JPH10508302A

JPH10508302A - 細胞特異的遺伝子供給ビヒクル

Info

Publication number: JPH10508302A
Application number: JP8513500A
Authority: JP
Inventors: エフ．カエム，ジョン; ジェイ．メーデ，トーマス; イー．フラサー，スコット
Original assignee: カリフォルニアインスティテュートオブテクノロジー
Priority date: 1994-10-12
Filing date: 1995-10-11
Publication date: 1998-08-18
Also published as: CA2202478A1; US6232295B1; EP0788374A2; AU690396B2; WO1996011712A3; WO1996011712A2; NZ296823A; AU4153596A

Abstract

(57)【要約】標的化細胞と特異的に結合してその中に取り込まれ、多数の生理学的作用物質、特に細胞の磁気共鳴映像（ＭＲＩ）のための常磁性イオンを供給し得る供給ビヒクルを記載する。本供給ビヒクルは、正味陽電荷を有し、正味陰電荷を有する別の高分子と錯体を形成する高分子を包含する。細胞ターゲッティング部分及び造影剤及び治療薬を含めた生理学的作用物質を一方又は両方の高分子と結合させる。一実施態様では、正味陰電荷を有する高分子は核酸である。したがって、供給ビヒクルは、遺伝子療法用の核酸及びＭＲＩコントラスト用の作用物質を特定の細胞に同時輸送する臨床プロトコールに用い得て、核酸供給の医学的映像モニタリングを可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】細胞特異的遺伝子供給ビヒクル本出願は、1994年10月12日提出のU.S.S.N.08/321,552の一部継続出願である。発明の背景磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）は、非侵襲性であり且つ被験者の正確な容積表現をもたらすため、近年、臨床的舞台装置の強力な道具として出現した。画像は、典型的核磁気共鳴（ＮＭＲ）実験における場合と同様に、高周波パルスで核スピンを励起しながら、検体に１つ又はそれ以上の直交する磁場勾配を課することにより作られる。種々の勾配場に関するデータの収集後、デコンボリューションにより検体の１、２又は３次元画像が得られる。典型的には、画像は既定容積素子のシグナル強度が水濃度及び緩和時間（Ｔ₁及びＴ₂）の関数である水の陽子からのＮＭＲシグナルに基づいている。これら３つのパラメーターの局部変動がＭＲ画像で観察される鮮明なコントラストを提供する。例えば、骨の含水量が低いと、それは明瞭に暗くなり、一方凝固血液のＴ₂時間が短いとそれは非凝固血液からのものよりシグナル強度が高くなる。ＭＲＩを医学的映像法において選ばれる技術にしたのと同じ利点が、それを生物学的実験に用いるための理想的映像手段にする。染料又は蛍光色素の使用を基礎にした光学顕微鏡映像技術とは異なり、ＭＲＩは有毒な光漂白副産物を生成しない。さらに、光学顕微鏡とは異なって、ＭＲＩはおよそ100 μに過ぎない表面内の細胞に対する光散乱又はその他の光学的収差に限定されない。ＭＲＩは、最初は純粋に非侵襲性のアプローチを考察されたが、しかし最近では、造影剤が本技法の診断的効用を有意に改良し得ることが判明した。ＭＲＩ造影剤は、周囲の水中での陽子の緩和時間を劇的に低減する。イオンＧｄ³⁺は、その大きな双極子及び緩和時間に及ぼす大きな作用のために、その非毒性キレート化形態で、もっとも一般的に用いられる常磁性イオンである。例えば、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）でキレート化されるＧｄ³⁺は、診断的放射線医学で現在広範に用いられている血管造影剤である。ＤＴＰＡの化学構造を図４に示す。伝統的ＭＲＩは迅速な非侵襲性手法での高立体分解能及び多面映像を提供する。ＭＲＩ造影剤を診断的に用いると、それらは血管で還流されて血管のコントラストを増強し、器官の病変及び浸潤を報告する。しかしながら、診断的放射線医学のための特定の組織の標識は、ＭＲＩに関しては依然として困難な挑戦である。既存の免疫学的技法の修正による細胞及び組織特異的ＭＲＩ造影剤開発の努力は、診断的放射線医学に多くの研究が集中した。例えば、常磁性イオン、一般にガドリニウムキレートＧｄ−ＤＴＰＡで標識された抗体が生成され、腫瘍及びその他の組織のＭＲＩコントラストに及ぼすその作用に関して試験された（Lex，A cta Biochim．Biophys．Hung．24:265-281(1989); 米国特許第 5,059,415号）。分子タンブリング率の低減のために、Ｇｄ−ＤＴＰＡは、抗体と結合すると、非結合Ｇｄ−ＤＴＰＡよりも有意に高い緩和度（ＭＲＩコントラスト増強の測定値）を示すと予測された。Ｇｄ当たりの緩和度のこの増大は、期待されていたが、タンパク質１分子当たり10〜50個のＧｄイオンで標識された抗体を用いて観察さるべき組織コントラストに十分なシグナルを発生する。残念ながら、抗体と結合したＧｄの緩和度は非結合Ｇｄ−ＤＴＰＡの場合よりわずかに良好であるに過ぎないことが判明している（Paajanen et al.，Magn．Reson．Med．13:38-43(1990)）。したがって、抗体標識化組織における検出可能なコントラスト増強を生じるためには、免疫学的試薬を、抗体１個当たり1000個でないとしても100 個のＧｄイオンと結合させねばならない。一般に、これは標準的技法の使用では到達し難い。抗体当たりのＧｄイオンの数はポリリシンを抗体と結合させ、次いでポリリシンをＧｄ−ＤＴＰＡで広範に標識することにより増大し得るという可能性を、数名の研究者が試験している（WO 93/01837）。今までのところ、これらの試みは、抗体に大きなポリマーを結合させることの望ましくないイオン的及び立体化学的作用のために、部分的に限定された成功を示しただけである。したがって、標的化ＭＲＩ造影剤の分野の研究は、高シグナル強度Ｔ₂造影剤として酸化鉄粒子の使用に転向した（Shen et al.，Magnet．Res．Med．29:599- 604(1993); Weissleder et al.，Magnetic Resonance Quarterly，8:55-63(1992 )）。しかしながら、酸化鉄粒子はまだヒトでの使用は認可されていない。造影剤の担体としてのリポソームは、同様に組織特異的ＭＲＩ剤として見込みがあることを示した（Schwendener，R．A.,Chimia 46:69-77(1992)）。２種類のこのような造影剤が開発された：即ち（ｉ）リン脂質二層間に閉じ込められた水溶性造影剤、及び（ｉｉ）Ｇｄ−ＤＴＰＡのようなＭＲＩ造影剤と共有結合する両親媒性分子を直接取り込むリポソーム。前者の種類のリポソーム造影剤はin v ivo で水溶性剤の漏出を蒙り、後者は肝臓及び脾臓における造影剤の長期停滞を蒙る。さらに、ポリリシンを用いた核酸の供給を多数の研究者が調査した。例えばトランスフェリン（Wagner et al.，Proc．Natl．Acad. Sci．USA 87:3410-3414(1991)）及びアシアロ糖タンパク質（Wu et al.，J．Bi ol．Chem．266:14338-14342(1991)）のような細胞表面受容体に関する配位子と結合するポリリシンは、ＤＮＡの受容体媒介性取込みを促進する。中性pHでのリシン側鎖の−ＮＨ³⁺基は、ＤＮＡの負に荷電したリン酸塩主鎖とキレート環を作るのに用いられる。多価陰イオン性ＤＮＡ及び多価陽イオン性ポリリシン−タンパク質共役体の電気的中性錯体は、相対的に高効率で特定の細胞中にＤＮＡを供給し得るドーナツ型粒子であると考えられるものを形成する（Wagner et al.，P roc．Natl．Acad．Sci．USA 88:4225-4259(1991)）。この技術に対する改良としてはトランスフェクション効率及びアデノウイルス粒子による同時トランスフェクション（Wagner et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:6099-6103(1992)）、又はfusogenic ペプチドのポリリシンとの共役結合（Wagner et al.，Proc．N atl．Acad．Sci．USA 89:7934-7938(1992)）、又はクロロキンの存在下でのトランスフェクション（Wagner et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:3410-3414 (1991)）を増大するための疎水性多価陽イオンとの錯体形成が挙げられるが、すべてＤＮＡのエンドソーム性分解を低減するためである。リソソーム性分解経路からの脱出を促すこれらの粒子の修飾が遺伝子発現を増大することが注目された（Wagner et al.，PNAS 89:7934-7938(1992)）。発明の要約前述に基づいて、生理学的作用物質の細胞及び組織特異的供給の改良の必要性が存在することは明らかである。