JPH10509054A - 均質な混合物から核酸を純化する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新しい洗浄過程を含むＤＮＡの単離および純化方法を開示する。この方法は、シリカをカオトロープ塩溶液の存在下でＤＮＡを含む均質な混合物で処理し、次に、連続する洗浄過程において、洗浄されかつ処理されたシリカを水性アルコールの洗浄溶液で洗浄しかつ分離することにより、ＤＮＡと他の細胞の不純物との均質な混合物からＤＮＡを単離および純化することを提供する。第１の洗浄過程は、処理されたシリカを少なくとも９５重量％のアルコール水溶液の第１の洗浄溶液で洗浄する。第２の洗浄過程は、同様に、処理されかつ洗浄されたシリカを９５重量％未満のアルコール水溶液の第２の洗浄溶液で洗浄する。

Description

【発明の詳細な説明】 均質な混合物から核酸を純化する方法 発明の背景発明の分野 本発明は、一般的には、ＤＮＡおよび他の物質を含む不均質または異種の混合 物からＤＮＡを単離しまた純化することに関する。具体的には、本発明は、容易 に利用可能である緩衝液、溶媒および材料を用いて高純度のＤＮＡを得るための 方法および試薬に関する。本発明は自動化された研究室計装への適用に好適であ り、また、自動化された蛍光サイクルＤＮＡシークエンサーを含むほとんどの適 用要求に対する使用に十分な高純度のＤＮＡを提供する。関連技術の説明 分子生物学の急速な発展により、様々な異なる出所すなわちソースからＤＮＡ を単離し、純化する能力について数多くの強調がなされてきた。ＤＮＡは、その ソースによって、タンパク質、脂質およびその他の分子成分を含む様々な成分と 共に混合物中に存在する。これらの混合物からＤＮＡを単離し、単離されたＤＮ Ａを引き続き純化する能力は、組換えＤＮＡの研究および方法、遺伝研究、およ び分子診断学を含む多くの方法論において重要である。特に、自動蛍光サイクル ・シークエンサーの使用が増えるにしたがって、高度に純化されたＤＮＡについ ての効率の高い方法が望まれるようになってきた。ＤＮＡのソースは、プラスミ ドＤＮＡ、コスミドＤＮＡもしくは他のベクターを含む処理された細菌または酵 母菌の溶菌液、ゲノムＤＮＡを含む血液もしくは尿、組換えファージ溶菌液、Ｄ ＮＡ増幅反応、および分子生物学的方法で使用される他のシステムを含む。 近年、数多くの単離および純化の方法が報告されまた商業化されてきた。初期 の方法は、広範囲の遠心分離過程、または、水性フェノールまたはクロロフォル ムにエタノールを加えて使用する２相抽出の沈殿および洗浄過程に依存していた 。これらの方法は時間を浪費し、また、高価な計装と、高価でありまた有害な試 薬とを必要とする。さらに、１層を他の相から除去すべくこれをピペットで移し 替える必要があるため、抽出および沈殿方法は自動化することが難 しい。クロマトグラフィ、特に高圧液体クロマトグラフィおよびカラムクロマト グラフィは、短鎖核酸にはうまく利用されてきた。しかし、長鎖核酸には過度の 機械的撹拌から鎖切断がしばしば生じる。 最近、商業化された純化システムは、けい藻土の調整またはガラス玉（ビーズ ）のようなガラスおよび/またはケイ酸塩の表面に結合させるＤＮＡの能力に信 頼をおいている。これらのシステムは、引き続く固定化ＤＮＡおよびシリカの洗 浄と次の前記ガラスまたはケイ酸塩の表面からのＤＮＡの溶離とのために低イオ ン強度の緩衝液および有機溶媒のような不均質な混合物および溶液からＤＮＡを 単離するためのガラスまたはケイ酸塩を提供する。これらのシステムに付随する 共通の不利点は、単離されたＤＮＡが、自動化された蛍光サイクルＤＮＡの配列 決定および次の増幅反応のような多くの特別な要求手順のためには十分に純粋で はないことである。したがって、溶離され、回収されたＤＮＡのさらなる純化が 求められ、次に、純化プロセスに要するさらなる時間と費用とが加わる。さらに 、それは、クロマトグラフィのカラムの使用と、沈殿および再懸濁の過程とを必 要とすることがあるため、さらなる純化は、ふつうの研究室の自動計装について の使用には適合しない。 近年、混合物からＤＮＡを単離するための他の方法論が示唆されている。例え ば、米国特許第 5,057,426 号明細書は、ＤＮＡを含む混合物から該ＤＮＡを分 離するのに、前記ＤＮＡを陰イオン交換樹脂に固定し、濾過により前記混合物か ら前記樹脂を除去することを示唆する。前記樹脂から前記固定ＤＮＡを回収する ため、前記ＤＮＡは、前記陰イオン交換樹脂上のサイトを得るために張り合う塩 または他のイオンシステムを用いて別個に溶離される。 