JPH10509049A

JPH10509049A - 毒物検出のための凍結乾燥生物発光細菌試薬

Info

Publication number: JPH10509049A
Application number: JP8517066A
Authority: JP
Inventors: バン・デイク，テイナ・カンガス; ワグナー，ロレイン・ウイノナ
Original assignee: イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー
Priority date: 1994-11-23
Filing date: 1995-11-20
Publication date: 1998-09-08
Also published as: EP0793729A1; ATE222605T1; CA2200702A1; WO1996016187A1; EP0793729B1; CA2200702C; DE69527850D1; US5731163A; DE69527850T2

Abstract

(57)【要約】ｌｕｘ遺伝子複合体に操作的に連結されたストレスプロモーターを含む細菌性細胞を含む環境障害物の検出の際に有用な試薬が、明記される培地中でその細菌を凍結乾燥させることにより調製された。この試薬は再水和の際に即座に用いてもよく、この際には環境障害物の存在についての陽性検査結果は、その細胞からの光発生の増加により示される。

Description

【発明の詳細な説明】毒物検出のための凍結乾燥生物発光細菌試薬発明の分野本発明は、検査用試薬として凍結乾燥生物発光細菌を用いる亜致死性レベルの環境障害物の検出のための方法に関する。技術的背景国民一般の懸念が募り、かつ政府の規制が強まることにより土壌および地下水の汚染物質を検出することが可能な環境探知系の開発に拍車がかかってきている。例えばガスクロマトグラフィーおよびマススペクトロフォトメトリーのような、感度がかなり高くかつ特異的な検出系がここ数年で知られてきているが；しかしながらこれらの系は高価な設備および熟練したオペレーターを必要とする。それに加え、試料の調製およびデータ解析は繁雑でありかつ長時間を要することがしばしばである。標準的米国水毒性検査に用いられる例えばダフニア（Ｄａｐｈｎｉａ）のような生きた生物体を必要とする毒性アッセイはより単純であるが；しかしながらこれらの検査は非特異的でありかつ特に迅速であるわけではない。細胞を基にする毒性アッセイ（これは高感度因子として細菌を取り込む）は幾分迅速である。これらの系は通常の自動分析系における試薬として細菌性細胞を用いる。例えば、ＲＯＤＴＯＸ系（ＣｅｎｔｒａｌＫａｇａｋｕ社、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）は、細菌の酸素消費を測定するバッチアッセイであり、かつ下水植物での使用のために設計された。例えば、ＧＢＩＴＯＸＡＬＡＲＭ系（ＧｅｎｏｓｓｅｎｓｃｈａｆｔＢｅｒｌｉｎｅｒＩｎｇｅｎｉｅｕｉｒｋｏｌｌｅｃｔｉｖｅ社、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のような細菌を基にする他の系は特定の化学物質の存在を測定することができる。ＧＢＩＴＯＸＡＬＡＲＭは、試料中の僅か０．１ｐｐｍ程のシアン化カリウムの存在を検出することが可能であることが知られている。これらの検出系は有用ではあるが、煩雑かつ複雑な検出系ということが使用の妨げとなっている。最近では細菌性生物発光の現象が環境探知系における一層単純かつ一層高感度な検出様式を提供するとみなされている。細菌性生物発光は５つの構造遺伝子（ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、およびｌｕｘＥ）の産物が協働して光を発生するように働く現象である。天然生物発光生物体が毒性検査における高感度要素として用いられている。ＭＩＣＲＯＴＯＸ系（ＭｉｃｒｏｂｉｃｓＣｏｒｐ．社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）がその一例である。このＭＩＣＲＯＴＯＸ系はフォトバクテリウムホスポレウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｈｏｓｐｏｒｅｕｍ）の天然のベースライン発光を測定し、そしてそれをその生物体の周囲の環境の敵対作用に関連付ける。光の発生と、エネルギー産生の中心的代謝現象との間ではＡＴＰレベル、ＮＡＤＰＨレベル、およびＦＭＮＨ₂レベルの３つの共役がフォトバクテリウムホスポレウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｈｏｓｐｏｒｅｕｍ）での光発生にとって必須であるため、これらの代謝産物の有効性および相互作用を妨害するいずれかの障害物は生物発光（ｌｕｘ）系の活性の減少、およびそのためその生物体による光発生の関連ある減少を引き起こすであろう。生物発光系の主な属性は、光発生の減少が迅速であり、それが障害物への露出の数分以内に生じるということである。これらの系のもう一つの重要な利点は、光検出が鋭敏な程までに感受性が高く（単光子のレベルにまで至る）、そして携帯用野外装置へ容易に応用可能であることである。それに加え光検出の後方業務は検出器を湿った生物学的試料に接触させることの必要性（これは、検出器の汚れおよび腐食が有意な動作不能時間の原因となる競合技術（例えば、イオン選択的電極）の重大な弱点である）が排除させられる。ＭＩＣＲＯＴＯＸ系および類似の系は有用ではあるものの、それらの感度は、代謝的に細胞を死滅もしくは阻害する障害物の検出レベルに限定される。これらの系による検出のためには、その障害物が細胞の中心的代謝を阻害するかもしくはＬｕｘ蛋白質を不活化させるかのいずれかを行うに十分な高レベルに到達している必要がある。細胞代謝に影響を及ぼすのに必要とされるものを下回るレベルの障害物レベルを検出可能とすることが必要である。致死濃度の汚染物質が有用な微生物集団を根絶してしまい、著しい出費および工場の動作不能期間を被ることになってしまう廃棄物処理工場がこのような例である。好ましい探知系は、有用な微生物集団が被害を被る以前の亜致死性レベルで障害物の存在を検出することが可能なものであろう。このような初期の徴候を用いて、固有の微生物集団を救済するための迅速な救済活動を開始させることができる。最近になって、ｌｕｘ構造性遺伝子を化学的反応を示す細菌プロモーターに融合させ、そしてその後にそのようなキメラ体を適切な宿主内に入れることによる組換え細菌が開発されている。これらの組換え細菌は、特異的刺激に応答して増殖するセンサー生物体である。この種の遺伝子融合の一例が、Ｈ．Ｍｏｌｄｅｒｓ（欧州特許第４５６６６７号）により記載されている。その特許では、ｍｅｒプロモーター（具体的にはＨｇイオンにより誘導される）を含み、生物発光の原因となる細菌性ルシフェラーゼ（ｌｕｘＡＢ）遺伝子複合体に融合させてあるインディケーター細菌株（ベクターにより介在される遺伝子転移による）が提供される。Ｍｏｌｄｅｒｓの検査系は、水銀の存在によるｍｅｒプロモーターの誘導、およびその後に生じるその組換え細菌からの光放出の増加（これがその検査結果となる）を頼みとしている。最近になって本出願人は、ｌｕｘ遺伝子複合体に操作可能に連結されるストレス誘導性プロモーターを含む細菌性ディテクター生物体を必要とする環境障害物の検出方法を開示した。ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ、ｄｎａＫ、ｄｎａＪ、ｇｒｐＥ、ｌｏｎ、ｌｙｓＵ、ｒｐｏＤ、ｃｌｐＢ、ｃｌｐＰ、ｕｓｐＡ、ｋａｔＧ、ｕｖｒＡ、ｆｒｄＡ、ｓｏｄＡ、ｓｏｄＢ、ｓｏｉ−２８、ｎａｒＧ、ｒｅｃＡ、ｘｔｈＡ、ｈｉｓ、ｌａｃ、ｐｈｏＡ、ｇｌｎＡ、ｍｉｃＦ、およびｆａｂＡを初めとする多種多様のストレスプロモーターが利用可能であった。各ストレスプロモーターは異なる種類の環境ストレスに感受性を示すので広範囲にわたる検出が可能となる。このようなディテクター生物体の原則的な利用性の内の一つは、排水処理工場のモニターならびに隔離地点の遠方での環境的試料の検査の際の利用である。野外検査の目的のためにはディテクター生物体を検査用地点にまで輸送し、そしてその間ずっと検出の際の最大の感受性が認められるようにその細胞を適切な増殖条件下に維持するが、これは不便なものである。さほどの厳密さを必要とせずに取り扱うことができる試薬のほうが遠方での野外使用にとっての適用性はずっと高くなるであろう。その目的のために、生きている細胞を必要とする多数の検出系に凍結乾燥もしくはフリーズドライさせた細胞を試薬として用いることが試みられてきた。フリーズドライもしくは凍結乾燥させた細胞は多数の野外応用法および検出用キットにおける試薬として用いられてきている。例えばＭｃＫｉｎｎｅｙら（ドイツ特許第２１００４７６号）は、フリーズドライ微生物組成物が油の改善のための試薬として有用であることを開示している。カンジダリポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の培養物をフリーズドライし、そしてこれをヒル石と混合し、そして油層に露出するが、そこではイーストは迅速に増殖する。ＭｃＫｉｎｎｅｙは、細胞はフリーズドライおよび再構成することができ、かつそれでも、気候順応および増殖のための十分な期間をおいた後には生化学的に機能するに十分な生育力を保持していることを示している。しかしながらＭｃＫｉｎｎｅｙは、その細胞が再構成直後に全ての正常な代謝機能を利用することが可能であるか否かについての記述は行っておらず、かつ転写および翻訳を管理するメカニズムが気候順応および細胞増殖の期間の後まで作動状態になっていることの教示は行っていない。Ｙａｔｅｓ（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４４、１０７２、（１９８２））は、天然の生物発光であるフォトバクテリウムホスホレウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍ）の使用を必要とするマイコトキシンの検出方法を開示している。フォトバクテリウムホスホレウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍ）の５０％光減少（ＥＣ５０）をもたらすマイコトキシンの濃度が、乾燥状態からのその細菌の再構成直後および再構成後５時間目に検出された。Ｙａｔｅｓはマイコトキシンの存在をフォトバクテリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からの光の減少を基に決定しており、そして再水和後０時間目での光の５０％減少をもたらすには高目の濃度が必要とされることを記述している。Ｙａｔｅｓは、フリーズドライ細菌を再構成した直後には、マイコトキシンの存在に応答してフォトバクテリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からの光の減少が生じ得ることを示している。しかしながらフォトバクテリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）における光発生にとっての代謝上の必要条件は新たな蛋白質の合成を要求しないため、Ｙｅｔｅｓは翻訳因子および転写因子が再水和後０時間目にその細胞内で機能しているか否かを記載してはいない。最近Ｃｏｒｂｉｓｉｅｒら（Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．、９、２８９、（１９９４））はＶ．フィスケリ（Ｖ．ｆｉｓｃｈｅｒｉ）もしくはＶ．ハルベイ（Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉ）のいずれかからのｌｕｘ遺伝子複合体と融合させた幾つかの金属感受性プロモーターを含み、金属の検出のための細菌性生物発光センサーとして有用な、遺伝子工学的に操作されたアルカリゲネスバクテリア（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｂａｃｔｅｒｉａ）を開示している。Ｃｏｒｂｉｓｉｅｒは、細胞性生物発光用装置に不利な影響を及ぼすことなくこれらの細胞を凍結乾燥もしくはフリーズドライできることを記載している。しかしながらＣｏｒｂｉｓｉｅｒの方法は依然として、細胞センサーが用いられる前の細胞の新環境順化のためにかなりの期間を見込んでいる。生物学的試薬としてのフリーズドライ細胞の使用を示す上記方法は、フリーズドライ細胞は再水和後にそれらの代謝活性を維持することができるが、完全な代謝能力を回復するために新環境順化および増殖の期間を必要とするものとみなしている。本出願人は以前に、ｌｕｘ遺伝子複合体に操作可能に連結させたストレスプロモーターを含むプラスミドで形質転換させた細菌性細胞が、環境ストレスおよび毒物の検出方法においてはディテクター生物体として有用であることを示した。仮定されるメカニズムは、環境毒素の存在がそのストレスプロモーターを活性化し、そしてそれが次にはｌｕｘ遺伝子複合体を作動させて、その細胞による光発生の原因となる新しい蛋白質を合成させるというものである。障害物もしくは毒物の存在は光発生の増加（Ｙａｔｅｓ（上述）に見られる減少とは対照的である）を基に決定され、そして新しい蛋白質の合成を必要とする。本出願人は今回、これらのストレスディテクター細胞をフリーズドライすることができ、そしてそれらは再水和の際には環境障害物の検出方法に即座に使用できるという驚くべき発見に至った。再水和後に即座に使用されるというこれらの細胞の能力は驚くべきものである。なぜなら今日まで、再水和後にそれ程すぐに新しい蛋白質を合成するのに必要とされる代謝活性のレベルを示すフリーズドライ細胞は全く教示されていなかったためである。他の事例では全て、新しい蛋白質の合成が観察される前には細胞を新環境順化もしくは初期増殖の期間に供する必要がある。例えばＹａｔｅｓ（上述）の方法では、光発生は再水和の直後にはマイコトキシンの存在に応答して減少することが観察される。しかしながら光発生の減少を頼みとする天然の生物発光細胞（フォトバクテリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ））を用いる検査に必要とされる代謝的必須条件は、活性Ｌｕｘ蛋白質の存在、還元能力（ＮＡＤＨ）、およびＡＴＰのみに過ぎない。それとは対照的に、ディテクター細胞を用い、光発生のための遺伝子調節を頼みとする検査についての要件には、活性Ｌｕｘ蛋白質、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、およびＧＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼの存在、ならびに翻訳および転写についての全必要事項が含まれる。従って、本出願人の発明内に含まれる細胞が備えるべき要件は、当該技術分野において教示されるものよりもはるかに厳重である。