したがって、組織特異性を失わずに多数の生理学的作用物質を結合し得る組織特異的供給ビヒクルを提供することが本発明の目的である。本発明のさらなる目的は、遺伝子供給及び治療に有用な供給ビヒクルを提供するために組織特異的細胞ターゲッティング部分及び核酸と結合する造影剤を包含する新規の供給ビヒクルを提供することである。このような遺伝子供給は、造影剤の存在又は非存在によりモニタリングし得る。さらに別の目的は、癌の治療に有用な供給ビヒクルを提供するために組織特異的細胞ターゲッティング部分及び治療約を包含する新規の供給ビヒクルを提供することである。本発明のこれらのそして他の目的及び特徴は、以下の詳細な説明及び添付の請求の範囲から当業者には明らかになる。本目的は、細胞特異的供給ビヒクル及びこのような供給ビヒクルが少なくとも映像造影剤をターゲッティング細胞又は組織に供給し得る方法により達成される。いくつかの実施態様では、供給ビヒクルは付加的特異的分子（例えば核酸）を供給するために構築される。本発明の一態様では、ａ）正味陽又は陰電荷を有する一次高分子、ｂ）一次高分子と反対の正味電荷を有し、一次高分子とキレート環を形成するする少なくとも１つの二次高分子であって、少なくとも１つの細胞ターゲッティング部分でそれに結合した二次高分子、及びｃ）一次又は二次高分子（図１Ａ及び１Ｂ参照）と、又は三次高分子（図１Ｃ参照）と結合し、三次高分子が、存在する場合には、一次高分子と反対の正味電荷を有し、一次高分子とキレート環を作る少なくとも１つの生理学的作用物質を包含する供給ビヒクルが提供される。もう一つの実施態様では、高分子の１つがポリアミンを包含する１つ又はそれ以上の高分子とキレート環を作る核酸を包含し、その結果生じる造影剤供給ビヒクルが細胞又は組織特異的に遺伝物質並びに生理学的作用物質を供給し得るようにする。さらに別の実施態様では、本発明は生理学的作用物質を細胞に供給する方法を提供する。本方法は、細胞を本発明の供給ビヒクルと接触させて、生理学的作用物質の存在を検出する工程から成る。図面の簡単な説明図１Ａは、正味陽電荷又は正味陰電荷を有する一次高分子（２）が一次高分子と反対の正味電荷を有する二次高分子（３）とキレート環を作る供給ビヒクル（１）を示す。少なくとも１つの細胞ターゲッティング部分（４）及び少なくとも１つの造影剤（５）が二次高分子と結合する。図１Ｂは、正味陽電荷又は陰電荷を有する一次高分子（２）が一次高分子と反対の正味電荷を有する二次高分子（２）とキレート環を作る供給ビヒクル（１）を示す。少なくとも１つの細胞ターゲッティング部分（３）が二次高分子と結合し、少なくとも１つの造影剤（４）が一次高分子と結合する。図１Ｃは、正味陽電荷又は正味陰電荷を有する一次高分子（２）が一次高分子と反対の正味電荷を有する二次高分子（３）とキレート環を作る供給ビヒクル（１）を示す。一次高分子と反対の電荷を有する三次高分子（６）は一次高分子とキレート環を作る。少なくとも１つの細胞ターゲッティング部分（４）は一次高分子と結合し、少なくとも１つのＭＲＩ造影剤（５）が三次高分子と結合する。図２は、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ポリ−Ｄ−リシンとキレート環を作るＤＮＡでトランスフェクトされた細胞の遺伝子発現のレベル（カラム１）をＧｄ−ＤＴＰＡ− ポリ−Ｄ−リシン成分を欠いた粒子でトランスフェクトした細胞（カラム２）とを比較する。カラム３では、遊離トランスフェリンを溶液に付加して遺伝子供給ビヒクルの取込みを競合的に阻害した（Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ポリ−Ｄ−リシンを含有する場合と欠いた場合の両方で）。すべての場合、ＤＮＡ 6μgはトランスフェリン（Ｔｆ）3 μg 及びＧｄ−ＤＴＰＡ修飾ポリ−Ｄ−リシン又は非修飾ポリ −Ｌ−リシン（ＰＬＬ） 4μg とキレート環を作った。誤差バーは１標準偏差を示す（ｎ−５）。図３は、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ポリ−Ｄ−リシンを含有する遺伝子供給ビヒクルでトランスフェクトされた細胞から得られるＭＲＩ画像（１及び２）とＧｄ−ＤＴＰＡ−ポリ−Ｄ−リシンを欠いたもの（３及び４）とを比較する。１においては、Ｇｄコントラスト増強を示す強いシグナルに注目。２及び４では、遊離トランスフェリンを付加して、粒子の取込みを競合的に阻害した。すべての場合、ＤＮＡ 12 μg はトランスフェリンポリリシン 6μg 及びＧｄ−ＤＴＰＡ修飾ポリ− Ｄ−リシン又は非修飾ポリ−Ｌ−リシン 14 μg とキレート環を作った。図４は、Ｇｄキレート化剤、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、並びに１，４，７，１０−テトラアザシクロ−ドデカン−Ｎ，Ｎ’−Ｎ”−Ｎ”’− 三酢酸（ＤＯＴＡ）及びｐ−アミノベンジル−ＤＯＴＡを示す。本発明の詳細な説明本発明の前には、細胞表面受容体を用いて特定の細胞又は組織に生理学的作用物質を標的化供給するための安全且つ有効な手段はなかった。本発明は、細胞への造影剤及び治療薬を含めた生理学的作用物質の供給のための供給ビヒクル及び方法を提供する。供給ビヒクルは、２個又はそれ以上の高分子細胞ターゲッティング部分及び生理学的作用物質を包含する。したがって、供給ビヒクルは使用するターゲッティング部分によってある種の細胞を標的にして、次いで、一般的には標的細胞に取り込まれる。したがって、生理学的作用物質は特定の種類の細胞を標的にする。本発明の供給ビヒクルは、一次高分子及び二次高分子を包含する。図１Ａに示すように、供給ビヒクル（１）は全体的に正味陽電荷又は陰電荷を有する一次高分子（２）を包含し、これを、反対に荷電した二次高分子（３）とキレート環を作る足場として用いる。図１Ｂに示すように、いくつかの供給ビヒクルは、一次高分子と反対の正味電荷を有し、一次高分子とキレート環を作る三次高分子（６）を包含する。好ましくは、一次及び二次高分子は静電相互作用により一緒に保持され、したがって互いに共有結合する必要がない。ある実施態様では、一次及び二次高分子はともに荷電基の混合物を含有し、したがって両性イオン性である。図１に線状高分子を示したのは目的を説明するためであって、必ずしも線状である必要はなく、プラスミドのような環状高分子を用いてもよい。供給ビヒクルは細胞取込みに適したあらゆる立体配置を取る。好ましい実施態様では、一次高分子は多価陰イオン性である（即ち、正味陰電荷を有するポリマー）。この実施態様においては、多価陰イオンは、ヘパリン、ポリガラクツロン酸、ムチン、核酸及び修飾リボース−リン酸塩主鎖を含むそれらの類似体、ポリペプチドポリグルタメート及びポリアスパルテート、並びに合成ポリマーのカルボン酸、リン酸及びスルホン酸誘導体を基礎にした分子を包含する。好ましい多価陰イオンは核酸である。本明細書中で用いる場合、「核酸」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡ、あるいはデオキシ及びリボヌクレオチドを含有する分子を指す。核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びセンス及びアンチセンス核酸を含めたオリゴヌクレオチドを含む。核酸の定義に特に含まれるものは、アンチセンス核酸である。アンチセンス核酸は核酸の非コード鎖とハイブリダイズするが、しかしリボヌクレオチド並びにデオキシリボヌクレオチドを含有し得る。一般に、アンチセンス核酸は遺伝子発現又はｍＲＮＡの翻訳を妨げるよう機能する。核酸は二本鎖又は一本鎖であり、あるいは二本鎖又は一本鎖配列の一部を含有する。好ましい実施態様では、核酸は二本鎖であり、最も好ましくは二本鎖プラスミドである。ＲＮＡまたはＤＮＡを一次高分子として用いる場合、核酸は付加的機能として役立つ。一実施態様では、核酸は、供給ビヒクルがレポーター遺伝子及び／又は遺伝子にコードされるタンパク質の存在又は非存在により付加的にモニタリングされ得るように、レポーター遺伝子をコードする。例えば、実施例に示すように、ルシフェラーゼをコードするレポーター遺伝子を用い得る。さらに、選択可能なマーカーをコードするＤＮＡ又はＲＮＡ配列を同様に供給して、組織又は細胞移植前にin vitroでトランスフェクト化細胞を選択する手段を提供し得る（Dema galhaessilverman et al.，"Bone-Marrow Transplantation- A Review" Cell T ransplantation ２:75-98(1993)）。好ましい実施態様では、本発明の供給ビヒクルは細胞への遺伝物質の供給の付加的機能を実行し得る。それゆえ、この実施態様は、遺伝子療法用の核酸及びＭＲＩコントラスト用の作用物質が特定細胞（例えば新形成腫瘍の細胞）に同時輸送されて、リアルタイムに核酸供給及び治療の医学的映像モニタリングを可能にするる新規の臨床プロトコールを包含する。好ましい実施態様では、核酸は一種の治療薬として用いられる。