JPH10509324A - 抑制されたアレルゲン性を有するポリペプチドの製造のための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は抑制されたアレルゲン性を有すポリペプチドを製造するための方法であって、ａ）前記ポリペプチドを生産可能な微生物を培養する、ｂ）前記ポリペプチドを実質的に純粋な状態で回収することによる方法に関連し、ここでこの微生物は発現されたポリペプチドが自己多量化するように改良されている。更に、かかるポリペプチドをコードする遺伝子を含んで成るDNA構築体、前記DNA構築体を含んで成る組換発現ベクター又は形質転換ビヒクル、前記DNA構築体又はベクターを担持する細胞を考慮する。更に、本発明の方法に従って製造した抑制されたアレルゲン性を有する微生物産生型ポリペプチド及びかかるポリペプチドを含んで成る組成物を考慮する。最後に、本発明はポリペプチドのアレルゲン性の抑制のためのジッパードメインの利用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 抑制されたアレルゲン性を有するポリペプチドの製造のための方法 発明の分野 本発明は、抑制されたアレルゲン性を有するポリペプチドを製造するための 方法に関する。更には、かかるポリペプチドをコードする遺伝子を含んで成るDN A構築体、前記DNA構築体を含んで成る組換発現ベクター又は形質転換ビヒクル、 前記DNA構築体又はベクターを担持する細胞に関する。また、本発明の方法に従 って製造された抑制されたアレルゲン性を有するポリペプチド、抑制されたアレ ルゲン性を有するオリゴマーポリペプチド、及び前記ポリペプチドを含んで成る 組成物に関する。最後に、本発明はポリペプチドのアレルゲン性を抑制するため のジッパードメインの利用に関する。 発明の背景 工業、家庭、食品／飼料、化粧品、医薬品等において利用するための酵素及び 非酵素タンパク質を含むポリペプチドがどんどん工業的に製造されてきている。 ポリペプチドであるので、それらは動物及びヒトの免疫系を刺激することができ る。ポリペプチドのアレルゲン性 一般に、ほとんどの人はポリペプチドに対して有害な作用が生ずるであろう程 度にまでさらされることはないが、このような現象が極めて重要である一定の危 険性のある集団が存在する。 このような危険性のある集団には、酵素を含んで成る製品の製造を扱う従業者 、及びポリペプチドを含んで成る製品に毎月直接触れる美容士の如き職人が含ま れる。 かかる危険性のある集団に関し、一定のポリペプチドは様々な種類の抗体の製 造を誘引する及び／又は細胞応答を供することがある。これらのルートの少なく とも一つはヒト及び動物において有害な作用を与えることがあり、なぜならポリ ペプチドに対する曝露は感作、それに続くアレルギーをもたらしうるからである 。 感作は免疫状態として定義されるが、アレルギーは臨床疾患として特性づけら れている。アレルギーは一般に抗原との２回以上の遭遇を必要とする。第一回目 の曝露は一次免疫反応を招き、それは個体の感作をもたらす。感作された個体が 同一の抗原と再度接触すると、それはアレルギー反応を誘引しうる。 より詳しくは、IgE（又は同等の物質）が肥満細胞の表層上の特異的なレセプ ターに付着する。その肥満細胞は化学媒介物質で充満された数多くの大型細胞質 顆粒を含む。肥満細胞に一旦付着すると、IgE分子はその抗体反応部位において 何週間も存続し得、特異的なアレルゲンを相互作用できるようになる。 IgE媒介式アレルギーを有する個体は肥満細胞に定着した数多くのIgE抗体を有 する。曝露により、その特異的なアレルゲン分子は細胞に定着した対応のIgE抗 体と結合する。これは化学媒介物質の細胞質顆粒の細胞放出を招き、鼻炎、結膜 炎、ウリカリア（uricaria）又はその他のアレルギー反応の如き症状を供する。 かかるアレルギー反応のアレルゲンへの曝露後数分又は数時間以内に起こり、 そして往々にして「即時型過敏反応」と呼ばれる。 IgE媒介式過敏反応はアレルゲンが吸入により気道を介して導入されるときに 生じうる。 アレルギー反応の発生は曝露の態様に少なくとも一部依存するものと信じられ ている。例えば、アレルゲン性タンパク質の鼻内負荷は、たとえ特定の血清IgE についての皮膚検査及びラジオアレルゴ ソルベント検査（RAST）が陰性であったとしても、アレルギー反応を誘引するこ とが認められている(Ivan Roitt，「Essential Immunology」第５版、p.152及び p.240，1984)。ポリペプチドのアレルゲン性の抑制 一般に、ポリペプチドのアレルゲン性の抑制のための従来技術の方法は、特に 塵状形態のポリペプチドが免疫系を刺激することを回避するため、ポリペプチド を固定化、顆粒化、コーティング又は溶解する様々な方法より成る。 どのようにしてもポリペプチド塵又は曝露状の溶解ポリペプチドが発生する危 険性が未だある。従って、ポリペプチドの多少の放出が生ずることがあり、それ は可能性のある感作及びそれに引き続くアレルギー反応を引き起こしうる。 この問題を軽減するための別の方法は、例えば細菌又は哺乳細胞培養物におい て、製造のためにヒト起源のポリペプチドを選定することであった。これはヒト にとってのいくつかの問題は解決しうるが、動物については解決しない。更に、 所望の特性を有するヒト起源のポリペプチドを見い出すのは多くのケースにおい て不可能であり、この理由のためその他の起源が考えられている。これは所望の 性質を供する分子の中に１又は複数の位置が改変された任意のヒトポリペプチド でありうる。それはまた細菌、糸状菌等を含むその他の種に由来する分子でもあ りうる。この後者の生成物の群は全て免疫刺激の潜在能を有するであろう。 アレルゲン性を低下させるための更なる提案はポリペプチド分子のサイズの縮 小にある（例えば日本国公開公報第4,112,753号又はResearch Disclosure No.33 5102を参照のこと）。しかしながら、これはポリペプチドの活性が重要でないと き、又は注目のポリペプチドの活性がポリペプチドの分解にかかわらず保持され るときにの み有効な解決案である。 プロテインエンジニアリングの利用は、エピトープマッピング及びそれに引き 続くアレルゲン性エピトープの改変を通じてポリペプチドのアレルゲン性を抑制 するために提案されている（WO92／10755(Novo Nordisk A/S)参照）。 医療分野において、ポリペプチドに対する一又は複数のポリマー分子の付加を 通じるポリペプチドの抗原性又は免疫原性の低下を行う提案がなされている。こ れは通常、ポリペプチドとその他の巨大分子構造体との相互作用を妨害する効果 をもつ。 かかるコンジュゲートは新規の特性をも発揮しうる：例えば、EP38,154（Beec ham Group Ltd.）は免疫抑制特性をもつポリサルコシンとのアレルゲンのコンジ ュゲートを開示している。 米国特許第4,179,337号（Ｅ_nzon）はポリエチレングリコール(PEG）又はポリ プロピレングリコールに複合された非免疫原性ポリペプチド、例えば酵素及びペ プチドホルモンを考慮している。１モルのポリペプチド当り10〜100モルのポリ マーが利用され、そして15％以上の生理活性が保持されている。この保持された ポリペプチドを水性溶液において哺乳動物循環系又は筋肉内に注射する。その非 免疫原性は皮内注射検査より評価される。 一般に１又は複数のポリマー分子のポリペプチド分子への付加は、例えば酵素 の活性を抑制する効果又は酵素とその基質との相互作用を妨害する効果を及ぼす ことが見い出された。 EP 183,503号(Beecham Group PLC)は、可逆性連結基により少なくとも一種の 水溶性ポリマーに連結された薬理学的に有用なポリペプチドを含んで成るコンジ ュゲートを提供することによる上記の概念の発案を開示する。 EP 471,125号(カネボウ(株))は、抗原性及び皮膚過敏症に対す る抑制効果をもたらしめる、トリアジン環を介して多糖類に連結された改良プロ テアーゼを発表している。利用された多糖類は10,000以上の平均分子量を有する 。この改良プロテアーゼ中の表層アミノ酸基についての修飾率は30％以上である 。 一般に、気道に侵入するアレルゲンは、プラスマ膜を通過してアレルギー反応 を引き起こすためには約100kDa未満の分子量を有さなくてはならないものと信じ られている。 WO94／10191(Novo Nordisk A/S)は低アレルゲン性タンパク質の製造のための 方法を開示しており、それにおいてはモノマーの親タンパク質分子は連結し合っ て、オリゴマーを形成している。これは例えばリンカーもしくはスペーサー分子 を利用することにより、又はモノマー分子同志をペプチド結合を介し、第一モノ マーのＣ末端と第二モノマーのＮ−末端との間で連結することにより行われる。 Folkesonら、Acta Physiol-Scand，139，p.437-354，1990は、導入したタンパ ク質マーカーの分子量と、気道を通じて血流に至る輸送量（生物有効率）との間 に反比例的な関係があることを示している。 EP 215,662号（マスダヒロシ）は抗腫瘍剤の如き医薬品において使用するため の微生物に由来する修飾又は非修飾プロテアーゼを考慮している。プロテアーゼ の修飾はプロテアーゼ分子を架橋させることによりダイマー又はオリゴマーを形 成することにより実施し得る。