JPH10508483A

JPH10508483A - オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの製法、そのためのベクターおよびそれらの使用

Info

Publication number: JPH10508483A
Application number: JP8515251A
Authority: JP
Inventors: ランデグレン，ウルフ; スンドヴァル，マッツ
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-11-07
Filing date: 1995-11-07
Publication date: 1998-08-25
Also published as: WO1996014406A1; SE9403805D0; US5952201A; EP0791057A1; CA2204637A1

Abstract

(57)【要約】標的ＤＮＡ配列に関連するＤＮＡ断片を、非対称に切断する制限酵素の認識モチーフを含むヌクレオチド配列に結合するか連結させ、次いで該構築物を制限酵素に暴露して、それによりその標的関連ＤＮＡ断片部分内で構築物を切断する工程からなることを特徴とする、標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズ可能な核酸配列を、このＤＮＡ配列についての知識を必要とせずに調製する方法。ベクターはそれゆえ標的関連ＤＮＡ断片挿入のための部位および、該挿入部位の一方側または両側の非対称に切断する制限酵素または酵素類のための認識配列からなる。

Description

【発明の詳細な説明】オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの製法、そのためのベクターおよびそれらの使用発明の分野本発明は核酸プローブおよびプライマーの製法ならびにそのためのベクターに関する。発明の背景ポリメラーゼ鎖反応、すなわちＰＣＲは、種々のＤＮＡ試料から所望の遺伝子配列を単離する高度に効率的な方法を提供する。一の一般的な必要条件は、特異的増幅プライマーを合成するためには、配列情報が増幅されるべき断片の両端から得られることである。ＤＮＡ配列を決定し、次いでプライマーを化学的に合成する費用またなお多くの適用の範囲を制限する。従って、多くの研究において、ＤＮＡ配列決定およびオリゴヌクレオチド合成の工程が、ゲノム断片がＰＣＲによって増幅される前に全く回避できれば最も役に立つと思われる。これは、例えば、ヒトまたは他のゲノム中で多形性マーカーを同定するためら、集団内で個人の特異的ＤＮＡセグメントの多形性の程度を分析するために設計された大きなプログラムには当てはまる。このような遺伝子マーカーは、遺伝病をマッピングするため、また様々な生物の遺伝的連鎖地図を確立または拡大するために必要である。上記の問題を部分的に克服する１のアプローチは、ストリンジェントでない(n onsringent)条件下で限定された一組のプライマー、いわゆるＲＡＰＤマーカーにて、比較的非特異的増幅を使用することである。これらのマーカーは、ＤＮＡ配列決定および特異的プライマーの化学的オリゴヌクレオチド合成を必要とせずにＰＣＲによって分析可能な比較的ランダムな多形性マーカーを確立する手段として役に立つ。発明の要約本発明は先行技術の方法の欠点を克服し、公知の構造であるが部分的に未知の配列の特異的増幅プライマー、ライゲーションプローブまたは他のプローブの酵素的合成を、特異的ＤＮＡ配列情報をクローンするアクセスなくして可能とする異なる戦略を提供する。一の態様において、本発明は、標的ＤＮＡ配列の知識を必要とせずにこのＤＮＡ配列にハイブリダイズできる、公知の構造であるが部分的に未知の配列の核酸配列の調製のためのベクターを提供し、該ベクターは、標的ＤＮＡ配列に関連するＤＮＡ断片の挿入部位、および該挿入部位の一方または両方の部位において非対称に切断する制限酵素（類）の認識配列を含む。