JPH10509028A - 細胞成長調節因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 筋細胞及び白血球細胞から分泌又は発生される新規な物質が開示される。この新規な物質は、腫瘍細胞の増殖及び刺激されたリンパ球の増殖を阻害することにおいて活性である。該物質は正常細胞の増殖を阻害しない。この物質は、癌、及び体液中又は個体から採取された細胞の体液内での成長によって調節された液体中の前記物質のレベルを治療又は防止するための本発明にしたがって使用され、癌の診断、又は癌が発達する個体のリスクのレベルを診断するために使用される。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞成長調節因子 本発明の分野 本発明は、一般には、ヒト及び家畜の医薬の分野であり、細胞の成長及び増殖 をもたらす新規な物質に関する。本発明はまた、疾患の予防又は治療における該 物質の使用に関する。本発明は更に、疾患の診断の方法、又は疾患を進行させる 傾向があるか、又は疾患を進行させる素因を有する固体に対するスクリーニング の方法に関する。 用語解説 本明細書中の説明を簡略化する目的で、幾つかの造語を使用した。これらの語 及び種類（これらは、本書の前後関係で理解されるべきである。）は以下の通り である。 「細胞成長因子（ＧＲ）」−細胞の成長又は増殖に関係する物質。成長又は増 殖に関するＧＲの影響は、細胞の成長又は増殖を促進すること、又は細胞の成長 又は増殖を阻害することの何れかである。 「内因性ＧＲ（ＥＧＲ）」−体内の細胞によって分泌されるか、又は体内の細 胞から発せられる物質であって、小細胞又は体内の他の細胞の成長又は増殖に影 響する物質。 「細胞増殖抑制性ＧＲ／ＥＧＲ」−細胞の成長又は増殖を停止する効果又は細 胞の成長又は増殖をかなり示す効果を有するＧＲ／ＥＧＲ。これは、実質的にい ずれの細胞の破壊も起こさない。内因性ＥＧＲｓは、典型的には、一の細胞サイ クル段階で細胞サイクルを阻害することによって作用する。 「低分子量−ＥＧＲ（ＬＭＷ−ＥＧＲ）」−約３，０００ダルトン以下の分子 量を有するＥＧＲ。 「筋因子（ＭＦ）」−筋細胞によって分泌されるか、又は筋細胞から発せられ るＬＭＷ−ＥＧＲ。 「白血球因子（ＷＢＦ）」−白血球細胞により分泌されるか、又は白血球細胞 から発せいられるＬＭＷ−ＥＧＲ。 「起源細胞」−ＥＧＲを分泌するか、又は発する細胞。 「標的細胞」−ＥＧＲによって影響を受ける細胞。 「調節培地（ＣＭ）」−起源細胞の該培地中での成長によって調整された培地 。従って、ＣＭは起源細胞によって分泌されたＥＧＲを含有する。 「筋細胞ＣＭ及び白血球ＣＭ」−それぞれ、筋細胞及び白血球細胞のこれら内 での成長によって調整された培地。筋細胞ＣＭ及び白血球細胞ＣＭは、それぞれ 、ＭＦ及びＷＢＦを含有する。 上記用語は以下の説明に関しても解釈され、理解されるべきである。 本発明の背景 「サイトカイン」として知られるＥＧＲｓの発見、特徴付け、生物学的試験及 び臨床的開発に関する多くの主要な研究がある。今日までに発見されている全て のサイトカインは、数千ダルトンから数万ダルトンの範囲の分子量を有する蛋白 質様物質である。サイトカインは、異なった起源及び標的細胞を有し、異なった 作用形式を有するが、全てが蛋白質様物質であるという一般的な基準で共通して いる。 身体での試験で、実験動物内の主要の成長及び増殖を十分に阻害することが報 告されている（S.A．Hoffman ら、1962，Cancer Res．22:597-599; V.E．Baraco s，1989，Chem．J．Physiol．Pharmacol.，67: 864-870）。A．Szent-Gyorgyi ら（1963，Science，140:1391-1392）は、胸腺、大動脈、筋肉及び腱を含む幾つ かの組織の抽出物が二種類の物質、即ち１つはマウスの腹水腫瘍の成長を促進す るもの（これらを「プロミン（Promine）」と称する。）、他方は、このような 成長を阻害するもの（これらを「レチン（Retine）」と称する。）を含むことを 報告した。レチンは、室温において一週間以上で分解する比較的不安定な低分子 量の物質として上記文献に開示されている。更に単離の方法に基づいて、該基質 は親油性であると思われる。筋細胞抽出物による腹水腫瘍細胞の阻害も、T．Nam ba ら（1968，British J．of Exp．Pathol．49:294-301）により開示され ており、筋細抽出物で見出される阻害活性はシリコン膜を介して透析しうる。熱 の影響は透析物では全く見出されていないが、該活性は抽出物の加熱で影響を受 ける。 E．Watta ら（米国特許第４，７０８，９４８）は、筋組織からも得られる腫 瘍の成長を阻害する高分子量のポリペプチドを開示した。M．Djaldetti ら（米 国特許第５，２４２，６９２）は、腫瘍細胞の増殖を阻害する筋細胞から誘導さ れる因子を開示した。筋細胞培養の上清から単離されるこの因子は、電気泳動で 決定された２５，０００〜３０，０００ダルトンの範囲の見かけの分子量を有す ることが見出された。 本発明の概要 本発明は、筋細胞又は白血球細胞によって分泌され、発生され、又は産生され る新規な物質であって、正常な非腫瘍細胞の増殖に実質的に影響を与えることな く、腫瘍細胞の増殖を阻害するという点において生物学的に活性である物質の発 見に基づいている。加えて、これらの物質は、刺激された免疫細胞の増殖を阻害 するという点でも効果的であることが見出されている。 従って、本発明は、そのひとつの側面として、実質的に精製された細胞成長調 節因子を提供する。該因子は、 （ａ）以下の特性を有する物質であるＬＭＷ−ＥＧＲ、 ｉ．これが、細胞、特に筋細胞又は白血球細胞から分泌されるか又はこれ らによって発生されることによって産生される。 ii．これが約３，０００ダルトン以下の分子量を有する。 iii．これが蛋白質性でない。 iv．これが水に可溶である。 ｖ．これが熱に安定である。 vi．これが細胞の増殖を阻害すること、特に腫瘍細胞の増殖又は刺激され たリンパ球の増殖を阻害するという点で生物学的に活性である。 又は、 （ｂ）（ａ）に従った物質の誘導体であり、細胞の増殖を阻害するという点で生 物学的に活性である物質、 の何れかである。 他の側面では、疾患の予防又は治療における前記物質の使用を提供する。この 側面に従えば、疾患又は不調の予防のための方法であって、必要なときに、効果 的な量の前記ＧＲを対象に投与することを具備した方法を提供する。増殖を阻害 するときのＧＲの活性の様式が与えられる場合、これは典型的には、所定期間に わたって周期的に対象に投与される。更に、本側面に従えば、所定量の前記ＧＲ を含有する組成物を提供する。この組成物は、治療に有効な量の前記ＧＲを薬学 的に許容しうる担体又は希釈剤と共に含有する薬学的組成物でありうる。該薬学 的組成物は、疾患又は障害の予防に有効となるように処方されるか、又は、疾患 又は障害の治療に有効となるように処方されうる。該組成物はまた、処方箋なし で購入可能な組成物、例えば汎用性（neutraceutical）組成物、食物添加物、健 康食品製剤のようなものでもありうる。最後に、本側面に従えば、このような組 成物を調製するための前記ＧＲの使用が提供される。 ガンの治療又は予防のため、又は活動過多の免疫系で起こる種々の症状の治療 又は予防、例えば器官拒絶反応に対抗することに向けられた治療、自己免疫疾患 の治療等の枠組みの範囲内で、刺激されたリンパ球の（脱離又は減少）活性を阻 害するために前記ＧＲを使用することが特に好ましい。 本発明の更なる側面に従えば、個体のガン若しくはガン様状態、又はガンの発 達の傾向があるか、若しくはガンの発達の素因を有する個体をスクリーニングす るための方法であって、前記個体から得た体液中の前記ＬＭＷ−ＥＧＲのレベル を決定することを具備した方法を提供する。 本発明の更なる側面は、適切な調節培地の活性フラクションの精製に基づく、 本発明のＧＲの調製方法である。 本発明の説明 本発明は、低分子量である新規なＥＧＲｓの発見に基ずく。「低分子量」の語 は、限外濾過によって決定される分子量が、約３，０００ダルトン以下、特に約 ２，０００ダルトン、又は、好ましくは、約５００ダルトン以下であるものと理 解されるべきである。これらの分子量は近似値であり、実際の数値とみなすこと ができないことは当業者には明かである。 本発明のＬＭＷ−ＥＧＲｓは、非ペプチド性であること、即ちこれらが蛋白質 でもなく、ペプチドでもなく、又はその生物学的活性に役割を演じる蛋白質若し くはペプチド部分を有する何れかの他の基質でもないことが見出された。（本発 明の発見は、ＬＭＷ−ＥＧＲが、成長調節因子としてのＬＭＷ−ＥＧＲの活性に 役割を演じないか、又は制限された役割のみを有するペプチド又はペプチド部分 に結合するか、又はこれと複合体を形成する形態で存在しうる可能性を除外する ことはできない。） 本発明に従えば、ＬＭＷ−ＥＧＲｓは今日まで、筋細胞のＣＭから、及び白血 球細胞のＣＭから得られていた。しかし、本発明に従ったＬＭＷ−ＥＧＲｓは他 の起源からも得ることができると信じられる。従って、本発明はＭＦ及びＷＢＦ に制限されない。対照的に、本発明に従った発見によって得られた知識を授けら れ、当業者に利用可能な標準的な技術及び知識を使用することによって、当業者 が、本発明の範囲内にある他のＬＭＷ−ＥＧＲｓを見出すことは困難ではないで あろう。 