異なったやり方につき、米国特許第 4,923,978 号明細書は、ガラス玉または シリカのような固形の物質をその表面が親水性の物質で被覆されるように処理す ることを示唆する。これらの表面は、タンパク質性の物質および非ＤＮＡを選択 的に結合するといわれている。したがって、混合物を含むＤＮＡおよびタンパク 質が前記処理された固形物質と接触することを可能とし、続いて前記処理済みの 物質を除去し、懸濁されまたは溶液中にある単離ＤＮＡを後方に離すことにより 、ＤＮＡを単離することができる。 ヨーロッパ特許出願第0 512 767 A1号は、結合剤としてのエチルアルコールを 100％まで使用して、シリカのような固形粒子の表面にＤＮＡを結合することを 容易にするために代表的に使用されるカオトロープ(chaotrope)と置き換えるこ とを示唆する。このプロセスは、自動蛍光サイクル配列決定に使用するための固 形粒子の表面からＤＮＡを除去することに引き続くさらなる純化を求めるものと して特徴づけられる。ほとんどの細菌プラスミド純化方法論の特徴は、アルカリ 溶解手順であり、次に、カオトロープの存在下でのシリカによる処理および次の 洗浄過程および溶離過程が引き続く。自動蛍光サイクルＤＮＡ配列決定の適用に 適するＤＮＡを得るため、これらの方法は、カラム濾過、または他の洗浄および 純化ＤＮＡの再懸濁により引き継がれる再沈殿を含むさらなる純化を必要とする 。一般に、これらの多段階の純化プロセスは労働集約的であると考えられる。 さらに、最近の研究室自動化の強調と共に、ロボット化が容易に適合可能であ るＤＮＡ純化方法に対する興味が増大している。シリカの洗浄後におけるさらな る純化を必要とする、現在使用中の一般的な、シリカを基本とする単離および純 化システムは、ロボットシステムには適しない。 したがって、本発明の目的は、後の洗浄沈殿および洗浄を必要とすることなし に自動蛍光サイクル配列決定の適用のために十分に純粋であるプラスミドＤＮＡ を単離しかつ回収するための方法を提供することにある。 本発明の他の目的は、自動研究室システムに容易に適合可能であるプラスミド ＤＮＡ純化方法を提供することにある。 さらに、本発明の他の目的は、高価な装置および試薬を必要としないＤＮＡ純 化方法を提供することにある。 発明の概要 本発明は、新規な洗浄の過程（ステップ）を含むＤＮＡの単離および純化方法 を提供することにより前記した目的を達成する。より詳細には、本発明の方法は 、カオトロープ塩溶液(chaotropic salt solution)の存在下でＤＮＡを含む均質 な混合物でシリカを処理することにより前記均質な混合物からＤＮＡを単離しか つ純化し、次いで、水性アルコール洗浄溶液で、連続する洗浄ステップ において、処理されたシリカを洗浄することを提供する。第１の洗浄ステップは 、少なくとも９５重量％のアルコール水溶液からなる第１の洗浄溶液で前記被処 理シリカを洗浄することを含む。第２のステップは、９５重量％未満のアルコー ル水溶液からなる第２の溶液で、前記の処理されかつ洗浄されたシリカを洗浄す ることを含む。各洗浄ステップに引き続き、洗浄システムから不要の物質と不純 物とを除去するため、使用後の洗浄溶液が前記洗浄されたシリカから分離される 。 本発明に従って、ＤＮＡを含む混合物にさらされたシリカを洗浄するとき、前 記処理されかつ洗浄されたシリカは、自動蛍光サイクル配列決定方法論で使用す るに十分な純度のＤＮＡを含む。引き続く使用のために前記シリカの表面から単 離されかつ純化されたＤＮＡを回収するため、前記シリカが水または低イオン強 度の緩衝液と組み合わされた水で単に洗浄される。これが、前記シリカから洗浄 水に前記ＤＮＡを溶離させる。前記シリカから、溶離されたＤＮＡを含む溶液を 分離した後、純化または精製されたＤＮＡはいつでも使用することができる。 本発明の好ましい実施例では、第１および第２の洗浄溶液は、それぞれ、水中 に約 95-99 重量％のエチルアルコールが存在するものおよび水中に約 70-85重 量％のエチルアルコールが存在するものからなる。最も好ましい第１および第２ の洗浄溶液は、それぞれ、約 99 重量％のエチルアルコール水溶液および約 75 重量％のエチルアルコール水溶液からなる。しかし、ＤＮＡのソースにより、こ の技術分野の専門家は、第１の洗浄のための 95-99 重量％間および第２の洗浄 のための 70-85 重量％間のアルコール量を最適にすると考えられる。