JPH10507934A - 代謝指向型グルタミン酸受容体に活性を示す化合物を同定するためのキメラ受容体および方法、ならびに神経学的障害および疾患の治療におけるそのような化合物の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はキメラ受容体を提供する。キメラ受容体は、代謝指向型グルタミン酸受容体の領域に相同な少なくとも１つの領域、およびカルシウム受容体に相同な少なくとも１つの領域を含む。本発明はまた、そのようなキメラ受容体を製造する方法、およびそのような受容体を用いて代謝指向型グルタミン酸受容体またはカルシウム受容体の活性を調節する化合物を同定し特徴づける方法を含む。本発明はまた、代謝指向型グルタミン酸受容体の活性を調節するか、または代謝指向型グルタミン酸受容体に結合する化合物および方法に関する。代謝指向型グルタミン酸受容体の活性の調節は、鎮痛効果、認知増強、および筋弛緩効果を含む、神経学的傷害および疾患の治療等の種々の目的に用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 代謝指向型グルタミン酸受容体に活性を示す化合物を同定するための キメラ受容体および方法、ならびに神経学的障害および疾患の治療における そのような化合物の使用 発明の分野 本発明は、代謝指向型グルタミン酸受容体に相同な一つもしくは複数の領域、 およびカルシウム受容体に相同な一つもしくは複数の領域を含むキメラ受容体に 関する。 発明の背景 以下の記述により本発明に関する情報の概要が提供される。これは、本明細書 に提供される情報のいずれかが特許請求の範囲に記載される本発明に対する従来 の技術であるか、あるいは具体的にもしくは暗示的に引用される刊行物のいずれ かが前記発明に対する従来の技術であるということの承諾ではない。 グルタミン酸は哺乳類の脳における主要な興奮性伝達物質である。グルタミン 酸は細胞表面受容体に結合し、そしてそのことによってその受容体を活性化する ことにより中枢のニューロンに影響を及ぼす。これらの受容体は２つの主要クラ スであるイオンチャンネル内蔵型（ｉｏｎｏｔｒｏｐｉｃ）および代謝指向型（ ｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｉｃ）グルタミン酸受容体に既に細分されているが、その 細分は受容体蛋白質の構造特性、受容体がシグナルを細胞内へ伝達する方法、お よび薬理学的特性に基づく。 イオンチャンネル内蔵型グルタミン酸受容体（ｉＧｌｕＲ）は、グルタミン酸 結合の際に開口して所定の一価および二価のカチオンの選択的内向き電流を生じ させ、そしてそのことにより細胞膜を脱分極させるリガンド依存型イオンチャン ネル（ｌｉｇａｎｄ−ｇａｔｅｄ ｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ）である。それに加 え、比較的高いカルシウム透過性を有する所定のｉＧｌｕＲは様々なカルシウム 依存的細胞内過程を活性化させ得る。これらの受容体は自然界ではホモメリック もしくはヘテロメリックでありうるマルチサブユニット蛋白質複合体である。様 々なｉＧｌｕＲサブユニットは全て共通の構造的モチーフを共有しており、これ らのモチーフは、比較的大きなアミノ末端細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、その後に 続く２つの膜スパニング領域（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ ｒｅｇｉ ｏｎ）（ＴＭ）を含む複数回貫膜ドメイン（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｒａｎｓｍｅ ｍｂｒａｎｅ ｄｏｍｅｉｎ）（ＴＭＤ）、第二の小さい細胞内ループ、および 第三のＴＭを含み、そして末端に至る前には細胞内カルボキシ末端ドメイン（Ｃ Ｔ）を含む。歴史的にｉＧｌｕＲは最初、アゴニストであるアルファ−アミノ− ３−ヒドロキシ−５−メチル−イソオキサゾール−４−プロピオン酸（ＡＭＰＡ ）、カイニン酸（ＫＡ）、およびＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ） による優先的活性化に基づき、薬理学的に３つの分類に細分された。後に、分子 クローニングによる調査と追加的な薬理学的研究とを組み合わせて、ＡＭＰＡ、 ＫＡ、およびＮＭＤＡ受容体の複数のサブタイプが哺乳類ＣＮＳで発現される、 より多岐にわたるｉＧｌｕＲの種類が見いだされた（Ｈｏｌｌｍａｎ ａｎｄ Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：３１、１９９４ ）。 代謝指向型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）は、グルタミン酸もしくは他の 強力なアゴニスト（これにはキスカル酸および１−アミノシクロペンタン−１， ３−ジカルボン酸（トランス−ＡＣＰＤ）が含まれる）の結合の後に様々な細胞 内第二メッセンジャーシステムを活性化することが可能なＧ蛋白質共役型（Ｇｐ ｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ）受容体である（Ｓｃｈｏｅｐｐ ｅｔ ａｌ． 、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１１：５０８、１９９０；Ｓｃ ｈｏｅｐｐ ａｎｄ Ｃｏｎｎ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ． １４：１３、１９９３）。 インサイチューでの異なる代謝指向型グルタミン酸受容体サブタイプの活性化 により、以下に記載の応答の内の一つもしくは複数が誘導される：ホスホリパー ゼＣの活性化、ホスホイノシチド（ＰＩ）加水分解の増加、細胞内カルシウム放 出、ホスホリパーゼＤの活性化、アデニリルシクラーゼの活性化もしくは阻害、 サイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の形成の増加および減少、グアニ リルシクラーゼの活性化、サイクリックグアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）の形成 の増加、ホスホリパーゼＡ₂の活性化、アラキドン酸放出の増加、ならびに電位 依存型イオンチャンネル（ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ ｉｏｎ ｃｈａｎｎｅ ｌ）およびリガンド依存型イオンチャンネルの活性の増加もしくは減少（Ｓｃｈ ｏｅｐｐ ａｎｄ Ｃｏｎｎ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１ ４：１３、１９９３；Ｓｃｈｏｅｐｐ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．２４：４ ３９、１９９４；Ｐｉｎ ａｎｄ Ｄｕｖｏｉｓｉｎ、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａ ｃｏｌｏｇｙ ３４：１、１９９５）。 これまでには８つの異なるｍＧｌｕＲサブタイプが分子クローニングを介して 既に単離されており、そして発見された順に従いｍＧｌｕＲ１〜ｍＧｌｕＲ８と 命名されている（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ、Ｎｅｕｒｏｎ １３：１０３１、１９９ ４、Ｐｉｎ ａｎｄ Ｄｕｖｏｉｓｉｎ、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３４：１、１９９５；Ｋｎｏｐｆｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ ．３８：１４１７、１９９５）。所定のｍＧｌｕＲサブタイプの別のスプライス 形態の発現を介すると、更に別の分岐種が生じる（Ｐｉｎ ｅｔ ａｌ．、ＰＮ ＡＳ ８９：１０３３１、１９９２；Ｍｉｎａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．、ＢＢＲ Ｃ １９９：１１３６、１９９４）。全てのｍＧｌｕＲは、大きいアミノ末端細 胞外ドメイン（ＥＣＤ）およびその後に続く仮想的７回貫膜ドメイン（７ＴＭＤ ）（これは、３本の細胞内ループおよび３本の細胞外ループにより連結される７ 本の仮想的膜スパニングヘリックスを含む）、ならびに種々の長さの細胞内カル ボキシ末端ドメイン（細胞質テイル）（ＣＴ）を保持する単一サブユニット膜蛋 白質であるという点で構造的に類似する（概略図１ａを参照されたい）。 この８つのｍＧｌｕＲは、アミノ酸配列の同一性、利用する第二メッセンジャ ーシステム、および薬理学的特性に基づき、３つのグループに細分されている（ Ｎａｋａｎｉｓｈｉ、Ｎｅｕｒｏｎ １３：１０３１、１９９４；Ｐｉｎｅ ａ ｎｄ Ｄｕｖｏｉｓｉｎ、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３４：１、１ ９９５；Ｋｎｏｐｆｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：１４１ ７、１９９５）。所定のグループ内でのｍＧｌｕＲ間のアミノ酸同一性は約７０ ％であるが、異なるグループのｍＧｌｕＲ間では約４０％に減少する。同グ ループのｍＧｌｕＲについては、この関連性はおおまかにはシグナル伝達メカニ ズムおよび薬理学的特性における類似性に対応する。 グループＩのｍＧｌｕＲは、ｍＧｌｕＲ１、ｍＧｌｕＲ５、および別のスプラ イシングを受けたそれらの変異体を含む。これらの受容体に対するアゴニストの 結合によりホスホリパーゼＣの活性化およびその後に続く細胞内カルシウムの移 動がもたらされる。たとえば、組換えｍＧｌｕＲ１受容体を発現するゼノパス（Ｘｎｏｐｕｓ ）卵母細胞が、電気生理学的手段により間接的にその効果を示すた めに既に利用されている（Ｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３４９：７ ６０、１９９１；Ｐｉｎ ｅｔ ａｌ．、ＰＮＡＳ ８９：１０３３１、１９９ ２）。同様の結果が、組換えｍＧｌｕＲ５受容体を発現する卵母細胞を用いて達 成された（Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１３３６ １、１９９２；Ｍｉｎａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．、ＢＢＲＣ １９９：１１３６ 、１９９４）。別法では、チャイニーズ（Ｃｈｉｎｅｓｅ）ハムスター卵巣（Ｃ ＨＯ）細胞内で発現された組換えｍＧｌｕＲ１受容体のアゴニスト活性化は、標 準的生化学的アッセイにより測定した際には、ＰＩ加水分解、ｃＡＭＰ形成、お よびアラキドン酸放出を刺激した（Ａｒａｍｏｒｉ ａｎｄ Ｎａｋａｎｉｓｈ ｉ、Ｎｅｕｒｏｎ ８：７５７、１９９２）。それと比較すると、ＣＨＯ細胞内 で発現されたｍＧｌｕＲ５受容体の活性化は、ＰＩ加水分解およびその後に続く 細胞内カルシウムの一過性変化（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）を刺激したが、ｃＡＭＰ 形成もしくはアラキドン酸放出の刺激化は観察されなかった（Ａｂｅ ｅｔ ａ ｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１３３６１、１９９２）。グループＩ のｍＧｌｕＲについてのアゴニスト力価の概要は、キスカル酸＞グルタミン酸＝ イボテン酸＞（２Ｓ，１’Ｓ，２’Ｓ）−２−カルボキシシクロプロピル）グリ シン（Ｌ−ＣＣＧ−Ｉ）＞（１Ｓ，３Ｒ）−１−アミノシクロペンタン−１，３ −ジカルボン酸（ＡＣＰＤ）である。キスカル酸は、グループ１１およびグルー プＩＩＩのｍＧｌｕＲと比較してグループＩの受容体については比較的選択的で あるが、これはまたイオンチャンネンル内蔵型ＡＭＰＡ受容体を強く活性化させ る（Ｐｉｎ ａｎｄ Ｄｕｖｏｉｓｉｎ、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ 、３４：１、Ｋｎｏｐｆｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８ ：１４１７、１９９５）。 グループＩＩのｍＧｌｕＲにはｍＧｌｕＲ２およびｍＧｌｕＲ３が含まれる。 ＣＨＯ細胞内で発現されたこれらの受容体の活性化は、百日咳毒素感受性様式で 阻害性Ｇ蛋白質Ｇ_iを介してアデニリルシクラーゼ活性を阻害する（Ｔａｎａｂ ｅ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｎ ８：１６９、１９９２；Ｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：１３７２、１９９３）。グループＩＩ受容 体についてのアゴニスト力価の概要は、Ｌ−ＣＣＧ−Ｉ＞グルタミン酸＞ＡＣＰ Ｄ＞イボテン酸＞キスカル酸である。予備実験により、Ｌ−ＣＣＧ−Ｉおよび（ ２Ｓ，１’Ｒ，２’Ｒ，３’Ｒ）−２−（２，３−ジカルボキシシクロプロピル ）グリシン（ＤＣＧ−ＩＶ）は双方ともグループＩＩの受容体について比較的選 択的なアゴニストであることが示唆される（Ｋｎｏｐｆｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｊ ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：１４１７、１９９５）。 グループＩＩＩのｍＧｌｕＲには、ｍＧｌｕＲ４、ｍＧｌｕＲ６、ｍＧｌｕＲ ７、およびｍＧｌｕＲ８が含まれる。グループＩＩの受容体同様、これらのｍＧ ｌｕＲは、ＣＨＯ細胞内で発現される場合には、百日咳毒感受性様式でアデニレ ートシクラーゼに対して負に共役して細胞内ｃＡＭＰ蓄積を阻害する（Ｔａｎａ ｂｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：１３７２、１９９３；Ｎａ ｋａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１１８６８、 １９９３；Ｏｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９： １２３１、１９９４；Ｄｕｖｉｏｉｓｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃ ｉ．１５：３０７５、１９９５）。グループとしてのそれらのアゴニスト効力の 概要は、（Ｓ）−２−アミノ−４−ホスホノ酪酸（Ｌ−ＡＰ４）＞グルタミン酸 ＞ＡＣＰＤ＞キスカル酸であるが、ｍＧｌｕＲ８は僅かに異なり、グルタミン酸 はＬ−ＡＰ４より強い効力を示す（Ｋｎｏｐｆｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ ．Ｃｈｅｍ．３８：１４１７、１９９５；Ｄｕｖｏｉｓｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：３０７５、１９９５）。Ｌ−ＡＰ４および（Ｓ）− セリン−Ｏ−リン酸（Ｌ−ＳＯＰ）の双方共がグループＩＩＩの受容体に対して 比較的選択性のアゴニストである。 最後に、８つのｍＧｌｕＲサブタイプは哺乳類ＣＮＳにおける独特な発現パタ ーンを有しており、多くの場合においてそのパターンは重複している（Ｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３４９：７６０、１９９１；Ｍａｒｔｉｎ ｅ ｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｎ ９：２５９、１９９２；Ｏｈｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ ．、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５３：１００９、１９９３；Ｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：１３７２；Ｏｈｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎ ｅｕｒｏｎ １３：５５、１９９４、Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ ｈｅｍ．２６７：１３３６１、１９９２；Ｎａｋａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１１８６８、１９９３；Ｏｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９；１２３１、１９９４；Ｄｕｖｏｉ ｓｌｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：３０７５、１９９５）。 その結果、所定のニューロンはだた一つの特定のｍＧｌｕＲサブタイプを発現で あろうが、他のニューロンは細胞上の類似するおよび／または異なる位置に局在 していてもよい複数のサブタイプを発現するであろう（すなわち、シナプス後樹 状突起および／または細胞体 対 シナプス前軸索終末）。従って、所定のニュ ーロンにおけるｍＧｌｕＲ活性化の機能面での結果は、発現される特定のｍＧｌ ｕＲ；グルタミン酸に対する受容体の親和性および細胞が露出されるグルタミン 酸の濃度；受容体により活性化されるシグナル伝達経路；ならびに細胞上の受容 体の位置に依存するであろう。所定の脳領域におけるｍＧｌｕＲ発現ニューロン 間での多重相互作用により、更に高レベルの複雑さが導入されうる。これらの複 雑さおよびサブタイプ−特異的ｍＧｌｕＲアゴニストおよびアンタゴニストの欠 如の結果として、神経機能に影響を及ぼす生理学的および病態生理学的過程にお ける特定のｍＧｌｕＲの役割は厳密には定義されていない。それにもかかわらず 、利用可能なアゴニストおよびアンタゴニストに関する研究により、グループＩ ＩおよびグループＩＩＩのｍＧｌｕＲと比較してグループＩのｍＧｌｕＲに関す るいくつかの一般的見識が得られている。 グループＩのｍＧｌｕＲの生理学的役割を解明する試みにより、これらの受容 体の活性化は神経的興奮を誘発することが示唆される。様々な研究により、ＡＣ ＰＤは海馬、大脳皮質、小脳、および視床、ならびに他の脳領域のニューロンに 対して適用したとき、シナプス後興奮を生成し得ることが既に示されている。こ の興奮はシナプス後ｍＧｌｕＲの直接的活性化に起因することが証拠により示さ れるが、ただし更にこの興奮はシナプス前ｍＧｌｕＲの活性化によって媒介され て神経伝達物質放出の増加をもたらすことも既に示唆されている（Ｂａｓｋｙｓ 、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１５：９２、１９９２；Ｓｃｈ ｏｅｐｐ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．２４：４３９、１９９４；Ｐｉｎ ａ ｎｄ Ｄｕｖｏｉｓｉｎ、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３４：１）。 薬理学的実験によりグループＩのｍＧｌｕＲがこの刺激化の媒介物であることが 暗示される。ＡＣＰＤの効果は、ｉＧｌｕＲアンタゴニストの存在下での低濃度 のキスカル酸により再生することができ（Ｈｕ ａｎｄ Ｓｔｏｒｍ、Ｂｒａｉ ｎ Ｒｅｓ．５６８：３３９、１９９１；Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２９：２７６、１９９２）、そしてｍＧｌｕＲ１ を活性化することが知られている２つのフェニルグリシン化合物、（Ｓ）−３− ヒドロキシフェニルグリシン（（Ｓ）−３ＨＰＧ）および（Ｓ）−３，５−ジヒ ドロキシフェニルグリシン（（Ｓ）−ＤＨＰＧ）もまた興奮を生じる（Ｗａｔｋ ｉｎｓ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｇｒｉｄｇｅ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏ ｌ．Ｓｃｉ．１５：３３３、１９９４）。それに加え、興奮は、ｍＧｌｕＲ１ア ンタゴニストとして知られる化合物である（Ｓ）−４−カルボキシフェニルグリ シン（（Ｓ）−４ＣＰＧ）、（Ｓ）−４−カルボキシ−３−ヒドロキシフェニル グリシン（（Ｓ）−４Ｃ３ＨＰＧ）、および（＋）−アルファーメチル−４−カ ルボキシフェニルグリシン（（＋）−ＭＣＰＧ）により遮断することができる（ Ｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２４４：１９５ 、１９９３；Ｗａｔｋｉｎｓ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｇｒｉｄｇｅ、Ｔｒｅｎｄ ｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１５：３３３、１９９４）。 ｍＧｌｕＲの生理学的役割を調べる他の研究により、シナプス前ｍＧｌｕＲの 活性化は、神経伝達物質の放出を阻害することにより興奮性および阻害性の両シ ナプス伝達を遮断し得ることが示されている（Ｐｉｎ ａｎｄ Ｄｕｖｏｉｓｉ ｎ、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３４：１）。ＡＣＰＤによる興奮性 シナプス伝達のシナプス前遮断は、既に、視覚皮質、小脳、海馬、線条、および 小脳扁桃のニューロンにおいて観察されており（Ｐｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒ ｒ．Ｄｒｕｇｓ：Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ １：１１１、１９９３）、一方で阻害的シナプス伝達の類似遮断が線条および嗅 球において示されている（Ｃａｌｂｒｅｓｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ．Ｌｅｔｔ．１３９：４１、１９９２；Ｈａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ ｕｒｅ ３６６：６８７、１９９３）。多数の証拠により、グループＩＩのｍＧ ｌｕＲは、このシナプス前阻害を媒介することが示唆される。他のニューロンに おける神経伝達物質放出のシナプス前阻害を媒介することが知られるアルファ₂ −アドレナリン作動性受容体およびＳＨＴ_1A−セロトニン作動性受容体同様に、 グループＩＩのｍＧｌｕＲはアデニリルシクラーゼの阻害と強く共役している。 ＡＣＰＤの阻害効果はまたＬ−ＣＣＧ−ＩおよびＤＣＧ−ＩＶ（これらはグルー プＩＩのｍＧｌｕＲの選択的アゴニストである）により模倣することができる（ Ｈａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３６６：６８７、１９９３；Ｊ ａｎｅ ｅｔ ａｌ．、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１２：８０９、１９ ９４）。それに加え、ｍＧｌｕＲ２の活性化は、その受容体が交感神経性ニュー ロンにおいて発現されるときにシナプス前Ｎ−タイプカルシウムチャンネル活性 を強く阻害し得ることが既に示されており（Ｉｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｕ ｒｏｎ １４：１０２９、１９９５）、そしてそれらのチャンネルの不活化は神 経伝達物質の放出を阻害することが知られている。最後に、グループＩＩのｍＧ ｌｕＲに対して選択的な濃度のＬ−ＣＣＧ−Ｉが、ラット線条体切片からの³Ｈ −吸引液の脱分極誘発放出を阻害することが既に観察されている（Ｌｏｍｂａｒ ｄｉ ｅｔ ａｌ．、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１０：１４０７、１９ ９３）。シナプス後レベルでのグループＩＩ ｍＧｌｕＲ活性化の生理学的効果 についての証拠は限定されている。しかしながら、ある研究により、Ｌ−ＣＣＧ −Ｉのシナプス後作用が培養間脳ニューロンでのＮＭＤＡレセプター活性化を阻 害し得ることが示唆される（Λｍｂｒｏｓｉｎｉ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｐｈ ａｒｍａｃｏｌ．４７：１０５７、１９９５）。 生理学的研究により、Ｌ−ＡＰ４もまた様々なＣＮＳニューロンにおける興奮 性シナプス伝達を阻害し得ることが既に示されている。これらのニューロンには 、皮質、海馬、小脳扁桃、嗅球、および脊髄のニューロンが含まれる（Ｋｏｅｒ ｎ ｅｒ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ａｇｏｎｉｓｔｓ ａｎｄ Ａｎ ｔａｇｏｎｉｓｔｓ ｐ．３０８、１９９２；Ｐｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒ ．Ｄｒｕｇｓ：Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ １ ：１１１、１９９３）。累積された証拠により、阻害はシナプス前ｍＧｌｕＲの 活性化により媒介されていることが示される。Ｌ−ＡＰ４の効果はＬ−ＳＯＰに より模倣することができ、そしてこれら２つのアゴニストはグループＩＩＩのｍ ＧｌｕＲについて選択的であるため、このｍＧｌｕＲグループのメンバーはシナ プス前阻害の媒介物であることが暗示される（Ｓｃｈｏｅｐｐ、Ｎｅｕｒｏｃｈ ｅｍ．Ｉｎｔ．２４：４３９、１９９４；Ｐｉｎ ａｎｄ Ｄｕｖｏｉｓｉｎ、 Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３４：１）。嗅球ニューロンでは、ｍＧ ｌｕＲのＬ−ＡＰ４活性化がシナプス前カルシウム電流を阻害することが既に示 されている（Ｔｒｏｍｂｌｅｙ ａｎｄ Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ ｓｃｉ．１２：２０４３、１９９２）。従って、グループＩＩＩのｍＧｌｕＲの 活性化により産生されるシナプス前阻害のメカニズムはグループＩＩのｍＧｌｕ Ｒのものに類似する、すなわち、Ｎ−タイプのカルシウムチャンネルの遮断およ び神経伝達物質放出の阻害であるように思われる。Ｌ−ＡＰ４は更に、シナプス 後に作用して網膜の両極細胞における過分極を生じさせることが知られている。 この作用はこれらの細胞におけるｃＧＭＰホスホジエステラーゼに共役するｍＧ ｌｕＲの活性化が原因であるかもしれないことが既に示唆されている（Ｓｃｈｏ ｅｐｐ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．２４：４３９、１９９４；Ｐｉｎ ａｎ ｄ Ｄｕｖｏｉｓｉｎ、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３４：１）。 アゴニスト、アンタゴニスト、およびｍＧｌｕＲを発現する組換え脊椎動物細 胞株を用いる代謝指向型グルタミン酸受容体の活性化の研究を用いて、異なる代 謝指向型グルタミン酸受容体の刺激化および阻害の細胞性効果が評価されている 。たとえば、ゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞で発現されたｍＧｌｕＲ１の アゴニスト刺激により、電気生理学的技術を間接的に用いて評定して、細胞内カ ルシウムの移動に対する受容体活性化の共役が示された（Ｍａｓｕ ｅｔ ａｌ ．、Ｎａｔｕｒｅ ３４９：７６０−７６５、１９９１）。ＣＨＯ細胞で発現さ れた ｍＧｌｕＲ１のアゴニスト刺激は、ＰＩ加水分解、ｃＡＭＰ形成、およびアラキ ドン酸放出を刺激した（Ａｒａｍｏｒｉ ａｎｄ Ｎａｋａｎｉｓｈｉ、Ｎｅｕ ｒｏｎ ８：７５７−７６５、１９９２）。ＣＨＯ細胞で発現されたｍＧｌｕＲ ５のアゴニスト刺激もＰＩ加水分解を刺激し、これは蛍光カルシウムキレーター ｆｕｒａ−２を細胞に負荷することにより評定してサイトゾルカルシウムの一 過性増大と関連することが示された（Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ ｈｅｍ．２６７：１３３６１−１３３６８、１９９２）。ＣＨＯ細胞におけるｍ ＧｌｕＲ１およびｍＧｌｕＲ５のアゴニスト誘導性活性化により誘導されるＰＩ 加水分解はＡＰ３およびＡＰ４（これらは両方共インサイチューでグルタミン酸 刺激化ＰＩ加水分解のアンタゴニストである）による拮抗作用は受けなかった（ Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３３：１９３１−１９３５、１９８６；Ｓｃｈｏｅｐｐ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５３：２７３−２７８、１９８９） 。ｍＧｌｕＲ２（Ｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｎ ８：１６９−１ ７９、１９９２）もしくはｍＧｌｕＲ７（Ｏｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２３１−１２３６、１９９４）を発現するＣＨ Ｏ細胞のアゴニスト刺激によりｃＡＭＰ形成の受容体媒介性阻害がもたらされ、 そして更にインサイチューで以前に観察されたリガンド特異性も確認された。部 位特異的突然変異誘発を組み合わせて、アゴニストを用いる研究も実施され、グ ルタミン酸結合において重要な役割を担う特異的アミノ酸が明らかにされた（Ｏ ’Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｎ １１：４１−５２、１９９３）。 