JPH10508580A

JPH10508580A - Ｅおよびｐセレクチンに対するリガンドのオリゴ糖構造

Info

Publication number: JPH10508580A
Application number: JP8510934A
Authority: JP
Inventors: エルハマー，エイク・ピー; ゲン，ジェン−グオ
Original assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1994-09-20
Filing date: 1995-09-15
Publication date: 1998-08-25
Also published as: WO1996009309A1; AU3548695A; EP0783508A1

Abstract

(57)【要約】Ｅ-およびＰ-セレクチンに対する特異的リガンドを、コムギ麦芽アグルチニンアガロースおよびＥ-またはＰ-セレクチン rＩg-アガロースクロマトグラフィーの組合せによって、イン・ビボ(in vivo)[³Ｈ]-グルコサミン標識ＨＬ-６０細胞から単離した。精製分子上の合計Ｏ-結合オリゴ糖は、ＮaＢＨ₄存在下のアルカリ加水分解によって遊離させ、特異的エキソグリコシダーゼ消化と組み合わせたイオン-交換、サイズ-排除および濾紙クロマトグラフィーによって分析した。種々の誘導リガンドおよび炭水化物を特許請求する。

Description

【発明の詳細な説明】ＥおよびＰセレクチンに対するリガンドのオリゴ糖構造発明の分野本発明は、細胞接着生物学の分野、ＥおよびＰセレクチンならびにＥおよびＰセレクチンに対するリガンドのオリゴ糖構造に関する。情報開示Ｈemmerich,Ｓtefanら「Ｉdentification of the Ｓulfated Ｍonosaccharides of ＧlyＣＡＭ-１，an Ｅndothelial-Ｄerived Ｌigand for Ｌ-Ｓelectin.」(1 994)Ｂiochemistry，Ｖol.33，pp.4820-4829。Ｈemmerich,ＳtefanおよびＲosen，Ｓteven「6'-Ｓulfated Ｓailyl Ｌewis ｘＩs a Ｍajor Ｃapping Ｇroup of ＧlyＣＡＭ-１.」(1994)Ｂiochemistry，Ｖo l.33，pp.4830-4835。1994年4月19日に発行されたＬasky,Ｌaurence Ａ.ら米国特許第5,304,640号「ＤＮＡＳequence Ｅncoding a Ｓelectin Ｌigand.」。この特許は、可能性のあるセレクチンリガンドのＤＮＡ配列を特許請求している。オクラホマ州立大学に発行されたＬasky，Ｌaurence Ａ.ら,WO94/11498-A1号「Ｎew glycoprotein for Ｐ-selectin.」。この出願は、可能性のあるＰ-セレクチンリガンドの幾つかのアミノ酸および糖蛋白質の特徴付けを試みている。 1992年9月１日に発行されたＢrandleyら米国特許第5,143,712号；1993年5月18 日に発行された米国特許第5,211,936号；および1993年5月18日に発行された米国特許第5,211,937号「Ｍethod of Ｄetermining a Ｃite of Ｉnflammation Ｕti lizing ＥＬＡＭ-１Ｌigands.」。Ｖarki，Ａjit(1994)Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ,Ｖol.91，pp.7390-7397「Ｓelectin Ｌigands」。セレクチンリガンド文献を概説しており、クラスター化した糖パッチの認識に特異性が関与し得るという仮説を論じている。Ｉmai，Ｙら(1991)Ｊ.Ｃell.Ｂiol.113:1213。双方ともＬ-セレクチンリガンドと考えられている５０ｋＤ分子および９０ｋＤ分子のマウス腹膜間リンパ節からの沈殿。Ｌasky，Ｌ.Ａ.ら(1992)Ｃell 69：927。モレキュラークローニングは、「Ｇly ＣＡＭ-１」と呼称されている５０ｋＤ蛋白質がムチン様分子であることを示している。Ｂaumhueter,Ｓ.ら(1993)Ｓcience 262：436。Ｌ-セレクチンに対する９０ｋＤリガンドの蛋白質コアは血管シアロムチンＣＤ３４と同一である。Ｌevinovitz，Ａ.ら(1993)Ｊ.Ｃell.Ｂiol.121:449-459。Ｅ-セレクチン-ＩgＧキメラを用いて、Ｅ-セレクチンに対する１５０ｋＤ糖蛋白質リガンドをマウス好中球前駆細胞系統から単離した。Ｍoore，Ｋ.Ｌ.ら(1992)Ｊ.Ｃell.Ｂiol.118:445-456。Ｐ-セレクチンリガンドの部分的特徴付け。Ｌenter，Ｍ.ら(1994)Ｊ.Ｃell.Ｂiol.125：471。各々、Ｅ-およびＰ-セレクチンに対する単一特異性リガンドである１５０ｋＤおよび１６０ｋＤの２種の分子、ならびに、各々、Ｅ-およびＰ-セレクチンの双方と相互作用する２３０ｋＤおよび１３０ｋＤの分子量を有する２つの他の分子の部分的説明。Ｔiemeyerら(1991)Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ 88：1138。固相アッセイにおいてＥ-セレクチン・トランスフェクト細胞に対してリガンド活性を有する数種のミエロイド-由来糖脂質の精製。Ｌarsenら(1990)Ｃell 63：467。Ｌe^X決定基(Ｇalβ1,4(α1,3Ｆuc)ＧlcＮＡc )は、ミエロイド細胞上のＰ-セレクチンリガンドの重要な因子である。Ｐolleyら(1991)Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ 88：6224。Ｐ-セレクチンに対するリガンドは、Ｅ-セレクチンに対するものと同一または酷似し得る。Ｓakoら(1993)Ｃell 75：1179。Ｖarki，Ａ.(1994)Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ，91：7390。ＨＬ-６０リガンド上のオリゴ糖構造は、Ｅ-およびＰ-セレクチンに対するリガンドで先に報告されたＮ-アセチルラクトサミンの特徴を分有するが、ルイス型置換は欠失している。Ｓpringer，Ｇ.Ｆ.(1984)Ｓcience 224：1198；Ｓpringer，Ｇ.Ｆ.(1989)Ｍol .Ｉmmunol．26：１；Ｏrntoft，Ｔ.Ｆ.ら(1990)Ｉnt.Ｊ.Ｃancer 45：666。しばしばＴn(ＧalＮＡc)およびＴ(Ｇalβ1,3ＧalＮＡc)と呼称される２種の構造は、各々、多くのガン、例えば、腸ガンおよび乳ガンで見られる公知のガン抗原である。Ｅlhammerら(1993)Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.268：10029。 van Ｈalbeek，Ｈら(1982)Ｅur.Ｊ.Ｂiochem.127：7。Ａmano，Ｊ.ら(1991)Ｊ.Ｂiol.Ｃhem．266：11461。Ｈirano，Ｔら(1993)Ｅur.Ｊ.Ｂiochem．214：763。出典明示して本明細書の一部とみなす。発明の背景細胞認識における蛋白質-蛋白質相互作用はしばしば認識されていたが、細胞認識における炭水化物の役割についてはわずかに最近になって真剣に研究されているにすぎない(Ｂrandley，Ｂ.Ｋ.およびＳchnaar，Ｒ.Ｌ.(1986)Ｊ.Ｌeuk.Ｂi ol.40:97；Ｓharon，Ｎ.およびＬis，Ｈ.(1989)Ｓcience 246：227参照)。近年においては、炭水化物化学の領域の研究者の大部分の焦点は糖蛋白質である。糖蛋白質は、真核生物細胞によって合成される異なる集団の分子を構成する。これらの蛋白質の共通の特徴は、それらがすべて共有結合炭水化物基を含んでおり、そのサイズは１〜＞２５単糖類の範囲となり得ることである。オリゴ糖構造が糖蛋白質に結合する結合の２の共通型は、オリゴ糖構造がオリゴ糖上の還元Ｎ -アセチルグルコサミンと蛋白質上のアスパラギン残基との間のアミド結合によって結合したＮ-結合オリゴ糖、ならびにオリゴ糖上の還元Ｎ-アセチルガラクトサミンと蛋白質上のセリンまたはスレオニン残基との間のエーテル結合を介してコンジュゲートしたムチン型Ｏ-結合オリゴ糖において見出される。炭水化物基と蛋白質との間の他の型の結合は実際存在するが、これらは、この論議にほとんど関連しない。幾つかの特徴は、Ｎ-結合およびムチン型Ｏ-結合オリゴ糖によって分有される。幾つかの類似性とは：その要素単糖の大部分が同一であり；非形質転換哺乳動物細胞によって合成された場合、両方の型の構造が末端シアル酸を運搬し；両方の型の構造がシアリルルイス(Ｓialyl Ｌewis)^Xのごとき血液群型置換を運搬し得( 下記参照)；および、両方の型のオリゴ糖がポリ-Ｎ-アセチルラクトサミン反復構造を含み得るということである。文献においても示されているこれらの知見は、ある種のＮ-結合とムチン型Ｏ-結合オリゴ糖との間に機能重複が存在し得ることを示唆している(Ｆukuda，Ｍ.(1992)およびＯlden，Ｋ.，Ｙeo，Ｔ.-Ｋ.およびＹeo，Ｋ.-Ｔ.(1992)Ｇlycoconjugates，Ａllen，Ｈ.Ｊ.およびＫisailu，Ｅ. Ｃ.編，pp379-401および403-420，Ｍarcel Ｄekker Ｉnc.社，Ｎew Ｙork)。それとは反対に、Ｏ-結合オリゴ糖の幾つかの機能および特徴はＮ-結合構造のものとは異なり(Ｊentoft，Ｎ.(1990)Ｔrends.Ｂiochem.Ｓci.15：291)、２の型の構造の生合成経路は全く異なる(Ｋornfeld，Ｒ.およびＫornfeld，Ｓ.(1985) Ａnn.Ｒev.Ｂiochem．54：631；Ｓchachter，Ｈ.およびＢrockhausen，Ｉ.(1992 )Ｇlycoconjugates，Ａllen，Ｈ.Ｊ.およびＫisailu，Ｅ.Ｃ.編，pp.263-332，Ｍarcel Ｄekker Ｉnc.社，Ｎew Ｙork)。オリゴ糖はよく位置決定されていて、その細胞表面ロケーションおよび構造多様性に起因して認識分子として作用する。Ｏ-結合鎖は、この型の置換の「クラスター」を含有する細胞表面糖蛋白質がよく伸長した強固な構造を形成し得るという事実に鑑みると興味深い(Ｊentoft，Ｎ.(1990)Ｔrends.Ｂiochem.Ｓci.15： 291-294)。かくして、これらの分子は理想的に位置して認識機能を行う。まったく異なる多数のオリゴ糖構造が、限定された数のグリコシルトランスフェラーゼの活性を介して生成され得る。したがって、これらの構造は、比較的少数の遺伝子産物で生成され得、このことは、広範な細胞-細胞相互作用に指向のにする必要な情報を確立するもっともな機構を示唆している。相互作用細胞上の細胞表面炭水化物および予想炭水化物結合蛋白質、いわゆるレクチンの異なる発現の例はＤodd，Ｊ.およびＪessel，Ｔ.Ｍ.(1985)Ｊ.Ｎeurosci．5：3278；Ｒegan，Ｌ. Ｊ.ら(1986)Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ，83：2248；Ｃonstantine-Ｐaton ，Ｍ.ら(1986)Ｎature，324：159;およびＴiemeyer，Ｍ.ら(1989)Ｊ.Ｂiol.Ｃhe m.，263：1671に記載されている。動物レクチンは３つのグループ：Ｃ-型(Ｃa²⁺-依存性)レクチン、Ｓ-型(可溶性)レクチンおよびＰ-型レクチンに分けられる(Ｄrickamer，Ｋ.(1993)Ａnnu.Ｒ ev.Ｃell Ｂiol．9：237-264)。Ｃ-型レクチンの重要なグループはセレクチンである。セレクチンは炎症部位の白血球管外遊出において重要な機能を有する。白血球は、種々の微生物感染症ならびにガンのごとき疾患に対する身体の保護に関与している。しかしながら、白血球細胞が血管の管腔部位の内皮細胞に接着した場合、身体組織に移動し、そこに蓄積して、しばしば、障害、腫張、痛みおよび炎症を引き起こす。例えば、白血球細胞が接合部に侵入し、組織を攻撃する場合、リューマチ関節炎が起きる。白血球細胞上の幾つかの分子は内皮細胞表面上のその受容体を認識し、その血管壁を通して炎症部位への移動を許容すると考えられている。白血球および内皮細胞上のこれらの細胞表面分子は細胞接着受容体と呼称される。これらの細胞性受容体間の認識を遮断し得る場合には、炎症応答を減じ、または削除し得ると考えられる。種々の接着受容体が異なる時間に内皮細胞表面上に提示され、これは、異なる型の白血球細胞によって認識され得る。２また３以上の受容体が共に働いてこの仕事を行い得る可能性がある。