加えて、 これらの専門家には、洗浄後のシリカから洗浄後の溶液を分離することが各洗浄 ステップに引き続いて適当なサイズのフィルタを介して前記シリカを濾過するこ とを優先的に含むことは理解されよう。これは、各洗浄ステップに引き続いて前 記シリカから除去された不要の不純物を除去することを提供する。 本発明の新規な洗浄ステップは、実質的に全てのタンパク質性物質、脂質、不 要な細胞片と、ＤＮＡ混合物をシリカに最初に露出させるに際して使用され た前記カオトロープ塩とを除去する一方、前記シリカに対する制限を維持するた めのＤＮＡに関する環境を提供するという効果を有する。続く前記シリカからの 単離ＤＮＡの溶離は、溶媒沈殿および引き続く洗浄またはスピンカラム純化のよ うなさらなる純化ステップを要しない十分な純度のＤＮＡを提供する。したがっ て、本発明は、従来の材料および廉価な装置を用いるシンプルで時間を節約する 方法を提供する。選択的に、本発明の単純性は、例えばロボット化研究室装置を 用いるＤＮＡの単離および純化プロセスまたは過程の完全な自動化を可能にする 。 本発明の方法に付随するさらなる利点は、以下の詳細な説明に記載された本発 明の理解によりこの技術分野の専門家により理解されよう。 発明の詳細な説明 本発明は、シリカに基礎をおくＤＮＡ純化方法が非常に低濃度の水性アルコー ル溶液により引き継がれる非常に高濃度の水性アルコール溶液の連続的な洗浄ス テップを利用するとき、ＤＮＡが前記シリカから溶離しまた非常に高い純度を有 するという発見に基づいている。本発明は、従来の方法すなわち一つの洗浄ステ ップを組み入れ、重要な塩の集合物を有する洗浄溶液を利用し、過剰な塩を除去 するために後の洗浄再沈殿を要するものとは異なる。有利なことに、本発明は、 溶媒の再沈殿およびスピンカラム溶離のような後の溶離純化を必要としない。 概して、本発明は、ＤＮＡおよび他の物質の均質な混合物からＤＮＡを単離す る方法を含み、また、前記均質な混合物およびカオトロープ(chaotrope)でのシ リカの第１の処理と、引き続く第１および第２の洗浄溶液のそれぞれによる前記 処理されたシリカの洗浄とを含む。前記第１の洗浄溶液は水中に少なくとも９５ 重量％のアルコールを有し、また、前記第２の洗浄溶液は水中に９５重量％未満 のアルコールを有する。本発明は、さらに、前記第１および第２の洗浄ステップ に引き続く、前記洗浄されたシリカからの洗浄溶液の分離を提供する。これは、 過剰なカオトロープおよび非結合の細胞物質が前記シリカの処理後に除去される ことを保証する。連続的な洗浄ステップおよび分離ステップ は、カオトロープ溶液の存在下で前記ＤＮＡ混合物でのシリカの第１の処理に関 連して行われるとき、前記シリカの表面に単離された純粋なＤＮＡを提供する。 好ましい実施例では、各洗浄ステップは２度繰り返され、また、さらに、適当 な洗浄溶液で前記処理されたシリカを混合することを含み、前記処理されたシリ カおよび洗浄溶液の混合物を培養し、次に、適当なサイズのフィルタを通して前 記培養された混合物を濾過する。本発明によれば、また、純化されたＤＮＡを回 収するため、単離されたＤＮＡを含む洗浄され、濾過されおよび乾燥されたシリ カは水または低イオン強度緩衝液で溶離される。 いかなるソース（出所）からのＤＮＡも、本発明の方法に従って純化される。 この技術分野の専門家には、ＤＮＡの純化の手順に日常的に適用される多くの物 質と過程との混合は馴染みの深いものであろう。典型的なソースは、a)血液、尿 、精液等の臨床用試料、b)ゲノムライブラリー、c)ＰＣＲまたは他の増幅反応シ ステム、d)細菌の溶菌液、およびe)ウイルスを含む。分子生物学者は、ＤＮＡの クローニングおよび/または配列決定のために細菌からプラスミドを回収するこ とに関して精通している。この理由から、本発明は、細菌のソースから純化され たプラスミドを単離しかつ回収することに関して記載されている。これらの専門 家には、しかし、本発明がＤＮＡのいかなるソースにも適用可能であることは理 解されよう。 以下に説明するように、本発明の好ましい実施例は、水中に約９９重量％のエ チルアルコールを有する第１の洗浄溶液と、水中に約７５重量％のエチルアルコ ールを有する第２の洗浄溶液との使用を含む。しかし、９５重量％を越えるアル コールを有する水性を基本とする第１の洗浄溶液は、外見上、対抗する不純物を 除去する間に前記シリカへの結合を維持するように前記ＤＮＡのための環境を付 与する。水性を基本とする第２の洗浄溶液は、非常に多量の水（９５重量％未満 のアルコール）を提供し、また、前記単離されたＤＮＡが前記シリカの表面に結 合されたままである間に前記不純物の残りを効果的に除去する。