例えば、本発明の臨床的使用は、リンフォカイン、成長ホルモン、外生的抗原、ウイルス酵素（感受性遺伝子）及び遺伝的調節因子等に関する遺伝子のような遺伝子療法のための核酸に関連する。遺伝子療法の臨床的可能性を開示する多数の参考文献が利用可能である（例えば、Gutierrez et al.，"Gene-Therapy for Cancer" Lancet 339 :715-721(1992); Zatloukal et al.，"Somatic Gene-Therapy for Cancer - The Utility of Transferrinfection in Generating Tumor Vaccines ：Gene 135 :199-207(1993)" ）。特に、核酸は、中でもとりわけ嚢胞性繊維症及び鎌状赤血球貧血のような突然変異によって引き起こされる遺伝病に関する野性型遺伝子を包含する。好ましい実施態様では、核酸は、適切な条件下で遺伝子を含有する細胞を殺し得る物質をコードする遺伝子を含有する。好ましい実施態様では、供給ビヒクルの核酸は、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子をコードする。この遺伝子を含有する細胞はガンシクロビルに感受性である；即ち、ガンシクロビルの存在下でＴＫを発現する細胞が殺される。したがって、好ましい実施態様では、造影剤を含有する供給ビヒクルは、本明細書中に略記したように、腫瘍細胞を標的とする。腫瘍のコントラストシグナルレベルが十分高い場合には、腫瘍細胞を殺すためにガンシクロビルが投与される。同様に、Ｇｐｔ遺伝子は細胞を６ −チオキサンチンに対して感受性にする。このアプローチのさらなる利点は、薬剤の取込み及び腫瘍の死亡を造影剤を用いてリアルタイムにモニタリングし得ることである。さらに別の実施態様では、核酸の治療的使用はアンチセンス核酸の使用に関する。当業界で公知のように、アンチセンス核酸を用いて特異的タンパク質をコードする遺伝子の発現を低減するかまたは排除する。いくつかの状況では、半減期が短いために、ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡを供給するのが望ましい。例えば、供給ビヒクルで細胞をトランスフェクトしてトランスフェクト化細胞を選択し得るが、又は、例えば一本鎖核酸中のレポーター遺伝子の存在に関して検定することによりそれらがトランスフェクトされたことをしめし得る。このような状況では、トランスフェクト化細胞はレポーター遺伝子を安定的に組み込めない。これは、組織移植及び幹細胞療法のような野性型細胞が望ましい状況で有益である。これらの場合、供給ビヒクルの有用性は造影剤で細胞を容易に標識し、最後に移植細胞の非侵襲性画像形成を可能にする能力にある。ＤＮＡ取込みが望ましくない場合は、ポリアスパルテート、ポリグルタメート、ヘパリン及び長鎖炭化水素のような他の多価陰イオンを用い得る。多価陰イオンは陽電荷ポリマー（多価陰イオン）がキレート環を作る陰電荷分子足場として作用する。したがって、多価陰イオン及び多価陽イオンは組合された場合に２つの高分子が生理学的条件下で多価錯体を形成するように十分な電荷を有する。一般に、高トランスフェクション効率を達成するには電気的中性が一般に必要であるため、錯体形成後、多価錯体は電気的にほぼ中性である（Wagner et al.,(1991)，上記参照）。以下で考察するように、細胞ターゲッティング部分及び生理学的作用物質によるポリマーの誘導化の長さ及び程度を変えて、電気的中性を達成し得る。好ましい多価陽イオンとしては、アシルアミド及び２−アシルアミド−２−メチルプロパントリメチルアミン、ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジン）又は同様の四級化ポリピリジン、ジエチルアミノエチルポリマー及びデキストラン共役体、ポリミキシンＢスルフェート、リポポリアミン、ポリ（アリルアミン）、例えば強多価陽イオンポリ（塩化ジメチルジアリルアンモニウム）、ポリエチレンイミン、ポリブレン、スペルミン、スペルミジン及びポリペプチド、例えばプロタミン、ヒストンポリペプチド、ポリリシン、ポリアルギニン及びポリオルニチンを基礎にした合成多価陽イオンが挙げられる。特に好ましい多価陽イオンは、ポリリシン及びスペルミジンで、前者が特に好ましい。ポリリシンの光学異性体の両方を用い得る。Ｄ異性体は細胞プロテアーゼに対する長期耐性を有するという利点を有する。Ｌ異性体は被験者からより迅速に除去されるという利点を有する。二次高分子としてポリリシンを用いる場合、高pHでのリシン側鎖の−ＮＨ₂基は活性化キレート化剤の多発性結合のための強力な求核試薬として役立つ。本発明は、ポリリシンのようなポリアミンの多価陽イオン性及び多価求核性の両方の利点を得る。高pHでは、平均で約5 〜20％のモノマー置換を生じる条件下で、リシンモノマーを生理学的作用物質と結合させる。生理学的pH〜低pHでは、残存する非標識化陽電荷リシンは核酸結合を促す。多価陰イオン及び多価陽イオンのサイズは、実質的に変化する。例えば、いくつかの核酸ベクターは100 キロ塩基の長さまで遺伝子を供給し得るし、人工染色体（メガベース）は酵母菌に供給されたということは公知である。したがって、多価陰イオンに対する一般的な大きさの限界はない。しかしながら、効率のよい受容体媒介性取込みのためには、核酸が少なくとも100 キロベース未満であって、約１〜約50キロベースが最も好ましい大きさで、約5 〜10キロベースが特に好ましい。核酸以外の多価陰イオンを用いる場合、ポリマーに関する好ましいサイズは約500 〜約50,000モノマー単位で、約5,000 〜約20,000が特に好ましい。一般的に、核酸複合体形成に関する多価陽イオンのサイズは、約500 モノマー残基未満である。ポリリシン及びポリアルギニンのようなポリアミノ酸を用いる場合、好ましいサイズは約10〜約200 残基である。好ましい実施態様では、供給ビヒクルは二次多価陽イオン分子とキレート環を作る一次多価陰イオン分子を包含する。下記の細胞ターゲッティング部分及び生理学的作用物質はいずれかの高分子と結合するが、しかし好ましい実施態様では、それらはいずれも多価陽イオンと結合する。別の実施態様では、それらはともに多価陰イオンと結合するか、あるいは細胞ターゲッティング部分が１つのポリマーに結合し、生理学的作用物質が他のポリマーに結合する（図１）。別の実施態様では、供給ビヒクルは一次高分子及び一次ポリマーと反対の正味電荷を有する２個又はそれ以上の二次高分子を包含する。即ち、図１に示すように、一次高分子と関連した多数の二次高分子を有し得る。好ましい実施態様では、一次高分子は多価陰イオン性であり、二次高分子は多価陽イオン性である。好ましい態様では、細胞ターゲッティング部分を二次高分子の１つに付加し、生理学的作用物質を別の二次高分子に付加するが、しかし各々の二次高分子は両方を含有し得る。上記のように、本発明の供給ビヒクルである高分子成分の他に、生理学的作用物質が高分子の１つと結合した。「生理学的作用物質」という用語は、本明細書中では、細胞特異的に供給するのに望ましい化合物を意味する。生理学的作用物質のこの定義には、造影剤及び治療薬がともに含まれる。本明細書中で用いる場合、「造影剤」という用語は、医学的画像形成に関して公知の種々の造影剤を含む。ＭＲＩに関しては、造影剤は常磁性又は超常磁性金属を包含し得る。本明細書中の「常磁性金属イオン」、「常磁性イオン」又は「金属イオン」とは、磁場にある程度比例して、磁場と平行に又は逆並行に磁化される金属イオンを意味する。一般に、これらは不対電子を有する金属イオンである。これは、当業界で理解される用語である。適切な常磁性金属イオンの例としては、ガドリニウムＩＩＩ（Ｇｄ⁺³又はＧｄ（ＩＩＩ））、鉄ＩＩＩ（Ｆｅ⁺³又はＦｅ（ＩＩＩ））、マンガンＩＩ（Ｍｎ⁺²又はＭｎ（ＩＩ））、イットリウムＩＩＩ（Ｙｔ⁺³又はＹｔ（ＩＩＩ））、ジスプロシウム（Ｄｙ⁺³又はＤｙ（ＩＩＩ））、クロム（Ｃｒ（ＩＩＩ）又はＣｒ⁺³）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施態様では、その高磁気モーメント（ｕ²＝63ＢＭ²）、対称電気基底状態（Ｓ^E）及びヒトにおける診断的使用に対するその今日の承認により、常磁性イオンはランタニド原子Ｇｄ（ＩＩＩ）である。Ｇｄ（ＩＩＩ）イオンは細胞に非常に有毒であり、したがってキレート化剤と結合させて、次にこれを高分子と結合させねばならない。ランタニド及び常磁性イオンをキレート環形成させるのに用いられる多数の公知の大環状キレート化剤又は配位子がある（例えば、Alexander，Chem ．Rev. 95:273-342(1995)及びJac kels, Pharm ．Med．Imag, Section III，Chap．20，p645(1990)参照。多数の大環状キレート化剤及びその合成を記載するこれらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる。）。