もう一つの態様において、本発明は、標的ＤＮＡ配列の知識を必要とせずにこのＤＮＡ配列にハイブリダイズできる、公知の構造であるが部分的に未知の配列の核酸配列の調製方法を提供し、該方法は、標的配列に関連するＤＮＡ断片を、非対称に切断する制限酵素の認識モチーフを含む核酸配列に結合または連結させ、該構築物を制限酵素で処理して、該構築物をそのＤＮＡ断片部分内で切断することよりなる。さらにもう一つの態様において、本発明は、断片のＤＮＡ配列の知識を必要とせずに、本発明の上記態様により調製された酵素−合成プライマーを用いることによって、ＤＮＡ断片を増幅する方法を提供する。さらにもう一つの態様において、本発明は、標的依存性ライゲーション反応のためのプローブを構築する方法を提供する。本発明の他の態様および利点は、以下の詳細な記述の考慮により明らかであり、これは、本発明の実行の例示となる実施例を含む。本発明を、添付の図面を参照することにより以下にさらに詳細に記載する。図面の簡単な説明図１Ａおよび１Ｂは４のパートＡ−Ｄの形態での、増幅プライマーを酵素的に誘導する戦略の模式図である。パートＡは特殊化されたクローニングベクターの構築を示し、パートＢはＡｌｕＩ断片のベクターへのクローニングを示し、パートＣは増幅プライマーの酵素的合成を示し、パートＤは、クローンの増幅したインサート由来のプライマーを用いた、ベクター中にクローンされたものに対応する配列の増幅を示す。制限酵素ＧｓｕＩおよびＡｌｕＩの認識配列は図中強調されている。図２は、ＧｓｕＩ部位を含む固定化されたベクター、環状化可能なプローブを調製するためのその切断および、一本鎖環状標的分子の捕捉および続いての放出のための後者の使用の模式図である。図３は、固相化学合成また酵素的合成由来のプライマー組を用いたＰＣＲによって得られた増幅生成物を比較するオートクラジオグラフの写真である。公知のＤＮＡ配列のＡｌｕＩ断片については、標準的固相化学により合成された特異的な１６量体プライマーを、３’−末端が同−１６−塩基の配列の同様に構築された３８量体、およびこの大きさの化学的に合成されたオリゴヌクレオチドと同じ３８量体配列を有することが期待される酵素的に合成されたプライマー対と比較した。発明の詳細な説明制限エンドヌクレアーゼ、または制限酵素は、特異的ＤＮＡ配列（通常配列中の４ないし８個のヌクレオチド）を認識し、該ＤＮＡを切断し、それによって二本鎖の切断を作り出すことのできる酵素である。制限酵素は、それらのサブユニット構造、コファクター要求、基質特異性およびいくつかの他の特徴により４のクラス、タイプＩ、II、IIIおよびIVに分けられる。タイプＩの酵素はほとんどランダムに認識部位から非常に離れたところで基質ＤＮＡを切断する。タイプII の酵素は、ＥｃｏＲＩによって例示されるが、認識部位の中または２、３ヌクレオチド離れた部位で切断する。タイプIIIおよびタイプIVの酵素は認識部位からいくぶん顕著にはなれた距離にある標的ＤＮＡ配列を切断し、それらはまたＤＮＡを完全には決して切断しないという特性を共通して有する。タイプIVの酵素は、タイプIIの制限酵素と類似しているが、ＡＴＰに依存しないという点でタイプ IIIの酵素と異なる。タイプIIIおよびタイプIV制限酵素は非対称に切断する酵素として共通に呼ばれる。タイプIV制限酵素の例示はＧｓｕＩ（ジャヌライティス (Janulaitis)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucl．Acid Res.)1989;17 (14):1989）（認識配列が５’ＣＴＧＧＡＧ３’でありこのモチーフから１６塩基下流を切断）；Ｅｃｏ５７Ｉ（認識配列が５’ＣＴＧＧＴＧ３’であり、このモチーフから１６塩基下流を切断）；ＭｍｅＩ（ボイド(Boyd)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucl．Acid Res.)1986;17(14):5255-5274）（６塩基認識モチーフであって、この配列から２２塩基下流の標的ＤＮＡを切断する）。制限酵素ＢｐｍＩ(ニュー・イングランド・バイオラブズ，ユーエスエイ(New Englan d Biolabs，U.S.A.))