一般に、前記第 １の洗浄ステップにおける水の量が９５重量％のアルコールより少ない場合、Ｄ ＮＡの収量は減少して純度が向上することが決定されてい る。同様に、前記第１の洗浄溶液に１００重量％のアルコールが用いられる場合 、前記収量は向上するが、結果として生じるＤＮＡは相当量の不純物を含む。 既に述べたように、本発明の典型的な方法は、細菌の溶菌液からの純化された プラスミドの回収を含む。したがって、典型的な純化過程は、まず、細菌培養か らの細菌の溶菌液の準備が必要である。この技術分野の専門家は、細菌を溶解さ せるための方法には精通している。本発明は、公知のアルカリ溶解のＢirnboim の処理または手順(Ｂirnboim ＆ Ｄoly,1979,and Ｂirnboim,1982)に基づいて記 載されているが、細菌の細胞を効果的に溶解しまたＤＮＡを開放する任意の手順 が適用可能である。典型的には、これらの手順は、細菌のペレットを溶液に加え ることを含み、前記溶液は、溶液中で前記プラスミドＤＮＡを引き離す間に細菌 の細胞を破壊して開き、前記細菌の染色体、細胞膜および他の要素を沈殿させる 。 したがって、関心のあるＤＮＡ配列を含むプラスミドで形を変えられた細菌を 用いる小スケールのプラスミド純化手順のため、細菌培養の１−２ mＬ試料がプ レート・ウェルフォーマット(plate-well format)において遠心分離され、その 結果、前記細菌が前記ウェルの底にペレット状に集まる。次に、前記液体を排出 するために前記プレートがひっくり返される。５０ mＭのグルコース、２５ mＭ トリスpＨ８の緩衝液、１０mＭおよびpＨ８のエチレンジニトロロ四酢酸(ＥＤＴ Ａ)、および、100-1000μg/mＬのＲＮＡse Ａ（ＲＮＡse Ａの活性または活量に 依存する濃度）の溶液が前記ペレットに加えられる。続いて、これに、細菌を溶 解しかつ細菌タンパク質と染色体およびプラスミド ＤＮＡ とを変性させる、0. 2Ｎ の ＮaＯＨ および１重量％のドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)の溶液が加 えられる。最後に、pＨ5，3Ｍの酢酸カリウムの第３の溶液の添加が前記混合物 を中和し、共有結合閉プラスミドをリアーニングさせる。前記染色体 ＤＮＡ、 タンパク質および高分子量 ＲＮＡ が固形の塊に凝集する。前記した手順から得 られた前記細胞溶菌液は、次に、沈殿の汚染を保ちまた前記プラスミド ＤＮＡ を含む溶菌液が通過することを許すフィルタに前記溶菌液を通すことにより前記 沈殿から分離される。 前記沈殿から前記溶菌液を分離するのに適当なフィルタは、十分に小さい孔サ イズ、典型的には３μｍ以下と結合する低タンパク質である。９６ウェル方法(9 6 well technologies)を利用する高効率の手順をおいて、好ましいフィルタは９ ６ウェル・フィルタプレートの形態のものであり、このフィルタはニューヨーク 州 イーストヒルの ＰＡＬＬ Ｃorp.から入手可能であり、Ｌoprodvne/Ｌopros orb の商標で販売されている。これは２相フィルタ膜システムからなり、その上 層が目の詰んだ繊維状のメッシュからなり、また、その下層が３μｍの孔サイズ のナイロン製膜からなる。この分野の専門家は、前記沈殿物から前記溶菌液を分 離する他の方法が遠心分離ステップであることを理解するであろう。典型的な遠 心分離方法では、約 2500rpm で約５分間を必要とする。 本発明によれば、適当量のシリカが、高濃度のカオトロープ塩を含む溶液の存 在下で前記溶解手順における濾過液として得られた細菌の溶菌液で処理される。 様々なソースからのシリカが本発明の実施において適当であり、また、ガラス玉 （ガラスビーズ）およびけい藻土を含むことができる。前記シリカの粒度は決定 的なものではなく、ミクロン以下の直径から100μｍの直径の範囲とすることが できる。好ましい実施例では、前記シリカは５μｍおよび１０μｍ間の平均粒度 を有する。 好ましくは、前記シリカはヒドロキシル化（水酸化）され、豊富化された表面 ヒドロキシル官能基を有する。このようなヒドロキシル化されたシリカは、カリ フォルニア州フラートンの Ｂeckman Ｉnstrumentsから入手可能であり、商標Ｕ ltrasphere で販売されている。 カオトロープ剤はこの分野では既知のものであり、また、ＤＮＡ 純化システ ムにおいて近頃使用されている。