JPH10508025A

JPH10508025A - 眼の遺伝子療法

Info

Publication number: JPH10508025A
Application number: JP8514779A
Authority: JP
Inventors: カスバートソン，アール・アンドリュー
Original assignee: ジェネンテク・インコーポレイテッド
Priority date: 1994-10-31
Filing date: 1995-10-30
Publication date: 1998-08-04
Also published as: WO1996013276A1; US20060063729A1; EP0789592A4; CA2203374A1; EP0789592A1; US5827702A; EP1621213A1; US6204251B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、眼の遺伝子療法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】眼の遺伝子療法発明の技術分野本発明は、眼の遺伝子療法に関する。発明の背景遺伝子療法による治療は、急速に現実のものとなりつつあり、すでに数ダースの遺伝子療法のプロトコルが国立衛生研究所の認可を受けており、また多くの他の遺伝子療法プロトコルが進行中である。眼の遺伝子療法による治療に適する多数の眼疾患および身体状態（コンディション）が存在する。これらの疾患は、２つのカテゴリーに分類することができるが、そのひとつは特定の遺伝子障害（優性または劣性）によって引き起こされる眼疾患であり、他方は、現在のところは遺伝子的根拠が解明されていないが、コンディションの治療に有用なタンパク質を発現する遺伝子を導入することによって治療しうる疾患である。第１のカテゴリーには、根本的な遺伝子欠損が知られている多数の疾患が含まれる。常染色体性網膜色素変性症（優性および劣性）は、ロドプシン遺伝子中の５０の突然変異によって起こる［ボックのInvest．Ophthalm．and Visual Sci.3 4(3):473(1993)］。常染色体性優性白点状網膜症、眼窩蝶形色素ジストロフィーおよび成人卵黄様斑点ジストロフィーは、ペリフェリン／ＲＤＳ遺伝子における突然変異と関係がある［カジワラらのNature Genetics 3:202(1993);ニコルスらのNature Genetics 3:202(1993);ウエルズらのNature Genetics 3:313(1993)］。ノリエ病[バーガーらのNature Genetics 1:199(1992)］、青錐体一色型色覚［ネイザンスらのScience 245:831(1989)］および先天性脈絡膜欠如[クレーマーらのNature 347:674(1990);メリーらのProc．Natl．Acad．Sci．USA 89:2135(1992 )]は、すべて遺伝子突然変異によって起こることがわかっている。脳回転状萎縮症を起こす遺伝子は、ミトコンドリア酵素オルニチンアミノトランスフェラーゼに６０以上の異なる突然変異を含んでいる。特定の遺伝子突然変異が表現型を起こすことがわかっている疾患に加えて、特定の遺伝成分が未知である多数の疾患が存在する。これらの疾患は、遺伝子に起因するかまたはタンパク質の発現に変化をもたらすような他の因子によって起こる。たとえば、年齢関連性黄斑変性は、老年の患者にとって重要な眼疾患である。網膜芽腫、前部および後部ブドウ膜炎、網膜脈管疾患、白内障、角膜ジストロフィーなどの遺伝性角膜欠損、網膜剥離および変性ならびに虹彩萎縮が、このカテゴリーに含まれる。糖尿病性網膜症などの緑内障および糖尿病に追随する網膜疾患も含まれる。最後に、遺伝的根拠はないけれども、重要な眼疾患を起こす多数のコンディションも眼疾患に含まれる。たとえば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染などのウイルス感染は頻繁に重大な症状を起こし、失明することもある。