JPH10507922A

JPH10507922A - 生存汚染粒子を持たないアデノウィルス、その製造および使用

Info

Publication number: JPH10507922A
Application number: JP8514357A
Authority: JP
Inventors: イエ，パトリス; ペリコデ，ミシエル; オルシニ，セシール
Original assignee: ローヌ−プーラン・ロレ・エス・アー
Priority date: 1994-10-28
Filing date: 1995-10-25
Publication date: 1998-08-04
Also published as: NO971764L; MX9702553A; FR2726285B1; US6312946B1; US6482617B2; FR2726285A1; IL115779A0; NO971764D0; KR100424803B1; NO320090B1; ZA959086B; FI971783L; AU703539B2; US20010039046A1; EP0787199A1; KR970707292A; WO1996013596A1; AU3847795A; CN1110564C; FI971783A7

Abstract

(57)【要約】新規なアデノウィルス由来ウィルスベクター、それの製造およびそれの遺伝子治療での使用が開示されている。詳細には、（ｉ）Ｅ１領域が不活化され、（ｉｉ）ゲノム構成が変更されており、（ｉｉｉ）産生系のゲノムで組換えを行った場合に非生存性粒子を形成するアデノウィルスゲノムを含む組換えアデノウィルスが開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】生存汚染粒子を持たないアデノウィルス、その製造および使用本発明は、新規なウィルスベクター、その製造およびそれの遺伝子治療での使用に関する。本発明はさらに、前記ウィルスベクターを含有する医薬組成物に関するものである。さらに詳細には、本発明は遺伝子治療用のベクターとしての組換えアデノウィルスに関する。遺伝子治療は、冒された細胞または臓器中に遺伝子情報を導入することで、欠失または異常（突然変異、異常発現など）を改善することにある。この遺伝子情報は、臓器から取り出した細胞にin vitroで導入後、次に修飾した細胞を体内に再度組み入れるか、あるいはin vivo で適切な組織に直接導入することができる。この第２の場合では各種方法があり、その中にはＤＮＡおよびＤＥＡＥ−デキストラン（Pagano et al,，J.Virol．1(1967)891）、ＤＮＡおよび核蛋白（Kane da et al.，Science 243(1989)375）、ＤＮＡおよび脂質（Felgner et al.,PNAS 84(1987)7413）の複合体やリポソームの利用(Fraley et al.，J.Biol.Chem.255 (1980)10431)などが関与する各種トランスフェクション法がある。さらに最近では、遺伝子転移のベクターとしてウィルスを利用する方法が、これらの物理的トランスフェクション法に対する有望な代替法として登場してきた。これに関して、各種ウィルスについて、ある種の細胞群を感染させる能力に関する試験が行われてきた。特には、レトロウィルス（ＲＳＶ、ＨＭＳ、ＭＭＳなど）、ＨＳＶウィルス、アデノ随伴ウィルスおよびアデノウィルスにそれが当てはまる。これらのウィルスのうち、アデノウィルスは遺伝子治療での使用に関して有利なある種の性質を示す。特に、当該ウィルスはかなり広い宿主スペクトルを持ち、休止細胞を感染させることができ、感染細胞のゲノム中に組み込まれず、現在までのところヒトにおいて重要な病気と関連のあったことがない。そうしてアデノウィルスは、筋肉(Ragot et al，Nalure 361(1993)647)、肝臓（Jaffe et al. ，Nature genetics 1(1992)372）、神経系（Akli et al.，Nalure genetics 3(1 993)224）などに対象遺伝子を転移させるのに使用されている。アデノウィルスは、約３６ｋｂの大きさの直鎖状二本鎖ＤＮＡを有するウィルスである。そのゲノムは特に、各末端の逆方向反復塩基配列（ＩＴＲ）、カプシド形成（encapsidation）配列（Ｐｓｉ）、初期遺伝子および後期遺伝子を有する（図１参照）。主要な初期遺伝子は、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４領域にある。これらのうち、Ｅ１領域（特にＥ１ａおよびＥ１ｂ）にある遺伝子が、ウィルス複製に必要である。例えば、Ｅ４およびＬ５領域としては、ウィルス増殖に関与する。主要な後期遺伝子は、Ｌ１〜Ｌ５領域にある。Ａｄ５アデノウィルスのゲノムについては完全に配列決定が行われており、データベースで入手可能である（特には、遺伝子バンクＭ７３２６０参照）。同様に、各種血清型（Ａｄ２、Ａｄ７、Ａｄ１２など）のアデノウィルスのゲノムのいくつかの部分または全体すらも、配列決定されている。上記のアデノウィルスの性質を考慮して、後者はすでに in vivoでの遺伝子転移に使用されている。そのために、アデノウィルスから誘導される各種ベクターが作られ、各種遺伝子（β−ｇａｌ、ＯＴＣ、α₁−ＡＴ、サイトカインなど）を組み込んでいる。これらの各構造体においては、アデノウィルスを修飾して、感染細胞中で複製できないようにしている。そこで、先行技術に記載の構造体は、異種ＤＮＡ配列を挿入する領域でＥ１（Ｅ１ａおよび／またはＥ１ｂ）領域と恐らくはＥ３領域が欠失しているアデノウィルスである（Levrero et al.，Ge ne 101(1991)195; Gosh-Choudhury et al.，Gene 50(1986)161）。他の構造体は、Ｅ１領域の欠失とＥ４領域の非必須部分の欠失を有する（ＷＯ９４／１２６４９）。そうであっても、先行技術に記載のベクターはいくつかの欠点を持っていることから、それの遺伝子治療での利用は制限される。特に、先行技術に記載の種類の組換えウィルスのバッチは、複製性粒子（replicative particles）、特には野生型で汚染される可能性がある。現在、アデノウィルスから誘導されるベクターが実際に、アデノウィルスゲノムの一部を組み込んだ相補系（complementation line）（系２９３）で産生される。詳細には、系２９３は、左側ＩＴＲ、カプシド形成領域およびＥ１領域（Ｅ１ａ、Ｅ１ｂおよびｐＩＸ蛋白をコードする領域の一部）を有してなるアデノウィルス血清型５（Ａｄ５）ゲノムの左側末端（約１１〜１２％）を有する。この系は、Ｅ１領域を欠失する組換えアデノウィルス、すなわち複製に必要なＥ１領域の全体または一部を欠いている組換えアデノウィルスをトランス補足（trans- complement）することができる。実際、Ｅ１組換えアデノウィルスは、この系が有するＥ１領域の良好なトランス補足の結果、２９３細胞で得ることができる。そうではあっても、その系のゲノムに組み込まれたアデノウィルス領域と産生することが望まれる組換えウィルスのＤＮＡの間には相同性の部分がある。その結果、産生時には各種の組換えイベントが起こり得、複製性ウィルス粒子、特にはＥ１＋型のアデノウィルスが生じる。図２に示したように、その結果、単組換えイベントとそれに続く染色体の切断（図２Ａ）または二重組換え（図２Ｂ）が起こり得る。これら２種類の修飾により、Ｅ１領域の機能性コピーを有する細胞のゲノムに存在する相当する部分によって、機能性Ｅ１領域を欠く組換えＤＮＡの左側部分の置換が生じる。さらに、系２９３によって産生される組換えベクターの力価が高いことを考慮すると（１０¹²より高い）、これらの組換えイベントが起こる確率は高い。実際、欠陥組換えアデノウィルスベクターの多くのバッチが、複製性ウィルス粒子（replicative viral particles）で汚染されていることが認められている。複製性粒子による汚染は、重大な欠点となる。実際、そのような粒子が治療用組成物中に存在すると、in vivo でウィルス増殖および制御できない転移が誘発されて、炎症反応、組換えなどの危険が生じると考えられる。従って、汚染されたバッチはヒトの治療に使用することはできない。本発明は、これらの欠点を改善することができる。本発明においては実際に、複製性粒子による汚染が全くない欠陥組換えアデノウィルスの産生を可能とする新規な構築について説明される。本発明においてはさらに、それらの組換えアデノウィルスの産生方法についても説明される。そうして本発明は、遺伝子治療、特にはin vivo での遺伝子の転移および発現に特に好適なアデノウィルスから誘導される新規な欠陥組換えベクターを提供するものである。本発明は特に、遺伝子構成が変えられ（modified）、産生系（producing line ）のゲノムとの組換えにより非複製性および／または非生存性（non-viable）のウィルス粒子を形成するアデノウィルスゲノムを有する欠陥組換えアデノウィルスの構築にある。本出願人は本願において、アデノウィルスのゲノム構成を変えることで、ストック製造時における複製性粒子の産生を回避できることを示している。そこで、本発明の第１の主題は、（ｉ）Ｅ１領域が不活化され、（ｉｉ）ゲノム構成が変えられ、（ｉｉｉ）産生系のゲノムとの組換えにより非生存性のウィルス粒子を形成することが可能なアデノウィルスゲノムを有する組換えアデノウィルスに関するものである。本発明の趣旨において、遺伝子もしくはゲノムの構成とは、図１に示したような野生型アデノウィルスのゲノムに存在する異なった遺伝子もしくは機能領域の配置を意味するものと理解すべきである。そこで、変更された（modified）遺伝子またはゲノムの構成は、一部の遺伝子または一部の領域がその元の位置にないゲノムに相当する。そこで、一部の遺伝子または一部の領域をゲノムから移動させて、別の部位に挿入することができる。さらに、所定の遺伝子または領域を特定部位に挿入し、元の領域を除去または不活化することも可能である（突然変異、欠失、挿入などにより）。非生存性ウィルス粒子という用語は、本発明の趣旨においては、感染細胞においてそのＤＮＡ複製および／または自律的増殖を行うことができないアデノウィルスを指す。そこで、非生存性ウィルス粒子は、感染細胞におけるその複製および／または増殖に少なくとも必要な配列を欠いているアデノウィルスゲノムを有する。その領域は、除去するか（完全にまたは部分的に）、非機能性とするか、あるいは他の配列によって置換することができる。複製および／または増殖に必要な配列には例えば、Ｅ１領域、Ｅ４領域またはＬ５領域がある。より詳細には、Ｅ４領域に関して、重要な遺伝子はＯＲＦ３およびＯＲＦ６遺伝子である。詳細には、本出願人は、遺伝子治療のためのベクターとしてのアデノウィルスの性質、すなわち特にヒト細胞での高い細胞感染力および対象遺伝子をその細胞に効果的に転移させる能力に影響を与えずに、ウィルスの複製または増殖に必須の機能を移動させることが可能であることを示している。そこで、好ましい実施態様において、本発明の主題は、ウィルスの複製および／または増殖に必須の領域が元の位置以外のゲノム位置に存在する組換えアデノウィルスである。有利には、この領域は、非機能性とされている別のゲノム領域中またはその領域の近辺にある。本発明のベクターは対象とする大きい遺伝子を組み込むことが可能で、汚染物である複製性ウィルス粒子を産生することなく、高い力価で産生され得ることから、特に有利である。本発明のベクターにおいて、Ｅ１領域または他の領域を、当業者に公知の各種方法によって不活化または非機能性とすることができ、その方法として特には、１以上の塩基の脱離、置換、欠失および／または付加がある。そのような修飾は、in vitro（単離ＤＮＡで）またはin situ で行うことができ、例えば、遺伝子工学的方法によって、あるいは別法として突然変異誘発因子による処理によって行うことができる。その遺伝子修飾は、その領域のコード部分またはコード領域外、例えば当該遺伝子の発現および／または転写調節を担当する領域に局在させることができる。そこで不活化は、産生の喪失、活性が障害された蛋白の産生あるいは低レベルでのまたは所望の調節形態に従った天然蛋白の産生によって、構造もしくはコンホメーションの変性の結果として、不活化蛋白の産生という形で現れ得る。