は同じ認識配列を有し、上記のＧｓｕＩと同じ方法で切断する。認識配列からさらに離れた標的ＤＮＡを切断するタイプIIIおよびIV酵素も存在する。このような酵素の例はＥｃｏ１５およびＨｉｎＰ１５１を含み、認識配列から２５または２６塩基下流を切断する。本発明により、非対称に切断する、すなわち、認識配列から一定距離でＤＮＡ基質を切断するタイプIIIまたはIV制限酵素の特質は、このＤＮＡ配列を知る必要なしに、標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズすることが可能な一定のサイズのプローブまたはプライマーを調製するために用いることができる。本発明の１の具体例において、増幅プライマーが調製され、所望により、ゲノムＤＮＡ試料から出発する大量のコピー数の増幅のための標準的ベクター配列由来のオリゴヌクレオチドと組み合わせて用いることができる。したがって、決められたサイズの増幅プライマーは、クローニング部位の両側に非対称に切断する制限酵素の認識配列を位置させることにより、増幅生成物のクローン化された断片の内部での消化を通して酵素的に生産できる。消化はクローン化された断片のＤＮＡ配列に依存せず、クローン化されたＤＮＡ断片の各部分が連結された元の増幅プライマーからなる切断生成物は、他のＤＮＡ試料からクローン化ＤＮＡ断片に対応する配列を増幅するために使用できる。このような増幅プライマーを生産する方法は、ここにより詳細に記載されるであろう。図１Ａ、パートＡを参照し、プラスミドベクターを所望の部位で切断し、非対称切断制限酵素の認識部位（図中では例示のためＧｓｕＩのための認識モチーフである）を含むオリゴヌクレオチドデュプレックスまたはリンカーを、各ベクター断片末端に結合する。両リンカーは、それら自身が連結するのを防ぐため５’ −りん酸基を欠く。制限断片末端へのリンカーの結合は制限部位を再び作らないので、時間がたつにつれ、より多くの制限末端がリンカー二量体で修飾される。生産されたベクターを、次いで、例えばゲル精製により、残存する環状ベクター分子から単離し、ＤＮＡ断片の分子クローニングに用いる。これは図１Ａ、パートＢに模式図に示し、これは、平滑末端ＡｌｕＩ切断ＤＮＡ断片をベクターに結合することによる組み換え分子の構築を示す。増幅プライマーを生産するため、リンカーオリゴヌクレオチド類の１に対応し、例えば、５’末端でビオチン保護したλエキソヌクレアーゼ消化に対して保護された５’−末端を持つ１個のプライマーを用い、個々のクローンを増幅する。得られた増幅精製物は、上記記載のごとくベクターに結合したオリゴヌクレオチド二量体を表すベクター由来の配列によって囲まれたクローン化ＡｌｕＩ断片中に存在する。図１ＡのパートＣを参照し、６−塩基モチーフ、５’ＣＴＧＧＡＧ３’は、ベクター中にクローン化されたインサートにただちに隣接し、制限酵素ＧｓｕＩの認識配列を表す。上記に述べたように、この酵素はＤＮＡ分子をこのモチーフから１６塩基下流で、ベクター中にクローン化された断片内部で切断する。この酵素での増幅精製物の消化後、得られた断片はゲル電気泳動で分離する。それにより増幅生成物の両末端由来の断片は定量化され、残存する未消化または部分的に消化された分子から単離される。最終的に、５’りん酸基を有するいずれのＤＮＡ鎖も酵素λエキソヌクレアーゼでの消化により除去され、一方、５ ’ビオチンを含む伸長生成物は、広い範囲のヌクレアーゼ濃度にわたりエキソヌクレアーゼに感受性でない。このようにして、リンカーライゲーションによりクローニングベクターに添加されたリンカー配列由来の５’末端部位およびベクターにクローン化されたインサートの末端由来の３’基からなる一本鎖増幅プライマーの対が得られる。例示された場合（図１Ａ，パートＣ）において、酵素ＧｓｕＩのための認識配列における最後の２個の位置を表す２つのヌクレオチド、ＡＧが、プライマー中のこれらの１６塩基のすぐ上流に位置する。これらの位置はクローン化された断片が由来するゲノムＤＮＡ中に存在することがまた公知である、なぜならこれらの断片は平滑末端を生じる制限酵素ＡｌｕＩ（図１Ａ，パートＣ）での消化に由来するからである。