同様に、本発明に用いるのに適切なキレート化剤を記載する多数の特許がある（例えば、米国特許第5,155,215 号、第5,087,440 号、第 5,219,553 号、第5,188,816 号、第4,885,363 号、第5,358,704 号、第5,262,53 2 号、並びにMeyeret al., Invest ．Radiol. 25:S53(1990)。これらすべての記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）。したがって、当業者に理解されるように、あらゆる公知の常磁性金属イオンキレート化剤又はランタニドキレート化剤を本発明に用い得る。金属イオンがＧｄ（ＩＩＩ）である場合、好ましいキレート化剤は、図４に示した１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン− Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−四酢酸（ＤＯＴＡ）である。別の実施態様において、金属イオンがＧｄ（ＩＩＩ）である場合、好ましいキレート化剤としてはジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）及び１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−テトラエチルリン（ＤＯＴＥＰ）が挙げられる。Ｇｄ（ＤＴＰＡ）^2-に関する安定定数（Ｋ）は非常に高く（lo g Ｋ＝22.4）、より一般的には生成定数として公知である。ＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ及びＤＯＴＥＰは、当業界で公知のように、置換される（例えば、米国特許第5, 262,632 号、第4,885,363 号及び第5,358,704 号参照）。他の常磁性イオンに対するキレート化剤も公知である（例えば、Lauffer et a l.，J. Am ．Chem．Soc. 109 :1622(1987); Lauffer，Chem ．Rev. 87:901-927 (1987); 並びに米国特許第4,885,363 号、第5,358,704 号及び第5,262,532 号参照。これらはすべて、Ｆｅ（ＩＩＩ）及びＭｎ（ＩＩ）に適したキレート化剤を記載する）。Ｙｔ（ＩＩＩ）イオンに適したキレート化剤としては、ＤＯＴＡ及びＤＰＴＡ並びにその誘導体(Moi et al.，J．Am ．Chem．Soc. 110 :6266-6267 (1988))、並びに中でも米国特許第4,885,363 号に記載されたキレート化剤が挙げられるが、これらに限定されない。従来技術の細胞外造影剤は、還流優位工程により組織中に蓄積される。下記に詳述するように、本発明の供給ビヒクル中へのキレート化剤の取込みは、１つ又はそれ以上の官能基を好ましくはキレート化剤主鎖に付加することによりキレート化剤構造を修飾することを包含する。例えば、ＤＴＰＡ及びＤＯＴＡのカルボン酸側鎖もさらなる共役のための部位として用い得る。しかしながら、この後者のアプローチは、キレート化「爪」の１つの置換による錯体安定性の損失を引き起こすために、好ましくない。この作用は、ＤＯＴＡ構造の生成定数が単一カルボン酸側鎖の損失に伴って有意に低減するとは思えないため、ＤＴＰＡでより顕著である。これにより、前記のように、生理学的安定性を低下させることなくＭＲＩ造影剤の緩和特性を利用する鍵は金属原子の結合部位をかき乱すことなく分子を官能化する（例えば、組織特異的又は代謝的プローブ部位を）ことであるため、ＤＯＴＡ及びｐ−アミノベンジルＤＯＴＡは好ましいキレート化剤となる。本明細書中に記載のＭＲＩ造影剤の他に、ＭＲＩに関して本発明を有益にする同一の特徴は、他のイメージング様相に関連する。γ線及びポジトロン射出断層撮影も、臨床的診断用に有効なイメージング技法である。したがって、ポジトロン射出断層撮影に有用な造影剤を常磁性キレート化剤の代わりに用いて映像を増強し得る。この例としては、¹⁹フッ素及び¹¹炭素、あるいは⁵¹クロム、⁶⁸ガリウム、⁹⁹テクネチウム及び¹¹¹インジウムのようなγ粒子を放出するキレート化剤が挙げられる。光学顕微鏡及び蛍光顕微鏡用の造影剤を用いてもよい。このような適用に特に有用な薬剤としては、フルオレセイン及びローダミン並びにそれらの誘導体が挙げられる（例えば、Molecular Probes Inc.，Handbook of Fluoros cent Probes and Research Chemicals，Haugland，1989 Catalogのpp116-118の修飾化デキストラン及びポリリシンの一覧表を参照）。これらのポリマーは、共通の染料、例えばアミノクマリン、カスケードブルー、クマリンアミノ、ダンシル、ジクロロフルオレセイン、ジメチルフルオレセイン、フルオレセイン、ボディピー、フィコビリタンパク質、例えばアロフィコシアニン及びフィコエリトリン、テキサスレッド、並びにルシファーイエローで修飾される。さらに、いくつかの光学的造影剤を用い得る。これらの光学造影剤は、下記のように、治療薬としても役立つ。これらの薬剤としては、ポルフィリン、アントラキノン、アントラピラゾール、ペリレンキノン、キサンテン、シアニン、アクリジン、フェノキサジン及びフェノチアジンが挙げられるが、これらに限定されない（Diwu， Z．J．and Lown，J.W.，Pharmacology and Therapeutics 36:1-35(1994); Gross weiner，L．I.，American Chemical Society Symposium Series 559:255-265(19 94)）。上記の造影剤の他に、本発明の生理学的作用物質としては治療薬が挙げられる。「治療薬」とは、本明細書中ではそれらが供給される細胞に生理学的作用を及ぼす薬剤を意味する。好ましい態様では、治療薬は細胞に有害又は有毒であり、したがって特定の細胞の選択的阻害、破壊又は死を可能にする。これは、下記のターゲッティング部分が腫瘍細胞に特異的である場合に特に有用である。この場合、供給ビヒクルは腫瘍細胞を標的にし、細胞と接触するか又は細胞中に入ると結合治療薬が腫瘍細胞を選択的に殺す。この方法で、本発明の供給ビヒクルはある種の治療薬、特に抗ガン剤の全身性毒性を低減させる。本実施態様の好ましい治療薬としては、抗ガン剤、酵素阻害剤、光線療法薬、放射性薬品、転写因子、配位子、ペプチド、並びにウイルスタンパク質及びいわゆる「腫瘍抑制剤」タンパク質を含めたタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施態様では、治療薬は抗ガン剤である。この場合、腫瘍細胞に対するビヒクルのターゲッティングがあらゆる全身性供給を最小にするため、抗ガン剤の全身性毒性は低減される。好ましい抗ガン剤又は抗腫瘍剤としては、シスプラチン、カルボプラチン、テトラプラチン、タキソール、メルファラン、５−フルオロウラシル、アザシタジン、シタラビン、メラプトプリン、メトトレキセート、チオグアニン、ポドフィリン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、ブスルファン、シクロホスファミド、メクロレタミン、チオテパ、アザチオプリン、カルムスチン、クロラムブシル、イオムスチン、シクロホスファミド、プロカルバジン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、イダルビシン、ジエチルスチルベストロール、タキソキシフェン、メゲストロール、ロイプロリド、ブロモクリプチン、アミノグルテチミン及びミトーテン挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施態様では、治療薬は腫瘍抑制タンパク質又は「成長調節因子」タンパク質である。適切なタンパク質としては、アデノウイルスＥ１Ａ腫瘍タンパク質、網膜芽腫感受性遺伝子ｐＲＢの生成物質、ＳＶ４０Ｔ抗原、ヒト乳頭腫Ｅ７タンパク質ｐ５３、並びにウイルス腫瘍タンパク質ｐ１０７、ｐ１３０及びｐ３００が挙げられるが、これらに限定されない(Hung et al.，Gene 159:65- 71(1995); Ludlow et al., Virus Res ．35:113-121(1995)参照)。好ましい実施態様では、治療薬は酵素阻害剤である。当業界で評価されているように、いくつかの酵素阻害剤も抗ガン剤である。特に好ましい酵素阻害剤としては、ＤＮＡ及びＲＮＡ複製経路の酵素の阻害剤、例えばリシン（リシンＩＩＩ又はリシンＩＶ）及びα−アマニチン；タンパク質合成経路の酵素阻害剤、例えばシクロヘキシミド、特に抗ウイルス性又は抗菌性酵素、例えばリファンピシンが挙げられる。さらに、細胞及びウイルスプロテアーゼ、例えばＨＩＶプロテアーゼの阻害剤、並びにチロシンキナーゼを含めた細胞及びウイルスキナーゼの阻害剤が挙げられる。特に、チロシンキナーゼを競合的に阻害する「自殺ペプチド」が挙げられる（Thomas et al., Rev ．Oncology 4(1)107(1991)参照）。一実施態様では、治療薬は、Grossweiner （上記）及びDiwu（上記）（いずれの記載内容も、参照により本明細書中に含まれる）に大体記載されているような光線療法化合物である。