ジッパードメインの利用によるポリペプチドの拡大化 以上からわかる通り、ポリペプチドを拡大化するための種々の技術が最近公知 となっている。「ジッパー技術」 「ジッパー技術」と呼ばれるその他の技術がポリペプチドの多量 化（オリゴマー化）を引き起こすことで知られる。 ジッパー技術はポリペプチド分子同志を自己多量化ポリペプチドドメイン（以 降、ジッパードメインと呼ぶ）を通じて連結させることを可能とする。かかるジ ッパードメインの例は、公知のα−らせん束、架橋束、多重束、平行巻状コイル （porallel coiled coil）、ポリ（Ｌ−グルタミン）鎖が含まれる。 ジッパードメインの最も簡単なケースには、双性ヘリックスより成るらせん束 、例えばロイシンジッパー及び四重α−らせん束(four α-helical bundles)が 含まれる。これらのドメインは(ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇ)n型の特徴的な７ 個のアミノ酸リピートを共有している。このペプタッドリピートの「ａ」及び「 ｄ」位は一般に疎水性であり、Cridkにより提唱されているようにα−ヘリック スのインターロッキングのためのポテンシャルを供する特性をもつ(Acta crysta llogr.，6，p.689-697，1953)。 この共有パターンにもかかわらず、それぞれの配列は二本鎖、三本鎖、四本鎖 、そして更にはそれより高い次元の鎖の数のらせん束さえも形成する（Cohenら 、TIBS，11，245-248，1986; Cohen，Proteins，vol.7，p.1-15，1990; Cohen， Science 263，p.488-489，1994; O'Sheaら、Cell，68，p.699-708，1992; O'She aら、Science，254，p.539-545，1991; O'Sheaら、Science，243，p.538-542，1 989; Eisenbergら、Proteins，1，p.16-22，1986; Hoら、J．Am．Chem．Soc，10 9，p.6751-6758，1987）。 ロイシンジッパーの例は、DNA結合性ポリペプチドのクラスに属する酵母転写 因子GCN4のＣ−末端に位置する33個のアミノ酸配列である(O'Sheaら、Science， 243，p.538-542，1989)。 遺伝子操作を介して、特異的なGCN4ロイシンジッパーが種々のポリペプチドに 融合されており、そしてモノマーポリペプチドの二量 化を媒介することが示された。 Huら、Science，Vol.250，p.1400-1403，1990には、GCN4ロイシンジッパーが バクテリオファージλレプレッサーのＮ−末端ドメインに融合され、そして二量 化についてのリポーターとして用いられる遺伝子系が記載されている。 Blondel及びBedouelle（Protein Engineering．4，p.457-461，1991）は、Ｅ ．コリ(E．coli)においてマルトース結合性タンパク質（MalE）を二量化した。 一般に、ロイシンジッパーはホモダイマーを形成するが、しかしロイシンジッ パーの群内では、ヘテロダイマーの形成を優先する特定のモチーフがある。その 二つの例はFos及びJunロイシンジッパー(O'Sheaら、Science，245，p.646,1989; Turner and Tjian，Science，243 p.1689，1989)並びにO'Shea（Current Biolo gy，vol.3，no.10，p.658-667，1993）に記載の人工ヘテロ二量型巻状コイルで ある。 また、上記の四重α−らせん束の自己多量化は、Ｅ．コリにおいて発現される ネズミのScFv抗体フラグメントと二量化することが示されている。この抗体フラ グメントはEisenbergら前掲、1986及びHoら前掲、1987によりデザインされたア ンチパラレルの四重らせん束に由来する２つの同一のらせん（それにおいては、 ２つのらせんは一の回転で隔てられている）のポリペプチドモチーフと融合して いる（figure 7参照）。この四重らせん束は２つのらせんをそれぞれが構成する ２個の分子から成る（PackらBio/Technology，Vol.11，p.1271-1277，1993）。 高次元の多量化をもたらしめるジッパードメインに関し、Lovejoyら、Science ，259，p.1288，1993は三重鎖のα−ヘリックス束の合成を報告しており、それ においてはらせんは上・上・下へと流れ ている。この構築体は、それがなければ二量化するGCN4ロイシンジッパーの中に 特定の突然変異を導入することにより作られている。 グルタミンリピート(ポリ(Ｌ−グルタミン))の導入は、タンパク質が多量化し て極性ジッパーを形成するようにもする(Stottら(1995)，Proceedings of the N ational Academy of Sciences of the United States of America 92(14)，p.65 09-6513)。 三量化を媒介しうるその他のポリペプチドモチーフは、PeteranderlらBochemi stry，31，p.12272-12276，1992に記載のサッカロマイセス・セレビジエ（Sacch aromyces cerevisiae）及びクルベロマイセス・ラクチス(Kluveromyces lactis) のショック転写因子の天然モチーフである。 四量化形成の例は、GCN4ロイシンジッパーのアミノ酸残基の改変を包含する(H arburyら、Science，262，p.1401-1407，1993)。これは小型ペプチドのみについ て示されている。 組換タンパク質に融合した多量化モチーフは高次元のポリペプチドオリゴマー の形成を媒介する（Wolberら、BIO/TECHNOLOGY，10，p.900-904，1992）。発現 された融合ポリペプチドは低塩濃度においてオリゴマーを形成し、そして高塩濃 度において解離する。従来技術の説明 ポリペプチドのアレルゲン性を抑制するための従来述べられている方法は全て 、対応の親ポリペプチドとの対比において、少なくとも一の追加の製造工程を含 む。これはその方法をめんどうにし、そして抑制されたアレルゲン性をもつポリ ペプチドの製造費を高めてしまう。 従来技術は、ポリペプチドの多量化のための手段としてのみ、ジッパーを述べ ている。 ポリペプチドのアレルゲン性を、ポリペプチドの製造工程の一体 化部分としてポリペプチドのサイズを増大させることにより抑制できることが所 望されるであろう。 発明の概要 本発明の目的は、アレルゲン性の抑制されたポリペプチドを製造するための一 体式の産業上利用できる方法を提供することにある。 本発明者は産業上利用するためにジッパードメインを利用する潜在能力を認識 し、そして驚くべきことに抑制されたアレルゲン性をもつポリペプチドを製造す るための方法であって ａ）前記ポリペプチドを生産可能な微生物を培養する；そして ｂ）前記ポリペプチドを実質的に純粋な形態で回収する；ここで前記微生物は 発現されたポリペプチド分子が自己多量化するように改良されている、 ことによる方法の提供を成し遂げた。 本発明の態様において、前記微生物は少なくとも一本のポリペプチド及び少な くとも一本のジッパードメインをコードするDNA配列を含んで成る１又は複数のD NA構築体の導入により改良されている。 本発明の別の目的は抑制されたアレルゲン性をもつポリペプチドの製造のため のDNA構築体であって、少なくとも一本のポリペプチド分子及び少なくとも一本 のジッパードメインをコードするDNA配列を含んで成る構築体の提供にある。 本発明は更に、本発明の前記DNA構築体を含んで成る組換ベクター又は形質転 換ビヒクル、そして更には前記DNA構築体又は前記組換ベクターもしくは形質転 換ビヒクルを含んで成る細胞に関する。 更に、本発明は本発明の方法に従って製造された抑制されたアレルゲン性を有 する微生物性ポリペプチドに関する。更には、本発明 の少なくとも一種のポリペプチド成分を含んで成る組成物も考慮する。 最後に、本発明はポリペプチドのアレルゲン性を抑制するためのジッパードメ インの利用に関する。 図面の簡単な説明 図１は、リンカー、GCN4ロイシンジッパー、及びシステインアミノ酸基を含む 柔軟性Ｃ末端延長ペプチドのDNA配列及びそれに由来するアミノ酸配列を示す。 図２はpAZ-1プラスミドの構築工程を示す。 図３は非還元条件下で泳動させたクマジーブルー染色SDS-PAGEを示し、ここで レーン４は分子量マーカーSeeBlue(商標)(Cat.：＃LC5625，Novex，Inc.，Ca，U SA)であり、そしてレーン２及び３はDNA構築体pAZ-1を含んで成るＥ．コリJM105 により発現されたポリペプチドである。 図４は還元条件下で泳動させたクマジーブルー染色SDS-PAGEを示し、ここでレ ーン１は分子量マーカーSeeBlue(商標)(Cat.：＃LC5625，Novex，Inc.，Ca，USA )であり、そしてレーン２及び３はDNA構築体pAZ-1を含んで成るＥ．コリJM105に より発現されたポリペプチドである。 図５はウェスタンブロットを示す。レーン１は分子量マーカーである。レーン ２及び３は非還元条件下で泳動させた。誘導型JM105/pAZ-1に由来するサンプル である。レーン４及び５は還元条件下で泳動させた同じサンプルである。 