網膜剥離、糖尿病性網膜疾患、網膜静脈血栓症、網膜動脈塞栓症、アレルギー性結膜炎ならびにその他の眼のアレルギー性応答、ドライアイ、リソソーム貯蔵疾患、グリコーゲン貯蔵疾患、コラーゲン障害、ムコ多糖類ならびにプロテオグリカン障害、スフィンゴリピドーシス、ムコリピドーシス、アミノ酸代謝障害、内分泌性眼疾患、前部および後部角膜ジストロフィー、網膜光受容体障害、角膜潰瘍および外科手術後の創傷などのその他の眼の創傷もまた、公知の遺伝子的成分をもたない重要なコンディションである。最近の研究では、３０年間にわたってヒト網膜色素変性症の研究用モデルとして供されている、ｒｄマウスの網膜変性表現型が、トランスジェニックｒｄマウスにおいてウシｃＧＭＰホスホジエステラーゼβサブユニットが発現することによって救われることが明らかにされた［レムらのProc．Natl．Acad．Sci．USA 1 5:442(1992)］。同様に、ｒｄマウスの網膜変性遅延（ｒｄｓ）表現型もまた、野生型ｒｄｓ遺伝子産物である３９ｋｄの膜表面糖タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを創製することによって治癒することができる［トラビスらのNeuron 9:113(1992)］。しかし、何人かのコメンテーターから指摘されているように、トランス遺伝子の挿入の不確実性ゆえに、トランスジェニックテクニックをヒトに対する療法に直接適用することはできない［ザックのArch．Ophthalm ol．111:1477(1993)、ボック（前述）］。さらに、レトロウイルスベクターを用いるインビトロの遺伝子トランスファーが、常染色体劣性遺伝の酵素欠損であるβ−グルクロニダーゼ欠損細胞上で行われた。該酵素をコードする遺伝子を形質転換した後は、β−グルクロニダーゼ欠損細胞は正常な酵素活性を呈した［ストラムらのExp．Eye Res．50:521-532(199 0)］。最近、アデノウイルスベクターを用いる２つのインビボプロトコルが報告されている[ベネットらのInvestigative Ophthalmology and Visual Science 1994 3 5(5):2535;リーらのInvestigative Ophthalmology and Visual Science 1994 35 (5):2543]。このように、インビボおよび生体内の眼の遺伝子療法が必要である。したがって、本発明の目的のひとつは、遺伝子工作した眼細胞の作製方法、さらに詳しくは生体内における遺伝子工作した眼細胞の作製方法を提供することである。発明の要約本発明は、外来性タンパク質を産生するように、生体内眼細胞に遺伝子工作を行ないうることが確定されたことを基盤としている。本発明のひとつの態様においては、本発明は遺伝子工作した眼細胞の作製方法を提供する。該方法は、眼細胞内へ外来性核酸の取り込みを許容する条件下で、眼細胞を外来性核酸に接触させることを特徴とする。本発明の別の態様においては、本発明は外来性核酸を生体内眼細胞に導入する方法を提供する。該方法は、眼細胞内へ外来性核酸の取り込みを許容する条件下で、眼細胞を外来性核酸に接触させることを特徴とする。本発明の別の態様においては、本発明は、眼疾患の治療方法を提供する。該方法は、当該眼疾患に関連するタンパク質をコードする外来性核酸を生体内眼細胞に導入することを特徴とする。本発明のさらに別の態様においては、本発明は、眼疾患の治療方法を提供する。該方法は、当該眼疾患の治療に有用なタンパク質をコードする外来性核酸を生体内眼細胞に導入することを特徴とする。本発明のさらにまた別の態様においては、本発明は、外来性核酸を含む眼細胞を提供する。図面の簡単な説明図１Ａおよび１Ｂは、角膜上皮細胞の凍結切片に組織化学的Ｘ−ｇａｌ染色を行ったものである。図１Ａの青いＸ−ｇａｌ染色は、実施例１に概略したような組織切除後に、β−ガラクトシダーゼマーカーが角膜表面の基底上皮細胞へ遺伝子輸送されていることを示す。図１Ｂはコントロールであり、染色されないことを示している。両切片は、エオシンで対比染色した。図２Ａおよび２Ｂは、角膜内皮細胞の凍結切片に組織化学的Ｘ−ｇａｌ染色を行ったものである。図２Ａの青いＸ−ｇａｌ染色は、β−ガラクトシダーゼマーカーが角膜表面の内皮細胞へ遺伝子輸送されていることを示す。