代謝指向型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）は、発作、頭部創傷、脊髄損傷 、癲癇、虚血、低血糖症、低酸素症、およびたとえばアルツハイマー（Ａｌｚｈ ｅｉｍｅｒ’ｓ）病のような神経変性性疾患を初めとする様々な神経学的病理に おける関与が既に暗示されている（Ｓｃｈｏｅｐｐ ａｎｄ Ｃｏｎｎ、Ｔｒｅ ｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１４：１３、１９９３；Ｃｕｎｎｉｎｇ ｈａｍ ｅｔ ａｌ．、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．５４：１３５、１９９４；Ｐｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３４：１、１９９５；Ｋ ｎｏｐｆｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：１４１７、１９９ ５）。痛覚および無痛覚における代謝指向型グルタミン酸受容体についての役割 もまた既に示されている（Ｍｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒ ｔ ４：８７９、１９９３）。代謝指向型グルタミン酸受容体もまた、海馬の長 期活性化（ｐｏｔｅｎｔｉｏｎａｔｉｏｎ）および小脳の長期抑制の誘導にとっ て必要とされることが既に示されている（Ｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ ｕｒｅ ３６３：３４７、１９９３；Ｂｏｒｔｏｌｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ．、Ｎ ａｔｕｒｅ ３６８：７４０、１９９４；Ａｉｂａ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ ７９：３６５およびＣｅｌｌ ７９：３７７、１９９４）。 代謝指向型グルタミン酸受容体アゴニストが様々な生理学的活性に影響を及ぼ すことが既に報告されている。たとえば、トランス−ＡＣＰＤは痙攣促進剤（ｐ ｒｏｃｏｎｖｕｌｓａｎｔ）薬および抗痙攣薬の両方の効果（Ｚｈｅｎｇ ａｎ ｄ Ｇａｌｌａｇｈｅｒ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１２５：１４７、１９ ９１；Ｓａｃａａｎ ａｎｄ Ｓｃｈｏｅｐｐ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ． １３９：７７、１９９２；Ｔａｓｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅ ｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ３：６２９、１９９２；Ｓｈｅａｒｄｏｗｎ、Ｎｅｕｒｏ ｒｅｐｏｒｔ ３：９１６、１９９２）、ならびにインビトロおよびインビボに おける神経保護効果（Ｐｉｚｚｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６ １：６８３、１９９３；Ｋｏｈ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：９４３１、１９９１；Ｂｉｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ． 、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．３２：１３５１、１９９３；Ｓｉｌｉｐｒａ ｎｄｉ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２１９：１７３、１ ９９２；Ｃｈｉａｍｕｌｅｒａ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏ ｌ．２１６：３３５、１９９２）を保持することが報告された。代謝指向型グル タミン酸受容体アンタゴニストＬ−ＡＰ３は低酸素性損傷をインビトロで保護す ることが示された（Ｏｐｉｔｚ ａｎｄ Ｒｅｙｍａｎｎ、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏ ｒｔ ２：４５５、１９９１）。続く研究により、トランス−ＡＣＰＤがＬ−Ａ Ｐ３による拮抗作用を受ける神経保護を生じることが報告された（Ｏｐｉｔｚ ａｎｄ Ｒｅｙｍａｎｎ、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．３２：１ ０３、１９９３）。（５）−４Ｃ３ＨＰＧはＤＢＡ／２マウスにおける聴原発作 を保護することが示された（Ｔｈｏｍａｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ ｃｈｅｍ．６２：２４９２、１９９４）。代謝指向型グルタミン酸受容体調節剤 の予期される他の調節効果には、シナプス伝達、ニューロン死、ニューロンの発 達、シナプス形成性、空間的学習、嗅覚記憶、心臓活動の中枢制御、覚醒、動作 の制御、および前庭眼反射の制御が含まれる（総説については、Ｎａｋａｎｉｓ ｈｉ、Ｎｅｕｒｏｎ １３：１０３１−３７、１９９４；Ｐｉｎ ｅｔ ａｌ． 、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３４：１、１９９５；Ｋｎｏｐｆｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：１４１７、１９９５、を参照さ れたい）。 当該技術分野で現在知られるｍＧｌｕＲ−活性分子の構造は、グルタミン酸結 合部位に結合することにより作用するように思われるアミノ酸に限定されている （Ｐｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３４：１、１ ９９５；Ｋｎｏｐｆｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：１４１ ８）。このことにより、そのような化合物の薬理学的特性および可能な治療的利 用法の範囲が限定される。更に、それらのｍＧｌｕＲ−活性分子に関連する薬理 学的特異性の範囲によっては、異なるサブタイプの代謝指向型グルタミン酸受容 体間の完全な識別は可能にはならない（Ｐｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｐｈ ａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３４：１、１９９５、およびＫｎｏｐｆｅｌ ｅｔ ａ ｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：１４１８）。一層効力が高くかつ一層選択 性の高いｍＧｌｕＲアゴニスト、アンタゴニスト、および調節剤が発見されるま では、ｍＧｌｕＲ−活性分子の分野における迅速な進歩はなされ得ない（Ｐｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３４：１、１９９５； Ｋｎｏｐｆｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：１４１８）。実 際、現在臨床的開発段階にあるｍＧｌｕＲ−活性分子は存在しない。個々のｍＧ ｌｕＲを発現する細胞株を用いる化合物および化合物ライブラリーの高処理量機 能性スクリーニングは、そのような新規化合物を同定するための重要なアプロー チである（Ｋｎｏｐｆｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：１４ １８）。 幾つかの研究室は、適切に機能するように思われる、代謝指向型グルタミン酸 受容体を発現する細胞株を既に構築している（Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉ ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１３３６１、１９９２；Ｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ． 、Ｎｅｕｒｏｎ ８：１６９、１９９２；Ａｒａｍｏｒｉ ａｎｄ Ｎａｋａｎ ｉｓｈｉ、Ｎｅｕｒｏｎ ８：７５７、１９９２、Ｎａｋａｎｉｓｈｉ、Ｓｃｉ ｅｎｃｅ ２５８：５９７、１９９２；Ｔｈｏｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｒａ ｉｎ Ｒｅｓ．６１９：２２、１９９２；Ｔｈｏｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕ ｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２７：３６１、１９９２；Ｏ’Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｎ １１：４１、１９９３；Ｎａｋｊｉｍａ ｅｔ ａｌ ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１１８６８、１９９３；Ｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：１３７２、１９９３；Ｓａｕｇｓ ｔａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏ１．４５：３６７、１９９４ ；Ｏｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２３１ 、１９９４；Ｇａｂｅｌｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ ．２４：５３３、１９９４；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ．Ａｂｓｔｒ．２０：４６８、１９９４；Ｆｌｏｒ ｅｔ ａｌ．、Ｓｏｃ．Ｎ ｅｕｒｏｓｃｉ．Ａｂｓｔｒ．２０：４６８、１９９４；Ｆｌｏｒ ｅｔ ａｌ ．、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３４：１４９、１９９４）。他の論 文には、機能的ｍＧｌｕＲ発現性細胞株の発現は予測可能でないことが既に記載 されている。たとえば、Ｔａｎａｂｅら（Ｎｅｕｒｏｎ ８：１６９、１９９２ ）はｍＧｌｕＲ３およびＧｌｕＲ４の機能的発現を示すことができず、ＣＨＯ細 胞内での天然のｍＧｌｕＲ１の発現を生じさせることが困難であることを記載し ている。Ｇａｂｅｌｌｉｎｉら（Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．２４：５３３、 １９９４）もまた、ＨＥＫ ２９３細胞内でのｍＧｌｕＲ１発現の困難性を記載 し、これらの困難性の幾つかはこれらの受容体の脱感作特性に起因するかもしれ ないことがありうることを記載している。それに加え、クラスＩのｍＧｌｕＲに おいて活性を示す化合物を同定するのに有用なスクリーニング法は、クラスＩＩ およびＩＩＩのｍＧｌｕＲにおいて活性を示す化合物の同定には容易に適用でき ず、かつ逆もできず、それは第二メッセンジャー共役の差異が原 因となっている。最後に、ｍＧｌｕＲはアゴニスト刺激の際に迅速に脱感作を生 じることが既に記載されており、このことがこれらの受容体を発現する細胞株の 生存率に不利な影響を及ぼすかもしれず、かつスクリーニングのための天然のｍ ＧｌｕＲの使用を困難にしている。 異なるＧ蛋白質に共役する受容体は異なるリガンド親和性および第二メッセン ジャーへの共役を呈する。Ｇ蛋白質共役型受容体は全て類似の構造を有している ：Ｎ−末端細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、７つの膜スパニングヘリックスを含みし たがって３本の細胞内ループおよび３本の細胞外ループを規定する７回貫膜ドメ イン（７ＴＭＤ）、および細胞質テイル(ＣＴ)。しかし各領域を含む厳密な配列 は異なっている。これらの配列の差異により、異なる化学組成物のリガンドとの 受容体相互作用および異なるＧ蛋白質との受容体相互作用の特異性が提供される ものと考えられる。関連する受容体からの小ペプチドセグメントが組換えＤＮＡ 技術を用いて交換されたキメラ受容体の構築は、この特異性を決定するにあたっ て異なる配列領域の関与を評定するための有用な技術であることが既に証明され ている。たとえば、様々なアドレナリン作動性受容体、ムスカリン性アセチルコ リン受容体、およびアンジオテンシン受容体の間での第三細胞内ループの交換に より、Ｇ蛋白質の共役特異性の変換がもたらされる。従って、活性化により通常 アデニレートシクラーゼの阻害もしくは活性化がもたらされる受容体を、同一も しくは類似のリガンド結合性特性を有するがその活性化によりホスホリパーゼ− Ｃの刺激化がもたらされる受容体に変換することおよびその逆を行うことができ る（Ｋｏｂｉｌｋａ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１３１０、１９ ８８；Ｗｅｓｓ ｅｔ ａｌ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２５８：１３３、１９８ ９；Ｃｏｔｅｃｃｈｉａ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．ＵＳＡ ８７：２８９６、１９９０；Ｌｅｃｈｌｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ ．、ＥＭＢＯ Ｊ．９：４３８１、１９９０；Ｗｅｓｓ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３８：５１７、１９９０；Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｊ ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：６２１９、１９９０；Ｃｏｔｅｃｃｈｉａ ｅ ｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６３３、１９９２；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１６６７７、 １９９５）。第三細胞内ループを共有するこれらの受容体では、この第三細胞内 ループがＧ蛋白質共役の特異性を決定する上での重要な役割を担っている。この ような実験により第三細胞内ループがこれらの関連受容体におけるＧ蛋白質共役 の特異性を決定する上での重要な役割を担っていることが示されるが、その原因 となるいずれかの特異的アミノ酸配列モチーフを同定することには成功していな い。それに加え、第三細胞内ループはそのような受容体の脱感作の少なくとも部 分的な原因であることが既に示されている（Ｏｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．、Ｃ ｅｌｌ ６７：７２３、１９９１；Ｌｉｇｇｅｔｔ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏ ｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：４７４０、１９９２）。 代謝指向型グルタミン酸受容体は総体的トボロジーの点では他のＧ蛋白質共役 型受容体に関連しているが、特異的アミノ酸配列の点では関連性がない。ｍＧｌ ｕＲの通常とは異なる特性は、それらの非常に巨大なＥＣＤ（約６００アミノ酸 ）である。多くの他のＧ蛋白質共役型受容体では、リガンド結合は７ＴＭＤ内で 生じる。しかし、各ｍＧｌｕＲの巨大ＥＣＤがリガンド結合性決定基を提供する ものと考えられる（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：５９７、１ ９９２；Ｏ’Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｎ １１：４１、１９９３； Ｓｈｉｇｅｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｎ １２：１２４５、１９９４ ）。異なるリガンド親和性および異なるＧ蛋白質共役を有するｍＧｌｕＲのＥＣ Ｄが交換されているキメラｍＧｌｕＲを用いて、ｍＧｌｕＲのＥＣＤはリガンド 特異性を決定するが、Ｇ蛋白質特異性は決定しないことが既に示されている（Ｔ ａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９３４１ 、１９９３）。更に、第三細胞内ループがサイズおよび配列の点で可変である他 のＧ蛋白質共役型受容体とは異なり、ｍＧｌｕＲの第三細胞内ループは小さくか つ非常に保存性が高い（Ｂｒｏｗｎ Ｅ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３ ６６：５７５、１９９３）。第二細胞内ループおよび／または細胞質テイルが交 換されたキメラｍＧｌｕＲが既に調製されている（Ｐｉｎ ｅｔ ａｌ．、ＥＭ ＢＯ Ｊ．１３：３４２）。これらの実験により研究者らは、大半の他のＧ蛋白 質共役型受容体とは異なり、「第二細胞内ループのＣ−末端および第７貫膜ドメ インの下流に位置するセグメントの両方がｍＧｌｕＲ１ｃによるホスホリ パーゼＣの特異的活性化に必要である」と結論付け、かつｍＧｌｕＲの第二細胞 内ループは他のＧ蛋白質共役型レセプターの第三細胞内ループの役割を担ってい ることを示唆した。 天然に存在するｍＲＮＡスプライス変異体が本質的には同一のリガンド結合特 性を有するプロスタグランジン Ｅ３（ＥＰ３）受容体を産生するが、ただしこ れらの変異体は異なる第二メッセンジャー経路を優先的に活性化させ（識別的Ｇ 蛋白質共役）、かつ異なる脱感作特性を呈することが既に記載されている（Ｎａ ｍｂａ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３６５：１６６、１９９３；Ｓｇｉｍｏ ｔｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２７１２、１９９３； Ｎｅｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：９５１７、 １９９３）。これらの変異体受容体異性体はそれらの細胞質テイルのみが異なっ ている。より長いテイルを有する異性体はホスホリパーゼ−Ｃに効率よく共役す るが、より短いテイルを有するものは効率的な共役を示さない。しかしながらｍ ＧｌｕＲ１およびｍＧｌｕＲ５の天然に存在するｍＲＮＡスプライス変異体の分 析により、それらの長い細胞質テイルはＧ蛋白質共役には直接的には関与しない かもしれないことが既に示されている（Ｐｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａ t’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０３３１、１９９２；Ｊｏｌｙ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １５：３９７０、１９９５）。 実際、Ｐｉｎら（上述）は、「しかしながら、ＰＬＣ−共役型ｍＧｌｕＲ（ｍＧ ｌｕＲ１および５）においてのみ見いだされる非常に長いＣ−末端ドメインは恐 らくＰＬＣ−活性化Ｇ蛋白質との特異的相互作用には関与していないであろう」 と記載している。 最近カルシウム受容体が記載されている（Ｂｒｏｗｎ Ｅ．Ｍ．ｅｔ ａｌ． 、Ｎａｔｕｒｅ ３６６：５７５、１９９３；Ｒｉｃｃａｒｄｉ Ｄ．ｅｔ ａ ｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１３１−１３ ５、１９９５；Ｇａｒｒｅｔｔ Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ ｍ．３１：１２９１９−１２９２５、１９９５）。このＣａＲは、他のｍＧｌｕ Ｒを例外として、ｍＧｌｕＲと有意な配列相同性を示す唯一の既知の受容体であ る。ＣａＲはいずれか一つのｍＧｌｕＲに対して約２５％の配列相 同性（アミノ酸同一性）を示すが、ｍＧｌｕＲ配列同士では＞４０％の相同性（ アミノ酸同一性）である。このＣａＲは、受容体機能および恐らくはリガンド結 合に関与することが既に暗示されている巨大ＥＣＤを有するｍＧｌｕＲと構造的 に関連している（Ｂｒｏｗｎ Ｅ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３６６： ５７５、１９９３；Ｐｏｌｌａｋ Ｍ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ ７５：１ ２９７−１３０３、１９９３）。この構造類似性はリガンド結合の特異性におけ る密接な類似性は付与しておらず、それはＣａＲにとっての天然のリガンドは無 機イオンＣａ²⁺であり、グルタミン酸はＣａＲ活性を調節しないためである。Ｃ ａＲもまた巨大な細胞質テイルを有し、かつホスホリパーゼ−Ｃの刺激化に共役 する。すなわち、ＣａＲは構造的および機能的に、他のｍＧｌｕＲよりはｍＧｌ ｕＲ１および５に一層深い関連性を示す。Ｐｉｎら（ＥＭＢＯ Ｊ．１３：３４ ２、１９９４）は、所定のアミノ酸がホスホリバーゼ−Ｃに共役するｍＧｌｕＲ の細胞内ループ内では保存されており、かつアデニレートシクラーゼの阻害に共 役するｍＧｌｕＲの細胞内ループ内では異なるアミノ酸が同一の位置で保存され ていることを記載している。細胞内ループ１および３はｍＧｌｕＲとＣａＲとの 間では最も高度に保存されている配列であるが（Ｂｒｏｗｎ Ｅ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３６６：５７５、１９９３）、これらの特定のアミノ酸 の内の約半分のみがＣａＲの対応位置に見いだされるに過ぎず、かつ実際のとこ ろこれらの内の一つのみがホスホリパーゼ−Ｃに共役する受容体について予測さ れるアミノ酸である。すなわち、ＣａＲとｍＧｌｕＲとの間の配列保存は、リガ ンド結合およびＧ蛋白質共役に関与する構造的ドメインの保存にほぼ一致するよ うに思われ、Ｇ蛋白質共役的特異性が予期される細胞内領域に含まれる特定の配 列モチーフについての証拠を提供しない。ＣａＲを発現する細胞株が既に取得さ れており、かつＣａＲの活性を調節する化合物を同定するためのそれらの使用が 開示されている（１９９４年１２月９日に出願され、現在係属中であり、引用に より本明細書に取り込まれる米国特許出願第０８／３５３，７８４号）。 異なるｍＧｌｕＲの活性に特異的に影響を及ぼす分子を同定するための理想的 スクリーニング法は、各々が同一の第二メッセンジャーシステムに共役し、かつ 高処理量スクリーニングに適用しうる様式で各機能的ｍＧｌｕＲを発現する細胞 株を提供するであろう。 本明細書に記載される引用文献はいずれも、請求の範囲に対する従来の技術と して容認するものではない。 発明の要約 本発明は、（１）代謝指向型グルタミン酸受容体およびカルシウム受容体から の配列を有するキメラ受容体蛋白質、ならびに代謝指向型グルタミン酸受容体、 カルシウム受容体、およびキメラ受容体のフラグメント；（２）そのようなキメ ラ受容体蛋白質およびフラグメントをコードする核酸；（３）そのような受容体 蛋白質、フラグメント、および核酸の使用；（４）そのような核酸を発現する細 胞株；（５）そのようなキメラ受容体蛋白質およびフラグメントを用いる代謝指 向型グルタミン酸受容体もしくはカルシウム受容体に結合するか、もしくはそれ らの受容体の活性を調節する化合物をスクリーニングする方法；（６）そのよう なスクリーニング法により同定される代謝指向型グルタミン酸受容体もしくはカ ルシウム受容体を調節するための化合物；（７）そのような化合物を利用して代 謝指向型グルタミン酸受容体もしくはカルシウム受容体を調節するための方法； ならびに（８）そのような化合物を用いて神経学的障害を治療する方法、に関す る。 本発明の化合物および方法の好ましい使用は、代謝指向性グルタミン酸受容体 活性を調節する化合物をスクリーニングすること、および神経学的疾患および障 害の治療を助けるためにそのような化合物を使用することである。 先の「発明の背景」に記載されるように、代謝指向型グルタミン酸受容体およ びカルシウム受容体は類似構造を有する。両タイプの受容体共、細胞外ドメイン （ＥＣＤ）、７回貫膜ドメイン（７ＴＭＤ）、および細胞内細胞質テイル（ＣＴ ）を有する。すなわち、本発明のキメラ受容体では、その受容体の配列の一部分 はｍＧｌｕＲの配列の一部分と同一もしくは相同であり、かつその配列の一部分 はＣａＲの配列の一部分と同一もしくは相同である。たとえば、キメラ受容体は 、ｍＧｌｕＲのＥＣＤ、ならびにＣａＲの７ＴＭＤおよびＣＴからなることがで きる。同様に、キメラ受容体は、ｍＧｌｕＲのＥＣＤおよび７ＴＭＤ、ならび にＣａＲのＣＴを含むことができる。ｍＧｌｕＲおよびＣａＲのドメインもしく はドメインの部分の他の組み合わせ物を構築し使用することもできる。 これらのキメラ受容体が目的の受容体であるが、それは一部には、それらの受 容体によりｍＧｌｕＲの所定の機能的特性とＣａＲの所定の機能的特性との結合 が可能になるためである。すなわち、実験により、当該技術分野で知られ、かつ 天然のｍＧｌｕＲにおけるアゴニストもしくはアンタゴニストであるリガンドが 、その細胞外ドメインがｍＧｌｕＲからのものであるキメラ受容体においてもそ のような活性を呈示することが示された。同様に、実験により、当該技術分野で 知られ、かつｍＧｌｕＲを調節するリガンドが、細胞外ドメインおよび７ＴＭＤ がｍＧｌｕＲからのものであるキメラ受容体に作用することが示された。これら 両事例では、ｍＧｌｕＲ活性を調節する他のリガンドもこれらのタイプのキメラ 受容体に作用するであろうことが予想される。 ｍＧｌｕＲ活性化合物についてのスクリーニングのためのｍＧｌｕＲの使用は 、リガンドの結合／活性化の際の受容体の迅速な脱感作および組換え脊椎動物細 胞においてその受容体を安定に発現させる困難性を初めとする多数の因子により 複雑なものとなっている（たとえば、図８Ｂおよび更には公開されたＰＣＴ特許 公開公報も参照されたい）。本発明の所定のキメラ受容体を利用してこれらの技 術的困難性を克服し、かつカルシウム受容体の一層頑丈な特質を利用することに よりはるかに改善されたスクリーニング法を提供することができる。たとえば、 ＣａＲの７ＴＭＤおよびＣＴをｍＧｌｕＲの細胞外ドメインと、あるいはＣａＲ のＣＴをｍＧｌｕＲのＥＣＤおよび７ＴＭＤと結合させることにより、ｍＧｌｕ Ｒの細胞外ドメインはＣａＲのＧｑ共役特性ならびに迅速な脱感作の喪失という 改善された特性という利点を有する（たとえば、図８Ｃを参照されたい）。従っ て、このようなキメラ受容体は天然のｍＧｌｕＲのものに類似するリガンド結合 性および活性化特性を有するが、ＣａＲに類似する改善された第二メッセンジャ ー共役を有する。従って、このキメラ受容体により、ｍＧｌｕＲ活性分子を同定 するためのスクリーニングが簡素化され、かつそのスクリーニングを効果的、実 際的、および再現性のある機能的なものとすることができる。 これらの新規キメラ受容体については、あるキメラ受容体内のｍＧｌｕＲとＣ ａＲとの配列の組み合わせが新規であることのみならず、活性が首尾よく結合し たことは予測外のことである。以前ではこのような結合は、密接に関連する配列 を有する受容体の部分を用いてのみ達成されていた。この場合には代謝指向型グ ルタミン酸受容体とカルシウム受容体との間の配列同一性は僅か１９〜２５％に 過ぎず、かつこの２タイプの受容体は僅か２５〜３０％の配列類似性を共有する に過ぎない（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３６６：５７５、１９ ９３）。 先に記載される３つのドメインはたとえば、リガンド結合部位およびＧ蛋白質 共役部位等のサブドメインから成り立っていることが認識される。従って幾つか の適用については、所望の活性を持たせる目的でキメラ受容体中に特定の受容体 からの完全なドメインを含有させることは必要ではない。たとえば、ｍＧｌｕＲ からのリガンド結合性部位のみをキメラ受容体中に取り込ませることができ、そ のキメラ受容体では残りの配列の内の大半もしくは全てがＣａＲに相同である。 同様に、あるキメラ受容体では７ＴＭＤの細胞質ループの一つがｍＧｌｕＲのル ープ配列に相同であることができ、かつ実質的にその受容体の残りの配列はＣａ Ｒに相同であることができるか、あるいはその逆に、細胞質ループの内の一つが ＣａＲのループ配列に相同であることができ、かつ実質的にその受容体の残りの 配列がｍＧｌｕＲに相同であることができる。 すなわち、本発明の第一態様は、細胞外ドメイン、７回貫膜ドメイン、および 細胞内細胞質テイルドメインを有するキメラ受容体を含む組成物を特徴とする。 このキメラ受容体は、代謝指向型グルタミン酸受容体の配列に相同な少なくとも ６つの連続するアミノ酸の配列、およびカルシウム受容体の配列に相同な少なく とも６つの連続するアミノ酸の配列を有する。 好ましい態様では、少なくとも一つのドメインが代謝指向型グルタミン酸受容 体の一つのドメインに相同であるか、あるいは少なくとも一つのドメインがカル シウム受容体の一つのドメインに相同である。具体的には、これは、代謝指向型 グルタミン酸受容体に相同なドメインおよびカルシウム受容体に相同なドメイン を有するキメラ受容体を含む。 好ましい態様では更に、キメラ受容体は、代謝指向型グルタミン酸受容体から の２つのドメインおよびカルシウム受容体からの一つのドメインか、あるいはカ ルシウム受容体からの２つのドメインおよび代謝指向型受容体からの一つのドメ インを有する。これは、３つのドメインの内の可能な組み合わせの各々を含む。 