不活化に使用することができる突然変異誘発剤の中では、例えばエネルギー照射（Ｘ線、γ線および紫外線など）などの物理的因子、あるいはアルキル化剤［メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、Ｎ−ニトロキノリン−１−オキサイド（ＮＱＯ）］、ビアルキル化剤、挿入因子などのＤＮＡ塩基の各種官能基と反応することができる化学的因子を挙げることができる。その遺伝子修飾は、例えばロトスタイン（Rothstein）が最初に報告したプロトコル（Meth．Enzymol. 101(1983)202）に従い、遺伝子破壊によって行うこともできる。その場合好ましくは、コード配列の全体または一部を破壊して、相同的組換えにより、ゲノム配列を非機能性配列もしくは突然変異体配列で置き換えることができるようにする。好ましくは、本発明のアデノウィルスにおいては、１以上の塩基の突然変異および／または欠失によって問題の領域を不活化する。さらに好ましくは、完全もしくは部分的欠失によって問題の領域を不活化する。より詳細には、欠失とは、問題とする遺伝子の全体または一部のあらゆる脱離を意味するものと理解される。これは特に、当該遺伝子のコード領域の全体もしくは一部、および／または当該遺伝子の転写プロモーター領域の全体もしくは一部に適用し得る。脱離は、実施例に示すように、標準的分子生物学的方法に従って、適切な制限酵素による消化と、それに続く連結反応によって行うことができる。特に好ましい方法として、遺伝子の不活化は、それが問題とする遺伝子のみに影響を与えて、他のウィルス遺伝子、特に隣接する遺伝子に影響しないような形で行う。さらに、点突然変異などの一部の変更は本質的に、細胞機序によって修正もしくは減衰される可能性があることから、不活化が分離時に完全に安定および／または不可逆的であることが特に好ましい。全体または部分的な欠失による不活化の場合、ウィルスの生存性に必須の領域は好ましくは、欠失部位または欠失部位付近にある。しかしながら、例えばすでに野生型ゲノムに存在する制限部位などの他の挿入部位を使用することが可能である。そうではあっても、その点に関しては、挿入を少なくとも欠失部位近辺で行うこと、すなわち、欠失部位外であるが、欠失部位と挿入部位を隔てる空間では起こり得ない組換えイベントが十分可能な部位で行うのが好ましい。好ましくは、欠失部位と挿入部位との間の距離は、５０ｂｐを超えてはならない。本発明の好ましい実施態様においては、ウィルスの複製および／または増殖に必須の領域を移動して、不活化したＥ１領域および／またはＥ３領域に含める。特に有利な実施態様によれば、本発明の組換えアデノウィルスでは、Ｅ１領域が、Ａｄ５アデノウィルス配列上のヌクレオチド４５４からヌクレオチド３３２８までのＰｖｕＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片の欠失によって不活化される。この配列は文献に記載されており、データベースにもある（特には、遺伝子バンクＭ７３２６０号を参照）。別の好ましい実施態様においては、Ｅ１領域が、ヌクレオチド３８２〜ヌクレオチド３４４６のＨｉｎｆＩＩ−Ｓａｕ３Ａ断片の欠失によって不活化される。本発明によるウィルスの複製および／または増殖に必須の領域は、有利には、Ｅ４領域および／またはｐＩＸ−ＩＶａ２領域および／またはＬ５領域などの全体もしくは一部から選択される。本発明の特に好ましい実施態様においては、必須領域は、Ｅ４領域の全体または機能性部分から成り、それはＥ１欠失部位またはその部位近辺に挿入される。この実施態様によれば、ウィルス増殖に必須のＥ４領域をその元の位置とは異なる位置に挿入して、産生系のゲノムによる組換えによって得られると考えられる構造体においてこの領域を不在とする（図３参照）。従って、本発明の主題は、不活化したＥ１およびＥ４領域の存在によってゲノムが区別され、Ｅ４領域の全体または機能性部分がＥ１領域もしくはその近辺に挿入された組換えアデノウィルスでもある。この種のアデノウィルスベクターは好ましくは、２個のＩＴＲ、カプシド形成領域、Ｅ４の全体もしくは機能性部分が挿入されているＥ１領域における欠失、ならび不活化された元のＥ４領域を有してなるものである。Ｅ４領域は、後期遺伝子の発現の調節、後期核ＲＮＡの安定性、宿主細胞の蛋白発現の喪失、ならびにウィルスＤＮＡの複製の効力に関与する。Ｅ４を持たない突然変異体は、増殖することができない。そこでＥ４は、ウィルスの複製および／または増殖に必須の領域を構成している。このＥ４領域は、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ３／４、ＯＲＦ６およびＯＲＦ６／７という名称の７個の読み取り枠から成る（図４）。これらのうち、ＯＲＦ３およびＯＲＦ６の２つは、ウィルス増殖に必須の遺伝子である。これらの各遺伝子は、ウィルス増殖を誘発することができる。他方、Ｅ４領域の不活化には、ＯＲＦ３およびＯＲＦ６の不活化を伴う。特定の実施態様では、本発明のベクターにおいて、Ｅ４領域の全体がＥ１欠失部位またはその部位の近辺に挿入される。その領域は特に、ヌクレオチド３５８３５〜３２７２０に相当するＭａｅＩＩ−ＭｓｃＩ断片に相当し得る。別の特定の実施態様においては、Ｅ４の機能性部分のみ、すなわちウィルス増殖を可能とするのに十分な部分のみを挿入する。この部分は、１以上の機能性ＯＲＦ３またはＯＲＦ６遺伝子を有してなるものである。好ましくは、Ｅ４の機能性部分は、本質的にＯＲＦ３またはＯＲＦ６からなるものである。例としては、これらのコード枠を、それぞれヌクレオチド３４８０１〜３４３２９および３４１１５〜３３１２６に相当するＰｖｕＩＩ− ＡｌｕＩおよびＢｇｌＩＩ−ＰｖｕＩＩ断片の形で、Ｅ４領域から単離することができる。有利には、Ｅ４領域またはこの領域の機能性部分も、転写プロモーター領域を有する。問題とするプロモーターは、Ｅ４領域のものであるか、あるいはウィルス（Ｅｌａ、ＳＶ４０、ＲＳＶＬＴＲなど）、真核生物もしくは哺乳動物のプロモーターなどの他の機能性プロモーターであることができる。好ましくは、使用するプロモーターはＥ４領域のプロモーターである。前述のように、Ｅ１に挿入されたＥ４の機能性部分は、必ずしも元の位置で欠失しているＥ４の部分に相当するとは限らない。そこで、最初の領域を点突然変異（欠失なし）によって不活化させて、機能性Ｅ４領域をＥ１領域に挿入することができる。同様に、最初のＥ４領域を完全に欠失させて、機能性部分のみをＥ１に挿入することができる。本発明の趣旨においては、Ｅ４領域の不活化とは、少なくともＯＲＦ３およびＯＲＦ６領域の機能不活化を包含するものである。これらの元の領域は、当業者に公知の任意の方法によって不活化することができる。特に、前述の全ての方法を、ＯＲＦ３およびＯＲＦ６またはＥ４の別の領域の不活化に適用することができる。例としては、ウィルスＡｄ２ｄｌ８０８のＥ４領域またはウィルスＡｄ５ｄｌ１００４、Ａｄ５ｄｌ１００７、Ａｄ５ｄｌ１０１１もしくはＡｄ５ｄｌ１０１４のＥ４領域の欠失を本発明に関して使用することができる（実施例３参照）。これらのアデノウィルスは例えば、それが産生することが望まれるウィルスのゲノムの左側部分を有する第１のプラスミド（Ｅ１領域における欠失を有し、その欠失またはその近辺には、少なくともＥ４の機能性部分が挿入されている）、ならびにウィルスのゲノムの右側部分を提供するウィルスゲノムＤＮＡ断片（不活化Ｅ４領域を有する）を、産生系中に同時トランスフェクションすることで得ることができる。組換え後、産生されたウィルスを増幅・単離する。これらのアデノウィルスはさらに、ＩＴＲと隣接領域を有してなるゲノムの両末端を相互交換することでも得ることができる。この点に関して、本発明の主題は、ゲノムが不活化Ｅ１領域を有し、ＩＴＲおよびカプシド形成領域を有してなる左側末端とＩＴＲおよびＥ４領域の全体もしくは機能性部分を有してなる右側末端が相互交換している組換えアデノウィルスでもある。詳細には、左側ＩＴＯおよびカプシド形成領域を有する左側末端は、Ａｄ５アデノウィルスゲノムの最初の３８２個のヌクレオチド（例：ＨｉｎｆＩ部位まで）にある。同様に、Ｅ４領域のプロモーターなど、右側ＩＴＲおよびＥ４領域の全体もしくは機能性部分を有する右側末端は、Ａｄ５アデノウィルスゲノムの最後の３２１５個のヌクレオチド（例：位置３２７２０のＭｓｃＩ部位から）にある。当業者の技術であれば、右側ＩＴＲおよびＥ４領域の全体もしくは一部がこの時点でウィルスの左側にあり、次にＡｄ５アデノウィルスゲノムの領域３４４６〜３２７２０があり、次にカプシド形成配列とこの時点では組換えウィルスの右側末端となる左側ＩＴＲがある本発明による組換えウィルスを構築することができる（図５参照）。それによって得られる組換えアデノウィルスのゲノムは、左側に移動した必須のＥ４領域が自然環境下で維持され、そうして高力価の感染サイクルに最適な活性条件下にあることから、特に有利である。さらに、この領域はこの時点で、産生系２９３のゲノムに存在することで生存粒子の発現の源となる領域より前にある。本発明の別の最も好ましい実施態様においては、必須領域はｐＩＸ蛋白およびＩＶａ２蛋白をコードする領域から成り、適宜に欠失した配列の置換物として、Ｅ３領域に挿入される（図６参照）。詳細には、ｐＩＸ蛋白およびＩＶａ２蛋白をコードする領域が、野生型Ａｄ５アデノウィルス配列上のヌクレオチド３３２８〜６３１６に相当するＢｇｌＩＩ−ＮｒｕＩ断片内にある。この実施態様では、生存性に必須の主要な後期遺伝子が欠失していることから、産生系に組み込まれたアデノウィルス領域と組換えアデノウィルスとの可能な組換えによって、非生存性のウィルス粒子のみが形成される。本発明の特定の実施態様によれば、アデノウィルスゲノムの２つの必須領域をそれらの元の位置から移動する。より好ましくは、それらの必須領域は、ｐＩＸ蛋白をコードする領域とＥ４領域の全体もしくは機能性部分のみをコードする領域によって表される。好ましい実施態様によれば、それらは欠失した配列の置換物としてＥ１領域に移動し、その読み取り枠の配向を保存しているかあるいは保存していない。詳細には、この種の構築を図示することを目的として、図８に示した構築を参照することができる。この構築では、ｐＩＸ蛋白をコードする領域は、組換えウィルスの右側末端になっている左側ＩＴＲの右側にある欠失Ｅ１領域に移動する。さらに、ｐＩＸ蛋白をコードする領域がそこにあって、逆方向に読まれる。Ｅ４の必須領域に関しては、それはＥ４プロモーターの制御下にＯＲＦ３〜ＯＲＦ６／７遺伝子によって表され、さらにそこでＥ１欠失部位に、ｐＩＸ蛋白をコードする領域とＩＶａ２蛋白をコードする領域の間に挿入されて、その位置は影響されていない。図８の具体的な構築の場合、ｐＩＸ蛋白およびＩＶａ２蛋白のそれぞれをコードする２つの領域が、別個のポリアデニル化部位を有している。この種の構築は、信頼性および安全性の観点から特に有利である。実際、例えばＥ４領域で、この種の２個のウィルス分子間に擬似的組換えがあると、それのカプシド形成配列のない組換えウィルスが生じる。同様に、この種のウィルス分子と前記アデノウィルスの相補的領域との組換えで、産生細胞系中にその領域を組み込むと、生存性に必須の主要な後期遺伝子が欠失したウィルス粒子のみが生じる。前述のように、本発明による組換えアデノウィルスは、ＩＴＲ配列とカプシド形成を行うことができる領域を有してなるのが有利である。逆方向反復塩基配列（ＩＴＲ）で、アデノウィルスの複製起点を構築する。その配列は、ウィルスゲノムの３’末端および５’末端に局在しており（図１参照）、そこから、当業者に公知の標準的な分子生物学的方法に従って容易に単離することができる。ヒトアデノウィルスのＩＴＲ配列のヌクレオチド配列（特には、Ａｄ２およびＡｄ５血清型のもの）が文献に記載されており、イヌアデノウィルス（特にはＣＡＶ１およびＣＡＶ２）についても記載されている。例えばＡｄ５アデノウィルスに関しては、左側のＩＴＲ配列はそのゲノムのヌクレオチド１〜１０３を有してなる領域に相当する。カプシド形成配列（Ｐｓｉ配列とも称される）が、ウィルスゲノムのカプシド形成には必要である。従って、本発明による欠陥組換えアデノウィルスを形成することができるようにするためにはこの領域が存在しなければならない。