図２Ｂはコントロールであり、染色されないことを示している。両切片は、エオシンで対比染色した。詳細な記載本発明は、眼細胞、特に生体内眼細胞へ外来性核酸を導入しうるという発見に基づいている。したがって、本発明は、遺伝子工作した生体内眼細胞の作製方法を提供する。本発明方法は、眼細胞内へ外来性核酸が取り込まれて該核酸が発現する条件下で、眼細胞を外来性核酸に接触させることを特徴とする。本明細書において、「生体内眼細胞」またはその文法的等価物とは、眼球に含まれた眼細胞、すなわちインビボの眼細胞を意味する。眼細胞としては、水晶体、角膜（内皮、支質および上皮角膜細胞）、虹彩、網膜、脈絡膜、強膜、毛様体、硝子体、眼血管系、シュレム管、眼筋細胞、視神経およびその他の感覚、運動および自律神経の細胞が挙げられる。本明細書において、「遺伝子工作した」とは、天然には通常見られない形体の細胞または組織を得るために外来性核酸を導入することなどの組換えＤＮＡ処置に付された細胞または組織を意味する。たとえば、該細胞は、外来性核酸を含む。一般に、外来性核酸は組換えＤＮＡ技術を用いて作製される。いったん遺伝子工作した細胞または組織を作製すると、該細胞または組織は、非組換え的、すなわち、宿主細胞のインビボ細胞機構を用いて複製しうるが、それらも本発明の目的のために遺伝子工作した細胞または組織とみなしてよいことが理解されよう。本明細書において、「核酸」またはその文法的等価物は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはリボおよびデオキシリボヌクレオチドの両方を含む分子を意味する。核酸には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびセンスおよびアンチセンス核酸を含むオリゴヌクレオチドが包含される。核酸は二本鎖、一本鎖であってよく、もしくは二本鎖または一本鎖配列の両方の部分を含んでいてもよい。本明細書において、「外来性核酸」または「組換え核酸」あるいはその文法的等価物は、通常、眼細胞において認知量または治療量で産生されないタンパク質をコードする核酸を意味する。したがって、外来性核酸とは、他の生物由来の異種核酸などの眼細胞のゲノムに通常は見られない核酸である。外来性核酸には、眼細胞のゲノムに通常見られるが、眼細胞において通常、認知量または治療量で発現しないタンパク質を発現させる形体である核酸も含まれる。たとえば、神経成長因子（ＮＧＦ）およびニューロトロフィン３（ＮＴ３）などのヒトニューロトロフィン類はヒト眼細胞のゲノム内にコードされるが、それらはヒト眼組織において通常、有意量または治療量では発現しない。したがって、あるヒト遺伝子は、それが該タンパク質のプロモーターを含むかまたは眼細胞内で該タンパク質の発現を増加させるなんらかの形体であるならば、ヒト眼細胞にとって外来性である。このように、遺伝子工作した眼細胞は、そのゲノム内に通常見られる遺伝子の余分のコピーを含んでいる。別法として、外来性核酸は、天然のタンパク質の変異体または突然変異体をコードしてもよい。いったん外来性核酸を作製し、宿主細胞または生物に再導入すると、該核酸は、非組換え的、すなわち、インビトロ処理操作よりもむしろ宿主細胞のインビボ細胞機構を用いて複製するが、しかし、組換え的に作製され、非組換え的に複製される、このような核酸も本発明の目的の外来性または組換え核酸とみなしてよいことが理解されよう。好ましい具体例では、外来性核酸は発現されるタンパク質をコードする。すなわち、それは眼疾患の治療に用いられるタンパク質である。別の具体例では、外来性核酸は、タンパク質の発現を阻害または調節するアンチセンス核酸である。この具体例では、外来性核酸は発現する必要がない。したがって、たとえば、眼腫瘍細胞が望ましくないタンパク質を発現する場合、本発明方法によって、アンチセンス核酸を増加させて望ましくないタンパク質の発現を調節する。同様に、タンパク質の突然変異体の発現によって、眼疾患が起こる場合もある。突然変異外来性遺伝子の発現レベルを低下させるためのアンチセンス核酸および遺伝子の正常なコピーをコードする核酸の両方を組み合わせることが可能である。