ＭＦ及びＷＢＦは、腫瘍特異的細胞増殖抑制性のＥＧＲｓであることが見出さ れている。これらは、正常な、非腫瘍形成性細胞に関していずれの顕著な影響も 有さずに腫瘍細胞の成長及び増殖を特異的に抑制するという独特の生物学的活性 を有する。加えて、ＭＦ及びＷＢＦは両方とも、腫瘍に非特異的（即ち、種々の 腫瘍細胞の成長及び増殖を阻害するという効果）であり、種非特異的（種々の動 物種から得た腫瘍細胞の成長及び増殖を阻害する活性を示す。）であることが見 出された。 言い換えれば、ＭＦ及びＷＢＦはガン細胞の成長及び増殖を阻害する広い活性 スペクトルを有している。更に、本発明に従った発見は、一種の動物種、特に哺 乳動物から誘導されたＭＦ及びＷＢＦが、他種の動物、特に哺乳動物のガン治療 に使用しうることを意味する。 ＭＦ及びＷＢＦは腫瘍増殖抑制性であることが見出されているが、、これらが 細胞の幾つかの破壊効果を、特に長期間の暴露によって有しうる可能性があるこ とを指摘すべきである。例えば、ＭＦ又はＷＢＦ、並びにこれらの誘導体に長期 間暴露した後、標的細胞は結局死亡、例えばアポトーシスを起こしうる。 腫瘍細胞の成長及び増殖を阻害するこれらの活性に加えて、ＭＦ及びＷＢＦは マイトジェンに対するリンパ球の応答の阻害、及び混合リンパ球細胞の反応（Ｍ ＬＲ）の阻害によって証明されるように、リンパ球の増殖も阻害する活性が見出 された。このことは、本発明のＧＲｓが免疫抑制活性を有しうることを意味する 。 一度ＬＭＷ−ＥＧＲが１つの種から単離されると、他の種から相同性のＬＭＷ −ＥＧＲを見出すことができることは明かである。例えば、現在までは、本発明 に従って得られるＭＦは、ラットおよびヒト起源のものであった。他の種、特に 哺乳動物種からも相同性のＭＦｓを得ることができることは疑いない。同様に、 本発明に従って今日までに得ることができるＷＢＦはヒト起源である。他の種、 特に哺乳動物からの相同性ＷＢＦｓも得ることができる。本発明はこのような相 同体も包含する。 本発明のＧＲは、単一の分子であるか、細胞の成長及び増殖に影響を与える添 加剤又は共同的な方法で共に操作される分子のグループであるか、又はこのよう な活性を有する分子複合体であり得る。 一度単離されれば、例えば化学的な修飾によって誘導体を調製することができ る。該ＬＭＥ−ＥＧＲの誘導体は、ＬＭＷ−ＥＧＲの生物学的活性と同様の生物 学的活性を有するであろう。ＬＭＷ−ＥＧＲ又はこのようなＬＭＷ−ＥＧＲの相 同体と同様の生物学的活性を有する誘導体は、例えばＬＭＷ−ＥＧＲを特徴づけ るために使用されるのと同様の生物学的試験を使用して同定することができる。 例えば、腫瘍細胞の成長又は増殖を阻害する活性を有するＭＦ及びＷＢＦの場合 、誘導体及び相同対は、場合によっては、in vitro で成長された腫瘍債オブの 成長又は増殖の阻害活性対して他の種からの合成誘導体又は機能化されたＣＭを 試験することによって、又はＭＬＲを阻害する能力によって見出されうる。当業 者は、各場合で、適切な生物学的試験を選択できることは疑いないであろう。 誘導体は、前記ＬＭＷ−ＥＧＲと同様の分子構造を有する分子でありうるが、 このうちには、１以上の化学基が他の化学基によって置換されているもの、前記 ＬＭＷ−ＥＧＲの還元又は酸化生成物等がある。 本発明のＧＲは、種々の治療目的であって、これを必要としている対象に、治 療に効果のある量で投与するために使用しうる。前記ＧＲが使用される１つの好 ましい治療指針は、ガンの治療又は予防である。治療に対しては、ガンの病歴の ある個体に、例えばガンの再発を抑制するためにＧＲが投与されうる。このよう な治療は、典型的には、化学療法、放射線療法、又は外科手術のような癌の除去 又は破壊を意図した初期治療の継続的管理であろう。予防のためには、前記ＧＲ はガンを持たない個体、又は何れかの癌性症状の診断の前の個体、特に癌の発達 の傾向があるか、又はその素因を有する高リスクの個体に投与されうる。高リス クの個体は、癌を発達させる発生学的な素因を有しうるような、例えば、癌を伴 うことが知られている種々の遺伝子の１つを有すると診断された個体、癌の病歴 を持つ一族の個体、光照射、カルチノーゲンへの暴露等のような種々の環境因子 にさらされて起こる癌を高リスクで発達させる個体等でありうる。 標的細胞の迅速な破壊以外で標的細胞の増殖を阻害するＧＲの生物学的活性が 示されれば、ＧＲは典型的には、所定期間周期的に投与されるであろう。しかし 、すでに、先に指摘したように、これらの成長を長期間抑制し続ければ、腫瘍細 胞は結局死亡し、その結果、所定期間後には治療を停止することができるであろ う。 前記ＧＲの他の好ましい治療指針は、免疫系の成分の活性を阻害することであ る。この例には、自己免疫疾患の治療、移植治療の枠組みの範囲内での使用、即 ち器官又は組織の拒絶を予防することを意図した移植後の治療等である。 本発明のＧＲｓは、腫瘍が引き続きの腫瘍細胞の筋肉内又は腹腔内接種によっ て誘導される一次腫瘍に対する動物モデル、並びに腫瘍が腫瘍細胞の静脈内接種 で誘導される転移に対する動物モデルを含めた種々の動物モデルで試験された。 ＧＲは、両種のモデルで腫瘍の発達を阻害するのに効果があることが見出された 。ＧＲｓは、非経口及び経口投与の両方で腫瘍の発達を阻害することが見出され た。公知のように、経口投与は、非経口投与より生理学的にかなり許容できる。 従って、癌の治療又は予防、特に長期間にわたって周期的にＧＲを投与すること を含めた治療又は予防管理に対しては、経口投与の経路が好ましい。 ＧＲは、効果的な量の前記ＧＲと共に、前記ＧＲに適合した生理学的に許容し うる担体を含有する薬学的組成物に製剤化される。前記ＧＲは、水に可溶である ことが見出されており、従って、非経口投与に対しては、生理学的に許容しうる 担体は生理食塩水でありうるか、又は経口投与に対しては食用の水溶液であり得 る。加えて、経口投与に対して、ＧＲは、カプセル、錠剤等の種々の投与量形態 に製剤化されうる。更に、ＧＲはまた、凍結乾燥され、使用前に担体又は希釈剤 と混合されうる。 本明細書中で使用される「効果的な量」の語は、所望の効果を達成するのに十 分な量であると理解されるべきである。例えば、癌治療の場合、効果的な量は、 与えられた治療管理で腫瘍細胞の成長又は増殖を阻害するのに十分な前記ＧＲの 量である。例えば、これは、発生の割合の減少又は腫瘍転移の数の減少又は癌に 関連した死亡率の減少によって明かとなる。癌の予防の場合、効果的な量は、与 えられた予防的な投与管理で、一次癌性成長の発生を防止するのに効果的な前記 ＧＲの量である。 薬学的組成物へのＧＲの処方に加え、本発明のＧＲはまた、他のタイプの組成 物、例えば食品添加組成物、汎用性組成物（neutraceutical compsition）、処 方箋なしで購入可能な「健康」製品等に処方されうる。 本発明に従って行われる実験は、癌患者の白血球細胞が正常な健康な個体の白 血球細胞よりも低い量のＬＭＷ−ＥＧＲを分泌することを示した。従って、体液 （例えば血清、尿等）内、又は細胞、例えば個体の筋細胞若くは白血球細胞の培 養上清のＬＭＷ−ＥＧＲのレベルを決定することによって、個体の癌を診断する こと、並びに個体の癌の状態の指針を得ることができるであろう。加えて、体液 中又は前記上清中のＬＭＷ−ＥＧＲのレベルの決定は、癌を発達する傾向がある か又はその素因を有する個体に対してのスクリーニングを基にしうる。ＬＭＷ− ＥＧＲのレベルの決定は、体液又は上清の活性、又は腫瘍細胞の増殖を阻害する これらの適切なフラクションの活性を試験することを含めた生物学的アッセイに よって行われうる。このような生物学的アッセイに加えて、ＬＭＷ−ＥＧＲの存 在も、それ自体当業者によって一般に知られた多くの分析法によって決定されう る。この方法には、ＬＭＷ−ＥＧＲ特異的抗体の使用に基づいた種々の免疫学的 アッセイ、適切な化学剤、例えば着色剤の使用に基づくアッセイ、分光学的なア ッセイ又は照射の吸収、例えば光吸収に基づくアッセイ、種々のクロマトグラ フィー技術等が含まれる。 本発明の他の側面によれば、本発明は生物起源から得た本発明のＧＲの精製方 法を提供する。この側面に従った方法は、 （ａ）細胞が、これらの回りの媒体へ細胞成長因子を産生し、分泌し、又は発生 する条件で細胞を成長すること、 （ｂ）細胞培養の上清を集めること、 （ｃ）約３，０００ダルトン以上の分子量の物質を含有する上清のフラクション と、約３，０００以下の分子量の物質を含有する上清のフラクションを分離し、 後者を選択すること、 を具備する。 ステップ（ｃ）で選択されたフラクションは種々の技術、特にクロマトグラフ ィー、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で更に精製しうる。 以下に、本発明を添付した図面を随時参照して本発明に従って行われる幾つか の実験によって例示する。これらの実験では、ＭＦ及びＷＢＦの in vitro 及び in vivo での活性を示した。また、ＭＦの精製及び特徴付けの手順を開示した。 この例示は、添付の請求の範囲で定義される本発明の完全な範囲を例示する以外 、本発明の範囲を制限すると解釈すべきでないことは当業者に明かであると確信 する。当業者が、上記及び以下の説明に基づいて、その権利主張した全ての範囲 で本発明を行いうることは疑いないであろう。 