カプシド形成配列は、野生型アデノウィルスのゲノム中、左側ＩＴＲとＥ１遺伝子との間に局在している（図１参照）。本発明のアデノウィルスにおいては、それは左側のＩＴＲまたは右側のＩＴＲのいずれかに隣接して局在し得る（図５参照）。それは標準的な分子生物学的方法によって単離もしくは人為的に合成することができる。ヒトアデノウィルスのカプシド形成配列のヌクレオチド配列（特にはＡｄ２およびＡｄ５血清型のもの）が文献に記載されており、イヌアデノウィルス（特にＣＡＶ１およびＣＡＶ２）についても知られている。例えばＡｄ５アデノウィルスに関しては、ゲノムのヌクレオチド１９４〜３５８の間に機能性カプシド形成配列が存在する。さらに、本発明によるアデノウィルスは、そのゲノムに関して他の修飾を有することができる。特に、他の領域が欠失して、ウィルスの能力を上昇させ、ウィルス遺伝子の発現に関連するそれらの副作用を低減することができる。そこで特に、Ｅ３領域全体またはその一部を欠失させることができる。本発明による組換えアデノウィルスは、遺伝子治療での使用に対して特に有望な性質を有するものである。これらのベクターは実際、感染、安全性および遺伝子転移能力に関して非常に高い性質を併せ持っている。本発明の組換えアデノウィルスはさらに、細胞、臓器もしくは生物体において転移および／または発現することが望ましい異種核酸配列をも有することが有利である。特に、異種ＤＮＡ配列は、１以上の治療効果を有する遺伝子を有することができる。そうして転移され得る治療効果のある遺伝子は、標的細胞で転写および適宜に翻訳されることで治療効果を有する産生物を生じる遺伝子である。特に、対象とする遺伝子は、治療効果を有する蛋白産生物をコードする遺伝子であることができる。そうしてコードされた蛋白産生物には、蛋白、ペプチド、アミノ酸などがあり得る。この蛋白産生物は標的細胞に関して相同的なものであっても良い（すなわち、標的細胞が病原性を示さない場合に、通常その標的細胞で発現する産生物）。この場合、蛋白の発現によって例えば、細胞での不十分な発現、または修飾の結果としての不活性もしくは活性の弱い蛋白の発現を補うか、あるいはその蛋白を過剰に発現させることができる。治療効果のある遺伝子はさらに、細胞蛋白の突然変異体をコードして、安定性を高めたり、活性を変えたりすることもできる。蛋白産生物はさらに、標的細胞に関して異種であることもできる。その場合、発現蛋白は例えば、細胞に不足している活性を補充もしくは提供して、細胞が病気と戦うことができるようにすることができる。本発明の趣旨における治療効果を有する産生物では、より具体的には、酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン（すなわちインターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦなど（ＦＲ９２／０３１２０））、成長因子、神経伝達物質もしくはその前駆体または合成酵素、栄養因子（すなわちＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５など）、アポリポ蛋白（すなわちＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥなど（ＦＲ９３／０５１２５））、ジストロフィンもしくはミニジストロフィン（ＦＲ９１／１１９４７）、腫瘍抑制遺伝子（すなわちｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｖなど（ＦＲ９３／０４７４５）、凝集に関与する因子をコードする遺伝子（すなわち因子ＶＩＩ）ＶＩＩＩ、ＩＸなど）、自殺遺伝子（すなわちチミジンキナーゼ、シトシンデスアミナーゼなど）など、あるいは、天然もしくは人為的免疫グロブリン（Ｆａｂ、ＳｃＦｖなど）の全体もしくは一部等が挙げられる。治療効果を有する遺伝子はさらに、標的細胞中での発現によって細胞性遺伝子の発現や細胞性ｍＲＮＡの転写を抑制できるようにするアンチセンスの遺伝子もしくは配列であることもできる。そのような配列は例えば、欧州特許１４０３０８号に記載の方法に従って、標的細胞において、細胞性ｍＲＮＡに対して相補的なＲＮＡに転写されることで、そのｍＲＮＡが蛋白に翻訳されるのを妨害することができる。治療効果を有する遺伝子はさらに、ヒトにおいて免疫応答を起こすことができる抗原性ペプチドをコードする遺伝子であることもできる。従ってこの特定の実施態様では、本発明によって、特に微生物もしくはウィルスに対してヒトを免疫感作することができるワクチンの産生が可能となる。その様な抗原性ペプチドは、特に、エプスタイン・バールウィルス、ＨＩＶウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス（ＥＰ１８５５７３）または擬似狂犬病（pseudorabies）ウィルス、あるいは腫瘍に対して特異的な（ＥＰ２５９２１２）抗原性ペプチドであることができる。通常、異種核酸配列は、感染した細胞において機能する転写プロモーター領域と、対象の遺伝子の３’側にあり、転写終止シグナルおよびポリアデニル化部位を規定する領域も有している。この要素の組み合わせは、発現カセットを構成する。そのプロモーター領域に関しては、それが感染細胞において機能できる場合には、当然問題の遺伝子の発現を起こさせるプロモーター領域となり得る。このプロモーター領域はさらに、各種由来の領域であることができる（他の蛋白の発現を起こすもの、あるいは合成の領域もある）。特に、これは真核生物遺伝子もしくはウィルス遺伝子のプロモーター配列であることができる。例えばこれは、それが感染することが望ましい細胞のゲノム由来のプロモーター配列であっても良い。同様に、これは、使用されるアデノウィルスを含むウィルスのゲノム由来のプロモーター配列であっても良い。この点に関しては、例えばＥ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、ＲＳＶ遺伝子などのプロモーターを挙げることができる。さらに、これらのプロモーター領域は活性化物質配列、調節配列または組織特異的もしくは優勢的発現を可能にする配列を加えることで修飾することができる。さらに、異種核酸がプロモーター配列を持たない場合には、それをそのような配列の下流で欠陥ウィルスのゲノムに挿入することができる。さらに、異種核酸配列は、特に治療効果を有する遺伝子の上流で、標的細胞の分泌経路で合成される治療用生成物を指示するシグナル配列を有することもできる。このシグナル配列は、治療用生成物の天然のシグナル配列であっても良いが、他の機能性シグナル配列または人為的シグナル配列であることもできる。治療効果を有する遺伝子の発現のためのカセットは、本発明による組換えアデノウィルスのゲノムの各種部位に挿入することができる。それは第１に、Ｅ１欠失の部位に挿入することができる。その場合、Ｅ４の領域またはその機能性部分の次に（５’または３’側）に局在する。それはさらに、配列に加えてまたは配列の置換物として、Ｅ３領域に挿入することもできる。それはさらに、不活化Ｅ４領域に局在させることもできる。さらに特に有利な態様においては、本発明のベクターはさらに、異種プロモーターの制御下に機能性Ｅ３遺伝子を有する。より好ましくは、そのベクターがｇｐ１９Ｋ蛋白の発現を可能とするＥ３遺伝子の一部を有する。この蛋白によって実際に、アデノウィルスベクターが、（ｉ）それの作用を制限する可能性があり、しかも（ｉｉ）望ましくない副作用を有する可能性のある免疫反応の対象となるのを防止することができる。本発明による組換えアデノウィルスは、各種由来のものが可能である。実際には、構造および性質にいくらか変動があるが、同等の遺伝子構成を示す各種アデノウィルス血清型がある。そのため、本願に記載の方法は、いずれの種類のアデノウィルスについても、当業者であれば容易に再現することができる。より詳細には、本発明のアデノウィルスはヒト由来、動物由来もしくはその両者（ヒトおよび動物）由来のものであることができる。ヒト由来のアデノウィルスに関しては、群Ｃに分類されるものを使用するのが好ましい。より好ましくは、各種ヒトアデノウィルス血清型のうち、２型または５型のアデノウィルス（Ａｄ２またはＡｄ５）の使用が、本発明の枠組みでは好ましい。前述のように、本発明のアデノウィルスは、動物由来であるか、あるいは動物由来のアデノウィルスから誘導される配列を有することもできる。本願出願人は実際、動物由来のアデノウィルスが高効率で、ヒト細胞を感染させることができること、ならびに試験を行ったヒト細胞中で増殖することはできないことを明らかにしている（ＦＲ９３／０５９５４号参照）。本出願人はさらに、動物由来のアデノウィルスがヒト由来のアデノウィルスによって全くトランス補足されないため、ヒトアデノウィルス存在下に、感染性粒子の形成につながり得るin vivo での組換えおよび増殖の危険性が排除されることも明らかにした。従って、遺伝子治療でのベクターとしてのウィルスの使用に固有の危険性がかなり低いことから、動物由来のアデノウィルスまたはアデノウィルス領域の使用は特に有利である。本発明の枠組み内で使用できる動物由来のアデノウィルスは、イヌ、ウシ、マウス（例：Ｍａｖｌ、Beard et al.，Virology 75(1990)81）、ヒツジ、ブタ、トリまたはサル（例：ＳＡＶ）由来のものがあり得る。より詳細には、トリのアデノウィルスでは、例えばフェルプス（Phelps）株（ＡＴＣＣＶＲ−４３２）、フォンテス（Fontes）株（ＡＴＣＣＶＲ−２８０）、Ｐ７−Ａ株（ＡＴＣＣＶＲ−８２７）、ＩＢＨ−２Ａ株（ＡＴＣＣＶＲ−８２８）、Ｊ２−Ａ株（ＡＴＣＣＶＲ−８２９）、Ｔ８−Ａ株（ＡＴＣＣＶＲ−８３０）、Ｋ−１１株（ＡＴＣＣＶＲ−９２１）またはＡＴＣＣＶＲ−８３１〜８３５と称される株などのＡＴＣＣで入手可能な血清型１〜１０が挙げられる。ウシアデノウィルスでは、各種公知の血清型を使用することができ、特にはＡＴＣＣＶＲ−３１３、３１４、６３９〜６４２、７６８および７６９の名称下にＡＴＣＣで入手できるもの（１〜８型）が挙げられる。さらに、マウスアデノウィルスＦＬ（ＡＴＣＣＶＲ−５５０）およびＥ２０３０８（ＡＴＣＣＶＲ−５２８）、ヒツジアデノウィルス５型（ＡＴＣＣＶＲ−１３４３）もしくは６型（ＡＴＣＣＶＲ−１３４０）、ブタアデノウィルス５３５９、または特にＡＴＣＣでＶＲ−５９１〜５９４、９４１〜９４３、１９５〜２０３の番号で呼ばれるアデノウィルスなどのサルアデノウィルス等を挙げることができる。好ましくは、各種動物由来のアデノウィルスでは、イヌ由来のアデノウィルスもしくはアデノウィルス領域、特には全てのＣＡＶ２アデノウィルス株［例：マンハッタン(manhattan)すなわちＡ２６／６１株（ＡＴＣＣＶＲ−８００）］を本発明の枠組み内では使用する。イヌアデノウィルスは、多くの構造研究の対象となってきた。そうして、ＣＡＶ１およびＣＡＶ２アデノウィルスの完全な制限マップが先行技術で報告されており（Spibey et al.，J.Gen.Virol.，70(1989 )165）、Ｅ１ａおよびＥ３遺伝子ならびにＩＴＲ配列についてのクローニングおよび配列決定が行われている（特には、Spibey et al.，Virus Res．14(1989)24 1; Linne Virus Res．23(1992)119，WO 91/11525 参照）。本発明による欠陥組換えアデノウィルスは、各種方法で得ることができる。第１の方法は、in vitroで得た（欠陥）組換えウィルスのＤＮＡをコンピテント細胞系、すなわち欠陥ウィルスの補足に必要な全ての機能をトランスで（in t rans）有する細胞系にトランスフェクションすることである。これらの機能は好ましくは、細胞のゲノムに統合されており、それによって組換えの危険性を低減し、細胞系に高い安定性を持たせる。Ｅ１領域のみが欠失しているアデノウィルスの場合、好ましい系は系２９３である。第２の方法は、in vitroで得た欠陥組換えウィルスのＤＮＡおよび１以上のヘルパーウィルスもしくはプラスミドのＤＮＡの好適な細胞系での同時トランスフェクションにある。この方法によれば、組換えアデノウィルスの全ての欠陥機能を補足することができるコンピテント細胞系を有することは適宜であって、必須ではない。これらの機能の一部は実際には、一種以上のヘルパーウィルスによって補足される。