発明の要約凍結乾燥された生物学的試薬による環境障害物の存在の検出方法が開示され、前記試薬はストレス誘導性プロモーター配列の制御下に発現性ｌｕｘ遺伝子複合体を含むディテクター生物体を含み、前記方法は：（ｉ）適切な水量で凍結乾燥された生物学的試薬を再水和させる段階であって、ベースライン生物発光が生じる段階）；（ｉｉ）即座にその再水和試薬を、環境障害物を含む疑いのある試料に接触させて試薬混合物を形成させる段階；（ｉｉｉ）その混合物を少なくとも２０分間、そして最高で３０℃の温度下でインキュベートする段階、および；（ｉｖ）その混合物からの生物発光の変化を検出する段階、を含んでなる。この方法は、多様な細菌集団を含む試料に関して用いることができ、そして段階（ｉｖ）の生物発光の変化が生物発光の増加もしくは減少となる態様を含む。ストレス誘導性プロモーターは、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ、ｄｎａＫ、ｄｎａＪ、ｇｒｐＥ、ｌｏｎ、ｌｙｓＵ、ｒｐｏＤ、ｃｌｐＢ、ｃｌｐＰ、ｕｓｐＡ、ｋａｔＧ、ｕｖｒＡ、ｆｒｄＡ、ｓｏｄＡ、ｓｏｄＢ、ｓｏｉ−２８、ｎａｒＧ、ｒｅｃＡ、ｘｔｈＡ、ｈｉｓ、ｌａｃ、ｐｈｏＡ、ｇｌｎＡ、ｍｉｃＦ、およびｆａｂＡからなる群より選択されてもよい。ストレス誘導性プロモーター配列の制御下に発現性ｌｕｘ遺伝子複合体を含む形質転換細菌を含む凍結乾燥させた生物学的試薬も開示される。本発明は更に、適切な溶媒および／または緩衝液と共に本明細書に開示される凍結乾燥させた生物学的試薬を含むキットにも関する。環境障害物の存在を検出するための好ましい態様は、梱包された組み合わせ物中に以下のものを含む：（ｉ）（ａ）ｌｕｘ遺伝子複合体に操作可能に連結されるストレスプロモーター遺伝子を含むＤＮＡ断片を含むディテクター細胞；（ｂ）適切な緩衝液；および（ｃ）凍結保護用試薬；を含む、アリコートに分けられた凍結乾燥生物学的試薬；（ｉｉ）再水和用試薬；ならびに（ｉｉｉ）適切な増殖用培地。このキットは更に、生物学的試薬からの光出力を測定する手段を含むことができる。図面の簡単な説明図１は、再構成された凍結乾燥細胞からのストレス応答の誘導を示す、時間に対する相対的光単位（ＲｅｌａｔｉｖｅＬｉｇｈｔＵｎｉｔｓ）のプロットである。発明の詳細な記述本明細書に用いられる際には、以下の用語を請求の範囲および明細書の解釈のために用いてよい。用語「プロモーター」および「プロモーター領域」は、通常では構造遺伝子の蛋白質コーディング配列の上流（５’端側）に位置し、ＲＮＡポリメラーゼおよび／または転写を正しい部位で開始させるのに必要とされる他の因子のための認識を提供することによりコーディング領域の発現を制御するＤＮＡの配列を意味する。プロモーター配列は遺伝子の発現を稼働させるのには必要ではあるが、必ずしも十分ではない。「断片」は、特定領域のＤＮＡ配列の分画を構築する。「核酸」は、一本鎖もしくは二本鎖であることができ、糖、リン酸エステル、およびプリンもしくはピリミジンのいずれかを含むモノマー（ヌクレオチド）でできている分子を意味する。細菌および高等な植物では、「デオキシリボ核酸」（ＤＮＡ）が遺伝子物質を意味する一方で、「リボ核酸」（ＲＮＡ）はＤＮＡから蛋白質への情報の翻訳に関与する。用語「形質転換」は、核酸の取り込み後の細胞内での新しい遺伝子の獲得を意味する。用語「操作可能に連結される」は、正しい方向および機能的ＲＮＡに転写されるべき読み取り枠での、２本のＤＮＡ断片の融合を意味する。用語「発現」は、遺伝子産物の配列をコードする遺伝子からの遺伝子産物への転写および翻訳を意味する。発現の際には遺伝子産物の配列をコードするＤＮＡ鎖はまず最初に相補的ＲＮＡ（これはメッセンジャーＲＮＡであることがしばしばである）に転写され、そしてその後には、そのように転写されたメッセンジャーＲＮＡはその遺伝子産物が蛋白質である場合には既述の遺伝子産物に翻訳される。用語「生物発光」は、いずれかの生きた生物体からの光放出の現象を意味する。用語「ｌｕｘ」は、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、およびｌｕｘＥを含み、かつ細菌性生物発光の現象の原因である構造遺伝子のｌｕｘ複合体を意味する。ｌｕｘ遺伝子複合体は、独立したｌｕｘ遺伝子の全て（協働して作用する）、もしくはｌｕｘ複合体のいずれかのサブセットを含んでもよい。用語「ストレス」もしくは「環境ストレス」は、環境障害物に対する露出の結果として細胞内に生じる状況を意味する。用語「障害物」もしくは「環境障害物」は、細菌性細胞もしくは細胞集団における正常な細胞代謝の変化をもたらすいずれかの物質もしくは環境変化を意味する。環境障害物は限定されるものではないが、化学物質、環境汚染物質、重金属、温度変化、ｐＨ変化、ならびに酸化損傷、ＤＮＡ損傷、嫌気生活、硝酸塩利用性もしくは病因の変化を生じさせる作用物質を含んでよい。用語「ストレス応答」は、ストレス蛋白質の検出可能レベルの誘導をもたらす細胞性応答を意味する。用語「ストレス蛋白質」は、環境ストレスの結果としてか、もしくは環境障害物の存在により誘導されるいずれかの蛋白質を意味する。典型的な蛋白質は限定されるものではないが、遺伝子ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ、ｄｎａＫ、ｄｎａＪ、ｇｒｐＥ、ｌｏｎ、ｌｙｓＵ、ｒｐｏＤ、ｃｌｐＢ、ｃｌｐＰ、ｕｓｐＡ、ｋａｔＧ、ｕｖｒＡ、ｆｒｄＡ、ｓｏｄＡ、ｓｏｄＢ、ｓｏｉ−２８、ｎａｒＧ、ｒｅｃＡ、ｘｔｈＡ、ｈｉｓ、ｌａｃ、ｐｈｏＡ、ｇｌｎＡ、ｍｉｃＦ、およびｆａｂＡによりコードされるものを含む。用語「ストレス遺伝子」は、その転写が環境ストレスの結果としてか、もしくは環境障害物の存在により誘導されるいずれかの遺伝子を意味する。典型的な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ストレス遺伝子は限定されものではないが、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ、ｄｎａＫ、ｄｎａＪ、ｇｒｐＥ、ｌｏｎ、ｌｙｓＵ、ｒｐｏＤ、ｃｌｐＢ、ｃｌｐＰ、ｕｓｐＡ、ｋａｔＧ、ＵＶｒＡ、ｆｒｄＡ、ｓｏｄＡ、ｓｏｄＢ、ｓｏｉ−２８、ｎａｒＧ、ｒｅｃＡ、ｘｔｈＡ、ｈｉｓ、ｌａｃ、ｐｈｏＡ、ｇｌｎＡ、ｍｉｃＦ、およびｆａｂＡを含む。用語「熱ショック遺伝子」は、その合成がシグマ−３２蛋白質をコードする構造遺伝子（ｒｐｏＨ）により正の方向に制御されるいずれかの遺伝子を意味する。用語「ストレス誘導性プロモーター」は、ストレス遺伝子を活性化させかつそのストレス遺伝子産物の発現を生じさせることが可能ないずれかのプロモーターを意味する。用語「ディテクター生物体」は、ｌｕｘ遺伝子複合体に融合されたストレス誘導性プロモーターを含んでなる遺伝子融合物を含み、かつ環境障害物に応答してｌｕｘ遺伝子産物を発現することが可能な生物体を意味する。典型的なディテクター生物体は限定されるものではないが、細菌を含む。用語「凍結乾燥された生物学的試薬」は、ｌｕｘ遺伝子複合体に融合されたストレス誘導性プロモーターを含んでなる遺伝子融合物を含み、かつ特定の培地中でフリーズドライされ、そして再水和の直後に、ある環境障害物に応答してｌｕｘ遺伝子産物を発現することが可能なディテクター生物体を意味する。用語「凍結乾燥する」もしくは「凍結乾燥」もしくは「フリーズドライ」は、減圧下での昇華による、凍結させた細菌培養物からの水の除去のための方法を意味する。