上記のように、いくつかの光学的造影剤は、それらの光感受性特性のために、治療薬と考えられる。したがって、光力学的治療薬は一般に、「光力学的ウインドウ」（約550 〜800 nm）中で光に曝露された場合に一重項酸素、過酸化物、ヒドロキシラジカル、過酸化物陰イオンラジカル又はその他の酸素化物質を生成することにより作用する。これらの生成物質は生細胞にとって非常に有害である。例えば、アントラサイクリン、アントラセネジオン及びアントラピラゾール；ペリレンキノン、ヘマトポルフィリン及びヘマトポルフィリン誘導体を含めたポルフィリン；アントライラゾール、キサンテン、シアニン、アクリジン、フェノキサジン及びフェノチアジンのような多数の適切な光線療法薬が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施態様では、光線療法薬は、光力学療法（ＰＤＴ）薬としてカナダで認可されたヘマトポルフィリンである。好ましい実施態様では、治療薬は放射性製剤化合物である。放射性製剤、例えば¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、¹²³Ｉ、¹¹¹Ｉｎ、⁹⁰Ｙ、²¹²Ｂｉ、²¹³Ｂｉ、⁹⁹? Ｔｃ、¹⁸⁶?Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、¹⁷⁷Ｌｕ及び¹⁵³Ｓｍは、十分公知の技術を用いて結合させる（例えば、Wu et al., Bioorganic Med ．Chem．Letts．4(3):449-454(1994); Larson , Cancer Suppl ．1991，67 :1253-1260; Schott et al.，Cancer Supp．73:993- 998(1994); Jurcic et al., Curr Op ．Immunol．6;715-721(1994)参照）。必要な場合には、例えばＤＯＴＡ及びＤＴＰＡを用いて、放射性同位体をキレート化する（Schott et al.,上記参照）。さらに別の実施態様では、治療薬を用いて細胞生存能力を増大する。例えば、インターフェロン及びその他のサイトカイン、例えばインターロイキン、成長因子及びコロニー刺激因子、並びにそれらの作動薬及び拮抗薬である（Thomas et al.,上記参照）。べつの実施態様では、単一種の生理学的作用物質を本発明の供給ビヒクルと結合させる。即ち、一種類の造影剤又は治療薬を結合させるが、しかし下記のように、各ビヒクルは多数の結合した作用物質を有する。別の実施態様では、１つ以上の種類の生理学的作用物質を各供給ビヒクルに結合させる。例えば、造影剤及び治療薬をともに単一ビヒクルに結合させ得る。あるいは、いくつかの異なる種類の治療薬又は造影剤を結合させ得る。高分子物質及び生理学的作用物質の他に、供給ビヒクルは細胞ターゲッティング部分を包含する。一次又は二次高分子の１つは、本発明の供給ビヒクルを細胞又は組織特異性にする少なくとも１つの細胞ターゲッティング部分（４）をそれに結合する。細胞ターゲッティング部分の選択は、標的化される特定の細胞又は組織に依る。増殖中の細胞が表面受容体を有するターゲッティング部分としてトランスフェリンを用いて、本発明を実証する。しかしながら、二次高分子に直接又は間接的に結合し得る、そしてそれと特異的に結合子、いくつかの場合には標的化細胞中に取り込まれ得る限りは、あらゆるターゲッティング部分を本発明に用い得る。例えば、適切なターゲッティング部分としては、抗体、タンパク質及び糖タンパク質配位子、ウイルス受容体及び標的、ホルモン、ペプチド、炭化水素、糖脂質並びに配位子類似体、並びに細胞及び組織特異的分布を示す薬剤及び毒素が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施態様では、ターゲッティング部分は細胞表面受容体に対する配位子である。好ましくは、細胞表面受容体は多数表示される（例えば少なくとも約 10⁵個／細胞）。好ましい細胞表面受容体及び／又は表面受容体配位子としては、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質、アセチルコリン、エンケファリン、エンドルフィン、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体結合に関与するタンパク質、ホルモン、例えばインスリン、甲状腺刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、エピネフリン、バソプレッシン、免疫計マーカー、例えば慢性関節リウマチを含めた自己免疫疾患に関連したものＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２５、ＣＤ３３及びＣＤ５４、並びに白血病に関連したもの、例えばＣＤ５、ＣＤ１９及びＣＤ２２が挙げられるが、これらに限定されない(Uckun，British J ．of Haematology 85:435-438(1993); Uckun et al.， Science 267:886-891(1995)参照)。公知の腫瘍抗原としては、ＥＲＢＢ２、ＦＭＳ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＴＰＲ−ＭＥＴ、ＲＥＴ、ＴＲＫ−ＴＭ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＴＣＲαＩＧＨも挙げられる（Urban et al.，上記参照）。好ましい実施態様では、ターゲッティング部分は抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。一実施態様においては、モノクローナル抗体は、上記のように腫瘍関連抗原に向けられる。当業界で公知のように、多数のこのような抗体が存在し、生検組織をスクリーニングするのに、並びに癌免疫療法に広く用いられている（特に、Urbanet al., Ann ．Rev．Immunol．10:617-644(1992); Kemshead e tal.， J ．Roval Soc．Med．86;219-224(1993)及びJurcic et al., 上記参照）。例えば、抗ＴＡＧ７２抗体Ｂ７２．３（King et al., 上記参照）又はＣＣ４９（Schott et al., 上記）、３Ｆ８、Ｔ１０１及び抗ＣＥＡ（Larson et al., 上記）、抗腎細胞癌抗体Ａ６Ｈ（Wilbur et al., 上記参照）、２Ｅ４（Wu et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 4(3)；449-454(1994 )）及びJurcic等（上記）が開示した抗体が有用である（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）。好ましくは、モノクローナル抗体は、細胞表面受容体のような細胞表面露呈エピトープに対する高特異性を有するＩｇＧ種の抗体である。上記のように、露呈エピトープは好ましくは多数（少なくとも約 10⁵個／細胞）表示される。当業界で評価されているように、抗体の活性断片も本発明の実行に有用である。好ましい実施態様では、抗体又はその活性断片は、造血幹細胞上には認められないＢリンパ球マーカーであるＣＤ₁₉に向けられる。当業界で公知のように、ＣＤ₁₉に対して標的化される免疫療法薬を首尾よく用いて、長期免疫抑制を引き起こさずにＢ細胞リンパ腫を破壊した（Uckun et al.，Sience，上記参照）。この実施態様においては、ＣＤ₁₉抗体又は活性断片を細胞ターゲッティング部分として用いる。好ましい実施態様では、ＣＤ₁₉抗体を用いる供給ビヒクルは標的化細胞に有毒である；例えば、それらはｔｋ遺伝子をコードする核酸を含有し得るか、又は治療薬として細胞毒素を用い得る。本発明の一実施態様では、造影剤供給ビヒクルは細胞ターゲッティング部分を有さず、概して細胞又は組織特異性でない。この実施態様においては、正味陽電荷を有する高分子を好ましくは修飾して、細胞取込みを促す疎水性残基を取り込む。核酸及び疎水性主鎖を有する多価陽イオンの錯体の細胞取込みは、当業界で公知である（Jean-Paul Behr，Bioconjugate Chemistry 5:382-389(1994)）。本発明の別の実施態様では、造影剤供給ビヒクルは細胞ターゲッティング部分（細胞及び組織特異性を生じさせるための）及びトランスフェクション効率を増強するための疎水性残基の両方を有する。一旦細胞ターゲッティング部分及び生理学的作用物質を選択すれば、本発明の供給ビヒクルの調製は下記のように進行する。好ましい実施態様では、供給ビヒクルを以下のように構築する。下記の技法を用いて、細胞ターゲッティング部分を高分子に付加する。この結合は、ターゲッティング部分がそのターゲッティング能力を有意に損失することなく恒久的に結合されるように、好ましくは共有結合である。次に、結合したターゲッティング部分を有するポリマーを反応に用いて、生理学的作用物質を付加する。