別の具体例では、外来性核酸は、転写または翻訳調節タンパク質などの調節タンパク質をコードする。この具体例では、タンパク質それ自体は、眼疾患に直接影響を与えないが、その代わりに、眼疾患に影響を与える他のタンパク質の発現を増加あるいは減少させる。他の具体例では、外来性核酸は、単一のタンパク質をコードする。別の具体例では、外来性核酸は、１種以上のタンパク質をコードする。したがって、たとえば、眼疾患の治療に有用な数種のタンパク質を所望することができる；また、数種のタンパク質をコードする外来性核酸を用いて一度に数種の眼疾患を治療することができる。同様に、「外来性」または「組換えタンパク質」は、組換え技術を用いて（すなわち前述の外来性または組換え核酸の発現を介して）生産されたタンパク質である。組換えタンパク質は、少なくとも１個以上の特徴によって、天然のタンパク質と区別される。たとえば、組換えタンパク質は、タンパク質の発現を増加させるような誘発プロモーターまたは高発現プロモーターを使用するため、通常に見られる濃度よりも特に高濃度で生産される。したがって、たとえば、外来性タンパク質は、通常は眼組織において発現しないタンパク質である。別の表現をすると、エピトープタグの付加またはアミノ酸の置換、挿入および欠失などがあるので、該タンパク質は、天然には通常認められない形体である。好ましい具体例では、外来性核酸は、眼疾患の治療に有用なタンパク質をコードする。本明細書において、「眼疾患」とは、疾患または健康な動物にとって正常でない眼の病的コンディションを意味する。ひとつの具体例では、眼疾患は、遺伝子欠損によって引き起こされる。遺伝子が同定されている、このような眼疾患の例としては、常染色体性網膜色素変性症、常染色体性優性白点状網膜症、眼窩蝶形色素ジストロフィー、成人卵黄様斑点ジストロフィー、ノリエ病、青錐体一色型色覚、先天性脈絡膜欠如および脳回転状萎縮症が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの疾患を遺伝子眼疾患ともいう。他の具体例では、眼疾患は、特定の既知の遺伝子型によって引き起こされない疾患である（将来的には、その遺伝成分は明らかにされるであろうが）。このような眼疾患としては、年齢関連性黄斑変性は、網膜芽腫、前部および後部ブドウ膜炎、網膜脈管疾患、白内障、角膜ジストロフィーなどの遺伝性角膜欠損、網膜剥離および変性ならびに虹彩萎縮が、および糖尿病性網膜症などの緑内障および糖尿病に追随する網膜疾患が挙げられる。さらに、遺伝的根拠はないけれども、眼疾患または機能不全を引き起こすようなコンディションも、眼疾患に含まれる。このようなコンディションとしては、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染、アレルギー性結膜炎ならびにその他の眼のアレルギー性応答、ドライアイ、リソソーム貯蔵疾患、グリコーゲン貯蔵疾患、コラーゲン障害、ムコ多糖類ならびにプロテオグリカン障害、スフィンゴリピドーシス、ムコリピドーシス、アミノ酸代謝障害、内分泌性眼疾患、前部および後部角膜ジストロフィー、網膜光受容体障害、角膜潰瘍および外科手術後の創傷などのその他の眼の創傷が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本明細書において、「外来性核酸の取り込みを許容する条件」とは、生体内眼細胞に外来性核酸を取り込ませ、発現させる経験に基づいた条件を意味する。該許容条件は、外来性核酸の形体に依存する。したがって、たとえば、外来性核酸がアデノウイルス、レトロウイルスあるいはアデノ随伴ウイルスベクターの形体である場合、許容条件とは細胞がウイルス感染しうる条件である。同様に、外来性核酸がプラスミドの形体である場合、許容条件とはプラスミドが細胞内にはいりうる条件である。このように、外来性核酸の形体とその取り込みを許容する条件との間には、相互関係がある。これらの条件は、一般に当業界において公知である。好ましい具体例では、核酸は、発現されるタンパク質をコードする。ある具体例では、外来性核酸の発現は、一時的である；すなわち、外来性タンパク質が発現する時間が限定されている。