このヘルパーウィルス自体は欠陥ウィルスである。この方法による本発明の欠陥組換えアデノウィルスの製造については、実施例にも説明してある。この点に関して本願では、Ａｄ５アデノウィルスゲノムの修飾された左側部分を有するプラスミド（プラスミドｐＣＯ１−Ｅ４シリーズなど）の構築についても説明してある。これらのプラスミドは、遺伝子治療におけるベクターとしての組換えアデノウィルスの構築に特に有用である。そのようにして、ｐＣＯ１−Ｅ４プラスミドは、Ｅ１の座に相当するヌクレオチド３８２〜３４４６の領域が欠失した、左側ＩＴＲからヌクレオチド６３１６までのアデノウィルスゲノムの左側領域を有しており、その領域にはＥ４の全体または機能性部分が挿入されている。さらに、ｐＣＯ１−Ｅ４プラスミドは多重クローニング部位を持っていることで、対象の異種核酸配列を組み込むことができる。ｐＣＯ１−Ｅ４プラスミドを用いて、不活化Ｅ４領域を有するアデノウィルスのゲノムの右側部分に相当するＤＮＡ（好ましくはウィルス由来）とともにコンピテント細胞系で同時トランスフェクションすることで、欠陥組換えアデノウィルスを得ることができる。後者のＤＮＡに関しては、Ｅ４領域が欠失しているＡｄ２ｄ１８０８（Weinberg et al.，J.Virol.57(1986)833）、Ａｄ５ｄｌ１００４、Ａｄ５ｄｌ１００７、Ａｄ５ｄｌ１０１１またはＡｄ５ｄｌ１０１４などの欠陥ウィルスのゲノムから得ることができる（実施例参照）。この点に関して本発明はさらに、複製性粒子を持たない組換えアデノウィルスの製造方法であって、コンピテント細胞系を、 −Ｅ１領域に欠失を有し、そのＥ１領域または該領域の近辺に少なくともＥ４領域の機能性部分が挿入されている、前記アデノウィルスのゲノムの左側を有してなる第１のＤＮＡ、ならびに −不活化Ｅ４領域および第１のＤＮＡと共通するアデノウィルスの一部を有する、前記アデノウィルスのゲノムの右側部分を少なくとも有してなる第２のＤＮＡによって同時トランスフェクションし、前記ＤＮＡ間の相同的組換えによって産生するアデノウィルスを回収する方法に関するものでもある。使用することができる細胞系では、特に、ヒト胎児腎臓系２９３（Graham et al.，J.Gen.Virol.36(1977)59）が挙げられる。前述のように、この系は特に、そのゲノムに、Ａｄ５ヒトアデノウィルスゲノムの左側部分を有する（１２％）。有利には、本発明の方法においては、第１のＤＮＡはｐＣＯ１−Ｅ４型のプラスミドから選択される。さらに、治療効果を有する遺伝子を有してなる組換えアデノウィルスを得るには、本発明の方法で使用する第１のＤＮＡまたは第２のＤＮＡがさらに、対象の異種ＤＮＡ配列を有する。その後、増殖した組換えウィルスを、ウィルス学の標準的方法に従って回収、精製および増幅する。そのようにして、プラスミドｐＣＯ１−Ｅ４によって、Ｅ１領域にヌクレオチド３８２からヌクレオチド３４４６にかけて欠失を有し、その領域においてはＥ４の全体もしくは機能性部分が挿入されており、さらには適宜に治療効果を有する遺伝子を持つ組換えアデノウィルスを形成することができる。本発明はさらに、上記の１以上の欠陥組換えアデノウィルスを有してなる医薬組成物に関するものでもある。本発明の医薬組成物は、局所投与、経口投与、非経口投与、経鼻投与、静脈投与、筋肉投与、皮下投与、眼内投与、経皮投与など向けに製剤することができる。好ましくは、その医薬組成物は、注射剤向けに医薬的に許容されるビヒクルを含有する。そのようなビヒクルとしては特に、無菌で等張性の塩水（saline）溶液（リン酸一ナトリウムもしくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネシウムなど、またはそのような塩の混合物）、あるいは状況に応じて無菌水もしくは生理食塩水を加えることで注射液を調製することができる乾燥組成物（特には凍結乾燥組成物）が挙げられる。注射に使用されるウィルスの用量は各種パラメータに従って、特には実施する投与形態、問題となる病気、発現させる遺伝子あるいは所望の治療期間に従って調整することができる。一般的に言えば、本発明による組換えアデノウィルスは、１０⁴〜１０¹⁴ｐｆｕ、好ましくは１０⁶〜１０¹⁰ｐｆｕの用量で製剤・投与する。ｐｆｕ（プラーク形成単位）という用語は、ウィルス溶液の感染力に相当し、適切な細胞培養を感染させ、一般には１５日後に感染細胞のプラーク数を測定することで求められる。ウィルス溶液のｐｆｕ力価の測定方法については、文献に詳細に記載されている。挿入する異種ＤＮＡ配列に応じて、本発明のアデノウィルスを用いて、遺伝性疾患（異栄養症、嚢胞性線維症など）、神経変性性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳなど）、癌、凝血障害もしくは異常リポ蛋白血症に関連する病気、ウィルス感染関連の病気（肝炎、ＡＩＤＳなど）等の多くの病気の治療もしくは予防を行うことができる。以下の実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は例示的なものであって、本発明を限定するものではないと考えるべきである。図面の説明図１は、Ａｄ５アデノウィルスの遺伝子構成を示す図である。Ａｄ５の完全な配列はデータベースで入手でき、当業者はあらゆる制限部位を選択もしくは形成し、そうしてゲノムのあらゆる領域を単離することができる。図２は、そのアデノウィルスと系２９３の間の組換えイベントを示す図である。図３は、本発明のある種のベクターおよびそれの系２９３との組換えの線図である。図４は、Ｅ４領域の構成を示す図である。図５は、相互交換した末端を有する本発明のアデノウィルスの線図である。Ｅ４＋は機能性Ｅ４領域を表し、ΔＥ４は非機能性Ｅ４領域を表し、Ψはカプシド形成配列を表す。対象遺伝子発現のためのカセットは図示していないが、本文中に示した方法に従って挿入することができる。図６は、本発明のある種のベクター（ｐＩＸ−ＩＶａ２）の線図である。ｐＩＸ＋ＩＶａ２は、１以上の機能性ＩＶａ２領域を有する。ΔＥ１ΔｐＩＸは、Ψ 領域とＥ２領域の１４０ｋＤの蛋白をコードする領域の末端（位置５２００）との間にあるアデノウィルス配列の欠失を示す。この欠失はさらにＩＶａ２領域をも含み、Ｅ＆ｂ領域の下流で系２９３の染色体に存在する配列に影響を与える。図７は、プラスミドｐＣＯ１に含まれるＨｉｎｄＩＩＩ断片の制限マップである。図８は、発現プラスミドｐＰＹ４０およびｐＰＹ６の線図である。図９は、プラスミドｐＧＹ１０の線図である。図１０は、プラスミドｐＣＯ１−（ＯＲＦ６＋ＯＲＦ７）の線図である。図１１は、プラスミドｐＰＹ７８およびｐＰＹ７７の線図である。図１２は、プラスミドｐＰＹ１５およびｐＪＹ１の線図である。図１３は、本発明によるある種のウィルスの線図である。図１４は、プラスミドｐＸＬ２６７５およびｐＸＬ２７５７の線図である。図１５は、プラスミドｐＰＹ６６、ｐＰＹ８２およびｐＰＹ７５の制限マップの線図である。図１６において、（Ａ）は、レプリコンＨｉｎｃＰ／Ａｄ５とプラスミドｐＰＹ６６の間の相同的組換えの制限マップの線図であり、（Ｂ）は。図１７は、２個のレプリコンｐＰＹ８２とＨｉｎｃＰ／Ａｄ５［ｄｅｌＥ４（ＳａｃＢ＋ＳｐｅｃＲ）］の相同的組換えを介してＨｉｎｃＰ／Ａｄ５［ｄｅｌＥ４（Ｙ＋ＩＴＲ）］を形成するプロトコールである。図１８は、ＨｉｎｃＰ／Ａｄ５［ＩＴＲＹｄｅｌＥ１（ＳａｃＢ＋ＳｐｅｃＲ）ｄｅｌＥ４（Ｙ＋ＩＴＲ）］およびＨｉｎｃＰ／Ａｄ５［ＩＴＲＹｄｅｌＥ１（ＯＲＦ６＋ＯＲＦ７）ｄｅｌＥ４（Ｙ＋ＩＴＲ）］の線図である。図１９は、プラスミドｐＰＹ７０、ｐＰＹ７１およびｐＰＹ７２の制限マップである。図２０は、プラスミドｐＧＹ１２、ｐＧＹ１４およびｐＭＣ２の制限マップである。図２１は、プラスミドｐＰＹ９１、ｐＰＹ９４およびｐＰＹ９２の制限マップである。図２２は、本発明による欠陥ウィルス形成のプロトコールである。一般的分子生物学的方法プラスミドＤＮＡの分取抽出（preparative extraction）、塩化セシウム勾配でのプラスミドＤＮＡの遠心、アガロースもしくはアクリルアミドゲルでの電気泳動、電気溶出によるＤＮＡ断片の精製、フェノールもしくはフェノール−クロロホルムによる蛋白抽出、塩水媒体中でのエタノールもしくはイソプロパノールを用いるＤＮＡ沈殿、大腸菌（Escherichia coli）中での形質転換等の分子生物学で使用される従来の方法は当業者には十分知られており、文献的に十分に記載されている［Maniatis T．et al.，″Molecular Clon1ng，a Laboratory Manual ″，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N．Y.，1982; Ausu bel F.M．et at．(eds)，″Current Protocols in Molecular Biology″，John Wiley & Sons，New York，1987］。ｐＢＲ３２２型およびｐＵＣ型プラスミドならびにＭ１３系のファージは市販のものである(Bethesda Research Laboratories.)。ＤＮＡ断片をその大きさに応じてアガロースもしくはアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、フェノールもしくはフェノール／クロロホルム混合物によって抽出し、エタノールで沈殿させ、次に供給者の指示に従ってファージＴ４ＤＮＡリガーゼ（Biolabs）の存在下にインキュベーションして、連結反応を行うことができる。５’突出（protruding）末端の充填（filling in）は、供給者の説明に従って、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩ（Biolabs）のクレノウ断片を用いて行うことができる。３’突出末端の破壊は、製造者の説明に従って使用するファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Biolabs）の存在下に行う。５’突出末端の破壊は、制御下にＳ１ヌクレアーゼで処理して行う。合成オリゴデオキシヌクレオチドを用いるin vitroでの部位指向性の突然変異誘発を、アマシャム（Amersham）が販売しているキットを用いて、テイラーらが開発した方法（Taylor et al.，Nucleic Acids Res．13(1985)8749-8764）に従って行うことができる。いわゆるＰＣＲ法［ポリメラーゼ連鎖反応 (polymerase-catalyzed chain reaction)，Saiki R.K．et al.，Science 230（1 985）1350-1354; Mullis K.B．and Faloona F.A.，Meth．Enzym ．155（1987）33 5-350］法によるＤＮＡ断片の酵素的増幅を、製造者の説明に従って、「ＤＮＡ熱サイクル装置(DNA thermal cycler)」（Perkin Elmer Cetus）を用いて行うことができる。ヌクレオチド配列の検証は、アマシャムが販売するキットを用いて、サンガーらが開発した方法（Sanger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci,USA,74(197 7)5463-5467）によって行うことができる。実施例１−プラスミドｐＣＯ１の構築（図７）Ａ−プラスミドｐＣＥの構築Ａｄ５アデノウィルスゲノムの左側末端に相当するＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片を最初に、ベクターｐＩＣ１９ＨのＥｃｏＲＩ部位とＸｂａＩ部位の間にクローニングした。これによりプラスミドｐＣＡが得られる。次に、プラスミドｐＣＡをＨｉｎｆＩで切断し、その５’突出末端を大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で満たし(filled in)、次にそれをＥｃｏＲＩで切断した。そうしてプラスミドｐＣＡから得られた、Ａｄ５アデノウィルスゲノムの左側末端を有する断片を次に、ベクターｐＩＣ２０Ｈ(Marsh et al,，Gene 32(1984)481)のＥｃｏＲＩ部位とＳｍａＩ部位との間にクローニングした。