剤およびカプセルの両方を持続放出製品として製造して、数時間に亘って薬物を連続放出させても差支えない。圧縮錠剤を、糖でまたはフイルムで被覆して、不快な味を遮断して、雰囲気から錠剤を保護するか、もしくは、胃腸管内での選択的な崩壊のために腸溶被覆しても差支えない。経口投与のための液体供給形態には、着色剤およびフレーバリングを含有させて、患者に受入れ易くしても差支えない。一般的に、非経口溶液に適した担体は、水、適切な油、生理食塩水、水性右旋糖（ぶどう糖）、および関連糖溶液並びにプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのようなグリコールである。非経口投与のための溶液は、好ましくは、活性成分の水溶性塩、適切な安定化剤、および必要であれば、緩衝物質を含有している。単体かまたは組合せの、硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸のような抗酸化剤が適した安定化剤である。クエン酸およびその塩並びにナトリウムＥＤＴＡも使用されている。さらに、非経口溶液に、塩化ベンザルコニウム、メチル−またはプロピル−パラベンおよびクロロブタノールのような保存剤を含有させてもよい。適切な製剤担体が、この業界で標準的な参考文献である、Remington's Pharma ceutical Sciences，Mack Pablishing Companyに記載されている。本発明の化合物を投与するのに有用な製剤供給形態は、以下に示すようなものであっても差支えない。カプセル：標準的なツーピースの堅いゼラチンカプセルの各々に、100 ミリグラムの粉末活性成分、175 ミリグラムの乳糖、24ミリグラムのタルクおよび６ミリグラムのステアリン酸マグネシウムを充填することにより、カプセルを作成する。ソフトゼラチンカプセル：活性成分の大豆油混合物を調製し、容積移送式真空ポンプによりゼラチン中に注射して、100 ミリグラムの活性成分を含有するソフトゼラチンカプセルを形成する。次いで、このカプセルを洗浄して乾燥させる。錠剤：供給ユニットが、100 ミリグラムの活性成分、0.2 ミリグラムのコロイド状二酸化ケイ素、５ミリグラムのステアリン酸ナトリウム、275 ミリグラムの微結晶性セルロース、11ミリグラムのトウモロコシ澱粉および98.8ミリグラムの乳糖となるように従来の方法により錠剤を調製する。適切なコーティングを施して、嗜好性を高めたり吸収を遅らせたりしてもよい。注射可能薬： 1.5 重量％の活性成分を10容積％のプロピレングリコールおよび水中で撹拌することにより、注射による投与に適した非経口組成物を調製する。この溶液を、塩化ナトリウムで等張性にして、殺菌する。懸濁液：各々５ミリリットルが、100 ミリグラムの細かく砕かれた活性成分、200 ミリグラムのナトリウムカルボキシメチルセルロース、５ミリグラムの安息香酸ナトリウム、1.0 グラムのソルビトール溶液Ｕ．Ｓ．Ｐ．および0.025 ミリグラムのバニリンを含有するように、経口投与のための水性懸濁液を調製する。この開示において、本発明を実施するのに特定の物質および条件が重要であるが、本発明の利点を達成するのを妨げない限り、不特定の物質および条件を除外する必要はない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｄ 473/30 Ｃ０７Ｄ 473/30 473/34 473/34 (72)発明者ウェイス，アレクサンダーエルアメリカ合衆国テキサス州 78245 サンアントニオオミクロンドライヴテキサスリサーチパーク（番地なし）リピテックインコーポレーテッド内 (72)発明者グッドヒュー，チャールズティーアメリカ合衆国テキサス州 78245 サンアントニオオミクロンドライヴテキサスリサーチパーク（番地なし）リピテックインコーポレーテッド内 (72)発明者ベイコス，タマスアメリカ合衆国テキサス州 78245 サンアントニオオミクロンドライヴテキサスリサーチパーク（番地なし）リピテックインコーポレーテッド内

Claims