他の具体例では、発現は永続的である。したがって、たとえば、治療タンパク質が短期間で輸送されるべき場合、一時的発現系を用いる；たとえば、眼の外科手術あるいは創傷後は、そのような外来性タンパク質が望ましい。反対に、網膜色素変性症または緑内障などの進行性あるいは先天性のコンディションに対しては、永続的発現が望ましい。別の具体例では、外来性核酸は、標的細胞のゲノムに組み込まれる；たとえば、後記レトロウイルスベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。一般に、比較的長期または永続的な発現が望まれる場合、これを行う。他の具体例では、外来性核酸は、標的細胞のゲノム内に組み込まれない、というよりむしろ自律的に細胞内に存在する。一時的発現が望まれる場合、この具体例が好ましい。許容条件は、使用される発現ベクター、望まれる発現量および標的細胞によって変わる。一般に、インビトロでの外来性細胞の取り込みを許容する条件が、インビボの眼細胞に対して使用される。眼の身体的構造的特徴が考慮される場合もある。たとえば、標的細胞が角膜内皮細胞である場合、許容条件には、内皮基底層まで角膜表面を露出させるために、組織切除または角膜内皮の削除が含まれる。その後、後のような種々の方法で外来性核酸を加える。当業界で公知の技術を用いて許容条件を分析する。たとえば、ノーザンハイブリッド形成法を用いてｍＲＮＡの存在を検出するか、または抗体あるいは生物学的機能アッセイを用いてタンパク質の存在を検出することによって、外来性核酸の発現をアッセイする。外来性核酸の取り込みのための特定の条件は、当業界で公知である。その条件としては、レトロウイルス感染、アデノウイルス感染、プラスミドによる形質転換、外来性核酸を含むリポソームによる形質転換、バイオリスティック(biolist ic)核酸輸送［すなわち、金または他の金属粒子を核酸で被覆したものを細胞に注入（shootingまたはinjecting）する］、アデノ随伴ウイルス感染およびエプスタイン・バーンウイルス感染が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらはすべて本発明の目的のための「発現ベクター」とみなすことができる。発現ベクターは、染色体外ベクターあるいは前述したような宿主のゲノムに組み込まれているベクターのいずれであってもよい。一般に、これらの発現ベクターには、外来性核酸に作動可能状態で結合した転写および翻訳調節核酸が含まれる。ここで、「作動可能状態で結合」とは、転写および翻訳調節ＤＮＡが、転写が開始される仕方で外来性タンパク質のコーディング配列に関連する位置に存在することを意味する。一般に、このことは、プロモーターおよび転写開始配列が、外来性タンパク質コーディング領域の５'末端に位置することを意味する。外来性タンパク質を発現するのに用いる眼の宿主細胞には、一般に、転写および翻訳調節核酸が適している；たとえば、哺乳類およびヒトにおいて外来性タンパク質を発現するのに用いるのは、哺乳類細胞由来、特にヒト由来の転写および翻訳調節核酸配列が好ましい。眼細胞の転写および翻訳調節配列が好ましい。数多くのタイプの適当な発現ベクターおよび適当な調節配列が当業界では公知である。一般に、転写および翻訳調節配列としては、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましい具体例では、調節配列は、プロモーターならびに転写開始および停止配列である。プロモーター配列は、構成または誘導プロモーターのいずれかをコードする。プロモーターは、天然のプロモーターまたはハイブリッドプロモーターのいずれであってもよい。１種以上のプロモーターの要素を組み合わせたハイブリッドプロモーターもまた当業界で公知であり、本発明に有用である。さらに、発現ベクターも付加的要素を含むことができる。たとえば、発現ベクターを組込むためには、発現ベクターは少なくとも１個の宿主細胞ゲノムと相同な配列を含んでおり、発現構築物に隣接する２個の相同配列を含んでいるのが好ましい。