用語「再水和」もしくは「再構成」は、特定量の液体（通常は滅菌水もしくは増殖用培地である）が凍結乾燥された生物学的試薬の試料に添加され、代謝活性が検出されうる段階へディテクター生物体の回復をもたらす過程を意味する。用語「相対的光単位（ＲｅｌａｔｉｖｅＬｉｇｈｔＵｎｉｔ）］は「ＲＬＵ」と省略され、そしてルミノメーターにより測定され、用いられるルミノメーターに特有な内部標準に対して検量される光放出の測定値を意味する。本発明は、ディテクター生物体にとって亜致死量であるレベルでの例えば化学性毒素のような環境障害物の検出方法を提供する。この方法は凍結乾燥させた生物学的試薬を取り込んでおり、その試薬の活性部分がディテクター生物体である。このディテクター生物体は、そのディテクター生物体が環境障害物に接触する際には、ストレスプロモーターが活性化されて、Ｌｕｘ蛋白質の産生およびその生物体からの光の発生がもたらされるように、ｌｕｘ遺伝子複合体に操作可能に連結されたストレスプロモーターを含む。ディテクター生物体を含む凍結乾燥試薬をいずれかの新環境順化もしくは増殖の安定化を行うことなしに、検出のために再構成直後に用いることができるという事実は本発明に特有である。本発明は広域な適用性を有することが予期される。可能な使用には、空気および水質のモニター、農薬および医療薬のデザインおよび製造、ならびに発酵過程の制御、プロセス監視、ならびに毒性スクリーニングが含まれる。これらの応用法は、化学物質、飲料、食品および矯味・矯臭剤、化粧品、農業系、環境系、規制取締まり系、ならびに診療系の企業を初めとする多くの事業に利益をもたらすことができる。本発明の方法および試薬は、亜致死性レベルの環境毒物の存在についていずれかの領域もしくは媒質をモニターする際に特に有用である。例えば、本発明が排水処理施設の流入点のモニター（これは、汚染物質がこのような施設の活性微生物集団を破壊することを回避するための要所である）に特に有用であろうということが企図される。それに加え、凍結乾燥させた生物学的試薬は、汚染物質により危険にさらされることがある商業用および住宅用の両地域内およびその周辺の土壌および地下水の野外検査への応用に特に適する。本発明のディテクター生物体により検出可能な環境障害物には、工業地域、排水流および農業用流去水に一般的に見いだされる多種多様な有機汚染物質および無機汚染物質が含まれる。このような化合物は限定されるものではないが、ポリ芳香族性炭化水素（ＰＡＨ）、ハロゲン化芳香族性物質、ならびに多種多様の重金属類（例えば、鉛、カドミウム、銅、亜鉛、およびコバルト）を含む。本発明の方法により検出されることが示される化合物には、アトラジン、ベンゼン、硫酸銅、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、エタノール、メタノール、２−ニトロフェノール、４−ニトロフェノール、ペンタクロロフェノール、フェノール、トルエン、ジメチルスルホキシド、亜硝酸鉛、塩化カドミウム、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、過酸化水素、ピューロマイシン、塩化水銀、２，４−ジクロロアナリン、プロパノール、ブタノール、イソプロパノール、塩化メチレン、ＴｒｉｔｏｎＸ１００、アクリルアミド、メチルバイオロゲン、マイトマイシンＣ、メナジオン、臭化エチジウム、セリンヒドロキサメート、およびキシレンが含まれる。検出される他の環境ストレスには、低リン酸レベル、貧窒素源、貧炭素源、および紫外光での照射が含まれていた。レポーター遺伝子：本発明にとって好ましいレポーター遺伝子はｌｕｘ遺伝子複合体であり、これは細菌性生物発光の原因であり、かつ細菌ビブリオフィスケリ（Ｖｉｂｒｉｏｆｉｓｃｈｅｒｉ）から単離される。細菌性生物発光は、５つの構造遺伝子（ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、およびｌｕｘＥ）の産物が協働的に作用して光を発生する現象である。ｌｕｘＤ産物は前駆体からＣ¹⁴脂肪酸を作製する。このＣ¹⁴脂肪酸は、ｌｕｘＥ産物の作用を介して、ＡＴＰ依存的反応中にアシル−酵素複合体へと活性化され、この反応が細菌性生物発光を細胞の高エネルギー状態へと共役させる。このアシル−酵素（ｌｕｘＥ産物）は転移剤として作用してアシル基をｌｕｘＣ産物に供与する。このアシル−ＬｕｘＣ二成分複合体はその後に、ＮＡＤＰＨが電子対およびプロトン供与体として作用してそのアシル複合体をＣ¹⁴アルデヒドへと還元させる反応で還元を受ける。この反応が細胞の還元力を細菌性光放出に共役させる。ルシフェラーゼ（ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの産物）による触媒作用を受ける光発生反応が光を生じる。光放出のためのエネルギーはアルデヒドの脂肪酸への転化およびＦＭＮＨ₂の酸化により提供され、これらの反応により光発生と細胞性エネルギー状態との間にもう一つの共役が提供される。細菌性ｌｕｘ複合体の源は、ｌｕｘ遺伝子複合体を含むｐＵＣＤ６１５プラスミドであり、これはＲｏｇｏｗｓｋｙら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９（１１）ｐｐ５１０１−５１２、（１９８７））により詳細に記載されている。ストレスプロモーター：本発明は、環境障害物の存在に対して感受性を示すストレス誘導性プロモーターを提供する。原核生物および真核生物の両細胞からのストレス誘導性プロモーターを使用してもよいが、細菌からのプロモーターが好ましく、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのプロモーターが最も好ましい。適切なストレス誘導性プロモーターは限定されるものではないが、以下の表Ｉに示される見出し「応答性遺伝子」における遺伝子リストから選択してもよい：表Ｉは、応答性遺伝子（一つもしくは複数）と、特定の調節遺伝子（一つもしくは複数）および調節回路、ならびに特定の刺激により開始される関連細胞性ストレス応答の関係を示す。ベクター本発明は更に、ストレス誘導性プロモーター−ｌｕｘ遺伝子融合物を含み、Ｌｕｘ蛋白質の発現のために細菌性宿主細胞を形質転換することが可能な形質転換ベクターも提供する。多種多様の形質転換ベクターを用いてもよいが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換することが可能なものが好ましい。ｐＧｒｐＥＬｕｘ．３およびｐＧｒｐＥＬｕｘ．５は適切な形質転換用ベクターの２つの具体例であり、それらの構造は今後の文中に詳細に記載されている。これらのベクターは、宿主細胞内にストレスプロモーター−ｌｕｘレポーター融合物を取り込ませる目的のために作製されたベクター総数の内のほんの一例である。しかしながら、これらの構築に用いられる方法および物質は他の全ての適切なベクターについての代表的なものでもあることが分子生物学の技術分野における当業者には容易に明らかになるであろう。ｐＧｒｐＥＬｕｘ．３およびｐＧｒｐＥＬｕｘ．５はｇｒｐＥプロモーターを含むベクターである。ｐＧｒｐＥＬｕｘ．３およびｐＧｒｐＥＬｕｘ．５は直接クローニングの方法により作製された。形質転換ベクター（例えば一般的なベクター）および適切なベクターの構築は当該技術分野に良く知られる手段により達成することができる。ｌｕｘ遺伝子の好ましい源は、プロモーター非含有性ｌｕｘ遺伝子複合体を含む既存のプラスミドである。同様に、形質転換ベクターの構築のためのストレス誘導性プロモーターＤＮＡの好ましい源もやはり既存のプラスミド（この場合、このストレス誘導性プロモーターＤＮＡは、制限酵素消化による単離に適する都合のよい制限部位によりフランクされている）もしくはＰＣＲ反応の産物のいずれかである。