幾つかの分子は、この様式で作用することがすでに知られている。血流から内皮細胞を通過して標的組織、例えば、傷害または感染の部位へ循環する白血球の補充および管外遊出は、炎症の初期応答で必須の工程である。これらのプロセスは、細胞表面接着分子の少なくとも３つのファミリー：インテグリン、イムノグロブリンスーパーファミリーおよびセレクチンによって開始する( Ｓpringer，Ｔ.Ａ.(1990)Ｎature 346：425；Ｈynes，Ｒ.Ｏ.およびＬander，Ａ .Ｄ.(1992)Ｃell 68：303)。セレクチンは、白血球-内皮細胞接着分子のファミリーであり、ＬＥＣ-ＣＡＭ： s(Ｌectin ＥＧＦＣomplement regulatory-Ｃell Ａdhesion Ｍolecule)とも呼称される(Ｉnflammation：Ｂasic Ｐrinciples and Ｃlinical Ｃorrelates，第２版，Ｊ.Ｉ.Ｇallinら編，Ｒaven Ｐress，Ｌtd社，ＮＹ 1992，pp407-419)。セレクチンとは、当該分野に従事する研究者によって好まれる言葉である(Ｂevi lacqua Ｍ.Ｐ.ら(1991)Ｃell 67:233)。セレクチンは、一般的に、生理学的および病理学的刺激の際の細静脈内皮細胞で白血球の「ローリング」と呼ばれる初期相互作用に最初に関与すると考えられている(Ｌawrence，Ｍ.Ｂ.およびＳ pringer，Ｔ.Ａ.(1990)，Ｃell 65:859-873)。白血球なる語には、好中球、好塩基性細胞、好酸球、単球およびＴ-細胞サブセットのごとき細胞が包含される( de Ｂruijne-Ａdmiraal，Ｌ.Ｇ.(1992)Ｂlood 80：34)。セレクチンファミリーは、現在のことろ、３つの細胞表面膜蛋白質よりなる( Ｌasky，Ｌ.Ａ.(1992)Ｓcience 258：964；ＭcＥver，Ｒ.Ｐ.(1991)Ｔhromb．Ｈ eamostasis 66：80)。Ｌ-セレクチンは、大部分の白血球において、リンパ球ホーミング受容体(a.k.a.末梢リンパ節ホーミング受容体(ｐｎＨＲ)を構造的に発現している。Ｌ-セレクチンは：ＬＥＣＡＭ-１、ＬＥＣ-ＣＡＭ-１、ＬＡＭ-１、ｇｐ９０ＭＥＬ、ｇｐ１００ＭＥＬ、ｇｐ１１０ＭＥＬ、ＭＥＬ-１４、ＭＥＬ- １４抗原、Ｌeu-8(抗原)、Ｌy-22(抗原)、ＴＱ１(抗原)およびＤＲＥＧ５６(抗原)としても知られているが、「Ｌ-セレクチン」なる語が好ましい。ＥＬＡＭ-１、ＬＥＣＡＭ-２およびＬＥＣ-ＣＡＭ-２としても知られているＥ-セレクチンは、好中球、単球およびメモリーＴ-細胞と相互作用する一過性サイトカイン-誘導性内皮細胞表面分子である。ＬＥＣ-ＣＡＭ-３、ＬＥＣＡＭ-３、ＣＤ-６２、ＧＭＰ-１４０およびＰＡＤＧＥＭとしても知られているＰ-セレクチンは、細胞性活性化および脱顆粒の間に内皮細胞および血小板の原形質膜上に迅速に発現され；それは好中球および単球に対する受容体として作用する。構造的には、すべてのセレクチンは、他のＣ-型レクチンに相同性のある１１８アミノ酸残基よりなるＮＨ₂-末端細胞外炭水化物認識ドメイン(ＣＲＤ)、つづいて、上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)様ドメイン、種々の数の補体調節蛋白質-様反復(異なるセレクチンについて異なる)、貫膜ドメインおよび細胞質テールを含む。機能的には、すべてのセレクチンは、反対側の細胞上のオリゴ糖リガンドに結合することによってＣａ²⁺-依存性細胞-細胞接触を媒介する。セレクチンは、その反対側の細胞の表面上に発現されている「セレクチンリガンド」と呼称されるもう１の糖蛋白質上のオリゴ糖構造と相互作用することが知られている。免疫沈降実験は、Ｌ-セレクチン-ＩｇＧキメラの構築物が、セレクチンリガンドを単離するのに用い得る化合物を提供することを示した。５０ｋＤ分子および９０ｋＤ分子は、双方ともＬ-セレクチンリガンドと考えられ、この型の化合物を用いたマウス腸間膜リンパ節から特異的に沈降した(Ｉmai，Ｙ.ら( 1991)Ｊ.Ｃell Ｂiol.113：1213)。モレキュラー・クローニングは、５０ｋＤ蛋白質がムチン様分子であることを示し、それを「ＧlyＣＡＭ-１」という(Ｌasky，Ｌ.Ａ.ら(1992)Ｃell 69：927)。９０ｋＤリガンドに対する最近の仕事により、この分子の蛋白質コアが血管シアロムチンＣＤ３４と同一であることが明らかとなった(Ｂaumheuter，Ｓ.ら(1993)Ｓcience 262：436)。リガンドは、また、Ｅ-セレクチンについて部分的に特徴付けられている。１５０ｋＤ糖蛋白質は、Ｅ-セレクチン-ＩｇＧキメラを用いて、マウス好中球前駆細胞系統から単離した(Ｌevinovitz，Ａ.ら(1993)Ｊ.Ｃell Ｂiol.121：449-459 、また、Ｂrandleyら，米国特許第5,143,712号、米国特許第5,211,936号および米国特許第5,211,937号特許も参照)。Ｐ-セレクチンリガンドは同様にして同定された。ヒト好中球からの１２０ｋＤ糖蛋白質は、¹²⁵Ｉ-Ｐ-セレクチン・ブロッティングアッセイ、および³Ｈ-グルコサミン標識ＨＬ-６０細胞抽出物のＰ- セレクチン・アフィニティークロマトグラフィーによって同定した(Ｍoore，Ｋ. Ｌ.ら(1992)Ｊ.Ｃell.Ｂiol.118:445-456)。加えて、Ｅ-およびＰ-セレクチンの両方に対するリガンドはマウスミエロイド細胞上で記載された。２種の分子、１５０ｋＤおよび１６０ｋＤは、各々、Ｅ- およびＰ-セレクチンに対して単一特異的リガンドであり、そのうえ、２３０ｋＤおよび１３０ｋＤの分子量を有する２つの他の分子も、各々、Ｅ-およびＰ-セレクチンの両方と相互作用する(Ｌenter,Ｍ.ら(1994)Ｊ.Ｃell Ｂiol.125：471) 。マンノース-6-ホスフェート(Ｍ６Ｐ)およびフルクトース-１-ホスフェートのごとき単純な単糖がネズミおよびヒトリンパ球と末梢リンパ節(ｐｌｎ)のＨＥＶとの相互作用を遮断し得るという知見(Ｓtoolmanら(1993)Ｊ.Ｃell Ｂiol.96：7 22；Ｓtoolmanら(1994)Ｊ.Ｃell Ｂiol.99：1535；Ｓtoolmanら(1987)Ｂlood 70 ：1842)は、Ｌ-セレクチンによって認識される内皮細胞リガンドが炭水化物-ベースであることを示唆している。さらに、一連の実験において、Ｒosenおよび彼の共同研究者らは、ｐｌｎＨＥＶに対するリンパ球のホーミング受容体-依存性の結合が、広スペクトルのシアリダーゼでのイン・ビトロ(in vitro)またはイン・ビボ(in vivo)のいずれかの処理によってなくなることを立証した(Ｒosenら (1985)Ｓcience 228：1005；Ｒosenら(1989)Ｊ.Ｉmmunol.142：1895)。このことは、末端のシアル酸が認識の重要な因子であることを強く示唆している。これらの研究者らは、また、Ｌ-セレクチンリガンド上のオリゴ糖構造が硫酸化されており、その硫酸化がセレクチン認識に重要であることを示唆するデータも示した (以下で比較)。幾つかの研究室は、広い範囲のアプローチを用いて、シアリルルイス^X(sＬe^x; ＮeuＡcα2,3Ｇalβ1,4(Ｆuc α1,3)ＧlcＮＡc)として知られている血液群オリゴ糖構造および幾つかの関連する構造が、Ｅ-セレクチンのリガンドとして機能し得ると結論した。Ｌｏweら，(1990)Ｃell 63:475は、α1,3/4-フコシルトランスフェラーゼで非-ミエロイド細胞をトランスフェクトし、sＬe^x決定基の発現と関連するＥ-セレクチンのリガンド活性を生成した。Ｇoeltzら(1990)Ｃell 63:1 349は、ミエロイド細胞におけるＥＬＡＭ-１リガンドの合成に関与しているようであるα１,３-フコシルトランスフェラーゼを同定し、クローン化した。より直接的なアプローチを用いてＰhillipsら，(1990)Ｓcience 250：1130、およびＷa lzら，(1990)Ｓcience 250：1132は、sＬe^X-含有糖コンジュゲートまたはsＬe^x に対する抗体のいずれかで、Ｅ-セレクチン依存性接着の阻害を示し得た。Ｔiemeyerら(1991)Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ 88：1138は、固相アッセイにおいて、Ｅ-セレクチン・トランスフェクト細胞に対してリガンド活性を有する幾つかのミエロイド-由来糖脂質を精製した。精製したＥ-セレクチン結合糖脂質の質量分析により、活性に必要な最小構造がＮ-アセチルグルコサミン(ＣＤ６５)上のα１,３-結合フコースを含有する第二の内部Ｎ-アセチルラクトサミン単位を有するシアリル化ラクトサミンであることを明らかにした。Ｔiemeyerは、sＬe^X置換を含む他の研究のように、シアル酸およびフコースの両方が予想リガンドの結合活性に必須であると結論した。他の研究者らは、Ｅ-セレクチンリガンドのＯ-結合オリゴ糖中にフコース、硫酸塩およびシアル酸が存在し、完全なリガンド活性にはシアル酸のようにそのフコースを要すると結論した(Ｌasky ら，米国特許第5,304,640号参照)。最後に、Ｈemmerichおよび共同研究者らは、最近、６-硫酸化sＬe^xがＬ-セレクチンリガンドＧlyＣＡＭ-１上の主要なキャッピング基であることを立証した(Ｈemmerich，Ｓ.ら(1994)Ｂiochemistry 33：48 20；Ｈemmerich，ＳおよびＲosen，Ｓ.Ｄ.(1994)Ｂiochemistry 33：4830)。Ｐ-セレクチンに対するリガンドの同定においても進歩があった。Ｐ-セレクチンに対するリガンドは、特に、両方のセレクチンが酷似したスペクトルの細胞型に結合するため、Ｅ-セレクチンに対するものと同一または酷似する可能性がある(Ｐolleyら(1991)Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ 88：6224)。セレクチン構造における顕著な相同性、ならびに、リガンドにおけるすでに立証された類似性は、これらの分子が、関連するが微妙に異なる構造を含むであろうことを示唆している。本明細書に引用した全ての刊行物および文献は出典明示して本明細書の一部とみなす。本発明者らは、その発明の１の態様において、Ｅおよび／またはＰ-セレクチンに対して共通のリガンドをここに単離し、そのリガンドのオリゴ糖部分を同定した。発明の概要本発明者らは、ＥおよびＰ-セレクチンに対する共通リガンド上のＯ-結合オリゴ糖の構造を報告する。この分子は、多数のＯ-結合オリゴ糖を含むが、Ｎ-結合オリゴ糖をほとんど含まない。Ｅおよび/またはＰ-セレクチンに対する他のリガンドについて報告された知見とは反対に、本発明者らは、本明細書で同定したリガンド上のＯ-結合オリゴ糖構造がＬe^X、Ｌe^a、sＬe^XまたはsＬe^a型置換を全く含んでいないことを見い出した。驚くべきことには、このリガンド上のＯ-結合オリゴ糖構造はほとんどまたはまったくフコースを有していない。本明細書に記載するリガンドもまた硫酸化オリゴ糖をほとんどまたはまったく含まない。かくして、本発明者らは、真にユニークなリガンドを記載する。本発明の１の目的は、セレクチンリガンドの精製方法を提供することである。本発明のもう１の目的は、精製セレクチンリガンド、特にはＥおよびＰ-セレクチンに対する共通リガンドを提供することである。本発明のさらなる目的は、このリガンド上のＯ-結合オリゴ糖構造を同定することである。もう１の態様は、天然では見い出すものがない、セレクチンリガンドのグリコシル化変形の調製を可能にすることである。もう１の態様において、本発明は、セレクチンリガンドの炭水化物ベースの決定基を模倣するセレクチンインヒビターの設計方法を提供する。本明細書中に論じる本発明のこれらのおよびさらなる目的は、この書類を勉強した後の当業者には明らかであろう。精製リガンドまたはそのフラグメント、ならびにリガンドの炭水化物およびポリペプチド要素、またはリガンドもしくはそのフラグメントに対する抗体は、Ｐ -またはＥ-セレクチンあるいはその両方の結合インヒビター、診断アッセイおよびキットとして使用し得る。本発明は、Ｅおよび／またはＰ-セレクチンに接着するこれらの単離分子、そのフラグメント、組合せおよび変形を包含する。Ｅおよび／またはＰ-セレクチンに接着するそれらの能力に加えて、それらのムチン型Ｏ-結合オリゴ糖に加えて、フコシル化Ｏ-結合オリゴ糖のそれらの欠失に加えて、Ｌe^xもしくは^aまたは sＬe^xもしくは^aのそれらの欠失に加えて、硫酸化オリゴ糖のそれらの欠失に加えて、単離リガンドは、以下の具体例によって一般に特徴付けることができ、それは、分離してか、または種々の組合せで、および遊離状態または基質に結合しているかのいずれかで生じ得る。 (１)単糖類ＧalＮＡc、 (２)二糖類Ｇalβ1,3ＧalＮＡc、 (３)Ｇal上の３で０または１のシアル酸で置換され、０または１のシアル酸がＧalＮＡcに結合した二糖類Ｇalβ1,3ＧalＮＡc、 (４)四糖類Ｇalβ1,4ＧlcＮＡcβ1,3/6Ｇalβ1,3ＧalＮＡc、 (５)１のシアル酸で置換され、該置換基が末端(非-還元)Ｇalの３-位にあるか、または還元ＧalＮＡcに結合しているかのいずれかである四糖類Ｇalβ1,4Ｇlc ＮＡcβ1,3/6Ｇalβ1,3ＧalＮＡc、 (６)２のシアル酸(１のシアル酸は末端(非還元)Ｇalの３-位にあり、もう１のシアル酸は還元ＧalＮＡcの６-位に結合している)で置換された四糖類Ｇalβ1,4 ＧlcＮＡcβ1,3/6Ｇalβ1,3ＧalＮＡc、 (７)末端(非還元)Ｇalの３-位または還元ＧalＮＡcのいずれかで１のシアル酸で置換された六糖類Ｇalβ1,4ＧlcＮＡcβ1,3/6Ｇalβ1,4ＧlcＮＡcβ1,3/6Ｇal β1,3ＧalＮＡc、 (８)２のシアル酸(１のシアル酸は末端(非還元)Ｇalの３-位にあり、もう１のシアル酸は還元ＧalＮＡcの６-位に結合している)で置換された六糖類Ｇalβ1,4 ＧlcＮＡcβ1,3/6Ｇalβ1,4ＧlcＮＡcβ1,3/6Ｇalβ1,3ＧalＮＡc、 (９)２のシアル酸(１のシアル酸は末端(非還元)Ｇalの３-位にあり、もう１のシアル酸は還元ＧalＮＡcに結合している)で置換された八糖類Ｇalβ1,4ＧlcＮＡcβ1,3/6Ｇalβ1,4ＧlcＮＡcβ1,3/6Ｇalβ1,4ＧlcＮＡcβ1,3/6Ｇalβ1,3Ｇa lＮＡc。図面の簡単な説明図１；ＱＡＥ-セファデックス(Ｓephadex)上でのＥ-およびＰ-セレクチンに対するＨＬ-６０共通リガンドから単離した標識Ｏ-結合オリゴ糖の分離。図２；サイズ-排除クロマトグラフィー上でのＥ-およびＰ-セレクチンに対するＨＬ-６０共通リガンドから単離したＯ-結合オリゴ糖の分離。図３；Ｅ-およびＰ-セレクチンに対するＨＬ-６０共通リガンドから単離した中性および電荷Ｏ-結合オリゴ糖のサイズ-排除分離。図４；Ｅ-およびＰ-セレクチンに対するＨＬ-６０共通リガンドから単離したＯ-結合１２.８ＧＵオリゴ糖の一連のエキソグリコシダーゼ消化。図５；Ｅ-およびＰ-セレクチンに対するＨＬ-６０共通リガンド上の１２.８ＧＵＯ-結合オリゴ糖のエキソグリコシダーゼ消化から得られた放射性フラグメントの分離。図６；Ｅ-およびＰ-セレクチンに対するＨＬ-６０共通リガンド上の３.５および２.５ＧＵＯ-結合オリゴ糖の同定。図７；Ｐ-およびＥ-セレクチンに対するほぼ１２０ｋＤリガンドの精製。本発明のさらなる説明および好ましい具体例、定義、略語および材料の供給源本発明と結合して用いる幾つかの標準的な略語には：ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン);ＤＥＡＥ(ジエチルアミノエチル)；ＤＭＳＯ(ジメチルスルフォキシド)；ＥＬＡＭ-１(内皮細胞/白血球接着分子-１)；ＮＡＮＡ(Ｎ-アセチルノイラミン酸)；ＴＦＡ(トリフルオロ酢酸)；トリス(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)が含まれる。他の略語：Ｃ-型(カルシウム-型);Ｇal(ガラクトース);ＧlcＮ(グルコサミン) ;ＧalＮ(ガラクトサミン)；ＧlcＮＡc(Ｎ-アセチルグルコサミン)；ＧalＮＡc( Ｎ-アセチルガラクトサミン)；Ｆuc(フコース)；Ｇal-６Ｓ(ガラクトース６- 硫酸)；ＧlcＮＡc-６Ｓ(Ｎ-アセチルグルコサミン６-硫酸)；ＧlcＵ-Ｓ(グルクロン酸モノ硫酸塩)；ＨＥＶ(高内皮細静脈)；ＨＰＡＥＣ(高-ｐＨアニオン-交換クロマトグラフィー)；Ｎ-アセチルラクトサミン。他の略語：Ｎeu５Ａc(Ｎ-アセチルノイラミン酸);ＳＡ(シアル酸);シアリルルイスＸまたはsＬe^X(Ｎeu5Ａcα２→３Ｇalβ1→４(Ｆucα１→３)ＧlcＮＡｃ)；ルイスＸまたはＬe^X(Ｇalβ１→４(Ｆucα１→３)ＧlcＮＡc)；ルイスａまたはＬe^a(Ｇalβ１→３(Ｆucα１→４)ＧlcＮＡc)；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ(ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動)。Ｌ-立体配置にあるフコース以外のすべての糖はＤ-立体配置にある。「リガンド」なる語は、適当な受容体に結合し得るいずれかのサイズまたは形態のいずれかの分子構造を説明するのに用いる。セレクチンに対する天然に発生するリガンドは、通常、該セレクチンと相互作用するオリゴ糖と共にポリペプチド骨格を有する。ここに、リガンドなる語は、所望の様式で作用し得、かつ所望の効果を有し得るいずれかの構造をいう。リガンドは、オリゴ糖部分のみを有し得る。より好ましくは、該リガンドは、天然または合成ポリペプチド、天然または合成ポリマー、非ペプチド有機化合物、無機化合物、基質、または他の適当な骨格物質よりなる骨格とともにオリゴ糖部分を有する。特に断らない限り、リガンドなる語の中にサイズ制限は本来存在しない。物質Ｄ-[６-³Ｈ]グルコサミン塩酸塩(３２Ci/mmol)はＡmersham Ｃorp.社から、Ｄ -[２-³Ｈ(Ｎ)]マンノース(２１.０Ci/mmol)はＮew Ｅngland Ｎuclear(NEN)社から購入した。コンカナバリンＡ-セファロースおよびＱＡＥ-セファデックスはＰ harmacia社から、バイオゲル(Ｂiogel)Ｐ-６はＢioＲad社から購入した。タチナタマメ β-ガラクトシダーゼおよびタチナタマメ β-Ｎ-アセチルグルコサミニダーゼはＳigma社から購入した。ザンソモーナス・マニホティス(Ｘanthomonas manihotis )のβ-ガラクトシダーゼはＮew Ｅngland Ｂiolabs社からのものである。アースロバクター・ウレアファシエンス(Ａrthrobacter ureafaciens)のノイラミニダーゼはＢoehringer社からのものである。アーモンド α-フコシダーゼはＯxford Ｇlycosystems社からのものである。Ｄulbecco修飾イーグル培地( ＤＭＥＭ)、熱不活化ウシ胎児血清(ＦＢＳ)、トリプシン、ペニシリンおよびストレプトマイシンはＧibco社からのものである。供給は特に断らない限り標準的な供給源からのものである。利用、組成物および投与本開示および本出願の請求の範囲に記載した化合物である炭水化物、オリゴ糖、蛋白質、リガンドおよびそれらのフラグメントは、ＥおよびＰ-セレクチンに対する結合および遮断活性を示す。この活性は、種々の血液関連疾患および障害の予防または治療において治療的価値を有する。特に、該化合物を用いれば、血小板白血球ロゼット形成および内皮細胞への白血球接着を阻害し得る。「白血球」なる語には、好中球、好塩基球、好酸球、単球およびＴ-細胞サブセットが包含される(de Ｂruijne-Ａdmiraal，Ｌ.Ｇ.，Ｂlood，vol.80.pp.134-142(1992年 8月)参照)。かくして、該化合物は、診断アッセイおよびキットの作製および使用に重要であって、その調製に用い得る。当該分野において公知である多くの方法を用いれば、血小板白血球ロゼット形成および白血球接着の阻害を立証し得、それ故に診断キットまたはアッセイを製造し得る。種々の疾病および障害もまた、本発明の化合物で治療または制御し得る。特に、本発明の具体例は：経皮経管冠動脈形成(ＰＴＣＡ)、心筋虚血、発作、血栓塞栓症、深静脈血栓症、血栓溶解の促進、心肺バイパスに関連する肺傷害後の再狭窄を包含する心血管疾患のごとき血液関連疾患；リューマチ関節炎、喘息、肺過敏感疾患、特に腎臓、心臓および肝臓器官の器官移植；(出血性および敗血性)ショック、多発性器官傷害症候群；熱傷害；自己免疫疾患、多発性硬化症；炎症性腸疾患；ならびに、一般的炎症、血管新生および(特に、乳房、腸および肺の転移ならびに神経芽腫のような)癌転移を包含する感染性疾患を治療するために該患者に投与し得る。オリゴ糖の機能は、それが結合する蛋白質とのコンジュゲートにおける以外は単独で考慮してはならない(Ｒademacherら，Ａnn.Ｒev.Ｂiochem.57，785-838(1 988)参照)。本発明の新規な剤は、したがって、例示的な以下の種々の可能性のある治療用途を有する：サイトカイン(例えば、ＴＮＦ、腫瘍壊死因子)が関与する毒性およびカヘキシー症候群の治療(例えば、悪性腫瘍、前-痙攣毒症、出血性ショック、肝臓疾患、呼吸器系苦痛症候群)。免疫抑制状態の化学療法(例えば、悪性腫瘍-関連免疫-抑制、医原性免疫-抑制(すなわち、薬物))。糖蛋白質(ＥＰ) または多価(ＥＰＣ)オリゴ糖の使用、例えば、移植片-対-宿主反応(移植)を患う患者の治療、宿主-対-移植片反応(移植)を患う患者の治療、ならびに、悪性疾患- 対-ＴＮＦの活性化の治療。さらに、本発明の化合物を用いれば、心臓弁およびジョイント移植(特に、臀部、膝部および一時的大腿)をコートして、白血球接着を阻害し得る。オリゴ糖でのこれらの装置のコーティングには、また、オリゴ糖がポリマーに導入され、ついで該装置に結合するポリマー調製物も含むであろう。炭水化物、オリゴ糖、蛋白質、リガンド、それらのフラグメントまたはそれらの処方を含む医薬組成物が本発明により提供される。本発明によるか、または本発明の請求の範囲によって記載される炭水化物構造を有する種々のリガンドのごとき本発明の化合物は、炎症を予防的に防ぐ、および／またはそれが始まった後にそれを回避するかのいずれかによって、それを要する対象に投与して、該対象を治療し得る。種々のデリバリーシステムが公知であり、該化合物の治療的デリバリーにそれを用い得る。該リガンドは好ましくは、医薬上許容される担体と一緒に投与し、該担体の性質は、例えば、通常固体担体を用いる経口投与および／またはＩＶ、液体溶液担体の投与の投与様式で異なる。投与方法には、限定するものではないが、静脈内経路が含まれる。一般に、成人ヒトに投与するオリゴ糖の量は、約０.１〜２０ｍｇ/ｋｇ、ｉ.ｖ.で４-１４日の範囲である。より好ましい範囲は、０.５〜２.５ｍｇ/ｋｇ投与量レベルであろう。当業者であれば、治療すべき疾患を容易に同定し、最適投与量をルーチン的に決定し得るであろう。選択の処方は、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンセルロースナトリウム、炭酸マグネシウム他を包含する種々の賦形剤を用いてなし得る。経口組成物は、溶液剤、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル剤、持放性処方または粉末剤の形態を採り得る。主題のリガンド分子は、ＤＭＳＯのごとき浸透エンハンサーを含む経皮処方で直接投与し得る。他の局所処方を投与して皮膚炎症を治療し得る。十分量のリガンド分子を投与して、炎症が予防し得るか、または緩和し得るかのいずれかとなり得るように、炎症を起こすまたは実際に起こしていると予想されるＥまたはＰ-セレクチンの実質部分に結合させ得る。かくして、本明細書で用いる「炎症を治療する」とは、炎症および／または炎症に関連する症状を予防し、または緩和することを意味しなければならない。典型的に、本発明の組成物は、１％未満〜約９５％の有効成分、好ましくは約１０％〜約５０％を含むであろう。投与頻度は、患者応答性をベースとした注意によって決定する。他の有効投与量は、確立した用量応答曲線の通常の試行を介して当業者によって容易に決定し得る。投与すべきＥまたはＰ-セレクチンリガンドの用量の決定においては、ＥまたはＰ-セレクチン受容体の全部を完全に遮断することを望むものがいないことを注意しなければならない。正常な治癒過程を進行させるためには、少なくとも幾つかの白血球細胞または好中球が、傷、感染または疾患状態を発生する領域における組織に運ばれなければならない。遮断剤として投与するＥまたはＰ-セレクチンの量は、患者の特定の要望に基づいて注意深く調整しなければならない一方、治療すべき疾患のタイプのごとき種々の因子を考慮しなければならない。本発明のリガンドまたは遮断剤を用いれば、リューマチ関節炎および多発性硬化症のごとき疾患を包含する広範な範囲の疾患を治療し得ると考えられる。本発明の組成物は、適用して、組織障害、腫張、炎症および／または苦痛を引き起こす範囲で組織中に蓄積する白血球細胞を発生する身体に対して免疫系が向けられるいずれの疾病状態も治療されなければならない。リューマチ関節炎の炎症は、例えば、多数の白血球細胞が疾患領域の接合部に迅速に入り、周辺の組織を攻撃した場合に発生する。