図面の簡単な説明 図面において、 図１〜９は、３，０００ダルトンで分子をカットオフする膜を通して濾過され た筋細胞ＣＭ又は白血球細胞ＣＭの濾液に含まれるＭＦ又はＷＢＦの効果を示す （このような濾過物は、本明細書中において、「３，０００ダルトンのＭＦ限外 濾過液」及び「３，０００ダルトンのＷＢＦ限外濾過液」とそれぞれ称する。） 。これらの図において、細胞を９６ミクロウェルプレートで成長させ、幾つかの 希釈（「１」−未希釈、「２」−二倍希釈等）で３，０００ダルトンのＭＦ濾過 物を用いてインキュベートした。全ての実験で、非調節培地を対照に用いた。図 １ 〜４、６、８及び９、特に図７において、細胞のパーフォレーションを³Ｈ−チ ミジンの取り込みによって測定した。縦軸は放射能のカウントを示す。図５及び 特に図７において、パーフォレーションを細胞カウントによって測定した。縦軸 は細胞数を示す。 図１は、２種類の腫瘍細胞系、Ｂ１６（これはネズミメラノーマ細胞系（図１ Ａ）である。）、ＨＴＢ−３８（これはヒトアデノカルチノーマ細胞系（図１Ｂ ）である。）の増殖に関する、新生児ラットの横紋筋細胞の一次培養物から得た ２，０００ダルトンのＭＦ限外濾過液の影響を示す。この図において、３，００ ０ダルトンのＭＦ限外濾過液の活性を粗製の調節培地（「粗製ＣＭ」）の活性と 比較した。 図２は、２種類の正常な非腫瘍細胞、ラット繊維芽細胞（図２Ａ）、ネズミ骨 髄細胞（図２Ｂ）に関する、新生児ラットの横紋筋細胞の一次培養物から誘導さ れた３，０００ダルトンのＭＦの影響を示す。 図３は、２種類の腫瘍細胞系、Ｂ１６（図３Ａ）、ＭＣＡ−１０５（ネズミ肺 のメチルコラントレンで誘導された肉腫系（図３Ｂ）の増殖に関する、ラット横 紋筋細胞系、Ｌ−８から誘導された３，０００ダルトンのＭＦ限外濾過液の影響 を示す。 図４は、２種類の正常なタイプの細胞、ネズミ骨髄細胞及びラット繊維芽細胞 の一次培養物に関する、Ｌ−８細胞から誘導された３，０００ダルトンのＭＦ限 外濾過液の影響を示す。 図５は、細胞のカウントに基づく細胞成長アッセイでのＮｂ₂−１１Ｃラット リンパ腫系細胞の成長に関する、新生児ラットの横紋筋細胞の一次培養物から誘 導される３，０００ダルトンのＭＦ限外濾過液の影響を示す。このアッセイにお いて、細胞は、Ｇ⁰／Ｇ¹フェーズにシンクロナイズされ、３，０００ダルトンの ＭＦ限外濾過液の粗製ＣＭ又は対照培地が添加され、次いで成長がｈＧＨの添加 によって刺激された。 図６は、幾つかの腫瘍細胞系の増殖に関するＬ−８細胞から誘導される３，０ ００ダルトンのＭＦ限外濾過液の影響を示す。各場合の結果は、それぞれの実験 における対照に対しての百分率である。 図７は、ヒト筋芽細胞から誘導される３，０００ダルトンのＭＦ限外濾過液の 影響を示す。Ｂ−１６及びＫ５６２細胞の成長は、³Ｈ−チミジンの取り込みに よって決定した。ＮＢＴ細胞の増殖は細胞のカウントによって決定した。 図８は、ネズミ及びヒト腫瘍細胞の増殖に関する、ヒトリンパ球から誘導され た３，０００ダルトンのＷＢＦ限外濾過液の影響を示す。増殖を対照に対する百 分率として示した。 図９は、ＰＨＡに対するリンパ球応答及び混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけ るＬ−８細胞から誘導される３，０００ダルトンのＭＦ限外濾過液の影響を示す 。 図１０は、被爆された２匹のそれぞれのマウスの腹膜を示す画像である。ここ で、腫瘍は２×１０⁵のＭＣＡ−１０５細胞の腹腔内注射によって誘導された。 注射の後、右側のマウスを、分取用逆相（ＲＰ）Ｃ１８高速液体クロマトグラフ ィーカラムから溶出されたフラクション（このフラクションを以下の本文で「Ｍ Ｆ−ＳＰ」と称する（７．６．２参照）。）を含む０．５ ml のＭＦを腹腔内注 射することによって一日に二回処理した。左側のマウスには対照のＲＰＭＩ培地 を注射した。 図１１は、被爆された２匹のそれぞれのマウスの腹膜を示す画像である。腫瘍 は５×１０⁵個のＢ−１６メラノーマ細胞の腹腔内注射によって誘導された。右 側の図は、Ｌ−８細胞から誘導された３，０００ダルトンのＭＦ限外濾過液（Ｐ ＢＳ中）の１ ml をｉ．ｐ．注射で一日に一回処理したマウスである。左側の図 は、対照のＰＢＳ培地をｉ．ｐ．注射で一日に一回処理したマウスである。 図１２は、２．５×１０⁵個の細胞でｉ．ｐ．注射されたそれぞれのマウスの 被爆された腹膜を示す画像である。図１２Ａに示されるマウスは、一日に１オン スあたり、Ｌ−８細胞から誘導される３，０００ダルトンのＭＦ限外濾過液の１ ml（ｐ．ｏ．）で処理されたマウスのグループからのものである。図１２Ｂに 示されたマウスは、対照のＲＰＭＩ培地でｐ．ｏ．処理された対照マウスのグル ープからのものである。 図１３は、５×１０⁵個のＢ−１６メラノーマ細胞でｉ．ｖ．注射されたマウ スの単離された肺を示す画像である。上側の列の肺は、一日に１ ml の対照のＰ ＢＳ溶液を用いて、ｐ．ｏ．投与した動物のグループから得たものである。下側 の列の肺は、一日にＬ−８細胞から得られた３，０００ダルトンのＭＦ濾過物の １ ml をｐ．ｏ．投与で処理した動物より成る実験グループから得たものである 。 図１４は、癌患者の血液及び健康な個体の血液から得た白血球の上清からの３ ，０００ダルトンの限外濾過液の、３種類の腫瘍細胞系（Ｂ−１６、ＳＫ及びＫ −５６２）の増殖の阻害に関する影響を示す。 図１４ａは、３，０００ダルトンの限外濾過液にさらされた後の、対照に対す る３種類の細胞系の増殖を示す。 図１４ｂは、阻害率として与えられる飛散結果を示す（阻害は、増殖の逆数で ある。１００％の増殖は０％の阻害である、等である（１００％以上の増殖の結 果も「０％」のスコアーで示した。）。）。 図１５は、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムを介して再クロマトグラフィーにかけたＭＦ を含有する溶液の２２０ nm での溶出プロフィールを示す（再クロマトグラフィ ーは、最初のクロマトグラフィーと同じカラムを用い、同じ方法で行った。）。 図１６〜２１は、細胞カウントで決定された、Ｎｂ₂細胞の成長の阻害におい て、種々のＨＰＬＣカラムから溶出された種々のフラクションの活性を示す。こ れらの図の各々の横軸はチューブの番号を示す（流速及び各チューブの容積に関 しては以下の本文を参照。）。縦軸は、ブランクと比較した細胞の相対数を示す （Ｎｂ₂細胞の成長培地には何れの溶液も添加せずに細胞を成長させ、これを１ ００％とした。）。 図１６及び１７は、ＮＢ２細胞の増殖の阻害における、２種類の異なった操作 で、分取用ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ−１８）カラムから溶出された種々のフラクショ ンの活性を示す。カラムに供給された溶液は、Ｌ−８細胞から誘導された３，０ ００ダルトンのＭＦ限外濾過液（ＰＢＳ中）又は対照のＰＢＳ溶液である。図１ ６において、ＭＦを含有する溶液は白丸（○）で、対照のＰＢＳ溶液は黒丸（● ）で示した。図１７において、ＭＦを含有する溶液は黒三角（▼）で、対照のＰ ＢＳ溶液は黒丸（●）で示した。 図１８は、ＮＢ２細胞の増殖の阻害における、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ−１ ８）カラムから溶出された種々のフラクションの活性を示す。このカラムに供給 された溶液は、図１６から得たフラクション５及び６の貯蔵物から成る。ＭＦを 含む溶液−黒丸（●）、対照−白丸（○）。 図１９は、Ｎｂ₂細胞の増殖の阻害における、スーパーデックス（superdex） カラムから溶出された種々のフラクションの活性を示す。カラムに供給された溶 液は、２５０ ml のチューブ９〜１０、５２０ ml のチューブ１０〜１１及び６ ００ ml のフラクション１１〜１２より成る図１７の溶出物から得た貯蔵溶液で ある。 図２０は、Ｎｂ₂細胞の増殖の阻害における、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣカラムか ら溶出された種々のフラクションの活性を示す。カラムに供給された溶液は、図 １７のチューブ６〜１２の貯蔵物である。ＭＦ溶液−黒四角（■）、対照、ＰＢ Ｓ溶液−白丸（○）。 図２１は、Ｎｂ２細胞の増殖の阻害における、サイズ排除（ＳＥ）カラムから 溶出された種々のフラクションの活性を示す。カラムに供給された溶液は、図１ ７で示された分取用ＲＰ−ＨＰＬＣカラムから溶出された別のフラクションであ る。フラクション「Ａ」、チューブ６〜８ − 白丸（○）；フラクション「Ｂ 」、チューブ８〜１０ − 黒丸（●）；フラクション「Ｃ」、チューブ１０〜 １２ − 白三角（▽）；及びフラクション「Ｄ」、チューブ１２〜１４− 黒 三角（▼）。 図２２は、Ｎｂ₂細胞の増殖の阻害における、スーパーデックスカラムから溶 出された種々のフラクションの活性を示す。カラムに供給された溶液は、以下の ような図２１の溶出物から得た種々のフラクションより成る。 図２２Ａは、以下の供給溶液、即ちフラクションＣのチューブ２８〜３０ − 白丸（○）；フラクションＣのチューブ２２〜２３ − 黒丸（●）；フラクシ ョンＢのチューブ２９〜３３ − 白三角（▽）の結果を示す。