ｐＧｒｐＥＬｕｘ．３およびｐＧｒｐＥＬｕｘ．５のベクターは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ストレス遺伝子ｇｒｐＥならびにｌｕｘ遺伝子複合体から構築される。ｐＧｒｐＥ４はｐＵＣ１８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、カタログ番号２７−４９４９−０１）に由来する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベクターである。ｐＧｒｐＥ４は、それ自体のプロモーターを含み、５’末端でＥｃｏＲＩ部位に、かつ３’末端でＢｂｕＩ部位に結合しているｇｒｐＥ遺伝子を含む。それに加えｇｒｐＥプロモーターは３’末端で、ＥｃｏＲＩ部位のすぐ下流にあるＰｖｕＩＩ部位およびＨａｅＩＩＩ部位に結合している（図２）。ＥｃｏＲＩおよびＢｂｕＩ制限酵素での消化により、ｇｒｐＥ遺伝子に相当する１．１ｋｂの断片が得られる。ＰｖｕＩＩでの更に進んだ消化により２本の断片が生じ、その内の一本がｇｒｐＥプロモーターを含む。このｇｒｐＥプロモーター断片上の３’側ＰｖｕＩＩ部位は、ホスホリル化されたＥｃｏＲＩリンカーへの連結を介してＥｃｏＲＩ部位に変換される。ＨａｅＩＩＩによる更に進んだ消化により、５’側にＨａｅＩＩＩ部位および３’側にＰｖｕＩＩ部位が都合よく結合しているｇｒｐＥプロモーター断片が得られる（図２）。ｌｕｘ遺伝子複合体を含むｐＵＣＤ６１５プラスミドがＲｏｇｏｗｓｋｙら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６９（１１）ｐｐ．５１０１−５１２（１９８７））により詳細に記載されている。プラスミドｐＵＣＤ６１５は、カナマイシン耐性およびアンピリシン耐性のための遺伝子を含み、かつプロモーター非含有性ｌｕｘ遺伝子オペロンを含む１７．６ｋｂのプラスミドである（図２）。ｐＵＣＤ６１５をまず最初に制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩで消化させてそのプラスミドの開環を行い、その後にｐｇｒｐＥＩＶのＨａｅＩＩＩ消化からのＤＮＡ断片との連結を実施する。典型的には連結反応の産物を、まず最初に適切な宿主を形質転換させ、そして生物発光についてのスクリーニングを行うことによりスクリーニングする。様々な宿主を用いてもよいが、高い形質転換頻度を有する宿主が好ましい。ＸＬ１Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）およびＤＨ５−α（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）がそのような２つの宿主である。生物発光スクリーニングの好ましい方法は、形質転換体の格子入り（ｇｒｉｄｄｅｄ）培養物を適切なＸ−線フィルムに露出させ、その後に露出の証拠として現像したフィルムの肉眼的分析を行うことを必要とする。形質転換させた宿主からのプラスミドの再単離および制限酵素消化、ならびにその後にゲル電気泳動を用いて正しいプラスミドの存在を確認する。２つの異なる形質転換コロニーから単離されたプラスミドｐＧｒｐＥＬｕｘ．３およびｐＧｒｐＥＬｕｘ．５は制限酵素分析に基づいては識別できない。幾つかの実験条件下ではｐＧｒｐＥＬｕｘ．５で形質転換させた細胞は、ｐＧｒｐＥＬｕｘ．３で形質転換させたものと比較すると高目のベースライン生物発光を示し、そしてそのためｐＧｒｐＥＬｕｘ．５は多くの環境障害物の検出にとって好ましい。形質転換宿主−ディテクター生物体：本発明は更に、環境障害物の存在下で発光を増加させることが可能な形質転換宿主細胞を提供する。多くの適切な宿主が利用可能であるが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が好ましく、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＲＦＭ４４３が最も好ましい。ＲＦＭ４４３はＷ３１０２に由来しており、このＷ３１０２はＢ．ＢａｃｈｍａｎｎによるＥ．ｃｏｌｉａｎｄＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ；ＣｅｌｌｕｌａｒａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｎｉｅｄｈａｒｄｔｅｔａｌ．、Ｅｄｓ．、ｐｐ１１９０−１２２０、ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９８７））に詳細に記載されている。ｐＧｒｐＥＬｕｘ．３によるＲＦＭ４４３の形質転換により新しい株ＴＶ１０６０が得られ、この株はブダペスト条約（ＢｕｄａｐｅｓｔＴｒｅａｔｙ）の条件によりＡＴＣＣに寄託してある。ｐＧｒｐＥＬｕｘ．５によるＲＦＭ４４３の形質転換により新しい株ＴＶ１０６１が得られる。株ＴＶ１０６１からの生物発光のベースラインは株ＴＶ１０６０からのものより大きくなる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＶ１０６０にはＡＴＣＣ受託番号６９１４２が、そしてＴＶ１０６１にはＡＴＣＣ受託番号６９３１５が割り当てられている。疎水性化合物が、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のようなグラム陰性細菌内への侵入部からその細胞エンベロープにより効果的に排除されることは良く知られている。最近ではコリシンに対する耐性のための突然変異（ｔｏｌＣ−）を含む数々の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株が、様々な有機分子に対する宿主細胞エンベロープの透過性を増加させるという予期せぬ追加的特性を有することが見いだされている。（Ｓｃｈｎａｉｔｍａｎｅｔａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７２（９）、ｐｐ５５１１−５５１３（１９９０））。場合によっては、適切なディテクター生物体としてｔｏｌＣ−突然変異体を含む形質転換細菌宿主を提供することが本発明の範囲内に含まれる。試薬の調製−細胞の凍結乾燥：細胞を保存する方法は様々であり、そして当該技術分野ではよく知られている（ＭａｉｎｔｅｎａｎｃｅｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓＫｉｒｓｏｐ、Ｂ．Ｅ．、ａｎｄＳｎｅｌｌＪ．Ｊ．Ｓ．、Ｅｄｓ、（１９８４）、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ）。選択される方法は、細胞の生存率、遺伝子の突然変異、培養物の使用頻度、および他のもののような因子に依存するであろう。その主な利用法が野外検査における使用である培養物については、キット、乾燥法、フリーズドライ法（凍結乾燥）、もしくは凍結法が最適である。これらの方法の内のいずれかが本発明に適合することが企図されるものの、最も好ましい方法は凍結乾燥である。培養物の凍結乾燥は、減圧下での刺激により凍結培養物から水を除去することを必要とする方法である。生きた生物体をフリーズドライする際には、その細胞にとっての最大生存率および最大の貯蔵時間の両方のために数々の要素を考慮に入れる必要がある。