当業者に評価されるように、本発明の供給ビヒクルは、種々の方法を用いて、種々のやり方で作り得る。下記に開示した方法が唯一のものという訳ではない。錯体当たりの細胞ターゲッティング部分の数は、供給ビヒクル当たり０（疎水性多価陽イオンを非特異的ＤＮＡ形質転換に用いるような場合）から1000個の細胞ターゲッティング部分まで変化し得る。錯体当たりの細胞ターゲッティング部分の好ましい数は、錯体のサイズによって、一般に約10〜約50である。好ましい実施態様では、ポリマーのターゲッティング部分対モノマー単位の比は、一般に約１対100 である。例えば、トランスフェリンを細胞ターゲッティング部分として、ポリ−Ｌ−リシンを多価陽イオンとして用いた場合、トランスフェリンタンパク質約１対リシンモノマー約100 が好ましい比である。スペルミン及びスペルミジンのようなポリアミンを単一窒素又は炭素で修飾して陽子化に十分な数のアミンを脱離させて。多価陰イオンと相互反応させる。ヒストン及びプロタミンを、プロタミン中のシステイン残基でのようなイオン性相互作用に関与しない部位で修飾する。一般に、ターゲッティング部分、特にタンパク様ターゲッティング部分の４つの官能基の１つを用いて、細胞ターゲッティング部分を結合させる。好ましい実施態様では、ポリマーはポリリシンであって、細胞ターゲッティング部分はグリコシル化タンパク質であり、結合のためには炭水化物を用いる。標準技法を用いて炭水化物の無水物を作り、次いで無水物をポリマーのアミノ基と、例えばポリリシンのε−アミノ基と反応させる。別の実施態様では、細胞ターゲッティング部分のシステイン残基を結合の部位として用いる。例えばＳＰＤＰ、マレイミド、α−ハロアセチル及びピリジルジスルフィドのような当業界で公知の多数のスルフヒドリル反応性リンカーがある（例えば、1994 Pierce Chemical Company catalog，technical s ection on cross-linkers,pp.155-200参照。この記載内容は参照により本明細書中に含まれる）。別の実施態様では、細胞ターゲッティング部分のアミノ基は、ポリマーのアミノ基との結合のために用いられる。例えば、多数の安定二官能基が当業界で十分公知であって、その例としては、ホモ二官能性及びヘテロ二官能性リンカーが挙げられる（Pierce Catolog and Handbook，pages 155-200 参照）。例えば、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）をトランスフェリンに付加し、次いで３−メルカプトプロピオネート修飾ポリリシンと反応させた（Wagner et al., Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 87:3410-3414(1990) ）（この記載内容は本明細書及び実施例に含まれる）。さらに別の実施態様では、十分公知のリンカーを用いて、カルボキシ基（ポリマーからの又は細胞ターゲッティング部分からの）を誘導し得る（Pierceカタログ参照）。例えば、カルボジイミドは、アミンのような良好な求核性物質による攻撃に対してカルボキシ基を活性化する(Torchilin et al., Critical Rev ．The rapeutic Drug Carrier Systems , 7(4);275-308(1991)参照。この記載内容は、本明細書中に含まれる)。当業界で公知のその他の技法を用いて抗体細胞ターゲッティング部分を結合させてもよい（Slinkin et al.，Bioconj．Chem．2：342-348(1991); Torchilin e t al.，上記； Trubetskoy et al.，Bioconj ，Chem. 3:323-327(1992)； King e t al.，Cancer Res ．54:617 6-6185(1994)；及び Wilbur et al.， Bioconjugate Chem ．5:220-235(1994)参照。これらの記載内容はすべて、参照により本明細書中に含まれる）。上記の方法を含めた種々の方法で細胞ターゲッティング部分を結合させ得ると理解すべきである。重要なことは、結合方法がターゲッティング部分の官能性を有意に変えないことである。即ち、ターゲッティング部分は依然としてその標的細胞表面受容体と結合して供給ビヒクルのエンドサイトーシスを引き起こし得る。当業者に評価されるように、これは容易に立証される。細胞ターゲッティング部分を高分子と結合させる前又は後に、生理学的作用物質を付加する。一般に、できるだけ多くの生理学的作用物質を、ビヒクルに悪影響を及ぼすことなく、各々の供給ビヒクルに付加するのが好ましい。多数の生理学的作用物質をポリアミンに結合させるか、又は生理学的作用及び核酸とのキレート環形成の両方ができる多価陽イオンを作るために結合させ得る。生理学的化合物及び／又は細胞ターゲッティング部分によりアミノ基側鎖の約20％までが修飾され、多価陰イオンとの相互作用のために生理学的pHで荷電したアミノ基の約 80％又はそれ以上が残る。これらの比は、２つの高分子種のサイズが異なる場合には、有意の電気的中性が維持される限り、さらに変わり得る。その結果生じる核酸ベースの生理学的作用物質供給ビヒクルは、1,000 〜10,000の生理学的作用物質を含有する。この大きさの等級は、従来のいかなる方法に依るものよりも大きい。造影剤の場合、このレベルの常磁性イオンは、標準ＭＲＩハードウエアを用いたこの作用物質の生理学的に穏当な濃度での標的化ＭＲＩコントラストを増強させる。多価陽イオン／多価陰イオン複合体形成の阻害を伴わない、且つ毒性又は浸透性悪作用を伴わない最大数の生理学的作用物質が望ましい。概して、生理学的作用物質は、多価陽イオン／多価陰イオン複合体のイオン相互作用の強さに依って、２モノマー当たり作用物質約１から約100 モノマー当たり作用物質約１までの比で、好ましくは約１作用物質／４モノマー〜１作用物質／20モノマーの範囲の比で高分子と結合する。約４〜10が好ましい。生理学的作用物質が造影剤、例えばＭＲＩ造影剤である場合、常磁性金属イオンキレート化剤、例えばＤＴＰＡ又はＤＯＴＡは先ず共有結合し、次いで複合体が金属イオンと反応する。十分公知の技法を用いて、ＤＴＰＡキレート化剤を本発明の高分子と結合させる（Hnatowich et al.， J ．Immunol．Methods，65:147 -157(1983)； Hnatowich et al., Int ．J．Appl．Radiot．Isot. 33:327(1982) ；Torchilin et al.，上記；参照。これらの記載内容はすべて、参照により本明細書中に含まれる）。好ましい実施態様では、キレート化剤の無水物を作り、アミノ基、例えば利用可能なリシン残基と反応させて、アミド結合を形成する。さらに、ＤＯＴＡをキレート化剤として用いる場合は、別の方法でそれを修飾して結合のための官能基を提供し得る。これは、その結果生じる毒性による複合体の安定性損失を回避するために配位原子の１つの誘導化を避けるために好ましい。例えば、いくつかの文献の方法は、ＤＯＴＡ大員環の合成的修飾として公にされた（Moi et al.， J ．Am．Chem．Soc．110:6266(1988)；McMurry et al.，B ioconj ．Che．3(2) ：108(1992); Ren et al., Bioconj ．Che．3(6):563(1992); Kumar et al.， Inorg ．Chem．32(20):4193(1993)）。一方法では、テトラペプチド出発物質を用いてｐ−アミノベンジル部分をＤＯＴＡ配位子に導入する（Mo i et al.，上記）。ｐ−アミノベンジル−ＤＯＴＡの構造を図４に示す。次に、ｐ−アミノベンジル部分のアミノ基をポリマーとの結合に用い得る。テトラペプチド出発物質の調製方法は、溶液法を用いて修飾して、生成物質の合成により高度の適応性を付加し得る。文献の手法を変更することにより、所望の配位子を調製し得る。その結果生じる大員環配位子骨格は、好結果のin vivo 造影剤の設計特徴を満たす。この場合、その後の高分子との結合のための官能基を付加し、次いで、安定な二官能性リンカー又はカルボジイミドの使用といったような細胞ターゲッティング部分結合に関して上記した技法を用い得る。ＤＯＴＡと同様の方法で官能基を含有するように、その他のキレート化剤を修飾し得る。生理学的作用物質が治療薬、例えば抗ガン剤又は光線療法薬である場合、同様の技法を用いる。上記の技法を用いて、タンパク様剤あるいはアミノ−又はカルボキシ含有剤を結合し得る。例えば、特にメトトレキセート、メルファラン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、シタラビン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、アミノグルテチミド、メクロロエタミン及びマイトマイシンを、アミノ基を介して結合する。メトトレキセート、メルファラン及びクロラムブシルは、カルボキシ基を介して結合し得る。