更に 図２２Ｂは、以下の供給溶液、即ちフラクションＣのチューブ３１〜３２ − 黒丸（●）；フラクションＣのチューブ２３〜２６ − 白丸（○）；フラクシ ョンＢのチューブ２９〜３３ − 白三角（▽）の結果を示す。 図２３は、Ｎｂ₂細胞の増殖の阻害における、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣから溶出 された種々のフラクションの活性プロフィールを示す。カラムに供給された溶液 は、分取用ＲＰ−ＨＰＬＣカラムから得た活性フラクション（１８％〜２８％ア セトニトリルで溶出）より成る。 図２４は、Ｎｂ₂細胞の増殖の阻害における、細部排除カラムから溶出された フラクションの活性プロフィールを示す。カラムに供給された溶液は、図２３に 示されたアリコートから得たフラクション１３〜１７である。 図２５は、Ｎｂ₂細胞の増殖の阻害における、親水性相互作用カラム（ＣＨＯ ）から溶出された種々のフラクションの活性プロフィールを示す。カラムに供給 された溶液は、図２４に示されたアリコートからの貯蔵されたフラクション２７ 〜３０である。 図２６は、サイズ排除カラムから得た活性フラクション（２７〜３２分の間で 溶出されたフラクション）のＮＭＲスキャンを示す。 本発明の詳細な説明 以下において、筋細胞ＣＭ及び白血球細胞ＣＭから得た活性フラクションの活 性を議論する場合、しばしば「ＭＦ」又は「ＷＢＦ」の表記を用いる。これら２ 種類のＣＭｓが以下に開示される活性を有する１以上のファクターを含有する可 能性のあることが理解されるべきである。実際に、本発明に従って得られたＨＰ ＬＣフラクションの結果（その幾つかを以下に示した。）はこの様式で説明され うる（しかし、他の説明も可能である。）。従って、例えば筋細胞ＣＭは腫瘍成 長抑制効果を有する１以上のファクターを含有しうる。従って、例えば「the Ｍ Ｆ」等としばしば表される表記は、筋細胞ＣＭが「ＭＦ」と称される全ての物質 の一以上を実際に含有しうるので、単一のＬＭＷ−ＥＧＲのみを含有する筋細胞 ＣＭを意味すると解するべきではない。 １． 調節培地 １．１ ＭＦ ＭＦを、以下の３つのタイプの筋細胞調製物の調節培地（ＣＭ）から得た。 １．１．１ 新生児ラットの一次培養物 ２４〜４８時間齢の新生児ラットの後肢から筋を分離し、小片に切り刻んだ。 ０．２５％トリプシンバルサン（tripsinvarsan）溶液でトリプシン化した後、 細胞を組織培養皿に予めプレート化し。繊維芽細胞及び単球を除去した。細胞を カウントし、富化されたダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）に播いた。 ５日後、培養物は収縮した筋細胞を含んでいた。次に、培地をデカンテーション し、ＲＰＭＩ又はＰＢＳ培地を添加した。細胞をＲＰＭＩ培地中で２４時間、並 びにＰＢＳ中で８時間若しくは２４時間インキュベートした。次に、上清を集め 、遠心し、更に加工するまで−２０℃の冷凍庫に保存した。 １．１．２ ラット筋細胞系（Lー８） Ｌ−８系（アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Cultur e Collection）−ＡＴＣＣ、名称ＣＲＬ１７６９から入手可能）は、新生児ラッ トの骨格筋芽細胞系（これは、成長因子を添加することなく増殖する未分化筋芽 細胞を含有する。）である。Ｌ−８細胞を培養皿に播き、４％グルコースを含有 するＲＰＭＩ培地（この培地は、これ以後「ＲＰＭＩ］と称する。）中で成長さ せた。３日後、分離した培養上清を捨て、ＲＰＭＩ又はリン酸緩衝生理食塩水（ ＰＢＳ）で置き換え、次いで更に２４時間インキュベートした。次に、上清を集 め、すぐには更に加工しない場合には、−２０℃の冷凍庫で保存した。 １．１．３ ヒト筋芽細胞 ヒト生検から得たヒト筋芽細胞を循環式培養フラスコ中で集塊するまで培養し た（米国特許５，１３０，４４１参照）。培養培地を除去し、ＤＭＥＭ又はＰＢ Ｓ溶液で置き換え、細胞を更に２４時間該溶液中でインキュベートした。次に、 上清を集め、細胞を遠心によってこれから分離した。 １．２ ＷＢＦ ＷＢＦを単核細胞の調節培地からえた。単核細胞を以下のようにして静脈血か ら単離した。２０ ml の静脈血をヘパリン化したシリンジを用いてヒト供与体か ら採取した。ヘパリン化された血液をＰＢＳで１：１に希釈し、１５ ml のフィ コール−ハイパック^TM（Ficoll-Hypaque^TM）（ファルマシア、スウェーデン）又 はヒストパック^TM（Histopaque^TM）（シグマ、セントルイス、Ｕ．Ｓ．Ａ．）上 に層状に重ね、４００×ｇで３０分間遠心した。単核細胞を含有する中間面を集 め、ＰＢＳで三回洗浄した。 ２×１０⁶／ml の単核細胞をＰＢＳに懸濁し、５％ＣＯ₂、９５％空気の湿ら せた雰囲気中、３７℃で４８時間インキュベートした。次に、細胞懸濁物を遠心 し、上清を集めた。 ２． 限外濾過 ５００、２，０００、２，０００及び１０，０００ダルトンの分子カットオフ を有するフィルター（セントリコン^TM（Centricon^TM）、アミコン（Amicon）、 Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて、上記起源から得られたＣＭを限外濾過にかけた。 ＭＦは、１０，０００、３，０００、２，０００ダルトンの分子カットオフを 有する膜を通した限外濾過液、並びに５００ダルトンの分子カットオフを有する 膜の限外濾過液に存在することが見出された。これを更に以下に示す。ＷＢＦを ３，０００ダルトンの分子カットオフを有する膜を通して限外濾過した。限外濾 過液にはＷＢＦが含まれることが見出された。 ５００、２，０００等の分子カットオフのフィルターを通した筋細胞ＣＭ限外 濾過液は、本明細書中では「５００ダルトンのＭＦ限外濾過液」「２，０００ダ ルトンのＭＦ限外濾過液」等と称する。３，０００ダルトンの分子カットオフを 有するフィルターを通したリンパ球ＣＭの限外濾過液は、本明細書中では「３， ０００ダルトンのＷＢＦ限外濾過液」と称する。 ３． ＭＦ及びＷＢＦによる in vitro での腫瘍細胞増殖の阻害 ３．１ 方法 ３．１．１ 細胞系 この in vitro アッセイでのＭＦ及びＷＢＦの効果を、幾つかの腫瘍細胞系及 び幾つかの非腫瘍細胞系で試験した。試験された細胞は以下の通りである。 （ａ）腫瘍細胞系 ヒト結腸から誘導されたアデノカルチノーマ細胞（ＡＴＣＣ、名称ＨＴＢ− ３８）であるＨＴ−２９、 ネズミ肺のメチル−コラントレンで誘導された肉腫細胞系であるＭＣＡ−１ ０５、 ネズミメラノーマ細胞系であるＢ１６−Ｆ１、 ヒトメラノーマ細胞系であるＳＫ−２８、 ヒト白血病細胞系であるＫ−５６２、 胸部カルチノーマ細胞系であるＤＡ３細胞、 胸部カルチノーマ細胞系であるＭＣＦ−７ ホルモン依存性のラットリンパ腫細胞系であるＮｂ₂−１１Ｃ（即ち、これ らの細胞の成長には成長ホルモンが必要である。）（Gertlerら、1985 Endocrin ol.，116:1636-1644）、及び 乳腺刺激性ホルモン依存性のラットリンパ腫細胞系であるＮｂ₂−ＳＰ （ｂ）非腫瘍細胞 ネズミ骨髄細胞系、 第一期ラット繊維芽細胞、及び ヒトリンパ球細胞系であるＩＭ−１９。 ３．１．２ ³ Ｈ−チミジン取り込みアッセイ 試験細胞（³Ｈ−チミジンの取り込みをアッセイする細胞）を１×１０⁴細胞／ マイクロウェルの初期細胞密度で、９６マイクロウェルプレートに播いた。各マ イクロウェルにはＲＰＭＩ及び、調節培地（ＲＰＭＩ又はＰＢＳの何れか中の筋 細胞ＣＭ又は白血球細胞ＣＭ）、細分されたＣＭ、対照のＲＰＭＩ又はＰＢＳ（ 即ち調節されていないもの）、又は細分された対照ＲＰＭＩ又はＰＢＳの何れか である試験溶液の混合物が含まれる。各試験溶液の結果を対応する対照と比較し た（例えば、ＰＢＳ中に細分された試験溶液を細分されたＰＢＳと比較する等。 ）。３７℃で４２時間インキュベートした後、各マイクロウェルに１０μＣの³ Ｈ−チミジンを加え、次いでＡにこの放射性マーカーを用いて６時間更にインキ ュベートした。次に、取り込まれた³Ｈ−チミジンの量を液体シンチレーション カウンターで測定した。 ３．１．３ 細胞カウントアッセイ ＮＢ₂−１１Ｃラットリンパ腫細胞系の細胞をシンクロナイズし、細胞を５％ 胎児牛血清を添加したＲＭＰＩ中で培養する以外、これまでに開示された（Gert ler ら、1985，Endocrinol.，116:1636-1644）ように培養した。Ｇ₀／Ｇ₁フェー ズでのＮｂ₂−１１Ｃ細胞のシンクロナイズ及び自己増殖のモニターを先に開示 （Gertler ら、上記文献）されたように行った。手短に説明すれば、馬血清を添 加した培地に細胞を移し、一夜インキュベートした。次いで、該細胞を約３×１ ０⁵細胞／ml に希釈し、２４ミクロウェルプレートに０．５ ml／ウェルで、複 数のウェルに分配した。次に、０．５ ml までの量の試験溶液を加え、自己増殖 を２mg/ml の最終濃度でｈＧＨを添加することによって開始した。細胞を５％の ＣＯ₂を含有する雰囲気中、３７℃でインキュベートし、７２時間インキュベー トした後、これらをコールター−カウンターでカウントした。各実験を二回繰り 返して行った。 Ｎｂ₂−ＳＰ及びＩＭ−９細胞系の細胞を同様の方法で試験した。 ３．２ 結果 ３．２．１ ＭＦ 新生児ラット横紋筋細胞の一次培養物から誘導された３，０００ダルトンのＭ Ｆ限外濾過液を用いた結果を図１及び図２に示し、Ｌ−８細胞から誘導された３ ，０００ダルトンのＭＦ限外濾過液を用いた結果を図３及び４に示した。