たとえばより好ましい態様では、キメラ受容体は代謝指向型グルタミン酸受容体 の細胞外ドメインに相同な一つのドメイン、代謝指向型グルタミン酸受容体の７ 回貫膜ドメインに相同な一つのドメイン、およびカルシウム受容体の細胞内細胞 質テイルドメインに相同な一つのドメインを有する。 他の好ましい態様では、キメラ受容体は、代謝指向型グルタミン酸受容体の細 胞質ループに相同な７回貫膜ドメインの内の少なくとも一つの細胞質ループを有 する。同様に他の好ましい態様では、キメラ受容体はカルシウム受容体の細胞質 ループに相同な少なくとも一つの細胞質ループを有する。 他の好ましい態様では更に、キメラ受容体は、カルシウム受容体のアミノ酸配 列に相同な少なくとも６つの連続するアミノ酸の配列を有し、かつそのキメラ受 容体の残りの配列は代謝指向型グルタミン酸受容体のアミノ酸配列に相同である 。他の態様では、カルシウム受容体のアミノ酸配列に相同な配列は有利により長 くてもよく、たとえば少なくとも１２、１８、２４、３０、３６、もしくはそれ を上回るアミノ酸の長さである。 同様に他の好ましい態様では、キメラ受容体は、代謝指向型グルタミン酸受容 体のアミノ酸配列に相同な少なくとも６つの連続するアミノ酸の配列を有し、か つそのキメラ受容体の残りの配列はカルシウム受容体のアミノ酸配列に相同であ る。他の態様では、代謝指向型グルタミン酸受容体のアミノ酸配列に相同な配列 は有利により長くてもよく、たとえば少なくとも１２、１８、２４、３０、３６ 、もしくはそれを上回るアミノ酸の長さである。 関連する態様では、本発明は、先の態様について記載されるキメラ受容体をコ ードする単離、濃縮、もしくは精製された核酸分子を含む組成物を提供する。具 体的にはこれは、カルシウム受容体のアミノ酸配列に相同な少なくとも６つの連 続するアミノ酸の配列および代謝指向型グルタミン酸受容体のアミノ酸配列に相 同な少なくとも６つの連続するアミノ酸配列を有するキメラ受容体をコードする 核酸を含む。先の態様と同様に、特定の態様では、カルシウム受容体および／ま たは代謝指向型グルタミン酸受容体からのアミノ酸配列に相同なキメラ受容体配 列は有利により長くてもよく、たとえば少なくとも１２、１８、２４、３０、３ ６、もしくはそれを上回るアミノ酸の長さである。 好ましい態様では、キメラ受容体は、代謝指向型グルタミン酸受容体の一つの ドメインに相同な一つのドメイン、および／またはカルシウム受容体に相同な一 つのドメインを有する。より好ましい態様では、キメラ受容体は、代謝指向型グ ルタミン酸受容体のドメインに相同な２つのドメインおよびカルシウム受容体の ドメインに相同な一つのドメインか、あるいはカルシウム受容体のドメインに相 同な２つのドメインおよび代謝指向型グルタミン酸受容体のドメインに相同な一 つのドメインを有する。 他の関連する態様では、先に記載されるキメラ受容体をコードする核酸は複製 可能な発現ベクター中に存在する。従ってこのベクターは、記載されるキメラ受 容体のいずれかをコードする核酸配列を含むことができる。 更に、ある関連態様では、本発明は先に記載される複製可能な発現ベクターで 形質転換された組換え宿主細胞を提供する。 本発明は更に、キメラ受容体の産生のための方法を特徴とし；この方法は適切 な栄養条件下で、先に記載されるキメラ受容体をコードする核酸配列を含む複製 可能な発現ベクターで形質転換もしくはトランスフェクトさせた原核生物もしく は真核生物の宿主細胞を、そのキメラ受容体の発現を可能にさせる様式で増殖さ せることを含む。 核酸に関連して、「単離された」によっては、その核酸が天然に見いだされる 以外の形態（すなわち、他の分子との会合）で存在することが意味される。たと えば、単離された受容体核酸は、同一染色体上に存在する一つもしくは複数の核 酸から分離されている。単離された核酸は同一染色体上に存在する他の核酸の内 の少なくとも９０％から分離されていることが好ましい。その核酸が、調製物中 に存在する全核酸の内の少なくとも７５％、一層好ましくは８５％、更に好まし くは９５％に相当する実質的に精製された調製物として提供されることが好まし い。 単離された核酸の他の例は組換え核酸である。好ましくは、組換え核酸は、発 現ベクター中にクローン化されたキメラ代謝指向型グルタミン酸受容体もしくは 代謝指向型グルタミン酸受容体フラグメントをコードする核酸を含む。発現ベク ターは、ポリペプチドを産生するためにクローン化された核酸配列を発現するた めの必須因子を含む。発現ベクターは、プロモーター領域（これはＲＮＡ転写の 開始を指示する）、ならびにＲＮＡに転写された際には合成開始のシグナルを発 するであろうＤＮＡ配列を含む。「発現ベクター」には、その中に含まれるＤＮ Ａ配列を発現することが可能なベクターが含まれ、すなわちコーディング配列は それらを発現させることが可能な他の配列に動作可能なように連結されている。 必ずしも常に明確に記述される訳ではないが、これらの発現ベクターは、エピソ ームもしくは染色体ＤＮＡに組込まれた部分のいずれかとして宿主生物体内で複 製できる必要があることが暗示される。必須ではないが有用な、効率のよい発現 ベクターの因子は、マーカーをコードする配列、それらの細胞を容易に同定する ことを可能にする蛋白質を含む細胞の表現型特性（たとえば、テトラサイクリン 耐性）をもたらす蛋白質をコードする配列である。要するに「発現ベクター」に は機能的定義が与えられており、特定の配列に適用される場合、含有される特定 のＤＮＡコードの発現をもたらすことが可能な任意のＤＮＡ配列がこの用語に含 まれる。現在のところこのようなベクターはしばしばプラスミドの形態であるた め、「プラスミド」および「発現ベクター」はしばしば互換的に用いられる。し かしながら本発明は、ウイルスベクターを初めとする、等価の機能を与え、折々 に当該技術分野に知られるようになるであろう他の形態の発現ベクターを含むこ とが意図される。組換え核酸は、キメラ代謝指向型グルタミン酸受容体、受容体 フラグメント、もしくはキメラ代謝指向型グルタミン酸受容体誘導体をコードす る核酸を、そのゲノムの調節剤の制御下か、もしくは外因性プロモーターを初め とする外因性調節剤の制御下に含有していてもよい。「外因性」によっては、代 謝指向型グルタミン酸受容体もしくはカルシウム受容体のためのコーディング配 列に対して通常はインビボで転写の上で共役しないプロモーターが意味される。 本発明は更に、代謝指向型グルタミン酸受容体および／またはカルシウム受容 体に結合する、および／またはその活性を調節する化合物のためのスクリーニン グ法をも提供する。これらの方法は、先に記載されるキメラ受容体もしくはその ようなキメラ受容体をコードする核酸配列を利用する。このようなキメラ受容体 は、たとえば代謝指向型グルタミン酸受容体からの結合特性とカルシウム受容体 からの細胞シグナル伝達特性との組み合わせ等の、２タイプの受容体からの特性 の有用な組み合わせを提供する。 すなわち、他の態様では、本発明は代謝指向型グルタミン受容体に結合するか 、もしくはその活性を調節する化合物のスクリーニング法を提供する。この方法 は、細胞外ドメイン、７回貫膜ドメイン、および細胞内細胞質テイルドメインを 有するキメラ受容体を調製することを含み、ここで少なくとも一つのドメインが 代謝指向型グルタミン酸受容体のドメインに相同であり、少なくとも一つのドメ インがカルシウム受容体のドメインに相同である。キメラ受容体および被験化合 物を許容される媒質中に導入する。キメラ受容体に対する被験化合物の結合性、 もしくはその化合物によるキメラ受容体の調節を物理的に検出可能な手段により モニターして、代謝指向型グルタミン酸受容体に結合するか、もしくはその活性 を調節する化合物を同定する。 好ましい態様では、キメラ受容体の細胞外ドメインは代謝指向型グルタミン酸 受容体の細胞外ドメインに相同である。また好ましい態様では、キメラ受容体は 、代謝指向型グルタミン酸受容体のドメインに相同な２つのドメインおよびカル シウム受容体の一つのドメインに相同なドメイン、あるいはカルシウム受容体の ドメインに相同な２つのドメインおよび代謝指向型グルタミン酸受容体の一つの ドメインに相同なドメインを有する。 他の態様では、本発明は、キメラ受容体をコードする核酸を利用する、代謝指 向型グルタミン酸受容体に結合するかもしくはその活性を調節する化合物のスク リーニング法を提供する。この方法は、細胞外ドメイン、７回貫膜ドメイン、お よび細胞内細胞質テイルドメインを有するキメラ受容体をコードする核酸配列を 調製することを含み、ここでキメラ受容体はカルシウム受容体のアミノ酸配列に 相同な少なくとも６つの連続するアミノ酸の配列、および代謝指向型グルタミン 酸受容体のアミノ酸配列に相同な少なくとも６つの連続するアミノ酸の配列を有 する。核酸配列を、宿主細胞内でそのキメラ受容体を発現しうる複製可能な発現 ベクター中に挿入する。適切な宿主細胞をこのベクターで形質転換させ、そして その形質転換宿主細胞および被験化合物を許容される媒質中に導入する。被験化 合物による結合もしくは調節の同定は、細胞におけるその化合物の効果をモニタ ーすることにより実施する。 好ましい態様では、キメラ受容体は、代謝指向型グルタミン酸受容体のドメイ ンに相同な少なくとも一つのドメインおよび／またはカルシウム受容体のドメイ ンに相同な少なくとも一つのドメインを有する。このことは具体的には、キメラ 受容体が、代謝指向型グルタミン酸レセプターの細胞外ドメインに相同な細胞外 ドメイン、および／または代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインを 有する好ましい態様を含む。特定の態様では、キメラ受容体は代謝指向型グルタ ミン酸受容体のドメインに相同な２つのドメインおよびカルシウム受容体のドメ インに相同なドメインか、あるいはカルシウム受容体のドメインに相同な２つの ドメインおよび代謝指向型グルタミン酸受容体の一つのドメインに相同なドメイ ンを有する。 また好ましい態様では、キメラ受容体は、カルシウム受容体の細胞質ループに 相同な、７回貫膜ドメインの少なくとも一つの細胞質ループを有し；特定の態様 では、そのキメラ受容体の残りの配列は代謝指向型グルタミン酸受容体の配列に 相同である。 他の好ましい態様では、キメラ受容体はカルシウム受容体のアミノ酸配列に相 同な少なくとも６つの連続するアミノ酸の配列を有し、そしてそのキメラ受容体 の残りのアミノ酸配列は代謝指向型グルタミン酸受容体のアミノ酸配列に相同で ある。更に他の好ましい態様では、キメラ受容体は代謝指向型グルタミン酸受容 体の細胞質ループに相同な、７回貫膜ドメインの少なくとも一つの細胞質ループ を有する。 更に他の好ましい態様では、宿主細胞は真核生物細胞である。 本発明の方法の文脈では、宿主内で化合物の「効果をモニターすること」は、 一つもしくは複数の細胞過程または一つもしくは複数の細胞構成成分の活性のレ ベルに及ぼすその化合物の効果を決定すること、あるいはその化合物と細胞性構 成成分との間の相互作用を検出することを意味する。 本発明は更に、代謝指向型グルタミン酸受容体もしくはカルシウム受容体に結 合するかもしくはそれを調節する化合物の、そのような受容体のフラグメントを 用いるスクリーニング法も提供する。たとえばこのようなフラグメントを、受容 体のシグナル経路の活性化の際に重要であることが既に示されている配列を含む ように選択することができる。 従って他の態様では、本発明は、代謝指向型グルタミン酸受容体もしくはカル シウム受容体に結合する化合物を、そのような受容体のフラグメントをコードす る核酸を調製し、宿主細胞内でそのフラグメントを発現することができる複製可 能な発現ベクター中にその配列を挿入し、ベクターで適切な宿主細胞を形質転換 させ、宿主細胞からフラグメントを回収し、被験化合物中のフラグメントを許容 される媒質中に導入し、そして物理的に検出可能な手段によりフラグメントに対 する化合物の結合をモニターすることによりスクリーニングする方法を特徴とす る。 好ましい態様では、フラグメントは代謝指向型グルタミン酸受容体のフラグメ ントであり；一層好ましい態様では、フラグメントはその受容体の細胞外ドメイ ンを含む。 他の好ましい態様では、フラグメントは代謝指向型グルタミン酸受容体の７回 貫膜ドメインを含む。一層好ましい態様では、フラグメントは代謝指向型グルタ ミン酸受容体の７回貫膜ドメインと細胞質テイルドメインとの両方を含む。 同様に、他の好ましい態様においては、フラグメントは、カルシウム受容体の フラグメントであり、好ましくはその受容体の細胞外ドメインから７回貫膜ドメ インまでを含むフラグメントである。一層好ましい態様では、フラグメントはカ ルシウム受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テイルドメインを含む。 所定の受容体フラグメントは、そのフラグメントが由来する受容体に類似する 様式で一つもしくは複数の細胞応答を活性化することが可能である。従って関連 する態様では、本発明は代謝指向型グルタミン酸受容体もしくはカルシウム受容 体に結合するかもしくはそれを調節する化合物を、そのような受容体のフラグメ ントをコードする核酸配列を調製し、その配列を複製可能な発現ベクター中に挿 入し、宿主細胞をそのベクターで形質転換し、宿主細胞および被験化合物を許容 される媒質中に導入し、そして宿主細胞におけるその化合物の効果をモニターす ることによりスクリーニングする方法を提供する。 所定の受容体については、ある受容体に結合するかもしくはそれを調節する化 合物をスクリーニングするために２つの異なる受容体のフラグメントを利用する ことが可能である。この方法は、第一受容体のフラグメントをコードする核酸を 調製し、その配列を、宿主内でそのフラグメントを発現しうる複製可能な発現ベ クター中に挿入し、適切な宿主細胞をベクターで形質転換させ、そして宿主細胞 から第一フラグメントを回収することを含む。第二受容体のフラグメントは類似 様式で調製される。これら２本のフラグメントおよび被験化合物を許容される媒 質中に導入し、そしてその化合物による結合および／または調節を物理的に検出 可能な手段によりモニターする。 好ましい態様では、あるフラグメントは代謝指向型グルタミン酸受容体からの ものであり、かつあるフラグメントはカルシウム受容体からのものである。特に 好ましい態様では、第一フラグメントが代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外 ドメインを含みかつ第二受容体がカルシウム受容体の７回貫膜ドメインおよび細 胞質テイルドメインを含むか、あるいは第一フラグメントが代謝指向型グルタミ ン酸受容体の細胞外ドメインおよび７回貫膜ドメインを含みかつ第二フラグメン トがカルシウム受容体の細胞質テイルドメインを含む。 他の特定の態様では、第一フラグメントがカルシウム受容体の細胞外ドメイン を含み、第二フラグメントが代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメイン および細胞質テイルドメインを含む。更に他の特に好ましい態様では、第一フラ グメントがカルシウム受容体の細胞外ドメインを含み、第二フラグメントが代謝 指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインおよびカルシウム受容体の細胞質 テイルドメインを含む。 代謝指向型グルタミン酸受容体およびカルシウム受容体の両方の活性を調節す る所定の化合物を同定することができる。従って本発明は更に、代謝指向型グル タミン酸受容体の一つのドメインに相同な一つのドメインおよびカルシウム受容 体の一つのドメインに相同な一つのドメインを含むキメラ受容体をコードする核 酸配列を調製することによりそのような化合物をスクリーニングする方法も提供 する。この配列を、宿主内でその受容体を発現しうる複製可能な発現ベクター中 に挿入し；適切な宿主細胞をそのベクターで形質転換させ、そしてその形質転換 宿主細胞および被験化合物を許容される媒質中に導入する。その化合物による結 合もしくは調節は、その宿主細胞における化合物の影響をモニターすることによ り観察される。 本発明は更に、代謝指向型グルタミン酸受容体もしくはカルシウム受容体に作 用する化合物の作用部位を決定するための方法も提供する。この方法は、あるキ メラ受容体をコードする核酸配列を調製することを含む。２つの関連する態様で は、キメラ受容体はカルシウム受容体のアミノ酸配列に相同な少なくとも６つの アミノ酸配列を有し、かつ残りのアミノ酸配列が代謝指向型グルタミン酸受容体 のアミノ酸配列に相同であるか、あるいはキメラ受容体は代謝指向型グルタミン 酸受容体のアミノ酸配列に相同な少なくとも６つのアミノ酸配列を有し、かつ残 りのアミノ酸配列がカルシウム受容体の配列に相同である。これらの態様では核 酸配列は、宿主細胞内でその受容体を発現することができる複製可能な発現ベク ター中に挿入される。このベクターを適切な宿主細胞中に形質転換させ、そして 形質転換宿主細胞および化合物を許容される媒質中に導入する。この宿主細胞に おけるその化合物の効果をモニターする；すなわち、化合物が対応する受容体か らの少なくとも６つのアミノ酸の配列における相互作用を通して、受容体で活性 を示す場合には、そのキメラ受容体は活性化を受けるであろうし、そして細胞効 果を観察することができる。一方でその化合物が少なくとも６つのアミノ酸配列 と相互作用せずこの作用により受容体を活性しない場合には、対応する細胞効果 は観察されないであろう。 従って「作用部位」は、その受容体にとっての天然のリガンドか、もしくは他 の目的の化合物との相互作用に関わる受容体上の位置（一つもしくは複数）を意 味する。たとえば、その受容体への結合により代謝指向型グルタミン酸受容体の 活性を調節する化合物については、その作用部位はその受容体へのその化合物の 結合に関与するアミノ酸を含むことができるが、ただし他の配列を含んでもよい 。そのような他の配列はたとえば、二次構造もしくは三次構造がその化合物の結 合に応答して変化を受ける配列を含むことができる。 本発明の他の特徴および利点は以下の好ましい態様の記述、および請求の範囲 から明らかになるであろう。 図面の簡単な説明 図１は、本明細書に記載される様々なキメラの概略図であり、それらキメラの 細胞外ドメイン、７回貫膜ドメイン、および細胞内細胞質テイルドメインを示す 。 図２（ａ−ｈ）は、実施例２に記載されるｐｍＧｌｕＲ１／ＣａＲのヌクレオ チド配列および対応するアミノ酸配列の図である。 図３（ａ−ｈ）は、実施例３に記載されるｐＣａＲ／Ｒ₁のヌクレオチド配列 および対応するアミノ酸配列の図である。 図４（ａ−ｇ）は、実施例４に記載されるｐａｒｔＣＨ３のヌクレオチド配列 および対応するアミノ酸配列の図である。 図５（ａ−ｇ）は、実施例４に記載されるｐｈＣＨ４のヌクレオチド配列およ び対応するアミノ酸配列の図である。 図６は、卵母細胞内の細胞内Ｃａ²⁺の放出に応答して生じるＣｌ電流により測 定される、ｍＧｌｕＲ１のアゴニストであるキスカル酸およびＬ−グルタミン酸 によるｍＧｌｕＲ１／ＣａＲの活性化を示すグラフ表示である。 図７は、細胞外カルシウムを増加させることによるＣａＲおよびＣａＲ／Ｒ１ キメラの活性化のグラフ表示である。応答振幅（細胞内Ｃａ²⁺の増加に応答する Ｃｌ^-電流）が示される。このデータは、ＣａＲ／Ｒ１がＣａＲに類似する様式 で細胞外Ｃａ²⁺により活性化されることを示す。 図８は、細胞外グルタミン酸が、ａ）ｒａｔｍＧｌｕＲ１ ＲＮＡ、およびｂ ）ｒａｔＣＨ３ ＲＮＡを注射したゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞内のＣ ｌ^-電流のオシログラフ上での増加を誘発することを示すグラフ表示である。し かしながら、卵母細胞を繰り返しアゴニストに供するとラットｍＧｌｕＲ１受容 体は脱感作を生じ、そして細胞内Ｃａ²⁺の放出を活性化しなくなる。ラットＣＨ ３はＣａＲの細胞質テイルをコードするが、これは天然のラットｍＧｌｕＲ１の ようには脱感作せず、そしてそのため化合物での反復攻撃誘発に適用しうる。 図９は、ｆｕｒａ−２を負荷した安定にトランスフェクションした、ｐＣＥＰ ＣａＲ／Ｒ１を発現するＨＥＫ２９３細胞内での細胞外カルシウムにより誘導さ れる細胞内カルシウムの増加を示すグラフ表示である。 詳細な説明 当業者には、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書に開示 される発明に対する様々な置換および改変を作製しうることが容易に認識される であろう。Ｉ．定義 以下の記載は本開示において用いられる幾つかの定義のリストである。これら の定義は本明細書に提供される全開示を考慮するものとして理解されるべきであ る。 「全身麻酔の際の補助剤」によっては、麻酔剤により生じる意識喪失に関連す る、疼痛を知覚する能力を減少させる麻酔剤と組み合わせて用いられる化合物が 意味される。 「異痛」によっては、通常は疼痛を誘発しない刺激が原因となる疼痛が意味さ れる。 「鎮痛剤」によっては、意識喪失をもたらす麻酔剤を産生することなしに侵害 刺激の知覚を変化させることにより疼痛を緩和させることが可能な化合物が意味 される。 「鎮痛活性」によっては、通常は苦痛であるだろう刺激に応答する疼痛を減少 させる能力が意味される。 「抗痙攣活性」によっては、たとえば、単純部分発作、複雑部分発作、癲癇発 作重積、および創傷により誘導される発作（たとえば、頭部外科手術を初めとす る頭部損傷後に生じるもの）による生じる痙攣を減少させる際の効果が意味され る。 「結合するもしくは調節する」によっては、その試薬が、受容体に結合し、か つその活性を調節する両方を行うか、あるいはその試薬が、受容体に結合するか 、もしくはその活性を調節するかのいずれかを行うことが意味される。 「カウザルギー」によっては、末梢神経の損傷に関連する苦痛な障害が意味さ れる。 「中枢性疼痛」によっては、中枢神経系の病変に関連する疼痛が意味される。 「認識亢進活性」によっては、記憶の獲得もしくは学習した課題の実施を改善 する能力が意味される。「認識亢進活性」によっては更に、通常の理性的思考プ ロセスおよび推論法を改善する能力が意味される。 「認識亢進剤」によっては、学習および記憶を改善することが可能な化合物が 意味される。 「効力」によっては、ある選択された化合物で所望される活性の統計学的に有 意なレベルが検出可能であることが意味され；「有意な」によってはｐ＜０．０ ５レベルでの統計的有意性が意味される。 「相同な」によっては、類似の核酸および／またはアミノ酸配列を有し、かつ 関連する受容体の一つもしくは複数の活性をある程度は保持するドメイン、アミ ノ酸配列、もしくは核酸配列の機能的等価物が意味される。受容体の相同なドメ インもしくは配列は、関連する受容体に対して少なくとも５０％の配列類似性、 好ましくは７０％、一層好ましくは９０％、更に一層好ましくは９５％の配列類 似性を有する。「配列類似性」は、ポリペプチドの起源に関わりなく２つの異な るポリペプチドにおけるアミノ酸配列間に観察される「相同性」を意味する。従 って「相同である」は、核酸および／またはアミノ酸の配列が同一であるという 状況を含む。関連する慣用句では、配列、サブドメイン、もしくはドメインが、 「代謝指向型グルタミン酸受容体からの」もしくは「代謝指向型グルタミン酸受 容体の」とは、その部分が代謝指向型グルタミン酸受容体の一部分と同様もしく は相同であることを意味し；同様に部分が、「カルシウム受容体から」もしくは 「カルシウム受容体の」とは、それらの部分がカルシウム受容体の部分と同一も しくは相同であることも示す。これらの慣用句はアミノ酸配列および／または核 酸配列に関して用いることができる。 ある程度の活性を保持する相同ドメインもしくは配列の能力は、本明細書に記 載される技術を用いて測定することができる。このような相同ドメインは誘導体 であることもある。誘導体には、翻訳中もしくは後に、たとえばリン酸化、グリ コシル化、架橋形成、アシル化、蛋白質分解性開裂、抗体分子、膜分子、もしく は他のリガンドへの連結により生じる修飾が含まれる（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９８８、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：２８５−３２０ 、を参照されたい）。 誘導体の特定の種類には、たとえば、欠失、置換、付加、およびアミノ酸修飾 のようなアミノ酸変化も含まれる。「欠失」は、関連するポリペプチドにおける 一つもしくは複数のアミノ酸残基の不在を意味する。「付加」は、関連するポリ ペプチドにおける一つもしくは複数のアミノ酸残基の存在を意味する。あるポリ ペプチドへの付加もしくは欠失は、アミノ末端、カルボキシ末端、および／また は内部でありうる。アミノ酸「修飾」は、天然に生じるアミノ酸を改変して非天 然に生じるアミノ酸を産生することを意味する。「置換」は、他のアミノ酸残基 （一つもしくは複数）によるそのポリペプチド内の一つもしくは複数のアミノ酸 残基の置換を意味する。誘導体は、一つを上回る改変および違うタイプの改変を 初めとする改変の様々な組み合わせを含むことができる。 アミノ酸変化の効果はたとえば、リン酸化、グリコシル化、鎖内連結、三次構 造、ならびに活性部位もしくは潜在的なアロステリック部位でのそのアミノ酸の 役割に依存して変化するが、置換されるアミノ酸が、入れ替わるアミノ酸と同一 のグループからのものであることが一般的には好ましい。以下のグループはある 程度は互換的なアミノ酸を含む：塩基性アミノ酸であるリシン、アルギニン、お よびヒスチジン；酸性アミノ酸であるアスパラギン酸およびグルタミン酸；中性 極性アミノ酸であるセリン、スレオニン、システイン、グルタミン、アスパラギ ン、および程度は劣るがメチオニン；非極性脂肪族アミノ酸であるグリシン、ア ラニン、バリン、イソロイシン、およびロイシン（しかしながらサイズという理 由で、グリシンとアラニンは一層緊密に関連し合い、そしてバリン、イソロイシ ン、およびロイシンは一層緊密に関連し合う）；ならびに芳香族アミノ酸である フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン。それに加え、異なるカテ ゴリーに分類されてはいるものの、アラニン、グリシン、およびセリンはある程 度は互換的であるように思われ、そしてシステインは追加的にこのグループに適 合するか、あるいは極性中性アミノ酸と共に分類されてもよい。 プロリンは非極性中性アミノ酸であるが、立体配座における影響のためその置 換は困難である。従って、プロリンによるもしくはプロリンのための置換は、同 一もしくは類似の立体配座上の結果が取得され得る場合を除き好ましくない。プ ロリン残基の立体配座付与特性は、これらの内の一つもしくは複数がヒドロキシ プロリン（Ｈｙｐ）により置換される場合に得ることができる。 修飾されたアミノ酸の例には以下のものが含まれる：変化させた中性非極性ア ミノ酸（たとえば、式Ｈ₂Ｎ（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨ［式中、ｎは２〜６である］の ω−アミノ酸、サルコシン（Ｓａｒ）、ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ＢｕＡｌａ） 、ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ＢｕＧｌｙ）、Ｎ−メチルイソロイシン（Ｎ−Ｍｅ Ｉｌｅ）、およびノルロイシン（Ｎｌｅｕ））；変化させた中性芳香族性アミノ 酸（たとえば、フェニルグリシン）；変化させた中性の極性アミノ酸（たとえば 、シトルリン（Ｃｉｔ）およびメチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）；変化させた 中性の非極性アミノ酸（たとえば、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ））；変化 させた酸性アミノ酸（たとえば、システイン酸（Ｃｙａ））；ならびに変化させ た塩基性アミノ酸（たとえば、オルニチン（Ｏｒｎ））。 好ましい誘導体は、関連する受容体蛋白質の受容体活性には有意な影響を及ぼ さない一つもしくは複数のアミノ酸変化を有する。受容体活性にとって必須でな い受容体蛋白質の領域では、アミノ酸は、活性に影響を及ぼす低い危険でもって 、欠失、付加、もしくは置換することができる。受容体活性にとって必須の領域 では、アミノ酸変化はあまり好ましくはなく、それは受容体活性に影響を及ぼす 一層大きな危険性が存在するためである。このような変化は保存的変化であるべ きである。たとえば、その配列内の一つもしくは複数のアミノ酸残基を、機能的 等価物として作用する類似極性の別のアミノ酸により置換することができる。 保存領域は非保存領域と比較して蛋白質活性にとって一層重要である傾向があ る。標準法を用いて、受容体活性の重要な保存もしくは非保存領域を、インビト ロ突然変異誘発技術もしくは欠失分析を用い、かつ本開示により記載される要領 で受容体活性を測定して決定することができる。 誘導体は、標準的化学技術および組換え核酸技術を用いて産生することができ る。特定のポリペプチドに対する修飾は、部位特異的突然変異誘発および固相合 成中のアミノ酸置換を介するもののような慎重なものであってもよく、あるいは そのポリペプチドを産生する宿主内での突然変異を介するもののような偶発的な ものであってもよい。誘導体を含むポリペプチドは、たとえば上述のセクション Ｉ．Ｇ．２．において、およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）により記載されるもののような標準技術を 用いて取得することができる。たとえばＳａｍｂｒｏｏｋの第１５章は、クロー ン化ＤＮＡの部位特異的突然変異誘発のための方法を記載している。 「痛覚過敏」によっては、通常は苦痛である刺激に対する応答亢進が意味され る。 「最少の」によっては、その薬剤のいずれかの副作用に対しては標準的個体に よる薬剤耐性が示されること、およびそのためその薬剤を標的疾患もしくは障害 の治療に用いることができることが意味される。