ダウノルビシン、ドキソルビシン、シタラビン、及びプリカマイシンは、炭水化物部分のアルデヒドを介して結合し得る。十分公知のリンカーを用いてもよい。十分公知の技法を用いてアミン基のような官能基をその部分と結合させ、次いで適切なリンカーを用い得る。例えば、光線療法薬をこの方法で結合し得る。一実施態様では、本発明の供給ビヒクルは、遺伝子発現の効率を増大するために、さらに他の作用物質を含有する。意外にも、ＤＮＡ／ポリ−Ｄ−リシン／Ｇｄ−ＤＴＰＡ／トランスフェリンの多複合体を用いて細胞をトランスフェクトすると、ＭＲＩ造影剤を欠いたＤＮＡ／ポリ−Ｄリシン／トランスフェリン複合体を用いた場合よりも高い効率の遺伝子トランスフェクションが達成される。Ｇｄ−ＤＴＰＡ− ポリリシンのこの高効率は、ポリリシンのＤ及びＬの両異性体を用いて多数の異なる比率の成分で（例えば図２参照）認められる。この作用は、細胞内部での同時のＧｄ−ＤＴＰＡ含有粒子の取込み増大又はそれらの遺伝子発現の効率増大に依るものと思われる。大多数の粒子が受容体媒介取込み経路によりエンドサイトーシスを介して取り込まれ、リソソーム区画で消化されることが公知である。リソソームからの粒子の放出を促す作用物質は、供給される遺伝子の発現を劇的に増大することが公知である。これらの作用物質としては、クロロキン、ウイルスゴースト及びfusoge nic ペプチドが挙げられる。さらに、粒子を細胞質から核へ移すタンパク質及びペプチドは、遺伝子発現をさらに増強する。したがって、本発明の供給粒子としては、リソソーム放出及び核取込みに関する作用物質、例えばインフルエンザウイルスfusogenic ペプチド（Wagner et al., Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 89:7 934-7938(1992)）及び核タンパク質、例えばＨＭＧ１が挙げられる。さらに、核局在シグナル（ＮＬＳ）ペプチドを核への非細胞供給のためにビヒクルに付加し得る（例えば、Goldfarb et al., Trends Cell Biol ．1:20-24(1991)）。上記の技法を用いて、これらの付加的物質を付加する。一旦作られれば、本発明の供給ビヒクルは種々の方法で用いられる。一実施態様では、供給ビヒクルを用いて核酸を細胞に供給する。供給ビヒクルは、少なくとも１つの結合細胞ターゲッティング部分及び結合造影剤を伴う核酸及び少なくとも１つの多価陽イオン分子を包含する。一実施態様では、単一多価陽イオン分子を用いる；別の実施態様では、上記のように二次又は多数の多価陽イオン分子を用いる。供給ビヒクルを標的細胞と接触させ、次いで、造影剤の存在を検出することにより核酸の存在をモニタリングする。この実施態様においては、供給ビヒクルは造影剤を包含するが、しかしあるいは造影剤と治療薬の両方を結合し得る。さらに別の実施態様では、供給ビヒクルを用いて生理学的作用物質を供給する。一実施態様では、造影剤を供給する。別の実施態様では、治療薬を供給するか、又は造影剤及び治療薬の両方を供給する。この実施態様においては、供給ビヒクルは一次高分子及び二次逆荷電高分子を包含する。ポリマーの一方又は両方は、結合細胞ターゲッティング部分及び生理学的作用物質を有する。生理学的作用物質の供給は、生理学的作用物質の存在を用いて検出する。標準ＭＲＩ法を用いて、ＭＲＩ造影剤を使用し、モニタリングし又は検出する。この実施態様においては、レポーター遺伝子をコードする核酸を用い、レポーター遺伝子又はタンパク質の存在又は非存在を用いて、供給検出を行う。好ましい実施態様では、供給ビヒクルを用いて腫瘍を検出及び／又は処置する。この実施態様においては、供給ビヒクルは、結合された細胞ターゲッティング部分及び生理学的作用物質を有する高分子を包含する。細胞ターゲッティング部分は、好ましくは腫瘍細胞受容体に特異的であるか、あるいは腫瘍又は急成長細胞に優先的に見出される受容体を標的にする。供給ビヒクルを用いて腫瘍を検出するか又は画像形成する場合、生理学的作用物質は好ましくは造影剤であり、好ましくはＭＲＩ造影剤である。供給ビヒクルを用いて腫瘍を処置する場合、生理学的作用物質は抗ガン剤又は光線療法剤である。好ましい実施態様では、腫瘍を処置するのに用いられる供給ビヒクルも、治療のリアルタイムモニタリングのために造影剤を組み入れる。本発明の供給ビヒクルは、当業界で公知のように患者又は被験者に投与する。一般に、供給ビヒクルは、静脈内及び皮下を含めて、公知の造影剤が提供されるのと同様に患者に供給される。いくつかの場合には、例えば肺上皮供給のためには、粒子をエーロゾル投与又は吸入投与する。ビヒクルの供給は、いくつかの方法でモニタリングし得る。結合造影剤は、十分公知の映像法で観察し得る。療法又はレポーター遺伝子の遺伝子供給は、標準分子生物学及びタンパク質技術を用いて、あるいは療法の場合には標的化細胞に及ぼす影響により、モニタリングし得る。以下の実施例で上記の本発明の使用方法をさらに詳細に説明し、本発明の種々の局面を実施するために意図された最良の方法を記載する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の説明のためのものであると理解される。本明細書に引用した参考文献はすべて、参照により本明細書中に含まれる。実施例実施例１：トランスフェリン−ポリ−Ｌ−リシンの調製サイズ排除クロマトグラフィーによりヒトアポトランスフェリンを精製し、30 mM 酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.0）に溶解した。4 ℃で、20モル当量の過ヨウ素酸ナトリウムを付加した。トランスフェリン炭水化物（Ｎ−アセチルノイラミン酸）をその無水物形態に酸化する反応を、4 ℃で120 分進行させた。修飾トランスフェリンをサイズ排除クロマトグラフィーにより精製し、直ちに、100 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.0）に溶解した0.5 当量のポリ−Ｌ−リシン（平均鎖長＝180 サブユニット）を含有する溶液に付加した。１時間の間隔で、４つのアリコート中の800 当量のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを付加して、反応生成物を第二アミンに還元した（Wagner et al., Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 89:793 4-7938(1992) ）。サイズ排除クロマトグラフィーによりトランスフェリン修飾化ポリ−Ｌ−リシンを分別した。多価陽イオン鎖当たり平均２個のトランスフェリン分子で修飾されたポリリシンを含有することが確定された分画を、次の実験に用いた。実施例２：ＤＴＰＡ−ポリ−Ｄ−リシンの調製標準的文献手法の変法を用いて、ポリリシンのＤＴＰＡ二無水物との共役を達成した（Hnatowich et al.，J ．Immunol．Methods 65:147-157(1983)）。多価陽イオン鎖のＤＮＡ結合能力を保持する必要に対してＧｄ含有粒子の高シグナル強度に対する欲求の平衡をとるために、モノマー側鎖の5 〜20％で修飾されたポリリシンを調製した。ポリ−Ｄ−リシン（平均鎖長＝180 サブユニット）5 mgを0.5 M炭酸ナトリウム緩衝液（pH 9.8）20ml中に溶解し、攪拌棒を備えた50ml丸底フラスコに入れた。新たに調製したＤＴＰＡ無水物を１時間かけて10回に分けて等量ずつ付加した（別々の反応で100、200及び400 倍当量過剰）。3 ％水酸化ナトリウム溶液を付加して、反応液のpHを9.8 に保持した。Pharmacia ＦＰＬＣ系を用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより、ＤＴＰＡ修飾ポリ−Ｄ−リシンを精製した。リシン鎖当たりのＤＴＰＡ分子の数を評価するために、精製物質のアリコートを水中でＥｕＣｌ₃と反応させた。生成物の蛍光発光測定（612 nm）を、ＳＬＭ8 000Ｃ分光蛍光光度計対一連の標準光度計で実施した。置換誘導体の総量は、100 倍過剰反応生成物に関しては9 〜11ＤＴＰＡ／ポリリシンの範囲であったが、これに対して400 倍反応は35ＤＴＰＡ／ポリリシンであった。各反応からのＥｕ −ＤＴＰＡ−ポリリシンを、ＵＶ濃色検定を用いてＤＮＡを結合するそれらの能力に関して試験した。この場合、多価陽イオンと錯体を形成するＤＮＡは非錯体化ＤＮＡより高いＵＶ光線吸収を示す。この検定を用いて、最小重度修飾ポリリシン（10Ｅｕ³⁺¹ｓ／ポリリシン）は非修飾ポリリシンと同様、ＤＮＡと結合した；最重度修飾ポリリシンはＤＮＡと全く結合しなかった；中等度標識化ポリリシンはＤＮＡ結合親和性の低減を示したことが判明した。平均10ＤＴＰＡＶ／ポリリシンを有する化合物を、70℃で3 時間、pH 7.0の蒸留水中で1.1 モル過剰量のＧｄ（Ｃ１）₃とキレート化させた。ゲル濾過によりＧｄ−ＤＴＰＡ−ポリ−Ｄ−リシンを精製し、その後の実験に用いた。実施例３：組織特異的／ＭＲＩ造影剤錯体の形成 Promega Corp.(Madison，Wisconsin)から「GeneLight」プラスミドを購入し、標準手法を用いて大量に調製した。