本発明の処方を投与すれば、また、心臓発作から生じた組織障害の効果後の望ましくないものも予防し得る。心臓発作が発生して、抗凝固剤または血栓溶解剤 (例えば、ｔＰＡ)の適用によるごとき患者が回復した場合、血塊が形成される内皮細胞内層がしばしば障害を受ける。抗血栓剤が該血塊を除去した場合、酸素を奪う内皮細胞内層における該血塊および他の障害組織の下側の障害組織が活性化される。ついで、細胞が障害を受けてから数時間以内に、活性化内皮細胞はＥまたはＰ-セレクチンを発現する。ついで、セレクチンが血管に拡がり、そこでそれは白血球細胞表面上の糖蛋白質リガンド分子に接着する。多数の白血球細胞が迅速に捕獲され、活性化内皮細胞の領域を取り囲む組織に運ばれ、炎症、腫張および壊死を発生させ、それによって患者の生存の見込みが低下する。心臓発作から生じる障害を患う患者の治療に加えて、実際の身体的障害を患う患者を本発明の処方で治療して、身体の領域が重症の障害に付された後に通常生じる炎症および膨潤の量を緩和し得る。本発明の処方を用いて治療し得る他の疾病状態には、種々のタイプの関節炎および成人呼吸器系苦痛症候群が包含される。本発明の開示を読んだ後は、当業者であれば、本発明の処方の投与によって治療および／または緩和し得る他の疾患状態および／または症候群を認識するであろう。投与の他の様式は、本発明での使用も発見するであろう。例えば、本発明のリガンド分子は、坐薬中に、ある種の場合においてはエアゾールおよび鼻腔内組成物に処方化し得る。坐薬については、ビヒクル組成物には、ポリアルキレングリコールまたはグリセライドのごとき典型的な結合剤および担体が含まれるであろう。鼻腔内処方は、通常、鼻粘膜への刺激を引き起こさず、繊毛機能も重大に障害しない担体が包含されるであろう。水、生理食塩水または他の公知物質のごとき希釈剤を本発明と一緒に使用し得る。鼻腔処方には、限定するものではないが、クロロブタノールおよび塩化ベンザルコニウムのごとき保存料も含有し得る。界面活性剤を存在させて、鼻粘膜による主題の蛋白質の吸収を向上し得る。本発明のリガンド分子は、注射し得るものとして投与することもできる。典型的には、注射し得る組成物は、溶液または懸濁液；注射前にも調製し得る液体担体中の、溶液に適した固形形態として調製する。該調製物は、乳化するか、またはリポソーム担体中に有効成分をカプセル化することができる。糖脂質および炭水化物形態のリガンド、またはより詳細にはチャート１に記載した化合物は、和合性の医薬上許容し得る賦形剤と混合し得る。適当な担体は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノール他ならびにそれらの組合せである。加えて、所望により、該担体は、湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝化剤のごとき微量の補助物質を含有し得る。投与量形態のごときの実際の製法は公知であり、または、当業者に明らかであろう(Ｒemington's Ｐharmaceutical Ｓci ences，Ｍack Ｐublishing Ｃompany社，Ｅaston，ＰＡ，第１７版，1985年参照 )。投与すべき組成物または処方は、いずれの場合においても、治療すべき対象において望ましい状態を達成するに十分なリガンド分子の量を含むであろう。本発明の種々のリガンド化合物は、それ自体で、あるいは前記した医薬上許容される賦形剤物質と組合せて使用し得る。しかしながら、本発明のリガンド化合物は、本発明の化合物がある種の様式で標識に結合したコンジュゲートとして製造し得る。かかるコンジュゲートを形成することによって、本発明のリガンド化合物は、炎症部位を検出し得るような標識用の生化学的デリバリーシステムとして作用する。本発明のリガンド化合物は、研究室プローブとして用いて、試料中のＥまたはＰ-セレクチンの存在につき試験することもできる。かかるプローブは、好ましくは放射性標識のごときで標識される。本発明は、最も実践的かつ好ましい具体例が何であると考えられるかを本明細書で示し、記載する。しかしながら、本発明の範囲内から離れ得ることおよび明白な変形は、本開示を読めば当業者が気付くであろうことは理解される。発明の化合物ＥおよびＰ-セレクチンに結合するＯ-結合オリゴ糖を有する糖蛋白質形態のリガンドを開示する。より詳細には、本発明は、(ａ)Ｅおよび／またはＰ-セレクチンの存在を検出し、(ｂ)炎症領域をアッセイし、ならびに、(ｃ)Ｅおよび／またはＰ-セレクチンの効果を遮断することによって炎症を緩和するのに有用である、Ｅおよび／またはＰ-セレクチンに結合する炭水化物リガンド、ならびに、かかるリガンドを含有する組成物に関する。本発明らは、ＥおよびＰ-セレクチンが、ＨＬ-６０細胞から単離したムチン-様リガンド糖蛋白質上のオリゴ糖構造を認識することに加えて、正常ヒト白血球から単離され、本発明を展開する酷似蛋白質を見出した。ＥおよびＰ-セレクチンに関連する事象の生物鎖に結合する能力を有し、妨害し得るリガンド分子、ならびにＥおよび／またはＰ-セレクチンを開示する。該リガンド分子は、Ｅおよび／またはＰ-セレクチンに結合し、刺激された内皮細胞に循環する好中球が結合するのを妨害することによって生化学的遮断剤として作用し、それによって炎症応答の一次事象が予防される。該リガンドは、Ｏ-結合オリゴ糖の形態であり、それは標識し、抗-炎症薬剤に結合し、および／または処方化して、(１)Ｅおよび／またはＰ-セレクチンの存在につき試料をアッセイするのに有用な組成物、(２)患者における炎症部位を検出するのに有用な組成物、および(３)炎症を治療する(または特定の疾患の炎症症候を治療する)、あるいは(４)Ｅおよび／またはＰ-セレクチンと循環する好中球との相互作用に関与する他の効果を遮断するのに有用な医薬組成物を提供し得る。本発明の重要な態様は、Ｅおよび／またはＰ-セレクチン受容体と循環する好中球との相互作用から生じるいずれの望ましくない効果をも治療し、予防し、および／または緩和するのに有用な医薬組成物である。かかる組成物は、医薬上許容される賦形剤物質の形態の不活性成分、ならびにＥおよび／またはＰ-セレクチンに結合し得る化合物を含み、該化合物はチャート１に開示する一般構造式を有する。本発明の第一の目的は、有用な処方中のＥおよび／またはＰ-セレクチンリガンドを提供することである。もう１つの目的は、試料中のＥおよび／またはＰ-セレクチンの存在につきアッセイするのに使用し得るＥおよび／またはＰ-セレクチンリガンドを含む組成物を提供することである。もう１つの目的は、炎症を治療するのに有用なＥおよび／またはＰ-セレクチンリガンドを含有する医薬処方を提供することである。他の目的には、炎症を治療し、該炎症部位を検出する方法を提供することが含まれる。本発明の利点は、リガンドが、Ｅおよび／またはＰ-セレクチンに効率的に結合し、それによって、炎症および／または他の有害な効果を生じる多くの受容体に好中球が結合することを遮断する、非-毒性形態のオリゴ糖および／またはその誘導体および模倣物であることである。本発明の特徴は、該リガンドを標識し得、かつ該標識リガンドをアッセイに使用して試料中のＥおよび／またはＰ-セレクチンの存在を検出し得ることである。本発明の他の特徴には、過剰量の白血球の部位への結合によって特徴付けられる広範囲の疾患の炎症症候を緩和する本発明の医薬処方の能力が含まれる。本発明のこれらのおよび他の目的、利点および特徴は、以下に十分に記載する単離、構造、処方および慣習の詳細を読み、(記号等が分子基等を全体にわたって示す)本発明の一部を形成する添付図面および一般構造式に参照すれば、当業者に明らかになるであろう。本発明のＥおよび／またはＰ-セレクチンリガンド、オリゴ糖、蛋白質、ＤＮＡ、それらのフラグメントならびにかかるリガンドを含有する組成物、ならびにかかるものを単離し使用する方法を記載する前に、本発明が、記載する特定の組成物、方法またはプロセスそれ自体に限定されるものでないことは理解される。組成物および方法は、勿論、変動し得る。また、本明細書にて用いる用語が特定の具体例を説明するのみの目的であって、限定することを意図したものでないことも理解される。本明細書および添付する請求の範囲において使用する「ある種」および「該」を形成する冠詞には、文脈が特に明らかに示さなければ、複数の指示対象を包含することを注意しなければならない。かくして、例えば、「リガンド」に対する参照にはリガンドの混合物が含まれ、「Ｅおよび／またはＰ-セレクチンリガンド」に対する参照にはかかる分子の混合物に対する参照が含まれ、「処方」または「方法」に対する参照には本明細書に記載するタイプの１または２以上の処方、方法および／または工程が含まれ、および／または、このことは、本開示、本明細書に引用する参照、参照および記載した他の適当なものを読めば、当業者なら明らかになるであろう。全体像血管壁は、内皮細胞と共に内部的に並んでいる。内皮細胞は、細胞にＥおよび／またはＰ-セレクチンを発現させるように活性化し得る。赤血球および白血球は双方とも血管中を流動する。白血球は、リガンドが受容体、すなわち、セレクチンへ結合することを許容する化学および物理特性を有する炭水化物リガンドを示す。リガンドが受容体に結合したら、白血球細胞が血管壁を通って周辺組織に運ばれる。周辺組織に運ばれた白血球細胞は、疾病と戦うごときプラスの効果と、炎症のごときマイナスの効果とを有し得る。本発明者らは、白血球細胞の表面上の存在から離れてリガンドを単離し、特徴付けた。これらの単離リガンドは、それ自体でＥおよび／またはＰ-セレクチンに接着し、医薬組成物に処方化し得、これを投与した場合には、Ｅおよび／またはＰ-セレクチンを効果的に遮断し、白血球細胞へ結合する受容体の接着を阻害するであろう。医薬上有効な量のリガンドを投与することにより、全部ではないが幾分かの白血球細胞は周辺組織に到達しないであろう。白血球細胞が周辺組織に到達する速度を遅くすることによって、炎症を予防および／または緩和し得る。生じる急性炎症応答については、循環好中球が結合し、血管壁を侵入して傷害部位に接近しなければならないことが知られている。幾つかの分子がこの相互作用に関与しており、これには、予想炭水化物リガンドのファミリーおよびそれらの受容体、すなわち、セレクチンが含まれる。本発明は、かかるリガンドの単離および特徴付けを含む。本発明は、Ｅおよび／またはＰ-セレクチンに接着する単離分子、それらのフラグメント、組合せおよび変形を包含する。Ｅおよび／またはＰセレクチンに対して接着するそれらの能力に加えて、それらのムチンタイプＯ-結合オリゴ糖に加えて、フコシル化ｏ-結合オリゴ糖のそれらの欠失に加えて、Ｌe^xもしくは^aまたはＳＬｅ^xもしくは^aのそれらの欠失に加えて、硫酸化オリゴ糖のそれらの欠失に加えて、単離リガンドは、別々に、または種々の組合せのいずれかの以下の具体例： (１)単糖類ＧalＮＡc、 (２)二糖類Ｇalβ１,３ＧalＮＡc、 (３)ＧalＮＡcに結合したＧal上の３位にある０または１のシアル酸で置換された二糖類類βＧalβ1，3ＧalＮＡc、 (４)四糖類Ｇalβ1，4ＧlcＮＡcβ1，3/6Ｇalβ1，3ＧalＮＡｃ、 (５)末端(非還元)Ｇalの３-位にあるか、または、還元ＧalＮＡcに結合しているかの１のシアル酸で置換された四糖類Ｇalβ1，４ＧlcＮＡcβ1，3/6 Ｇalβ1，3ＧalＮＡc、 (６)２のシアル酸(そのうちの１のシアル酸は末端(非還元)の３位にあり、もう１のシアル酸は還元ＧalＮＡcに結合している)で置換された四糖類Ｇ alβ1，4ＧlcＮＡcβ1，3/6Ｇalβ1，3ＧalＮＡc、 (７)末端(非還元)Ｇalの３位にあるか、または、還元ＧalＮＡcに結合しているかの１のシアル酸で置換された六糖類Ｇalβ1，4ＧlcＮＡcβ1，3/6 Ｇalβ1，4ＧlcＮＡcβ1，3/6Ｇalβ1，3ＧalＮＡc、 (８)２のシアル酸(そのうちの１のシアル酸は末端(非還元)Ｇalの３- 位にあり、もう１のシアル酸は還元ＧalＮＡcに結合している)で置換された六糖類Ｇalβ1，4ＧlcＮＡcβ1，3/6Ｇalβ1，4ＧlcＮＡcβ1，3/6Ｇalβ1，3ＧalＮＡc、 (９)２のシアル酸(そのうちの１のシアル酸は末端(非還元)Ｇalの３- 位にあり、もう１のシアル酸は還元ＧalＮＡcに結合している)で置換された八糖類Ｇalβ1，4ＧlcＮＡcβ1，3/6Ｇalβ1，4ＧlcＮＡcβ1，3/6Ｇalβ1，4ＧlcＮＡcβ1，3/6Ｇalβ1，3ＧalＮＡc によって一般的に特徴付けられ得る。ＨＬ-６０細胞から単離したＥおよびＰ-セレクチンに対して共通のリガンドから回収したＯ-結合オリゴ糖構造も、チャート１に示して要約する。チャート１は、タイプＡ-Ｅと命名した５タイプの構造を要約している(チャート１には図示していない２のさらなるタイプの構造もリガンド上に存在し得、それらは、タイプＦおよびＧといい、「明らかな変形および好ましい化合物」と標した以下のセクションで論じる)。