これによってプラスミドｐＣＢが得られる。次に、プラスミドｐＣＢをＥｃｏＲＩで切断し、それの５’突出末端を大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で満たし、それをＢａｍＨＩで切断した。そうして得られたプラスミドｐＣＢの断片で、Ａｄ５アデノウィルスゲノムの左側末端を有するものを、ベクターｐＩＣ２０ＨのＮｒｕＩ部位とＢｇｌＩＩ部位の間にクローニングした。これにより、Ａｄ５アデノウィルスの最初の３８２個の塩基対を有し、それに続いて多重クローニング部位を有するという有利な特徴を持つプラスミドｐＣＥが得られる。Ｂ−プラスミドｐＣＤ’の構築最初にＡｄ５アデノウィルスゲノムのＳａｕ３Ａ（３３４６）〜ＳｓｔＩ（３６４５）断片とＳｓｔＩ（３６４５）〜ＮａｒＩ（５５１９）断片を連結し、ベクターｐＩＣ２０ＨのＣｌａＩ部位とＢａｍＨＩ部位の間にクローニングした。これによりプラスミドｐＰＹ５３が得られる。次に、ｄａｍ−コンテクスト(dam -context)から調製した、Ｓａｕ３Ａ（３３４６）部位からＴａｑＩ（５２０７）部位にあるＡｄ５アデノウィルスゲノムの一部を有するプラスミドｐＰＹ５３のＳａｌＩ−ＴａｑＩ断片を、ベクターｐＩＣ２０ＨのＳａｌＩ部位とＣｌａＩ部位の間にクローニングした。それによってプラスミドｐＣＡ’が得られる。次に、ｄａｍ−コンテクストから調製したＡｄ５アデノウィルスゲノムのＴａｑＩ（５２０７）−ＮａｒＩ（５５１９）断片とプラスミドｐＣＡ’のＳａｌＩ−ＴａｑＩ断片とを連結し、ベクターｐＩＣ２０ＨのＳａｌＩ部位とＮａｒＩ部位の間にクローニングした。これにより、プラスミドｐＣＣ’が得られる。次に、ｄａｍ−コンテクストから調製したＡｄ５アデノウィルスゲノムのＮａｒＩ（５５１９）−ＮｒｕＩ（６３１６）断片とプラスミドｐＣＣ’のＳａｌＩ−ＮａｒＩ断片とを連結し、ベクターｐＩＣ２０ＲのＳａｌＩ部位とＮｒｕＩ部位の間にクローニングした。これにより、プラスミドｐＣＤ’が得られる。Ｃ−プラスミドｐＣＯ１の構築プラスミドｐＣＤ’のＸｈｏＩによる部分消化と、次にＳａｌＩによる完全消化を行って、Ｓａｕ３Ａ部位（３４４６）からＮｒｕＩ部位（６３１６）のＡｄ５アデノウィルス配列を有する制限断片が得られる。この断片を、プラスミドｐＣＥのＳａｌＩ部位にクローニングした。これにより、ＨｉｎｆＩ部位（３８２）までのＡｄ５アデノウィルスの左側部分、多重クローニング部位ならびにＡｄ５アデノウィルスのＳａｕ３Ａ（３４４６）−ＮｒｕＩ（６３１６）断片を有するプラスミドｐＣＯ１が得られる（図７）。実施例２−ｐＣＯ１−Ｅ４型のプラスミドの構築（図７）本実施例は、ｐＣＯ１−Ｅ４型のプラスミドの構築、すなわちプラスミドｐＣＯ１（実施例１）におけるアデノウィルスのＥ４領域の全体もしくは機能性部分の組み込みによって得られるプラスミドの構築について説明するものである。２．１．Ｅ４領域全体のクローニング２．１．１．Ｅ４領域の元のプロモーターから発現したもの −プラスミドｐＰＹ２は、大腸菌のｄａｍ＋コンテクストから調製されるプラスミドｐＩＣ２０ＨのＸｂａＩ部位およびＳａｌＩ部位の間へのプラスミドｐＭＳＧ（ファルマシア）のＡｖｒ２−Ｓａｌ１断片（ＭＭＴＶウィルスのプロモーター／ＬＴＲを含む約１．３ｋｂ）のクローニングに相当する。 −プラスミドｐＰＹ４は、ＢａｍＨ１およびＢｇｌ２による開裂後の３５ｂｐ断片の欠失と、それに続く再連結によってプラスミドｐＰＹ２から誘導される。 −プラスミドｐＰＹ５は、プラスミドｐＩＣ２０ＨのＣｌａ１部位とＢａｍＨ１部位の間へのＡｄ５のＥ４領域を含むＴａｑ１−Ｂｇｌ２断片（位置３５５７６〜３２４９０）のクローニングに相当する。そこでこの時点で、このプラスミドにおいては、Ａｄ５のＥ４領域の全体が、多重クローニング部位由来のＥｃｏＲＶ部位およびＳｐｈ１部位によってフランキングされている。プラスミドｐＰＹ５のＥｃｏＲＶによる部分的消化とそれに続くＳｐｈ１による消化によって、Ａｄ５のＥ４領域の全体を含む約３．１ｋｂのＥｃｏＲＶ−Ｓｐｈ１断片を精製することができる。 −プラスミドｐＰＹ４のＳｍａ１部位とＳｐｈ１部位の間にこのＥｃｏＲＶ− Ｓｐｈ１断片をクローニングすることにより、プラスミドｐＰＹ６が得られる（図８）。 −プラスミドｐＰＹ６* は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片（Biol abs）を用いた充填（filling in）による開裂とそれに続く再連結によってＸｂａ１部位が破壊されていること以外は、プラスミドｐＰＹ６と同一である。そうして、プラスミドｐＰＹ６* は、ＲＳＶウィルスのＬＴＲプロモーターの制御下に発現されるＥ４領域の全体（位置３５５７６のＴａｑ１部位からポリアデニル化部位から約３００ｂｐ後に局在する位置３２４９０まで）を有する。プラスミドｐＦＧ１４４［F,L.Graham et al.,EMBO J.(1989)8:2077-2085］は特に、位置３４７７３からのＡｄ５ゲノムの右側末端を含む１１６２ｂｐのＳａｕ３Ａ断片を有する。この断片を次に、プラスミドｐＩＣ２０ＨのＢａｍＨＩ部位にクローニングすることでプラスミドｐＧＹ９が得られる。そのプラスミドにはこの時点で、ベクターに関係する断片の配向の結果として１１８４ｂｐのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片にＳａｕ３Ａ断片が含まれる。この断片を次に、電気溶出によって精製し、ＡｖｒＩＩで切断し、酵素ＭａｅＩＩによって部分的加水分解する。制限産生物の一つは、Ａｄ５のＥ４領域のプロモーターと右側ＩＴＲの境界までを含むＭａｅＩＩ（３５８３５）−ＡｖｒＩＩ（３５４６３）断片に相当する。この３７２ｂｐ断片を次に、電気溶出によって精製し、プラスミドｐＰＹ６* のＡｖｒＩＩ−ＳａｌＩ断片の存在下に、プラスミドｐＣＯＩのＣｌａＩ部位とＳａｌＩ部位の間で連結することで、ｐＣＯＩ−Ｅ４型（図７）であるプラスミドｐＧＹ１０（図９）が得られる。２．１．２．異種プロモーターから発現されたものｉ）ＭＭＴＶウィルスのＬＴＲからの発現プラスミドｐＰＹ６から、ＭＭＴＶＬＴＲ／Ｅ４発現カセットに相当する約４．５ｋｂのＸｈｏ１−Ｓａｌ１断片を得る。このカセットをプラスミドｐＣＯ１のＳａｌ１部位でクローニングすることで、ｐＣＯ１−Ｅ４型であるプラスミドｐＣＯ１−ＭＭＴＶ／Ｅ４（ＩＴＲとΨ配列に関して可能なＥ４領域の２つの配向）が形成される。ｉｉ）ｐＧＲＥ５プロモーターからの発現プラスミドｐＧＲＥ５．１のＸｂａ１断片（約１ｋｂ）のクローニングには、糖質コルチコイドとポリアデニル化シグナル［Mader and White Proc.Natl,Acad ,Sci.(1993)90:5603-5607］によって非常に誘導されやすい最小プロモーターから構成される発現カセットが含まれる。ｄａｍ−コンテクストから調製されるプラスミドｐＩＣ２０ＨのＸｂａ１部位間へのこの断片のクローニングによってプラスミドｐＰＹ２１が形成される。そのプラスミドにおいては、糖質コルチコイド受容体に対する５個の結合部位はこの時点では多重クローニング部位由来のＢｇｌ２部位に隣接して局在している。プラスミドｐＰＹ２１から、糖質コルチコイドによって非常に誘導されやすい最小プロモーターに相当する約０．８ｋｂのＢｇｌ２−ＥｃｏＲ１断片を得る。プラスミドｐＩＣ２０ＨのＢｇｌ２部位とＥｃｏＲ１部位との間へのこの断片のクローニングにより、プラスミドｐＰＹ２６が得られる。プラスミドｐＰＹ５から、Ａｄ５ゲノムの位置３５５７６〜３４９３０のＴａｑ１−Ｈｉｎｄ３断片を含む約０．６５ｋｂのＥｃｏＲＶ−Ｈｉｎｄ３断片を得る。プラスミドｐＩＣ２０ＲのＥｃｏＲＶ部位とＨｉｎｄ３部位の間にこの断片をクローニングすることで、ＥｃｏＲ１部位がこの時点で、Ｔａｑ１部位（位置３５５７６）に近接して局在するプラスミドｐＰＹ２４が得られる。プラスミドｐＩＣ２０ＨのＥｃｏＲ１部位とＳｐｈ１部位の間への、プラスミドｐＰＹ２４のＥｃｏＲ１−Ｈｉｎｄ３断片（０．６５ｋｂ）とプラスミドｐＰＹ５のＨｉｎｄ３−Ｓｐｈ１断片（位置３４９３０〜３２４９０のＡｄ５ＤＮＡを含む約２．４ｋｂ）のクローニングにより、プラスミドｐＰＹ３７が得られる。このプラスミドから、位置３５５７６〜３２４９０のＡｄ５のＥ４領域全体を含む約３．１ｋｂのＥｃｏＲ１−Ｓｐｈ１断片が得られる。プラスミドｐＰＹ２６のＥｃｏＲ１部位とＳｐｈ１部位の間へのこの断片のクローニングにより、Ｅ４領域がｐＧＥ５プロモーターから発現される発現プラスミドｐＰＹ４０（図８）が得られる。このプラスミドでは、Ｅ４領域の第１のスプライシングドナー部位は保持されている。プラスミドｐＰＹ４０のｐＧＲＥ５／Ｅ４発現カセットは、約３．９ｋｂのＢｇｌ２−Ｓａｌ１断片の形で入手でき、それをプラスミドｐＣＯ１のＢａｍＨ１部位とＳａｌ１部位の間にクローニングすることで、ｐＣＯ１−Ｅ４型であるプラスミドｐＣＯ１−ｐＧＲＥ５／Ｅ４が得られる（図７）。２．２．機能性Ｅ４小領域のクローニング２．２．１．Ｅ４領域の元のプロモーターから発現したものｉ）最小ＯＲＦ６＋ＯＲＦ７配列プラスミドｐＧＹ４７’は、プラスミドｐＩＣ２０Ｒの相当する部位間へのプラスミドｐＰＹ６のＢｇｌ２−Ｓａｌ１断片（Ｅ４領域のＯＲＦ６およびＯＲＦ７読み取り枠の全体に等価な位置３４１１５〜３２４９０のＡｄ５のＥ４領域を含む）のクローニングに相当する。プラスミドｐＧＹ４７’では、Ｅ４領域のＯＲＦ６＋ＯＲＦ７領域はこの時点では、約１．６５ｋｂのＣｌａ１−Ｓａｌ１断片に含まれる。位置３５８３５〜３５４６４のＡｄ５配列に相当するＭａｅ２−Ａｖｒ２断片を、Ｍａｅ２による部分的加水分解とＡｖｒ２による全加水分解後の電気溶出によって精製する。次にこの断片をＴａｑ１で加水分解し、プラスミドｐＧＹ４７ ’由来のＣｌａ１−Ｓａｌ１断片（１．６５ｋｂ）の存在下に、Ｍａｅ２−Ｔａｑ１断片（位置３５８３５〜３５５７６）をプラスミドｐＣＯ１のＣｌａ１部位とＳａｌ１部位の間にクローニングする。その反応生成物の一つは、ｐＣＯ１− Ｅ４型であるプラスミドｐＣＯ１−（ＯＲＦ６＋ＯＲＦ７）（図１０）に相当する。別の特に有利な例では、ＯＲＦ７の終止コドンとＢｇｌ２部位の間に位置する配列（位置３２４９０までで、それによりＥ４のポリアデニル化部位を含む）を欠失させ、異種ポリアデニル化部位で置換する。そうして、ＳＶ４０ウィルスの「後期」ポリアデニル化シグナルに相当するＸｂａ１−Ｓａｌ１断片（約０．２５ｋｂ）をプラスミドｐＧＬ３から単離し、ｄａｍ＋コンテクストから調製されるプラスミドｐＩＣ２０Ｈの相当する部位間にクローニングし、それによって、プラスミドｐＰＹ７６が得られる。プラスミドｐＰＹ７６のＫｐｎ１部位とＢａｍＨ１部位の間へのＫｐｎ１−ＢｓｓＨ２断片（Ａｄ５ゲノム上の位置３３５９８〜３３２４９）およびＢｓｓＨ２−Ｓａｕ３Ａ断片（位置３３２４９〜３２８９１）のクローニングにより、プラスミドｐＰＹ７７が得られる（図１１）。このプラスミドから、Ｋｐｎ１−Ｓａｌ１断片（位置３３５９８〜３２８９１にある配列を含む約０．７ｋｂ）を得て、それをプラスミドｐＣＯ１−（ＯＲＦ６＋ＯＲＦ７）の相当する部位間にクローニングすることで、ｐＣＯ１−Ｅ４型であるプラスミドｐＰＹ７８（図１１）が得られる。ｉｉ）ＯＲＦ６配列のみプラスミドｐＰＹ７６のＫｐｎ１部位とＳｍａ１部位の間に、Ｋｐｎ１−ＢｓｓＨ２断片（Ａｄ５ゲノム上の位置３３５９８〜３３２４９）およびＢｓｓＨ２ −Ｐｖｕ２断片（位置３３２４９〜３３１２６）をクローニングすることで、プラスミドｐＰＹ７９が得られる。このプラスミドから、Ｋｐｎ１−Ｓａｌ１断片（位置３３５９８〜３３１２６にある配列を含む約０．５ｋｂ）を得て、それをプラスミドｐＣＯ１−（ＯＲＦ６＋ＯＲＦ７）の相当する部位間にクローニングすることで、ｐＣＯ１−Ｅ４型であるプラスミドｐＣＯ１−（ＯＲＦ６）が得られる。ｉｉｉ）ＯＲＦ３配列のみＥ４領域のＯＲＦ３読み取り枠のみが存在するｐＣＯ１−Ｅ４型のプラスミドも、同様にして形成することができる。実際、ＯＲＦ３のみの発現が、Ｅ４領域が欠失しているウィルスを補足するには十分であることが知られている。２．２．２．異種プロモーターから発現されたものｉ）ＭＭＴＶウィルスのＬＴＲからの発現プラスミドｐＰＹ６のＢｇｌ２−Ｘｂａ１断片（約１．６５ｋｂ）には、位置３４１１５〜３２４９０のＡｄ５配列がある（Ｅ４領域のＯＲＦ６＋ＯＲＦ７）。