このような副作用は当該技術分 野で良く知られている。最少副作用は、標的障害もしくは疾患についての薬剤認 可については許容されるとしてＦＤＡ（米国食品医薬局）によって考慮されるで あろうものである。 「調節する」によっては、細胞の受容体活性の増加もしくは減少を生じること が意味される。 「調節剤」によっては、アゴニスト、アンタゴニスト、およびアロステリック 調節剤などを初めとする、受容体を調節する化合物が意味される。調節剤はその 受容体に結合することが好ましい。 「筋肉弛緩剤」によっては、筋肉の緊張を減少させる化合物が意味される。 「神経痛」によっては、一本もしくは複数本の神経の分布における疼痛が意味 される。 「神経変性性疾患」によっては、中枢神経系の細胞に影響を及ぼし、正常に機 能する神経系細胞の能力の進行性低下がもたらされる神経学的疾患が意味される 。神経変性性疾患の例には、アルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ）病、ハ ンチントン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ）病、およびパーキンソン（Ｐｅｒｋｉ ｎｓｏｎ’ｓ）病が含まれる。 「神経学的障害および疾患」によっては、神経系の障害および疾患が意味され る。神経学的障害および疾患の例には、全体性および局所性虚血性発作、ならび に出血性脳卒中、頭部創傷、脊髄損傷、心臓停止および新生児窮迫の際のような 低酸素誘導性神経細胞損傷、ならびに癲癇が含まれる。 「神経保護活性」によっては、神経学的障害および疾患の治療における効果が 意味される。 「物理的に検出可能な手段」によっては、本明細書に記載される結合法および スクリーニング法を初めとする、ｍＧｌｕＲもしくはＣａＲ受容体への結合もし くはその調節を検出するための当業者に知られるいずれかの手段が意味される。 従って、たとえば、このような手段は、分光光学的方法、クロマトグラフィー法 、競合性結合アッセイ、および特定の細胞機能のアッセイ、ならびに他の技術を 含むことができる。 「強力な」によっては、代謝指向型グルタミン酸受容体で、一つもしくは複数 の受容体活性に関し、１００μＭを下回る、一層好ましくは１０μＭを下回る、 そして更に一層好ましくは１μＭを下回るＥＣ₅₀値（半最大活性を生じる濃度） もしくはＩＣ₅₀（半最大阻害を生じる濃度）もしくはＫ_d（半最大結合を生じる 濃度）を有する化合物が意味される。 「選択的」によっては、その化合物が、イオンチャンネル内蔵型グルタミン酸 受容体を活性化する、その活性を阻害する、および／またはその受容体に結合す るよりも低い濃度で代謝指向型グルタミン酸受容体を活性化する、その活性を阻 害する、および／またはその受容体に結合することが意味される。好ましくは、 濃度差は１０倍、一層好ましくは５０倍、および更に一層好ましくは１００倍で ある。 「療法上有効な量」によっては、患者において所望される治療効果を生じる化 合物の量が意味される。たとえば、疾患もしくは障害に関しては、これはその疾 患もしくは障害の一つもしくは複数の症状をある程度減少させ、そして部分的も しくは完全のいずれかでその疾患もしくは障害に関連するかもしくはその原因と なる生理学的もしくは生物学的パラメーターを正常に戻す量である。ある患者を 療法的に治療するのに用いられる場合には、これは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ ｍｇ／ｋｇの間、好ましくは５０ｍｇ／ｋｇを下回る、一層好ましくは１０ｍｇ ／ｋｇを下回る、一層好ましくは１ｍｇ／ｋｇを下回ることが予測される量であ る。その量が、代謝指向型グルタミン酸受容体において約１ｎＭ〜１０μＭの化 合物の有効濃度を提供することが好ましい。化合物の量はそのＥＣ₅₀（アンタゴ ニストの場合にはＩＣ₅₀）、ならびに患者に関する年齢、サイズ、および疾患に 依存する。 ＩＩ．技術 Ａ．キメラ受容体および使用への一般的アプローチ 先の「要約」に示されるように、本発明は、代謝指向型グルタミン酸受容体と カルシウム受容体の両蛋白質の部分を含むキメラ受容体に関する。本発明は更に 、代謝指向型グルタミン酸受容体およびカルシウム受容体のフラグメントにも関 する。関連する態様には、そのようなキメラ受容体およびフラグメントをコード する核酸、そのような受容体、フラグメント、および核酸の使用、ならびにその ような核酸を発現する細胞株が含まれる。開示される使用には、そのようなキメ ラ受容体およびフラグメントを用いて、代謝指向型グルタミン酸受容体もしくは カルシウム受容体に結合するかもしくはその活性を調節する化合物をスクリーニ ングする方法が含まれる。本発明は更に、そのようなスクリーニング法により同 定される代謝指向型グルタミン酸受容体もしくはカルシウム受容体を調節するた めの化合物、ならびにそのような化合物を利用して所定の障害を治療するため、 あるいは代謝指向型グルタミン酸受容体もしくはカルシウム受容体を調節するた めの方法も含む。 幾つかの異なるＧ蛋白質共役型受容体について実施された実験により、Ｇ蛋白 質共役特異性および受容体脱感作は主に、細胞内に存在するアミノ酸配列（すな わち、３本の細胞質ループおよび／または細胞内細胞質テイルの内の一つもしく は複数内の配列）により決定されるという一般原則が既に示唆されている。異な る代謝指向型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）からの個別の蛋白質セグメント を組み合わせることによりキメラ受容体を形成するという最近の実験により、こ れらの受容体ではリガンド結合特異性は細胞外ドメインにより決定されるという ことが示唆される。 従って本発明の好ましい態様は、ｍＧｌｕＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、な らびにカルシウム受容体（ＣａＲ）の７回貫膜ドメイン（７ＴＭＤ）および細胞 内細胞質テイル（ＣＴ）からなるキメラ受容体を含み、ＣａＲ活性分子がＣａＲ に作用する際に観察されるものに類似するシグナル伝達によりｍＧｌｕＲ活性分 子に応答する。 同様に他の好ましい態様では、本発明は、選択されたｍＧｌｕＲの細胞内細胞 質Ｃ−末端テイルドメインがカルシウム受容体のＣ−末端テイルにより置換され ているキメラ受容体を含む。Ｃ−末端テイルは７回貫膜領域の後に存在する細胞 質領域を包含する。 本発明の好ましい態様は更に、ｍＧｌｕＲの細胞質ループドメイン（第一と第 二、第三と第四、および第五と第六貫膜領域の間）の全てもしくは幾つかを包含 するペプチド配列が一つもしくは複数のＣａＲからの対応するペプチド配列で類 似様式で置換されているキメラ受容体をも含む。具体的にはそのような態様は、 ｍＧｌｕＲのＥＣＤ、ｍＧｌｕＲの７ＴＭＤ、およびカルシウム受容体のＣ−末 端テイルを有するキメラ受容体を含むが、ただし７−ＴＭＤの一つもしくは複数 のサブドメインはＣａＲからの配列で置換されている。これは特に、７ＴＭＤの 一つもしくは複数の細胞質ループがＣａＲからの配列で置換されている受容体を 含む。細胞質ループのこのような置換は、単一もしくはいずれかの組み合わせで 実施してもよい。一般的には当業者に知られる技術を用いて、そのような標的「 ドメイン」および「サブドメイン」は個別もしくは組み合わせて「スワッピング 」することができる。 これらのキメラ受容体は当業者に知られておらず、機能的キメラ受容体はこれ までには一層緊密に関連し合った受容体の部分を組み合わせることによってのみ その構築に成功していたに過ぎないため、それらの機能は予測できない。実際の ところ、代謝指向型グルタミン酸受容体とカルシウム受容体との間の配列同一性 は僅か１９〜２５％であり、かつこの２タイプの受容体は僅か約２５〜３０％の 配列類似性を共有するに過ぎない（Ｂｒｏｗｎ Ｅ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ ｕｒｅ ３６６：５７５、１９９３）。 実験により、天然のｍＧｌｕＲについてのアゴニストもしくはアンタゴニスト である当該技術分野で知られるリガンドも、細胞外ドメインがｍＧｌｕＲからの ものであるキメラ受容体においてそのような活性を呈示することが既に示されて いる。ＥＣＤに結合し、かつｍＧｌｕＲの活性を調節する他のリガンド（たとえ ば、アゴニスト、アンタゴニスト、およびアロステリック調節剤など）もそのよ うなキメラ受容体に作用することが予測される。実験により更に、当該技術分野 に知られるｍＧｌｕＲを調節するリガンドが、ＥＣＤおよび７ＴＭＤがｍＧｌｕ Ｒからのものであるキメラ受容体に作用することも既に示されている。ｍＧｌｕ Ｒ活性を調節する他のリガンドも、それらがｍＧｌｕＲのＥＣＤもしくは７ＴＭ Ｄに結合するか否かには関わりなく、このタイプのキメラ受容体に作用すること が予測される。 キメラ受容体は、非修飾カルシウム受容体について知られる連結に類似する様 式で細胞内もしくは第二メッセンジャーの機能に連結される。たとえばＣａＲに ついての場合と同様に、キメラ受容体はＧ蛋白質（一つもしくは複数）との共役 を通してホスホリパーゼＣの活性化、イノシトールリン酸の生成、および／また は細胞内貯蔵庫からのカルシウムイオンの放出を行う。ｍＧｌｕＲはリガンド結 合／活性化の際には迅速に脱感作するが、ＣａＲはそうではないため、ＣａＲに 活性を示す化合物の一層効果的な高処理量スクリーニングおよび組換え細胞株内 での安定な受容体発現が可能となる。キメラｍＧｌｕＲ／ＣａＲ受容体はリガン ド結合／活性化の際には迅速に脱感作せず、かつそのため高処理量スクリーニン グのために効果的に用いることができることは重要である。それに加え、キメラ 受容体は安定な細胞株で機能的に発現され得る。 このようなキメラ受容体を発現する細胞を調製し、そして選択されたｍＧｌｕ Ｒの活性を調節する化合物を同定するための機能性アッセイに用いることができ る。たとえば、受容体の活性化によりもたらされる細胞内カルシウムレベルの増 加を、蛍光カルシウムキレート染料の使用によりモニターすることができる。カ ルシウム受容体において作用を示す分子を同定するための機能性アッセイが既に 記載されている（たとえば、公開されているＰＣＴ特許出願「Ｃａｌｃｉｕｍ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、ＰＣＴ第ＵＳ９３／ ０１６４２号（国際公開第９４／１８９５９号）（１９９４年９月に公開され、 引用によりその全文が本明細書に取り込まれる）。 現代における薬剤の発見の際に益々一般的になってきている常法は、目的の活 性を有する特異的分子を同定するための様々な標的部位特異的アッセイの使用で ある。これらのアッセイにより分子の巨大コレクションもしくはライブラリー（ たとえば、組み合わせライブラリー、大規模な製薬会社により保持される所有化 合物ライブラリーなど）から薬剤リード分子が選択される。薬剤リード分子は、 それらが目的の薬理学的標的に結合し、このことにより潜在的にそれらの標的の 活性を修飾する場合に「選択」される。このアッセイは、直接結合性置換アッセ イもしくは間接的機能性アッセイを初めとする多くのタイプのものであることが できる。治療用リード化合物を単離するためのアッセイを首尾よく開発および使 用する目的では、標的分子（たとえば、受容体）をまず最初に同定および単離す る必要がある。様々な受容体において活性を示す分子を同定するための多くの機 能性アッセイが既に文献に記載されており、そしてそれらのアッセイにより結合 性アッセイに勝る独特な利点が提供される。演繹的に、どのリガンド分子がイン ビトロでその受容体の活性を調節しているのかを知ることは必要ではないし、そ してその受容体の厳密な生理学的機能を知ることも必要ではない。機能性アッセ イおよび後続の医薬品化学的研究において同定された化合物を、そのような情報 を取得するための実験的被験化合物として用いることができる。 ８つの固有なｍＧｌｕＲが現在知られているが、それらの個々の機能の詳細は ほとんど未明のままである。それにもかかわらず、ｍＧｌｕＲにおいて活性を示 す分子が製薬会社により探索されているが、それはそれらの受容体が中枢神経系 において見いだされ、かつ記憶、運動機能、疼痛感覚、および神経変性などに関 連する過程の調節に関わっていることが知られているためである。従って、ｍＧ ｌｕＲを調節する化合物は、記憶、認識、および運動機能（たとえば、発作時の ）に影響を及ぼす障害もしくは疾患の治療、ならびに疼痛および神経変性性障害 （たとえば、卒中、およびアルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ）病など） の治療に有用であろう。 ｍＧｌｕＲにおいて活性である分子を同定するためのスクリーンは、クローン 化ｍＧｌｕＲ自体を用いて構築できる。しかし天然ｍＧｌｕＲを用いた機能性ス クリーンは問題が多い。第１に、大部分のｍＧｌｕＲはＧ₁蛋白質を介して共役 しており、これが機能アッセイにそれらを用いるのを制限する。Ｇ_i蛋白質はア デニレートシクラーゼの阻害に連結しており、アデニレートシクラーゼの変化は 大規模な化合物ライブラリーから薬物リード分子を選択するように設計された高 処理量の機能性スクリーンでは容易には測定されないからである。 他のＧ蛋白質を介してホスホリパーゼＣの活性化に共役している受容体（たと えばＧ_q共役受容体）はこの欠点をもたないので、ｍＧｌｕＲ１およびｍＧｌｕ Ｒ５が機能アッセイに利用できると当初は考えられた。これら２種類のｍＧｌｕ Ｒは、Ｇ_q蛋白質（１またはそれ以上）を介して、測定可能な細胞内機能（たと えばホスホリパーゼＣの活性化、イノシトールリン酸の生成、および細胞内貯蔵 所からのカルシウムイオンの放出）に共役しているからである。 しかしここに第２の制限が提起される。これらのｍＧｌｕＲはアゴニストが結 合すると急速に脱感作されるからである。すなわち機能性応答が急速に消失し、 速やかには回復できない（たとえば図８ａ参照）。さらに、それらが共役するＧ 蛋白質に無関係にｍＧｌｕＲを発現する完全に機能性である安定な細胞株を得る のは必ずしも可能ではなかった（Ｔａｎａｂａ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｅ ｕｒｏｎ ８：１６９−１７９；Ｇａｂｅｌｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４ ，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ Ｉｎｔ．２４：５３３−５３９）。したがって天然ｍＧ ｌｕＲを最適な様式で高処理量の機能性スクリーニングアッセイに用いるために は重大な技術的難点を克服しなければならない。 本明細書に記載する発明は、リガンド結合／活性化に際して急速に脱感作され ることがなく、組換え脊椎動物細胞において安定に発現しうるカルシウム受容体 の、より強固な面を利用することによって、これらの技術的難点を克服し、はる かに改良されたスクリーニング法を提供する（たとえば図８ｂ参照。公開された 国際特許出願“カルシウム受容体−活性分子”、国際特許出願第ＵＳ９３／０１ ６４２号（ＷＯ９４／１８９５９）、１９９４年９月公開、も参照されたい。こ れは参考として本明細書に含まれる）。たとえばＣａＲの７ＴＭＤおよびＣＴを ｍＧｌｕＲの細胞外ドメインに、またはＣａＲのＣＴをｍＧｌｕＲのＥＣＤおよ び７ＴＭＤに結合させることにより、ｍＧｌｕＲの細胞外ドメインは急速に脱感 作されないという改良された性質のほか、ＣａＲのＧｑ共役特性という利点をも 備えている（たとえば図８ｃ参照）。したがって本発明は、天然ｍＧｌｕＲのも のと類似のリガンド結合性および活性化特性を備え、ただしＣａＲと類似する改 良された第２メッセンジャー共役性を備えたキメラ受容体を提供する。 したがって、本発明のキメラ受容体はｍＧｌｕＲ活性分子の同定を簡単にし、 効果的、実用的かつ再現性のある機能性スクリーンを可能にするので、本発明の 組成物および方法はｍＧｌｕＲ活性またはカルシウム受容体活性を調節する分子 の同定に有用である。これらの分子には、たとえばアゴニスト、アンタゴニスト 、アロステリック調節剤などが含まれる。たとえば代謝指向型グルタミン酸受容 体において活性である化合物をスクリーニングするために構築されるキメラ受容 体に、カルシウム受容体の特定のドメインのシグナル伝達特性を使用できる。こ のようなキメラ受容体は、ホスホリパーゼＣを活性化して細胞内カルシウムを移 動させるＧ蛋白質へのカルシウム受容体のアゴニスト誘導性共役に伴う特定の特 異な特性を利用するであろう。これらの特性には、たとえばリガンド誘導による ダウンレギュレーション／脱感作がないことが含まれ、これに伴って代謝指向型 グルタミン酸受容体がリガンド活性化される。こうして、ホスホリパーゼＣを活 性化して細胞内カルシウムを移動させるＧ蛋白質と普通は共役しない代謝指向型 グルタミン酸受容体、たとえばＧ_iと共役する受容体に、カルシウム受容体の卓 越したシグナル伝達特性を伝達できる。 ある態様においては、このようなキメラ受容体を発現する組換え細胞をスクリ ーニング法に用いる。細胞は前記の特性を獲得し、これによってそれらを高処理 量機能アッセイに利用するのが容易になり、したがって代謝指向型グルタミン酸 受容体に結合するかまたはその活性を調節する化合物についての、より効果的な スクリーニング法が提供される。 一般に、有用なキメラ受容体はｍＧｌｕＲおよびＣａＲの部分を、それらの部 分が目的とする結合、シグナル共役または他の機能性をキメラ受容体に付与する ように含有する。個々の受容体に由来する配列の長さは、異なる用途においては 異なる大きさであってよい。さらに、特定の受容体に由来する部分の配列は、ｍ ＧｌｕＲもしくはＣａＲ中の対応する配列と同一であってもよく、またはｍＧｌ ｕＲもしくはＣａＲ配列の当該機能を保持する相同配列であってもよい。したが って本発明のキメラ受容体は、細胞外ドメイン、７回貫膜ドメイン、および細胞 内細胞質テイルドメインをもつ。これらのキメラ受容体は、ｍＧｌｕＲ由来の配 列と相同な少なくとも６アミノ酸の連続配列、およびＣａＲ由来の配列と相同な 少なくとも６アミノ酸の連続配列をもつ。しかし多くの場合、ｍＧｌｕＲおよび ／またはＣａＲ由来の配列は６アミノ酸より長くてもよい。たとえばそれらの配 列のうち一方または両方が少なくとも１２、１８、２４、３０、３６またはそれ 以上のアミノ酸の長さであってもよい。 ｍＧｌｕＲ由来の部分とＣａＲ由来の部分は通常は同一長さではないであろう 。たとえばこれらのタイプのうち一方に由来する配列が上記の長さ（たとえば少 なくとも６、１２、１８、２４、３０、３６またはそれ以上のアミノ酸）であり 、これに対しキメラ受容体の残りの配列が他方のタイプの受容体に由来する配列 と同一または相同であってもよい。 ある態様においては、少なくとも一方の受容体タイプに由来する部分がサブド メインである。これに関して“サブドメイン”は、ドメインについてのアミノ酸 の全配列より少ないアミノ酸配列を意味する。サブドメインの例にはリガンド結 合性ドメインが含まれるが、これに限定されない。他の例には細胞質ループまた は７回貫膜ドメインの領域の１つが含まれる。したがってある場合には、キメラ 受容体は細胞外ドメイン、７回貫膜ドメイン、および細胞内細胞質テイルドメイ ンをもち、これらはサブドメインを含む。このようなキメラ受容体の１例におい ては、少なくとも１つのサブドメインがカルシウム受容体のサブドメインに相同 であり、残りのサブドメインおよびドメインが代謝指向型グルタミン酸受容体の サブドメインおよびドメインに相同である。他の例においては、少なくとも１つ のサブドメインが代謝指向型グルタミン酸受容体のサブドメインに相同であり、 残りのサブドメインおよびドメインがカルシウム受容体のサブドメインおよびド メインに相同である。 より具体的な例においては、キメラ受容体の７回貫膜ドメインは３つの細胞質 ループを含有する；少なくとも１つの細胞質ループは代謝指向型グルタミン酸受 容体の細胞質ループに相同である；または少なくとも１つの細胞質ループはカル シウム受容体の細胞質ループに相同である。他の具体例においては、細胞外ドメ インは代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であり、７回貫膜 ドメインは代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに相同であり、た だし７回貫膜ドメインの１またはそれ以上の細胞質ループはカルシウム受容体の 細胞質ループ（１またはそれ以上）と相同であり、細胞質テイルはカルシウム受 容体の細胞質テイルと相同である。このように細胞質ループ１、２および３はい ずれも、１個だけまたはいかなる組合わせにおいても、カルシウム受容体の細胞 質ループ（１またはそれ以上）で置換できる。 他の場合にはキメラ受容体は、ｍＧｌｕＲもしくはＣａＲのドメインまたは好 ましくはｍＧｌｕＲおよびＣａＲそれぞれに由来する少なくとも１つのドメイン の配列と同一または相同な配列のドメインをもつ。より好ましくは、キメラ受容 体は１受容体タイプに由来する２つのドメインおよび他の受容体タイプに由来す る１つのドメインをもつ。このようなキメラ受容体の特定の好ましい態様の組成 物を以下に記載する： 下記をもつキメラ受容体を含む組成物 １．カルシウム受容体の細胞外ドメインに相同な１つのドメイン、代謝指向 型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに相同な１つのドメイン、および代謝 指向型グルタミン酸受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同な１つのドメイ ン；または ２．代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同な１つのドメイ ン、カルシウム受容体の７回貫膜ドメインに相同な１つのドメイン、およびカル シウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同な１つのドメイン；または ３．代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同な１つのドメイ ン、カルシウム受容体の７回貫膜ドメインに相同な１つのドメイン、および代謝 指向型グルタミン酸受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同な１つのドメイ ン；または ４．カルシウム受容体の細胞外ドメインに相同な１つのドメイン、代謝指向 型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに相同な１つのドメイン、および カルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同な１つのドメイン；また は ５．カルシウム受容体の細胞外ドメインに相同な１つのドメイン、カルシウ ム受容体の７回貫膜ドメインに相同な１つのドメイン、および代謝指向型グルタ ミン酸受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同な１つのドメイン；または ６．代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同な１つのドメイ ン、代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに相同な１つのドメイン 、およびカルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同な１つのドメイ ン；または ７．代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同な１つのドメイ ン、代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに相同な１つのドメイン （ただし１またはそれ以上の細胞質ループがカルシウム受容体の細胞質ループ（ １またはそれ以上）と相同な細胞質ループ（１またはそれ以上）で置換されてい る）、およびカルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同な１つのド メイン。 Ｂ．キメラ受容体をコードする核酸 上記のキメラ受容体をコードする単離された核酸分子を含有する組成物も本発 明において有用である。そのような核酸分子を単離、精製または濃縮できる。好 ましくは核酸は、調製物中に存在する全核酸の少なくとも７５％、より好ましく は８５％、最も好ましくは９５％となる、実質的に純粋な調製物として提供され る。 そのような核酸分子は複製可能な発現ベクター中に存在してもよい。複製可能 な発現ベクターを好適な宿主細胞中へ形質転換して、組換え宿主細胞を得ること ができる。本発明はそのような形質転換した宿主細胞を用いて、キメラ受容体を 製造する方法をも提供する。この方法は、核酸分子をキメラ受容体の発現が可能 な様式で含む複製可能な発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションし た原核生物または真核生物宿主細胞を好適な栄養条件下で増殖させることを含む 。 キメラ受容体または受容体フラグメントをコードする核酸の用途には、以下の うち１またはそれ以上が含まれる：受容体蛋白質の製造、これはたとえば構造決 定、受容体に対する分子の活性のアッセイ、療法薬として有用な分子のスクリー ニング、および受容体に結合する抗体の入手に利用できる。本発明のキメラ受容 体は、カルシウム受容体または代謝指向型グルタミン酸受容体のいずれか、また は両方において活性である化合物の同定に有用である。また本発明のフラグメン トは、カルシウム受容体または代謝指向型グルタミン酸受容体のいずれか、もし くは両方に結合するか、またはそれらを調節する化合物の同定に有用である。 したがって本発明は、たとえば代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメイ ンをコードする単離した核酸であって、その代謝指向型グルタミン酸受容体の７ 回貫膜ドメインおよび細胞内細胞質テイルドメインを実質的に含まないものをも 提供する。同様に、単離した核酸は、少なくとも１つの膜スパニングドメイン部 分を実質的に含まない代謝指向型グルタミン酸受容体をコードすることができる 。他の例においては、単離した核酸は、その代謝指向型グルタミン酸受容体の細 胞外ドメインを実質的に含まない代謝指向型グルタミン酸受容体をコードするこ とができる。 Ｃ．代謝指向型グルタミン酸受容体フラグメントおよびカルシウム受容体フラ グメント 受容体フラグメントは代謝指向型グルタミン酸受容体またはカルシウム受容体 の部分である。好ましくは受容体フラグメントは、全長受容体に結合する１また はそれ以上の結合剤に結合する。結合剤にはリガンド、たとえばグルタミン酸、 キスカル酸、アゴニストおよびアンタゴニスト、ならびに受容体に結合する抗体 が含まれる。フラグメントは、受容体に結合しうる他の分子を選択する用途など 、種々の用途をもつ。 フラグメントは標準法、たとえば受容体ＤＮＡのクローン化した部分配列の発 現、および受容体蛋白質の蛋白質分解性開裂により生成できる。蛋白質は蛋白質 分解酵素、たとえばトリプシン、キモトリプシンまたはペプシンによって特異的 に開裂する。これらの酵素はそれぞれ、それが攻撃するタイプのペプチド結合に 関して特異的である。トリプシンは、そのカルボニル基が塩基性アミノ酸、通常 はアルギニンまたはリシンに由来するペプチド結合の加水分解を触媒する。ペプ シンおよびキモトリプシンは芳香族アミノ酸、特にトリプトファン、チロシンお よびフェニルアラニンに由来するペプチド結合の加水分解を触媒する。 開裂蛋白質フラグメントの別の組が、蛋白質分解酵素に感受性である部位にお ける開裂を阻止することにより生成する。たとえばリシンのε−アミノ基とエチ ルトリフルオロチオアセテートを緩和な塩基性の溶液中で反応させると、その隣 のペプチド結合がトリプシンによる加水分解に対してもはや感受性でない遮断さ れたアミノ酸残基が得られる（Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ.,Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ １：４０１，１９６２）。したがって、このようなポリペプチ ドをトリプシンで処理するとアルギニル残基においてのみ開裂する。 蛋白質分解酵素による加水分解に対して感受性であるペプチド結合を形成する ように、ポリペプチドを修飾することもできる。たとえばシステイン残基をβ− ハロエチルアミンでアルキル化すると、トリプシンで加水分解されるペプチド結 合が得られる（Ｌｉｎｄｌｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ １７８：６４７，１９５６）。 さらに、ポリペプチド鎖を特定の残基において開裂させる試薬を使用できる（ Ｗｉｔｃｏｐ，Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．，１６．２２１，１９６１ ）。たとえば臭化シアンはボリペプチドをメチオニン残基において開裂させる（ Ｇｒｏｓｓ ＆ Ｗｉｔｋｉｐ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８３．１５１ ０，１９６１）。 こうして代謝指向型グルタミン酸受容体またはそのフラグメントを修飾剤、蛋 白質分解酵素および／または試薬の多様な組み合わせにより処理することによっ て、種々の大きさをもつ異なるオーバーラップしたペプチドが多数生成する。こ れらのペプチドフラグメントを、そのような消化物からクロマトグラフィー法に より単離および精製できる。あるいは適切な固体状態での合成法を用いてフラグ メントを合成できる。 目的とする生物学的活性をもつフラグメントを選択できる。