ベクターに封入するのに適した相同配列を選択することによって、該組込み発現ベクターを、宿主細胞の特定の遺伝子座に直接結合することができる。ベクターを組み込むための構築物は、当業界において公知である。適当なレトロウイルスベクターとしては、ＬＮＬ６、ＬＸＳＮおよびＬＮＣＸが挙げられる。適当なアデノウイルスベクターは、たとえばＥ１領域などのウイルスがインビボで複製するのに必要な遺伝子要素が除去されているＡｄ２またはＡｄ５などのヒトアデノウイルスを修飾したもの、およびアデノウイルスゲノムに挿入された対象の外来性遺伝子をコードする発現カセットを含む（たとえば、Ａｄ_GvＣＦＴＲ₁₀）。本明細書において、「眼疾患関連タンパク質」とは、遺伝眼疾患の源として同定された遺伝子によってコードされるタンパク質を意味する。したがって、それらの遺伝成分が同定されている眼疾患、たとえば網膜色素変性症では、関連タンパク質はロドプシンである。このように、関連タンパク質が無いか有るかは、遺伝眼疾患の結果あるいは原因のいずれかである。本明細書において、「眼疾患の治療に有用なタンパク質」とは、眼疾患の症状を緩和するのに効果のあるタンパク質を意味する。眼疾患には、遺伝子が関連するものと遺伝成分をもたないものがある。したがって、たとえば、眼の創傷、アレルギー、ウイルス感染、潰瘍などは、有用なタンパク質で治療することができる。たとえば、ｇＤは、単純ヘルペスウイルス感染の治療に、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦＢ）は角膜内皮創傷に、抗ＩｇＥ抗体は眼のアレルギーに、および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）は網膜変性症に有用なタンパク質である。神経成長因子（ＮＧＦ）およびニューロトロフィン５（ＮＴ５）ならびにこれらの融合体および／または突然変異体は、網膜変性症の治療、網膜脈管疾患後のダメージの遅延化または予防、または網膜剥離あるいは緑内障の治療に有用である。これらの神経栄養因子は、視神経圧迫、外傷または脱髄の治療に用いることもできる。免疫抑制タンパク質は、角膜移植後の移植片拒絶反応の治療に用いる。脈管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニスト（抗体または小分子といったような）は、網膜および硝子体の新生血管疾患の治療に用いる。塩基性繊維芽細胞増殖因子は、ラットにおいて光受容体の寿命を長くすることが明らかにされている［ファクトロビッチらのNature 347:83-86(1990)］。ひとつの具体例では、外来性核酸を角膜上皮細胞に輸送する。角膜上皮細胞をそれぞれ損傷、アレルギー反応および感染に付す。その後、これらのコンディションおよびその他のコンディションの治療に有用なタンパク質を本発明方法にしたがって輸送する。別の具体例では、外来性核酸を角膜内皮細胞に輸送する。角膜内皮細胞の機能不全は失明を引き起こすので、これは特に重要である。この層はしばしば白内症の水晶体摘出術中に損傷を受ける（この手術は、米国において最も一般的な外科手術である）。さらに、角膜内皮細胞は再生できないので（細胞分裂が起こらないので）、角膜内皮細胞の分裂または再生を引き起こすタンパク質の発現は、角膜内皮損傷の重要な治療となりうる。別の具体例では、外来性核酸を角膜周辺部下の小柱網の細胞に導入する。小柱網は眼の前眼房からの流出管であり、眼房水（眼房を充填している液体）を眼から排液する。緑内障は眼内圧を増加させ、米国における失明の一般的な原因となっているので、この処置は重要である。したがって、本発明方法は、眼房水の流出の調節および緑内障の治療に有用である。また別の具体例では、外来性核酸を眼の脈絡膜層の細胞に導入する。眼の脈絡膜層は、網膜に血液を供給する器官であり、したがって、網膜にタンパク質を供給する。たとえば、本発明方法にしたがってＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）を輸送して網膜変性症を治療する。また別の具体例では、外来性核酸を網膜、強膜または毛様体の細胞に導入する。この処置は、たとえば、緑内障の治療または予防において水性液の産生をコントロールするために行う。