従って、酵素で合成されたプライマーのそれぞれ１つは、クローン化断片のそれぞれの側のゲノム配列に相補的な多数の（ここでは１８）塩基（３’末端塩基と２の５’末端塩基）、およびベクターに由来する多数の塩基を有する。上記の酵素的に合成されたプライマーは、図１Ｂ、パートＤに概略的に例示されるように、染色体ＤＮＡのＡｌｕＩ消化により得られた断片のＰＣＲ増幅のために用いることができる。第一に、該プライマーは、例えば５の増幅サイクルの数で用いられ、必要な場合には、酵素合成プライマーの比較的低い濃度を補う長いアニーリング時間を用いる。これらの第一のサイクルにおいて、望むＤＮＡ断片は、どちらかの末端をベクター配列に隣接して得られる。そこでもはや酵素的に合成されたプライマーを使用することは必要でないが、さらに断片が増幅して大量になることは、「標準的な」ベクター由来のプライマー、すなわちリンカープライマーの１つまたはその変種によって便利に行うことができる。上記方法の変法において、丁度互いに隣接するが、反対の向きに非対称に切断する酵素のための２の認識部位を含み、平滑に切断する制限酵素が丁度２つの部位のまさに間で切断するように、該酵素のための部位を一緒に含むクローニングベクターを調製した。これにより非対称に切断する酵素の２の認識部位を含むクローニングベクターが、部位の間の平滑切断に先立ち増幅されることと、自由なベクター末端の自己ライゲーションを防ぐためのホスファターゼ処理、非対称切断酵素によってひき続いて切断される標的ＤＮＡ配列の挿入およびライゲーションを可能とする。１の例として、２個の並んでいるが反対向きのＧｓｕＩ（またはＢｐｍＩ）部位が挙げられ、これらは制限酵素Ｅｃｌ１３６II(ニュー・イングランド・バイオラブズ，ユーエスエイ(New England Biolabs，U.S.A.))によって、それらの間で平滑に切断され得る。上記から明らかなように、本発明方法の工程は単純であり、平行して非常に多数の断片について容易に行え、大きな組の遺伝子マーカーの開発を可能とする。望むならば、成功したマーカーを配列決定し、通常の化学的合成のＰＣＲに基づくプライマーに変換できるが、酵素合成プライマーを用いて続けることもまた可能である。上記記載のごとく構築された酵素的合成増幅プライマーは、非常に特異的で感受性のある検出試薬を提供することができる。従って、本発明のもう１つの具体例において、ＰＣＲによる複雑な混合物中での個々の生物を検出するのに適当な増幅プライマーが、ＤＮＡ調製物を制限消化し、該断片を上記記載の特別のベクターにクローニングし、次いで個々のクローンを単離して所望の数の増幅プライマーの対を得ることによって得られる。これらの増幅プライマーは、かくして、単離された生物からのＤＮＡ試料の評価またはこれらからのＤＮＡ配列情報の必要無しに開発し、試験できる。同一標準プライマーで増幅可能なもう１つの断片の混入の危険を避けるため、標準プライマーの３’−位にリボースを含め、増幅生成物をアルカリ分解可能とするような用心がなされるべきである。同一ＤＮＡ断片を異なるリンカー、または「標準プライマー」にて２つの異なるベクターにクローン化することにより、いわゆるネステッド(nested)ＰＣＲを行うことができることが容易に分かる。これは、クローン化断片の内部に対して様々な距離で切断する酵素用の異なるフランキング領域を用いることにより可能となる。ネステッドＰＣＲにおいて、多数のサイクルを第一の組のプライマーで行い、その際、多数のサイクルを、第一の組のプライマーと内部でハイブリダイズする第二の組のプライマーで行う。これはＰＣＲプロセスの効率と選択性を増加させる。容易に理解されるように、合成プライマーの調製において、いずれかの残存する部分的に消化されたまたは未消化の増幅生成物から、非対称に切断する酵素での切断後に得られた、所望の末端の断片を単離することが必要である。なぜならば不完全な消化生成物は、酵素的に誘導されたプライマーを用いた場合、引き続いての増幅において誤った陽性を生起しかねないからである。上記調製法において、ゲル電気泳動を、所望の断片を単離するために用いる。