これら の各々の図において、横軸の数字は、希釈の逆数（「１」−未希釈、「２」−二 倍希釈等）を表し、縦軸は、放射能（１分あたりのカウント数−ＣＰＭ）を示す 。対照（各々の場合で、左側の縦棒）にはＣＭと同じ方法で加工された未調節の 培地を用いた。 図１及び３に示されるように、ラット横紋筋細胞（図１）の一次培養物又はＬ −８横紋筋細胞（図３）から得たＭＦは腫瘍細胞の増殖を阻害したが、正常細胞 にはこのような阻害効果は全く有していなかった（それぞれ図２及び図４）。ま た、粗製ＣＭに存在する抗増殖活性が限外濾過液で維持されるという事実に よって明らかなように、ＭＦは３，０００ダルトンの分子カットオフを有する膜 を通して濾過されることがわかるであろう。更に、図１及び３から明らかなよう に、ＭＦの影響は希釈の程度を上げるに従って減少し、これは更に、この効果が 限外濾過液で特異的なファクターによって媒介されることを示している。 図５は、種々の希釈率において、Ｌ−８系から誘導された粗製ＣＭ、並びにそ の３，０００ダルトンでのＭＦ限外濾過液の活性を示した。明らかなように、粗 製ＣＭは、限外濾過液で維持される抗増殖活性を示した。更に、この効果は、希 釈の程度を上げるに従って減少し、これはまた、これが特異的なファクターで媒 介される活性であることを示している。 Ｌ−８細胞系から誘導される３，０００ダルトンのＭＦ限外濾過液（未希釈） の効果は、図６に示されている（結果は対照に対する百分率として示されている 。各実験の対照を１００％とみなした。）。明らかなように、ＭＦは試験された 全ての腫瘍細胞系の増殖を阻害する活性を有していた。 図７は、３種類の細胞系の増殖の阻害における、ヒト筋芽細胞から誘導される ３，０００ダルトンのＭＦ限外濾過液の活性を示す（結果は対照に対する百分率 で示されている。）。Ｂ−１６及びＫ５６２細胞系の増殖は、³Ｈ−チミジンの 取り込みを決定することで試験した。Ｎｂ₂細胞系の増殖は細胞数をカウントす ることによって試験した。ヒトから誘導されたＭＦは試験された全ての細胞系の 増殖の阻害において活性であることがわかる。 他の実験で、腫瘍細胞の増殖を阻害する活性が見出された分取用ＲＰ−ＨＰＬ Ｃから得られたフラクション（図１５からのフラクション５及び６）を一緒に貯 蔵し、４５℃でエバポレートし、次いで５ ml の水に溶解し、チューブに移し、 再度真空下で乾燥し、最後に２ ml の水に溶解し、無菌化した。これらのフラク ションの所定量を試験し。３種類の異なった細胞系、Ｎｂ₂−１１Ｃ、ｎｂ₂−Ｓ Ｐ及びＩＭ−９の増殖を阻害するこれらの能力を決定した。 結果を以下の表Ｉに示した（増殖は細胞のカウントで決定した。）。 明らかなように、ＭＦは、ホルモン依存性Ｎｂ₂−１１Ｃ腫瘍細胞系、並びに ホルモン非依存性Ｎｂ₂−ＳＰ腫瘍細胞系の増殖を阻害した。これとは対照的に 、ＭＦは、非腫瘍性のヒトリンパ球細胞系ＩＭ−９には基本的に効果がなかった 。 図８は、ネズミ及びヒト細胞系の増殖における、３，０００ダルトンのＷＢＦ 限外濾過液の効果を示す。ここでも明らかなように、ＷＢＦは、試験されたネズ ミ及びヒト起源の全ての細胞系の増殖を阻害した。 ４． ＭＦ及びＷＢＦによるＰＨＡに対するリンパ球応答及びＭＬＲの in vi tro での阻害 ２個体から得たリンパ球を一緒に培養すると、各個体に対するＨＬＡはリンパ 球増殖を起こすであろう細胞反応を起こす（増殖は、２個体のＨＬＡ抗原間の差 に直接に関連する。）。この反応のＷＢＦ又はＭＦの効果を調査するために、２ 個体から得た１×１０⁶細胞／ml の単核細胞（この細胞は上記１．２で説明した ように調製した。）を１０％ＦＣＳを含有するＰＢＳ中でインキュベートし、異 なった希釈の３，０００ダルトンのＭＦ及びＷＢＦ限外濾過液をこの細胞に加え た。培養物を、５％ＣＯ₂、９５％空気の湿らせた雰囲気中、３７℃で５日間イ ンキュベートした。インキュベーションの債簿の６時間の間に、各ウェルに１μ Ci の³Ｈ−チミジンを添加した。細胞を回収し、３Ｈ−チミジンの取り込みをＬ ＫＢ液体シンチレーションカウンター（ＬＫＢ、ピスカタウェイ、ＮＪ、Ｕ．Ｓ ．Ａ．）で決定した。 ＰＨＡ（フィトヘマアグルチニン）はリンパ球の細胞表面糖に結合し、引き続 きの細胞増殖を伴う芽細胞形成へのリンパ球トランスフォーメーションを誘導す る。ＰＨＡで誘導される反応に関するＭＦ又はＷＢＦの効果を調査するために、 単核細胞を、１０⁶細胞／ml の濃度で、１０％胎児牛血清（イスラエルインダス トリーズ、ベト−ハ−エメク（Bet-ha-Emek）、イスラエル）及び１μｇ／ml の ＰＨＡ（ウェルカムラボラトリーズ、Ｕ．Ｋ．）を添加した各々０．２ ml のＲ ＰＭＩを含有する９６ウェルのマイクロウェルプレートに播いた。幾つかのウェ ルでは、０．２ ml のＲＰＭＩは、半分が本来のＲＰＭＩより成り、半分がＲＰ ＭＩ中の、Ｌ−８細胞から得た３，０００ダルトンのＭＦ限外濾過液より成る。 培養物をＣＯ₂インキュベータ中で４日間インキュベートし、インキュベーショ ンの期間の最後に１μ Ci の³［Ｈ］−チミジンを加え、更に２４時間インキュ ベートし、ダイアテック（Dyatech）細胞回収機で回収し、放射能をＬＫＢシン チレーターでカウントした。 図９は、ＰＨＡに対するリンパ球反応及びＭＬＲの阻害におけるＭＦの効果を 示す（結果は１：１希釈に対して示されており、対照に対する百分率として与え られている。）。定性的には、同様な結果がＷＢＦで得られた。更に、ＭＦ及び ＷＢＦの両方の効果は希釈に比例した（希釈の程度を上げると効果は減少する。 ）（結果は示していない。）。 ５． in vivo での研究 ５．１ ＭＦでのｉ．ｐ．接種、ｉ．ｐ．治療による腫瘍（ＭＣＡ）の誘導 ３０匹のＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスに２．５×１０⁵のＭＣＡ−１０５細胞を腹 腔内注射した。このマウスを、「ＭＦ−ＳＰ」と以下（６．５．２節）で命名し たＲＰ−ＨＰＬＣフラクションの５ ml でｉ．ｐ．注射することによって一日に 二回処理した。このマウスを３３日目に殺し、腫瘍病巣を評価した。 代表的な結果を、腹腔を開いた２匹の動物を表した図１０に示した。ここで、 図１０Ａに示された動物はＭＦ−ＳＰフラクションで処理したものであり、図１ ０Ｂに示された動物は対照のＲＰＭＩ培地で処理されたものである。明らかなよ うに、非常に大きな腫瘍の成長が対照動物で観測された（図１０Ｂの矢印）が、 非常に小さな、目立たない腫瘍病巣（図１０Ａの矢印によって示されるもの）が 、ＭＦ−ＳＰで処理された動物で観測された。 ５．２ ＭＦでのｉ．ｐ．接種、ｉ．ｐ．治療による腫瘍（Ｂ−１６メラノー マ）の誘導 ４０匹のＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスに５×１０⁵個のＢ−１６メラノーマ細胞を ｉ．ｐ．注射した。２０匹のマウスを対照として供与し、ＰＢＳを毎日ｉ．ｐ． 注射した。２０匹のマウスをＬ−８から誘導された３，０００ダルトンのＭＦ限 外濾過液の１ ml で毎日処理した。これらのマウスを１５日目に殺し、動物の腹 腔での腫瘍の成長の程度を試験した。核実験グループの代表的な２匹のマウスの 開腹した腹腔を表す図１１から、非常に大きな多数の腫瘍病巣が対照動物で見出 すことができたが、処理動物では僅かな非常に小さい腫瘍病巣のみが存在してい ることがわかる。 ５．３ ｉ．ｐ．接種による腫瘍（ＭＣＡ−１０５）の誘導。ｉ．ｐ．及びｐ． ｏ．の両投与によるＭＦでの治療 ３０匹のＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスに２．５×１０⁵個のＭＣＡ−１０５細胞を ｉ．ｐ．注射した。１０匹のマウスを経口（ｐ．ｏ．）投与によりＬ−８マウス 細胞から誘導された３，０００ダルトンＭＦ限外濾過液の１ ml で毎日処理した 。１０匹のマウスを同じ溶液のｉ．ｐ．注射により毎日処理した。１０匹のマウ スを対照グループとして供し、ＲＰＭＩ培地を用いてｐ．ｏ．で毎日処理した。 これらのマウスを３０日目に殺し、これらの腹腔を露出し、これらの腫瘍成長 の程度を試験した。各グループの代表的な２匹のマウスを図１２にし示した。（ 図１２Ａ−ＭＦで処理したマウス。図１２Ｂ−対照）。図１２Ａから解るように 、ＭＦ処理された動物の腹腔で腫瘍増殖の形跡は全くなかったが、対照グルー プの動物の腹腔では大きな腫瘍病巣が現われた。この実験で、９０％の対照グル ープのマウスに腫瘍病巣が発達したが、ＭＦを用いてｉ．ｐ．又はｐ．ｏ．の何 れかで処理したマウスの４０％のみで病巣が発達した。 ５．４ ｉ．ｍ．接種による腫瘍の誘導（ＤＡ３胸部カルチノーマ）。ｉ．ｐ． 及びｐ．ｏ．投与によるＭＦでの治療 １×１０⁶個のＤＡ３細胞を、３０匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスの足に筋肉内（ｉ ．ｍ．）注射した。１０匹のマウスを対照として供与し、ＰＢＳのｉ．ｐ．注射 により毎日処理した。１０匹のマウスに、Ｌ−８筋細胞から誘導される３，００ ０ダルトンのＭＦ限外濾過液（ＰＢＳ中で調製した。）の１ ml のｉ．ｐ．注射 によって毎日処理した。１０匹のマウスを、同様のＭＦを含有する溶液でｐ．ｏ ．投与（１ ml）により処理した。マウスは、足に大きな腫瘍を発育させた。