チャート１が、結合記号でスラッシュによって分離した２の数字を含む場合、それはこの結合が決定的に決定したものでないことを示し；幾つかの末端シアル酸の「±」は、この位がシアル酸とコンジュゲートし得るか、または、し得ないことを示している。これらの５タイプのオリゴ糖は、グルコース単位(ＧＵ)で、それの対応するサイズ(シアル酸なしの)によって示され得る。ＧＵとはサイズ指標である。１２. ８ＧＵオリゴ糖は、いずれかのグルコースも含む必要はなく、むしろ、１２.８単位を含有するグルコースオリゴマーとそれが同サイズであろう。かくして、チャート１は、一番上から一番下にかけて、最初は、示すごとく２のシアル酸残基を含有する１２.８ＧＵのサイズの１タイプのオリゴ糖を示しており、このオリゴ糖をタイプＡまたは１２.８ＧＵと命名する。チャート１において一番上から２番目は９.８ＧＵのサイズのオリゴ糖であり、これは、２の形態、すなわち、示す位置に１または２のシアル酸残基を含むものが存在し得、このオリゴ糖はタイプＢまたは９.８ＧＵと命名する。３番目は、示すごとく、０、(いずれかの位置に )１または２のシアル酸残基を含有する６.３ＧＵのサイズのオリゴ糖であり、タイプＣまたは６.３ＧＵと命名する。４番目は、０、１または２のシアル酸残基を有する３.５ＧＵのサイズのオリゴ糖であり、タイプＤまたは３.５ＧＵと命名する。ついで、５番目は、２.５ＧＵのサイズのシアル酸残基を有していないオリゴ糖であり、タイプＥまたは２.５ＧＵと命名する。グルコース単位、ＧＵで示したサイズはシアル酸を含まない。チャート１に示す各炭水化物についてのシアル酸残基の相対分布を表３に示す。１のシアル酸を運ぶ構造については、(末端ガラクトース上または還元Ｎ-アセチルガラクトサミン上の)オリゴ糖上のこの置換基の位置は決定していない。Ｇa lＮＡcそれ自体以外のすべてのオリゴ糖は、比較的にシンプルな設計の構造に基づくコア１である。１２.８、９.８および６.３ＧＵオリゴ糖は、Ｎ-アセチルラクトサミン反復単位の数およびシアル化パターンであるそれらの間の変動のみを有するすべて線状の非分岐ポリ-Ｎ-アセチルラクトサミン反復構造である。Ｅ-およびＰ-セレクチンに対するオリゴ糖リガンド上のルイス^Xまたはルイス^a タイプ-フコース置換を示唆する文献中の豊富なデータによると、これらのタイプの置換が、この分子から回収した構造に欠失しているようであることは注目に値する。幾つかの実験(そのすべては失敗した)が、ＨＬ-６０リガンドからのオリゴ糖上のフコースの存在を立証することを目的として行われた。 ³Ｈ-マンノースは該分子上の同定し得るオリゴ糖構造に取り込むことができず、該分子から単離した[³Ｈ]-グルコサミン標識オリゴ糖はα-フコシダーゼ消化に対して感受性でなかった。さらに、すべての構造は、β-ガラクトシダーゼおよびβ-Ｎ-アセチルグルコサミニダーゼでの別の消化によって完全に分解することができ、このことは、分岐フコースが存在しないことを示唆している。最後に、オーレリア・アウアランティア(Ａurelia auarantia)のレクチンに結合するか、または、それといずれかの他の方法で相互作用するリガンド分子からｏ-結合オリゴ糖は全く単離されなかった。このレクチンは、末端フコースを含むオリゴ糖を特異的に認識する。かくして、ＨＬ-６０リガンド上のＯ-結合オリゴ糖構造は、Ｅ-およびＰ-セレクチンに対するリガンドについて以前に報告したＮ-アセチルラクトサミン特徴を分有するが、ルイスタイプの置換基を欠失している(Ｖarki，Ａ.(1994)Ｐroc. Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ，91：7390)。より大きな(１２.８、９.８および６.３ＧＵ)構造の大部分は、再度、セレクチン結合についてのシアル酸の報告された要件と一致して、シアル化されている (表３)。しかしながら、ＧalＮＡc(２.５ＧＵ)が全く、および、ほぼ７５％のＧalβ1 ，3ＧalＮＡc(３.５ＧＵ)がいずれのシアル酸も含んでいないことは注意しなければならない。しばしば、各々、Ｔｎ(ＧalＮＡc)およびＴ(Ｇalβ1，3ＧalＮＡ c)と呼称されるこれらの２種の構造は、多くの癌、例えば、腸および乳癌で見られる公知の癌抗原である(Ｓpringer,Ｇ.Ｆ.(1984)Ｓcience 224：1198；Ｓpring er，Ｇ.Ｆ.(1989)Ｍol.Ｉmmunol.26：１；およびＯrntoft，Ｔ.Ｆ.ら(1990)Ｉnt .Ｊ.Ｃancer 45：666参照)。Ｅ-およびＰ-セレクチンに対するＨＬ-６０共通リガンド上のＯ-結合オリゴ糖上のシアル酸の分布の概要については、表３に示す。リガンドのすべての構造によって分有運されているさらなる特徴は、それらが非分岐であることである。前記したごとく、(ＧalＮＡcを除く)すべての構造は同一のコア、コア１に基づいており、還元Ｎ-アセチルガラクトサミンが２のシアル酸を含む構造上のシアル酸で恐らく置換されていることを除いては分岐が存在せず；１のシアル酸を含有するいずれかの構造上のシアル酸でこの位置を置換した場合は知られていない。非分岐の、ラクトサミンを含有するＯ-結合オリゴ糖は、哺乳動物においては比較的限定して分布するようである。Ｃomplex Ｃarbohydrate Ｄatabaseにおいて構造を合致させる検索により、６.３ＧＵオリゴ糖がヒト呼吸器外傷ムチンの種々の調製で以前に記載されている(van Ｈalbeek,Ｈら(1982)Ｅur.Ｊ.Ｂiochem .127：7；Ｌamblin，Ｇら(1984)Ｅur.Ｊ.Ｂiochem.143：227；Ｌamblin，Ｇ.ら( 1984)Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.259：9051；Ｂerg，Ｊ.ら(1987)Ｅur.Ｊ.Ｂiochem.168：5 7；Ｋlein，Ａら(1988)Ｅur.Ｊ.Ｂiochem.171：631；Ｌehrmitte，Ｍ.ら(1991) Ｇlycobiology 1：277；human salivary mucins，Ｋlein,Ａ.ら(1992)Ｂio-chem istry 31：6152；human seminal mucins，Ｈanish，Ｆ.Ｇ.ら(1986)Ｅur.Ｊ.Ｂi ochem.155：239；human meconium glycoproteins，Ｌawson，Ａ.Ｍ.ら(1991)Ｃa rbohydr.Ｒes.221：191；human milk β1,4galactosyltransferase，Ａmano，Ｊ .ら(1991)Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.226：11461；およびporcine zona pellucida，Ｈiran o，Ｔ.ら(1993)Ｅur.Ｊ.Ｂiochem.214：763)ことが明らかとなった。９.８ＧＵオリゴ糖は、human milk β1,4 galactosyltransferase，Ａmano，Ｊ.ら(1991)Ｊ.Ｂiol.Chem.266：11461；porcine zona pellucida，Ｈirano，Ｔ .ら(1993)Ｅur.Ｊ.Ｂiochem.214：763；Ｃollocalia mucin，Ｈanisch，Ｆ.Ｇ. およびＵhlenbruck，Ｇ.(1984)Ｈoppe-Ｓeyler's Ｚ.Ｐhysiol.Ｃhem.365:119；およびhuman leucocyte common antigen，Ｃhilds，Ｒ.Ａ.ら(1983)Ｂiochem.Ｂ iophys.Ｒes.Ｃommun.110：424に報告されている。１２.８ＧＵオリゴ糖の１のみの以前の記載は、porcine zona pellucida，Ｈi rano，Ｔ.ら(1993)Ｅur.Ｊ.Ｂiochem.214：763において見出された。幾つかの他の哺乳動物糖蛋白質上のこれらのオリゴ糖構造の異常な特徴の欠失および存在(前記参照)は、結合特異性および親和性がリガンド上の単一オリゴ糖を超えるものと関連し得ることを示している。チャート１に同定した２または３以上の炭水化物は、リガンド上に高親和性結合ドメインを協同的に生成し得る。本明細書に記載するリガンドは、ムチン様と記載し得る特徴を有し；それは広範囲にわたってＯ-グリコシル化されており；リガンド上には３またはより少ないＮ-結合オリゴ糖しか存在しない。Ｏ-結合オリゴ糖は強固なクラスターを形成するようである。該分子は、プロナーゼまたはトリプシンによる分解に対して非常に耐性である。結合「パッチ」のタイプを含む高親和性結合ドメインに関するさらなる事実は、以下の実験によって提供され、この実験では、固定化Ｅ-またはＰ-セレクチンに結合し得る単一オリゴ糖構造(群)または糖ペプチドフラグメント(群)を同定することができないことを示している。精製した、[³Ｈ]-グルコサミン標識リガンド分子のＥ-またはＰ-セレクチンカラムへの再-適用は、親和性マトリックスへのかなりの結合を生じた。トリプシンは、ある程度の結合活性を保有するフラグメントを生じた。同様にして、合計精製Ｏ-結合リガンドオリゴ糖、すなわち、全５の構造を一緒にＥ-セレクチンカラムに適用し、カラムから素通りした画分中に実質的に全部の適用した放射能が回収された。一まとめにすると、これらの結果は、より好ましいリガンドが単一オリゴ糖構造を超えるもの(おそらくはセレクチンとの高-親和性相互作用に要し得る特異的配置で示されている)を有するという観察と一致する。本明細書に引用した書類は出典明示して本明細書の一部とみなす。明白な変形および好ましい化合物前記の議論は、好中球が本明細書ではリガンドと呼称する表面分子を有し、そのリガンドが、本明細書ではＥ-またはＰ-セレクチンと呼称する受容体である内皮細胞表面上の受容体分子に対して高親和性を有し、それに結合することを立証している。リガントとして作用する抽出したより大きな分子はそのように作用する。なぜならば、それは、ＥまたはＰ-セレクチンに対する接着に要する分子の特定の点に特定の分子立体配置を有するからである。本明細書の実験は、最初に、ＥまたはＰ-セレクチンに対して接着する分子群を単離し、特徴付け、その後に、これらの分子のオリゴ糖構造を詳細に同定し、特徴付けた。チャート１に開示する一般構造式には、ＥまたはＰ-セレクチン受容体に接着し得る単離化合物の特徴的な特徴を含む多数の化合物が包含される。構造の変形も可能であるが、但し、それらの変形は、ＥまたはＰ-セレクチンへのリガンドの接着を妨害するであろう構造および／または電荷-関連特徴を変化させるものであってはならない。かくして、その最も広い意味において、本発明は、チャート１、および以下に論じるタイプＦおよびＧに開示する分子のみならず、その同等物をも包含し、その同等物は、Ｅおよび／またはＰ-セレクチンに接着するチャート１の分子と同等またはそれより大きな程度でＥおよび／またはＰ-セレクチンに接着する親和性および能力を有する。もちろん、かかるさらなる分子の特徴は、本明細書に記載する接着アッセイおよび／または制御された脱着力条件下でＥおよび／またはＰ-セレクチンに対する予想リガンドの接着を試験する関連アッセイを用いて確認し得る。抽出され、および／または合成し得る他のかかる分子は、患者のＥおよび／またはＰ-セレクチン受容体を少なくともある程度で遮断し、かくして、ＥまたはＰ-セレクチンの表面上のセレクチンリガンドの接着が阻害され、それによってかかる好中球が結局起こす有害な応答(例えば、炎症)が回避されるように、患者に直接使用し、および／または処方化し、デリバリーし得る。前記で論じ、チャート１、タイプＡ-Ｅに示す５タイプのオリゴ糖が存在する。これらの５タイプに加えて、より少量の少なくとも２の他の僅かに異なるタイプのオリゴ糖、タイプＦおよびＧが存在し得る。ここで、チャート１および図４に参照して、１２.８および９.８ＧＵオリゴ糖からの１１.８および８.８ＧＵ分解産物のβ-Ｎ-アセチルグルコサミニダーゼ消化の際に、各々、１１.８ＧＵおよび８.８ＧＵピーク中の全放射能は溶出容量におけるシフトを示しておらず、したがって、２のピーク(９.８および１２.８ＧＵ)はさらなる構造を含有している可能性がある。これらの２のピークはタイプＦおよびＧオリゴ糖を表す。タイプＦおよびＧオリゴ糖はタイプＢまたはＡとしての同分布のシアル酸を有し、それらは同サイズで、それらはフコースおよび硫酸塩を全く含有していない(タイプ-Ａ-１２.８ＧＵはタイプＧに相当し、タイプＢ-９.８ＧＵはタイプＦと同サイズである)。リガンド分子上の５または７タイプの各オリゴ糖の１コピーは、リガンド上の合計炭水化物を表すことを意図するものではない。