しかしながら、分取用ゲル電気泳動は比較的厄介で、末端断片および不完全な消化生成物を適切には分析できない。所望の末端断片から離れた中央ピースを含む断片を除去する代替方法を、以下に記載する。中央セグメントが未知の配列構成であるという事実にもかかわらず、末端断片は、以下のような２の別々の反応においてクローン化断片を増幅することによって効率的に単離される：クローン化インサートの２の増幅のそれぞれにおいて、一方または他方の増幅プライマーをビオチン化し、これによって増幅分子が、例えばＷＯ９４／１１５２９に記載されたようなタイプのストレプトアビジン被覆コーム、または常磁性粒子のごとき固体支持体上で単離されることが可能となる。ＤＮＡ連結を含めた固定化の他の方法を用いることもできる。適当に洗浄した後、一方または他方の末端断片が、支持体から遠い末端に位置する非対称制限酵素部位を選択的に消化することによって、残りの増幅分子から放出される。この選択的消化は、クローン化インサートのそれぞれの側における２つの異なる非対称制限酵素部位、例えばタイプIV酵素の認識配列を持つベクターを用い、２の別々の反応において固定化され増幅された分子を切断することによってなすことができる。タイプIV制限酵素のこのような対の例はＧｓｕＩおよびＥｃｏ５７Ｉである。別法として、インサートの両側に単一の制限部位を有するベクターは、もしそれがタイプIV制限酵素の６塩基の認識配列の最初の２塩基に対応するプライマーの３’末端からの、例えば５−位または６−位においてベクターに対してミスマッチであるようにビオチン化増幅プライマーが設計されると使用できる。クローン化断片を増幅するプライマーの能力を保存したままで部位の一方または他の認識配列を破壊する他の配列変更ももちろん可能である。この戦略において、２の増幅生成物を、支持体上の固定化および制限切断前にプールすることができる。切断後、一本鎖プローブを得るために、放出された断片をλ−エキソヌクレアーゼで処理し、次いで酵素的増幅プライマーとして直接使用することができる。本発明の酵素的プライマー合成アプローチは、環状化可能なプローブを生産するためにも用いることができる。環状化可能なプローブ（いわゆる"padlock"プローブ）の調製および使用は、ランデグレン(Landegren)らの、サイエンス(Scie nce)265,2085-2088(1994)に記載されている。そのようなプローブは、リンカー配列に連結した２の標的相補的セグメントからなる。特異的な核酸分子の認識に際し、プローブの末端はリガーゼの作用により連結され、標的配列に連結した環状ＤＮＡを作り出す。これらのプローブは最小のバックグラウンドで高度に特異的な検出を提供する。本発明のもう一つの具体例により、そのような環状化可能なプローブは、ＤＮＡ配列を特別に設計されたベクターにクローニングすることによって調製でき、ベクターは次いでクローン化断片からのＤＮＡ配列情報の使用または特異的なオリゴヌクレオチドの使用なしに環状化可能なプローブとして使用できる。大量な組のこのようなクローンを、例えば、ｃＤＮＡ集団間の減法比較に対し平行して処理することができる。例えば、ライブラリーとライブラリーの比較は、所与の組織で発現される全ての遺伝子のライブラリーと、一方、環状一本鎖プラスミドライブラリー中にサブクローンされた、酵母人工染色体からのゲノムの特定の領域に位置する全ての配列のライブラリーとの間で行うことができる。これは、例えば、ある病気の遺伝子が、連鎖分析によって１の領域に位置決定されており、特定の組織で発現することが公知である場合に有用である。必要なベクターは、一方ではＧｓｕＩのごとき非対称に切断する酵素のための認識モチーフを、他方では、ＮｏｔＩのごとき近接する稀な制限部位を生じるように、オリゴヌクレオチドを、制限消化プラスミドに結合することによって調製できる。該ベクターを構築する１の方法は、２のオリゴヌクレオチド二量体を、２の制限酵素での消化によって生じた２つの異なる末端に挿入することによる。組換えプラスミドは、次いで、例えば、ＡｌｕＩ消化により生じた平滑末端ＤＮＡ断片をベクターに連結することによって作り出すことができる。得られた構築物は細菌に形質転換し、一本鎖組換え分子が生じる。