図６は、IgG₁陽性と認められた1.0μｇのモノマー及び１.0μｇのダイマーのT ermamyl(ターマミル)(登録商標)に気管内曝露したDunkin Hartleyモルモットの 数、対曝露開始日からの経過日数を示 す。 発明の詳細な説明 本発明者は驚くべきことに、抑制されたアレルゲン性をもつポリペプチドを製 造するための一体式の産業利用性のある方法であって、ポリペプチドの生物活性 が少なくとも実質的に維持されている方法の提供の成功に収めた。 「実質的に」維持された活性とは、本発明との関連においては、修飾されてい ない親ポリペプチドの活性と比べ、少なくとも20％〜30％、好ましくは30％〜40 ％、より好ましくは40〜60％、より良くは60％から80％に至るまで、更により良 くは80％から約100％に至るまでの活性と定義される。 前記ポリペプチドは、以下に例示する多大な数の産業上の用途のために利用さ れうる。 ポリペプチドの産業上の利用性に関連して、アレルギー反応の危険性を及ぼし うるのは主にアレルゲンの吸入であるものと理解される。従って、本発明は重要 な長所の一つは、本発明者がアレルゲンの呼吸負荷の問題を解決したことにあり 、一方、従来技術の解決策は主として疑わしい免疫原の皮膚負荷を考慮している 。呼吸負荷ははるかに高感度な問題である。 「抑制されたアレルゲン性」なる語は、アレルギー状態に至りうる（ヒトにお ける）IgE（及び特定の動物においては、同等の効果をもつ分子、例えばモルモ ットではIgG₁）の生産量が、対応の親ポリペプチドに比べ、本発明のポリペプチ ドを吸入したときに有意に低まっていることを意味する。 「免疫原」、「抗原」及び「アレルゲン」なる語は以下に定義し、なぜならこ れらの語は往々にして、科学者によってさえも不明瞭 な態様で使用されているからである。 「免疫原」は、ヒト及び動物の中に導入されたときに免疫反応を刺激できる物 質と定義する。 「抗原」なる語は、免疫系により非自己分子として認識されたときに単独で抗 体を発生させることのできる物質を意味する。 更に、「アレルゲン」はアレルギー感作を引き起こしうる又は(ヒトにおいて は)IgE抗体（そして動物においては同等の効果をもつ分子）によるアレルギー反 応を引き起こしうる抗原と定義できうる。 「免疫原」なる語はより広義な語であり、そして「抗原」及び「アレルゲン」 を含むものと理解される。 上記の通り、皮膚検査では陰性であっても、吸入検査ではアレルギー反応を誘 発しうるという公知の事実に基づき、皮膚接触により引き起こされるアレルギー 反応を媒介する皮膚アレルゲンと、気管支樹における細胞結合型IgEとの接触に よりアレルギー反応を引き起こす呼吸性アレルゲンとを区別することが、少なく とも本発明のポリペプチドとの関係において重要である。 従って、アレルゲン性の評価は、気管支内投与した親ポリペプチドと、抑制さ れたアレルゲン性をもつ本発明の対応のポリペプチドとの効果を比較する吸入検 査によりなされうる。 動物モデル及びin vitroモデルのそれぞれにおいて二通りの有害評価手法が存 在する。ECETOCにより推奨される動物モデル（Monografi ECETOC no.19，p17-27 ）はマウス及びモルモットモデルの双方を含む。 マウスモデルは、課題の物質の一次遭遇を経た感作の誘導期の際に起こる現象 を焦点とする。しかしながら、マウスはポリペプチドを調べるために適当でない と考えられている。 これに反して、モルモットモデルは事前に感作しておいた動物において誘導し た誘引反応の関数として呼吸性アレルゲンを同定するものである。ECETOCは、モ ルモットを利用した研究の結果を、ヒトにおける有害評価の適切な基準と認定し ている。 詳しくは、本発明に係るアレルゲン性の評価との関係において、モルモットに おけるポリペプチドの気管支導入を包括するモデルが適当である。 モルモットの一の適当な品種Dunkin Hartley種はアレルギー反応との関係でIg E抗体を（ヒトのように）産生しない。しかしながら、それらは別のタイプの抗 体、即ちIgG₁A及びIgG₁Bであって、吸入されたポリペプチドに対するそのアレル ゲン性を特性化するものを産生する（例えば、Prento，ATLA，19，P8-14，1991 参照）。 従って、Dunkin Hartley動物モデルを利用したとき、IgG₁A及びIgG₁Bの相対量 はアレルゲンレベルの尺度である。 その他の動物モデル、例えばラット、ウサギ等も同等の研究のために利用でき うる。 本発明に係る抑制されたアレルゲン性をもつポリペプチドの製造は、詳しくは 、 ａ）前記ポリペプチドを生産可能な微生物を培養する；そして ｂ）前記ポリペプチドを実質的に純粋な状態で回収する；ここで前記微生物は 、発現されるポリペプチド分子が自己多量化するような態様で改良されている、 ことを含んで成る。 このポリペプチドのアレルゲン性はポリペプチドの拡大化により抑制されるも のと信じられている。 「自己多量化」なる語は、本発明との関係では、いくつかの所望のポリペプチ ド分子を、例えばジッパードメインの利用により連結 させ合うことを意味し、そして二量化、三量化、四量化、多重量化、重合、等を 含む。 本発明の好適な態様において、この微生物はその中に１又は複数種のDNA構築 体を導入することにより改良される。前記DNA構築体は、少なくとも一本のジッ パードメインに作用可能式に連結された注目の少なくとも一本のポリペプチドを コードするDNA配列を含んで成る。任意的に、このDNA配列は、ポリペプチドとジ ッパードメインをコードする配列の間にショートリンカー配列を、及び／又は精 製用タッグをコードするDNA配列を更に含んで成りうる。 多量化したポリペプチドの回収は任意の適当な方法で実施してよい。ポリ-His テール精製用タッグを利用する場合、ポリペプチドは例えばYipら(1994)，Molec ular Biotechnology，vol.1，p.151-164；Fatiadiら、(1987)，CRC Critical Re v．Anal．Chem．18，pl-44に記載の手順に従い、IMAC（固定化金属アフィニティ ークロマトグラフィー）により回収されうる。 リンカー配列は課題のポリペプチドをジッパードメインに連結するアミノ酸配 列をコードするDNA配列である。 ポリペプチドの拡大化は培養中に起こる。ジッパードメインのアミノ酸配列は 注目のポリペプチドのＮ−又はＣ−末端にグラフトされて発現される。この融合 ポリペプチドが発現されると、ジッパードメインは例えば二つづつ会合し、そし て疎水性及び静電気相互作用により束ねられる。 使用するジッパードメインに依存して、融合ポリペプチドは三量体、四量体等 も形成しうる。 本発明の方法は、抑制されたアレルゲン性をもつポリペプチド生成物を獲得す るために培養の後及び回収の前に追加の工程を必要としない事実により有利であ る。 更に、本発明に係る方法は注目の任意のポリペプチドであって、親形態にあっ てはアレルギー反応を引き起こしうる任意のポリペプチドでありうるもののため に利用されうる。 この群は約100kDa未満の分子量をもつポリペプチドを含んで成る。一般に、前 記分子量は約５kDa〜150kDa、好ましくは約20kDa〜100kDa、特に約20kDa〜80kDa の範囲に属する。 このポリペプチドは微生物又は哺乳類起源であってよく、そして天然ポリペプ チド又はその変異体であってよい。 本発明の態様において、注目のポリペプチドは少なくとも一種の触媒活性を示 す酵素である。 かかる酵素はプロテアーゼ（金属、酸性、中性又はアルカリ性）、リパーゼ、 キュチナーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リアーゼ、キシラナーゼ、ペクチナー ゼ、プルラナーゼ、ポリガラクシロナーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼ、オキシ ドリダクターゼ、トランスグルタミナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、フィターゼ 及びペルオキシダーゼを含んで成る群から選ばれる。 かかる酵素の特定の例はTermamyl(登録商標)(Novo Nordisk A/S)、即ち、約55 kDaの分子量を有するα−アミラーゼである。本発明の方法は複数種の生物活性 を発揮するハイブリド生成物、例えば脂質分解及びタンパク質分解活性の如き２ 種類の触媒活性を示すヘテロダイマー酵素の製造を可能にする。 更に、１又は複数種の触媒活性を発揮する三量化、四量化、多量化ポリペプチ ド及び／又は酵素である。 抑制されたアレルゲン性をもつポリペプチドは以下に記載の任意の適当な細菌 又は菌類生物により生産されうる。DNA 構築体 本発明の別の目的は少なくとも一本のポリペプチド及び少なくと も一本のジッパードメインをコードするDNA配列を含んで成る抑制されたアレル ゲン性をもつポリペプチドの製造用のDNA構築体の提供にある。 本明細書において用いる語「DNA構築体」とは、cDNA、ゲノムDNA、合成DNA，R NA又はPNA起源の任意の核酸分子を意味する。「構築体」なる語は核酸セグメン トであって、一本鎖でも二本鎖でもよく、そして少なくとも一本のジッパードメ インに融合した注目のポリペプチドをコードするDNA配列に基づきうるものを意 味するつもりである。