リガンドのムチン様特徴は、それが多数のオリゴ糖構造を含有することを示唆している。同様なリガンド分子(クローン化されたもの)は、ｏ-グリコシド的グリコシル化用の５３の予想部位を含有している(Ｓakoら,(1993)Ｃell 75：1179; Ｅlhammerら，(1993)Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.268：10029)。したがって、５または７のオリゴ糖がリガンド分子上に２以上のコピーで存在し、セレクチンによって認識される特徴はいずれかの数の異なるタイプの構造のいずれかの組合せを含み得るようである。リガンドが受容体、ＥまたはＰ-セレクチンと結合した場合、それは選択された組合せの炭水化物を用いて結合する。ある種の組合せが確かに必要であり、その範囲は１〜７タイプのオリゴ糖(群)、好ましくは５タイプＡ〜Ｅとし得る。数種の他の哺乳動物糖蛋白質における異常な特徴の欠失およびこれらのオリゴ糖構造の存在は、結合特異性および親和性を付与する特徴がリガンド上の単一オリゴ糖と関連せず、むしろ２以上の構造が高親和性結合ドメインを協同的に作成し得ることを示唆している。セレクチンリガンドに関する最近の概説においてＶarkiは、セレクチンとそのリガンドとのこのタイプの相互作用が最もありそうであると結論しており；また、彼は、現在に至って簡単に記載されてきたある種のリガンド分子のムチン様特徴がいかにしてこのタイプの結合「パッチ」に適応し得たかも記載している(Ｖark i,Ａ.(1994)Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ：7390)。本明細書に記載するリガンドは、ムチン様として記載し得る特徴(それが広範囲にわたってＯ-グリコシル化されていること；該分子に顕著な量のＮ-結合オリゴ糖も存在すること)を有する。Ｏ-結合オリゴ糖は、強固なクラスターを形成するようであり、該分子はプロナーゼまたはトリプシンによる分解に対して非常に耐性である。特異的オリゴ糖リガンド構造の例をこれにより提供する。本発明のある種の具体例において、予想リガンドのいずれかの数および１〜３、より好ましくは２のいずれかの数および組合せて組合せた、７タイプ(Ａ-Ｇ) 、好ましくは５タイプ(Ａ-Ｅ)のオリゴ糖の１のみ、２のみまたは３のみのいずれかの組合せ(タイプＡ-Ｅのみをチャート１に示す)が存在する。また、記載し、特許請求するのは、オリゴ糖組合せがそれ自体でいずれかの数の回数反復する多価形態である。例えば、予想リガンドに対して、１〜３のいずれかの数および組合せで、７タイプ(Ａ-Ｇ)のオリゴ糖の７のうちの１のみが存在する場合の具体例が考えられる。３の可能な組合せで、いずれかの数の回数反復する７タイプのオリゴ糖のうちの１のみが存在するであろう。これにより、３のみ×７または２１の可能性( Ａ、ＡＡ、ＡＡＡ、Ｂ、ＢＢ、ＢＢＢ、Ｃ他)が許容される。より好ましくは、２の可能な組合せで５タイプのみのうちの１が具体化するであろう。これにより、５のみの可能性(ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＥＥ)が許容されるであろう。なおより好ましくは、２のみの可能な組合せで、恐らくいずれかの数の回数反復する５タイプのオリゴ糖のうちの２のみが存在する具体例である。この具体例により、予想リガンドについて１５のみのユニークな可能性(ＡＡ、ＡＢ、ＡＣ、ＡＤ、ＡＥ、ＢＢ、ＢＣ、ＢＤ、ＢＥ、ＣＣ、ＣＤ、ＣＥ、ＤＤ、ＤＥ、ＥＥ ) が許容される。オリゴ糖の順序も重要となり得る。１の具体例は、いずれかの数の回数反復する、３のユニークな可能な組合せで７の可能なオリゴ糖のうちの３を許容するであろう。これにより、７×(７×７) または３４３の可能性が許容されるであろう。これらの可能性のいくつかをここに示す。ＡＡＡ、ＡＡＢ、ＡＡＣ、ＡＡＤ、ＡＡＥ、ＡＡＦ、ＡＡＧ、ＡＢＡ、ＡＢＢ、ＡＢＣ、ＡＢＤ、ＡＢＥ、ＡＢＦ、ＡＢＧ、ＡＣＡ、ＡＣＢ、ＡＣＣ、ＡＣＤ、ＡＣＥ、ＡＣＦ、ＡＣＧ、ＡＤＡ、ＡＤＢ、ＡＤＣ、ＡＤＤ、ＡＤＥ、ＡＤＦ、ＡＤＧ、ＡＥＡ、ＡＥＢ、ＡＥＣ、ＡＥＤ、ＡＥＥ、ＡＥＦ、ＡＥＧ、ＡＦＡ、ＡＦＢ、ＡＦＣ、ＡＦＤ、ＡＦＥ、ＡＦＦ、ＡＦＧ、ＡＧＡ、ＡＧＢ、ＡＧＣ、ＡＧＤ、ＡＧＥ、ＡＧＦ、ＡＧＧ、ＢＡＡ、ＢＡＢ、ＢＡＣ、ＢＡＤ、ＢＡＥ、ＢＡＦ、ＢＡＧ、ＢＢＡ、ＢＢＢ、ＢＢＣ、ＢＢＤ、ＢＢＥ、ＢＢＦ、ＢＢＧ、ＢＣＡ、ＢＣＢ、ＢＣＣ、ＢＣＤ、ＢＣＥ、ＢＣＦ、ＢＣＧ、ＢＤＡ、ＢＤＢ、ＢＤＣ、ＢＤＤ、ＢＤＥ、ＢＤＦ、ＢＤＧ、ＢＥＡ、ＢＥＢ、ＢＥＣ、ＢＥＤ、ＢＥＥ、ＢＥＦ、ＢＥＧ、ＢＦＡ、ＢＦＢ、ＢＦＣ、ＢＦＤ、ＢＦＥ、ＢＦＦ、ＢＦＧ、ＢＧＡ、ＢＧＢ、ＢＧＣ、ＢＧＤ、ＢＧＥ、ＢＧＦ、ＢＧＧ、このシリーズはすべての可能なタイプ、すなわち、ＣＡＡ...ＣＣＣ...ＣＧＧ他；ＤＡＡ...ＤＤＤ...ＤＧＧ他；ＥＡＡ...ＥＥＥ...ＥＧＧ他；ＦＡＡ...ＦＦＦ...ＦＧＧ他；ＧＡＡ...ＧＧＧ...ＧＧＧ他に連続している。３の組合せシリーズは、タイプＡ-ＦにわたってタイプＡ-Ｅが好ましい。化合物の調製および分析方法分析方法代謝的標識、リガンド分子の単離ならびに放射標識オリゴ糖および糖ペプチドの調製ＨＬ-６０細胞は、ノーマルＲＰＭＩ培地において４８時間、³Ｈ-グルコサミン(５０μＣi/ｍl)で標識した。Ｐ-セレクチンリガンドの調製Ｐ-セレクチン・アフィニティーカラム(Ａffi-Ｇel 15樹脂１０ｍl上にカップリングした精製ヒト血小板Ｐ-セレクチン１０ｍｇ)およびウシ血清アルブミンでガードしたカラムは、Ｍaら(1994)Ｊ.Ｂiol.Ｃhem．269，27739-27746によって記載されているごとく調製した。標識細胞は、Ｍooreら((1992)Ｊ.Ｃell Ｂiol. 118，445-456)によって記載されているごとく洗剤で溶解し、その細胞溶解物を、ＣaＣl₂存在下でＢＳＡガードカラムを通したＰ-セレクチン・アフィニティーカラムに適用した。ＰＢＳ５０ｍl、ｐＨ７.４、１ｍＭＣaＣl₂、０.０１％Ｂri j-35および０.０２％ＮaＮ₃で洗浄した後、Ｍaら((1994)Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.印刷中 )によって記載されているごとく、結合物質を１０ｍＭＥＤＴＡを含有する同緩衝液で溶出した。リガンド分子の純度は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ上でルーチン的に測定し；該精製調製物は１のみの放射性蛋白質バンドを含有していた(図７)。ついで、ＷesselおよびＦlugge，(1984)Ａnal.Ｂiochem．138：141によって記載されている方法を用いて、精製放射標識分子を沈殿させて塩および洗剤を除去し、実質的にＣarlson ，(1968)Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.24：616によって記載されているごとく温和なアルカリ性ホウ水素化ナトリウム処理によってＯ-結合オリゴ糖を遊離させた。(ＳＤＳ- ＰＡＧＥによって測定した)沈殿工程におけるリガンド分子の回収率は、不変動で＞９０％であった。遊離したオリゴ糖構造は、分析前にＳepＰak Ｃ₁₈カートリッジ上で精製した。５５℃にて４時間、１００ｍＭＴris-ＨＣl、ｐＨ８.０、２０ｍＭＣaＣl₂ 中のプロナーゼ(２ｍｇ/ｍl)で消化することによって、糖ペプチドを無傷の精製放射標識リガンド分子から調製した。図７．Ｐ-およびＥ-セレクチンに対する〜１２０ｋＤリガンドの精製 [³Ｈ]ＧlcＮＡcで標識したＨＬ-６０細胞をＴriton Ｘ-100で溶解し、Ｃａ²⁺ 存在下にてＰ-セレクチン・アフィニーカラムまたはＥ-セレクチン受容体-グロブリン・アフィニティーカラムに別々に負荷した。よく洗浄した後、結合物質をＥＤＴＡで溶出し、(還元条件下の)７％ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、つづいてオートラジオグラフィーに付した。レーン１、Ｐ-セレクチン・アフィニティーカラムからの溶出物；レーン２、Ｅ-セレクチン受容体-グロブリン・アフィニティーカラムからの溶出物。酵素処理アースロバクター・ウレアファシエンス(Ａrthrobacter ureafaciens)のノイラミニダーゼ(２Ｕ/ｍl)での消化は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５ .０中で１８時間行い；タチナタマメ β-ガラクトシダーゼ(４００ｍＵ/ｍl)は５０ｍＭクエン酸-リン酸、ｐＨ４.６中で４８時間；タチナタマメ β-Ｎ-アセチルグルコサミニダーゼ(４.１５ｍＵ/ｍl)は５０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５.６中で１８時間；ザンソモーナス・マニホーティス(Ｘanthomonas manihot is )のβ-ガラクトシダーゼ(167Ｕ/ｍl)は５０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ４. ５中で１８時間；アーモンド α-フコシダーゼ(０.２ｍＵ/ｍl)は５０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５.０中で１８時間行った。すべての酵素消化は、トルエン大気下３７℃で行った。カラムクロマトグラフィーＱＡＥ-セファデックス上のイオン-交換クロマトグラフィーは、実質的にＶar ki，Ａ.およびＫornfeld，Ｓ.(1983)Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.258，2808-2818によって記載されているごとく行った。電荷オリゴ糖は、２ｍＭＴris塩基中の上昇する濃度のＮaＣlでステップ-ワイズ溶出し；１.５ｍl画分を採取し；カラムベッド容量は１ｍlであった。アースロバクター・ウレアファシエンス(Ａrthrobacter ur eafaciens )のノイラミニダーゼでの消化によってシアル酸を除去した。サイズ排除クロマトグラフィーおよび脱シアル化オリゴ糖の一連のエキソグリコシダーゼ消化は、Ｂiogel Ｐ-４タイプのカラム(Ｇlycan Ｓizing Ｃolumn，Ｏxford Ｇlycosystems社)およびＨigh-Ｒesolution Ｐrogram(３０μl/分で３６６分につづき２３４分にわたって２００μl/分まで線形上昇する)を用いたＧlycoＭap Ｃhromatograph上で行い；２滴の画分(ほぼ９０μl)を採取した。濾紙クロマトグラフィー合計放射性アミノ糖組成を決定するため、試料を６ＮＨＣＬ中、１００℃にて４時間加水分解(強酸加水分解)し、再-アセチル化し、Ｃummings，Ｒ.Ｄ.およびＫornfeld，Ｓ.(1982)Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.257，11230-11234によって記載されているごとくホウ酸を浸透させたペーパー上で分離した。中性糖(マンノースおよびフコース)組成は、酢酸エチル-ピリジン-水(８：２：１)中で１６時間下降型濾紙クロマトグラフィー上で³Ｈ-マンノース標識オリゴ糖加水分解物(２Ｍトリフルオロ酢酸、１００℃にて４時間)を分離することによって測定した。小さな放射性オリゴ糖は、ピリジン-酢酸エチル-氷酢酸-水(５:５:１:３)中の下降型濾紙クロマトグラフィー上で１９-２０時間分離した。シアル酸は、酢酸イソアミル-氷酢酸-水(３：３：１)中の下降型濾紙クロマトグラフィー上で２０時間分離した。好ましい具体例の調製Ｅ-およびＰ-セレクチンに対するＨＬ-６０リガンド上のオリゴ糖構造の特徴付け放射性単糖(アミノ糖)の分離は、ＨＬ-６０リガンド分子上の合計オリゴ糖構造の強酸加水分解からホウ酸濾紙クロマトグラフィーによって得られ、大部分の放射能はＧalＮＡc標準と共-移動し、ＧalＮＡc:ＧlcＮＡc比はほぼ１.８：１となった。プロナーゼでの無傷[³Ｈ]-グルコサミン標識分子の消化によって調製した糖ペプチドは、コンカナバリンＡ-セファロース上で分離した。これは、実質的に全部の適用した放射能をカラムから素通りする画分に溶出し、顕著な量の放射能をハプテン糖、α-メチルマンノシドおよびα-メチルグルコシドによって溶出し、このことは、リガンド分子がいずれの高-マンノース、ハイブリッドまたは二-触覚(antennary)複合体タイプのオリゴ糖も含んでいないことを示唆している。リガンド分子上のＮ-結合グリカンの部分的特徴付けからの結果は、これらの構造が、外側鎖を含有する多量のポリ-Ｎ-アセチルラクトサミンとの複数接触複合体が優勢であり；これらの構造の大部分がコア-フコシル化されていることを示唆している。