このプラスミドはＳＶ４０エンハンサー／プロモーターの制御下でルシフェラーゼ遺伝子（P．pyralis）を含有し、本試験で用いたＫ５６２のような哺乳類細胞中で強いルシフェラーゼ発現を生じた。この遺伝子の発現は、トランスフェクト化細胞の抽出物中の光生成を測定することにより、容易にモニタリングし得る。典型的には、プラスミド 6μg をＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（150 mM塩化ナトリウム、20mM ＨＥＰＥＳ，pH7.3）0.5 ml中の次善量のトランスフェリン−ポリリシンに付加し、室温で10分間錯体を形成させた（Wagner et al., Proc ．Natl．A cad．Sci．USA 88 :4255-4259(1991)）。ポリ−Ｄ−リシン又はＧｄ−ＤＴＰＡ− ポリ−Ｄ−リシンの量を変えて溶液に付加し、ＤＮＡとの３成分錯体を形成することにより陰電荷を完全に中性にした。実施例４：標的化細胞中のＤＮＡ発現ＲＰＭＩ培地＋10％ウシ胎児血清、100 単位／ペニシリン１ml、 100 μg ／ストレプトマイシン１ml及び２mMグルタミンの懸濁液中で、Ｋ５６２細胞を増殖させた。形成されたＧｄ−ＤＴＰＡ−ポリリシン／ＤＮＡ／トランスフェリン−ポリリシン複合体を、細胞500,000 個及び100 μM クロロキンを含有する細胞懸濁液 2mlに付加して、37℃で10時間インキュベートさせた。対照として、いくつかの細胞を同時に遊離トランスフェリンで処理して、ＭＲＩ造影剤供給ビヒクルの受容体媒介性取込みを競合的に阻害した。その後、細胞を新鮮な培地中で洗浄し、18時間後に収穫した。細胞をＨＥＰＥＳ緩衝食塩水で３回洗浄して、抽出緩衝液 30 μl 中で溶解させた。ルシフェラーゼ基質及びアデノシン三リン酸の付加直後に、Beckman シンチレーション計数器で発光を検定した。図２は、Ｇｄ−ＤＴＰＡポリ−Ｄ−リシンを含有する遺伝子供給ビヒクルを用いて観察された遺伝子発現のレベル（カラム１）と、造影剤の代わりに非修飾ポリ−Ｌ−リシンを含有する遺伝子供給ビヒクルとを比較したグラフである。ポリリシンへのＧｄキレートの付加は、遺伝子トランスフェクションの効率を実際に増強した。これは他の粒子組成物でも同様に観察されている。これらの実験に遊離トランスフェリン20μg を付加した場合、遺伝子トランスフェクションの効率を示す光発生は劇的に低減した（図３）。この作用は、遺伝子トランスフェクションのメカニズムが事実上、トランスフェリン媒介性取込みであることを示す。実施例５：ＭＲＩ映像獲得マイクロイメージング付属品を備えた11.7 Tesla Bruker AMX 500 MHz ＭＲＩ分光計を用いて、ＭＲＩ映像を獲得した。トランスフェクション効率を検定するのに用いたものと同一の細胞の懸濁液ヲ用いて、図３に示す映像を得た。約500, 000 個の細胞を2 mmガラス毛細管に移して、懸濁液から沈殿させた。管を密封し、マルチスライススピンエコープロトコールを用いて映像を得た（ＴＲ／ＴＥ＝300/13 ms）。Ｇｄベースの造影剤に適していたように、これらのパラメーターはＴ₁発光映像を生じた。図３では、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ポリ−Ｄ−リシンを含有する粒子でトランスフェクトされた細胞を１及び２に示す。２における遊離トランスフェリンの付加は粒子の取込みを競合的に阻害し、ＭＲＩコントラストを低減した。これはさらに、これらの粒子のＭＲＩコントラスト増強が特異的で且つトランスフェリン取込み経路を介していることを確証する。したがって、ＤＮＡ、トランスフェリン、Ｇｄ−ＤＴＰＡ及びポリリシンで構成される粒子で処理した細胞は、有効な遺伝子トランスフェクション並びに劇的ＭＲＩコントラスト増強を同時に示した。本明細書中に示した文書はすべて、参照により本明細書に含まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 49/00 Ａ６１Ｋ 43/00 51/00 37/52 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者メーデ，トーマスジェイ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 91007, アルタデナ，ニューヨークドライブ 1656 (72)発明者フラサー，スコットイー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92660, ニューポートビーチ，ビソンアベニュ 720

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の：ａ）正味陽又は陰電荷を有する一次高分子；ｂ）上記一次高分子と反対の正味電荷を有し、上記一次高分子と錯体を形成する少なくとも１つの二次高分子であって、少なくとも一つの細胞ターゲッティング部分がそれと結合した二次高分子；及びｃ）上記一次又は二次高分子と結合する、あるいは三次高分子と結合する少なくとも一つの生理学的作用物質であって、上記三次高分子が、存在する場合には、上記一次高分子と反対の正味電荷を有し、上記一次高分子と錯体を形成する生理学的作用物質を包含する供給ビヒクル。２．上記一次高分子が核酸を包含する請求項１記載の供給ビヒクル。３．上記核酸がＤＮＡである請求項２記載の供給ビヒクル。４．上記ＤＮＡがポリペプチドをコードする請求項３記載の供給ビヒクル。５．上記ポリペプチドがヘルペスチミジンキナーゼタンパク質である請求項３記載の供給ビヒクル。６．上記二次高分子がポリアミンを包含する請求項２記載の供給ビヒクル。７．上記三次高分子が存在し、ポリアミンを包含する請求項６記載の供給ビヒクル。８．上記二次高分子がポリリシン及びスペルミジンから成る群から選択される請求項６記載の供給ビヒクル。９．上記二次高分子がポリリシン又はスペルミジンを包含し、上記三次高分子がポリリシン又はスペルミジンを包含する請求項７記載の供給ビヒクル。１０．上記生理学的作用物質が造影剤を包含する請求項１記載の供給ビヒクル。１１．上記造影剤がキレート化剤と錯体を形成する常磁性イオンを包含する請求項１０記載の供給ビヒクル。１２．上記常磁性イオンがガドリニウムである請求項１１記載の供給ビヒクル。１３．上記キレート化剤がジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又は１，４，７，１０−テトラアザシクロードデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’四酢酸（ＤＯＴＡ）を包含する請求項１２記載の供給ビヒクル。１４．上記生理学的作用物質が治療薬である請求項１記載の供給ビヒクル。１５．上記治療薬が光線療法薬及び抗ガン剤から成る群から選択される請求項１４記載の供給ビヒクル。１６．以下の：（ａ）上記細胞を、以下の：ｉ）核酸；ｉｉ）上記核酸と錯体を形成する少なくとも１つの一次高分子であって、上記細胞上の表面受容体に対して少なくとも１つの細胞ターゲッティング部分と結合した一次高分子；及びｉｉｉ）上記一次高分子又は二次高分子と結合した少なくとも１つの造影剤であって、上記二次高分子が、存在する場合には、上記核酸と錯体を形成する造影剤を包含する核酸供給ビヒクルと接触させ；（ｂ）上記核酸が上記細胞に供給されたか否かの指示として上記細胞中の上記造影剤の存在を検出する工程から成る細胞への核酸の供給方法。１７．以下の：（ａ）上記細胞を、以下の：ｉ）正味陽又は陰電荷を有する一次高分子；ｉｉ）上記一次高分子と反対の正味電荷を有し、上記一次高分子と錯体を形成する少なくとも１つの二次高分子であって、上記細胞上の表面受容体に対する少なくとも一つの細胞ターゲッティング部分がそれと結合した二次高分子；及びｉｉｉ）上記一次又は二次高分子と結合する、あるいは三次高分子と結合する少なくとも一つの生理学的作用物質であって、上記三次高分子が、存在する場合には、上記一次高分子と反対の正味電荷を有し、上記一次高分子と錯体を形成する生理学的作用物質を包含する供給ビヒクルと接触させ；そして（ｂ）上記生理学的作用物質が上記細胞に供給されたか否かの指示として上記細胞中の上記生理学的作用物質の存在を検出する工程から成る細胞への生理学的作用物質の供給方法。１８．上記生理学的作用物質が造影剤である請求項１７記載の方法。１９．上記生理学的作用物質が治療薬である請求項１７記載の方法。２０．上記供給ビヒクルが少なくとも１つの造影剤及び少なくとも１つの治療薬を包含する請求項１７記載の方法。２１．上記検出が磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）による請求項１８又は２０記載の方法。２２．以下の：（ａ）正味陽電荷を有し、上記供給ビヒクルの細胞取込みを促す疎水性残基を有する一次高分子；（ｂ）正味陰電荷を有し、上記一次高分子と錯体を形成する二次高分子；及び（ｃ）上記一次又は二次高分子と結合した少なくとも１つの生理学的作用物質を包含する供給ビヒクル。