この構築体は任意的にその他のDNAセグメント、例えばシ ョートリンカー配列及び／又は特に精製の目的のために使用されるペプチドセグ メントをコードする配列を含みうる。 本発明のDNA構築体は適宜、ゲノム又はcDNA起源であってよく、例えばゲノム 又はcDNAライブラリーを調整し、そして注目のポリペプチドの全て又は一部をコ ードするDNA配列を標準の技術に従って（Sambrookら、Molecular cloning，A La boratory Manual，cold Spring Harbor，NY，1989参照）合成オリゴヌクレオチ ドプローブを用いるハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることによ り得られるものであってよい。 このDNA配列は触媒活性を発揮するポリペプチドをコードしうる。特に、このD NA配列はプロテアーゼ（金属、酸性、中性又はアルカリ性）、リパーゼ、キュチ ナーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リアーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ、ポ リガラクシロナーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼ、オキシドリダクターゼ、トラ ンスゲルタミナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、フィターゼ又はペルオキシダーゼ を含んで成る群から選ばれる少なくとも一種の酵素をコードしうる。 本発明のDNA構築体は確立された標準の方法、例えばBeaucage and Caruthers，Tetrahedron Letters，22，p，p.1859-1869，1981に記載のホス ホラミジット法又はMatthesら、EMBO Journal，3，p.801-805，1984に記載の方 法により合成的に調製もされうる。ホスホラミジット法に従うと、オリゴヌクレ オチドは例えば自己DNAシンセサイザーで合成され、精製され、アニーリングさ れ、ライゲーションされ、そして適当なベクターの中にクローニングされる。 更に、このDNA構築体は合体起源とゲノム起源の複合体、合成起源とcDNA起源 の複合体、又はゲノム起源とcDNA起源との複合体であって、合成、ゲノム又はcD NA起源のフラグメントを（適宜）ライゲーションすることにより標準の技術に従 って調製されたものであってよく、そのフラグメントは全DNA構築体の様々な部 分に対応する。 このDNA構築体は例えばUS 4,683,202号又はSaikiらScience，239，p.487-491 ，1988に記載の通りにして、特異的なプライマーを利用するポリメラーゼ連鎖反 応によっても調製されうる。 特定の態様において、本発明のDNA構築体はSEQ ID No.1に示すDNA配列、更に はSEQ ID No.2に示すアミノ酸配列をコードするが遺伝子コードの縮重によりSEQ ID No.1に示すDNA配列とは異なりうる核酸配列を含んで成る。組換ベクター 更なる観点において、本発明は本発明のDNA構築体を含んで成る組換ベクター 又は形質転換ビヒクルに関する。本発明のDNA構築体を挿入する組換ベクターは 任意のベクターであって組換DNA手順に簡単にかけることができるものであって よく、そしてベクターの選定は往々にしてそれを導入すべき宿主細胞に依存する であろう。即ち、このベクターは自己複製ベクター、即ち、染色体外質として依 存するベクターであって、その複製が染色体の複製とは独立したも の、例えばプラスミドであってよい。または、このベクターは宿主細胞に導入し たときに、宿主細胞ゲノムに組込まれ、そしてそれが組込まれた染色体と一緒に 複製されるものであってよい。 このベクターは好ましくは自己多量化すべき注目のポリペプチドをコードする DNA配列がDNAの転写のために必要とされる別のセグメントに作用可能式に連結さ れている発現ベクターである。一般に、この発現ベクターはプラスミドもしくは ウィルスDNAに由来するか、又は双方の因子を含みうる。「作用可能式に連結」 なる語は、セグメントがその意図する目的のために適正に機能するように、例え ば転写がプロモーターにおいて開始され、そして注目のポリペプチドをコードす るDNA配列にわたって進むように配列されていることを意味する。 このプロモーターは選定の宿主細胞の中で転写活性を示し、且つ宿主細胞に対 して同種又は異種であるポリペプチドをコードする遺伝子に由来しうる任意のDN A配列であってよい。 酵母宿主細胞における使用にとって適当なプロモーターの例には酵母解糖系遺 伝子（Hitzemanら、J．Biol．Chem.，255，p.12073-12080，1980; Alber and Ka wasaki，J．Mol．Appl．Gen.，1，p.419-434，1982）又はアルコールデヒドロゲ ナーゼ遺伝子(Youngら、Genetio Engineering of Microorganisms for Chemical s（Hollaenderら、縮）、Plenum Press，New York）、又はIPII（US 4,599,311 ）又はADH2-4c（Russellら、Nature，304，p.652-654，1983）プロモーターが含 まれる。 糸状菌宿主細胞における使用にとって適当なプロモーターの例は、例えばADH3 プロモーター(McKnightら、The EMBO J.，4，p.2093-2099，1985)又はTpiAプロ モーターである。その他の有用なプロモーターの例は、Ａ．オリガ（A．Oryzae ）TAKAアミラーゼ、リゾム コール・ミーヘイ(Rhizomucor miehei)アスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニ ガー（A．niger）中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー酸安定性α−アミラーゼ、Ａ ．ニガー又はＡ．アワモリ（A．awamori）グルコアミラーゼ（gluA）、リゾムコ ール・ミーヘイ・リパーゼ、Ａ．オリガアルカリ性プロテアーゼ、Ａ．オリザ・ トリオースホスフェートイソメラーゼ又はＡ．ニドゥランス(A．nidulans)アセ トアミダーゼをコードする遺伝子に由来するものである。TAKA−アミラーゼ及び gluAプロモーターが好ましい。 細菌宿主細胞における使用にとって適当なプロモーターの例には、バチルス・ ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)マルトジェニックアミ ラーゼ遺伝子、バチルス・リシェニホルミス（B．licheniformis）アルファ−ア ミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリケファシエンス（B．amyloliquefaciens） BANアミラーゼ遺伝子、バチルス・スブチリス・アルカリ性プロテアーゼgenもし くはバチルス・ピュミルス（B．pumilus）キシロシダーゼ遺伝子のプロモーター 、又はファージラムダＰ_RもしくはＰ_Lプロモーター、又はＥ．コリ lac，Trpも しくはfacプロモーターが含まれる。 このDNA配列は、必要ならば、適当なターミネーターに使用可能式に連結され ていてもよい。 本発明の組換ベクターは更に注目の宿主細胞の中でベクターを複製させるよう にするDNA配列を含んで成りうる。 このベクターは更には選択マーカー、例えばその産物が宿主細胞の欠陥を補う 遺伝子、例えばジヒドロホレートリダクターゼ（DHFR）もしくはシゾサッカロマ イセス・ポンペ（Schizosaccharomyces pombe）TRI遺伝子(P．R．Russell，Gene 40，1985，p.125-130に記載)をコードする遺伝子、又はアンピシリン、カナマ イシン、テト ラサイクリン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ヒグロ マイシンもしくはメトトレキセートの如き薬剤に対する耐性を授けるものを含ん で成りうる。糸状菌に関しては、選択マーカーにはomdS，pyrG，argB，niaD，tr pC及びsCが含まれる。 ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路へと導くため、分泌シグナル配列（リーダ ー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られる）を組換ベクターの中に施 してよい。この分泌シグナル配列はポリペプチドをコードするDNA配列と適正な リーディングフレーム内で連結されている。分泌シグナル配列は一般にポリペプ チドをコードするDNA配列に対して５′側に配置されている。この分泌シグナル 配列はポリペプチドに通常一体化したものであるか、又は別の分泌型ポリペプチ ドをコードする遺伝子に由来しうる。 酵母細胞からの分泌のため、この分泌シグナル配列は発現ポリペプチドの細胞 の分泌経路に至る効率的な誘導を確実なものとする任意のシグナルペプチドをコ ードしうる。このシグナルペプチドは天然シグナルペプチド、又はその機能的な 一部、又は合成ペプチドであってよい。