高濃度のカオトロープ剤の存在下において、Ｄ ＮＡ が選択的にシリカに結合される。明らかに、前記カオトロープ剤は水分子 と ＤＮＡ との相互作用を低減し、その結果、ＤＮＡ は、前記水性溶液中の残 りより前記シリカの表面に優先的に水素結合する。カオトロープ剤は、チオシア ン酸グアニジン、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウムおよび塩酸グアニジン を含むがこれらに限定されない本発明の実施に有用である。本発明の好ま しい実施例は、6Ｍの塩酸グアニジンの水溶液を使用する。前記カオトロープざ 剤が5Ｍから7Ｍの範囲の比較的高濃度で存在するとき、最良の結果が得られる。 本発明によれば、前記 ＤＮＡ が前記カオトロープ剤の存在下で前記シリカと の相互作用が可能とされた後、前記処理されたシリカが前記水性の混合物から分 離される。種々の方法が、前記シリカが漏斗形の装置に詰め込まれその一方で前 記シリカから前記水性の混合物が排出可能とすることを含む、前記水性の混合物 を除去するために利用可能である。好ましい実施例では、処理されたシリカと水 性の混合物との組合せがフィルタ膜を通される。前記膜は、堆積したＤＮＡを有 する処理されたシリカを捕え、前記カオトロープ剤と前記溶菌液からの不純物と を濾過液中に通すことを許す。この時点で、前記処理されたシリカは、また、少 量のタンパク質性の物質と、他の細菌細胞成分であって十分に純粋なＤＮＡを得 るために除去されなければならないものとを含む。 このＤＮＡ純化方法における次の過程またはステップは、好ましくは水の９５ 重量％を超え、最も好ましくは水の約９９重量％である水性アルコールの第１の 洗浄溶液で前記処理されたシリカを洗浄することを含む。この洗浄の過程は、前 記処理されたシリカと前記洗浄溶液とを混合すること、結果として生じた混合物 を培養すること、次に前記処理されかつ洗浄されたシリカから濾過液を分離する ことを含む。好ましくはこの分離は洗浄されたシリカを濾過することにより行わ れるが、しかし、遠心分離も代わりの分離方法である。この洗浄、培養および分 離過程は、好ましくは、少なくとも一回、最も好ましくは２度繰り返される。 最後の洗浄過程は、前記第２の洗浄溶液が９５重量％未満であることを除き、 前記第１の洗浄ステップで使用されたと同様の方法で処理され、洗浄されかつ濾 過されたシリカを洗浄することを含む。最も好ましくは、前記第２の洗浄溶液は 、約７５重量％のエチルアルコールである。この第２の洗浄ステップは一緒にさ れ、また、残りのカオトロープ剤とタンパク質性物質のような他の不純物または 汚染物質とが溶液になるように数分間培養される。最後に、洗浄されたシリカは 、適当なフィルタを介しての濾過によりまたは遠心分離により、 濾過液から分離される。最適な結果を得るため、前記第２の洗浄ステップが少な くとも一回、最も好ましくは２度繰り返され、最後の濾過は前記シリカが乾燥す るまで行われる。 本発明の実施に適当なアルコールは、メチルアルコール、エチルアルコールお よびイソプロピルアルコールであってこれらに限定されない低分子量で水溶性の ものである。好ましい実施例では、前記アルコールはエチルアルコールであるが 、本発明に従って処理される ＤＮＡ の純度および収量は任意の低アルキルアル コールを用いる場合も良好である。 処理されかつ洗浄されたシリカからアルコール洗浄溶液を分離するために適当 なフィルタは、前記シリカを残すのに適当な孔寸法を有するほとんどのフィルタ を含む。前記したように、本発明の利点は、９６ウェル・プレートの形態および 自動化の適合性にある。この形態を採用する実施例では、特に好ましいフィルタ は、ＰＡＬＬ Ｃorp.から入手可能でありまた商標Ｌoprodyneで販売されている ９６ウェル・フィルタプレート(96 well filter plate)である。このプレートの フィルタ部分は、３μｍの孔寸法を有する低タンパク質結合ナイロンである。 前記した２つの洗浄ステップの結果生じるものは、前記シリカの表面に堆積ま たは沈殿した単離された ＤＮＡ であり、不要な細胞の不純物と過剰なカオトロ ープ剤とは前記洗浄濾過液中に除去される。次の使用のために純化されたＤＮＡ を回収するため、前記ＤＮＡは、ＤＮＡが溶離溶液中に存在することを除き、前 記洗浄ステップに似た過程において前記シリカから溶離される。水は好ましい溶 離媒体であり、ＤＮＡの配列決定において使用されるＤＮＡには最も有利な点を 提供する。有利なことに、水は特に適する溶離媒体であるため、結果として得ら れるＤＮＡは塩から遊離している。