３ 週間後、マウスを殺し、転移による肺病巣が検出され、肺のこの病巣をカウント した。対照グループで２３．４±６の転移病巣をカウントしたが、これに対して 、ｉ．ｐ．処理グループでは６．２±１．３の病巣をカウントし、ｐ．ｏ．処理 グループでは２．２±０．６の病巣をカウントした。 ５．５ ｉ．ｖ．接種による腫瘍の誘導（Ｂ−１６メラノーマ）。ｐ．ｏ．投与 によるＭＦでの治療 ３０匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに５×１０⁵個のＢ−１６メラノーマ細胞を 静脈内注射した。２０匹のマウスに、Ｌ−８細胞から誘導された３，０００ダル トンのＭＦ限外濾過液の１ ml で、腫瘍の接種の日から開始して毎日ｐ．ｏ．投 与により処置した。１０匹を対照として供与し、ＰＢＳのみをｐ．ｏ．投与した 。１８日目にマウスを殺した。黒色腫瘍病巣の発達がこれらの肺に観測された。 ２つのグループの代表的な肺を図１３に示した（上列−対照。下列−ＭＦ処理。 ）。明らかなように、対照グループの肺に多くの黒色転移病巣が存在したが、実 験グループではわずかな小さな病巣が見出されたのみであった。 ６． 健康な個体及び癌患者から得た白血球細胞から分泌されたＷＢＦの度合い 単核細胞を２３の健康な個体の静脈血（血液銀行から得たサンプル）、及び３ ３の入院している癌患者から単離した。手順は１．２で開示したとおりである。 上清を２×１０⁶／ml の単核細胞の培養物から集め、上清を集め、次に、２で開 示したように、３，０００ダルトンの分子カットオフを有するフィルターを通し て限外濾過した。 限外濾過液を、３種類の癌細胞系、Ｂ−１６ネズミメラノーマ、ＳＫヒトメラ ノーマ、及びＫ−５６２ヒト白血病細胞系から得た癌細胞の増殖を阻害するその 能力に対して試験した。 結果を図１４に示した。図１４Ａからわかるように、健康な個体の単核細胞か ら得た限外濾過液は、試験された細胞系の５０％以下の顕著な増殖の阻害を示し たが、癌患者からの限外濾過液では、非常にわずかな、決して十分ではない増殖 の阻害のみであった。図１４Ｂから更に明らかなように、２つのグループ間の重 なりは全くなかった。 これらの結果は、健康な個体から得たリンパ球によって分泌されたＷＢＦに比 べて癌患者から得た単核細胞によって分泌されたＷＢＦのレベルがかなり低い程 度であることを示している。従って、これらの結果は、本発明のＬＭＷ−ＥＧＲ のレベルを試験する診断の意義を示している。加えて、ＷＢＦの能力レベルも重 要な治療の有為性を有する。 ７． ＭＦの特徴づけ ７．１ バイオアッセイ 筋細胞ＣＭを、以下で更に説明するように分別し、種々のフラクションを上記 の細胞系を用いてアッセイした。細胞の成長に関する各フラクションの効果を³ Ｈチミジンの取り込み、又は上記の細胞カウントアッセイによって決定した。 ７．２ ＭＦの推定タンパク質特性の試験 ＭＦがタンパク質用物質であるか否かを決定するために、筋細胞ＣＭ（ラット 筋細胞一次培養物から誘導されたもの。）を、タンパク質分解酵素に対する感度 、凍結乾燥の間の安定性、及び種々の温度でのインキュベーションの効果を含む 一 連の処理にかけた。このような処理の後、ＣＭを最初の培地出希釈することによ って最初の塩及びタンパク質濃度に戻すか、又は希釈されている場合にはタンパ ク質濃度の希釈因子を、結果を評価するために考慮に入れた。使用したアッセイ は³Ｈチミジンの取り込みアッセイであった。 ７．２．１ 蛋白質分解酵素の効果 トリプシン及びプロナーゼ（この２つは、蛋白質分解酵素製剤である。）を試 験した。トリプシンの効果を決定するために２種類の手順を使用した。 （ｉ）ＭＦを含有する溶液を３７℃で４時間トリプシン（０．５〜２μｇ／ml） でインキュベートし、次いでトリプシン活性を約２倍モルの大豆トリプシン阻害 剤（ＳＴＩ）を添加することによって停止した。非調節培地（ＭＦを含まない） を対照として使用した。 （ii）ＭＦを含有する溶液を３７℃で１〜４時間、又は室温で一夜トリプシン（ ０．５〜２μｇ／ml）でインキュベートし、インキュベートに続いて、酵素をＰ −アミノベンズアミジンアガロースのカラムで除去した。ＭＦを含まない培地を 対照として供した。更に対照をトリプシンのみで試験し、これによりカラムの実 行条件下−重炭酸塩バッファーでこのカラムからトリプシン活性体が溶出されな かったことが示された。 プロナーゼの効果を試験するために、セファロースゲルに固定化されたプロナ ーゼと筋細胞ＣＭを接触させて、筋細胞ＣＭを試験した。ここでもまた、ＭＦを 含まない培地を対照として使用した。結果を以下の表 II に示した（数字は非調 節対照培地と比較した阻害％を表す。）。 上記は、両手順によるトリプシン、並びにプロナーゼでの処置がＭＦの腫瘍成 長阻害活性に有為な影響がないことを示している。 ７．２．２ 凍結乾燥 筋細胞ＣＭを前透析せずに凍結乾燥し、次に凍結乾燥物をその元の容積まで水 で再溶解した。この処理によって、ＭＦの腫瘍成長阻害活性にはっきりと感知で きる損失はなかった。従って、ＭＦが凍結乾燥に安定であることが示された。 ７．２．３ 熱処理 筋細胞ＣＭ（先のラット筋細胞培養物から誘導されたもの。）を４〜１００℃ の範囲の温度で、種々の時間に渡って処理した。これらの処理の後、サンプルを ＭＣＡ及びＨＴＢの両細胞で処理した。結果を以下の表IIIに示した（数字は温 度処理後のＭＦの阻害能力の変化（％として）を示す。 他の一連の実験で、調節培地の３，０００ダルトンの限外濾過液を沸点まで加 熱して試験した。腫瘍細胞の増殖を阻害する、この低分子量フラクションの活性 の何れの損失もなかった。 上記の結果は、１００℃での煮沸を含めた試験温度の全てで阻害能力の減少が ないことを示す。 ７．２．４ まとめ 腫瘍細胞の成長を阻害するＭＦの能力の減少は試験された条件下では全く観測 されなかった。これは、明らかに、ＭＦがタンパク質でないことを示している。 これに対して、幾つかの処理の後に阻害活性が増加する結果が示された。これは 、ＭＦを含有する培地が、ＭＦに対して逆の効果を発揮し、処理中に破壊される タンパク質因子を含有するという事実によって説明しうる。 ７．３ ＭＦのサイズ ＭＦを含有するＣＭを、１０、２及び０．５ｋＤの分子カットオフを有するア ミコン膜の限外濾過によって分別した（滞留物は少なくとも１回の追加のＰＢＳ の所定容積を用いて各場合で二回濾過した。）。１０及び２ｋＤの膜の場合、基 本的に全ての阻害活性体（９０％以上）が最初の２回の濾液中に見出された。０ ．５ｋＤの膜では、約８０％の活性体が濾液中に見出され、若干の活性体（２０ ％）が二回目の滞留物中に残留した。阻害活性体をＨＴＢ３８及びＭＣＡ両細胞 により各場合で試験した。 ＭＦを含有するＣＭの、１２及び３ｋＤの分子カットオフを有する膜を通して の透析で、活性成分が両方の膜を通り抜けることが示された。 上記の結果は、ＭＦが約５００ダルトン以下のオーダー、又はそれ以下の分子 量を有することを示している。 ７．４ ＭＦ（ラット筋細胞の一次培養物から誘導されたもの）のＲＰ−ＨＰＬ Ｃでの特徴付け １０ｋＤ膜の濾液をＣ−１８逆相（ＲＰ）カラム（４×２５０ mm）でクロマ トグラフにかけた。濾液を、カラムに塗布する前に０．１％トリフルオロ酢酸溶 液に希釈し、初期濃度にした。これを５〜３５％グラジェントのアセトニトリル で展開した（これらの両成分は、予めこれらがＭＦの阻害活性を有さないことを 決定するために試験しされた。）。ＨＴＢ−３８細胞で試験された活性体は０． １％ＴＦＡ中１５％アセトニトリルで溶出された。次に活性フラクションをアセ トニトリルグラジエントで同じカラムで再度クロマトグラフィーにかけ、部分的 に精製されたＭＦが以前と同様の位置（保持時間約２１分）で溶出された。最初 の２回と同様の条件下でこの最後のフラクションについて三回目のＲＰクロマト グラフィーを行った。単一の阻害ピークが見出され、これは、図１５に示される 溶出プロフィールの２２０nmの吸光度のピークの位置と一致した。 ７．５ ＭＦ（ラット筋細胞の一次培養物から誘導されたもの）の大量精製 ７．５．１ 実験プロトコール ラット筋細胞ＣＭをアミコンの１０ｋＤ膜で限外濾過した。１０ｋＤの濾液を 、分取用ＨＰＬＣカラムに取り付けられたＣ−１８逆相（ＲＰ）カラム（４７× ３００ mm）でクロマトグラフィーにかけた。フラクションをＨＴＢ−３８細胞 を用いた細胞増殖で試験し、活性フラクションを二回目のＣ１８ＲＰカラム（分 析用：４×２５０ mm）で再度クロマトグラフィーにかけ、活性フラクションを 上記のように同定した。 ７．５．２ 精製されたＭＦフラクションの活性 セクション７．５．１の最後のステップで得られた物質を「ＭＦ−Ｐ」と命名 した。一方、最初のＲＰカラムの後に得られた物質を「ＭＦ−ＳＰ」と命名した （このフラクションは、セクション５．１でも試験された。）。粗製調節培地（ ＣＭ）、ＭＦ−Ｐ及びＭＦ−ＳＰフラクション、並びに限外濾過の滞留物（Ｒ） の活性を以下の表IVに示した（活性はu/ml で表した。１ｕは増殖アッセイで５ ０％の阻害を起こす物質の量として定義される。）。 明らかなように、試験された全てのフラクションは試験された細胞系の増殖を 阻害する活性を有していた。これにはＲフラクションも含まれ、活性因子は、米 国特許５，２４２，６９２で開示された腫瘍増殖阻害剤の可能性がある。 ７．６ Ｌ−８細胞系から誘導されるＭＦのＨＰＬＣによる特徴付け セクション７．