【特許請求の範囲】１．化学式：の化合物、または治療的に許容されるその塩であって、Ｂが、自然に生じる核塩基、または、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル−Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルオキシ、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルチオ、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ、置換アミノ基、アリール、アラルキル、アリールオキシ、アラキコキシ、アリールチオ、アラルキルチオ、複素環およびアミノ基からなる群より選択される置換核塩基より選択され、塩基がピリミジンである場合には、塩基の位置４の原子が硫黄であって差支えなく、塩基がプリンである場合には、塩基の位置６の原子が硫黄であってもよく；Ｒ₁およびＲ₂が独立してＨ、モノハロゲン、ジハロゲン、ＯＲ₅またはＢであり、ここで、Ｒ₅はＨ、ＣＯＲ₆、Ｐ（Ｏ）ｎＲ₇Ｒ₈であり、ここで、Ｒ₆は、１−５炭素原子の置換または未置換アルキル、もしくは置換または未置換芳香族環構造物であり、Ｒ₇およびＲ₈の各々がＨまたは１−５炭素原子のアルキルであり、ｎが２または３であり；Ｒ₃およびＲ₄が独立してＢ、ＨまたはＯＲ₉であり、ここで、Ｒ₉はＨ、ＣＯＲ１０、Ｐ（Ｏ）ｍＲ１１Ｒ１２であり、ここで、Ｒ１０が１−５炭素原子の置換または未置換アルキル、もしくは、置換または未置換芳香族環構造物であり、Ｒ₁₁およびＲ₁₂は各々Ｈまたは１−５炭素原子のアルキルであり、ｍが２または３であり、Ｒ₁−Ｒ₄の一方のみがＢであり；Ｒ₄がＢであり、Ｂが５−フルオロウラシルである場合には、Ｒ₁およびＲ₂が両方ともＨではなく；Ｒ₁およびＲ₂の各々がＯＨであり、Ｒ₃がＨでありＲ₄がＢである場合には、ＢはＡではなく；Ｒ₁およびＲ₂の各々がＯＨであり、Ｒ₄がＨであり、Ｒ₃がＢである場合には、ＢはＡではないことを特徴とする化合物。２．Ｒ₃がＢとして定義され、Ｒ₄がＨであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の化合物。３．Ｒ₄がＢとして定義され、Ｒ₃がＨであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の化合物。４．ＢがＣ、Ｔ、Ｕ、Ｇ、Ａ、ヒポキサンチンおよび５−フルオロウラシルからなる群より選択される核塩基または置換核塩基であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の化合物。５．Ｒ₁およびＲ₂の各々がＯＨであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の化合物。６．Ｒ₃がＢであり、Ｒ₄がＨであり、ＢがＣ、Ｔ、Ｕ、Ｇ、Ａ、ヒポキサンチンおよび５−フルオロウラシルからなる群より選択される核塩基であり、Ｒ₁およびＲ₂の各々がＯＨであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の化合物。７．Ｒ₄がＢであり、Ｒ₃がＨであり、ＢがＣ、Ｔ、Ｕ、Ｇ、Ａ、ヒポキサンチンおよび５−フルオロウラシルからなる群より選択される核塩基であり、Ｒ₁およびＲ₂の各々がＯＨであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の化合物。８．β−Ｌ−エリトロフラノシル−５−フルオロウラシル；β−Ｌ−エリトロフラノシルウラシル；β−Ｌ−エリトロフラノシルシストシン；β−Ｌ−エリトロフラノシルヒポキサンチン；β−Ｌ−エリトロフラノシルグアニン；α−Ｌ−エリトロフラノシル−５−フルオロウラシル；および３′−アジド−２′，３′− ジデオキシ−β−Ｌ−エリトロフラノシルチミン並びに製剤的に許容されるその塩からなる群より選択されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の化合物。９．製剤的に許容される担体および治療に効果的な量の１種類以上の請求の範囲第１項記載の化合物からなる製剤組成物。 10．製剤的に許容される担体および治療に効果的な量の１種類以上の請求の範囲第８項記載の化合物からなる製剤組成物。 11．哺乳動物内の癌を治療する方法であって、癌を阻害する量の請求の範囲第１項記載の化合物を、癌を有する哺乳動物に投与する工程からなることを特徴とする方法。 12．哺乳動物内の癌を治療する方法であって、癌を阻害する量の請求の範囲第８項記載の化合物を、癌を有する哺乳動物に投与する工程からなることを特徴とする方法。