たとえばフラグメ ントはリガンド結合部位のみを含むことができる。そのようなフラグメントは、 フラグメントに対する特異的結合を検出するためのルーティン法により当業者が 容易に同定できる。たとえば代謝指向型グルタミン酸受容体の場合、受容体フラ グメントをコードする核酸を発現させてポリペプチドフラグメントを生成させ、 次いでこれを適切な結合条件下で受容体リガンドと接触させて、そのリガンドが そのフラグメントに結合するか否かを判定することができる。そのようなフラグ メントは、グルタミン酸のアゴニストおよびアンタゴニストについての、ならび に血清または他の身体組織からグルタミン酸を分離するのに有用な療法効果につ いてのスクリーニングアッセイに有用である。 他の有用なフラグメントには、受容体の細胞外部分、膜スパニング部分、また は細胞内部分のみをもつものが含まれる。これらの部分は、受容体のアミノ酸配 列を既知の受容体の配列と比較することにより、または他の標準的方法で、容易 に同定できる。これらのフラグメントは他の受容体のフラグメントと共にキメラ 受容体を形成して、細胞内で目的の機能を果たす細胞内部分、および細胞をグル タミン酸、または本明細書に記載するアゴニストもしくはアンタゴニストの存在 に対して応答させる細胞外部分を備えた受容体を作成するのに有用である。キメ ラ受容体遺伝子は適切に配合された場合には、受容体の機能不全を伴う、または 受容体機能の調節が患者に望ましい効果を与える、多様な疾病の遺伝子療法に有 用である。 さらに、細胞内ドメインを熱量測定、放射測定、発光測光、分光測光または蛍 光測光アッセイによって容易に検出できる目的酵素プロセスに共役するように、 また細胞外部分とその天然リガンド（たとえばグルタミン酸）あるいは本発明の アゴニストおよび／またはアンタゴニストとの相互作用によって活性化されるよ うに、キメラ受容体を構築できる。そのようなキメラ受容体を発現する細胞を用 いて、代謝指向型グルタミン酸受容体アゴニストおよびアンタゴニスト、ならび に場合によっては無機イオン受容体アゴニストおよびアンタゴニストのスクリー ニングを容易にすることができる。 したがって本発明は、カルシウム受容体、代謝指向型グルタミン酸受容体、ま たはカルシウム受容体配列および代謝指向型グルタミン酸受容体配列を含有する キメラ受容体のフラグメントまたは精製ポリペブチドをも提供する。これらのフ ラグメントを用いて、代謝指向型グルタミン酸受容体またはカルシウム受容体に おいて活性である化合物をスクリーニングすることができる。たとえば、カルシ ウム受容体または代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインを含有するフ ラグメントを可溶性受容体結合アッセイに用いて、組合わせライブラリー中のど の分子がアッセイ領域内の受容体を結合しうるかを同定できる。そのような“結 合性”分子はその受容体の機能に影響を与えると推定できる。好ましい受容体フ ラグメントには、機能性受容体活性、結合部位、抗体認識のためのエピトープ（ 一般に少なくとも６個のアミノ酸）、および／または代謝指向型グルタミン酸受 容体アゴニスト、アンタゴニストもしくは調節剤を結合する部位をもつものが含 まれる。他の好ましい受容体フラグメントには、細胞外部分、貫膜部分、細胞内 部分、および／または多重貫膜部分（たとえば７回貫膜部分）のみをもつものが 含まれる。そのような受容体フラグメントは多様な用途をもち、たとえば特定の 領域に対する抗体を得るために用いられ、またキメラ受容体または他の受容体の フラグメントを形成して特異な特性を備えた新規受容体を作成するために用いら れる。 精製したポリペプチドまたはフラグメントは、好ましくは代謝指向型グルタミ ン酸受容体またはカルシウム受容体またはキメラ受容体の少なくとも６個の連続 アミノ酸を含む。ポリペプチドに関して“精製”とは、ポリペプチドが天然に産 するポリペプチドと別個の形（すなわちそれと他の分子が結合したもの）である ことを意味する。好ましくはポリペプチドは、調製物中に存在する全蛋白質の少 なくとも７５％、より好ましくは８５％、最も好ましくは９５％となる実質的に 純粋な調製物として提供される。 多くの用途において、精製したポリペプチドまたはフラグメントは代謝指向型 グルタミン酸受容体またはカルシウム受容体またはキメラ受容体に由来する６個 より多い連続アミノ酸を含むことが好ましい。たとえば精製ポリペプチドは“母 体”受容体の少なくとも１２、１８、１４、３０、３６またはそれ以上の連続ア ミノ酸を含むことができる。 カルシウム受容体、代謝指向型グルタミン酸受容体、またはキメラ受容体の７ 回貫膜ドメインおよび細胞質テイルドメインのみを含有する他のフラグメントを 調製できる。そのようなフラグメントは、たとえばその作用部位が７回貫膜ドメ インである化合物をスクリーニングするための機能アッセイに有用である。 前記のように本発明は、受容体フラグメントを用いる、受容体に結合する化合 物のスクリーニング法を提供する。１例においては本方法は以下の工程を含む： 受容体のフラグメントをコードする核酸配列を調製し；宿主においてそのフラグ メントを発現しうる複製可能な発現ベクターにこの配列を挿入し；宿主細胞をこ のベクターで形質転換し；宿主細胞からフラグメントを回収し；フラグメントお よび被験化合物を許容しうる媒質に導入し；そしてこのフラグメントへのその化 合物の結合を物理的に検出可能な手段でモニターする。受容体が代謝指向型グル タミン酸受容体である場合、フラグメントは好ましくは代謝指向型グルタミン酸 受容体の細胞外ドメイン、または代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメ イン、または代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テ イルドメインを含有する。受容体がカルシウム受容体である場合、フラグメント は好ましくはカルシウム受容体の細胞外ドメイン、またはカルシウム受容体の７ 回貫膜ドメイン、またはカルシウム受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テイ ルドメインを含有する。 代謝指向型グルタミン酸受容体およびカルシウム受容体の特定のフラグメント は、相互作用する化合物と接触した際に普通は“母体”受容体によって活性化さ れる１またはそれ以上の細胞応答を活性化する機能を維持する。たとえばｍＧｌ ｕＲまたはＣａＲの７ＴＭＤおよびＣＴを含有するがＥＣＤを含有しない細胞発 現フラグメントは、７ＴＭＤと相互作用する化合物と接触した際に細胞応答（１ またはそれ以上）を活性化できる。したがって代謝指向型グルタミン酸受容体ま たはカルシウム受容体に結合するかまたはそれらを調節する化合物、たとえばキ メラ受容体につき本明細書に記載した化合物をスクリーニングするための、細胞 を基礎とする方法にそのようなフラグメントを採用することは、欠失した配列で はなくそのフラグメントと相互作用する活性化合物を同定するのに有用である。 カルシウム受容体、代謝指向型グルタミン酸受容体、またはカルシウム受容体 配列と代謝指向型グルタミン酸受容体配列を含むキメラ受容体の単離されたフラ グメントをインビトロ機能アッセイにおいて組み合わせて、いずれかの受容体に おいて活性である化合物をスクリーニングできる。そのようなインビトロアッセ イは、たとえば一方の受容体の細胞外ドメインをもつフラグメント、ならびに他 方の受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テイルドメインをもつフラグメント を含むことができ、その際細胞外ドメインはインビトロで７回貫膜／細胞質テイ ルドメインフラグメントを相補するであろう。こうして、スクリーニングアッセ イに有用な機能性キメラ受容体が、それらをコードする核酸の組換えの必要なし に調製される。代わりにこれらの機能性キメラ受容体は、異なる受容体の部分を インビトロで組み合わせることにより得られる。 このようなフラグメントの組合わせにより、受容体に結合するかまたは受容体 を調節する化合物をスクリーニングする方法が提供される。このような方法の例 には、以下の工程が含まれる：第１受容体のフラグメントである第１フラグメン トをコードする核酸配列を調製し；宿主においてそのフラグメントを発現しうる 複製可能な発現ベクターにこの配列を挿入し；宿主細胞をこのベクターで形質転 換し：宿主細胞からフラグメントを回収し；第２受容体のフラグメントである第 ２フラグメントをコードする核酸配列を調製し；宿主において第２フラグメント を発現しうる複製可能な発現ベクターにこの配列を挿入し；宿主細胞をこのベク ターで形質転換し；宿主細胞から第２フラグメントを回収し；第１フラグメント および第２フラグメントの両方を許容しうる媒質に導入し；そしてこの化合物の 結合および調節を物理的に検出可能な手段でモニターする。 特に好ましい例においては、第１フラグメントは代謝指向型グルタミン酸受 容体の細胞外ドメインを含有し、第２フラグメントはカルシウム受容体の７回貫 膜ドメインおよび細胞質テイルドメインを含有する；第１フラグメントはカルシ ウム受容体の細胞外ドメインを含有し、第２フラグメントは代謝指向型グルタミ ン酸受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テイルドメインを含有する；または 第１フラグメントはカルシウム受容体の細胞外ドメインを含有し、第２フラグメ ントは代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインおよびカルシウム受容 体の細胞質テイルドメインを含有する。 Ｄ．キメラ受容体を用いた、代謝指向型グルタミン酸受容体活性を調節する化 合物を同定するためのスクリーニング法 科学文献に記載されるｍＧｌｕＲアゴニストおよびアンタゴニスト化合物は、 内因性アゴニストであるグルタミン酸に関連をもつ（総説については以下を参照 されたい：Ｃｏｃｋｃｒｏｆｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ． ２３：５８３−５９４，１９９３；Ｓｃｈｏｅｐｐ ａｎｄ Ｃｏｎｎ，ＴＩＰ Ｓ １４：１３−２０，１９９３；Ｈｏｌｌｍａｎｎ ａｎｄ Ｈｅｉｎｅｍａ ｎｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：３１−１０８，１９９４） 。そのようなアゴニストおよびアンタゴニスト化合物は、酸性部分、通常はカル ボン酸部分、時にはホスファチジン酸部分を含む。その場合、そのような化合物 は恐らくアミノ酸であるグルタミン酸と同じ部位でｍＧｌｕＲを結合するのであ ろう。これは、グルタミン酸の競合的アンタゴニストであることが示されたメチ ルカルボキシルフェニルグリシンにつき確認された（Ｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ． ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．−Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｅｃｔ．２４４：１９５ −１９７，１９９３）。ｍＧｌｕＲにおいて活性であり、負の電荷をもたず、か つアミノ酸であるグルタミン酸に類似しない化合物は、グルタミン酸結合部位に おいて作用しないと推定できる。 代謝指向型グルタミン酸受容体を標的とする化合物は、診断用および治療用を 含めた幾つかの用途をもつ。多数のそれらの化合物の合成がＮｅｍｅｔｈらによ り“カルシウム受容体活性分子”と題する国際特許出願公開第ＷＯ ９３／０４ ３７３号に記載されており、これは本明細書に参考として含まれるものとする。 代謝指向型グルタミン酸受容体に結合する化合物、および代謝指向型受容体グル タミン酸の活性を調節するのに有効な化合物を、本明細書に記載する方法で同定 できる。代謝指向型グルタミン酸受容体に選択的に結合しうる化合物は、他のグ ルタミン酸受容体に対比して代謝指向型グルタミン酸受容体の存在を測定するた めに診断用として使用できる。 以下に、代謝指向型グルタミン酸受容体活性を調節する化合物を得るために使 用しうる方法を記載する。ある化合物が代謝指向型グルタミン酸受容体調節剤ま たはカルシウム受容体調節剤の１またはそれ以上の活性をもつ効力を測定するこ とによりそれが本発明のキメラ受容体の活性を調節する効力を評価するために、 種々のスクリーニング法を実施できる。本発明のキメラ受容体を発現する細胞に おいて、そのような活性には細胞内カルシウム、イノシトールリン酸およびサイ クリックＡＭＰに及ぼす影響が含まれる。 ｆｕｒａ−２による［Ｃａ²⁺］_iの測定は、新規な有機分子の活性をスクリー ニングするための極めて迅速な手段を提供する。午後だけで１０〜１５種類の化 合物（または分子タイプ）を試験し、それらが細胞内Ｃａ^2-を移動させる効力、 または移動を阻害する効力を１回の実験で評価することができる。観察されるＣ ａ²⁺］_iの増加の、ＰＭＡによる抑制に対する感受性も評価できる。 たとえばｆｕｒａ−２を負荷した、本発明のキメラ受容体を発現する組換え細 胞を、まず０．５ｍＭ ＣａＣｌ₂含有緩衝液に懸濁する。被験物質を小容量（ ５〜１５μｌ）のキュベットに添加し、蛍光信号の変化を測定する。キュベット 内で、ある予定濃度に達するまで、またはそれ以上の蛍光の変化が認められなく なるまで、被験物質の濃度を累積増大させる。蛍光の変化が認められない場合、 その分子は不活性であるとみなし、それ以上の試験を行わない。 最初の試験では、分子を５または１０ｍＭという高い濃度で試験してもよい。 比較的有効な分子が分かるにつれて、最高濃度を低下させた。たとえば新規分子 を５００μＭ以下の濃度で試験する。この濃度で蛍光の変化が認められない場合 、その分子は不活性であるとみなせる。 ［Ｃａ²⁺］_iを増加させる分子を追加試験する。本発明のキメラ受容体の正の 調節剤をスクリーニングする際に考慮しうる分子の２つの特性は、細胞内Ｃａ²⁺ の移動およびＰＫＣ活性化剤に対する感受性である。 １つの細胞調製物で［Ｃａ²⁺］_i、サイクリックＡＭＰレベル、ＩＰおよび他 の細胞内メッセンジャーに関するデータが得られる。典型的な方法は、細胞にｆ ｕｒａ−２を負荷し、次いで細胞懸濁液を二分し；大部分の細胞を［Ｃａ²⁺］_i の測定に使用し、残りを分子と共にインキュベートしてサイクリックＡＭＰに対 する作用を評価する。 イノシトールリン酸の測定は時間のかかるスクリーニングである。しかしクロ リド（ギ酸ではなく）で溶離するイオン交換カラムは回転蒸発（約３０時間かか る）が不必要であるので、ＩＰ₃生成スクリーニングのための極めて迅速な手段 を 提供する。この方法によれば一人の実験者が約１００個の試料を午後だけで処理 できる。［Ｃａ²⁺］_i、サイクリックＡＭＰおよびＩＰ₃の測定により評価して興 味深いと分かった分子につき、ＨＰＬＣにより種々のイノシトールリン酸の形成 を調べ、それらの異性体形を評価することによって、より厳密な分析を行うこと ができる。 以下はこれらのスクリーニング操作に有用な方法の具体例である。 １．サイクリックＡＭＰの測定 この節にはサイクリックＡＭＰレベルの測定につき記載する。細胞を前記に従 ってインキュベートし、インキュベーション終了時に０．１５ｍｌの試料を採取 し、０．８５ｍｌの熱湯（７０℃）に移し、この温度で５〜１０分間加熱した。 次いで試験管を数回凍結融解し、細胞残滓を遠心分離により沈降させた。上清の 一部をアセチル化し、放射免疫測定法によりサイクリックＡＭＰ濃度を測定した 。 ２．イノシトールリン酸生成の測定 この節はイノシトールリン酸生成の測定法につき記載する。上皮小体細胞を４ μＣｉ／ｍｌの³Ｈ−ミオイノシトールと共に２０〜２４時間インキュベートす ることにより、膜のリン脂質を標識した。次いで細胞を洗浄し、０．５ｍＭのＣ ａＣｌ₂および０．１％ＢＳＡを含有するＰＣＢに再懸濁した。ミクロ遠心管中 で種々の濃度の有機ポリカチオンの不在下または存在下に種々の時間、インキュ ベーションを行った。１ｍｌクロロホルム−メタノール−１２Ｎ ＨＣｌ（２０ ０：１００：１；ｖ／ｖ／ｖ）の添加により反応を停止した。フィチン酸加水分 解物水溶液（２００μｌ；２５μｇリン酸／試験管）を添加した。試験管を遠心 し、６００μｌの水相を１０ｍｌの水に希釈した。 ＡＧｌ−Ｘ８を用いるイオン交換クロマトグラフィーによりクロリド形または ギ酸形のイノシトールリン酸を分離した。ＩＰ₃レベルのみを測定したい場合に はクロリド形を用い、一方、主要イノシトールリン酸（ＩＰ₃、ＩＰ₂およびＩＰ₁ ）を分離するためにはギ酸形を用いた。ＩＰ₃のみを測定するためには、希釈し た試料をクロリド形カラムに付与し、カラムを１０ｍｌの３０ｍＭ ＨＣｌ、次 いで６ｍｌの９０ｍＭ ＨＣｌで洗浄し、ＩＰ₃を３ｍｌの５００ｍＭ ＨＣｌ で溶離した。最後の溶出液を希釈し、計数した。すべての主要イノシトールリン 酸を測 定するためには、希釈した試料をギ酸形カラムに付与し、ギ酸緩衝液の濃度を高 めることによりＩＰ₁、ＩＰ₂およびＩＰ₃を順次溶離した。ギ酸カラムから溶出 した試料を回転蒸発させ、残渣をカクテルに装入し、計数した。 異性体形のＩＰ₃をＨＰＬＣにより判定した。１ｍｌの０．４５Ｍ過塩素酸を 添加することにより反応を停止し、氷上に１０分間保存した。遠心後に、上清を ＮａＨＣＯ₃でｐＨ７〜８に調整した。次いでこの抽出液をパーティシル（Ｐａ ｒｔｉｓｉｌ）ＳＡＸアニオン交換カラムに付与し、ギ酸アンモニウムの直線濃 度勾配で溶離した。次いで種々の画分をダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）で脱塩し、 次いで回転蒸発させたのちパッカード、トリカーブ（Ｔｒｉ−ｃａｒｂ）１５０ ０ＬＳＣで液体シンチレーション計数した。 すべてのイノシトールリン酸分離法につき、有機ポリカチオンが分離を妨害す るか否かを判定するために、基準品を用いた適切な対照を採用した。妨害する場 合には、イノシトールリン酸の分離前に、障害分子を除去するために試料をカチ オン交換樹脂で処理した。 ３．リード分子の使用 リード分子が天然リガンドの作用を模倣し、またはそれに拮抗する効力を系統 的に測定することにより、アゴニストおよびアンタゴニストに関する種々の官能 基の重要度を確認できる。試験した分子のうちあるものは薬物候補として好適で あり、一方、他は薬物候補として必ずしも好適ではない。ある分子の薬物候補と しての適性は、有効性および毒性などの要因に依存する。それらの要因は標準法 により評価できる。たとえばリード分子を用いて、受容体による療法の基礎とな る仮説が適切であることを証明し、また受容体調節剤が受容体に作用するのを可 能にする構造特性を判定し、これにより本発明に有用な他の分子を得ることがで きる。 本明細書に記載される実施例は、ｍＧｌｕＲおよびＣａＲの活性の調節剤とし て有用な分子の一般的な設計方法を提示する。これらの実施例には、他の分子を 得るためのスクリーニング法、たとえば天然産物ライブラリーのスクリーニング 法も記載される。これらの方法を用いて、当業者はｍＧｌｕＲおよびＣａＲの他 の有用な調節剤を同定できる。 カルシウム受容体を発現する細胞株は既に得られており、それらをカルシウム 受容体の活性を調節する化合物の同定のための高処理量スクリーニングに利用し うる方法が開示されている（参照：米国特許出願第０８／３５３，７８４号、１ ９９４年１２月９日出願、本明細書に参考として含まれる）。代謝指向型グルタ ミン酸受容体を発現する細胞株は既に得られており、それらを代謝指向型グルタ ミン酸受容体の活性を調節する化合物の同定のために利用しうる方法が開示され ている（欧州特許出願公開第０ ５６８ ３８４ Ａ１号；欧州特許出願公開第 ０ ５６９ ２４０ Ａ１号；国際特許出願公開第ＷＯ ９４／２９４４９号； および国際特許出願公開第ＷＯ ９２／１０５８３号）。したがって発現した受 容体の活性の調節を検出するための生化学的、分光測光または他の物理的測定を 用いる組換え細胞によるアッセイ法、特に影響を受けた細胞内メッセンジャーの 変化を測定するアッセイ法は当業者に知られており、化合物および化合物ライブ ラリーの高処理量機能性スクリーニングに適するように構成できる。それぞれの 機能アッセイ法が高処理量スクリーニングにとっての利点および欠点をもつこと は当業者に自明であり、これらは当該受容体、用いる細胞株、受容体機能の調節 を検出するために用いる生化学的測定および物理的測定の性質、スクリーニング される化合物ライブラリーの性質、ならびに他の種々のパラメーターに依存する 。殊に有用かつ実用的な方法は、ホスホリパーゼ−Ｃと共役した受容体の活性の 調節を検出するための、細胞内Ｃａ²⁺の蛍光指示薬の使用である。 ［³Ｈ］グルタミン酸、または本明細書に記載した方法で見出した、ｍＧｌｕ Ｒを調節することが認められた他の化合物をリード化合物として用いると、類似 の、またはより強力な活性をもつ他の化合物を見出すことができ、次いでこれを リード化合物として使用しうることが期待される。［³Ｈ］グルタミン酸などの リード化合物を、標準法による分子設計および化合物ライブラリーのスクリーニ ングに利用できる。放射性リガンド結合法［放射性標識結合アッセイ法］を利用 して、グルタミン酸結合部位に結合する化合物を同定できる。そのような結合ア ッセイ法はｍＧｌｕＲ上のグルタミン酸結合部位に結合する新規化合物を見出す のに有用であるが、本発明によればｍＧｌｕＲにおける特異かつ有用な活性をも つ新規化合物を見出し、これを放射性標識し、同様に放射性リガンドアッセイ法 に使用 して、この新規リード化合物が定める部位に結合する他の化合物をさらに見出す ことができる。このスクリーニング試験によって、多数の潜在的に有用な化合物 をそれらがグルタミン酸結合部位に結合する能力につきスクリーニングできる。 標準的検出法を用いて、代謝指向型グルタミン酸受容体上のグルタミン酸結合部 位への結合を検出するための他の迅速アッセイ法を考案できる。この節に記載し た方法で、グルタミン酸結合部位において作用する他の化合物を同定できる。高 処理量アッセイ法をまず生成物ライブラリー（たとえば天然産物ライブラリーお よび化合物ファイル）のスクリーニングに用いて、グルタミン酸（またはリード 化合物）結合部位において活性をもつ化合物を同定する。次いでこれらの化合物 を、代謝指向型グルタミン酸受容体上のグルタミン酸またはリード化合物結合部 位を標的とする薬物開発プログラムのための化学的リード構造体として利用する 。動物試験を含めたルーティン実験を行って、目的活性をもつ化合物を同定でき る。 以下のアッセイ法を高処理量アッセイ法として利用できる。ラット脳膜を、Ｗ ｉｌｌｉａｍｓら（Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３６：５７５，１９８９ ）の方法に従い、以下の点を変更して調製する：体重１００〜２００ｇの雄スプ ラーグ−ドーレイ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラット（ハーラン・ラボラ トリーズ）を断頭により屠殺する。ラット２０匹からの皮質または小脳を清浄に し、切断する。得られた脳組織を、４℃で最低に設定したポリトロンホモジナイ ザーにより、５ｍＭ Ｋ−ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）を含有する０．３２Ｍスクロ ース３００ｍｌ中でホモジナイズする。ホモジネートを１，０００×ｇで１０分 間遠心し、上清を除去し、３０，０００×ｇで３０分間遠心する。得られたペレ ットを２５０ｍｌの５ｍＭ Ｋ−ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）に再懸濁し、氷上で１ ５分間撹拌し、次いで３０，０００×ｇで３０分間遠心する。このペレットを３ ００ｍｌの５ｍＭ Ｋ−ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）に再懸濁し、３２℃で３０分間 インキュベートする。次いで懸濁液を１００，０００×ｇで３０分間遠心する。 膜を５００ｍｌの５ｍＭ Ｋ−ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）に再懸濁することにより 洗浄し、３２℃で３０分間インキュベートし、１００，０００×ｇで３０分間遠 心する。３０分間のインキュベーションを含めたこの洗浄処理を繰り返す。最終 ペレットを６０ｍｌの５ｍＭ Ｋ−ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）に再懸濁し、アリコ ートに分けて−８０℃で保存する。 ［³Ｈ］グルタミン酸（リード化合物の一例として）を用いた結合アッセイを 行うには、ＳＰＭ（シナプス形質膜）のアリコートを融解し、３０ｍｌの３０ｍ ＭＥＰＰＳ／１ｍＭ Ｋ−ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）に再懸濁し、１００，０００ ×ｇで３０分間遠心する。ＳＰＭを緩衝液Ａ（３０ｍＭ ＥＰＰＳ／１ｍＭ Ｋ −ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）に再懸濁する。この反応混合物に［³Ｈ］グルタミン 酸を添加する。結合アッセイをポリプロピレン試験管中で行う。最終インキュベ ーション容量は５００μｌである。１００μＭの非放射性グルタミン酸の存在下 で非特異的結合を測定する。二重試料を０℃で１時間インキュベートする。３ｍ ｌの氷冷した緩衝液Ａを添加することによりアッセイを終結し、次いで予め０． ３３％ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）に浸漬したガラス繊維フィルター（Ｓｃｈ ｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ Ｎｏ．３０）で濾過する。フィルターを さらに３ｍｌの緩衝液Ａで３回洗浄し、³Ｈにつき３５〜４０％の効率でシンチ レーション計数することにより放射能を測定する。 上記アッセイの正当性を立証するために、以下の実験を実施できる： （ａ）フィルターへの［³Ｈ］グルタミン酸の非特異的結合の量を下記により 測定する：種々の濃度の［³Ｈ］グルタミン酸を含有する５００μｌの緩衝液Ａ を、予め浸漬したガラス繊維フィルターに導通する。フィルターをさらに３ｍｌ の緩衝液Ａで４回洗浄し、³Ｈにつき３５〜４０％の効率でシンチレーション計 数することにより、フィルターに結合した放射能を測定する。 （ｂ）ＳＰＭを緩衝液Ａに再懸濁することにより、飽和曲線を作成する。アッ セイ緩衝液（５００μｌ）は６０μｇの蛋白質を含有する。１．０ｎＭから４０ ０μＭの範囲の［³Ｈ］グルタミン酸濃度を半対数単位で用いる。これらのデー タから飽和曲線を作成し、見掛けのＫ_D値およびＢ_max値をスカッチャード分析（ Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０，１９ ４９）により決定する。［³Ｈ］グルタミン酸の結合の協同性を、ヒルプロット （Ｈｉｌｌ，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．４０：１９０，１９１０）の作成により測定 する。 （ｃ）ＳＰＭを緩衝液Ａに再懸濁することにより、蛋白質（受容体）濃度に対 する結合の依存性を測定する。アッセイ緩衝液（５００μｌ）は、それのＫ_D値 に 等しい濃度の［³Ｈ］グルタミン酸および増大する濃度の蛋白質を含有する。［³ Ｈ］グルタミン酸の特異的結合は存在する蛋白質（受容体）の量に対して直線関 係にあるはずである。 （ｄ）ＳＰＭを緩衝液Ａに再懸濁することにより、リガンド−受容体の結合の 時間経過を測定する。アッセイ緩衝液（５００μｌ）は、それのＫ_D値に等しい 濃度の［³Ｈ］グルタミン酸および１００μｇの蛋白質を含有する。二重試料を ０℃で種々の長さの時間インキュベーし；平衡に達した時間を測定し、この時点 を以下のすべてのアッセイにルーティンに採用する。 （ｅ）結合部位の薬理を競合実験により分析できる。そのような実験において は、［³Ｈ］グルタミン酸の濃度および蛋白質の量を一定に維持し、一方、被験 （競合）薬物の濃度を変化させる。このアッセイにより、競合薬物につきＩＣ₅₀ および見掛けのＫ_Dを測定できる（Ｃｈｅｎｇ ａｎｄ Ｐｒｕｓｏｆｆ，Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２：３０９９，１９７３）。競合薬物 の協同性を、ヒルプロット分析により測定する。 ［³Ｈ］グルタミン酸の特異的結合は、代謝指向型グルタミン酸受容体上のグ ルタミン酸結合部位への結合を表す。このように、グルタミン酸類似体は［³Ｈ ］グルタミン酸の結合に対して競合的に作用し、このアッセイにおけるそれらの 効力は代謝指向型グルタミン酸受容体活性の機能アッセイ（たとえばツメガエル 属(Ｘｅｎｏｐｕｓ)卵母細胞において発現したクローン化代謝指向型グルタミン 酸受容体の電気生理学的評価）におけるそれらの効力と相関するはずである。逆 に、グルタミン酸結合部位以外の部位において活性をもつ化合物は、［³Ｈ］グ ルタミン酸結合を競合的に置換しないはずである。むしろ非競合的相互作用を示 唆する［³Ｈ］グルタミン酸結合の複雑なアロステリック調節が起こる可能性が ある。 （ｆ）［³Ｈ］グルタミン酸を平衡に到達させ（前記（ｄ）参照）、非放射性 である競合薬物を大過剰に反応混合物に添加したのち［³Ｈ］グルタミン酸の結 合を測定することにより、解離反応速度を推定する研究を行う。次いで、種々の 時間間隔で［³Ｈ］グルタミン酸の結合をアッセイする。このアッセイで［³Ｈ］ グルタミン酸結合の結合速度および解離速度が測定される（Ｔｉｔｅｌｅｒ，Ｍ ｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｏｐａｍｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉ ｎｄｉｎｇ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｄｏｐａｍｉｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏ ｇｙ、マーセル・デッカー社、ニューヨーク、１９８３）。