適当なシグナルペプチドはα因子シグナ ルペプチド（US 4,870,008参照）、マウス唾液腺アミラーゼ（O．Hagenbuchleら 、Nature，289，p643-646，1981参照）、改良カルボキシペプチダーゼシグナル ペプチド（L.A．Valkら、Cell，48，p.887-897，1987参照）、酵母BARIシグナル ペプチド（WO87/02670参照）、又は酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３（YAP3） シグナルペプチド（M．Egel-Mitaniら、Yeast，6，p.127-137，1990参照）であ ることが認められた。 酵母の中での効率的な分泌のため、リーダーペプチドをコードする配列をシグ ナル配列の下流、且つポリペプチドをコードするDNA配列の上流に挿入してもよ い。リーダーペプチドの機能は発現ポリ ペプチドを小胞体からゴルジ装置へと導き、そして更には培養培地への分泌のた めに分泌用分泌小胞へと導くことを可能にすることにある（即ち、細胞壁を横断 する又は少なくとも細胞膜を介し酵母細胞のペリプラズマ空間に至る輸送）。こ のリーダー配列は酵母α−因子リーダーであってよい（その利用はUS4,546,082 ，EP16,201,EP123,294，EP123,544及びEP163,529に記載されている）。または、 このリーダーペプチドは合成リーダーペプチド、即ち、天然には古いリーダーペ プチドであってよい。合成リーダーペプチドは例えばWO89/02463又はWO92/11378 に記載の通りにして構築されうる。 糸状菌における使用のため、シグナルペプチドは好都合にはアスペルギルス種 アミラーゼ又はグルコアミラーゼをコードする遺伝子、リゾムコール・ミーヘイ ・リパーゼもしくはプロテアーゼをコードする遺伝子、又はヒュミコラ・ラヌギ ノーザ(Humicola lanuginosa)リパーゼをコードする遺伝子に由来しうる。 このシグナルペプチドは好ましくはＡ．オリザTAKAアミラーゼ、Ａ．ニガー中 性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー酸安定性アミラーゼ、又はＡ．ニガーグルコアミ ラーゼをコードする遺伝子に由来する。 本発明の好適な態様において、前記ベクターはpAZ-1発現のベクターである。 注目のポリペプチドをコードするDNA配列、プロモーター並びに任意的にター ミネーター及び／又は分泌シグナル配列をそれぞれライゲーションするのに、更 には複製にとって必須の情報を含む適当なベクターにそれらを挿入するのに利用 する手順は当業者に公知である（例えば、Sambrookら、前掲、1989参照）。宿主細胞 宿主細胞に導入された注目の融合ポリペプチドをコードするDNA配列は注目の 宿主にとって同種でも異種であってもよい。もし宿主 細胞に対して同種なら、即ち、天然においてその宿主細胞により産生されるもの なら、それは一般に別のプロモーター配列に作用可能式に連結されているか、又 は許されるのなら、その天然環境とは異なる別の分泌シグナル配列及び／もしく はターミネーター配列に作用可能式に連結されているであろう。「同種」なる語 は注目の宿主生物にとって天然のポリペプチドをコードするcDNA配列を含むこと を意図する。「異種」は宿主細胞により天然では発現されないDNA配列を含むこ とを意図する。即ち、このDNA配列は別の起源に由来しうるか、又は合成配列で あってよい。 本発明のDNA構築体又は組換ベクターを導入する宿主細胞は注目のポリペプチ ドを産生可能な任意の細胞であってよく、そして細菌、酵母、糸状菌が含まれる 。 培養に基づき注目のポリペプチドを産生可能な細菌宿主細胞の例はグラム陽性 菌、例えばバチルス株、例えばＢ．スブチリス、Ｂ．リシェニホルミス、Ｂ．レ ンタス(B．lentus)、Ｂ．ブレビス(B．brevis)、Ｂ．ステアロサーモフィルス、 Ｂ．アルカロフィルス(B．alkalophilus)、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ． コアギュランス(B．coagulans)、Ｂ．サーキュランス(B．circulans)、Ｂ．ロー タス(B．lautus)、Ｂ．メガテリウム(B．megaterium)又はＢ．スリンジエンシス （B．thuringiensis）、又はストレプトマイセス（Streptomyces）の株、例えば Ｓ．リビダンス（S．lividans）、Ｓ．ムリヌス（S．murinus）又はＳ．グリセ ウス（S．griseus）、又はグラム陰性菌、例えばエッシェリヒア・コリ（Escher ichia coli）である。細菌の形質転換はプロトプラスト形質転換により、又はコ ンピテント細胞の利用により、周知の態様で行われうる（Sambrookら、前掲参照 ）。 ポリペプチドをＥ．コリの如き細菌の中で発現させる場合、ポリ ペプチドは細胞質の中に、一般には不溶性顆粒（封入体として知られる）として 保持されうるか、又は細菌の分泌配列によりペリプラズマ空間へと導かれうる。 前者の場合、細胞を溶菌し、そして顆粒を回収及び変性させ、その後ポリペプチ ドを変性剤の希釈によりリフォルディングする。後者の場合、ポリペプチドは、 例えば音波処理又は浸透圧ショックによる細胞の破砕によりペリプラズマ空間の 内容物を放出させ、次いでそのポリペプチドを回収することにより、ペリプラズ マ空間から回収される。 適当な酵母細胞の例にはサッカロマイセス種又はシゾサッカロマイセス種の細 胞、特にサッカロマイセス・セレビシエ又はサッカロマイセス・クリイベリ(S． kluyveri)の株が含まれる。酵母細胞を異種DNAにより形質転換させ、そしてそれ から異種ポリペプチドを生産するための方法は例えば米国特許第4,599,311号、 同4,931,373号、同4,870,008号、同5,037,743号及び同4,845,075号に記載され、 それらは全て引用することで本明細書に組入れる。形質転換細胞は選択マーカー により決定される表現型、一般には薬剤耐性により、又は特定の養分、例えばロ イシンの非存在下で増殖する能力により選別される。酵母における利用にとって 好適なベクターは米国特許第4,931,373号に開示のPOT1ベクターである。本発明 はポリペプチドをコードするDNAには例えば上記の如きシグナル配列及び任意的 にリーダー配列が先行していてよい。適当な酵母細胞の更なる例はクルイベロマ イセスの株、例えばＫ．クラチス、ハンセヌラ(Hansenula)、例えばＨ．ポリモ ルファ(H．polymorpha)、又はピシア（Pichia）、例えばＰ．パストリス(P．pas toris)である(Gleesonら、J．Gen．Microbiol，132，1986，p.3459-3465；米国 特許第4,882,279号参照)。 その他の菌類細胞の例は糸状菌、例えばアスペルギルス種、ニュ ーロスポラ（Newrospora）種、フサリウム（Fusarium）種、又はトリコデルマ(T richoderma)種、特にＡ．オリガ、Ａ．ニドゥランス又はＡ．ニガーの細胞であ る。ポリペプチドの発現のためのアスペルギルス種の利用は例えばEP272,277号 、EP238,023号及びEP184,438号に記載されている。例えば、Ｆ．オキシスポルム の形質転換はMalardierら、Gene，78，p.147-156，1989に記載の通りにして実施 できうる。 宿主細胞として糸状菌を使用するとき、それは好都合には本発明のDNA構築体 により、組換宿主細胞が得られるように宿主染色体の中にそのDNA構築体を組込 むことにより形質転換されうる。この組込みは遺伝学的に有利と考えられ、なぜ ならDNA配列は細胞の中で安定維持される傾向にあるからである。宿主染色体へ のDNA構築体の組込みは慣用の方法に従い、例えば相同又は異種組換により実施 されうる。 上記の形質転換細胞を次に適当な栄養培地の中で、注目のポリペプチドの発現 が可能となる条件下で培養し、その後得られるポリペプチドをその培養物から回 収する。 細胞を培養するのに用いる培地は宿主細胞の増殖のために適当な任意の慣用の 培地、例えば最少培地又は適当な添加物を含む複合培地であってよい。適当な培 地は商業的供給者から入手するか、又は公開の処方に従って調製できる（例えば 、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログ）。細胞により産 生されるポリペプチドは次にその培養培地から、遠心分離又は濾過による宿主細 胞の培地からの分離、その上清液又は濾過のタンパク質成分の塩、例えば硫酸ア ンモニウムによる沈殿、注目のポリペプチドのタイプに依存する種々のクロマト グラフィー手順、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラ フィー、アフィニティーク ロマトグラフィー等による精製を含む、慣用の手順により、回収してよい。ポリペプチド 本発明は本発明の方法に従って製造された抑制されたアレルゲン性をもつポリ ペプチドにも関連する。 本発明のポリペプチドは注目のポリペプチドに融合したジッパードメインより 成る。このポリペプチドのアミノ酸配列のＮ−又はＣ−末端はジッパードメイン にグラフトされている。 このジッパードメインは製造段階におけるポリペプチドを多量化できる任意の ドメインであってよい。