プラスミドｐＩＣ２０ＨのＢｇｌ２部位とＸｂａ１部位の間にこの断片をクローニングすることで、プラスミドｐＰＹ１３が得られる。このプラスミドはこの時点で、約１．６５ｋｂのＸｈｏ１−Ｓｐｈ１断片中にＡｄ５のＥ４（ＯＲＦ６＋ＯＲＦ７）小領域を有する。プラスミドｐＰＹ４のＳａｌ１部位とＳｐｈ１部位の間にこの断片をクローニングすることで、ＭＭＴＶウィルスのＬＴＲプロモーターの制御下にＡｄ５のＥ４領域の（ＯＲＦ６＋ＯＲＦ７）の発現のためのカセットに相当する約３．１ｋｂのＸｈｏ１−Ｓａｌ１断片を有するプラスミドｐＰＹ１５（図１２）が得られる。プラスミドｐＣＯ１のＳａｌ１部位でこの断片をクローニングすることで、ｐＣＯ１−Ｅ４型であるプラスミドｐＣＯ１−ＭＭＴＶ／（ＯＲＦ６＋ＯＲＦ７）が得られる。ｉｉ）ｐＧＲＥ５プロモーターからの発現プラスミドｐＰＹ１３のＢｇｌ２−Ｓａｌ１断片（約１．６５ｋｂ）には、Ａｄ５のＥ４（ＯＲＦ６＋ＯＲＦ７）小領域がある。プラスミドｐＩＣ２０ＨのＢａｍＨ１部位とＳａｌ１部位の間にこの断片をクローニングすることで、この時点で（ＯＲＦ６＋ＯＲＦ７）小領域が約１．６５ｋｂのＥｃｏＲ１−Ｓｐｈ１断片に含まれるプラスミドｐＰＹ４５が得られる。プラスミドｐＰＹ２６のＥｃｏＲ１部位とＳｐｈ１部位の間にこの断片をクローニングすることで、約２．５ｋｂのＢｇｌ２−Ｓａｌ１断片の形でｐＧＲＥ５プロモーターから発現される（ＯＲＦ６＋ＯＲＦ７）小領域の発現のためのカセットを含むプラスミドｐＪＹ１（図１２）が得られる。プラスミドｐＣＯ１のＢａｍＨ１部位とＳａｌ１部位の間にこのＢｇｌ２−Ｓａｌ１断片をクローニングすることで、ｐＣＯ１−Ｅ４型であるプラスミドｐＣＯ１−ｐＧＲＥ５／（ＯＲＦ６＋ＯＲＦ７）が得られる。実施例３−ｐＣＯ１−Ｅ４型のプラスミドから誘導される組換えアデノウィルスの構築本実施例では、ヌクレオチド３８２からヌクレオチド３４４６までのＥ１領域の欠失、不活化Ｅ４領域およびＥ１欠失に挿入されたＥ４の全体もしくは機能性部分を有する組換えアデノウィルスの構築について説明する。当業者の技術によれば、Ｅ１^-Ｅ４⁺組換えアデノウィルスを系２９３で構築・増殖することができる。例えば、ｐＣＯＩ−Ｅ４型のプラスミドを、Ｅ４領域における修飾／欠失を有するウィルスゲノムの存在下に、２９３細胞に同時トランスフェクションして、この領域を非機能性とする（少なくともＯＲＦ３およびＯＲＦ６に突然変異）。そこでそのようなウィルスは、Ｅ４領域を機能的にトランス補足しない系で非生存性である。それとは対照的に、これらのウィルスは系Ｗ１６２［Weinberg and Ketner Proc.Natl.Acad.Sci.(1983)80:5383-5386］またはフランス特許９４／０４５９０（１９９４年４月１８日）に記載の２９３Ｅ４⁺ 系の一つで事前に増殖しておくことができる。そのようなウィルスには、ウィルスＡｄ２ｄ１８０８［Challberg and Ketn er Virology(1981)114 :196-209］、Ａｄ５ｄｌ１００４、Ａｄ５ｄｌ１００７またはＡｄ５ｄｌ１０１４［Bridge and Ketner J.Virol．(1989)63 :631-638］あるいはＡｄ５ｄｌ１０１１［Bridge et al.，Virology(1993)193 :794-801］等がある。そこで、酵素ＸｍｎＩによって線状化したｐＣＯＩ−Ｅ４型のプラスミドと非機能性Ｅ４領域を有し酵素ＣｌａＩによって制限されたウィルスのウィルスゲノムＤＮＡとの同時トランスフェクションにより、系２９３でのその２つのＤＮＡ間の相同的組換え後に相当するウィルスが得られる。そこでこれらのウィルスは、左側のＩＴＲと機能性カプシド形成配列（例：配列Ψ、ヌクレオチド１〜３８２）と、それに続く機能性プロモーターから発現される機能性Ｅ４領域（完全あるいは少なくともＯＲＦ３またはＯＲＦ６）および例えばＥ４領域の元のプロモーター［ＴａｑＩ（３５５７６）−ＭａｅＩＩ（３５８３５）断片に含まれる］、あるいは誘導可能なプロモーターと次にＡｄ５ゲノムの位置３４４６に局在するＳａｕ３Ａ部位の下流に位置し、右側ＩＴＲまで続き、従って最初のＥ４^-ウィルスに存在するＥ４機能の欠失を含む領域の存在によって識別される（図１３）。例えば、ウィルスＡｄ５ｄ１０１１由来のゲノムの右側にあるＥ４欠失によって識別されるＥ１^-Ｅ４⁺ウィルスは、系２９３で１０¹¹ＰＦＵ／ｍＬを超える力価にて増殖することができる。実施例４−ウィルスゲノムの右側でのΨ配列の導入４．１．Ｅ４領域への（ＳａｃＢ＋ＳｐｅｃＲ）カセットの導入４．１．１．プラスミドｐＰＹ６６の構築プラスミドｐＦＧ１４４由来のＢｃｌ１−Ａｃｒ２断片（約０．５ｋｂ）は、位置３５４６４のＡｖｒ２部位からのＡｄ５ゲノムの右側末端に相当する。大腸菌のｄａｍ−コンテクストから調製されたプラスミドｐＩＣ１９ＨのＸｂａ１部位とＢａｍＨ１部位の間にこの断片をクローニングすることにより、プラスミドｐＰＹ２３が得られる。このプラスミドから、位置３５６１７のＨａｅ３部位までのＡｄ５ゲノムの右側末端を含む約３２０ｂｐのＳａｌＩ−Ｈａｅ３断片を得る。プラスミドｐＩＣ２０ＨのＸｈｏ１部位とＥｃｏＲＶ部位の間にこの断片をクローニングすることで、プラスミドｐＰＹ２９が得られる。次に、位置３２４９０〜３３０９３のＡｄ５ゲノムに相当するＢｇｌ２−Ｓｍａ１断片を、プラスミドｐＰＹ２９のＢａｍＨ１部位とＳｍａ１部位の間にクローニングすることで、プラスミドｐＰＹ６４が得られる。このプラスミドから、Ｘｂａ１−Ｈｉｎｄ３断片を得て、それをプラスミドｐＸＬ２６７５（図１４）の多重クローニング部位の相当する部位間にクローニングすることで、プラスミドｐＰＹ６５が得られる。プラスミドｐＸＬ２６７５（２５１３ｂｐ）は、ＣｏｌＥ１型のレプリコンであり（約１．１５ｋｂのＢｓＡ１−Ｐｖｕ２断片に含まれ、市販のプラスミドｐＢＫＳ＋由来のもの）、大腸菌においてカナマイシン抵抗性を与える遺伝子（Ｔｎ５由来、ファルマシアのプラスミドｐＵＣＫＸＸＸ）および合成多重クローニング部位を有する。プラスミドｐＸＬ２７５７（図１４）から、B．subtilis のＳａｃＢ遺伝子と大腸菌においてスペクチノマイシン抵抗性を与える遺伝子を有する約４ｋｂのＳｍａ１−ＥｃｏＲＶ断片を得る。プラスミドｐＰＹ６５のＳｍａ１部位にクローニングされたこの断片の（ＳａｃＢ＋ＳｐｅｃＲ）カセットにより、プラスミドｐＰＹ６６が得られる（図１５）。４．１．２．大腸菌におけるウィルスゲノムの構築プラスミドｐＰＹ６６を用いて、Ａｄ５から誘導され、大腸菌ｐｏｌＡで機能性であるレプリコンに含まれるウィルスゲノムとの相同的組換えによって（ＳａｃＢ＋ＳｐｅｃＲ）カセットを導入することができる。フランス特許出願９５／０１６３２３に記載の技術は、大腸菌における複製のある種の性質の利用に基づいたものである。実際、不和合性のＨｉｎｃＰ（および例えばＲＫ２）のレプリコンは、ｐｏｌＡ遺伝子によってコードされた酵素の不在下に複製する。逆に、ＣｏｌＥ１型のレプリコン（ｐＵＣ、ｐＩＣ、ｐＢＲなどの型のプラスミド）は、複製するのにこの酵素を必要とする。この知見に基づき、最初にプラスミドｐＦＧ１４４から誘導されるＡｄ５ゲノムをプラスミドＲＫ２（ＨｉｎｃＰ類のもの）にクローニングし、電気穿孔法によってｐｏｌＡ遺伝子に突然変異を起こした大腸菌株に導入した。プラスミドｐＦＧ１４４でＥ３領域に代えて含まれているレプリコンＣｏｌＥ１（ｐＢＲ）を有するＸｂａ１断片をゲノムから欠失させた（フランス特許出願９５／０１６３２３）。これにより、大腸菌ｐｏｌＡ／Ａｄ５と称される大腸菌株が得られる。重要な点は、この株に存在するアデノウィルスゲノムがＩＴＲの各側にあるＰａｃ１部位によってフランキングされていること、ならびにそのようなゲノムが２９３細胞へのトランスフェクション後に感染性であるということである。相同的組換えによる大腸菌ｐｏｌＡ／Ａｄ５への（ＳａｃＢ＋ＳｐｅｃＲ）カセットの導入を、以下のようにして行う。ａ）最初にプラスミドｐＰＹ６６を電気穿孔法によって大腸菌ｐｏｌＡ／Ａｄ５に導入する。スペクチノマイシンおよびカナマイシンの存在下での選択を行う。そこで、抵抗性クローンは、レプリコンＨｉｎｃＰ／Ａｄ５とプラスミドｐＰＹ６６の間の同時組み込みの形成に相当する。実質的に全ての場合で、その２種類のレプリコンの間に、相同的組換えイベントによってプラスミドｐＰＹ６６の挿入が行われている。次に、位置３２４９０〜３３０９３（６０３ｂｐ）のＥ４領域での組換えの結果に相当するクローンを単離する（図１６Ａ）。ｂ）この細菌性クローンは、（ＳａｃＢ＋ＳｐｅｃＲ）カセットの各側に配列（ＡおよびＢ）の「直接反復」を有する。すなわち、一方が６０３ｂｐであり、他方が３２０ｂｐ（ゲノムの右側末端）である。そのような配列が存在すると不安定となり、（ＳａｃＢ＋ＳｐｅｃＲ）カセットの各側で希な相同的組換えイベントを生じる。それらの相同的組換えイベントにより、ｃｏｌＥ１レプリコンの放出と、従ってカナマイシン抵抗性マーカーの喪失が生じる。組換えイベントが最も多く起こるのは、その６０３ｂｐの配列においてであり、それらは開始状態、すなわち未修飾Ｅ４領域を有するアデノウィルスゲノムを再生することから全く価値がなく、そのような組換え体はもはや（ＳａｃＢ＋ＳｐｅｃＲ）カセットを持たないことから、スペクチノマイシン抵抗性を喪失している。従って、それらはこの抗生物質に対して感受性であり、さらに、炭素源としてのショ糖の存在下に成長することができる。それとは対照的に、そのゲノムの右側末端での３２０ｂｐ（配列Ｂ）における相同的組換えイベントにより、最初に存在するＥ４領域の喪失と、（ＳａｃＢ＋ＳｐｅｃＲ）カセットによるそれの置換が生じる（図１６Ａ）。これにより、大腸菌ｐｏｌＡ／Ａｄ５［ｄｅｌＥ４（ＳａｃＢ＋ＳｐｅｃＲ）］と称される大腸菌クローンが得られる。そのようなクローンは、スペクチノマイシン抵抗性であり、唯一の炭素源としてのショ糖の存在下に成長することができない。右側末端が修飾されたそのようなゲノムを有する大腸菌クローンが、それの「カナマイシン感受性」、スペクチノマイシン抵抗性表現型およびショ糖に対する感受性の結果として単離される。４．２．ウィルスゲノムの右側でのΨ配列の導入４．２．１．プラスミドｐＰＹ８２の構築最初に、プラスミドｐＰＹ６* 由来で位置３２４９０〜３３０９３のＡｄ５ゲノムに相当するＳａｌ１−Ｓｍａ１断片を、プラスミドｐＣＯ７の相当する部位間にクローニングすることで、プラスミドｐＰＹ８１を得る。Ｐｓｔ１によるプラスミドｐＣＯ１の全制限と再連結後に得られるプラスミドｐＣＯ７は従って、位置３８２までのＡｄ５の左側末端およびプラスミドｐＣＯ１の多重クローニング部位、それに続く位置３４４５から位置３７８８に局在するＰｓｔ１部位までのＡｄ５配列を有する。プラスミドｐＰＹ８１から、約１．４ｋｂのＨ３−Ｘｂａ１断片を得て、プラスミドｐＸＬ２６７５の相当する部位間にこの断片をクローニングすることで、プラスミドｐＰＹ８２が得られ、それの制限マップを図１５に示してある。４．２．２．大腸菌でのウィルスゲノムの構築右側ＩＴＲに隣接したΨ配列の導入も、電気穿孔法による大腸菌へのプラスミドｐＰＹ８２の導入によってウィルスゲノムＨｉｎｃＰ／Ａｄ５［ｄｅｌＥ４（Ψ＋ＩＴＲ）］を得た後の相同的組換えによって行うことができる。最初に、カナマイシン存在下に、レプリコン融合イベントを選択する。次に、両方のレプリコンに共通する配列３２４９０と３３０９３の間の相同的組換えイベントに相当するクローンを単離する（図１６Ｂ）。次に、十分な数の世代にわたってカナマイシン選択を解除（lift）することで、レプリコンＣｏｌＥ１（プラスミドｐＸＬ２６７５由来）の放出（ejection）イベントを増幅する。次に、炭素源としてのグルコースをショ糖に代えると、ＩＴＲでの相同的組換えによってレプリコンＣｏｌＥ１放出イベントが生じた細菌性クローンが単離され、それによってウィルスゲノムＨｉｎｃＰ／Ａｄ５［ｄｅｌＥ４（Ψ＋ＩＴＲ）］が得られる（図１６Ｂ）。このイベントに相当するクローンである大腸菌ｐｏｌＡ／Ａｄ５［ｄｅｌＥ４（Ψ＋ＩＴＲ）］を単離する。実施例５−ゲノムが左側にΨ配列の欠失を有するウィルスを得る上で有用な構築の開発５．１．ウィルスゲノムの左側への（ＳａｃＢ＋ＳｐｅｃＲ）カセットの導入プラスミドｐＣＯ１のＨｉｎｄ３−ＥｃｏＲＶ断片（約０．４ｋｂ）は、位置３８２までのウィルスゲノムの左側末端を有する。