合計Ｏ-結合オリゴ糖は、温和なアルカリ性ホウ水素化ナトリウム処理によって精製[³Ｈ]-グルコサミン標識リガンド分子から切断した。ついで、遊離したオリゴ糖をＱＡＥ-セファデックス上で分画し、電荷構造をステップ-ワイズで上昇するＮａＣl濃度で溶出した(図１および表１)。図１．ＱＡＥ-セファデックス上での、Ｅ-およびＰ-セレクチンに対するＨＬ- ６０共通リガンドから単離した標識Ｏ-結合オリゴ糖の分離Ｏ-結合オリゴ糖構造の電荷分離総計Ｏ-結合オリゴ糖は、精製イン・ビボ[³Ｈ]-グルコサミン標識共通リガンドまたはＥおよびＰ-セレクチンから単離し、ＱＡＥ-セファデックス上で分画した。中性ならびに１および２個のオリゴ糖を含有するオリゴ糖は、各々、カラム素通り画分中ならびに２０および７０ｍＭＮａＣlで溶出された。カラム上に負荷した放射能のほぼ１２％は、イオン-交換マトリックスと相互作用せず、素通り画分に回収された。残りの放射能は１および２の電荷を有する画分に各々溶出された(表１および図２参照)。ＱＡＥクロマトグラフィーからの電荷および中性画分中の放射能の分布における幾分かの変動が、異なるリガンド調製物において認められた。対照実験は、１４０ｍＭＮａＣlで溶出された小ピーク中の放射能が部分的に７０ｍＭＮａＣl溶出物中の後期溶出画分の一部分を、および部分的に(糖)ペプチドフラグメントを表すことを示している。アースロバクター・ウレアファシエンス(Ａrthrobacter ureafaciens)のノイラミニダーゼで消化後の電荷画分の再クロマトグラフィーは、ＱＡＥ-セファデックスカラム素通り画分中に溶出される電荷画分および１の電荷を有する物質を含有する画分に溶出される残りの部分(７０ｍＭおよび２０ｍＭ溶出物について各々２４％および２５％)の両方に大部分の放射能を生じた。これらのノイラミニダーゼ耐性の電荷画分中の放射性物質は、濾紙クロマトグラフィーによって同定した。１または２のいずれかの電荷を有する構造を含有する画分からのノイラミニダーゼ耐性放射能は、遊離シアル酸としてクロマトグラフィーに付したものの９５％を超える放射能を含有していた。このことは、ノイラミニダーゼ消化が試料中のオリゴ糖からシアル酸を完全に除去し、ノイラミニダーゼ処理後にその電荷を保持する放射能が遊離シアル酸のみを表すことを意味している(表１参照)。Ｏ- 結合オリゴ糖構造の電荷分離は、Ｅ-およびＰ-セレクチンに対するＨＬ６０共通リガンドから単離した。Ｏ-結合オリゴ糖構造のサイズ排除クロマトグラフィーノイラミニダーゼ消化オリゴ糖を、続いてサイズ-排除クロマトグラフィーによって分離した。図２は、分子上のＯ-結合オリゴ糖の完全な混合物の分離を示している。糖の混合物は、各々、１２.８、９.８、６.３、３.５および２.５グルコース単離(ＧＵ)よりなるオリゴマーの位置に溶出する５のピークに分離された。表２は、クロマトグラム上の５のピーク中の放射能の分布を示している。また、この表には、分子上のオリゴ糖構造の最終特徴付けに基づく、各構造中のアミノ糖の数および分子上の個々のオリゴ糖の分布(合計オリゴ糖の％)も含まれる。図３は、各々、０、１および２の電荷を含有する構造部分のサイズ分離を示す (表３、図２および図３参照)。図２．Ｅ-およびＰ-セレクチンに対するＨＬ-６０共通リガンドから単離したＯ-結合オリゴ糖のサイズ排除クロマトグラフィー上での分離合計Ｏ-結合オリゴ糖を精製イン・ビボ(in vivo)[³Ｈ]-グルコサミン標識Ｅ/ Ｐ-セレクチンリガンドから単離し、シアル酸をノイラミニダーゼ消化によって除去し、得られた中性オリゴ糖をＧlycoＭapカラム上で分離した。クロマトグラム上の５の放射能ピーク(右側から左側)は、各々、１２.８、９.８、６.３、３. ５および２.５単位より構成されるグルコースオリゴマーに対応する溶出容量を有する。図３．Ｅ-およびＰ-セレクチンに対するＨＬ-６０共通リガンドから単離した中性および電荷Ｏ-結合オリゴ糖のサイズ-排除分離ＨＬ-６０リガンドからの合計[³Ｈ]-グルコサミン標識Ｏ-結合オリゴ糖を図１記載するごとくＱＡＥ-セファデックス上で分画した。ノイラミニダーゼ消化によって電荷オリゴ糖からシアル酸を除去した後に、中性オリゴ糖(パネルＡ)ならびに１(パネルＢ)および２のシアル酸(パネルＣ)を含有するオリゴ糖をＧlyco- Ｍapカラム上で別々に分画した。測定可能な量の放射能を含有するクロマトグラム部分のみを図に示す。単離オリゴ糖の構造決定ＨＬ-６０リガンドから単離したオリゴ糖の構造を決定するために、３のより大きなピーク(１２.８、９.８および６.３ＧＵ)を一連のエキソグリコシダーゼ消化およびＧlycＭap上の再クロマトグラフィーに付した。図４は最も大きな(１２.８ＧＵ)オリゴ糖の一連の分解を示す。最初に、この構造をタチナタマメ β-ガラクトシダーゼおよびタチナタマメ β-Ｎ-アセチルグルコサミニダーゼで順次消化すると；これは、各々、溶出容量において１および２のＧＵシフトを生じた。２ＧＵ放射性消化産物は、β-Ｎ-アセチルグルコサミニダーゼ消化によって遊離した。これらは、１の末端Ｎ-アセチルラクトサミン単位の除去につき、予想された結果であった(図４、最上パネル)。遊離した放射能は、濾紙クロマトグラフィーによってＮ-アセチルグルコサミンと同定された。これらの２の消化からの産物は、９.８ＧＵに溶出された(図４、最上パネル )。図４から明らかなごとく、１２.８ＧＵオリゴ糖の最初のβ-Ｎ-アセチルグルコサミニダーゼ消化はこのピーク中のすべての放射性物質を消化せず；幾分かの放射能は消化後の１１.８ＧＵにも溶出された(図４、最上パネル)。かくして、１２.８ＧＵピークはさらなるオリゴ糖構造を含んでいるようである。図４．Ｅ-およびＰ-セレクチンに対するＨＬ-６０共通リガンドから単離したＯ-結合１２.８ＧＵオリゴ糖の一連のエキソグリコシダーゼ消化ＨＬ-６０リガンド上の合計Ｏ-結合オリゴ糖の画分から単離した１２.８ＧＵオリゴ糖(図２参照)を、「実験方法」に記載するごとく、一連のエキソグリコシダーゼ消化およびＧlycoＭapカラム上の再クロマトグラフィーに付した。グルコースオリゴマー標準の溶出位置は、クロマトグラムの上部に矢印で示し；数字は個々の標準分子のサイズ(ＧＵでの)を同定している。鍵は、非消化分子について、ならびにタチナタマメ β-Ｎ-アセチルグルコサミニダーゼおよびタチナタマメβ- ガラクトシダーゼでの消化からの産物について得られた溶出特性を同定している。Ｅ、溶出容量(ｍl)；Ｒ、放射能９.８ＧＵピーク中の放射能の分解は、タチナタマメまたはエス・ニューモニエ (Ｓ.pneumoniae)β-ガラクトシダーゼでの消化によって開始した。このことは、ピーク中の放射能の５０-７５％(この数字は異なる調製物で変動する)につき、溶出容量中に１のＧＵシフトを生じた。残りの２５-５０％の放射能はβ-ガラクトシダーゼ消化に対して耐性で、これは再度、９.８ＧＵピークがさらなるオリゴ糖(群)を含むことを示唆している。これらの構造の完全なエキソグリコシダーゼ消化に十分な量の[³Ｈ]-グルコサミン標識１２.８および９.８ＧＵオリゴ糖を個別に得ることが困難なことに起因して、１２.８ＧＵオリゴ糖(前記参照)の部分消化からの９.８ＧＵ産物を、連続したエキソグリコシダーゼ分解の前に９.８ＧＵオリゴ糖(前記参照)からの８.８ＧＵ β-ガラクトシダーゼ消化産物と一緒にプールした。プールした構造の一連のエキソグリコシダーゼ消化を図４、中位および下位パネルに示す。タチナタマメ β-ガラクトシダーゼに続くタチナタマメ β-Ｎ-アセチルグルコサミニダーゼでの２連続サイクルの消化は、両方の消化サイクルについて、各々、１および２のグルコース単位の溶出容量におけるシフトを生じた(図４)。 β-Ｎ-アセチルグルコサミニダーゼ消化により遊離された２のＧＵフラグメントおよび最後の３.５ＧＵ消化産物は、各々、濾紙クロマトグラフィー上でＮ-アセチルグルコサミンおよびＧalβl，3ＧalＮＡc-olと同定された(図５、パネルＡおよびＢ；クロマトグラフィー標準は：１、Ｇalβ1，3ＧalＮＡc-olおよび２、ＧalＮＡc-ol)。図５．Ｅ-およびＰ-セレクチンに対するＨＬ-６０共通リガンド上の１２.８ＧＵＯ-結合オリゴ糖のエキソグリコシダーゼ消化から得た放射能フラグメントの分離１２.８ＧＵオリゴ糖のエキソグリコシダーゼ消化によって生成した２および３.５ＧＵフラグメントを、ピリジン-酢酸エチル-氷酢酸-水(５:５:１:３)中の下降型濾紙クロマトグラフィー上で分離した。パネルＡおよびＢは、各々、２および３.５ＧＵエキソグリコシダーゼ消化フラグメントの分離を示す。標準は１、Ｇalβ1，3ＧalＮＡc-ol；２、ＧalＮＡc-olであった。タチナタマメ β-ガラクトシダーゼでの６.３ＧＵオリゴ糖の消化がカラム上の溶出容量における１のＧＵシフトを生じたことは、１の末端ガラクトースの除去を示していた。ザンソモーナス・マニホーティス(Ｘanthomonas manihotis)の β-ガラクトシダーゼでの６.３ＧＵオリゴ糖の消化が溶出容量におけるシフトを生じなかったことは、この構造上の末端ガラクトースがＮ-アセチルグルコサミンに１,４結合していることを示唆していた。タチナタマメ β-Ｎ-アセチルグルコサミニダーゼでの(タチナタマメ β-ガラクトシダーゼ消化産物の)続く消化がさらに２のＧＵシフトを生成することは、１のＮ-アセチルグルコサミンの除去を示唆しており；この消化から遊離された放射能は２のＧＵで溶出され、濾紙クロマトグラフィー上でＮ-アセチルグルコサミンと同定された。再度、残りの(６.３ＧＵオリゴ糖の)３.５ＧＵフラグメントは、濾紙クロマトグラフィー上の分離によって、Ｇalβ1，3ＧalＮＡc-olと同定された。リガンド分子上の２のより小さなＯ-結合構造を濾紙クロマトグラフィー上で同定した。３.５ＧＵオリゴ糖はＧalβ1，3ＧalＮＡc-ol標準と共-移動し、タチナタマメおよびウシ精巣β-ガラクトシダーゼでのこの構造の消化につづく濾紙上の再クロマトグラフィーによって、この標準とその同一が明らかにされた。最後に、２.５ＧＵ構造が濾紙クロマトグラフィー上でＧalＮＡc-olと共-移動することは、同一構造を示唆している(図６、各々、パネルＡおよびＢ；クロマトグラフィー標準は：１、Ｇalβ1，3ＧalＮＡc-olおよび２、ＧalＮＡc-ol)。ＧalＮＡc、およびリガンド上のＧalβ1，3ＧalＮＡcの重要な部分がいずれのシアル酸も含まないことは注目に値する。したがって、ＨＬ-６０リガンド分子はＴおよびＴｎ抗原の両方を運んでいる。図６．Ｅ-およびＰ-セレクチンに対するＨＬ-６０共通リガンド上の３.５および２.５ＧＵＯ-結合オリゴ糖の同定。ＨＬ-６０リガンド上の合計Ｏ-結合オリゴ糖の分画から単離した３.５および２.５ＧＵ構造(図２参照)を、ピリジン-酢酸エチル-氷酢酸-水(５：５：１：３)中の下降型濾紙クロマトグラフィーに付した。パネルＡおよびＢは、各々、２.５および３.５ＧＵオリゴ糖の分離を示している。標準は１、Ｇalβ1，3ＧalＮＡc-ol；２、ＧalＮＡc-olであった。[Ｆ] 可能性のあるフコース分岐の分析文献中の膨大な量のデータが、セレクチンを有するＨＬ-６０細胞から単離したリガンド分子を含むＥ-およびＰ-セレクチンに対するリガンドの間の相互作用が、リガンドオリゴ糖上の外側(Ｌewisタイプの)フコース分岐の存在に依存することを示唆しているため、本発明者らは、このタイプの置換を検出することを特に目的とした実験を行った。ＨＬ-６０リガンドから単離した無傷１２.８、９.８および６.３ＧＵオリゴ糖をアーモンドα-フコシダーゼで個別に消化したが；これは、３のオリゴ糖のいずれかについての溶出容量におけるシフトを生じ得なかった。加えて、本発明者らは、リガンドを単離する前に[³Ｈ]-マンノースでＨＬ-６０細胞をイン・ビボ( in vivo)標識することによって、いずれのマンノースまたはフコース結合放射能もＯ-結合リガンドオリゴ糖に導入できなかった。