特定の態様において、このジッパードメインはロイシン ジッパー、例えばGCN4ロイシンジッパーである。 好ましくは、モノマーのポリペプチドは５kDa〜150kDa、好ましくは20kDa〜10 0kDa、特に20kDa〜80kDaの分子量を有する。 ２個のポリペプチド分子、例えばTermamyl（登録商標）分子より成るポリペプ チドを多量化するためのロイシンジッパーを使用する場合、ロイシンジッパーは 通常ホモダイマーを安定にするのに十分な親和力を有する。しかしながら、ダイ マーを更に安定化するために、システインをロイシンジッパーの中に含ませてよ い。この構築体はハイブリドポリペプチドの２個のモノマーの間でのジスルフィ ド結合の形成をもたらしうる。 本発明のポリペプチドは２〜10個又はそれより多くのポリペプチド分子を含ん で成る。好適な態様において、自己多量化ポリペプチドはダイマー、トリマー、 テトラマー又はオリゴマーである。 ポリペプチドの生物活性、例えば二量体酵素の酵素活性は維持又は擬態される ことが可能である。 更に、本発明のポリペプチドは複数の生物活性、例えば２以上の 異なる酵素活性、例えば脂質分解及びタンパク質分解活性を発揮しうる。オリゴマーポリペプチド 本発明は抑制されたアレルゲン性をもつオリゴマーポリペプチドであって、少 なくとも一本のジッパードメインに結合又は連結された少なくとも一本のポリペ プチドに複合した少なくとも一本のジッパードメインに結合又は連結された少な くとも一本のポリペプチドを含んで成るオリゴマーポリペプチドにも関連する。 前記オリゴマーポリペプチドは任意の適当な方法により作られた又は任意の適 当な方法により調製されたホモオリゴマー、ヘテロオリゴマー又はより高次元な オリゴマーポリペプチドであってよい。 前記ジッパードメインは従来述べられている任意のジッパードメインでよい。 一の態様において、前記オリゴマーポリペプチドは少なくとも一つの先に述べ た酵素活性を示す。 前記ジッパードメインは注目のポリペプチドのＣ−又はＮ−末端のいづれかに 連結されていてよい。 以下において、「ポリペプチド」なる語は本発明の方法に従って製造したポリ ペプチド及び本発明の前記オリゴマーポリペプチドの双方を含む。 本発明に係るポリペプチドは高度に制御された安定性を示しうる。 あるケースにおいては、このポリペプチドは好都合には不可逆的に融合し合っ てよく、これはその生成物が無視できる程にしか、アレルギー状態を引き起こし うる症状の再発をよび起こしうる分解の傾向をもたないことを意味する。 しかしながら、一定のその他のケースにおいては、ポリペプチド が製造及び／又はバルクでの取扱い段階ではオリゴマー化状態を保ち、その後解 離することが、そのポリペプチドがヒト又は動物への曝露の危険性を及ぼさない とき、好都合である。 ポリペプチド間の連結の切断は例えば物理状態、例えばpH、イオン強度、温度 、還元又は酸化電位等により活性化されうる。 更に、特定の化合物の存在は例えば低次元のオリゴマー又はモノマーへの解離 をもたらしうる。 特に、ポリペプチドの活性がオリゴマー状態のときに低下する場合は解離は好 都合でありうる。組成物 本発明は本発明の少なくとも一本のポリペプチド及び／又は少なくとも１個の オリゴマーポリペプチドを含んで成る組成物にも関連する。 この組成物は更に、洗剤、例えば石けん、家庭用品、農薬、パーオナルケア製 品、化粧品、香水、薬品、織物の処理に用いられる組成物、食品及び／又は飼料 に通常用いられるその他の成分を含んで成りうる。洗剤 本発明に従うと、本発明のポリペプチドは洗剤に用いられる酵素であってよい 。それは洗剤の中に無塵顆粒、安定化液又は保護酵素の形態で含ませてよい。無 塵顆粒は例えば米国特許第4,106,991号及び4,661,452号(共にNovo Industri A/S )に開示の通りに製造され得、そして当業界公知の方法により任意的にコーティ ングされていてよい。ワキシーコーティング材の例は1,000〜20,000の平均分子 量を有するポリ（エチレンオキシド）製品（ポリエチレングリコール；PEG）；1 6〜50個のエチレンオキシド単位を有するエトキシル化ノニルフェノール；その アルコールが12〜20個の炭素原子を含み 、そして15〜80個のエチレンオキシド単位のあるエトキシル化脂肪アルコール； 脂肪酸；並びに脂肪酸のモノ−及びジ−及びトリ−グリセリドである。流動層技 術による塗布に適する膜形成性コーティング材の例は特許GB1,483,591号に記載 されている。液体酵素は、例えばポリオール、例えばプロピレングリコール、糖 又は糖アルコール、乳酸又は硼酸を樹立された方法に従って添加することにより 安定化されうる。その他の酵素安定化剤が当業界において公知である。保護酵素 はEP238,216号に開示の方法に従って調製されうる。 洗剤は任意の慣用の形態、例えば粉末、顆粒、ペースト又は液体であってよい 。液体洗剤は水性であってよく、一般に70％以下の水及び０〜30％の有機溶媒を 含むものであるか、又は非水性であってよい。 この洗剤は１又は複数種の界面活性剤を含んで成り、それぞれはアニオン、非 イオン、カチオン又は双イオン性であってよい。この洗剤は通常０〜50％のアニ オン性界面活性剤、例えば線形アルキルゲンゼンスルホネート(LAS)、アルファ −オレフィンスルホネート(AOS)、アルキルスルフェート(脂肪アルコールスルフ ェート)(AS)、アルコールエトキシスルフェート(AEOS又はAES)、第二アルカンス ルホネート(SAS)、アルファースルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−又はア ルケニルコハク酸、又は石けんを含むであろう。それはた０〜40％の非イオン性 界面活性剤、例えばアルコールエトキシレート（AEO又はAE）、カルボキシル化 アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグ リコシド、アルキルジメチルアミンオキシ、エトキシル化脂肪酸モノエタノール アミド、脂肪酸モノエタノールアミン、又はポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミ ド（例えばWO92/06154号記載）をも含みうる。 洗剤は更に１又は複数種の酵素、例えばアミラーゼ、リパーゼ、 キュチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ及びオキシダーゼ を含んで成ってよい。 洗剤は１〜65％の洗浄ビルダー又は錯形成剤、例えばゼオライト、ジホスフェ ート、トリホスフェート、ホスホネート、シトレート、ニトリロトリ酢酸(NTA) 、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ジエチレントリアミン五酢酸(DTMPA)、ア ルキル−又はアルケニルコハク酸、可溶性シリケート又は層状シリケート(例え ばHoechst由来のSKS-6)を含みうる。洗剤はビルダー抜き、即ち洗浄ビルダーを 本質的に含まなくてもよい。 洗剤は一又は複数種のポリマーを含んで成ってよい。その例はカルボキシメチ ルセルロース(CMC)、ポリ(ビニルピロリドン)(PVP)、ポリエチレングリコール(P EG)、ポリ(ビニルアルコール)(PVA)、ポリカルボキシレート、例えばポリアクリ レート、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、及びラウリルメタクリレート／ア クリル酸コポリマーであってもよい。 洗剤は漂白剤を含んでよく、それはH₂O₂起源、例えば過硼酸塩又は過炭酸塩で あって、テトラアセチルエチレンジアミン（TAED）又はノナノイルオキシベンゼ ンスルホネート（NOBS）の如き過酸形成漂白活性化剤と組合されうるものを含ん で成ってよい。または、この漂白剤は例えばアミド、イミド又はスルホンタイプ の過酸を含んで成ってよい。 本発明のポリペプチドを含んで成る本発明の洗剤は慣用の安定化剤、例えばポ リオール、例えばプロピレングルコール又はグリセロール、糖又は糖アルコール 、乳酸、硼酸、又は硼酸誘導体、例えば芳香族硼酸エステルを利用して安定化さ れ得、そして本組成物は例えばWO92/19709及びWO92/19708号に記載の通りにして 処方されうる。 この洗剤は更にその他の慣用の洗浄成分、例えば布帛コンディショナー、例え ば粘土、発泡促進剤、発泡抑制剤、腐蝕防止剤、汚れ懸濁剤、汚れ再付着防止剤 、染料、殺菌剤、蛍光増白剤又は香料を含んでよい。 pH（使用濃度において水性溶液中で測定）は通常中性又はアルカリ性、例えば ７〜11の範囲にあってよい。 