これらの環状一本鎖分子は、次いで、図２に概略的に例示されるように、固相、例えば膜上のパッチ中に固定化される。プライマーをベクター分子にハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長し、非対称に切断する酵素の認識配列を二本鎖とし、インサートの切断を可能とする。分子の該酵素での消化後、伸長した分子の断片を変性洗浄により除去する。得られた固定化された環状化可能なプローブは、図２にも例示されるように、標的分子を捕捉するために用いることができる。この目的のために、上記のごとく調製された組換えクローンの集団を、一本鎖環状分子に変換する。指向的にクローン化されたｃＤＮＡ集団の比較のために、このライブラリーは、もちろん、上記構築物と反対の極性であるべきである。さらに、ベクターは、同じ、まれにしか切断しないカッター酵素部位を有してはならないし、少なくとも、認識配列を取り囲む配列と同じ極性であってはならない。これらの分子をいまや固定化プローブに暴露し、ライゲーションに続くストリンジェントな洗浄によって捕捉される。オリゴヌクレオチドを、次いで、捕獲物であるベクターの、まれにしか切断しないカッター部位の領域にアニールし、これらは、稀なカッター酵素での消化により直線化される。捕捉されたクローンは、変性洗浄によって放出され、修復され、分子クローニングのために細菌に形質転換する。上記記載のアプローチは、分子内反応（ライゲーション）に基づくので、多数のクローンを処理することができ、次いで同じ反応において捕獲のプローブとして適用できる。対照的に、例えば、ＰＣＲは、プライマー間の非特異的クロストークの問題による同じ反応において行われる少量の反応を可能にするにすぎない。以下において、本発明は非限定実施例によって例示されるであろう。実施例化学的オリゴヌクレオチド合成以下のオリゴデオキシヌクレオチドは、アプライド・バイオシステムズ(Appli ed Biosystems)３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（アプライド・バイオシステムズ・インコーポレイテッド，ユーエスエイ(Applied Biosystems Inc.，USA) 上で合成された。 -Bomnil: ５’ビオチン残基の付加により合成された上記のＯｍｎｉｌ（Ｏｍｎｉ１およびＯｍｎｉ２の配列において、制限酵素ＧｓｕＩの認識配列に下線が引かれている。）クローニンクベクタープライマーの構築プラスミドｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴＭ１３をＥｃｏＲＩで消化し、同じ反応において、オリゴヌクレオチド二量体Ｏｍｎｉ１およびＯｍｎｉ２を制限断片末端に結合した（図１Ａ，パートＡ）。２０ＵのＥｃｏＲＩを、１０ｍＭトリス −ＨＣｌ、ｐＨ７.５，１０ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭ酢酸カリウム、および５ｍＭＡＴＰを含有する終容量１０μｌ中の５μｇのプラスミドに添加した。３時間３７℃の後、２.５ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを、オリゴヌクレオチドＯｍｎｉ１およびＯｍｎｉ２と共にそれぞれ２５μＭにて添加した。反応を１４℃ で一晩放置した。添加したリンカーと直線化したベクター分子は、１.５％ＮｕＳｉｅｖｅＧＴＧアガロースゲル(ナルゲン(Nalgene))中で精製し、クローニングベクターとして用いた。Ａｌｕ−消化断片のクローニングと、陽性クローンのスクリーニングＸ染色体上に位置するヒト・アメリオゲニン(ameliogenin)遺伝子からのAlu-I 消化断片は、上記ベクターに結合され、E．coliの株ＤＨ５に導入された（図１Ａ、ートＢ）。個々の細菌クローンを、爪楊枝で、寒天プレートからエッペンドルフチューブ中の１００μｌの水へ移し、試料を５分間沸騰させ、次いで氷上で冷却した。細胞のデブリを短い遠心において沈澱させ、１μＬの上清を、１のプライマーＢＯｍｎｉ１の１μＭでの３０μＬのＰＣＲ中の鋳型源として用いた。