回収の時点では、培養物は健常であり、そして対数期もしくは初期定常期のいずれかで、かつ約１０⁸／ｍｌの密度で活発に増殖しなければならない。その細胞を保存するための培地における基本的必須条件は凍結保護用試薬である。スキムミルク、スクロース、デキストラン、ウマ血清、およびイノシトールを初めとする様々な凍結保護用試薬が知られている。本発明の目的のためには、約１２％の濃度のスクロースが好ましい。培地および凍結保護用試薬の選択は経験に基づく過程であり、そして選択は最高の細胞生存率および貯蔵パラメーターに基づいて実施される。本出願では、培地と凍結保存用試薬との４つの異なる組み合わせ物を、細胞生存率、生物発光の誘導開始、およびベースライン発光の安定性におけるそれらの効果について分析した。４つの凍結乾燥用培地が以下にリストされる：Ａ．グルコース（１％）を含むＬＢ培地Ｂ．カザミノ酸（２％）およびグルコース（１％）を含む最少培地（ＭｉｎｉｍａｌＭｅｄｉａ）Ｃ．カザミノ酸（２％）、グルコース（１％）、およびスクロース（１％）を含む最少培地（ＭｉｎｉｍａｌＭｅｄｉａ）Ｄ．カザミノ酸（２％）、グルコース（１％）、およびスキムミルク（１２％）を含む最少培地（ＭｉｎｉｍａｌＭｅｄｉａ）。先の培地の内、凍結乾燥用培地（Ｃ）が最高の細胞生存率と併せ、生物発光誘導性開始の迅速さおよびベースライン発光の安定性を示すことが見いだされた。この方法では細胞を、カナマイシンを含むＬＢＧブイヨン中でＯ．Ｄ．６００で約２の吸光度にまで増殖させ（対数期増殖）、そしてその培養物の部分を先の凍結乾燥用培地（Ｄ）内で継代培養させ、そして対数期の密度に再度至るまで増殖させる。この時点で細胞を遠心分離により回収し、凍結乾燥用培地中に再懸濁させ、そして凍結乾燥用バイアル内で−７０℃に凍結させた。バイアルを凍結乾燥機内に入れ、そして少なくとも３時間、２０ミリリットル以下、および−１００℃で凍結乾燥させた。バイアルを密封し、そして再水和まで冷蔵庫もしくは冷凍庫の温度で貯蔵した。検査方法における使用のために凍結乾燥細胞を再水和させる目的では、凍結乾燥試薬を、凍結乾燥以前の試料の容積に等しい容積中の滅菌水に再懸濁させた。その後、細胞を即座に、環境障害物を含む疑いのある試料に露出させ、そして生物発光の変化についてのモニターを行った。生物発光は、ＤｙｎａｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．社（Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ）により作製されたものに類似する種類のルミノメーターで測定される。以下の実施例は本発明を詳細に説明することが意味されるが、いかなる点においても本発明を制限するとして見なされるべきではない。先の論議およびこれらの実施例から当業者は本発明の本質的な特徴を確認することができ、そして本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な使用法および条件に本発明を適用させるための本発明の様々な変異物および改変物を作製することができる。実施例一般的方法大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＶ１０６１は、ビブリオフィスケリ（Ｖｉｂｒｉｏｆｉｓｃｈｅｒｉ）のｌｕｘＣＤＡＢＥレポーター遺伝子に融合された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇｒｐＥ熱ショックプロモーターを含むプラスミドを含み、そして先の「発明の詳細な既述」の項目に詳細に記載されている。細菌性培養物の維持および増殖および凍結乾燥に適する材料および方法（ＭａｔｅｒｉａｌｓａｎｄＭｅｔｈｏｄｓ）は、ＭａｎｕａｌｏｆＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＧｅｎｅｒａｌＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（ＰｈｉｌｌｉｐｐＧｅｒｈａｒｄｔ、Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ、ＲａｌｐｈＮ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、ＥｕｇｅｎｅＷ．Ｎｅｓｔｅｒ、ＷｉｌｌｉｓＡ．Ｗｏｏｄ、ＮｏｅｌＲ．ＫｒｉｅｇａｎｄＧ．ＢｒｉｇｇｓＰｈｉｌｌｉｐｓ、ｅｄｓ）、ｐｐ．２１０−２１３、ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ、において見いだすことができる。細菌性細胞の増殖、維持、および凍結乾燥に用いられる全ての試薬および物質は、他に特に明記されていない限り、ＤｉｆｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社もしくはＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ社から取得された。実施例１凍結乾燥させた生物学的試薬の調製実施例１は、特別に製剤された培地中での凍結乾燥方法による生物学的試薬の調製法を記載する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＶ１０６１細胞を、以下の構成成分（ｇ／Ｌ）を含むＬＢＧブイヨン中で増殖させた：トリプトン、１０；イーストエキストラクト、５；塩化ナトリウム、１０；グルコース、１０、および２．５ｇ／Ｌの最終濃度のカナマイシン。培養物をＯ．Ｄ．６００が２となる中期対数期にまで増殖させた。その後にこの培養物を、以下の成分（ｇ／Ｌ）を含む産生用培地に接種するのに用いた：硫酸アンモニウム、０．３；硫酸マグネシウム、０．４５；クエン酸ナトリウム二水和物、０．０４７；硫酸第一鉄七水和物、０．０２５；チアミン −ＨＣｌ、０．０６；リン酸二カリウム、１．９５；リン酸二水素ナトリウム、０．９；ビオチン、０．００５；カザミノ酸、２０．０；微量要素溶液、１ｍＬ保存液；ウラシル、０．１；グルコース、２０．０；塩化カルシウム二水和物、０．０２６。微量因子溶液は以下の成分（ｇ／Ｌ）で構成されていた：硫酸亜鉛七水和物、８；硫酸銅五水和物、３；硫酸マグネシウム一水和物、２．５；ホウ酸、０．１５；モリブデン酸アンモニウム四水和物、０．１；塩化コバルト六水和物、０．０６。産生用培養物を２６℃、ｐＨ７．０、溶存酸素（ＤＯ２）５０％下で増殖させた。溶存酸素は増殖中に撹拌および通気を増加させることにより制御した。（ｒｐｍ３００−１２００；通気１００−３００Ｌ／Ｈ）。培養物がＯＤ６００で１．８に達した際（対数増殖期）にこれらを遠心分離により回収した（ＳｏｒｖａｌｌＳｕｐｅｒｓｐｅｅｄ、９０００ｒｐｍで２０分間、４℃）。培地をデカンテーションにより除去し、そして細胞を氷水中に維持した。細胞ペレットを、出発培養物の半容量の新鮮な産生用培地および同半容量の２４％の滅菌スクロース中に再懸濁させた。細胞を再懸濁させ、そして滅菌凍結乾燥用バイアル中に分配した。バイアルを−７０℃で凍結した。培養物は、凍結乾燥過程が完結するまで凍結させたままにした。バイアルは、培養物および凍結乾燥機の汚染を回避するため吸気システムおよび事前に滅菌してあるフィルター（ＰａｌｌＥｍｆｌｏｎＩＩ０．２ミクロン、絶対単位）を用いて凍結乾燥機内に入れた。バイアルを少なくとも３時間、２０ミリリットル以下、および−１００℃で凍結乾燥した。バイアルを密封し、そして再水和するまで冷蔵庫もしくは冷凍庫の温度で保存した。