同様に、さらに他の具体例では、外来性核酸を網膜血管系あるいは眼血管系の細胞、硝子体の細胞または水晶体の細胞（たとえば水晶体上皮細胞など）に導入する。本明細書において、「動物」には、ヒトおよび他の動物ならびに生物が包含される。したがって、本発明方法は、ヒトの療法および家畜病治療の両方に適用しうる。たとえば、適用される家畜としては、イヌ、ウシ、ネコ、ブタ、ウマおよびヒツジ、ならびに爬虫類、鳥、ウサギ、およびラット，ネズミ，モルモットやハムスターなどの齧歯類などのペット化動物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。動物園の動物などのペットではない有価動物もまた治療することができる。好ましい具体例では、動物は哺乳類であり、最も好ましい具体例では、動物はヒトである。さらに、本発明方法は、眼疾患動物モデルの作製においても有用である。すなわち、遺伝子の突然変異したコピーを動物に導入して薬物スクリーニングおよび薬物療法のためのモデルを作製することができる。たとえば、突然変異が眼疾患を引き起こすか、または眼疾患においてひとつの役割を演じることがわかっている遺伝子を、齧歯類およびウサギなどの動物に導入して眼疾患を得る。たとえば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を眼内マクロファージにて発現させて網膜変性症モデルを作製する。同様に、Ｓ−抗原を眼にて発現させてブドウ膜炎モデルを作製することができる。次に記載する実施例により上記本発明方法をさらに詳しく説明し、本発明の種々の態様を実行するための最良の型式を記載する。これらの実施例によって本発明の真の範囲が制限されるものではなく、むしろ説明の目的のみで提示されていることを理解すべきである。引用した文献は本発明の参考文献であることを明示する。実施例実施例１角膜上皮細胞への外来性核酸の輸送まず、ＣＭＶ／βガラクトシダーゼ発現カセットに隣接したアデノウイルスＤＮＡ配列を有するシャトルプラスミドを作成することによってβ−ガラクトシダーゼ発現組換えアデノウイルスベクターを構築するが、ＤＮＡ欠失変異株アデノウイルスｄ１３２４を２９３細胞に共トランスフェクトさせる場合は、相同組換えイベントによって、β−ガラクトシダーゼ発現カセットがウイルスのＥ１領域に設置される。したがって、得られるＥ１−欠失組換えウイルスは、２９３細胞以外のすべての細胞において、複製不能であり、大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現する。この遺伝子産物を、その酵素機能についてアッセイするか、または該酵素をＸ−ｇａｌ基質に接触させた結果、マーカー遺伝子を発現する細胞が特徴的に青く染色されることによる組織化学的アッセイを行う。組換え複製不能ウイルスベクターを、ヒト胎児腎細胞系である２９３細胞内で生産し、該細胞はＥ１タンパク質をトランスで発現する。１×１０⁹ｐｆｕ／ｍｌのウイルスベクター調製品２０μを、平衡緩衝塩類液［１０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１ｍＭＭｇＣｌ₂、１０％グリセロール］中、麻酔したスプラーグ−ダウリーラットの無傷の角膜上皮細胞に局所的に適用する。ウイルス溶液を３０分間そのままにしておき、次いで溶液を除去し、眼の表面を保護用水性軟膏（ラグビー・アーティフィシャル・ティアーズ：白色ワセリン、鉱物油および無水ラノリン）で覆う。動物を回復させ、次いで２４時間後に屠殺する。ＴｉｓｓｕｅＴｅｋ中で眼を凍結し、厚さ７μmの組織切片を切り出し、β−ガラクトシダーゼの発現を検出するために、該切片を組織化学的に染色する。コントロール動物にはビヒクルのみを局所適用し、同じ処理で眼を加工する。試験動物もコントロール動物も、角膜上皮細胞においてβ−ガラクトシダーゼを発現しない。角膜の上皮細胞は、層状・ウロコ状の上皮細胞である。再外部の細胞は薙ぎ倒され、表面から規則正しく生理的にはがれていくが、同時にその下の不完全分化細胞から更新される。