１０μＬ量のＰＣＲ試料は、インサートが増幅プライマーへの合成のために用いられる前に、増幅生成物を定量し、サイズを決定するために、１.５％アガロースゲル中で分離された。特異的増幅プライマーの酵素的合成増幅プライマーを調製するために（図１Ａ，パートＣ）、ＢＯｍｎｉ１で増幅した２μｇのインサートを、２％ＮｕＳｉｅｖｅＧＴＧアガロース(ナルゲン(Nalgen))中で精製し、８ユニットのＧｓｕＩ(ファーメンタス，ビルニウス、リトアニア(Fermentas,Vilnius，Lithuania))で、、１５μｌの１００ｍＭＮａＣｌ、５０ＭＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７.９、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭジチオスレイトール、およびＢＳＡが０.１μｇ／μｌで、３時間３７℃ にて消化した。消化生成物を２％アガロースゲル中の電気泳動によって分離した。増幅生成物から酵素的消化によって放出された末端断片は、該物質が未消化物質に混入しないよう気を付けてゲルから単離した。単離された断片を、５’−リン酸基でＤＮＡ鎖を破壊するが、鎖を５’−位でビオチン残基で置換することによって、λエキソヌクレアーゼ(ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies))で処理した。反応は、約２００ｎｇの末端断片、５０ｎｇ／μｌＢＳＡ、２ユニットのλエキソヌクレアーゼ、６７ｍＭグリシン−ＫＯＨ、ｐＨ９.４、２.５ＭＭＭｇＣｌ₂を含む終容量１０ｍｌで１時間３７℃にて行った。ＤＮＡは５分間９４℃にて反応前にあらかじめ加熱した。残存する５’−ビオチン化ＤＮＡ鎖は、増幅プライマーとして用いられた。酵素−合成プライマーを用いた増幅酵素的に合成されたプライマーは、０.０５μＭの濃度にて、１μＭのオリゴヌクレオチドＯｍｎｉ１と、ヒト・ゲノミックＤＮＡ試料の増幅のために用いられた（図１Ｂ、パートＤ）。最初の５の増幅サイクルの、アニーリング時間は、正規の増幅プロトコルにより１０分間に設定された。融点は増幅プライマータの鋳型特異的３’−末端について公知でないのて、２の異なる増幅プログラムが各々のプライマー対について試みられた。完全な増幅プログラムは以下の通りである：９４℃にて１分間、４０℃または５５℃にて５−１５分間、そして７２℃にて１分間の５サイクルに続き、９４℃で１分間、５５℃で１分間、そして７２℃ にて１分間。図３のオートラジオグラフは、どちらも化学的に合成された１６塩基長のプライマー（Ａｍ１およびＡｍ２）を用いたレーン２およびレーン３の増幅反応（鋳型無し）の結果；Ｏｍｎｉ１と同一である５’末端にさらに２２塩基が付加した同じ１６塩基（Ａ１およびＡ２）を用いたレーン４およびレーン５の増幅反応（鋳型無し）の結果；プライマーを生じるために用いられるプラスミドクローンからのＢＯｍｎｉ１でのレーン６およびレーン７の増幅反応（鋳型無し）の結果；またはオリゴヌクレオチドＡ１およびＡ２の配列に同一であると見積もられる公知のＤＮＡ配列の２００塩基長のＡｌｕＩ断片のための酵素合成プライマーでのレーン８およびレーン９の増幅反応（鋳型無し）の結果のアガロースゲル電気泳動を図示する。レーン１および１０は１００ｂｐのラダーであり、オートラジオグラフから明らかなように、オリゴヌクレオチドの３の対は全て、ヒトのゲノミックＤＮＡ試料に適用された場合には、ほぼ同じサイズの増幅生成物を生じる。これはこれらのプライマーに対し期待されるサイズである。添加された鋳型ＤＮＡの非存在下で、増幅生成物は観察されず、このことは、増幅生成物は未消化のクローンインサートの混入のコピーを表すものはないことを断言する。ポリモルフィック配列の同定増幅プライマーＯｍｎｉ１は、³²Ｐで３７℃にて５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７.５，５０ｍＭＫＣｌ，１０ｍＭＭｇＣｌ₂，および０.５ＩＣＩ γ³²ＰＡＴＰ中、３０分間の反応でリン酸化された。プライマーはゲノミックＤＮＡ試料の増幅のために用いられ、これに続いて６％ポリアクリルアミド変性ゲル電気泳動による生成物の分離が行われた。増幅生成物間のサイズのばらつきはオートラジオグラフィーによって表された。