プラスミドｐＸＬ２６７５の相当する部位間にこの断片をクローニングすることにより、プラスミドｐＰＹ８３が得られる。酵素Ｘｂａ１によるプラスミドｐＣＯ１（ｄａｍ＋コンテクストで調製されたもの）の消化、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片による処理および次に再連結によって、プラスミドｐＣＯ１ＤＳａｌが得られる。このプラスミドから、位置３４４６〜４４１９のＡｄ５配列（ＮｓｉＩ部位）を有する約１ｋｂのＢａｍＨ１−Ｎｓｉ１断片を得る。プラスミドｐＩＣ２０ＲのＢａｍＨ１部位とＰｓｔ１部位の間にこの断片をクローニングすることにより、プラスミドＰＹ８６が得られ、そのプラスミドにおいてはこの時点で、位置３４４６と４４１９の間にある配列がＢａｍＨ１−Ｂｇｌ２断片に含まれる。プラスミドｐＰＹ８３のＢａｍＨ１でこの断片をクローニングすることにより、プラスミドｐＰＹ８７が得られる。次に、プラスミドｐＸＬ２７５７の（ＳａｃＢ＋ＳｐｅｃＲ）カセットに相当するＳｍａ１−ＥｃｏＲＶ断片をプラスミドｐＰＹ８７のＥｃｏＲＶ部位にクローニングし、それによりプラスミドｐＰＹ８８が得られる（図１７）。このプラスミドを用い、図１６Ａに示したものと同様の手順に従って、ＨｉｎｃＰ／Ａｄ５［ｄｅｌＥ４（Ψ＋ＩＴＲ）］ゲノムの左側部分をプラスミドｐＰＹ８８由来の相当する部分に代え、それによってＨｉｎｃＰ／Ａｄ５［ＩＴＲΨｄｅｌＥ１（ＳａｃＢ＋ＳｐｅｃＲ）ｄｅｌＥ４（ ΨＩＴＲ）］という名称のウィルスゲノムを得る。それの構造を図１８に示してある。５．２．Ψ配列の欠失と機能性Ｅ４領域の導入５．２．１．プラスミドｐＧＹ５０’の構築基質としてプラスミドｐＹ２３を用い（このプラスミドは、位置３５４６４に局在するＡｖｒ２部位までのアデノウィルスゲノムの右側末端を含む）、オリゴヌクレオチド 5′-CGGCGGGAATTCTTAATTAACATCATCAATAATATACCTTATTTTGG-3′（配列番号２）（ＥｃｏＲ１部位とＰａｃ１部位に下線を施してある）および 5′-C ACCACCTGCAGGGCAGCCATAACAGTCAGCCTTACC-3′（配列番号３）（Ｐｓｔ１部位に下線を施してある）を用いるＰＣＲにより、アデノウィルスゲノムの右側末端を増幅した。そうして、ＰＣＲ増幅によって、Ａｄ５の右側末端に相当する４１８ｂｐの断片が得られ、それにはＩＴＲのすぐ上流にＰａｃ１部位と次にＥｃｏＲ１部位が導入されており、一方Ｐｓｔ１部位は位置３５５１７に隣接して局在している。プラスミドｐＵＣ１９のＥｃｏＲ１部位とＰｓｔ１部位の間にこの断片をクローニングすることで、プラスミドｐＸＬ２６２４が得られる（フランス特許出願９５／０１６３２３参照）。位置３５５７６のＴａｑ１部位からのウィルスゲノムの右側末端に相当するプラスミドｐＸＬ２６２４のＥｃｏＲ１−Ｔａｑ１断片を、プラスミドｐＧＹ４７ ’のＥｃｏ１部位とＣｌａ１部位の間にクローニングし、それによってプラスミドｐＰＹ８９が得られる。このプラスミドから、位置３５５７６までのウィルスゲノムの右側末端と、次に位置３４１１５〜３２４９０のＥ４（ＯＲＦ６＋ＯＲＦ７）小領域を含む約２ｋｂのＥｃｏＲ１−Ｓａｌ１断片を得る。プラスミドｐＸＬ２６７５のＥｃｏＲ１部位とＰｓｔ１部位の間にプラスミドｐＰＹ８９のＥｃｏＲ１−Ｓａｌ１断片とプラスミドｐＣＯ１のＳａｌ１−Ｎｓｉ１断片（位置３４４６〜４４１９のＡｄ５ゲノムを含む）をクローニングすることで、プラスミドｐＧＹ５０’が得られる（図１７）。５．２．２．プラスミドｐＰＹ９０’の構築プラスミドｐＰＹ７８のＫｐｎ１−Ｓｓｔ１断片（約０．９５ｋｂ）は、位置３２８９１と３３５９８の間にありその直後にＳＶ４０ウィルスの「後期」ポリアデニル化シグナルがあるＥ４領域のＣ末端部分に相当する。プラスミドｐＰＹ８９の相当する部位間にこの断片をクローニングすることで、プラスミドｐＰＹ９０が得られる。このプラスミドから、位置３５５７６までのウィルスゲノムの右側末端と、次に位置３４１１５〜３２８９１のＥ４（ＯＲＦ６＋ＯＲＦ７）小領域を有する約２ｋｂのＥｃｏＲ１−Ｓａｌ１断片を得る。プラスミドｐＸＬ２６７５のＥｃｏＲ１部位とＰｓｔ１部位の間にプラスミドｐＰＹ９０のＥｃｏＲ１−Ｓａｌ１断片とプラスミドｐＣＯ１のＳａｌ１−Ｎｓｉ１断片（位置３４４６〜４４１９のＡｄ５ゲノムを含む）をクローニングすることで、プラスミドｐＰＹ９０’が得られる（図１７）。５．２．３．左側末端での機能性Ｅ４領域の導入プラスミドｐＧＹ５０’またはｐＰＹ９０’を用い、図１６Ｂに示したものと同様の手順に従って、ＨｉｎｃＰ／Ａｄ５［ＩＴＲΨｄｅｌＥ１（ＳａｃＢ＋ＳｐｅｃＲ）［ｄｅｌＥ４（Ψ＋ＩＴＲ）］ゲノムの左側部分を前記プラスミド由来の相当する部分に代える。例えば、プラスミドｐＰＹ９０’を用いることで、ＨｉｎｃＰ／Ａｄ５［ＩＴＲＤΨｄｅｌＥ１（ＯＲＦ６＋ＯＲＦ７）［ｄｅｌＥ４（Ψ＋ＩＴＲ）］と称するウィルスゲノムが得られ、それの構造を図１８に示してある。実施例６−ゲノムが右側部位上に新たなＥ４欠失を有するウィルスを得る上で有効な構築の開発６．１．Ψ配列不在下６．１．１．Ｍａｅ２−Ｈａｅ３の欠失（３２８１１〜３５６１７）プラスミドｐＰＹ３２がフランス特許出願９４／０４５９０（１９９４年４月１８日）に記載されている。このプラスミドから、Ｂｇｌ２部位（位置３２４９０）からのＡｄ５ゲノムの右側末端に相当しＭａｅ２部位（位置３２８１１）からＨａｅ３部位（位置３５６１７）までの欠失を有する約０．６５ｋｂのＢｇｌ２−Ｈｉｎｄ３断片を得る。プラスミドｐＸＬ２６７５のＢａｍＨ１部位とＨｉｎｄ３部位の間にこの断片をクローニングすることで、プラスミドｐＰＹ７０が得られ、それの制限マップを図１９に示してある。このプラスミドを用いて、例えば大腸菌ｐｏｌＡ／Ａｄ５［ｄｅｌＥ４（ＳａｃＢ＋ＳｐｅｃＲ）］に、相同的組換えによって、相当するＥ４欠失を導入することができる。６．１．２．Ｔａｑ１−Ａｖｒ２の欠失（３３０５５〜３５４６４）プラスミドｐＧＹ１２は、市販のプラスミドｐＳＬ１１８０のＢｓｓＨ２部位とＥｃｏＲＶ部位の間へのＢｓｓＨ２−Ｍｓｃ１断片（位置３３２４９〜３２７２０）のクローニングに相当する（図２０）。プラスミドｐＧＹ１２のＥｃｏＲ１部位とＢｓｓＨ２部位の間へのプラスミドｐＸＬ２６２４のＥｃｏＲ１−Ｔａｑ１断片（この断片は、位置３５５７６のＴａｑ１部位までのＡｄ５ゲノムの右側末端に相当する）およびＴａｑ１−ＢｓｓＨ２断片（位置３５５７６〜３３２４９）のクローニングにより、プラスミドｐＧＹ１３が得られる。そこでこのプラスミドから、位置３２７２０までのＡｄ５ゲノムの右側末端を含むＥｃｏＲ１ −Ｈｐａ１断片（約３．２５ｋｂ）を得る。プラスミドｐＩＣ２０ＨのＥｃｏＲ１部位とＳｍａ１部位の間にこの断片をクローニングすることで、プラスミドｐＧＹ１４が得られる（図２０）。このプラスミドから、位置３４７００までのＡｄ５ゲノムの右側末端に相当するＥｃｏＲ１−ＢｓｐＨ１断片を得る。ｄａｍ＋コンテクストから調製されるプラスミドｐＩＣ２０ＨのＸｂａ１部位とＥｃｏＲ１部位の間に、Ａｄ５ゲノムのＢｓｐＨ１−Ｘｂａ１断片（位置３３７５０〜３０４７０）と共にこの断片をクローニングすることで、プラスミドｐＭＣ２が得られる（図２０）。Ａｄ５ゲノム上の位置３１２２４と３３０５５の間に局在するＳｐｈ１−Ｔａｑ１断片をプラスミドｐＭＣ２から精製し、次に、プラスミドｐＩＣ２０ＨのＳｐｈ１部位とＣｌａ１部位の間にクローニングすることで、プラスミドｐＹＪ５が得られる。大腸菌ｄａｍ−コンテクストへの転移後、このプラスミドから、位置３２４９０〜３３０５５に位置するウィルスゲノムの配列を含むＢｇｌＩＩ− ＸｂａＩ断片を得る。次に、プラスミドｐＸＬ２６７５のＢａｍＨ１部位とＸｈｏ１部位の間に、プラスミドｐＭＣ２由来であって位置３５４６４に局在するＡｖｒ２部位からのウィルスゲノムの右側末端を含むＡｖｒ２−Ｘｈｏ１断片と共にこのＢｇｌ２−Ｘｂａ１断片をクローニングして、プラスミドｐＰＹ７１が得られる（図１９）。このプラスミドを用いて、例えば大腸菌ｐｏｌＡ／Ａｄ５［ｄｅｌＥ４（ＳａｃＢ＋ＳｐｅｃＲ）］にて、相同的組換えによって相当するＥ４欠失を導入することができる。６．１．３．Ｓｍａ１−Ｓｍａ１の欠失（３３０９３〜３５３５６）Ｓｍａ１によるプラスミドｐＭＣ２の全消化とそれに続く再連結によって、プラスミドｐＭＣ２ＤＳｍａ１が得られる。このプラスミドから、位置３２４９０からのＡｄ５ゲノムの右側末端全体を持ち、位置３３０９３〜３５３５６のＥ４領域に欠失を有する約１．２ｋｂのＢｇｌ２−Ｈｉｎｄ３断片を得る。プラスミドｐＸＬ２６７５のＢａｍＨ１部位とＨｉｎｄ３部位の間にこの断片をクローニングすることで、プラスミドｐＰＹ７２が得られ、それの制限マップを図１９に示してある。このプラスミドを用いて、例えば大腸菌ｐｏｌＡ／Ａｄ５［ｄｅｌＥ４（ＳａｃＢ＋ＳｐｅｃＲ）］にて、相同的組換えによって相当するＥ４欠失を導入することができる。６．２．Ψ配列の存在下６．２．１．Ｓｍａ１−Ｓｍａ１の欠失（３３０９３〜３５３５６）プラスミドｐＧＹ９のＢａｍＨ１−ＥｃｏＲ１断片（約１．２ｋｂ）は、位置３４７７３にＳａｕ３ＡからのＡｄ５ゲノムの右側末端を含む。この制限断片を電気溶出によって精製し、Ｓｍａ１で切断し、次に酵素Ｍａｅ２による部分的加水分解を行う。制限産物の一つは、ＭａｅＩＩ（３５８３５）−ＳｍａＩ（３５３５６）断片に相当する。プラスミドｐＰＹ８２のＳｍａ１部位とＣｌａ１部位の間にこの断片をクローニングすることで、プラスミドｐＰＹ７５が得られる（図１５）。このプラスミドを用いて、例えば大腸菌ｐｏｌＡ／Ａｄ５［ｄｅｌＥ４（ＳａｃＢ＋ＳｐｅｃＲ）（Ψ＋ＩＴＲ）］にて、相同的組換えによって相当するＥ４欠失を導入することができる。６．２．２．Ｔａｑ１−Ｓｍａ１の欠失（３３０５５〜３５３５６）位置３２４９０（多重クローニング部位のＳａｌＩ部位）を含むプラスミドｐＰＹ８２のＴａｑ１断片を、プラスミドｐＩＣ２０ＨのＣｌａ１部位にクローニングし、それにより、多重クローニング部位のＸｈｏ１部位が位置３２４９０に隣接して位置するプラスミドｐＩＣＴａｑが得られる。プラスミドｐＩＣＴａｑから、位置３２４９０〜３３０５５を含むＸｈｏ１− Ｓｍａ１断片を得て、この断片をプラスミドｐＰＹ７５のＳａｌ１部位とＳｍａ１部位の間へのクローニングを行って、プラスミドｐＰＹ９１を得る（図２１）。６．２．３．Ｈｐａ２−Ｓｍａ１の欠失（３２９８０〜３５３５６）位置３２４９０〜３２９８０を含むプラスミドｐＰＹ８２のＳａｌ１−Ｈｐａ２断片を、プラスミドｐＩＣ２０ＨのＳａｌ１部位とＣｌａ１部位の間にクローニングして、プラスミドｐＰＹ９３を得る。このプラスミドから、位置３２４９０〜３２９８０を含むＳａｌ１−ＥｃｏＲＶ断片が得られ、この断片をプラスミドｐＰＹ７５のＳａｌ１部位とＳｍａ１部位の間にクローニングすることで、プラスミドｐＰＹ９４を得る（図２１）。６．２．４．Ｓａｕ３Ａ−Ｓｍａ１の欠失（３２８９１〜３５３５６）位置３２４９０〜３２８９１を含むプラスミドｐＰＹ８２のＳａｕ３Ａ断片を、プラスミドｐＩＣ２０ＨのＢａｍＨ１部位にクローニングして、多重クローニング部位のＳａｌ１部位が位置３２４９０に隣接して位置するプラスミドｐＩＣＳａｕを得る。プラスミドｐＩＣＳａｕから、位置３２４９０〜３２８９１を含むＳａｌ１−Ｓｍａ１断片が得られ、この断片をプラスミドｐＰＹ７５の相当する部位の間にクローニングすることで、プラスミドｐＰＹ９２を得る（図２１）。実施例７−実施例４および５に従って大腸菌で構築した組換えゲノムを用いる２９３細胞のトランスフェクションのプロトコール実施例４および５に記載のプラスミド、あるいは例えば異なったＥ４欠失もしくは修飾された機能性Ｅ４領域によって識別される類似のプラスミドまたは例えば所定の治療効果を有する遺伝子の発現のためのカセット導入に相当する類似のプラスミド等の構築を行って、大腸菌ｐｏｌＡにおいて相同的組換えによって組換えウィルスゲノムが得られる。制限によって検証した後、細菌性クローンを単離し、そのプラスミド内容物を抽出・精製する。次にそのＤＮＡについて酵素Ｐａｃ１による全消化を行い、２９３細胞にトランスフェクションする。このＤＮＡは感染性であり（Ｅ１−Ｅ４＋ウィルス）、約２週間後に細胞病理学的効果（ＣＰＥ）が発現する。次に、ＣＰＥを徐々に２９３細胞で増幅し、ウィルスストックを調製する（フランス特許出願０１６３２３参照）。