本発明の範囲に属する洗剤の特定の態様には以下のものが含まれる： １）600ｇ／β以上のバルク密度を有する顆粒として配合された、以下を含んで 成る洗剤 −線形アルキルベンゼンスルホネート （酸として計算） ７〜12％ −アルコールエトキシスルフェート （例えばC_12-18アルコール、１〜2EO） 又はアルキルスルフェート（例えばC_16-18） １〜４％ −アルコールエトキシレート （例えばC_14-15アルコール、7EO） ５〜９％ −炭酸ナトリウム（Na₂CO₃） 14〜20％ −可溶性シリケート（Na₂O・2SiO₂） ２〜６％ −ゼオライト（NaAlSiO₄） 15〜22％ −硫酸ナトリウム（Na₂SO₄） ０〜６％ −クエン酸ナトリウム／クエン酸 （C₆H,Na₃O₇/C₆H₈O₇） ０〜15％ −過硼酸ナトリウム(NaBO₃・H₂O) 11〜18％ −TAED ２〜６％ −カルボキシメチルセルロース ０〜２％ −ポリマー（例えばマレイン酸／アクリル酸 コポリマー、PVP，PEG） ０〜３％ −酵素 ０〜５％ −微量成分（例えば、発泡抑制剤、香料、 蛍光増白剤、光学漂白剤） ０〜５％ ２）600ｇ／ｌ以上のバルク密度を有する顆粒として配合された、以下を含んで 成る洗剤 −線形アルキルベンゼンスルホネート （酸として計算） ６〜11％ −アルコールエトキシスルフェート （例えばC_12-18アルコール、１〜2EO） 又はアルキルスルフェート（例えばC_16-18） １〜３％ −アルコールエトキシレート （例えばC_14-15アルコール、7EO） ５〜９％ −炭酸ナトリウム（Na₂CO₃） 15〜21％ −可溶性シリケート（Na₂O・2SiO₂） １〜４％ −ゼオライト（NaAlSiO₄） 24〜34％ −硫酸ナトリウム（Na₂SO₄） ４〜10％ −クエン酸ナトリウム／クエン酸 （C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇） ０〜15％ −カルボキシメチルセルロース ０〜２％ −ポリマー（例えばマレイン酸／アクリル酸 コポリマー、PVP，PEG） １〜６％ −酵素 ０〜５％ −微量成分（例えば、発泡抑制剤、香料） ０〜５％ ３）600ｇ／ｌ以上のバルク密度を有する顆粒として配合された、以下を含んで 成る洗剤 −線形アルキルベンゼンスルホネート （酸として計算） ５〜９％ −アルコールエトキシレート （例えばC_12-15アルコール、7EO） ７〜14％ −脂肪酸として石けん（例えばC_16-22脂肪酸） １〜３％ −炭酸ナトリウム（Na₂CO₃） 10〜17％ −可溶性シリケート（Na₂O・2SiO₂） ３〜９％ −ゼオライト（NaAlSiO₄） 23〜33％ −硫酸ナトリウム（Na₂SO₄） ０〜４％ −過硼酸ナトリウム(NaBO₃・H₂O） ８〜16％ −TAED ２〜８％ −ホスホネート（例えばEDTMPA） ０〜１％ −カルボキシメチルセルロース ０〜２％ −ポリマー（例えばマレイン酸／アクリル酸 コポリマー、PVP，PEG） ０〜３％ −酵素 ０〜５％ −微量成分（例えば、発泡抑制剤、香料、 蛍光増白剤） ０〜５％ ４）600ｇ／ｌ以上のバルク密度を有する顆粒として配合された、以下を含んで 成る洗剤 −線形アルキルベンゼンスルホネート （酸として計算） ８〜12％ −アルコールエトキシレート （例えばC_12-15アルコール、7EO） 10〜25％ −炭酸ナトリウム（Na₂CO₃） 14〜22％ −可溶性シリケート（Na₂O・2SiO₂） １〜５％ −ゼオライト（NaAlSiO₄） 25〜35％ −硫酸ナトリウム（Na₂SO₄） ０〜10％ −カルボキシメチルセルロース ０〜２％ −ポリマー（例えばマレイン酸／アクリル酸 コポリマー、PVP，PEG） １〜３％ −酵素 ０〜５％ −微量成分（例えば、発泡抑制剤、香料） ０〜５％ ５）以下を含んで成る水性液体洗剤 −線形アルキルベンゼンスルホネート （酸として計算） 15〜21％ −アルコールエトキシレート（例えばC_12-15 アルコール、7EO又はC_12-15アルコール、5EO） 12〜18％ −脂肪酸として石けん（例えばオレイン酸） ３〜13％ −アルケニルコハク酸（C_12-14） ０〜13％ −アミノエタノール ８〜18％ −クエン酸 ２〜18％ −ホスホネート ０〜３％ −ポリマー（例えばPVP，PEG） ０〜３％ −硼酸塩（例えばB₄O₇） ０〜２％ −エタノール ０〜３％ −プロピレングリコール ８〜14％ −酵素 ０〜５％ −微量成分（例えば、分散剤、発泡抑制剤、 香料、蛍光増白剤） ０〜５％ ６）以下を含んで成る水性構築液体洗剤 −線形アルキルベンゼンスルホネート （酸として計算） 15〜21％ −アルコールエトキシレート（例えばC_12-15 アルコール、7EO又はC_12-15アルコール、5EO） ３〜９％ −脂肪酸として石けん（例えばオレイン酸） ３〜10％ −ゼオライト（NaAlSiO₄） 14〜22％ −クエン酸カリウム ９〜18％ −カルボキシメチルセルロース ０〜２％ −ポリマー（例えばPVP，PEG） ０〜３％ −硼酸塩（例えばB₄O₇） ０〜２％ −定着用ポリマー、例えばラウリルメタクリ レート／アクリル酸コポリマー；25：１の モル比；MW3800 ０〜３％ −グリセロール ０〜５％ −酵素 ０〜５％ −微量成分（例えば分散剤、発泡抑制剤、 香料、蛍光増白剤） ０〜５％ ７）600ｇ／ｌ以上のバルク密度を有する顆粒として配合された、以下を含んで 成る洗剤 −脂肪アルコールスルフェート ５〜10％ −エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド ３〜９％ −石けんとして脂肪酸 ０〜３％ −炭酸ナトリウム（Na₂CO₃） ５〜10％ −可溶性シリケート（Na₂O・2SiO₂） １〜４％ −ゼオライト（NaAlSiO₄） 20〜40％ −硫酸ナトリウム（Na₂SO₄） ２〜８％ −過硼酸ナトリウム(NaBO₃・H₂O) 12〜18％ −TAED ２〜７％ −ポリマー（例えばマレイン酸／アクリル酸 コポリマー、PEG） １〜５％ −酵素 ０〜５％ −微量成分（例えば、発泡抑制剤、香料、 蛍光増白剤） ０〜５％ ８）顆粒として配合された、以下を含んで成る洗剤 −線形アルキルベンゼンスルホネート （酸として計算） ８〜14％ −エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド ５〜11％ −脂肪酸として石けん ０〜３％ −炭酸ナトリウム（Na₂CO₃） ４〜10％ −可溶性シリケート（Na₂O・2SiO₂） １〜４％ −ゼオライト（NaAlSiO₄） 30〜50％ −硫酸ナトリウム（Na₂SO₄） ３〜11％ −クエン酸ナトリウム（C₆H₅Na₃O₇） ５〜12％ −ポリマー（例えばマレイン酸／アクリル酸 コポリマー、PVP，PEG） １〜５％ −酵素 ０〜５％ −微量成分（例えば、発泡抑制剤、香料） ０〜５％ ９）顆粒として配合された、以下を含んで成る洗剤 −線形アルキルベンゼンスルホネート （酸として計算） ６〜12％ −非イオン界面活性剤 １〜４％ −脂肪酸として石けん ２〜６％ −炭酸ナトリウム（Na₂CO₃） 14〜22％ −ゼオライト（NaAlSiO₄） 18〜32％ −硫酸ナトリウム（Na₂SO₄） ５〜20％ −クエン酸ナトリウム（C₆H₅Na₃O₇） ３〜８％ −過硼酸ナトリウム(NaBO₃・H₂O) ４〜９％ −漂白活性化剤（例えばNOBS又はTAED） １〜５％ −カルボキシメチルセルロース ０〜２％ −ポリマー（例えばポリカルボキシレート 又はPEG） １〜５％ −酵素 ０〜５％ −微量成分（例えば、香料、蛍光増白剤） ０〜５％ 10）以下を含んで成る水性液体洗剤 −線形アルキルベンゼンスルホネート （酸として計算） 15〜23％ −アルコールエトキシスルフェート （例えばC_12-15アルコール、２〜３EO） ８〜15％ −アルコールエトキシレート（例えばC_12-15 アルコール、7EO又はC_12-15アルコール、5EO） ３〜９％ −脂肪酸として石けん（例えばラウリル酸） ０〜３％ −アミノエタノール １〜５％ −クエン酸ナトリウム ５〜10％ −吸湿剤（例えばトルエンスルホン酸 ナトリウム） ２〜６％ −硼酸塩（例えばB₄O₇） ０〜２％ −カルボキシメチルセルロース ０〜１％ −エタノール １〜３％ −プロピレングリコール ２〜５％ −酵素 ０〜５％ −微量成分（例えばポリマー、分散剤、 発泡抑制剤、香料、蛍光増白剤） ０〜５％ 11）以下を含んで成る水性液体洗剤 −線形アルキルベンゼンスルホネート （酸として計算） 20〜32％ −アルコールエトキシレート（例えばC_12-15 アルコール、7EO又はC_12-15アルコール、5EO） ６〜12％ −アミノエタノール ２〜６％ −クエン酸 ８〜14％ −硼酸塩（例えばB₄O₇） １〜３％ −ポリマー（例えばマレイン酸／アクリル酸 コポリマー、定着用ポリマー、例えばラウリル メタクリレート／アクリル酸コポリマー） ０〜３％ −グリセロール ３〜８％ −酵素 ０〜５％ −微量成分（例えば吸湿剤、分散剤、 発泡抑制剤、香料、蛍光増白剤） ０〜５％ 12）600ｇ／ｌ以上のバルク密度を有する顆粒として配合された、以下を含んで 成る洗剤 −アニオン界面活性剤（線形アルキルベンゼン スルホネート、アルキルスルフェート、アル ファ−オレフィンスルホネート、アルファ− スルホ脂肪酸メチルエステル、アルカンスル ホネート、石けん） 25〜40％ −非イオン性界面活性剤 （例えばアルコールエトキシレート） １〜10％ −炭酸ナトリウム（Na₂CO₃） ８〜25％ −可溶性シリケート（Na₂O・2SiO₂） ５〜15％ −硫酸ナトリウム（Na₂SO₄） ０〜５％ −ゼオライト（NaAlSiO₂） 15〜28％ −過硼酸ナトリウム(NaBO₃・4H₂O) ０〜20％ −漂白活性化剤（TAED又はNOBS） ０〜５％ −酵素 ０〜５％ −微量成分（例えば、香料、蛍光増白剤） ０〜３％ 13）線形アルキルベンゼンスルホネートの全体又は一部を（Ｃ₁₂−Ｃ₁₈）アルキ ルスルフェートに置き換えた１〜12）に記載の洗剤 