このパラメーターの 温度依存性を理解するために、反応温度を変化させる実験をさらに行う（０〜３ ０℃）。 以下は、代謝指向型グルタミン酸受容体活性を調節する化合物を得るための迅 速スクリーニングアッセイ法の一例である。このスクリーニングアッセイではま ず、グルタミン酸結合部位を含む組換え受容体または受容体フラグメントに化合 物が結合する効力を測定する。次いで、代謝指向型グルタミン酸受容体に結合す る化合物を、それらが代謝指向型グルタミン酸受容体における１またはそれ以上 の活性を調節する能力につき試験する。 １方法においては、好適な生物、たとえばヒトに由来するキメラ受容体または 代謝指向型グルタミン酸受容体のフラグメントをコードする、ｃＤＮＡまたは遺 伝子のクローンを標準法により得る。そのクローンの別個のフラグメントを適切 な発現ベクター内で発現させて、グルタミン酸を結合しうる入手可能な最小受容 体ポリペプチド（１またはそれ以上）を産生させる。こうしてグルタミン酸結合 部位を含有するポリペプチドを同定する。そのような実験は、代謝指向型グルタ ミン酸受容体を発現する安定にトランスフェクションした哺乳動物細胞株（たと えばＨＥＫ ２９３細胞）の使用によって容易になる。 あるいは代謝指向型グルタミン酸受容体を化学的に修飾されたグルタミン酸と 化学反応させて、選ばれた化合物と接触する（または隣接する）代謝指向型グル タミン酸受容体のアミノ酸残基を修飾し、これにより同定可能にすることができ る。次いで、グルタミン酸と相互作用すると判定され、グルタミン酸との結合に 十分であるアミノ酸を含有する代謝指向型グルタミン酸受容体のフラグメント（ １またはそれ以上）を、標準法により組換え発現させることができる。 目的とする結合特性をもつ組換えポリペブチド（１またはそれ以上）を、標準 的な化学的操作により固相支持体に結合させることができる。次いでこの固相、 すなわちアフィニティーマトリックスをグルタミン酸と接触させて、グルタミン 酸がカラムに結合しうることを証明し、グルタミン酸を固相から分離しうる条件 を確認する。次いで大規模な化合物ライブラリーを用いてこの操作を繰り返し、 このアフィニティーマトリックスに結合しうる化合物を判定する。次いで結合し た化合物をグルタミン酸と同様な方法で放出させる。他の結合および放出条件を 用いて、グルタミン酸の結合に用いたものと異なる条件下で（たとえば特に病的 状態で遭遇する生理学的条件をより良く模倣した条件）結合しうる化合物を得る ことができる。こうして、グルタミン酸結合部位に結合する化合物を、液体媒質 または抽出液中に存在する極めて多数の化合物から選択できる。 別法においては、キメラ受容体をカラムその他の固相支持体に結合させる。次 いで、その受容体上のグルタミン酸結合部位に結合する試薬により競合排除され ない化合物を同定できる。それらの化合物は受容体上の別の結合部位を示す。そ れらの化合物は既知の化合物と構造的に異なる可能性があり、療法薬として有用 なアゴニストまたはアンタゴニストの化合物群である可能性がある。 代謝指向型グルタミン酸受容体活性を調節することにより、代謝指向型グルタ ミン酸受容体の活性化に際して起こる細胞応答が増大または低下する。代謝指向 型グルタミン酸受容体の活性化に対する細胞応答は、活性化される代謝指向型グ ルタミン酸受容体のタイプに依存する。一般に代謝指向型グルタミン酸受容体の 活性化によって下記の１またはそれ以上の活性が生じる；（１）ＰＩ加水分解の 増大；（２）ホスホリパーゼＣの活性化；（３）サイクリックアデノシンモノホ スフェート（ｃＡＭＰ）の形成の増大および低下；（４）ｃＡＭＰの形成の低下 ；（５）イオンチャンネル機能の変化；（６）ホスホリパーゼＤの活性化；（７ ）アデニリルシクラーゼの活性化または阻害；（８）グアニリルシクラーゼの活 性化；（９）サイクリックグアノシンモノホスフェート（ｃＧＭＰ）の形成の増 大；（１０）ホスホリパーゼＡ₂の活性化；（１１）アラキドン酸放出の増大； （１２）電位依存性およびリガンド依存性イオンチャンネルの活性の増大または 低下；（１３）ならびに細胞内カルシウムの増加。代謝指向型グルタミン酸受容 体の活性化を阻害すると、これらの活性のうち１またはそれ以上の起こるのが阻 止される。 特定の代謝指向型グルタミン酸受容体の活性化とは、それに続いて、活性化さ れた受容体のタイプに付随する１またはそれ以上の活性を生じさせる事象を意味 する。ｍＧｌｕＲ１の活性化によって下記の１またはそれ以上の活性が生じる： ＰＩ加水分解の増大、ｃＡＭＰ形成の増大、細胞内カルシウム（Ｃａ²⁺）の増加 、およびアラキドン酸形成の増大。化合物がグルタミン酸結合部位活性化のアゴ ニストまたはアンタゴニストとして作用することにより、１またはそれ以上の代 謝指向型グルタミン酸受容体活性を調節できる。 本発明のキメラ受容体は、ＣａＲにより生じるシグナルを検出することによっ てｍＧｌｕＲにおいて活性である化合物をスクリーニングする方法を提供する。 これらのキメラ受容体は国際特許出願第ＵＳ９３／０１６４２号（ＷＯ９４／１ ８９５９）（これは本明細書に参考として含まれる）に記載のスクリーニング法 に利用できる。これらの方法には、ｆｕｒａ−２を用いるスクリーニング法、お よびカルシウム受容体を発現する細胞株を用いる細胞質ゾルＣａ²⁺の測定、およ び卵母細胞発現を用いるスクリーニング法が含まれる。 本明細書に記載するスクリーニング法により同定される活性化合物は、代謝指 向型グルタミン酸受容体活性を調節するための療法用分子として、または異常な 代謝指向型グルタミン酸受容体活性を特色とする疾病を伴う患者を診断するため の診断薬として有用である。好ましくは、これらのスクリーニング法を用いて、 代謝指向型グルタミン酸受容体をもつ細胞において細胞外グルタミン酸または他 の代謝指向型グルタミン酸受容体アゴニストの活性を模倣または遮断する効力に つき潜在的に有用な分子をスクリーニングし、そしてその分子が１００μＭ以下 のＥＣ₅₀、ＩＣ₅₀をもつか否かを判定することにより、代謝指向型グルタミン酸 受容体調節剤を同定する。より好ましくは、それらの分子が細胞外グルタミン酸 または他のｍＧｌｕＲアゴニストにより誘発される［Ｃａ²⁺］の増加を模倣また は遮断する効力につき試験する。 代謝指向型グルタミン酸受容体調節剤の同定は、高処理量スクリーニング系の 採用によって促進される。高処理量スクリーニングによれば多数の分子を試験で きる。たとえば多数の分子を高速自動化法を採用して個々に、または組合わせラ イブラリーを用いて一緒に試験できる。組合わせライブラリー中に存在する、代 謝指向型グルタミン酸受容体活性を調節しうる個々の化合物は、組合わせライブ ラリーの画分を精製および再試験することにより得られる。こうして数千個ない し数百万個の分子を一日でスクリーニングできる。活性分子は、同等または増大 した活性をもつさらに他の分子を設計するためのモデルとして使用できる。好ま しくは同定法には組換えキメラ代謝指向型グルタミン酸受容体を用いる。受容体 をコードするベクターを用いて、キメラ受容体を種々の細胞内に導入できる。好 ましくは種々の細胞において分子の活性を試験して、第１タイプの代謝指向型グ ルタミン酸受容体においてはグルタミン酸の１またはそれ以上の活性を模倣また は遮断するが、第２タイプの代謝指向型グルタミン酸受容体においてはその活性 を模倣または遮断しない、代謝指向型グルタミン酸受容体アゴニスト分子または 代謝指向型グルタミン酸受容体アンタゴニスト分子を同定する。 前記のように本発明は、代謝指向型グルタミン酸受容体の部分およびカルシウ ム受容体の部分をもつキメラ受容体を用いて代謝指向型グルタミン酸受容体活性 を調節する化合物をスクリーニングするための新規方法を提供する。種々の化合 物をｍＧｌｕＲ部分への結合につき試験するので、このタイプの具体的な受容体 においては、カルシウム受容体部分のシグナル伝達プロセスを利用してｍＧｌｕ Ｒ活性の調節を検出する。このスクリーニング法は多様な様式で、たとえば代謝 指向型グルタミン酸受容体およびカルシウム受容体に由来する異なる部分をもつ キメラ受容体を用いて実施できる。特定の好ましい例を以下に記載する。 一例においては、代謝指向型グルタミン酸受容体に結合するかまたはその活性 を調節する化合物のスクリーニング法は、細胞外ドメイン、７回貫膜ドメインお よび細胞内細胞質テイルドメインをもつキメラ受容体の調製を伴う。少なくとも ６個の連続アミノ酸の配列は代謝指向型グルタミン酸受容体由来の配列と同一ま たは相同であり、かつ少なくとも６個の連続アミノ酸の配列はカルシウム受容体 由来の配列と同一または相同である。キメラ受容体および被験化合物を許容しう る媒質に導入し、受容体に対する被験化合物の結合または被験化合物による受容 体の調節を、このような結合性または調節性化合物の同定のために、物理的に検 出しうる手段でモニターする。許容しうる媒質には、一般にｍＧｌｕＲおよび／ またはＣａＲの天然リガンドがその中でｍＧｌｕＲまたはＣａＲと相互作用する 媒質が含まれるであろう。 ｍＧｌｕＲおよびＣａＲのうち一方または両方に由来する、より長い配列をも つキメラ受容体を用いることがしばしば有益であろう。たとえばキメラ受容体は 、 ｍＧｌｕＲまたはＣａＲのうち一方または両方に由来する配列と同一または相同 である、少なくとも１２、１８、２４、３０、３６またはそれ以上のアミノ酸の 配列をもつことができる。有用な１キメラ受容体においては、１つのドメインが 代謝指向型グルタミン酸受容体の１つのドメインと相同であり、かつ少なくとも １つのドメインがカルシウム受容体の１つのドメインと相同である。 第２の例において代謝指向型グルタミン酸受容体に結合するかまたはその活性 を調節する化合物のスクリーニング法は、キメラ受容体をコードする核酸配列を 用いる。その核酸を細胞内で発現させ、細胞に対する被験化合物の作用をモニタ ーすることにより、被験化合物による結合または調節を観察する。したがって一 般にこの方法は、キメラ受容体をコードする核酸配列を調製することを含む。コ ードされるキメラ受容体は細胞外ドメイン、７回貫膜ドメインおよび細胞内細胞 質テイルドメインをもつ。上記の例の場合と同様にキメラ受容体は、ｍＧｌｕＲ およびＣａＲそれぞれに由来する配列と同一または相同である少なくとも６個の 連続アミノ酸の配列をもつ。同様に上記のように、ｍＧｌｕＲおよびＣａＲのう ち一方または両方に由来する配列は、特定の用途においてはより長く、少なくと も１２、１８、２４、３０、３６またはそれ以上のアミノ酸の長さであることが 有益であろう。この核酸配列を、宿主細胞において上記キメラ受容体を発現しう る複製可能な発現ベクターに挿入し、宿主細胞をこのベクターで形質転換する。 形質転換した宿主細胞および被験化合物を許容しうる媒質に導入し、宿主細胞に 対する被験化合物の作用をモニターする（たとえば前記の手法またはアッセイ法 により）。宿主細胞は真核細胞であることが好ましいが、必須ではない。 キメラ受容体のアミノ酸配列は、個々の場合に多様な組合わせで選択できる。 たとえばキメラ受容体は代謝指向型グルタミン酸受容体のドメインと相同である 少なくとも１つのドメイン、およびカルシウム受容体のドメインと相同である少 なくとも１つのドメインを含むことができる。キメラ受容体のドメイン（１また はそれ以上）は、たとえば代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインおよ び／または７回貫膜ドメインと相同である。 同様に３つの細胞質ループをもつキメラ受容体は、ｍＧｌｕＲの細胞質ループ と相同である少なくとも１つのループ、またはＣａＲの細胞質ループと相同であ る少なくとも１つのループ、またはこれらの受容体それぞれの細胞質ループと相 同である少なくとも１つのループをもつことができる。 同様に他のキメラ受容体においては、一方のタイプの受容体（ＣａＲまたはｍ ＧｌｕＲ）の配列と相同である受容体部分があり、そのキメラ受容体の残りは他 方のタイプの受容体（ＣａＲまたはｍＧｌｕＲ）の配列と相同である。たとえば キメラ受容体は、一方の受容体タイプの配列と相同である少なくとも６、１２、 １８、２４、３０、３６またはそれ以上の連続アミノ酸の配列をもち、キメラ受 容体の残りの配列は他方のタイプの受容体に由来する配列と相同でありうる。こ れにはさらに、少なくとも１つの細胞質ループがそれらの受容体タイプの一方に 由来するか、または少なくとも１つのドメインがそれらの受容体タイプの一方に 由来する場合が含まれる。 特定の用途においては、他の組合わせの配列も有用であろう。 代謝指向型グルタミン酸受容体およびカルシウム受容体の両方において活性で ある化合物をスクリーニングするためには、キメラ代謝指向型グルタミン酸受容 体／カルシウム受容体も使用できる。これは、ＣａＲ中のものと異なるｍＧｌｕ Ｒ中のドメインまたはサブドメインにおいて相互作用する化合物をスクリーニン グするのに特に有用である。そのようなキメラは、たとえば代謝指向型グルタミ ン酸受容体の細胞外ドメイン内において作用し、かつカルシウム受容体の７回貫 膜ドメインまたは細胞質テイルドメイン内においても作用する化合物をスクリー ニングするのに特に有用である。そのようなキメラは、カルシウム受容体の７回 貫膜ドメインおよび細胞質テイルに結合した、代謝指向型グルタミン酸受容体の 細胞外ドメインを含有するであろう。 代謝指向型グルタミン酸受容体およびカルシウム受容体の両方において活性で あるそのような化合物をスクリーニングするためには、化合物を本発明の種々の 方法に従ってキメラ受容体、カルシウム受容体および代謝指向型グルタミン酸受 容体に対してスクリーニングする。キメラ受容体のカルシウム受容体部分の７回 貫膜ドメインにおいて活性である化合物は、カルシウム受容体自身に対して試験 した場合にも活性であるはずである。そのような化合物をスクリーニングするた めの好ましい方法は、それらを本発明方法に従って、まず代謝指向型グルタミン 酸受容体の細胞外ドメインならびにカルシウム受容体の７回貫膜ドメインおよび 細胞質テイルドメインをもつキメラ分子に対してスクリーニングし、次いで陽性 化合物を代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインおよび７回貫膜ドメイ ンおよびカルシウム受容体の細胞質テイルドメインをもつキメラ分子ならびにカ ルシウム受容体自身との両方に対してスクリーニングすることである。両分子に おいて活性である化合物は、３種類すべてのキメラ受容体に対して試験した場合 に陽性であろう。 逆に、代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テイル ドメインに結合した、カルシウム受容体の細胞外ドメインを含有するキメラは、 カルシウム受容体の細胞外ドメイン内において作用し、かつ代謝指向型グルタミ ン酸受容体の７回貫膜ドメインまたは細胞質テイル内においても作用する化合物 をスクリーニングするのに特に有用である。好ましくは、カルシウム受容体の細 胞外ドメインおよび代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインおよび細 胞質テイルドメインを含有するキメラ受容体をさらに修飾して、カルシウム受容 体の細胞質テイル部分を含有させる。このより好ましい態様は、これによってカ ルシウム受容体の卓越したシグナル伝達特性を獲得し、一方ではなおカルシウム 受容体と代謝指向型グルタミン酸受容体の両方において作用する化合物をスクリ ーニングするのに有用である。 したがって１態様においては、本発明はキメラ受容体をコードする核酸配列を 調製することにより代謝指向型グルタミン酸受容体とカルシウム受容体の両方に おいて活性である化合物をスクリーニングする方法を特徴とする。このキメラ受 容体は細胞外ドメイン、７回貫膜ドメインおよび細胞質テイルドメインをもち、 少なくとも１つのドメインは代謝指向型グルタミン酸受容体のドメインと相同で あり、かつ少なくとも１つのドメインはカルシウム受容体のドメインと相同であ る。この核酸配列を、宿主細胞において上記キメラ受容体を発現しうる複製可能 な発現ベクターに挿入し、宿主細胞をこのベクターで形質転換する。形質転換し た宿主細胞および被験化合物を許容しうる媒質に導入し、細胞に対する被験化合 物の作用をモニターする。 一般にキメラ受容体を用いる上記のスクリーニング法それぞれにつき、個々の 用途に適切な結合、調節および／またはシグナル共役特性を与えるように、ｍＧ ｌｕＲと相同なキメラ受容体部分およびＣａＲと相同な部分を選択する。 Ｅ．作用部位 キメラ受容体分子は、代謝指向型グルタミン酸受容体またはカルシウム受容体 に対して活性な化合物であると既に同定されている化合物の作用部位を決定する 方法にも有用である。たとえばカルシウム受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞 質テイルに結合した、代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインを含有す るキメラ、ならびに代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインおよび細 胞質テイルドメインに結合した、カルシウム受容体の細胞外ドメインを含有する キメラは、代謝指向型グルタミン酸受容体またはカルシウム受容体に対して活性 な化合物の作用部位を決定する際に有用である。当業者はこれらが大きな配列交 換の一例であって、作用部位の決定をより正確にするためにはより小さな配列交 換も採用しうることが認識されるであろう。 したがって本発明は、代謝指向型グルタミン酸受容体に対して活性な化合物の 作用部位を決定する方法であって、キメラ受容体をコードする核酸配列を調製し 、その際キメラ受容体はカルシウム受容体のアミノ酸配列と相同である少なくと も６個のアミノ酸の配列を含み、残りのアミノ酸配列は代謝指向型グルタミン酸 受容体のアミノ酸配列と相同であり；この配列を、宿主細胞において前記キメラ 受容体を発現しうる複製可能な発現ベクターに挿入し；宿主細胞をこのベクター で形質転換し；形質転換した宿主細胞および前記化合物を許容しうる媒質に導入 し；そして細胞に対する該化合物の作用をモニターすることによる方法を提供す る。 スクリーニング法につき前記に示したように、個々の用途においては種々の大 きさの配列交換を用いることが有利である。たとえば他の用途においては、カル シウム受容体由来の配列と相同な配列はたとえば少なくとも１２、１８、２４、 ３０、３６またはそれ以上のアミノ酸の長さであってもよい。 逆にカルシウム受容体に対して活性な化合物の作用部位を決定する方法は前記 と同様な様式で実施され、ただし代謝指向型グルタミン酸受容体のアミノ酸配列 と相同である少なくとも６個のアミノ酸の配列を含み、残りのアミノ酸配列はカ ルシウム受容体のアミノ酸配列と相同であるキメラ受容体をコードする核酸を用 いる。また前記方法と同様に、代謝指向型グルタミン酸受容体由来の配列と相同 な配列は種々の用途において異なる長さ、たとえば少なくとも１２、１８、２４ 、３０、３６またはそれ以上のアミノ酸の長さであってもよい。 Ｆ．代謝指向型グルタミン酸受容体活性の調節 代謝指向型グルタミン酸受容体活性の調節を利用して、種々の作用、たとえば 抗けいれん作用、神経保護作用、鎮痛作用、認識増強作用および筋弛緩作用を得 ることができる。これらの作用それぞれが療法上利用される。療法用として使用 される化合物は療法上有効な投与量では最小の副作用をもつべきである。 ある化合物が代謝指向型グルタミン酸受容体の活性を調節する効力は、１また はそれ以上の代謝指向型グルタミン酸受容体活性を測定する電気生理学的および 生化学的アッセイ法により判定できる。一般にそのようなアッセイは、当該代謝 指向型グルタミン酸受容体（１またはそれ以上）を発現する細胞を用いて実施で きるが、これらのアッセイはモニターすべき細胞活性を調節する本発明のキメラ 受容体を発現する細胞を用いて実施することもできる。そのようなアッセイの例 には以下のものが含まれる：クローン化した代謝指向型グルタミン酸受容体を発 現するツメガエル卵母細胞における代謝指向型グルタミン酸受容体機能の電気生 理学的評価、クローン化した代謝指向型グルタミン酸受容体を発現するトランス フェクション細胞株（たとえばＣＨＯ細胞、ＨＥＫ ２３９細胞など）における 代謝指向型グルタミン酸受容体機能の電気生理学的評価、クローン化した代謝指 向型グルタミン酸受容体を発現するトランスフェクション細胞株におけるＰＩ加 水分解およびｃＡＭＰ蓄積の生化学的評価、ラット脳（たとえば海馬、皮質、線 条体など）切片におけるＰＩ加水分解およびｃＡＭＰ蓄積の生化学的評価、培養 したラット小脳顆粒細胞における細胞質ゾルＣａ²⁺の蛍光測定、ならびにクロー ン化した代謝指向型グルタミン酸受容体を発現するトランスフェクション細胞株 における細胞質ゾルＣａ²⁺の蛍光測定。 ヒトにおいて療法用として使用する前に、それらの化合物を動物モデルを用い てインビボで試験することが好ましい。ある化合物が種々の疾患もしくは障害を 処置し、または鎮痛作用、認識増強作用もしくは筋弛緩作用などの作用を及ぼす 有効性を評価するための動物実験は、標準法により実施できる。 Ｇ．新規な薬剤および薬剤組成物 本明細書に記載するキメラ受容体およびスクリーニング法は、キメラ代謝指向 型グルタミン酸受容体に結合する効力により見出された代謝指向型グルタミン酸 受容体結合剤（たとえば化合物および薬剤組成物）を提供する。それらの結合剤 は好ましくは代謝指向型グルタミン酸受容体の調節剤である。これらの薬剤のう ちあるものは、本明細書に記載したスクリーニング法により同定された新規化合 物であろう。さらに、そのような同定された化合物を、同定された活性化合物の 類似体に基づくスクリーニングアッセイにおいて、または同定された化合物をリ ード化合物として用いる医療化学物質開発において、リード化合物として使用す ると、そのような同定された化合物から標準法により他のそのような化合物が誘 導される。 さらに、キメラ受容体を用いる新規かつ有効なスクリーニング法を提供するこ とにより、本発明は代謝指向型グルタミン酸受容体において有効な薬剤を製造す る方法を提供する。このような有効な方法がなければ、そのような薬剤は同定さ れない。本方法は、本明細書に記載するタイプのキメラ受容体を前記のスクリー ニング法に用いるスクリーニング法によって、有効な薬剤を同定するものである 。同定された薬剤またはその薬剤の類似体は、療法上有効な量で患者に投与する のに十分な量で合成される。 Ｈ．疾患および障害の処置 本発明の化合物および方法の好ましい用途は、神経疾患および神経障害の処置 である。神経疾患および神経障害を伴う患者は、標準的な臨床法により診断でき る。 神経疾患および神経障害には、神経変性性疾患、グルタミン酸興奮毒性、全身 性および限局性虚血ならびに出血性発作、頭部外傷、脊髄損傷、低酸素誘発性神 経細胞傷害、ならびにてんかんが含まれる。これら種々の疾患または障害はさら に医学的に特徴づけることができる。たとえば神経変性性疾患にはアルツハイマ ー病およびパーキンソン病が含まれる。 本発明の他の好ましい用途は、他の療法効果、たとえば鎮痛作用、認識増強作 用または筋弛緩作用を得ることにある。本発明は、好ましくはそのような処置を 必要とする患者においてこれらの作用のうち１またはそれ以上を得るために用い られる。 そのような処置を必要とする患者は、標準的な臨床法により診断できる。たと えば鎮痛作用の発生を利用して、急性および慢性疼痛の臨床状態を伴う患者を治 療でき、これには下記のものが含まれる：予防的術前鎮痛；末梢神経障害、たと えば真性糖尿病および多発性硬化症に伴って起こるもの；幻想肢痛；灼熱痛；神 経痛、たとえば帯状庖疹に伴って起こるもの；中枢痛、たとえば脊髄障害に伴っ て見られるもの；痛覚過敏症；ならびに異痛症。 患者を処置する方法においては、代謝指向型グルタミン酸受容体の少なくとも １つの細胞外ドメインをもつキメラ受容体の活性をインビトロで調節する化合物 を、療法上有効な量で患者に投与する。一般にこの化合物はグルタミン酸結合部 位活性化のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することにより、代謝指 向型グルタミン酸受容体活性を調節する。好ましくは患者は神経疾患または神経 障害を伴い、好ましくは化合物は生理学的活動に対して効果をもつ。そのような 生理学的活動は、けいれん、神経保護、神経の死、神経の発達、心臓活動の中枢 制御、覚醒、運動の制御、および前庭性眼球反射であってもよい。 代謝指向型グルタミン酸受容体活性の調節により処置できる疾患または障害に は、下記のうち１またはそれ以上が含まれる：（１）異常なグルタミン酸恒常性 を特色とするもの；（２）代謝指向型グルタミン酸受容体活性によりその産生が 影響される可能性のある異常な量の細胞外または細胞内メッセンジャーを特色と するもの；（３）それ自体が代謝指向型グルタミン酸受容体活性によって改善さ れる可能性のある細胞内または細胞外メッセンジャーの異常な作用（たとえば種 類または程度の異なる作用）を特色とするもの；および（４）代謝指向型グルタ ミン酸受容体活性の調節が有益な効果を及ぼす他の疾患または障害、たとえば受 容体活性によって刺激された細胞内または細胞外メッセンジャーの産生が異常な 量の異なるメッセンジャーを補償する疾患または障害。 本発明の化合物および方法を用いて他の効果、たとえば鎮痛作用、認識増強作 用または筋弛緩作用を得ることもできる。 “患者”とは、代謝指向型グルタミン酸受容体活性の調節が有益な効果をもつ 哺乳動物を意味する。代謝指向型グルタミン酸受容体活性の調節を伴う処置を必 要とする患者は、医療の専門家に知られている標準的手法で確認できる。好まし くは患者は下記のうち１またはそれ以上を特色とする疾患または障害をもつヒト である：（１）異常なグルタミン酸活性；（２）代謝指向型グルタミン酸受容体 活性によりその産生または分泌が影響される異常な量のメッセンジャー；および （３）代謝指向型グルタミン酸受容体活性によりその機能が影響される異常な量 または活性のメッセンジャー。 “療法上有効な量”とは、患者の疾患もしくは障害の１もしくはそれ以上の症 状をある程度軽減し、またはその疾患に伴うかもしくはその原因である１もしく はそれ以上の生理学的もしくは生化学的パラメーターを部分的もしくは完全に正 常に戻す薬剤の量を意味する。 より一般的には、本発明は代謝指向型グルタミン酸受容体をもつ細胞に、代謝 指向型グルタミン酸受容体におけるグルタミン酸の１もしくはそれ以上の作用を 模倣するか、または代謝指向型グルタミン酸受容体におけるグルタミン酸の１も しくはそれ以上の作用を遮断するのに十分な量の代謝指向型グルタミン酸受容体 調節分子を付与することにより、代謝指向型グルタミン酸受容体活性を調節する 方法を提供する。この方法はインビトロまたはインビボで実施できる。 Ｉ．配合物および投与 本発明方法により同定された活性化合物は、前記の種々の疾患および障害を処 置するための薬剤または薬剤組成物として利用できる。これに関して薬剤または 薬剤組成物とは、哺乳動物、好ましくはヒトに投与するのに適した形の薬剤また は組成物を意味する。 本発明の化合物を患者に投与するのに適した配合物および様式は、当技術分野 で既知の要因、たとえば個々の疾患または障害、目的とする効果、および患者の タイプに依存する。本化合物は一般にヒトの患者を処置するために用いられるが 、他の脊椎動物、たとえば他の霊長類、農場動物、たとえばブタ、ウシおよびニ ワトリ、ならびにスポーツ動物およびペット、たとえばウマ、イヌおよびネコに おける類似または同じ疾患の処置にも使用できる。 好ましくは療法上有効な量を薬剤組成物として付与する。薬剤または薬剤組成 物とは、多細胞生物、たとえばヒトに投与するのに適した形の薬剤または組成物 を意味する。好適な剤形は、一部は用途または投与経路、たとえば経口、経皮ま たは注射に依存する。そのような剤形は、標的細胞が多細胞宿主中または培養物 中のいずれにあっても、薬剤または組成物を標的細胞に到達させるものでなけれ ばならない。たとえば血流中に注射される薬剤または薬剤組成物は可溶性でなけ ればならない。他の要因は当技術分野で既知であり、これには毒性、および薬剤 または薬剤組成物がその効果を発揮するのを阻止する剤形などの考慮事項が含ま れる。 本発明組成物は、その薬剤学的に許容しうる塩類（たとえば酸付加塩）および ／または複合体としても配合できる。薬剤学的に許容しうる塩類は、それらを投 与する濃度で無毒の塩類である。そのような塩類の製剤は、組成物がその生理学 的効果を発揮するのを阻止することなく組成物の物理化学的特性を変化させるこ とにより、薬剤としての使用を容易にする。物理的特性の有用な変化の例には、 経粘膜投与を容易にするための融点降下、および高濃度の薬物の投与を容易にす るための溶解度の増大が含まれる。 薬物学的に許容しうる塩類には、酸付加塩、たとえば硫酸塩、塩酸塩、リン酸 塩、スルファミン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、メタンスルホ ン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸 塩、シクロヘキシルスルファミン酸塩およびキニン酸塩が含まれる（たとえば前 掲の国際特許出願第ＵＳ９２／０３７３６号を参照されたい）。薬剤学的に許容 しうる塩類は、酸、たとえば塩酸、硫酸、リン酸、スルファミン酸、酢酸、クエ ン酸、乳酸、酒石酸、マロン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼ ンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクロヘキシルスルファミン酸および キニン酸から得られる。 