我々は、おそらく、我々が遺伝子移動を達成した角膜上皮細胞、すなわち外部上皮細胞構造が、遺伝子輸送後２４時間経過してから検査をおこなったために、経時変化によって脱落したからであると推論する。我々は、局所遺伝子輸送処理を行う前に角膜上皮細胞の再外部層を外科的に除去することによって、より深い、より長命の細胞への遺伝子輸送が達成され、次いで輸送された遺伝子が発現し、インビボにおいて長期間生存しうると推論する。このような表面上皮細胞の外科的除去は「組織切除」と称され、角膜潰瘍化を含めた多くの角膜上皮疾患状態の治療の際に行われる。したがって、我々は、表面上皮細胞の組織切除後のラットの角膜上皮細胞の回復速度を測定するための実験を行った。麻酔したラットの角膜上皮細胞を外科用メスの刃で再生可能な状態で削り取る。次いで、上皮の修復を確認するために、５分、１時間、１６時間および２日の間隔で眼を組織学的に検査する。外科処置後、手術をしていない眼と表面上皮細胞を除去された眼の間に、１６時間以内に差異を目視することは不可能であることがわかった。したがって、２番目の実験として、削り取り処置によって表面角膜上皮細胞の組織切除を行った後すぐに、１×１０⁹ｐｆｕ／ｍｌの組換えアデノウイルス２０μｌを角膜表面に適用し、３０分間放置する。次いで、前述のように、２４時間後に動物を屠殺する。図１Ａおよび１Ｂに示されるように、これらの眼の切片の組織化学的染色から、アデノウイルスベクターの局所適用を受けた動物の角膜上皮細胞においては大量にβ−ガラクトシダーゼマーカー遺伝子が発現しているが、コントロール動物においては発現がないことがわかる。実施例２角膜内皮細胞への外来性核酸の輸送３０ｇニードルとハミルトンシリンジを用い、麻酔したラットの前眼房から眼房水２０μｌを抜き取る。β−ガラクトシダーゼマーカー遺伝子を輸送する、前述の１×１０⁹ｐｆｕ／ｍｌの複製不能組換えアデノウイルスベクターの溶液２０μｌを、抜き取った液体の代わりに加える。コントロールラットはビヒクルのみで同様に処理する。２４時間後に動物を屠殺し、眼をＴｉｓｓｕｅＴｅｋで凍結し、切片を作成し、β−ガラクトシダーゼ検出用に染色する。図２Ａおよび２Ｂに示されるように、ウイルスベクターを処置された動物の角膜後部表面細胞（角膜内皮細胞）では、その大部分がくっきりと染色されているが、ビヒクルのみで処理された動物では染色がみられない。さらに、ベクター処置動物の毛様体上皮細胞も染色される。実施例３脈絡膜細胞への外来性核酸の輸送１×１０⁹ｐｆｕ／ｍｌのβ−ガラクトシダーゼ発現組換えアデノウイルスベクターの溶液５μｌを、麻酔したラットの眼の硝子体液（後部）に注射する。コントロールラットはビヒクルのみで同様に処理する。２４時間後に動物を屠殺し、眼をＴｉｓｓｕｅＴｅｋで凍結し、切片を作成し、β−ガラクトシダーゼ検出用に染色する。ウイルスベクターを処置された動物の脈絡膜（眼の後部を取り巻く血管の被膜である）の細胞のいくらかは、くっきりと染色される。しかし、ビヒクルのみで処理された動物では染色されない。

Claims

【特許請求の範囲】１．遺伝子工作した生体内眼細胞の作製方法であって、外来性核酸を発現させための眼細胞内へ該核酸の取り込みを許容する条件下で、眼細胞を外来性核酸に接触させることを特徴とする方法。２．外来性核酸がレトロウイルスの形体である請求項１に記載の方法。３．外来性核酸がアデノウイルスの形体である請求項１に記載の方法。４．外来性核酸がプラスミドの形体である請求項１に記載の方法。５．外来性核酸がアデノ随伴ウイルスの形体である請求項１に記載の方法。６．眼疾患に関連するタンパク質をコードする外来性核酸を、眼細胞内へ該核酸の取り込みを許容する条件下で、生体内眼細胞に導入することを特徴とする眼疾患の治療方法。７．眼疾患の治療に有用なタンパク質をコードする外来性核酸を、眼細胞内へ該核酸の取り込みを許容する条件下で、生体内眼細胞に導入することを特徴とする眼疾患の治療方法。８．外来性核酸を含む眼細胞。９．細胞が角膜内皮細胞である請求項６または７に記載の方法。１０．細胞が角膜上皮細胞である請求項６または７に記載の方法。１１．細胞が脈絡膜細胞である請求項６または７に記載の方法。１２．外来性核酸を導入する前に、細胞の組織切除をおこなう請求項１０に記載の方法。