Claims

【特許請求の範囲】１．標的ＤＮＡ配列に関連するＤＮＡ断片を、非対称に切断する制限酵素の認識モチーフを含むヌクレオチド配列に結合するか連結させ、次いで該構築物を制限酵素に暴露して、それによりその標的関連ＤＮＡ断片部分内で構築物を切断する工程からなる、標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズ可能な核酸配列を、このＤＮＡ配列についての知識を必要とせずに調製する方法。２．該核酸配列を、直線化した環状ベクターのそれぞれの末端に連結し、該標的関連ＤＮＡ断片をベクターに挿入し連結し、所望により該ベクターを増幅し、該二のヌクレオチド配列および該ＤＮＡ断片の組立体を非対称に切断する酵素により該ＤＮＡ断片内で両端から切断することからなる請求項１記載の方法。３．二のヌクレオチド配列および該ＤＮＡ断片の組立体を、切断工程に先立って増幅させる工程からなる請求項２記載の方法。４．増幅が、該ヌクレオチド配列にハイブリダイズするプライマーを用いた酵素的増幅によって行われる請求項３記載の方法。５．該プライマーがその５’末端でλエキソヌクレアーゼ消化に対して、例えばビオチン化により保護され、増幅プロセスで得られた未保護鎖がλエキソヌクレアーゼ消化に付される請求項４記載の方法。６．非対称に切断する制限酵素の認識モチーフを含む該ヌクレオチド配列を、直線化した核酸プラスミドベクターの一端に連結し、該標的関連ＤＮＡ断片をベクターに挿入し結合させ、次いで、ベクターを該制限酵素によって該ＤＮＡ断片内で切断し、それによって環状化可能なプローブを形成することからなる請求項１記載の方法。７．さらに、制限酵素認識モチーフの近くの稀な認識部位を供することよりなる請求項６記載の方法。８．該切断後、所望のハイブリダイズするヌクレオチド配列または配列類を、ゲル精製、好ましくはゲル電気泳動によって単離する請求項１ないし７いずれか１項記載の方法。９．切断工程を行うに先立って、増幅断片を固体支持体に固定化する請求項３ないし８のいずれか１項記載の方法。１０．標的関連ＤＮＡ断片の各側の非対称切断酵素用の認識配列を供し、固体支持体に結合する２の増幅断片を得るための二の増幅反応を行い、次いで、支持体から離れた末端に位置する非対称酵素制限部位において各増幅断片を選択的に切断する請求項９記載の方法。１１．標的関連ＤＮＡ断片の各側に異なる非対称切断制限酵素部位を供し、二の別々の反応において、固定化された増幅断片を切断する請求項１０記載の方法。１２．標的ＤＮＡ配列に、このＤＮＡ配列の知識を必要とせずにハイブリダイズ可能な、公知の構造であるが部分的に未知の配列である核酸配列の調製のためのベクターであって、該ベクターが標的ＤＮＡ配列に関連するＤＮＡ断片挿入のための部位、および該挿入部位の一方側または両側の非対称切断制限酵素または酵素類のための認識配列からなることを特徴とする該ベクター。１３．該ＤＮＡ断片の挿入後、ベクターが一本鎖にされ、該非対称切断制限酵素での切断後に、環状化可能なプローブを形成できる請求項１２記載のベクター。１４．さらに、該認識配列の近くの稀な認識部位からなる請求項１３記載のベクター。１５．該部位に挿入される該ＤＮＡ断片を有し、所望により、膜のごとき固体支持体に固定化されてもよい請求項１３または１４記載のベクター。１６．伸長プライマーとして、請求項１ないし５いずれか１項により調製された酵素合成プライマーを使用することを特徴とする、ＤＮＡ断片のＤＮＡ配列の知識を必要とせずに、該ＤＮＡ断片を増幅させる方法。１７．該酵素合成プライマーにより第一の数の増幅サイクルを行い、次いで、直線化したベクター末端に連結した該ヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能な化学的合成プライマーにより第二の数の増幅サイクルを行うことよりなる請求項１６記載の方法。