薬物学的に許容しうる塩類は標準的技術で調製できる。たとえば遊離塩基形の 化合物を、適切な酸を含有する好適な溶剤、たとえば水性または水性アルコール 溶液に溶解し、次いで溶液の蒸発により単離する。他の例においては、塩類は遊 離塩基と酸を有機溶剤中で反応させることにより調製される。 化合物の投与を容易にするためにキャリヤーまたは賦形剤を用いることもでき る。キャリヤーおよび賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種 々の糖類、たとえば乳糖、グルコースもしくはスクロース、または種々のデンプ ン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、および生 理学的に適合する溶剤が含まれる。組成物、すなわち薬物組成物は、静脈内、腹 腔内、皮下、および筋肉内、経口、局所または経粘膜を含めた種々の経路で投与 できる。 本発明化合物は、全身および局所または限局投与を含めた多様な投与様式のた めに配合できる。方法および配合物は、一般にＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａ ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版、マック・パブリシング 社、ペンシルベニア州イーストン、中に見られる。 全身投与のためには経口投与が好ましい。経口投与のためには本化合物を一般 的な経口投与剤形、たとえばカプセル剤、錠剤およびトニック剤中に配合する。 あるいはたとえば筋肉内、静脈内、腹腔内、皮下、くも膜下または脳室内への 注射を採用できる。注射のためには本発明化合物を溶液、好ましくは生理学的に 適合する緩衝液、たとえばハンクス液またはリンガー液中に配合する。あるいは 本発明化合物を、米国局方基準により規定されるように安全であるとして一般に 受け入れられている１またはそれ以上の賦形剤（たとえばプロピレングリコール ）中に配合する。さらに、本化合物を固体剤形中に配合し、使用直前に溶解また は懸濁してもよい。凍結乾燥した形のものも含まれる。 全身投与は経粘膜もしくは経皮によってもよく、または前記の分子を経口投与 してもよい。経粘膜または経皮投与のためには、浸透すべきバリヤーに適切な浸 透剤を配合物中に用いる。そのような浸透剤は一般に当技術分野で既知であり、 たとえば経粘膜投与のためには胆汁酸およびフシジン酸の誘導体が含まれる。さ らに、浸透を促進するために界面活性剤を用いてもよい。経粘膜投与はたとえば 鼻内噴霧により、または坐剤を用いて行うことができる。経口投与のためには、 前記の分子を一般的な経口投与剤形、たとえばカプセル剤、錠剤および液体製剤 中に配合する。 局所投与のためには、一般に当技術分野で知られているように本発明化合物を 軟膏剤、膏薬、ゲル剤またはクリーム剤中に配合する。 種々の化合物の投与量は標準法により決定できる。一般に療法上有効な量は、 そのＥＣ₅₀またはＩＣ₅₀、ならびに患者の年齢および体格、ならびに患者に付随 する疾患または障害に応じて、約１ｎｍｏｌ〜３μｍｏｌの分子、好ましくは０ .１ｎｍｏｌ〜１μｍｏｌである。一般にそれは約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、好 ましくは約０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ（処置すべき動物の体重）である。 Ｊ．トランスジェニック動物 本発明は、キメラ受容体、特にキメラ代謝指向型グルタミン酸受容体をコード するトランスジーンを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物をも提供する。ト ランスジェニック非ヒト哺乳動物は、キメラ受容体導入の効果を研究するための インビボ試験系として特に有用である。実験モデル系を用いて、細胞培養もしく は組織培養における、全動物体における、または全動物体もしくは組織培養系内 の特定の細胞もしくは組織における作用を研究できる。これらの作用を一定の期 間にわたって研究できる（胚形成期間を含む）。 本発明は、前記受容体の生理学的作用を研究するための実験モデル系を提供す る。種々の受容体発現度をもつモデル系を作成できる。たとえば受容体をコード する核酸を、天然に母体受容体を発現する細胞内へ挿入し、これによりキメラ遺 伝子をはるかに高いレベルで発現させることができる。また組換え遺伝子を用い て相同組換えにより内因性遺伝子を不活性化し、これにより受容体欠損性の細胞 、組織または動物を形成できる。 遺伝子の不活性化は、たとえば挿入変異を含むように工学的に処理した組換え 遺伝子（たとえばｎｅｏ遺伝子）を用いて行うことができる。この組換え遺伝子 をレシピエント細胞、組織または動物のゲノムに挿入し、受容体の転写を不活性 化する。そのような構築体を、トランスフェクション、形質導入および注入など の方法で細胞、たとえば胚幹細胞に導入できる。無傷の受容体配列を欠如する幹 細胞からは、受容体を欠損するトランスジェニック動物が形成されるであろう。 好ましい試験モデルはトランスジェニック動物である。トランスジェニック動 物は、細胞に人為的に挿入され、そしてその細胞から発生する動物のゲノムに挿 入されたＤＮＡを含有する細胞をもつ。好ましいトランスジェニック動物は、霊 長類、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌおよびネコであ る。 トランスジェニック動物を得るためには多様な方法がある。たとえばＤＮＡを 雌雄の前核が融合する前に妊娠卵の前核に注入するか、または細胞分裂開始後に 胚細胞（たとえば２細胞胚の核）に注入できる（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ .,Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４４３８−４４４２， １９８５）。他の例では、本発明のキメラ受容体ヌクレオチド配列を運搬するよ うに改変されたウイルス、特にレトロウイルスを胚に感染させることができる。 胚の内細胞材料に由来する、培養において安定化した多能性幹細胞を、本発明 のヌクレオチド配列を取り込むように培養において操作できる。そのような幹細 胞から、胚盤胞に移植し、これを養母に移植して分娩させることにより、トラン スジェニック動物を形成できる。トランスジェニック実験に適した動物は標準的 な業者、たとえばチャールズ・リバー（マサチュセッツ州ウィルミントン）、タ コニック（ニューヨーク州ジャーマンタウン）およびハーラン・スプラーグ・ド ーレイ（インディアナ州インディアナポリス）から入手できる。 胚細胞（ＥＳ）を培養し、次いでエレクトロポレーション、リン酸カルシウム ／ＤＮＡ沈殿、および直接注入などの方法でＥＳ細胞にＤＮＡを導入することに よりトランスジェニック動物を形成する方法も、当業者に周知である。たとえば Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒ ｔｓｏｎ編，ＩＲＬプレス（１９８７）を参照されたい。 胚の操作方法は当技術分野で周知である。げっ歯類の胚の操作方法およびＤＮ Ａを接合体の前核にマイクロインジェクションする方法が当業者に周知である（ Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，前掲）。魚類、両生類の卵、および鳥類へのマイ クロインジェクション法はＨｏｕｄｅｂｉｎｅ ａｎｄ Ｃｈｏｕｒｒｏｕｔ（ Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ ４７：８９７−９０５，１９９１）に詳述されている 。ＤＮＡを動物組織に導入するための他の方法が米国特許第４，９４５，０５０ 号（Ｓａｎｄｆｏｒｄら，１９９０年７月３０日）に記載されている。 トランスフェクションおよび目的クローンの単離は標準法により実施できる（ たとえばＥ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，前掲）。たとえばランダムな遺伝子組込 みは、抗生物質耐性をコードする遺伝子と共に核酸をトランスフェクションする ことにより実施できる。あるいはたとえば抗生物質耐性をコードする遺伝子を、 本発明のキメラ受容体をコードする核酸配列に物理的に結合させる。 ＥＳに導入されたＤＮＡ分子を相同組換え法により染色体に組み込むこともで きる（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２，１９ ８９）。組換え事象の正の選択（たとえばネオマイシン耐性）および二重−正負 選択（たとえばネオマイシン耐性とガンシクロビル耐性）、ならびにその後のＰ ＣＲによる目的クローン同定のための方法については、Ｃａｐｅｃｃｈｉ（前掲 ）およびＪｏｙｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３８：１５３−１５６ ，１９８９）により記載されており、それらの教示が本明細書に含まれる。 操作の最終段階は標的ＥＳ細胞を胚盤胞に注入し、その胚盤胞を偽妊娠雌に移 植することである。得られたキメラ動物を繁殖させ、子孫をサザンブロット法に より分析して、トランスジーンを保有する個体を確認する。 トランスジェニック動物の形成方法を記載した例は、以下のとおりである。雌 マウスを過剰排卵誘発し、雄と交尾させる。交配した雌をＣＯ₂窒息または頸椎 脱臼法により屠殺し、切除した卵管から胚を回収する。周囲の卵丘細胞を除去す る。次いで前核胚を洗浄し、注入時まで保存する。 精管切除した雄とつがいにしたランダムな周期の雌マウス成体を、移植胚のレ シピエントとして用いる。レシピエント雌をドナー雌と同時に交配させ、胚を外 科手術によりレシピエント雌へ移植する。 トランスジェニックラットの形成法はマウスのものと同様である。Ｈａｍｍｅ ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６３：１０９９−１１１２，１９９０を参照され たい。トランスジェニック非げっ歯類哺乳動物および他の動物の形成法は当技術 分野で既知である。たとえばＨｏｕｄｅｂｉｎｅ ａｎｄ Ｃｈｏｕｒｒｏｕｔ （前掲）；Ｐｕｒｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８１− １２８８，１９８９；およびＳｉｍｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｙ ６：１７９−１８３，１９８８を参照されたい。 Ｋ．トランスフェクション細胞株 機能性キメラ受容体を発現する核酸を用いて、特異的キメラ受容体を機能的に 発現するトランスフェクション細胞株を形成できる。そのような細胞株は多様な 用途をもち、たとえば代謝指向型グルタミン酸受容体活性を調節しうる分子の高 処理量スクリーニングに用いられ；また代謝指向型グルタミン酸受容体への結合 をアッセイするために用いられる。 多様な細胞株が、内因性機能応答に外因性発現受容体を共役させることができ る。多数のこれらの細胞株（たとえばＮＩＨ−３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＮＧ１１５、 ＣＨＯ、ＨＥＫ ２９３およびＣＯＳ７）を試験して、それらが内因性代謝指向 型グルタミン酸を欠如することを確認できる。外因性グルタミン酸に対する応答 を欠如する系を用いて、本発明のクローン化キメラ受容体を発現する安定にトラ ンスフェクションした細胞株を樹立できる。 これらの安定なトランスフェクション体の調製は、キメラ代謝指向型グルタミ ン酸受容体ｃＤＮＡをコードする配列を多重クローン部位にクローン化した真核 細胞発現ベクター、たとえばＰＭＳＧで、適切な細胞株をトランスフェクション することにより達成される。これらの発現ベクターは、多様な哺乳動物細胞にお いてｃＤＮＡの高レベル転写を駆動するプロモーター領域、たとえばマウス乳房 腫瘍ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶ）を含む。さらに、これらのベクターは当 該ｃＤＮＡを安定に発現する細胞を選択するための遺伝子を含む。ＰＭＳＧベク ター中の選択性マーカーは、非トランスフェクション細胞を死滅させるために培 養に添加される代謝阻害薬に対する抵抗性を与える酵素、キサンチン−グアニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）をコードする。高処理量スク リーニングアッセイに用いる代謝指向型グルタミン酸受容体発現細胞株の調製に 最適な条件を決定するために、通常は多様な発現ベクターおよび選択方式が評価 される。 プラスミドＤＮＡを含む真核細胞株のトランスフェクションに最も有効な方法 は、その細胞株に応じて異なる。キメラ受容体発現構築体を、Ｃａ²⁺ホスフェー ト沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、リポフェクションま たはエレクトロポレーションなどの適切な方法で、培養細胞内へ導入する。 トランスフェクションＤＮＡを安定に取り込んだ、またはエピソーム保持して いる細胞は、前記のように選択培地に対するそれらの耐性により確認され、そし て耐性コロニーの拡大によりクローン細胞株が得られる。これらの細胞株による キメラ代謝指向型グルタミン酸受容体ｃＤＮＡの発現を、溶液ハイブリダイゼー ションおよびノーザンブロット分析により評価する。この受容体蛋白質の機能性 発現は、外部から付与されたカルシウム受容体アゴニストに応答した細胞内Ｃａ²⁺ の移動を測定することにより判定される。 以下の実施例は本発明を説明するものであって、その範囲を限定するものでは ない。 ＩＩＩ．実施例 本発明の種々の観点および態様を説明するために以下の実施例を提示する。こ れらの実施例は本明細書に開示する発明を限定するものではなく、本発明の新規 なキメラ受容体を構築する方法を説明するものである。それらの実施例はまた、 どの化合物が目的のｍＧｌｕＲを結合または調節するかをスクリーニングする方 法を説明する。 実施例１： ｐｈＰＣａＲ４．０およびｐｍＧｌｕＲ１ プラスミドｐｈＰＣａＲ４．０（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：１２９ １９，１９９５、本明細書に参考として含まれる）を、アンピシリン１００ｕｇ ／ｍｌ（ベーリンガー・マンハイム）を含有する栄養ブロス中で増殖した、上記 プラスミドを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞から単離した。このプラスミドＤ ＮＡを、ヒトカルシウム受容体をコードするＤＮＡ源として用い、ベクターｐＢ ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（ストラタジーン）のＥｃｏＲＩ部位にＴ７配向でク ローン化した。制限酵素および修飾酵素は、別途明記しない限りすべてニュー・ イングランド・バイオラボズから購入された。 市販のラット嗅球ｃＤＮＡライブラリー（ストラタジーン）のオリゴヌクレオ チドスクリーニングにより得たラットｍＧｌｕＲ１の２つのオーバーラップサブ クローンから、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ中でプラスミドｐ７−３／６Ａを 組み立てた。このプラスミドＤＮＡを代謝指向型グルタミン酸受容体ｍＧｌｕＲ １源として用いた。またそれを用いて、市販のヒト小脳ｃＤＮＡライブラリーを ヒト類似体につきスクリーニングした。ヒト小脳ライブラリーを、Ｓａｍｂｒｏ ｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１章，１９８９、に記載の方法により、放射性標識ラ ットｍＧｌｕＲ１でスクリーニングした。陽性プラークを製造業者のプロトコー ルにより採取し、制限酵素地図を作成して、それらを公開されたヒトｍＧｌｕＲ １配列（欧州特許出願公開第０ ５６９ ２４０Ａ１および０ ５６８ ３８４ Ａ１号）と対比した。２つのサブクローンを組み立てて、完全なヒトｍＧｌｕＲ １を形成した。 あるいはヒトｍＧｌｕＲ１の配列は欧州特許出願公開第０ ５６９ ２４０Ａ １および０ ５６８ ３８４Ａ１号により得られる。この配列を用いて調製した プローブを用いてヒトｃＤＮＡライブラリーを探査し、全長ヒトクローンを得る ことができる。さらに、当該配列は本明細書に記載の配列を用いて合成できる。 実施例２： ｐｍＧｌｕＲ１／ＣａＲ 組換えＰＣＲおよび多工程クローニング法によりキメラ受容体を構築した。組 換えＰＣＲの概説はＨｉｇｕｃｈｉ，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉ ｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９０） 、アカデミック・プレス社、により提示される。第１構築体においては、組換え ＰＣＲを用いてｍＧｌｕＲ１とＣａＲの配列を細胞外ドメインと貫膜ドメインの 接合部で結合した。この第１キメラｐＲ１／ＣａＲは、ｍＧｌｕＲ１の細胞外ド メイン、ならびにカルシウム受容体の貫膜領域および細胞内領域を含んでいた。 キメラ接合部は３回の別個のＰＣＲ反応により形成された。第１反応はラットｍ ＧｌｕＲ１に特異的な２つのプライマー、すなわちヌクレオチド１１４６〜１１ ６７をコードする２２ｍｅｒであるＡ４、ならびにｍＧｌｕＲ１の２２塩基（ヌ クレオチド−１７５５〜−１７７６）およびＣａＲ由来の２１塩基（ヌクレオチ ド −１８３７〜−１８５７）を含む４３ｍｅｒであるアンチセンスプライマーｏｌ ｉｇｏＢを用いた。これらのプライマーを用いてラットｍＧｌｕＲ１の６５０ｂ ｐフラグメントを増幅させた。別個のＰＣＲ反応において、ＣａＲの５００ｂｐ フラグメントを、ハイブリッドプライマーＣ、すなわちｏｌｉｇｏＢの相補体で ある４３ｍｅｒ、およびＤ４、すなわちＣａＲのヌクレオチド−２２５６〜−２ ２７９に対応するアンチセンスプライマーにより増幅させた。これら２回のＰＣ Ｒ生成物をアガロースゲルから精製し、等モル比で外部プライマーＡ４およびＤ ４ならびにプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼＰｆｕ（ストラタジーン） の存在下にアニールした。この１，１００ｂｐキメラＰＣＲ生成物をＮｓｉ I で消化し、ＥｃｏＲＶおよびＮｓｉ Ｉで消化したｐｈＣａｒ４.０中へサブク ローニングした。得られたサブクローンを次いでＸｈｏ ＩおよびＳｆｉ Ｉで 消化してＣａＲの細胞外ドメインを除去し、これをラットｍＧｌｕＲ１のＸｈｏ Ｉ−Ｓｆｉ Ｉフラグメントで置換した。得られたキメラｐＲ１／Ｃａｒを、 制限酵素地図作成およびシーケナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）バージョン２．０ （ＵＳバイオケミカル）による二本鎖ＤＮＡ配列決定により証明した。ｐＲ１／ ＣａｒのＤＮＡ配列および対応するアミノ酸配列を図２に示す。 実施例３： ｐＣａＲ／Ｒ１ 第２構築体ｐＣａＲ／Ｒ１は、ＣａＲの細胞外ドメインならびにｍＧｌｕＲ１ の貫膜領域および細胞内領域をコードするという点で、実施例２に記載したキメ ラの逆であった。キメラ接合部は前記に従って組換えＰＣＲにより形成された。 第１反応はＣａＲに特異的な２つのプライマー、すなわちヌクレオチド８６２〜 ８８３に対応する２２ｍｅｒであるＣＲＳｆ１、ならびにＣａＲに対応する１８ 塩基（ヌクレオチド−１７７７〜−１７９４）およびｍＧｌｕＲ１由来の１８塩 基（ヌクレオチド−２１１０〜−２１２７）を含む３６ｍｅｒであるアンチセン スプライマーＣＲ１７９４を用いた。これらのプライマーを用いてＣａＲの９３ ５ｂｐフラグメントを増幅させた。別個のＰＣＲ反応において、ｍＧｌｕＲ１の ３６０ｂｐフラグメントを、ハイブリッドプライマーＲ１２１１０、すなわちｍ ＧｌｕＲ１の１８塩基（ヌクレオチド２１１０〜２１２７）に共有結合したＣａ Ｒの１８塩基（ヌクレオチド１７７７〜１７９４）を含む３６ｍｅｒ、およびＲ １Ｂｇｌ、すなわちｍＧｌｕＲ１のヌクレオチド−２４５１〜−２４７０に対応 するアンチセンスプライマーにより増幅させた。これら２回のＰＣＲ生成物をア ガロースゲルから精製し、等モル比で外部プライマーＣＲＳｆ１およびＲ１Ｂｇ ｌならびにプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼＰｆｕ（ストラタジーン） の存在下にアニールした。この１，２５０ｂｐキメラＰＣＲ生成物をＳｆｉ I およびＢｇｌ ＩＩで消化し、同一酵素で消化したｐ７／３Ａ中へサブクローニ ングした。サブクローンを次いでＳａｌ ＩおよびＳｆｉ Ｉで消化してｍＧｌ ｕＲ１の細胞外ドメインを除去し、次いでＣａＲのＳａｌ Ｉ−Ｓｆｉ Ｉフラ グメントで置換した。得られたキメラｐＣａＲ／Ｒ１を、制限酵素地図作成およ びシーケナーゼ、バージョン２．０（ＵＳバイオケミカル）による二本鎖ＤＮＡ 配列決定により証明した。ｐＣａＲ／Ｒ１のＤＮΛ配列および対応するアミノ酸 配列を図３に示す。 実施例４： ｐｒａｔＣＨ３およびｐｈＣＨ４ これらのキメラは、ＣａＲの細胞質テイルをラットまたはヒトｍＧｌｕＲ１の 細胞外ドメインおよび貫膜ドメインにスワッピングした結果である。組換えＰＣ Ｒを用いてＣａＲのＣ−末端テイルをヒトｍＧｌｕＲ１（ラットｍＧｌｕＲ１シ グナル配列をコードする）のヌクレオチド２５３５の後に結合させた。第１ＰＣ Ｒ反応はヒトｍＧｌｕＲ１に特異的な２つのプライマー、すなわちヌクレオチド ２２４２〜２２６５に対応する２４ｍｅｒであるＭ−１ｒｅｖ、ならびにｈｍＧ ｌｕＲ１の１８塩基（ヌクレオチド−２５１８〜−２５３５）およびＣａＲの１ ８塩基（ヌクレオチド−２６０２〜−２６１９）を含む３６ｍｅｒであるアンチ センスプライマーＣＨ３Ｒ１を用いた。これらのプライマーを用いてｈｍＧｌｕ Ｒ１の３００ｂｐフラグメントを増幅させた。別個のＰＣＲ反応において、Ｃａ Ｒの７５０ｂｐフラグメントを、ハイブリッドプライマーＣＨ３ＣａＲ、すなわ ちｏｌｉｇｏ ＣＨ３Ｒ１の相補体である３６ｍｅｒ、およびＢｌｕｅｓｃｒｉ ｐｔベクターにおいてＣａＲの３’末端から下流の領域で開始する市販のＴ３プ ライマー（ストラタジーン）により増幅させた。これら２回のＰＣＲ生成物をア ガロースゲルから精製し、等モル比で外部プライマーＭ−１ ｒｅｖおよびＴ３ ならびにプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼＰｆｕ（ストラタジーン）の 存在下にアニールした。この１ｋｂキメラＰＣＲ生成物をＮｈｅ ＩおよびＮｏ ｔ Ｉで消化し、同一酵素で消化したｐｈｍＧｌｕＲ１中へサブクローニングし た。得られたキメラｐｈＣＨ４を、制限酵素地図作成および二本鎖ＤＮＡ配列決 定により証明した。このクローンを用いた卵母細胞における機能活性を検出する ためには、ラットｍＧｌｕＲ１由来の５’側非翻訳領域およびシグナル配列をこ のヒトクローンの同一領域と交換する必要があった。これはＢｓｕ３６Ｉ制限部 位を用いて行われた。さらに、ラットｍＧｌｕＲ１のＡｃｃ Ｉフラグメントを ｐｈＣＨ４内へサブクローニングして、この同一キメラのラット型を形成した。 このキメラをｒａｔＣＨ３と呼ぶ。ｐｒａｔＣｈ３のＤＮＡ配列および対応する アミノ酸配列を図４に示す。ｐｈＣＨ４４のＤＮＡ配列および対応するアミノ酸 配列を図５に示す。 したがって上記の各実施例に記載した方法で、他のｍＧｌｕＲ／ＣａＲキメラ を構築し、評価し、かつスクリーニングできる。この例においてはグループＩの 代謝指向型グルタミン酸受容体を採用した。これはカルシウム受容体と同様にホ スホリパーゼＣの活性化および細胞内カルシウム移動に共役し、Ｃ−末端テイル のスワッピングにより第２メッセンジャー系の一体性を維持した。さらに、Ｃａ ＲテイルをｍＧｌｕＲ１に付加した場合、脱感作特性が失われた。これは、細胞 内ドメインのスワッピングにより代謝指向型グルタミン酸受容体の特異的なＧ蛋 白質共役をＣａＲのものに変更しうることを証明する。たとえばグループＩＩの ｍＧｌｕＲ、たとえばＧ_i共役するｍＧｌｕＲ２またはｍＧｌｕＲ３をＧｑ共役 受容体に変更できる。これは、実施例２、３および４に記載のプロトコールによ りこれらの受容体上へＣａＲのＣ−末端細胞質ゾルテイルを交換することによっ て実施できる。有効なＧｑ共役は、実施例５および６の記載に従って卵母細胞に おいて評価できる。グループＩＩをＬ−ＣＣＧ−Ｉ（それらの最も有効なアゴニ スト）により活性化すると、細胞内Ｃａ²⁺の移動が誘発され、これにより電位固 定卵母細胞において検出可能な内向きの調整Ｃｌ^-電流が測定されるであろう。 Ｇ蛋白質結合の有効性を高めるために、ＣａＲの細胞内（細胞質）ループをさ らに１またはそれ以上、ｍＧｌｕＲ１上へスワッピングするのが有用であろう。 そのような置換は、たとえばカルシウム受容体の細胞内ループ１、細胞内ループ ２および細胞内ループ３のいずれかを単独で、または任意のループの組合わせで 行うことができる。そのようなサブドメインのスワッピングはＧ蛋白質結合特異 性を最も効果的に伝達するのに必要であろう。 実施例５： ＲＮＡのインビトロ転写 実施例１〜４に記載した受容体をコードするＲＮＡ転写体を、ｍＭｅｓｓａｇ ｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ（商標、アンビオン）と共に供給されるＴ７ポリメラーゼ により、ブラスミド鋳型からの酵素転写によって調製した。それぞれのプラスミ ドを制限酵素で処理して、ｃＤＮＡ挿入配列の３’末端に対して遠位で１回切断 を行い、鋳型を直線化した。このＤＮＡをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼと共に、Ｇ ｐｐｐＧキャップヌクレオチド、ｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＵＴＰおよびｒＧＴＰ の存在下でインキュベートした。この合成ＲＮＡ転写体を反応混合物のＤＮａｓ ｅ処理およびそれに続くアルコール沈殿により精製した。吸光分光法（ＯＤ₂₆₀ ）によりＲＮＡを定量し、エチジウム染色した１．２％ホルムアルデヒドゲル上 で視覚化した。 実施例６： 卵母細胞における機能性発現 注入用の卵母細胞を、雌アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉs ）成体から、Ｃ．Ｊ．Ｍａｒｃｕｓ−ＳｅｋｕｒａおよびＭ．Ｊ．Ｍ．Ｈｉｔｃ ｈｃｏｃｋ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２（ １９８７）に記載の方法で得た。１．５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼタイプＩＡ（ ワーシントン）を含有する無Ｃａ²⁺−変更バース塩類溶液（ＭＢＳ）中で、卵巣 葉片を３０分間インキュベートした。次いで実施例５に従って調製した５ｎｇの ＲＮＡ転写体を各卵母細胞に注入した。注入後に、０．５ｍＭ ＣａＣｌ₂を含 有するＭＢＳ中で１６℃において２〜７日間、卵母細胞をインキュベートしたの ち、電気生理学的に検査した。 グルタミン酸およびカルシウム受容体アゴニストに応答した卵母細胞膜を横切 る電流伝達電極の電位記録により、各キメラ受容体が機能する効力を測定した。 アキソクランプ（Ａｘｏｃｌａｍｐ）２Ａ増幅器（アキソン・インスツルメンツ 、カリフォルニア州フォスター・シティー）を用いて標準２電極電位固定法によ り、卵母細胞を−６０ｍＶの保持電位に電位固定した。電流をチャート記録計で 記録 した。標準対照塩類溶液は０．３ｍＭ ＣａＣｌ₂および０．８ ＭｇＣｌ₂を含 有するＭＢＳであった。被験物質を約５ｍｌ／分の流量で流すことにより供給し た。実験はすべて室温で行われた。保持電流はその卵母細胞において安定であり 、異なる卵母細胞につき＋１０から−２００ｎＡまで変化した。受容体の活性化 に応答したＩ_Clの活性化、およびそれに続く細胞内Ｃａ²⁺（［Ｃａ］_in）を、− ６０ｍＶにおける保持電流に対比した、アゴニスト、すなわち薬物により刺激さ れた内向きピーク電流の測定により定量した。 図６ ｐＲ１／ＣａＲ対ラットｍＧｌｕＲ１（グルタミン酸およびキスカル酸） 図７ ＣａＲ／Ｒ１対ｈＰＣａｒ（カルシウム） 図８ ｐｒａｔＣＨ３対ラットｍＧｌｕＲ１およびＣａＲ（脱感作トレース） 実施例７： ｐＣａＲ／Ｒ１由来のｐＣＥＰＣａＲ／Ｒ１の構築 プラスミドｐＣａＲ／Ｒ１由来のＤＮＡを制限酵素Ｋｐｎ ＩおよびＮｏｔ Ｉで消化し、市販のエピソーム哺乳動物発現ベクターｐＣＥＰ４（インビトロゲ ン）中へクローン化した。このリゲーション生成物を、ＤＮＡ形質転換受容性に したＤＨ５ａ細胞内へトランスフェクションした。これらの細胞を、アンピシリ ン１００ｕｇ／ｍｌを含有するルリア−ベルタニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ ，ＬＢ）プレート（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ ｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８９に記載）内 で平板培養した。増殖したコロニーからクローンを選択した。このクローンｐＣ ＥＰＣａＲ／Ｒ１を制限酵素消化により解明した。 実施例８： ＨＥＫ２９３／ｐＣＥＰＣａＲ／Ｒ１のトランスフェクションお よび増殖 ヒト胚腎細胞（２９３，ＡＴＣＣ，ＣＲＬ １５７３）をルーティン様式で増 殖させた。細胞を１０ｃｍの細胞培養プレート内で、１０％ウシ胎児血清（ＦＣ Ｓ）および１×ペニシリン−ストレプトマイシン（ＰＳ、ライフ・テクノロジー ズ）を含有するダルベッコの変更イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）中において平板培 養すると、一夜のインキュベーション後に約７０％集密となった。