特に洗浄溶液中に塩を含む従来の純化過程と 異なり、本発明に従って純化されたＤＮＡは実質的に塩から遊離している。引き 続いて複数の例に示すように、このような塩遊離のＤＮＡの配列を決定するとき 、非常に限定された数の配列決定誤差が生じる。しかし、この分野の専門家には 、ＤＮＡを扱う分野で知られた緩衝液の代表的な低塩濃度緩衝液が溶離媒体とし て利用可能であることが認識されている。 次の諸例は、本発明の実施例を示すために提供され、本発明を限定するもので はない。例１ 次の実験は、９６ウェルフォーマット、細菌培養、細胞溶解、洗浄、および適 当な９６ウェルプレートで生じた溶離を用いて行われた。この実験は、代表的な 細胞溶解および本発明に従うＤＮＡ純化過程を示す。細菌培養準備 溶菌または溶解のための細菌を得るため、50μg/mＬまでのアンピシリンを含 む２ mＬsの培養媒体を複数の小さい試験管に入れた。各試験管は、無菌の爪楊 枝で、関心のあるコロニーを接触させて接種された。使用したＥコリ菌株は、プ ラスミドに基づく pＢluescript または pＵＣ で形質転換されたαＤＨ5および ＸＬ1である。培養は、好気的に成長し、成長後に処理しまたはさらなる処理の ために冷凍した。前記培養は矩形のウェルプレート（カリフォルニア州フラート ンのＢeckman Ｉnstrumentsからの）に移し、約2500回転で５分間遠心分離して 細菌をペレット化し、液体を排出するために逆様にした。前記プレートは、次い で、Ｂiomek 自動研究室ワークステーション（カリフォルニア州フラートンのＢ eckman Ｉnstruments）におかれた。前記Ｂiomekは、装置に設けられた一般的な 指示に従って自動処理を行うようにプログラムを組まれている。細菌溶菌液の準備 次の成分を有する、水性緩衝液および安定化溶液を準備した。50mＭ のグルコ ース、pＨ8，25mＭ の Ｔris ＨＣＬ、10mＭ の ＥＤＴＡ、850μ g/mＬのＲＮ ＡseＡ。これらの成分の全ては、Ｂiodyne から購入した ＲＮＡseＡ を除いて 、ミズーリ州セントルイスのＳigma Ｃhemicals から購入した。次の成分を有す る水性の溶菌溶液を準備した。0.2N の ＮaＯＨ および1重量％の ＳＤＳ。両成 分はＪＴ Ｂakerから購入した。最後に、pＨ5,3Ｍの酢酸カリウム(ＪＴ Ｂaker より)の第３の水溶液を準備した。 次のステップは、前記Ｂiomekにより行われた個々の操作に基づいて記載され ているが、手動によるピペット操作および移送操作によっても行うことがで きる。細菌細胞を溶解するため、100μＬの安定緩衝溶液と200μＬの溶解溶液と を細菌ペレットを含む各ウェルに加えた。前記ウェルは、５分間、室温で培養し た。最後に、前記第３の溶液の150μＬが各ウェルに加えられ前記混合物を中和 し、染色体 ＤＮＡ およびタンパク質 ＳＤＳ の複合体を粘着性の塊に集める間 に前記プラスミド ＤＮＡ を優先的にリアニーリングし、溶液中に残した。 各ウェル中の混合物は、Ｌoprodyne/Ｌoprosorbフィルタプレートを通して濾 過し、この間、９６ウェルプレートにおける他の対応する一組のウェルを通して 透明な溶菌液を引張る真空を用いた。前記粘着性の塊は前記フィルタプレートに 残った。細菌溶菌液ＤＮＡ純化 透明な細菌溶菌液の各ウェルに、175μＬのヒドロキシル化されたシリカのス ラリ（１７重量％のシリカ）を加えた。前記ヒドロキシル化されたシリカはＵlt rashpere として知られ、また、10μｍの粒度を有する。また、各ウェルに水性の 6Ｍ塩酸グアニジン（ＪＴ Ｂakerから購入）溶液を加えた。溶菌液混合物、シリ カおよぴ塩酸グアニジン溶液の混合物は混合され、５分間置いた。９６ウェルの それぞれにおける液体は、次いで、シリカの通過を許さない９６ウェルフィルタ プレート(Ｌoprodyne)に通した。 本発明の新規な洗浄ステップを次のようにして行った。各ウェルのシリカに、 200μＬの水性の９９重量％のエチルアルコールを加えた。前記ウェルの内容を 混合し、約５分間培養し、次いで、真空濾過方法を用いて前記洗浄溶液を濾過し た。使用したフィルタは、Ｌoprodyneプレートフィルタである。この洗浄過程は 繰り返し行った。次に、200μＬの水性７５重量％のエチルアルコール溶液を、 前記シリカを含む各ウェルに加えた。各ウェルの内容を混合し、５分間培養し、 前記第１の洗浄ステップに関して説明したように濾過した。この第２の洗浄過程 は２度繰り返した。