実施例２環境ストレスの検出のための凍結乾燥用試薬の使用実施例２は、環境ストレスの検出のための凍結乾燥させた生物学的試薬の使用を示す。ディテクター生物体は、ビブリオフィスケリ（Ｖｉｂｒｉｏｆｉｓｃｈｅｒｉ）のｌｕｘＣＤＡＢＥレポーター遺伝子に融合された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇｒｐＥ熱ショックプロモーターを含むプラスミドを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＶ１０６１であり、これを、試薬を調製するために実施例１に記載された要領で増殖、回収、および凍結乾燥させる。この試薬は、凍結乾燥以前の試料の容積に等しい容積の滅菌水に再懸濁させた。再構成させた細胞を、再水和後の３つの異なる時間に、ストレス誘導に応答するそれら細胞の能力について検査した。細胞は即座に用いたか、あるいは使用前に３０もしくは６０分間インキュベートしたかのいずれかであった。生育可能な細胞は、連続稀釈した再水和細胞をＬＢプレート上でプレート培養することにより測定した。ストレスに応答する細胞の能力の評価は、２．５％（ｖ／ｖ）のエタノールを添加してあるかもしくは無添加の（最終エタノール濃度はそれぞれ０％もしくは２％であった）８０μｌのＬＢ培地への２０μｌの再水和細胞の添加後の光出力の動態変化を測定することにより実施された。白色マイクロタイタープレート（Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅ（商標）、ＤｙｎａｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．社）内のこれら処理細胞からの生物発光は、２６℃に制御された温度のＤｙｎａｔｅｃｈＭＬ３０００マイクロタイタープレート用ルミノメーターで定量した。測定値の単位は相対的光単位（ＲＬＵ）である。図１のデータにより示されるように、エタノールが与えられていない細胞は定常的なベースライン発光を維持した一方で、２％のエタノールの存在下での細胞は１００倍の光出力増加を示した。重要な記載事項とは、再水和後０分および３０分目に用いられた細胞が類似の光発生動態を示すことにより、本試薬がこのアッセイにおいて有効となるには新環境順化期は全く必要とされないということである。実施例３凍結乾燥用培地の決定実施例３は、生物発光用ディテクター細胞に最も適する凍結乾燥用培地の選択法を説明する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＶ１０６１細胞をＬＢＧブイヨン中で増殖させ、そして実施例１に記載される要領で産生用培地に接種した。この産生用培地での増殖およびそこからの回収後、細胞ペレットを、出発培養物の半分の容積の凍結乾燥用の４つの異なる培地中に再懸濁させた。Ａ．グルコース（１％）を含むＬＢ培地Ｂ．カザミノ酸（２％）およびグルコース（１％）を含む最少培地（ＭｉｎｉｍａｌＭｅｄｉａ）Ｃ．カザミノ酸（２％）、グルコース（１％）、およびスクロース（１２％）を含む最少培地（ＭｉｎｉｍａｌＭｅｄｉａ）Ｄ．カザミノ酸（２％）、グルコース（１％）、およびスキムミルク（１２％）を含む最少培地（ＭｉｎｉｍａｌＭｅｄｉａ）。細胞は実施例１に記載の要領で凍結乾燥させ、そして検査用に保存した。再水和の際には、各培地中で凍結乾燥させた細胞を、生存率、再水和過程中のベースライン発光の安定性、および誘導過程中のベースライン安定性について分析した。細胞の生存率は再水和後の細胞をプレート培養し、そしてコロニー形成単位（ＣＦＵ）を基に生育細胞数を決定することにより決定した。再水和中のベースライン生物発光の安定性は、３０分の期間にわたり再水和細胞の生物発光を継続的にモニターすることにより決定した。誘導過程中のベースライン発光の安定性は、検査の期間（これはいつも１２０分であった）を通してずっと対照細胞（環境障害物に露出させていないもの）の生物発光をモニターすることにより決定した。遅れ時間は、誘導から光出力の初期増加までの時間の量を測定することにより決定した。健常で凍結乾燥していない細胞についての平均遅れ時間は２０分であった。分析結果が以下の表Ｉに示される。表Ｉの情報により理解されるように、再水和期および誘導期の両方の間に良好な光出力の安定性を示す唯一の培地は培地（Ｃ）であった。ベースラインが安定でなかった全事例によっては光出力の定常的増加が示されたが、これは恐らく細胞の健康状態および代謝活性の増加が原因であるように思われる。培地（Ｃ）はほぼ必須となっている気候順応期間を必要とすることなく即時に高レベルの代謝活性を行うことが可能な細胞を提供するという驚くべき結果を示した。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年１１月２０日【補正内容】最近になって本出願人は、ｌｕｘ遺伝子複合体に操作可能に連結されるストレス誘導性プロモーターを含む細菌性ディテクター生物体を必要とする環境障害物の検出方法を開示した（国際公開第９４／１３８３１号）。ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ、ｄｎａＫ、ｄｎａＪ、ｇｒｐＥ、ｌｏｎ、ｌｙｓＵ、ｒｐｏＤ、ｃｌｐＢ、ｃｌｐＰ、ｕｓｐＡ、ｋａｔＧ、ｕｖｒＡ、ｆｒｄＡ、ｓｏｄＡ、ｓｏｄＢ、ｓｏｉ−２８、ｎａｒＧ、ｒｅｃＡ、ｘｔｈＡ、ｈｉｓ、ｌａｃ、ｐｈｏＡ、ｇｌｎＡ、ｍｉｃＦ、およびｆａｂＡを初めとする多種多様のストレスプロモーターが利用可能であった。各ストレスプロモーターは異なる種類の環境ストレスに感受性を示し、よって広範囲にわたる検出が可能となる。このようなディテクター生物体の本質的利用性の内の一つは、排水処理工場のモニターならびに隔離地点の遠方での環境的試料の検査の際の利用である。野外検査の目的のためには、ディテクター生物体を検査用地点にまで輸送し、そしてその間ずっと検出の際の最大の感受性を考慮するためにその細胞を適切な増殖条件下に維持するが、これは不便なものである。さほどの厳密さを必要とせずに取り扱うことができる試薬のほうが遠方での野外使用にとっての適用性はずっと高くなるであろう。その目的のために、生きている細胞を必要とする多数の検出系に凍結乾燥もしくはフリーズドライさせた細胞を試薬として用いる試みを実施した。フリーズドライもしくは凍結乾燥させた細胞は多数の野外応用法および検出用キットにおける試薬として用いられてきている。例えばＭｃＫｉｎｎｅｙら（ドイツ特許第２１００４７６号）は、フリーズドライ微生物組成物が油の改善のための試薬として有用であることを開示している。カンジダリポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の培養物をフリーズドライし、そしてこれをヒル石と混合し、そして油層に露出するが、そこではそのイーストは迅速に増殖する。ＭｃＫｉｎｎｅｙは、細胞はフリーズドライおよび再構成することができ、かつそれでも、新環境順化および増殖のための十分な期間をおいた後には生化学的に機能するに十分な生育力を保持していることを示している。しかしながらＭｃＫｉｎｎｅｙは、その細胞が再構成直後に全ての正常な代謝機能を利用することが可能であるか否かについての記述は行っておらず、かつ転写および翻訳を管理するメカニズムが新環境順化および細胞増殖の期間の後まで作動状態になっていることの教示は行っていない。生物学的試薬としてのフリーズドライ細胞の使用を示す先の方法は、フリーズドライ細胞は再水和後にそれらの代謝活性を維持することができるが、完全な代謝能力を回復するために新環境順化および増殖のためにかなりの期間を必要とするものとみなせる。