ＤＮＡをトラ ンスフェクション用に調製するために、プラスミドｐＣＥＰＣａＲ／Ｒ１をエタ ノールで沈殿させ、すすぎ、そして１ｕｇ／ｕｌの濃度で無菌水に再懸濁した。 １４μｇのＤＮＡをリポソーム配合物ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標、ライ フ・テクノロジーズ）と共に２０分間、無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標、ラ イフ・テクノロジーズ）中でインキュベートした。室温でインキュベートしたの ち、６．８ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭをトランスフェクション配合物に添加した。 この溶液を、予め無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ洗浄溶液５ｍｌで２回すすいだ細胞に 添加した。細胞およびトランスフェクション配合物を３７℃で５時間インキュベ ートし、この時点で培地およびウシ胎児血清を追加して血清濃度を１０％にした 。一夜のインキュベーション後に、培地を１０％ＦＣＳおよび１×ＰＳを含有す るＤ−ＭＥＭに戻した。さらに２４時間のインキュベーション後に細胞をトリプ シンで脱離させ、ハイグロマイシン(ベーリンガー・マンハイム)２００ｕｇ／ｍ ｌを含有する培地（ベーリンガー・マンハイム）中で再び平板培養した。増殖し た細胞はハイグロマイシン耐性遺伝子をコードするｐＣＥＰＣａＲ／Ｒ１を含ん でいた。個々のクローンを回収し、標準組織培養法により増殖させた。新鮮な組 織培養培地中へ解離させ、新たな培養皿に最初の容量の１／１０で接種すること により、個々のクローンおよびプールした安定な細胞の両方の継代培養物を調製 した。 実施例９： ＨＥＫ２９３／ｐＣＥＰＣａＲ／Ｒ１のＦｕｒａアッセイ 細胞外カルシウムの増加に応答した細胞内カルシウム放出の測定を、Ｆｕｒａ アッセイ法（Ｐａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）により定量する。ｐＣＥＰ ＣａＲ／Ｒ１を含む安定にトランスフェクションした細胞に、１.２５ｍＭＣａ Ｃｌ₂、１ｍｇ／ｍｌグルコース、０．５％ＢＳＡ¹を含有するＳＰＦ−ＰＣＢ（ １２６ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２０ｍＭ ＨＥ ＰＥＳ、ｐＨ７．４）中で３７℃において２０〜３０分間のインキュベーション により、２μＭのｆｕｒａ−２アセトキシメチルエステルを負荷する。次いで０ ．５ｍＭ ＣａＣｌ₂、０．５％ＢＳＡを含有するＳＰＦ−ＰＣＢ中で細胞を１ 〜２回洗浄し、密度４〜５００万個／ｍｌとなるように再懸濁し、プラスチック ビーカー内に２２℃で保存する。蛍光信号を記録するために、石英キュベット内 へＢＳＡを含有しない３７℃のＳＰＦ−ＰＣＢで細胞を５倍希釈して、最終ＢＳ Ａ濃度０．１％を得る（ＢＳＡを含有しない３７℃のＳＰＦ−ＰＣＢ １．２ｍ ｌ＋ 細胞懸濁液０．３ｍｌ）。蛍光の測定は、３７℃で常に撹拌しながら、注文製造 した分光光度計（バイオメディカル・インスツルメンテーション・グループ、ペ ンシルベニア大学）を用いて行う。励起および発光波長はそれぞれ３４０および ５１０ｎｍである。蛍光信号を検量するために、ジギトニン（シグマ、ミズーリ 州セントルイス；カタログ＃Ｄ ５６２８；５０μｇ／ｍｌ、最終）を添加して Ｆ_maxを得る。見掛けのＦ_minをＥＧＴＡ（１０ｍＭ、最終）およびトリス塩基（ ｐＨ約１０、最終）の添加により測定する。２２４ｎＭの解離定数（Ｋｄ）およ び下記の方程式を用いて、放出された細胞内Ｃａ²⁺の濃度を計算する： ［Ｃａ²⁺］_i＝（Ｆ−Ｆ_min／Ｆ_max−Ｆ）×Ｋｄ 結果を図９にグラフで示す。 実施例１０： 組換え受容体結合アッセイ 下記は代謝指向型グルタミン酸受容体活性を調節する化合物の迅速スクリーニ ングアッセイ法の一例である。このスクリーニングアッセイ法では、まず化合物 が組換えキメラ受容体、またはｍＧｌｕＲ、ＣａＲもしくはキメラ受容体の受容 体フラグメントに結合する効力を測定する。次いで、それらの受容体またはフラ グメントに結合する化合物を、それらが代謝指向型グルタミン酸受容体における １またはそれ以上の活性を調節する効力につき試験する。 １方法においては、代謝指向型グルタミン酸受容体をコードするｃＤＮＡまた は遺伝子クローンを得る。そのクローンの別個のフラグメントを適切な発現ベク ター内で発現させて、グルタミン酸に結合しうる可能な最小の受容体ポリペプチ ド（１またはそれ以上）を産生させる。このような実験は、代謝指向型グルタミ ン酸受容体を発現する安定にトランスフェクションした哺乳動物細胞株（たとえ ばＨＥＫ２９３細胞）を用いることによって容易になる。 目的とする結合特性を備えた組換えポリペプチド（１またはそれ以上）を、標 準的な化学的方法で固相支持体に結合させることができる。この固相、すなわち アフィニティーマトリックスを、次いでグルタミン酸と接触させて、グルタミン 酸がカラムに結合することを証明し、またグルタミン酸が固相から分離しうる条 件を確認できる。次いで大規模な化合物ライブラリーを用いてこの方法を繰り返 し、このアフィニティーマトリックスに結合しうる化合物を判定できる。次いで 、結合した化合物をグルタミン酸と同様な様式で放出させることができる。他の 結合および放出条件を用いて、グルタミン酸の結合に用いたものと異なる条件下 で（たとえば特に病的状態で遭遇する生理学的条件をより良く模倣した条件）結 合しうる化合物を得ることができる。こうしてｍＧｌｕＲに結合する化合物を、 液体培地または抽出液中に存在する極めて多数の化合物から選択できる。 他の方法においては、キメラ代謝指向型グルタミン酸／カルシウム受容体をカ ラムその他の固相支持体に結合させる。次いで、その受容体上のグルタミン酸結 合部位に結合する試薬により競合排除されない化合物を同定できる。それらの化 合物は受容体上の他の結合部位を規定する。それらの化合物は既知の化合物と構 造的に異なる可能性があり、療法薬として有用なアゴニストまたはアンタゴニス トの化合物群を示す可能性がある。 他の態様は以下の請求の範囲に含まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＭ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，Ｋ Ｚ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，Ａ Ｕ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ， ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ハンマーランド，ランス・ジー アメリカ合衆国ユタ州84010，バウンティ フル，サウス 400 イースト 3201

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．キメラ受容体を含む組成物であって、 前記キメラ受容体は細胞外ドメイン、７回貫膜ドメイン、および細胞内細胞質テ イルドメインを含み、 ここで、少なくとも６個の連続するアミノ酸の配列は代謝指向型グルタミン酸受 容体の配列に相同であり、かつ少なくとも６個の連続するアミノ酸の配列はカル シウム受容体の配列に相同であることを特徴とする組成物。 ２．前記細胞外ドメイン、前記７回貫膜ドメイン、および前記細胞内細胞質テイ ルドメインの少なくとも１つのドメインが代謝指向型グルタミン酸受容体のドメ インに相同である、および／または、少なくとも１つのドメインがカルシウム受 容体のドメインに相同である、請求項１記載の組成物。 ３．前記細胞外ドメイン、前記７回貫膜ドメイン、および前記細胞内細胞質テイ ルドメインの少なくとも１つのドメインが代謝指向型グルタミン酸受容体のドメ インに相同であり、かつ 少なくとも１つのドメインがカルシウム受容体のドメインに相同である、請求項 ２記載の組成物。 ４．前記キメラ受容体が、 カルシウム受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、 代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、およ び 代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメ イン を含む、請求項３記載の組成物。 ５．前記キメラ受容体が、 カルシウム受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、 カルシウム受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、および 代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメ イン を含む、請求項３記載の組成物。 ６．前記キメラ受容体が、 代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、 カルシウム受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、および 代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメ イン を含む、請求項３記載の組成物。 ７．前記キメラ受容体が、 代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、 代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、およ び カルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメイン を含む、請求項３記載の組成物。 ８．前記キメラ受容体が、 代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、 カルシウム受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、および カルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメイン を含む、請求項３記載の組成物。 ９．前記キメラ受容体が、 カルシウム受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、 代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、およ び カルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメイン を含む、請求項３記載の組成物。 １０．前記キメラ受容体が、 代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、 代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、ただ し前記７回貫膜ドメインはカルシウム受容体の少なくとも１つの細胞質ループを 含み、および カルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメイン を含む、請求項３記載の組成物。 １１．前記７回貫膜ドメインの少なくとも１つの細胞質ループが代謝指向型グル タミン酸受容体の細胞質ループに相同である、請求項１記載の組成物。 １２．前記７回貫膜ドメインの少なくとも１つの細胞質ループがカルシウム受容 体の細胞質ループに相同である、請求項１記載の組成物。 １３．前記キメラ受容体の少なくとも６個の連続するアミノ酸配列がカルシウム 受容体のアミノ酸の配列に相同であり、かつ前記キメラ受容体の残りのアミノ酸 配列が代謝指向型グルタミン酸受容体のアミノ酸の配列に相同である、請求項１ 記載の組成物。 １４．前記キメラ受容体の少なくとも６個の連続するアミノ酸配列が代謝指向型 グルタミン酸受容体のアミノ酸の配列に相同であり、かつ前記キメラ受容体の残 りのアミノ酸の配列がカルシウム受容体のアミノ酸の配列に相同である、請求項 １記載の組成物。 １５．キメラ受容体をコードする、濃縮された、精製された、または単離された 核酸分子を含む組成物であって、 前記キメラ受容体は細胞外ドメイン、７回貫膜ドメイン、および細胞内細胞質テ イルドメインを含み、 ここで、少なくとも６個の連続するアミノ酸の配列は代謝指向型グルタミン酸受 容体の配列に相同であり、かつ少なくとも６個の連続するアミノ酸の配列はカル シウム受容体の配列に相同であることを特徴とする組成物。 １６．前記キメラ受容体が、 カルシウム受容体のドメインに相同である少なくとも１つのドメイン、および 代謝指向型グルタミン酸受容体のドメインに相同である少なくとも１つのドメイ ン を含む、請求項１５記載の組成物。 １７．前記キメラ受容体が、 代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、 カルシウム受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、および 代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメ イン を含む、請求項１６記載の組成物。 １８．前記キメラ受容体が、 代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、 代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、およ び カルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメイン を含む、請求項１６記載の組成物。 １９．前記キメラ受容体が、 代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、 カルシウム受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、および カルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメイン を含む、請求項１６記載の組成物。 ２０．前記キメラ受容体が、 代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、 代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、ただ し前記７回貫膜ドメインはカルシウム受容体の少なくとも１つの細胞質ループを 含み、および カルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメイン を含む、請求項１６記載の組成物。 ２１．請求項１３記載のキメラ受容体をコードする核酸を含む組成物。 ２２．請求項１４記載のキメラ受容体をコードする核酸を含む組成物。 ２３．請求項２記載のキメラ受容体をコードする核酸分子を含む、複製可能な発 現ベクター。 ２４．請求項２３記載のベクターにより形質転換された組換え宿主細胞。 ２５．キメラ受容体を製造する方法であって、請求項１３記載の発現ベクターで 形質転換されたまたはトランスフェクトされた原核生物または真核生物宿主細胞 を、適切な栄養状態下で、前記キメラ受容体の発現を可能にする様式で増殖させ ることを含む方法。 ２６．代謝指向型グルタミン酸受容体に結合するかまたはその活性を調節する化 合物をスクリーニングする方法であって、 ａ）細胞外ドメイン、７回貫膜ドメイン、および細胞内細胞質テイルドメインを 含むキメラ受容体を調製し、ここで、少なくとも１つのドメインは代謝指向型グ ルタミン酸受容体のドメインに相同であり、かつ少なくとも１つのドメインはカ ルシウム受容体のドメインに相同であり、 ｂ）前記キメラ受容体および前記化合物を許容可能な媒質中に導入し、そして ｃ）物理学的に検出可能な手段により結合または調節をモニターし、このことに より、前記代謝指向型グルタミン酸受容体に結合するかまたはその活性を調節す る化合物を同定する； の各工程を含む方法。 ２７．前記キメラ受容体の前記細胞外ドメインが代謝指向型グルタミン酸受容体 の細胞外ドメインに相同である、請求項２６記載の方法。 ２８．前記キメラ受容体が、 代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、 カルシウム受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、および 代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメ イン を含む、請求項２７記載の方法。 ２９．前記キメラ受容体が、 代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、 代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、およ び カルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメイン を含む、請求項２７記載の方法。 ３０．前記キメラ受容体が、 代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、 カルシウム受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、および カルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメイン を含む、請求項２７記載の方法。 ３１．前記キメラ受容体が、 代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、 代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、ただ し、前記７回貫膜ドメインはカルシウム受容体の少なくとも１つの細胞質ループ を含み、および カルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメイン を含む、請求項２７記載の方法。 ３２．代謝指向型グルタミン酸受容体に結合するかまたはその活性を調節する化 合物をスクリーニングする方法であって、 ａ）細胞外ドメイン、７回貫膜ドメイン、および細胞内細胞質テイルドメインを 含むキメラ受容体をコードする核酸配列を調製し、ここで該キメラ受容体はカル シウム受容体のアミノ酸の配列に相同である少なくとも６個の連続するアミノ酸 の配列、および代謝指向型グルタミン酸受容体のアミノ酸の配列に相同である少 なくとも６個の連続するアミノ酸の配列を含み、 ｂ）該配列を宿主細胞中で前記キメラ受容体を発現しうる複製可能な発現ベクタ ー中に挿入し、 ｃ）宿主細胞を（ｂ）のベクターで形質転換し、 ｄ）前記形質転換された宿主細胞および前記化合物を許容可能な媒質中に導入し 、そして ｅ）前記化合物の前記宿主細胞に及ぼす影響をモニターする； の各工程を含む方法。 ３３．前記キメラ受容体が、代謝指向型グルタミン酸受容体のドメインに相同で ある少なくとも１つのドメイン、および／または、カルシウム受容体のドメイン に相同である少なくとも１つのドメインを含む、請求項３２記載の方法。 ３４．前記キメラ受容体が、代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに 相同である細胞外ドメインを含む、請求項３３記載の方法。 ３５．前記キメラ受容体が、 代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、 カルシウム受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、および 代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメ イン を含む、請求項３４記載の方法。 ３６．前記キメラ受容体が、 代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、 代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、およ び カルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメイン を含む、請求項３４記載の方法。 ３７．前記キメラ受容体が、 代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、 カルシウム受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、および カルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメイン を含む、請求項３４記載の方法。 ３８．前記キメラ受容体が、 代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、 代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、ただ し、前記７回貫膜ドメインはカルシウム受容体の少なくとも１つの細胞質ループ を含み、および カルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメイン を含む、請求項３４記載の方法。 ３９．前記キメラ受容体が代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに 相同である７回貫膜ドメインを含む、請求項３３記載の方法。 ４０．前記７回貫膜ドメインの少なくとも１つの細胞質ループがカルシウム受容 体の細胞質ループに相同である、請求項３２記載の方法。 ４１．前記キメラ受容体の残りの配列が代謝指向型グルタミン酸受容体の配列に 相同である、請求項４０記載の方法。 ４２．前記キメラ受容体がカルシウム受容体のアミノ酸の配列に相同である少な くとも６個の連続するアミノ酸の配列を含み、かつ前記キメラ受容体の残りのア ミノ酸配列が代謝指向型グルタミン酸受容体のアミノ酸の配列に相同である、請 求項３２記載の方法。 ４３．前記７回貫膜ドメインの少なくとも１つの細胞質ループが代謝指向型グル タミン酸受容体の細胞質ループに相同である、請求項３２記載の方法。 ４４．前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項３２記載の方法。 ４５．代謝指向型グルタミン酸受容体またはカルシウム受容体に結合する化合物 をスクリーニングする方法であって、 ａ）受容体のフラグメントをコードする核酸配列を調製し、 ｂ）前記配列を、宿主細胞中で前記フラグメントを発現しうる複製可能な発現ベ クター中に挿入し、 ｃ）宿主細胞を（ｂ）のベクターで形質転換し、 ｄ）前記宿主細胞からフラグメントを回収し、 ｅ）前記フラグメントおよび前記化合物を許容可能な媒質中に導入し、そして ｆ）化合物のフラグメントへの結合を物理学的に検出可能な手段によりモニター する； の各工程を含む方法。 ４６．前記受容体が代謝指向型グルタミン酸受容体である、請求項４５記載の方 法。 ４７．前記フラグメントが前記代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメイン を含む、請求項４６記載の方法。 ４８．前記フラグメントが前記代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメイ ンを含む、請求項４６記載の方法。 ４９．前記フラグメントが代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインお よび細胞質テイルドメインを含む、請求項４６記載の方法。 ５０．前記受容体がカルシウム受容体である、請求項４５記載の方法。 ５１．前記フラグメントが前記カルシウム受容体の細胞外ドメインを含む、請求 項５０記載の方法。 ５２．前記フラグメントが前記カルシウム受容体の７回貫膜ドメインを含む、請 求項５０記載の方法。 ５３．前記フラグメントが前記カルシウム受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞 質テイルドメインを含む、請求項５０記載の方法。 ５４．代謝指向型グルタミン酸受容体またはカルシウム受容体に結合するかまた はそれを調節する化合物をスクリーニングする方法であって、 ａ）受容体のフラグメントをコードする核酸配列を調製し、 ｂ）前記配列を宿主細胞中において前記フラグメントを発現しうる複製可能な発 現ベクター中に挿入し、 ｃ）宿主細胞を（ｂ）のベクターで形質転換し、 ｄ）前記形質転換された宿主細胞および前記化合物を許容可能な媒質中に導入し 、そして ｅ）前記化合物の前記宿主細胞に及ぼす影響をモニターする； の各工程を含む方法。 ５５．前記フラグメントが代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインお よび細胞質テイルドメインを含む、請求項５４記載の方法。 ５６．前記フラグメントがカルシウム受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テ イルドメインを含む、請求項５４記載の方法。 ５７．受容体に結合するかこれを調節する化合物をスクリーニングする方法であ って、 ａ）第１の受容体のフラグメントを含む第１のフラグメントをコードする核酸配 列を調製し、 ｂ）該配列を宿主細胞中で前記第１のフラグメントを発現しうる複製可能な発現 ベクター中に挿入し、 ｃ）宿主細胞を（ｂ）のベクターで形質転換し、 ｄ）第１のフラグメントを宿主細胞から回収し、 ｅ）第２の受容体のフラグメントを含む第２のフラグメントをコードする核酸配 列を調製し、 ｆ）（ｅ）の配列を宿主細胞中で前記第２のフラグメントを発現しうる複製可能 な発現ベクター中に挿入し、 ｇ）宿主細胞を（ｆ）のベクターで形質転換し、 ｈ）第２のフラグメントを（ｇ）の宿主細胞から回収し、 ｉ）前記第１のフラグメントおよび前記第２のフラグメントおよび前記化合物を 許容可能な媒質中に導入し、そして ｊ）化合物の結合および／または調節を物理学的に検出可能な手段によりモニタ ーする； の各工程を含む方法。 ５８．前記第１のフラグメントが代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメイ ンを含み、かつ 前記第２のフラグメントがカルシウム受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テ イルドメインを含む、請求項５７記載の方法。 ５９．前記第１のフラグメントが代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメイ ンおよび７回貫膜ドメインを含み、かつ 前記第２のフラグメントがカルシウム受容体の細胞質テイルドメインを含む、請 求項５７記載の方法。 ６０．前記第１のフラグメントがカルシウム受容体の細胞外ドメインを含み、か つ 前記第２のフラグメントが代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインお よび細胞質テイルドメインを含む、請求項５７記載の方法。 ６１．前記第１のフラグメントがカルシウム受容体の細胞外ドメインを含み、か つ 前記第２のフラグメントが代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインお よびカルシウム受容体の細胞質テイルドメインを含む、請求項５７記載の方法。 ６２．代謝指向型グルタミン酸受容体およびカルシウム受容体の両方の活性を調 節する化合物をスクリーニングする方法であって、 ａ）キメラ受容体をコードする核酸配列を調製し、ここで該キメラ受容体は細胞 外ドメイン、７回貫膜ドメイン、および細胞内細胞質テイルドメインを含み、こ こで少なくとも１つのドメインは代謝指向型グルタミン酸受容体のドメインに相 同であり、かつ少なくとも１つのドメインはカルシウム受容体のドメインに相同 であり、 ｂ）該配列を宿主細胞中で前記キメラ受容体を発現しうる複製可能な発現ベクタ ー中に挿入し、 ｃ）宿主細胞を（ｂ）のベクターで形質転換し、 ｄ）前記形質転換した宿主細胞および前記化合物を許容可能な媒質中に導入し、 そして ｅ）前記化合物の前記細胞に及ぼす影響をモニターする； の各工程を含む方法。 ６３．代謝指向型グルタミン酸受容体活性化合物の作用部位を決定する方法であ って、 ａ）キメラ受容体をコードする核酸配列を調製し、ここで該キメラ受容体はカル シウム受容体のアミノ酸の配列に相同である少なくとも６アミノ酸配列を含み、 かつ残りのアミノ酸配列は代謝指向型グルタミン酸受容体のアミノ酸の配列に相 同であり、 ｂ）該配列を宿主細胞中で前記キメラ受容体を発現しうる複製可能な発現ベクタ ー中に挿入し、 ｃ）宿主細胞を（ｂ）のベクターで形質転換し、 ｄ）前記形質転換した宿主細胞および前記化合物を許容可能な媒質中に導入し、 そして ｅ）前記化合物の前記細胞に及ぼす影響をモニターする； の各工程を含む方法。 ６４．カルシウム受容体活性化合物の作用部位を決定する方法であって、 ａ）キメラ受容体をコードする核酸配列を調製し、ここで該キメラ受容体は代謝 指向型グルタミン酸受容体のアミノ酸の配列に相同である少なくとも６アミノ酸 配列を含み、かつ残りのアミノ酸配列はカルシウム受容体のアミノ酸の配列に相 同であり、 ｂ）該配列を宿主細胞中で前記キメラ受容体を発現しうる複製可能な発現ベクタ ー中に挿入し、 ｃ）宿主細胞を（ｂ）のベクターで形質転換し、 ｄ）前記形質転換した宿主細胞および前記化合物を許容可能な媒質中に導入し、 そして ｅ）前記化合物の前記細胞に及ぼす影響をモニターする； の各工程を含む方法。