最後に、前記シリカを露出して、乾燥するまで真空濾過を行 った。 純粋な形態の単離された ＤＮＡ を回収するため、前記洗浄されたシリカを含 む前記ウェルのそれぞれに７０μＬの水を加えた。前記９６ウェルプレート は約５分間培養した。収集プレートを前記フィルタプレート下に置き、前記シリ カを濾過し、純粋なプラスミドを含む水を集めた。純粋な ＤＮＡ の収量は、培 養開始の少なくとも１μg/mＬである。例２ ＤＮＡ の純度は ＤＮＡ 配列決定方法の成功のファクタであるため、自動化 された蛍光サイクル ＤＮＡ 配列決定実験は、本発明に従って純化された ＤＮ Ａ の高い純度を示すために行った。以下に記載した議論および実験は、本発明 に従って純化された ＤＮＡ がさらなる純化なしに自動配列決定に使用すること ができ、また、商業的に入手可能のシステムと比べて非常に優れた結果を提供す ることを示す。 前記したようにして準備された細菌の溶菌液は、本発明に従って、２つの商業 的に利用可能である ＤＮＡ の純化手続および ＤＮＡ の純化過程の対象となる 。より詳細には、Ｐromega and Ｑiagenから購入したＤＮＡ純化キットは、製造 業者の指示に従って ＡＢＩ 装置の自動蛍光サイクル配列決定のためのプラスミ ドを準備するために使用した。これらの実験のための細菌溶菌液は、上記例１で 説明したように準備し、また、前記純化キット製造業者により推薦された手続に 従って行った。加えて、例１で説明したように準備した、純化したプラスミド ＤＮＡ を同じ装置の自動配列決定に用いた。配列決定されたプラスミドは、そ れぞれ、α ＤＨ5 および ＸＬ1 において形質転換されたpＢｌuescript(pＢlue )である。表１は、３５０塩基配列、４００塩基配列、４５０塩基配列および５ ００塩基配列のそれぞれのための配列決定の実行における配列決定誤差数の形態 で配列決定データを提供する。絶対誤差以外の配列決定アンビギュイティーは、 表１において（±）で示されている。 Ｑiagen により供給された純化プロセスは、陰イオン交換方法、これに引き続 くシリカ結合ステップ、その後の約８０％のエタノールを含む洗浄である。Ｐro megaにより供給された純化プロセスは、８３ｍＭのＮaＣlおよび８ｍＭのＴris ＨＣＬ pＨ7.5の水性緩衝水における５５％エチルアルコールにより引き継がれ るシリカ結合ステップである。上に示した配列決定結果から分かるように、Ｐro mega のシリカを基本とするプロセスは、自動 ＤＮＡ 配列決定分析に適する純 度であるように再沈殿および洗浄のような追加の純化手続を必要とする。対照的 に、本発明に従って準備された ＤＮＡ は、第１の高アルコール濃度および第２ の低アルコール濃度の２つの洗浄後、使用のためには十分な純度である。 例３ 回収した ＤＮＡ の純度上のアルコールの可変濃度の効果を示すため、例１に 記載したように準備した細菌溶菌液を用いて実験を行った。例１に示した純化プ ロセスも、また、洗浄に用いられた水中のアルコールの可変の量を除いて、 これらの実験に組み入れた。純化されたプラスミドは、ＤＮＡ の収量を決定す るために紫外線分光光度計 260nm における吸光度について分析した。表IIに示 された結果は、各純化または精製についての同じ培養バッチを用いる培養のμg/ mＬ中の全収量を示す。 表IIは、９９重量％エチルアルコールの第１の洗浄溶液が７５重量％エチルア ルコールの洗浄溶液と組み合わされるとき、収量が一般に高くなることを示す。 さらに、２６０における吸光度の測定から得られた収量データに加えて、280nm におけるタンパク質のピークを観察することにより不純レベルに関す る情報を得ることができる。第１の洗浄で１００％のエチルアルコールを用いる と、前記不純レベルは最大となり、相対的に受け入れ不能であった。 例４ 自動蛍光サイクルシークエンサーを用いて配列決定されるように異なる濃度の エチルアルコールを用いて純化された ＤＮＡ の能力を分析するために他の実験 を行った。これらの試料は、例１および例２で記載したようにして得、また、分 析した。第１の洗浄溶液は表IIIに示すように変わり、また、第２の洗浄溶液は ７５重量％のエチルアルコール水溶液であった。２つの菌株(strain)を成長させ 、純化し、配列決定した−プラスミド pＵC18＋1.5ＫＢ 挿入断片を有するα Ｄ Ｈ5およびプラスミドpＢ1＋1.5ＫＢ挿入断片を有するＸＬ1。表IIIは、次の自動 配列決定の間に観察された配列決定誤差の数に基づいて３５０塩基配列、４００ 塩基配列、４５０塩基配列および５００塩基配列の配列決定の結果を示す。 