本出願人は以前に、ｌｕｘ遺伝子複合体に操作可能に連結させたストレスプロモーターを含むプラスミドで形質転換させた細菌性細胞が、環境ストレスおよび毒物の検出方法においてはディテクター生物体として有用であることを示している。仮定されるメカニズムは、環境毒素の存在がそのストレスプロモーターを活性化し、そしてそれが次にはｌｕｘ遺伝子複合体を作動させて、その細胞による光発生の原因となる新しい蛋白質を合成させるというものである。障害物もしくは毒物の存在は光発生の増加（Ｙａｔｅｓ（上述）に見られる減少とは対照的である）を基に決定され、そして新しい蛋白質の合成を必要とする。Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔ．（１９８８）１０（６）３８３−３８８、は、Ｖ．ハルベイ（Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉ）からの細菌性ルシフェラーゼアルファおよびベータをコードする遺伝子を用い、かつ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃ−プロモーターの制御下でクローン化された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を開示している。この形質転換細菌は重金属カドミウムのための生物発光センサーとして用いられており、この開示は凍結乾燥された細胞の使用を含む。本出願人は今回、これらのストレスディテクター細胞をフリーズドライすることができ、そしてそれらは再水和の際には環境障害物の検出方法に即座に使用できるという驚くべき発見に至った。再水和後に即座に使用されるというこれらの細胞の能力は驚くべきものである。なぜなら今日まで、再水和後にそれ程すぐに新しい蛋白質を合成するのに必要とされる代謝活性のレベルを示すフリーズドライ細胞は全く教示されていなかったためである。他の事例では全て、新しい蛋白質の合成が観察される前には細胞を新環境順化もしくは初期増殖の期間に供する必要がある。例えばＹａｔｅｓ（上述）の方法では、光発生は再水和の直後にはマイコトキシンの存在に応答して減少することが観察される。しかしながら光発生の減少を頼みとする天然の生物発光細胞（フォトバクテリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ））を用いる検査に必要とされる代謝的必須条件は、活性Ｌｕｘ蛋白質の存在、還元能力（ＮＡＤＨ）、およびＡＴＰのみに過ぎない。請求の範囲１．凍結乾燥した生物学的試薬で亜致死性環境障害物の存在を検出する方法であって、前記試薬がストレス誘導性プロモーター配列の制御下に発現性ｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子複合体を含むディテクター原核生物微生物体を含んでなり、（ｉ）凍結乾燥させた生物学的試薬を適量の水で再水和させる段階であって、ベースライン生物発光が生じる段階；（ｉｉ）即座にその再水和試薬を、環境障害物を含む疑いのある試料に接触させて試薬混合物を形成させる段階；（ｉｉｉ）少なくとも２０分間、そして最高３０℃の温度でその混合物をインキュベートする段階、および；（ｉｖ）その混合物からの生物発光の変化を検出する段階、を含んでなる方法。４．前記試料が多様な微生物集団を含む、請求の範囲１の方法。６．前記ｌｕｘ遺伝子複合体がディテクター生物体に対して異種である、請求の範囲１の方法。８．ストレス誘導性プロモーターが、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ、ｄｎａＫ、ｄｎａＪ、ｇｒｐＥ、ｌｏｎ、ｌｙｓＵ、ｒｐｏＤ、ｃｌｐＢ、ｃｌｐＰ、ｕｓｐＡ、ｋａｔＧ、ｕｖｒＡ、ｆｒｄＡ、ｓｏｄＡ、ｓｏｄＢ、ｓｏｉ−２８、ｎａｒＧ、ｒｅｃＡ、ｘｔｈＡ、ｈｉｓ、ｌａｃ、ｐｈｏＡ、ｇｌｎＡ、ｍｉｃＦ、およびｆａｂＡからなる群より選択される、請求の範囲１の方法。１０．ストレス誘導性プロモーター配列の制御下に発現性ｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子複合体を含む形質転換細菌を含む、凍結乾燥された生物学的試薬。１１．以下の：（ｉ）（ａ）ｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子複合体に操作的に連結されたストレスプロモーター遺伝子を含むＤＮＡ断片を含むディテクター原核生物微生物細胞；（ｂ）適切な緩衝液；および（ｃ）凍結保護用試薬；を含む、アリコートに分割され凍結乾燥された生物学的試薬：（ｉｉ）再水和用試薬；ならびに（ｉｉｉ）適切な増殖用培地、を梱包された組み合わせ物中に含む、亜致死性環境障害物の損害の存在を検出するためのキット。１２．細胞学的試薬からの光出力を測定するための手段を更に含む、請求の範囲１１のキット。

Claims

【特許請求の範囲】１．凍結乾燥した生物学的試薬により環境障害物の存在を検出する方法であって、前記試薬がストレス誘導性プロモーター配列の制御下に発現性ｌｕｘ遺伝子複合体を含むディテクター生物体を含んでなり、（ｉ）凍結乾燥させた生物学的試薬を適量の水で再水和させる段階（この段階でベースライン生物発光が得られる）；（ｉｉ）即座にその再水和試薬を、環境障害物を含む疑いのある試料に接触させて試薬混合物を形成させる段階；（ｉｉｉ）少なくとも２０分間、そして最高３０℃の温度でその混合物をインキュベートする段階、および；（ｉｖ）その混合物からの生物発光の変化を検出する段階、を含んでなる方法。２．段階（ｉｖ）の生物発光の変化が生物発光の増加である、請求の範囲１の方法。３．段階（ｉｖ）の生物発光の変化が生物発光の減少である、請求の範囲１の方法。４．前記試料が多様な微生物集団を含む、請求の範囲１の方法。５．前記環境障害物が亜致死性である、請求の範囲１の方法。６．前記ｌｕｘ遺伝子複合体がディテクター生物体に対して異種である、請求の範囲１の方法。７．ディテクター生物体が細菌である、請求の範囲１の方法。８．ストレス誘導性プロモーターが、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ、ｄｎａＫ、ｄｎａＪ、ｇｒｐＥ、ｌｏｎ、ｌｙｓＵ、ｒｐｏＤ、ｃｌｐＢ、ｃｌｐＰ、ｕｓｐＡ、ｋａｔＧ、ｕｖｒＡ、ｆｒｄＡ、ｓｏｄＡ、ｓｏｄＢ、ｓｏｉ−２８、ｎａｒＧ、ｒｅｃＡ、ｘｔｈＡ、ｈｉｓ、ｌａｃ、ｐｈｏＡ、ｇｌｎＡ、ｍｉｃＦ、およびｆａｂＡからなる群より選択される、請求の範囲１の方法。９．発現性ｌｕｘ遺伝子複合体が、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、およびｌｕｘＥ、またはそれらのいずれかのサブセットもしくは組み合わせ物でできている、請求の範囲１の方法。１０．ストレス誘導性プロモーター配列の制御下に発現性ｌｕｘ遺伝子複合体を含む形質転換細菌を含む、凍結乾燥された生物学的試薬。１１．（ｉ）（ａ）ｌｕｘ遺伝子複合体に操作可能に連結されたストレスプロモーター遺伝子を含むＤＮＡ断片を含むディテクター細胞；（ｂ）適切な緩衝液；および（ｃ）凍結保護用試薬；を含む、アリコートに分割され凍結乾燥された生物学的試薬：（ｉｉ）再水和用試薬；ならびに（ｉｉｉ）適切な増殖用培地、を梱包された組み合わせ物中に含む、環境障害物の損害の存在を検出するためのキット。１２．細胞学的試薬からの光出力を測定するための手段を更に含む、請求の範囲１１のキット。