【手続補正書】【提出日】１９９７年４月１６日【補正内容】補正した請求の範囲１．ＥおよびＰ-セレクチンの両方に結合し、かつ、ＮおよびＯ-結合オリゴ糖を含み、そのオリゴ糖の大部分はＯ-結合である実質的に純粋なリガンド。２．２％未満のＬe^X、Ｌe^a、sＬe^XまたはsＬe^aタイプの置換を含むことを特徴とする請求項１記載の実質的に純粋なリガンド。３．Ｌe^X、Ｌe^a、sＬe^XまたはsＬe^aタイプの置換を実質的に含まないことを特徴とする請求項２記載の実質的に純粋なリガンド。４．当該リガンド上のｏ-結合オリゴ糖が２％未満のフコースを含むことを特徴とする請求項１記載の実質的に純粋なリガンド。５．当該リガンド上のｏ-結合オリゴ糖がフコースを実質的に含まないことを特徴とする請求項４記載の実質的に純粋なリガンド。６．２％未満の硫酸化オリゴ糖を含むことを特徴とする請求項１記載の実質的に純粋なリガンド。７．硫酸化オリゴ糖を実質的に含まないことを特徴とする請求項６記載の実質的に純粋なリガンド。８．イン・ビボ(in vivo)³Ｈ-グルコサミン標識分子上で、ＧalＮＡc：ＧlcＮＡcに関連する放射能の比が約１.８：１であることを特徴とする請求項１記載の実質的に純粋なリガンド。９．当該リガンドのｏ-結合オリゴ糖構造が、シアル酸置換を含まない分岐を全く示さないことを特徴とする請求項１記載の実質的に純粋なリガンド。１０．該リガンドがａ）２％未満のＬe^X、Ｌe^a、sＬe^XまたはsＬe^aタイプの置換、およびｂ）２％未満の硫酸化オリゴ糖を含み、かつ、ｃ）当該リガンド上のｏ-結合オリゴ糖が２％未満のフコースを含むことを特徴とする請求項１記載の実質的に純粋なリガンド。１１．イン・ビボ(in vivo)³Ｈ-グルコサミン標識分子上で、ＧalＮＡc：ＧlcＮＡcに関連する放射能の比が約１.８：１であることを特徴とする請求項１０記載の実質的に純粋なリガンド。１２．当該リガンドのオリゴ糖構造が、シアル酸置換を含まない分岐を示さないことを特徴とする請求項１１記載の実質的に純粋なリガンド。１３．該リガンドがａ）Ｌe^X、Ｌe^a、sＬe^XまたはsＬe^aタイプの置換を実質的に含まず、ｂ）フコシル化ｏ-結合オリゴ糖を実質的に含まず、かつ、ｃ）硫酸化オリゴ糖を実質的に含まないことを特徴とする請求項１２記載の実質的に純粋なリガンド。１４．７の同一タイプのオリゴ糖を包含する、チャート１に示すタイプＡ-Ｅの５タイプのうちの複数のオリゴ糖を含むことを特徴とする請求項１３記載の実質的に純粋なリガンド。１５．６の同一タイプのオリゴ糖を包含する、チャート１に示すタイプＡ-Ｅのうちいずれか５タイプのうちの複数のオリゴ糖を含むことを特徴とする請求項１４記載の実質的に純粋なリガンド。１６．５の同一タイプのオリゴ糖を包含する、チャート１に示すタイプＡ-Ｅのうちのいずれか５タイプのうちの複数のオリゴ糖を含むことを特徴とする請求項１５記載の実質的に純粋なリガンド。１７．４の同一タイプのオリゴ糖を包含する、チャート１に示すタイプＡ-Ｅのうちのいずれか４タイプのうちの複数のオリゴ糖を含むことを特徴とする請求項１６記載の実質的に純粋なリガンド。１８．３の同一タイプのオリゴ糖を包含する、チャート１に示すタイプＡ-Ｅのいずれか３タイプのうちの複数のオリゴ糖を含むことを特徴とする請求項１７記載の実質的に純粋なリガンド。１９．２の同一タイプのオリゴ糖を包含する、チャート１に示すタイプＡ-Ｅのうちのいずれか２タイプのうちの複数のオリゴ糖を含むことを特徴とする請求項１８記載の実質的に純粋なリガンド。２０．タイプＡ-Ｅのうちのいずれか１タイプのうちの複数のオリゴ糖を含むことを特徴とする請求項１９記載の実質的に純粋なリガンド。２１．以下のオリゴ糖：を含むことを特徴とする請求項１２記載の実質的に純粋なリガンド。２２．以下のオリゴ糖：を含むことを特徴とする請求項１２記載の実質的に純粋なリガンド。２３．以下のオリゴ糖：を含むことを特徴とする請求項１２記載の実質的に純粋なリガンド。２４．以下のオリゴ糖：を含むことを特徴とする請求項１２記載の実質的に純粋なリガンド。２５．以下のオリゴ糖：を含むことを特徴とする請求項１２記載の実質的に純粋なリガンド。２６．いずれかの組合せで、チャート１に示す５の構造によって表される５タイプのうちいずれか５のうちの複数のオリゴ糖を含むことを特徴とする請求項１２記載の実質的に純粋なリガンド。２７．いずれかの組合せで、チャート１に示す５の構造によって表される５タイプのうちいずれか４のうちの複数のオリゴ糖を含むことを特徴とする請求項２６記載の実質的に純粋なリガンド。２８．いずれかの組合せで、チャート１に示す５の構造によって表される５タイプのうちいずれか３のうちの複数のオリゴ糖を含むことを特徴とする請求項２７記載の実質的に純粋なリガンド。２９．いずれかの組合せで、チャート１に示す５の構造によって表される５タイプのうちいずれか２のうちの複数のオリゴ糖を含むことを特徴とする請求項２８記載の実質的に純粋なリガンド。３０．いずれかの組合せで、チャート１に示す５の構造によって表される５タイプのうちいずれか１のうちの複数のオリゴ糖を含むことを特徴とする請求項２９記載の実質的に純粋なリガンド。３１．以下のオリゴ糖タイプＡＡ、ＡＢ、ＡＣ、ＡＤ、ＡＥ、ＢＢ、ＢＣ、ＢＤ、ＢＥ、ＣＣ、ＣＤ、ＣＥ、ＤＤ、ＤＥまたはＥＥのうちのいずれかのうちの複数を含むことを特徴とする請求項２９記載の実質的に純粋なリガンド。３２．以下のオリゴ糖タイプＡＡ、ＡＢ、ＡＣ、ＡＤまたはＡＥのうちのいずれかのうちの複数を含むことを特徴とする請求項３１記載の実質的に純粋なリガンド。３３．以下のオリゴ糖タイプＢＡ、ＢＢ、ＣＢ、ＤＢまたはＥＢのうちのいずれかのうちの複数を含むことを特徴とする請求項３１記載の実質的に純粋なリガンド。３４．以下のオリゴ糖タイプＣＡ、ＣＢ、ＣＣ、ＤＣまたはＥＣのうちのいずれかのうちの複数を含むことを特徴とする請求項３１記載の実質的に純粋なリガンド。３５．以下のオリゴ糖タイプＤＡ、ＤＢ、ＤＣ、ＤＤまたはＥＤのうちのいずれかのうちの複数を含むことを特徴とする請求項３１記載の実質的に純粋なリガンド。３６．以下のオリゴ糖タイプＥＡ、ＥＢ、ＥＣ、ＥＤまたはＥＥのうちのいずれかのうちの複数を含むことを特徴とする請求項３１記載の実質的に純粋なリガンド。３７．請求項１記載のリガンドを含むことを特徴とする医薬組成物。３８．５またはそれ未満の炭水化物のうちいずれかの組合せのうちの複数で、チャート１に示される炭水化物のうちのいずれかを含むことを特徴とする医薬組成物。３９．請求項１記載のリガンドをそれを要する患者に投与することを特徴とする疾病治療法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 31/70 ＡＣＤＡ６１Ｋ 31/70 ＡＣＤＡＣＶＡＣＶＡＤＳＡＤＳＡＤＵＡＤＵＡＥＤＡＥＤＣ０７Ｈ 13/06 Ｃ０７Ｈ 13/06 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ＥおよびＰ-セレクチンの両方に結合し、かつ、ＮおよびＯ-結合オリゴ糖を含み、そのオリゴ糖の大部分はＯ-結合である実質的に純粋なリガンド。２．２％未満のＬe^X、Ｌe^a、sＬe^XまたはsＬe^aタイプの置換を含むことを特徴とする請求項１記載の実質的に純粋なリガンド。３．Ｌe^X、Ｌe^a、sＬe^XまたはsＬe^aタイプの置換を実質的に含まないことを特徴とする請求項２記載の実質的に純粋なリガンド。４．当該リガンド上のｏ-結合オリゴ糖が２％未満のフコースを含むことを特徴とする請求項１記載の実質的に純粋なリガンド。５．当該リガンド上のｏ-結合オリゴ糖がフコースを実質的に含まないことを特徴とする請求項４記載の実質的に純粋なリガンド。６．２％未満の硫酸化オリゴ糖を含むことを特徴とする請求項１記載の実質的に純粋なリガンド。７．硫酸化オリゴ糖を実質的に含まないことを特徴とする請求項６記載の実質的に純粋なリガンド。８．イン・ビボ(in vivo)³Ｈ-グルコサミン標識分子上で、ＧalＮＡc：ＧlcＮＡcに関連する放射能の比が約１.８：１であることを特徴とする請求項１記載の実質的に純粋なリガンド。９．当該リガンドのｏ-結合オリゴ糖構造が、シアル酸置換を含まない分岐を全く示さないことを特徴とする請求項１記載の実質的に純粋なリガンド。１０．該リガンドがａ）２％未満のＬe^X、Ｌe^a、sＬe^XまたはsＬe^aタイプの置換、およびｂ）２％未満の硫酸化オリゴ糖を含み、かつ、ｃ）当該リガンド上のｏ-結合オリゴ糖が２％未満のフコースを含むことを特徴とする請求項１記載の実質的に純粋なリガンド。１１．イン・ビボ(in vivo)³Ｈ-グルコサミン標識分子上で、ＧalＮＡc：ＧlcＮＡcに関連する放射能の比が約１.８：１であることを特徴とする請求項１０記載の実質的に純粋なリガンド。１２．当該リガンドのオリゴ糖構造が、シアル酸置換を含まない分岐を示さないことを特徴とする請求項１１記載の実質的に純粋なリガンド。１３．該リガンドがａ）Ｌe^X、Ｌe^a、sＬe^XまたはsＬe^aタイプの置換を実質的に含まず、ｂ）フコシル化ｏ-結合オリゴ糖を実質的に含まず、かつ、ｃ）硫酸化オリゴ糖を実質的に含まないことを特徴とする請求項１２記載の実質的に純粋なリガンド。１４．７の同一タイプのオリゴ糖を包含する、チャート１に示すタイプＡ-Ｇの７タイプのうちいずれかの数のオリゴ糖を含むことを特徴とする請求項１３記載の実質的に純粋なリガンド。１５．６の同一タイプのオリゴ糖を包含する、チャート１に示すタイプＡ-Ｇのうちいずれか６タイプのうちのいずれかの数のオリゴ糖を含むことを特徴とする請求項１４記載の実質的に純粋なリガンド。１６．５の同一タイプのオリゴ糖を包含する、チャート１に示すタイプＡ-Ｅのうちのいずれか５タイプのうちのいずれかの数のオリゴ糖を含むことを特徴とする請求項１５記載の実質的に純粋なリガンド。１７．４の同一タイプのオリゴ糖を包含する、チャート１に示すタイプＡ-Ｅのうちのいずれか４タイプのうちのいずれかの数のオリゴ糖を含むことを特徴とする請求項１６記載の実質的に純粋なリガンド。１８．３の同一タイプのオリゴ糖を包含する、チャート１に示すタイプＡ-Ｅのいずれか３タイプのうちのいずれかの数のオリゴ糖を含むことを特徴とする請求項１７記載の実質的に純粋なリガンド。１９．２の同一タイプのオリゴ糖を包含する、チャート１に示すタイプＡ-Ｅのうちのいずれか２タイプのうちのいずれかの数のオリゴ糖を含むことを特徴とする請求項１８記載の実質的に純粋なリガンド。２０．タイプＡ-Ｅのうちのいずれか１タイプのうちいずれかの数のオリゴ糖を含むことを特徴とする請求項１９記載の実質的に純粋なリガンド。２１．以下のオリゴ糖：を含むことを特徴とする請求項１２記載の実質的に純粋なリガンド。２２．以下のオリゴ糖：を含むことを特徴とする請求項１２記載の実質的に純粋なリガンド。２３．以下のオリゴ糖：を含むことを特徴とする請求項１２記載の実質的に純粋なリガンド。２４．以下のオリゴ糖：を含むことを特徴とする請求項１２記載の実質的に純粋なリガンド。２５．以下のオリゴ糖：を含むことを特徴とする請求項１２記載の実質的に純粋なリガンド。２６．いずれかの組合せで、チャート１に示す５の構造によって表される５タイプのうちいずれか５のうちのいずれかの数のオリゴ糖を含むことを特徴とする請求項１２記載の実質的に純粋なリガンド。２７．いずれかの組合せで、チャート１に示す５の構造によって表される５タイプのうちいずれか４のうちのいずれかの数のオリゴ糖を含むことを特徴とする請求項２６記載の実質的に純粋なリガンド。２８．いずれかの組合せで、チャート１に示す５の構造によって表される５タイプのうちいずれか３のうちのいずれかの数のオリゴ糖を含むことを特徴とする請求項２７記載の実質的に純粋なリガンド。２９．いずれかの組合せで、チャート１に示す５の構造によって表される５タイプのうちいずれか２のうちのいずれかの数のオリゴ糖を含むことを特徴とする請求項２８記載の実質的に純粋なリガンド。３０．いずれかの組合せで、チャート１に示す５の構造によって表される５タイプのうちいずれか１のうちのいずれかの数のオリゴ糖を含むことを特徴とする請求項２９記載の実質的に純粋なリガンド。３１．以下のオリゴ糖タイプＡＡ、ＡＢ、ＡＣ、ＡＤ、ＡＥ、ＢＢ、ＢＣ、ＢＤ、ＢＥ、ＣＣ、ＣＤ、ＣＥ、ＤＤ、ＤＥまたはＥＥのうちのいずれかのうちいずれかの数を含むことを特徴とする請求項２９記載の実質的に純粋なリガンド。３２．以下のオリゴ糖タイプＡＡ、ＡＢ、ＡＣ、ＡＤまたはＡＥのうちのいずれかのうちいずれかの数を含むことを特徴とする請求項３１記載の実質的に純粋なリガンド。３３．以下のオリゴ糖タイプＢＡ、ＢＢ、ＣＢ、ＤＢまたはＥＢのうちのいずれかのうちいずれかの数を含むことを特徴とする請求項３１記載の実質的に純粋なリガンド。３４．以下のオリゴ糖タイプＣＡ、ＣＢ、ＣＣ、ＤＣまたはＥＣのうちのいずれかのうちいずれかの数を含むことを特徴とする請求項３１記載の実質的に純粋なリガンド。３５．以下のオリゴ糖タイプＤＡ、ＤＢ、ＤＣ、ＤＤまたはＥＤのうちのいずれかのうちいずれかの数を含むことを特徴とする請求項３１記載の実質的に純粋なリガンド。３６．以下のオリゴ糖タイプＥＡ、ＥＢ、ＥＣ、ＥＤまたはＥＥのうちのいずれかのうちいずれかの数を含むことを特徴とする請求項３１記載の実質的に純粋なリガンド。３７．請求項１記載のリガンドを含むことを特徴とする医薬組成物。３８．５またはそれ未満の炭水化物のうちいずれかの組合せのうちいずれかの数で、チャート１に示される炭水化物のうちのいずれかを含むことを特徴とする医薬組成物。３９．請求項１記載のリガンドをそれを要する患者に投与することを特徴とする疾病治療法。