実施例８−ｐＩＸ領域が移動しているゲノムでの、ウィルス取得のための構築８．１．プラスミドｐＣＯ１−ｐＩＸの構築細胞ゲノムとウィルスＤＮＡの間の組換えが複製性粒子を形成せずに、それのＩＴＲ、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ領域ならびにｐＩＸをコードする配列のみを有するウィルスを形成するような形で、ゲノム内のウィルスｐＩＸをコードする配列の配向を変えることが有用である。そのようなウィルスは欠陥ウィルスであり、組換えアデノウィルスよりかなり小さい。そのためこのウィルスは、ウィルスストック調製時に塩化セシウムでの遠心によって容易に分離することができる（図２２）。オリゴヌクレオチド 5′-GATATCTGAAGATACAGATTGAG-3′（配列番号４）および 5′-CGGCCGTTAAACCGCATTGGGAG-3′（配列番号５）を用いたプラスミドｐＣＯ１のＰＣＲ増幅産生物をプラスミドｐＣＲ２（Invitrogen）にクローニングすることで、プラスミドｐＣＲ２−ｐＩＸを構築した。ＥｃｏＲＶとＢａｍＨ１で消化したプラスミドｐＩＣ２０Ｒに、ｐＣＲ２−ｐＩＸのＥｃｏＲＶ−Ｅａｇ１断片とＳＶ４０のポリＡを含むプラスミドｐＣＩ（Promega）のＥａｇ１−ＢａｍＨ１断片をクローニングすることで、プラスミドｐＩＣ−ｐＩＸ−ｐＡを構築した。オリゴヌクレオチド5′-AAGCTTATTGCCATCATTATGGAC-3′（配列番号６）および 5′-ACTAGTTATTTAGGGGTTTTGCGC-3′（配列番号７）を用いたプラスミドｐＣＯ１のＰＣＲ増幅産生物をプラスミドｐＣＲ２（Invitrogen）にクローニングすることで、プラスミドｐＣＲ２−ＩＶａ２を構築した。ｐＣＲ２−ＩＶａ２のＨｉｎｄ３−Ｓｐｅ１断片とウシ成長ホルモン遺伝子のポリアデニル化シグナルを有するプラスミドｐＣＤＮＡ３（Invitrogen）のＸｂａ１−Ｓｐｈ１断片を、Ｈｉｎｄ３およびＳｐｈ１で消化したプラスミドｐＩＣ２０Ｒにクローニングすることで、プラスミドｐＩＣ−ＩＶａ２−ｐＡを構築した。次に、プラスミドｐＩＣ−ＩＶａ２−ｐＡのＢｓｔＸ１−Ｓａｌ１断片をプラスミドｐＣＯ１のＢｓｔＸ１−Ｓａｌ１部位間にクローニングして、プラスミドｐＣＯ１−＿ｐＩＸを得た。ｐＩＸをコードする遺伝子がアデノウィルスゲノムの配向とは逆で、ＩＶａ２をコードする遺伝子と同方向に配向するように、ｐＩＣ−ｐＩＸ−ｐＡのＣｌａ１カセットをｐＣＯ１−＿ｐＩＸのＣｌａ１部位に導入することで、プラスミドｐＣＯ１− ｐＩＸを構築した。そこで、プラスミドｐＣＯ１−ｐＩＸは、Ａｄ５のＩＴＲ−Ψ配列およびＡｄ５内で天然配向の逆方向に配向したウィルスのｐＩＸ発現のためのカセット（ｐＩＸについてのプロモーターと遺伝子およびそれに続くＳＶ４０のポリＡ）と、次にポリＡがウシ成長ホルモンのもので置換されたＩＶａ２配列を有する。８．２．ウィルスの構築「伝統的な方法で」、Ｘｈｏ１で線状化したプラスミドｐＣＯ１−ｐＩＸとＣｌａ１で消化したウィルスＡｄＲＳＶβＧａ１のウィルスＤＮＡとを２９３細胞中に同時トランスフェクションすることにより、組換えウィルスを構築した。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年１０月１６日【補正内容】１７．ｐＩＸ蛋白をコードする領域の全体とＥ４領域の全体もしくは機能性部分のみがそれらの元の位置から移動しているようなゲノム構成を持つことを特徴とする請求項１に記載の組換えアデノウィルス。１８．前記２領域が、欠失配列の置換物としてＥ１領域に移動していることを特徴とする請求項１７に記載のアデノウィルス。１９．ｐＩＸ蛋白をコードするドメインに相当する読み取り枠が配置され、逆方向に読み取られるものであることを特徴とする請求項１７または１８に記載のアデノウィルス。２０．ＩＴＲおよびカプシド形成領域を含む左側末端とＩＴＲを含む右側末端が相互交換していることを特徴とする請求項１７、１８および１９のいずれか１項に記載のアデノウィルス。２１．ゲノムが不活化Ｅ１領域を有し、且つ、ＩＴＲおよびカプシド形成領域を含む左側末端とＩＴＲおよびＥ４領域の全体もしくは機能性部分を含む右側末端が相互交換していることを特徴とする請求項１に記載の組換えアデノウィルス。２２．左側末端がＡｄ５ゲノムの最初の３８２個のヌクレオチドに含まれ、右側末端がＡｄ５ゲノムの最後の３２１５個のヌクレオチドに含まれることを特徴とする請求項２０または２１に記載の組換えアデノウィルス。２３．ゲノムが不活化したＥ１領域およびＬ５領域を有し、且つ、Ｌ５領域の全体もしくは機能性部分が不活化Ｅ１領域中または該領域の近辺に存在することを特徴とする請求項１に記載の組換えアデノウィルス。２４．前記ＩＴＲとカプシド形成領域を有して成ることを特徴とする請求項１ないし２３のいずれか１項に記載の組換えアデノウィルス。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者オルシニ，セシールフランス国、エフ−75012・パリ、リユ・ドウ・ラ・ブツト、19

Claims

【特許請求の範囲】１．Ｅ１領域が不活化され、ゲノム構成が変更され、且つ産生系のゲノムで可能な組換えを行った場合に非生存性ウィルス粒子を形成するアデノウィルスゲノムを有して成ることを特徴とする組換えアデノウィルス。２．複製および／または増殖に必須の１以上の領域がその元の位置以外のゲノム位置に存在することを特徴とする請求項１に記載の組換えアデノウィルス。３．前記必須領域が、非機能性である別のゲノム領域近辺または該領域にあることを特徴とする請求項２に記載の組換えアデノウィルス。４．非機能性ゲノム領域が、１以上の塩基の突然変異および／または欠失によって不活化された領域であることを特徴とする請求項３に記載の組換えアデノウィルス。５．非機能性領域が、部分的または全体的欠失によって不活化されていることを特徴とする請求項３または４に記載の組換えアデノウィルス。６．非機能性領域が、不活化したＥ１領域および／またはＥ３領域によって表されることを特徴とする請求項２ないし５のいずれか１項に記載の組換えアデノウィルス。７．Ｅ１領域がヌクレオチド４５４からヌクレオチド３３２８のＰｖｕＩＩ− ＢｇｌＩＩ断片の欠失またはヌクレオチド３８２からヌクレオチド３４４６のＨｉｎｆＩＩ−Ｓａｕ３Ａ断片の欠失によって不活化されていることを特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項に記載の組換えアデノウィルス。８．ウィルスの複製および／または生存性に必須の領域が、Ｅ４領域の全体もしくは一部および／またはｐＩＸ−ＩＶａ２領域の全体もしくは一部および／またはｐＩＸ領域の全体もしくは一部および／またはＬ５領域の全体もしくは一部から選択されることを特徴とする請求項２ないし７のいずれか１項に記載の組換えアデノウィルス。９．Ｅ４領域の全体もしくは一部が、Ｅ１領域欠失部位中もしくは該部位近辺に位置するようなゲノム構成を持つことを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１項に記載のアデノウィルス。１０．Ｅ４領域が、ヌクレオチド３５８３５〜３２７２０に相当するＭａｅＩＩ−ＭｓｃＩ断片によって表されることを特徴とする請求項９に記載の組換えアデノウィルス。１１．Ｅ４領域が少なくともコード枠ＯＲＦ３によって表されることを特徴とする請求項９に記載の組換えアデノウィルス。１２．Ｅ４領域が少なくともコード枠ＯＲＦ６によって表されることを特徴とする請求項７または８に記載の組換えアデノウィルス。１３．ｐＩＸ蛋白およびＩＶａ２蛋白をコードする領域の全体が、適宜に、欠失した配列の置換物として、Ｅ３領域中に位置するようなゲノム構成を持つことを特徴とする請求項１ないし７のいずれか１項に記載の組換えアデノウィルス。１４．ｐＩＸ−ＩＶａ２をコードする領域が、Ａｄ５アデノウィルス配列上のヌクレオチド３３２８〜６３１６を有してなるＢｇｌＩＩ−ＮｒｕＩ断片から成ることを特徴とする請求項１３に記載の組換えアデノウィルス。１５．産生系が系２９３であることを特徴とする請求項１に記載の組換えアデノウィルス。１６．ゲノムが不活化したＥ１領域およびＥ４領域を有し、且つ、Ｅ４領域の全体または機能性部分が不活化Ｅ１領域中もしくは該領域付近に存在することを特徴とする組換えアデノウィルス。１７．ｐＩＸ蛋白をコードする領域の全体とＥ４領域の全体もしくは機能性部分のみがそれらの元の位置から移動しているようなゲノム構成を持つことを特徴とする組換えアデノウィルス。１８．前記２領域が、欠失配列の置換物としてＥ１領域に移動していることを特徴とする請求項１７に記載のアデノウィルス。１９．ｐＩＸ蛋白をコードするドメインに相当する読み取り枠の配置が、逆方向に読み取られるものであることを特徴とする請求項１７または１８に記載のアデノウィルス。２０．ＩＴＲおよびカプシド形成領域を含む左側末端とＩＴＲを含む右側末端が相互交換していることを特徴とする請求項１７、１８および１９のいずれか１項に記載のアデノウィルス。２１．ゲノムが不活化Ｅ１領域を有し、且つ、ＩＴＲおよびカプシド形成領域を含む左側末端とＩＴＲおよびＥ４領域の全体もしくは機能性部分を含む右側末端が相互交換していることを特徴とする組換えアデノウィルス。２２．左側末端がＡｄ５ゲノムの最初の３８２個のヌクレオチドに含まれ、右側末端がＡｄ５ゲノムの最後の３２１５個のヌクレオチドに含まれることを特徴とする請求項２０または２１に記載の組換えアデノウィルス。２３．ゲノムが不活化したＥ１領域およびＬ５領域を有し、且つ、Ｌ５領域の全体もしくは機能性部分が不活化Ｅ１領域中または該領域の近辺に存在することを特徴とする組換えアデノウィルス。２４．前記ＩＴＲとカプシド形成領域を有して成ることを特徴とする請求項１ないし２３のいずれか１項に記載の組換えアデノウィルス。２５．異種核酸配列を有することを特徴とする請求項１ないし２４のいずれか１項に記載の組換えアデノウィルス。２６．前記異種核酸配列が１以上の治療効果を有する遺伝子を有して成ることを特徴とする請求項２５に記載の組換えアデノウィルス。２７．前記異種核酸配列が、欠失配列に加えてあるいは欠失配列の置換物として、Ｅ１、Ｅ３またはＥ４領域に存在することを特徴とする請求項２５または２６に記載の組換えアデノウィルス。２８．アデノウィルスゲノムがヒト由来、動物由来またはそれら両方由来のものであることを特徴とする請求項１ないし２７のいずれか１項に記載のアデノウィルス。２９．ヒト由来のアデノウィルスが、群Ｃに分類されるもの、好ましくはアデノウィルス２型もしくは５型（Ａｄ２もしくはＡｄ５）から選択されることを特徴とする請求項２８に記載のアデノウィルス。３０．動物由来のアデノウィルスが、イヌ、ウシ、マウス、ヒッジ、ブタ、トリおよびサル由来のアデノウィルスから選択されることを特徴とする請求項２８に記載のアデノウィルス。３１．少なくとも１つの、請求項１ないし３０のいずれか１項に記載の欠陥組換えアデノウィルスを有して成る医薬組成物。３２．注射剤用として医薬的に許容されるビヒクルを有してなる請求項３１に記載の医薬組成物。３３．左側ＩＴＲからヌクレオチド６３１６までのＡｄ５アデノウィルスゲノムの左側部分を有してなり、且つ、Ｅ１遺伝子に相当するヌクレオチド３８２〜３４４６にある領域を欠失し該領域にはＥ４の全体もしくは機能性部分が挿入されているｐＣＯ１−Ｅ４プラスミド。３４．複製性粒子を持たない組換えアデノウィルスの製造方法において、コンピテント細胞系を、 −Ｅ１領域に欠失を有し、そのＥ１領域中または該領域の近辺に少なくともＥ４領域の機能性部分が挿入されている、前記アデノウィルスのゲノムの左側部分を有してなる第１のＤＮＡ、ならびに −不活化Ｅ４領域および第１のＤＮＡと共通の部分を有する、前記アデノウィルスのゲノムの右側部分を少なくとも有してなる第２のＤＮＡによって同時トランスフェクションし、組換えによって産生するアデノウィルスを回収することを特徴とする方法。３５．前記細胞系が系２９３であることを特徴とする請求項３４に記載の方法。３６．第１のＤＮＡがｐＣＯ１−Ｅ４型のプラスミドから選択されることを特徴とする請求項３４に記載の方法。３７．前記第１または第２のＤＮＡがさらに、対象とする異種ＤＮＡ配列を有することを特徴とする請求項３４ないし３６のいずれか１項に記載の方法。