６．１〜７．６．５で、幾つかの代表的なＨＰＬＣの結果を示 した。セクション７．６．１ではＭＦの例示的な精製法を示す。 ７．６．１ 逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣ ＰＢＳ中、１６０ ml の３，０００ダルトンのＭＦ限外濾過液（ＰＢＳで筋細 胞を８時間インキュベーションした後に得られたもの。）をＲＰ−ＨＰＬＣカラ ム（Ｃ−１８）を通してクロマトグラフィーにかけた。溶出溶液は、Ｂ−ピュア ー^TM（B-pure^TM）装置（Barnstead，Dubuque，Iowa）で調製されたＨＰＬＣグレ ードの水、及びＨＰＬＣグレードのアセトニトリル（G.T．Baker，U.S.A.）であ った。溶出液の勾配は、３０分間で、０％アセトニトリルから６０％アセトニト リルまでの間であった。流速は１００ ml/分であった。２分間づつフラクション （各２００ ml よりなる。）を集めた。 得られた各ＨＰＬＣフラクションの２０ ml を濃縮遠心機で乾燥するまで蒸発 させ、次いで乾燥したフラクションを１００μｌの水に懸濁し、次いで乾燥する まで再度蒸発させ、次いで２ ml のＰＢＳに溶解し、次いで試験細胞を含有する ミクロウェルに各フラクションから０．２ ml を塗布することによってフラクシ ョンを細胞カウントアッセイでこれらの増殖阻害活性に対して試験した。 図１６及ぶ１７は２つの異なった実験での種々のフラクションの活性を示す。 両結果は特異的な阻害の存在を示した。これらは、図１６のフラクション５及び ６、及び図１７のフラクション８〜１２で溶出された。 図１６のフラクション５及び６を貯蔵し、４５℃で蒸発させ、５ ml の水に溶 解し、チューブに移し、真空下に再度乾燥し、２ ml の水に溶解し、無菌化した 。これらの濃縮されたフラクションの１ ml を、１００％の水から６０％アセト ニトリルの間の操作溶液の２０分以内のグラジェント、及び流速１ ml/分で分析 用ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ−１８）カラムでクロマトグラフィーにかけた。フラクシ ョンを１分づつ（各１ ml）集め、次いで乾燥し、５％ＨＳを含有する０．４ ml のＲＰＭＩに溶解し、無菌化した。０．１５ ml を細胞を含む各ウェルに加え た（活性は細胞カウントアッセイで決定した。）。対照として、ＰＢＳ溶液をＨ ＰＬＣで分別し、同様の方法で活性を試験した。 種々の溶出されたフラクションの活性を図１８に示した。これらの結果はフラ クション１５に特異的な阻害の存在を示す。 ７．６．２ スーパーデックスカラムでのＨＰＬＣ 図１７の活性フラクションを２つの貯蔵されたフラクションに分割した。「Ｆ Ｒ１」と命名された第一のフラクションは、チューブ６〜８からの１２００ ml 、チューブ８〜９からの５５０ ml、チューブ９〜１０からの３００ ml 及びチ ューブ１０〜１１からの３０ ml を合わせて得られた。「ＦＲ２」と命名された フラクションは、チューブ９〜１０の２５０ ml、チューブ９〜１１の５２０ ml 及びチューブ１１〜１２の６００ ml から得られた。ＦＲＩ及びＦＲ２の各々 を乾燥し、１０ ml の蒸留水に溶解した。不溶性の沈殿が遠心後に形成されるの で、これらのフラクションを更に１０ ml（ＦＲＩの場合）及び５ ml（ＦＲ２の 場合）のＰＢＳで抽出した。二回の抽出の後でもかなりの沈殿が残った。 この結果は、ほとんどの活性体がＦＲ１に存在すること、ＦＲ２はＦＲ１の活 性体の約１５〜２０％のみを有することを示している。不溶な調製物のＰＢＳ抽 出物はＦＲ１と比較して約４％の活性体のみを与えた。 ２ ml のＦＲ２を乾燥し、０．４ ml の水に溶解した。この０．２ ml をＰＢ Ｓで平衡にしたスーパーデックスカラムにかけた。カラムを１ ml/分で、操作溶 液としてＰＢＳを用いて展開し、１ ml のフラクションを集めた。採集を分離の 開始後０．３分から開始した。溶出されたフラクションを無菌化し、この０．２ ml を各ウェルに加えた。 スーパーデックスカラムから溶出された種々のフラクションの阻害は、図１９ に示されている。特異的な阻害はフラクション１８〜２２に見出されうる。フラ クション１８〜２２を集め、同じ条件下、同じカラムで再度クロマトグラフィー にかけた。再クロマトグラフィーの結果は、これらのフラクションに２以上の活 性物質（「ＭＦｓ」）の混合物が存在する可能性を示している。 同様の溶出プロフィールもＦＲ１で得られているが、結果は、ＦＲ１が、ＦＲ ２と比較して、そのＭＦ内容物について約１０倍以上濃縮されたことを示してい るようである。 ７．６．３ スーパーデックスＨＰＬＣ後の分析ＲＰ−ＨＰＬＣ フラクションＦＲ１及びＦＲ２を貯蔵し、１ ml のアリコートを分析用ＲＰ− ＨＰＬＣ（Ｃ−１８）カラムにかけた。１ ml づつのフラクションを集め、乾燥 し、５％ＨＳを含有する０．４ ml のＲＰＭＩに溶解し、この溶液の０．５ ml を各細胞を含有するウェルに塗布した。結果を図２０に示した。明らかなように 、チューブ１６に１つのシャープな活性のピークがあった。加えて、チューブ４ にも低い阻害活性があった。これらの結果は、筋細胞ＣＭに１以上の腫瘍増殖阻 害物質があることを示している。 ７．６．４ サイズ排除（ＳＥ）ＨＰＬＣ 分取用ＲＰ−ＨＰＬＣから得たフラクション６〜８（「Ａ」）、８〜１０（「 Ｂ」）、１０〜１２（「Ｃ」）及び１２〜１４（「Ｄ」）を、ポリヒドロキシエ チルアスパルタミド（ポリヒドロキシエチル−Ａ^TM（PolyHYDR0XYETHYL-A^TM）ポ リＬＣにより製造）でコーティングされたシリカゲル粒子を含むカラム で、別々にクロマトグラフィーにかけた。操作溶液は、５０μＭの蟻酸水溶液の イソクラチック溶液（即ち、グラジェントを設けず。）であった。 ０．５ml のフラクションを集め、乾燥し、０．８ ml のＰＢＳに溶解した。 次に、０．１５ ml の各フラクションを各細胞を含有するウェルに塗布した。ク ロマトグラフィーの結果を図２１に示した。この結果は、恐らく、チューブ３２ で弱い活性があること以外、フラクション６〜８２活性が全くないことを示して いる。フラクションＢでは、非常に明確で幅広の活性ピークがチューブ２９〜３ ７に見出された。フラクションＣでは、２つの明らかな活性のピークがあり、１ つはチューブ２１〜２３に、他方はチューブ２８〜３１にあった。最後に、フラ クションＤでは、チューブ２１〜２２に単一の活性のピークが見られた。 ７．６．５ ＳＥ−ＨＰＬＣ後のスーパーデックスＨＰＬＣ ＳＥカラムから溶出された活性フラクションを貯蔵し、高真空（Hetovac ＶＲ −１、Heto，Denmark）下、濃縮遠心で乾燥し、０．４ ml に溶解し、次いで０ ．２ ml のサンプルをＰＢＳで平衡化したスーパーデックスカラムで分離した。 １ ml のフラクションを集め、次いで０．２ ml を各細胞を含有するウェルに塗 布した。 図２２Ａからわかるように、フラクションＢのＳＥ−ＨＰＬＣのチューブ２９ 〜３３は、スーパーデックスカラムから溶出されたチューブ２１〜２４で阻害活 性を示した。この活性プロフィールは、１以上の活性物質があること、又は活性 物質が幾つかの形態で出現することの可能性を示している。 図２２Ｂは１７〜２１分で溶出される特異的な阻害ピークを示す。 ７．６．６ 親水性相互作用ＨＰＬＣ 以下の図２５で示されるサイズ排除ＨＰＬＣのアリコートから得たフラクショ ン３７〜３２を一緒に貯蔵し、乾燥し、０．２ ml の水に溶解した。２つの各０ ．０８５ ml の量を親水性相互作用（ＣＨＯ）ＨＰＬＣカラム（PolyGLYCOPLEX^{T M} 、ポリ−ＬＣにより製造）に注入した。次にこのカラムを、７０％アセトニト リル水溶液よりなる溶液を用いて、１ ml/分の操作速度で展開した。１ ml づつ のフ ラクションを集め、乾燥し、０．６ ml のＰＢＳに溶解し、０．１ ml のフラク ションを９６ミクロウェルプレートの各ウェルに塗布し、生理食塩水カウントア ッセイ（セクション３．１．３）で試験した。 このカラムから溶出された溶液の活性プロフィールは図２３から明かである。 ＣＨＯアリコートのもっとも高い特異的阻害がフラクション２〜８２見出された が、第二の阻害ピークもフラクション１０で見出されたことがわかる。若干の弱 い活性もフラクション２１〜３０で広いピークとして観測された。 ８． ＭＦの精製 ８．１ 手順 以下のステップよりなるＭＦの精製の方法を開発した。 （ａ）調節培地の調製 調節培地を１．１．２で説明したように、ＰＢＳ中でＬ−８細胞から調 製した。 （ｂ）限外濾過 調節培地を、２で説明したように、３，０００ダルトンの分子カットオ フを有する膜を通して限外濾過にかけた。 （ｃ）分取ＲＰ−ＨＰＬＣ 次に、限外濾過液を分取ＲＰ−ＨＰＬＣ、Ｃ−１８カラムでクロマトグ ラフィーにかけた。典型的には、まず、カラムをＨＰＬＣグレードの水で２０分 洗浄し、次いで２００ ml の３，０００ダルトン限外濾過液をこのカラムに導入 し、更に１０分間水での洗浄を続けた。次にこのカラムをアセトニトリル：水の 、３０分間で０％アセトニトリルから６０％アセトニトリルのグラジェントで展 開した。展開溶液の速度は約１００ ml/分であった。活性フラクションは約８〜 １４分の間にカラムから溶出した。 次に活性フラクションを一緒に貯蔵し、次いでこの貯蔵したフラクショ で濃縮し、次いで濃縮遠心した。 （ｄ）分析ＲＰ−ＨＰＬＣ 次に貯蔵し、濃縮し、乾燥したフラクションを５ ml の水に溶解し、再 度真空下で乾燥し、次いで２ ml の水に溶解した。次に、この濃縮したフラクシ ョンの１ ml を、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ、Ｃ−１８カラムでクロマトグラフィー にかけた。操作溶液はアセトニトリル：水の、２０分間で０％アセトニトリルか ら６０％アセトニトリルグラジェント、１ ml/分の流速であった。このカラムを 導入し、次いで５分間水で洗浄した。この洗浄の後、カラムをアセトニトリルの グラジェントで展開した。 活性フラクションは１２〜１９分の間に得られたフラクションに溶出し た。 次に活性フラクションを濃縮し、濃縮させた遠心機中で乾燥した。 （ｅ）サイズ排除クロマトグラフィー 次に、乾燥されたフラクションを蟻酸と混合し、次いでこの溶液の２０ ０ ml サンプルを７．６．４で説明したサイズ排除カラムに導入した。展開溶液 及び操作条件は７．６．４で説明したとおりである。活性フラクションは主に２ ７〜３２分後に溶出した。 上記の仕様と同様の仕様を有する場合でさえも、異なったカラム及び溶出条件 のわずかな変更で異なった溶出プロフィールが得られ、従って、活性フラクショ ンは上で報告したものと異なった保持時間の後に溶出されうる。しかし、上記の ような阻害活性に対する各フラクションの試験によって、当業者は何れの過度の 困難さもなく、本発明のＧＲを含有する精製されたフラクションの位置を見出し 、単離することが可能であろう。 ８．２ 精製の結果 図２４は分析ＲＰ−ＨＰＬＣから溶出されたフラクションの阻害活性プロフィ ール、及びサイズ排除ＨＰＬＣ（図２５）から溶出されたフラクションの活性を 示す。精製手順はセクション８．１で先に説明したとおりである。 ９． ＮＭＲ−ＭＦの可能なオリゴ糖特性 図２５に示されたようなサイズ排除カラムから溶出された活性フラクションを 乾燥し、次いでメタノールに溶解した（乾燥及び続きのメタノールへの溶解を連 続して三回のサイクルで行った。）。次に、メタノール抽出物を乾燥するまで蒸 発させ、調製物を０．５ ml の重水素化メタノールに再溶解した。メタノールで の抽出後の残りを０．５ ml の重水に溶解した。 ＮＭＲスペクトルを図２６に示した。明らかなように、水フラクションのＮＭ Ｒは１つの僅かなピークを示したが、メタノール抽出物のＮＭＲは３〜４ppmの 部分に幾つかのピークを示した。これらのピークはオリゴ糖に典型的なＣ−ＯＨ 基のプロトンに特徴的なものである。 これらの結果は、ＭＦがオリゴ糖である可能性を示唆する。 １０． 白血球細胞ＣＭの３，０００ダルトンの限外濾過液及びこれらの分別物 の活性 白血球細胞ＣＭから得られた３，０００ダルトンの限外濾過液を活性試験にか け、Ｌ−８ＣＭから得られた３，０００ダルトンの限外濾過液のそれと比較した 。結果を以下の表Ｖに示した。 白血球細胞ＣＭから得た２００ ml の３，０００ダルトンの限外濾過液を上記 （セクション７．６．６参照）のような分取ＲＰ−ＨＰＬＣで分離した。２００ ml のフラクションを集めた。１０（２００の中から）mlのアリコートを乾燥し 、０．６ ml に溶解した。この後、０．１ ml を各ウェルに塗布した。 比較として、Ｌ−８ＣＭから得た３，０００ダルトンの限外濾過液を同様の方 法で分別した。 結果を以下の表VIに示した。 明らかに、両アリコートはフラクション４〜６２阻害ピークを示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ギルギス、 ラオフ アメリカ合衆国、バージニア州 22031− 2209、フェアーファックス、プラスパラテ ィー・アベニュー 2930、キャンダー・ダ イアグナスティックス・ホールディング・ カンパニー内

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 実質的に精製された細胞成長因子（ＧＲ）であって、 （ａ）ＬＭＷ−ＥＧＲが以下の特性を有する物質であるか、 ｉ．これが筋細胞又は白血球細胞から分泌されるか、又はこれらによって 発生されることにより産生される； ii．これが約３，０００ダルトン以下の分子量を有する； iii．これが非タンパク質性である； iv．これが水に可溶である； ｖ．これが熱に安定である；及び、 vi．これが細胞の増殖を阻害することにおいて生物学的に活性である。 又は （ｂ）（ａ）の物質の誘導体である物質及び細胞の増殖を阻害することにおいて 生物学的に活性である物質 の何れかであるもの。 ２． 請求の範囲第１項に記載のＧＲであって、前記ＬＭＷ−ＥＧＲが筋細胞 又は白血球細胞から分泌されるか、又はこれらによって発生されることにより産 生されるもの。 ３． 請求の範囲第１項に記載のＧＲであって、腫瘍細胞の増殖、又は刺激さ れたリンパ球の増殖を阻害することにおいて生物学的に活性であるもの。 ４． 請求の範囲第１項に記載のＧＲであって、非腫瘍細胞の増殖に実質的に 影響を与えずに腫瘍細胞の増殖を阻害することにおいて生物学的に活性であるも の。 ５． 請求の範囲第４項に記載のＧＲであって、骨髄細胞の増殖に実質的に影 響を与えることなく腫瘍細胞の増殖を阻害することにおいて生物学的に活性であ るもの。 ６． 請求の範囲第４項に記載のＧＲであって、非腫瘍性リンパ球の増殖に実 質的に影響を与えることなくリンパ腫細胞の増殖を阻害することにおいて生物学 的に活性であるもの。 ７． 請求の範囲第１項に記載のＧＲであって、前記ＬＭＷ−ＥＧＲが筋細胞 又は白血球細胞の何れかの、培地中での成長によって調節された培地から得られ うるもの。 ８． 請求の範囲第１項に記載のＧＲであって、約２，０００ダルトン以下の 分子量を有するもの。 ９． 請求の範囲第８項に記載のＧＲであって、約５００ダルトン、又はこれ 以下の分子量を有するもの。 １０． 請求の範囲第１項に記載のＧＲであって、前記ＬＭＷ−ＥＧＲがＬ− ８と命名され、ＣＲＬ１７６９の名の下にアメリカンタイプカルチャーコレクシ ョン（ＡＴＣＣ）に寄託されたラット筋細胞系によって分泌又は発生されるもの 。 １１． 治療的に効果のある量の請求の範囲第１項に記載のＧＲを、必要とし ている患者に投与することを具備した疾患又は障害の治療又は予防の方法。 １２． 請求の範囲第１１項に記載の方法であって、前記疾患又は障害が癌で ある方法。 １３． 請求の範囲第１１項に記載の方法であって、免疫系を鋭敏にさせる症 状の治療のための方法。 １４． 請求の範囲第１１項に記載の方法であって、前記ＧＲが患者に経口的 に投与される方法。 １５． 請求の範囲第１項に記載のＧＲを含有する組成物。 １６． 請求の範囲第１５項に記載の組成物であって、これが薬学的組成物で あり、治療的に効果のある量の請求の範囲第１項に記載のＧＲを薬学的に許容し うる担体又は希釈剤と供に含有する組成物。 １７． 請求の範囲第１６項に記載の組成物であって、経口投与のための組成 物。 １８． 個体の癌の状態の診断、又は癌を発達させる個体のリスクを決定する ための方法であって、 （ａ）個体からの体液、又は前記個体から採取した細胞の培養物からの上清の何 れかである試験液体を得ること； （ｂ）該試験液体中の、請求の範囲第１項で定義したＬＭＷ−ＥＧＲのレベルを 決定すること； （ｃ）健康な個体の前記ＬＭＷ−ＥＧＲの平均レベルに対して前記レベルを比較 すること。ここで、前記平均レベルは前記個体が癌を有するか又は高いリスクで 癌を発達させる個体の指針となる； を具備する方法。 １９． 実質的に精製された細胞成長調節因子の調製方法であって、 （ａ）細胞がこれらの回りの培地に細胞成長調節因子を産生し、分泌し、又は発 生させる条件で、細胞を成長させること、 （ｂ）細胞培養物の上清を集めること、 （ｃ）約３，０００ダルトン以上の分子量の物質を含有する上清のフラクション と、約３，０００ダルトン以下の分子量の物質を含有する上清のフラクションを 分離し、後者を選択すること、 を具備した方法。 ２０． 請求の範囲第１８項に記載の方法であって、 （ｄ）選択されたフラクションを更にクロマトグラフィーによる精製手段にかけ ること、 を具備した方法。 ２１． 実質的に精製された細胞成長調節因子の増殖の方法であって、 （ａ）筋細胞又は白血球細胞を培養すること、 （ｂ）細胞培養物から上清を集めること、 （ｃ）約５００から３，０００ダルトンの分子カットオフを有する膜を通して該 上清を濾過すること、 （ｄ）（ｃ）で得られた濾液を、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰ ＬＣ）カラムを通してクロマトグラフィーにかけ、腫瘍細胞に関して増殖阻害活 性を示すフラクションを選択すること、 を具備した方法。 ２２． 請求の範囲第２０項に記載の方法であって、 （ｅ）ステップ（ｄ）で得られた選択されたフラクションをＲＰ−ＨＰＬＣカラ ムを通して再クロマトグラフィーにかけ、腫瘍細胞に関して成長阻害活性を示す フラクションを選択すること、 を具備した方法。 ２３． 請求の範囲第２０項に記載の方法であって、 （ｅ）ステップ（ｄ）で得られた選択されたフラクションをサイズ排除クロマト グラフィーでクロマトグラフィーにかけ、腫瘍細胞に関して成長阻害活性を示す フラクションを選択すること、 を具備した方法。