上記のデータにより、９８重量％または９９重量％のエチルアルコールを用 いる第１の洗浄が、さらなる純化過程なしに良好な配列決定データを提供するこ とがわかる。 例５ 以下は、本発明に従って洗浄溶液として他の低アルキルアルコールを使用する 適用可能性を示す。例１に記載したように、培養を準備し、また、透明にされた 溶菌液でシリカを処理した。シリカは、次に、種々の洗浄過程で露出させた。表 IVは結果を示す。 上記の例は本発明のいくつかの実施例について記載したものであって、本発明を 限定するものではない。この分野の専門家には、上記の発明の範囲内において多 くの変更が可能であることが理解されよう。例えば、粒子結合担体がシリカとし て記載されている。しかし、ガラス玉、けい藻土および他の類似の固形粒子も適 することは、この分野の専門家に明らかであろう。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ＤＮＡと他の物質との均質な混合物からＤＮＡを単離する方法であって、 ａ）カオトロープの存在下でシリカを前記均質な混合物で処理すること、 ｂ）前記処理されたシリカを少なくとも９５重量％のアルコールからなる第１ の洗浄溶液で洗浄すること、 ｃ）前記処理されかつ洗浄されたシリカを９５重量％未満のアルコール水溶液 からなる第２の洗浄溶液で洗浄し、単離された前記ＤＮＡを前記シリカの表面に 据えることを含む、ＤＮＡの単離方法。 ２ さらに、前記ステップ（ｃ）の後に前記洗浄されたシリカを水性溶液で処理 することにより前記シリカの表面から純化された前記ＤＮＡを溶離することを含 む、請求項１に記載の方法。 ３ 前記ステップ（ｂ）および（ｃ）を繰り返して行う、請求項１に記載の方法 。 ４ 前記アルコールはエチルアルコールである、請求項１に記載の方法。 ５ 前記第１の洗浄溶液は９５−９９重量％のアルコール水溶液である、請求項 １に記載の方法。 ６ 前記第２の洗浄溶液は７０−８５重量％のアルコール水溶液である、請求項 １に記載の方法。 ７ 前記第１の洗浄溶液は９９重量％のエチルアルコール水溶液であり、前記第 ２の洗浄溶液は７５重量％のエチルアルコール水溶液である、請求項１に記載の 方法。 ８ さらに、前記ステップ（ａ）の後に前記処理されたシリカを濾過によって分 離することを含む、請求項７に記載の方法。 ９ 均質な混合物からＤＮＡを単離する方法において、該方法は、シリカを前記 均質な混合物で処理することおよび前記処理されたシリカをエタノールを含む溶 液で洗浄することを含み、さらに、 ａ）カオトロープの存在下で前記シリカを前記均質な混合物中で処理すること 、 ｂ）前記処理されたシリカを９５重量％以上のアルコール水溶液からなる第 １の洗浄溶液で洗浄すること、および ｃ）前記洗浄されたシリカを９５重量％未満のアルコール水溶液からなる第２ の洗浄溶液で洗浄することを含む、ＤＮＡの単離方法。 １０ 前記アルコールはエチルアルコールである、請求項９に記載の方法。 １１ 前記第１の洗浄溶液は９５−９９重量％のエチルアルコール水溶液である 、請求項９に記載の方法。 １２ 前記第２の洗浄溶液は７０−８５重量％のエチルアルコール水溶液である 、請求項９に記載の方法。 １３ ＤＮＡと他の物質との均質な混合物からＤＮＡを単離および純化する方法 であって、 ａ）カオトロープ塩溶液の存在下でシリカを前記均質な混合物で処理すること 、 ｂ）前記処理されたシリカを前記カオトロープ塩溶液および前記均質な混合物 から分離すること、 ｃ）前記処理されかつ分離されたシリカを少なくとも９５重量％のエチルアル コールを含む第１の洗浄溶液で洗浄すること、 ｄ）前記洗浄されたシリカを前記第１の洗浄溶液から分離すること、 ｅ）前記ステップ（ｄ）で濾過された前記シリカを９５重量％未満のエチルア ルコール水溶液からなる第２の洗浄溶液で洗浄し、単離された前記ＤＮＡを前記 シリカの表面に据えること、 ｆ）前記洗浄されたシリカを前記第２の洗浄溶液から分離すること、および ｇ）前記ステップ（ｆ）で洗浄された前記シリカを水性溶液で洗浄することに より前記ＤＮＡを前記シリカから溶離することを含む、ＤＮＡの単離および純化 方法。 １４ 前記第１の洗浄溶液は９５−９９重量％のエチルアルコール水溶液である 、請求項１３に記載の方法。 １５ 前記第２の洗浄溶液は７０−８５重量％のエチルアルコール水溶液である 、請求項１３に記載の方法。 １６ 前記カオトロープ塩溶液は濃縮された塩酸グアニジンである、請求項１ ３に記載の方法。