14）600ｇ／ｌ以上のバルク密度を有する顆粒として配合された、以下を含んで 成る洗剤 −(C_12-18)アルキルスルフェート ９〜15％ −アルコールエトキシレート ３〜６％ −ポリヒドロキシ脂肪酸アミド １〜５％ −炭酸ナトリウム（Na₂CO₃） ３〜12％ −可溶性シリケート（Na₂O・2SiO₂） ０〜６％ −ゼオライト（NaAlSiO₄） 10〜20％ −層状ジシリケート（例えばHoechst由来の SK56） 10〜20％ −クエン酸ナトリウム ４〜８％ −過炭酸ナトリウム(NaBO₃・H₂O) 13〜22％ −TAED ３〜８％ −ポリマー（例えばポリカルボキシレート 及びPVP） ０〜５％ −酵素 ０〜５％ −微量成分（例えば、発泡抑制剤、香料、 蛍光増白剤、光学漂白剤） ０〜５％ 15）600ｇ／ｌ以上のバルク密度を有する顆粒として配合した、以下を含んで成 る洗剤 −（C_12-C₁₈）アルキルスルフェート ４〜８％ −アルコールエトキシレート 11〜15％ −石けん １〜４％ −ゼオライトMAP又はゼオライトＡ 35〜45％ −炭酸ナトリウム（Na₂CO₃） ２〜８％ −可溶性シリケート（Na₂O・2SiO₂） ０〜４％ −過炭酸ナトリウム 13〜22％ −TAED １〜８％ −カルボキシメチルセルロース ０〜３％ −ポリマー（例えばポリカルボキシレート 及びPVP） ０〜３％ −酵素 ０〜５％ −微量成分（例えば蛍光増白剤、ホスホネート、 香料） ０〜３％ 16）追加の成分として、又は上述の漂白剤の代わりとして安定化又は封入化過酸 を含む、１）〜15）記載の洗剤。 17）過硼酸塩が過炭酸塩を置き代わっている１），３），７），９）及び12）記 載の洗剤。 18）マンガン触媒を更に含む、１），３），７），９），12），14）及び15）記 載の洗剤。マンガン触媒は例えば「Efficient manganese catalysts for low-te mperature bleaching」Nature，369，p.637-639，1994に記載の化合物のいづれ かであってよい。 19）液体非イオン性界面活性剤、例えば線形アルコキシル化第一アルコール、ビ ルダー剤（例えばホスホネート）、酵素及びアルカリを含む、非水性洗浄液とし て配合された洗剤。この洗剤はアニオン 性界面活性剤及び／又は漂白剤をも含んで成ってよい。 本発明の注目の酵素は洗剤において常用されている濃度で組込まれてよい。本 発明の洗剤において、抑制されたアレルゲン性をもつ注目の酵素は洗剤液１リッ トル当り、0.001〜100mgの酵素に相当する量で加えてよい。食器洗剤 抑制されたアレルゲン性をもつ本発明のポリペプチドは食器洗剤においても好 適に利用されうる。 食器洗剤はアニオン、非イオン、カチオン、両性又はこれらのタイプの混合型 であってよい界面活性剤を含んで成る。洗剤は０〜90％の非イオン界面活性剤、 例えば低から非発泡性のエトキシル化プロポキシル化直鎖アルコールを含むであ ろう。 洗剤は無機及び／又は有機系の洗浄ビルダ一塩を含んでよい。洗浄ビルダーは 有燐と無燐型とに副分類されうる。洗剤は通常１〜90％の洗浄ビルダーを含む。 存在しているなら、有燐無機系アルカリ洗浄ビルダーの例には、水溶性塩、特 にアルカリ金属ピロホスフェート、オルトホスフェート、及びポリホスフェート が含まれる。存在しているなら、有燐有機系アルカリ洗浄ビルダーには、水溶性 アルカリ金属炭酸塩、硼酸塩及びシリケート、並びに様々なタイプの水不溶性結 晶又はアモルファスアルミノシリケート（そのうちゼオライトが最も良く知られ た代表例である）が含まれる。 適当な有機系ビルダーの例には、アルカリ金属、アンモニウム及び置換化アン モニウム、クエン酸塩、コハク酸塩、マロン酸塩、脂肪酸スルホン酸塩、カルボ キシメトキシコハク酸塩、アンモニウムポリアセテート、カルボキシレート、ポ リカルボキシレート、アミノポリカルボキシレート、ポリアセチルカルボキシレ ート及びポリ ヒドロキシスルホネートが含まれる。 その他の適当な有機系ビルダーには高分子量ポリマー及びコポリマーであって ビルダー特性を有することで知られるもの、例えば適当なポリアクリル酸、ポリ マレイン酸及びポリアクリル酸／ポリマレイン酸コポリマー、並びにその塩が含 まれる。 食器洗剤は塩素／臭素系又は酸素系の漂白剤を含みうる。無機系の塩素／臭素 系漂白剤の例は次亜塩素酸及び次亜臭素酸リチウム、ナトリウム又はカルシウム 、及び塩素化リン酸三ナトリウムである。有機系の塩素／臭素系漂白剤の例は複 素環式Ｎ−ブロモ及びＮ−クロロイミド、例えばトリクロロイソシアヌル酸、ト リブロモイソシアヌル酸、ジブロモイソシアヌル酸及びジクロロイソシアヌル酸 、並びにカリウム及びナトリウムの如き水溶性カチオンを有するその塩である。 ヒダンチオン化合物も適当である。 酸素系漂白剤、例えば無機過塩の形態のものが好ましく、漂白前駆体として、 又はペルオキシ酸化合物が好ましい。適当なペルオキシ漂白化合物の典型例はア ルカリ金属過硼酸塩（四水和物及び一水和物の双方）、アルカリ金属過炭酸塩、 過珪酸塩及び過リン酸塩である。好適な活性化材料はTAED及びグリセロールトリ アセテートである。 本発明の食器洗剤は酵素のための慣用の安定化剤、例えばポリオール、例えば プロピレングリコール、糖又は糖アルコール、乳酸、硼酸、又は硼酸誘導体、例 えば芳香族硼酸エステルを用いることで安定化されうる。 本発明の食器洗剤は更に慣用の洗浄成分、例えば浮遊防止材料、充填剤、発泡 抑制剤、腐蝕防止剤、汚れ懸濁剤、封鎖剤、汚れ再付着防止剤、脱水剤、染料、 殺菌剤、蛍光体、増粘剤及び香料を含んでよい。 最後に、本発明のポリペプチドは慣用の食器洗剤、例えば以下の特許公開物の いづれかに記載の洗剤のいづれかの中に使用されうる： EP518719，EP518720，EP518721，EP516533，EP516554，EP516555，GB2200132，D E3741617，DE3727911，DE4212166，DE4137470，DE3833047，WO93/17089，DE4205 071，WO52/09680，WO93/18129，WO93/04153，WO92/06157，WO92/08777，EP42912 4，WO93/21299，US5141664，EP561452，EP561446，GB2234980，WO93/03129，EP4 81547，EP530870，EP533239，EP554943，EP346137，US5112518，EP318204，EP31 8279，EP271155，EP271156，EP346136，GB2228945，CA2006687，WO93/25651，EP 530635，EP414197，US5240632。織物用途 抑制されたアレルゲン性をもつ本発明の酵素を含む更なるポリペプチドは酵素 顆粒又は粉末の取扱いを包含する織物産業における目的のための用途において利 用されうる。 織物用途の例を以下に列挙する： ｉ．セルロース分解酵素は布帛の色調密度におる局部バリエーションを供するた めにデニム衣料の最終仕上げに幅広く利用されている（酵素助長式「ストーンウ ォッシュ」）。 ii．バイオ−ポリシング 更に、セルロース分解酵素はバイオ−ポリシング工程において有用である。バ イオ−ポリシングは布帛の湿潤性を損うことなく取り扱い及び外観に関する布帛 の品質を改善する糸表面の特異的な処理である。バイオ−ポリシングは例えばWO 93/20278号に記載の方法の適用により得られうる。 iii．サイズ除去 織物の製織の際、糸はかなりの機械的応力にかけられる。破断を 防ぐため、それらは通常ゼラチン状物質（サイズ）によるコーティング（サイジ ング）により補強される。最も一般的なサイズ剤は天然又は改質形態のデンプン である。従って、均一性及び耐久性は布帛からのサイズの除去、いわゆるサイズ 除去を経たときにのみ得られる。デンプン又は改質デンプンを含むサイズにより サイジングされた布帛のサイズ除去は好ましくはアミロース分解酵素の利用によ り助長される。 iv．漂白清浄 漂白において、清浄カタラーゼが過剰の過酸化水素の除去のために働きうる。 ｖ．絹のがん除去 絹繊維上のがんのプロテアーゼによる除去。(「Novo Enzymes for Silk Degum ming」の出願書類が注問に応じて入手できる）。パーソナルケアー用途 また、パーソナルケアー技術分野において、本発明に係るポリペプチドが注目 される。以下に用途例を列挙する。 １）プロテアーゼ： プロテアーゼはコンタクトレンズの洗浄のためのよく知られた活性成分である 。これらはレンズ上のタンパク質性の汚れを加水分解し、それを可溶性にする。 タンパク質性の汚れの除去は快適な装着のために必須である。 プロテアーゼは肌洗浄用製品の有効な成分でもある。それらは死んだケラチン 様皮膚細胞の上膚を除去し、それ故肌をより明るく、且つよりフレッシュに見せ る。 プロテアーゼは口内ケア製品、特に義歯の洗浄用製品、更には歯みがき粉にお いて利用されうる。 ２）リパーゼ： リパーゼは可撓な皮膚脂質の除去のための肌洗浄用製品及び耐にきび製品の活 性成分として化粧品に、更には肌ケアの活性成分としてクリーム及びローション に適用されうる。 リパーゼは毛髪の表面からの皮脂及びその他の脂肪物質の効果的な除去のため の洗髪用製品（例えばシャンプー）にも利用されうる。 リパーゼはコンタクトレンズの洗浄用製品の有効な成分でもあり、その場合そ れらはレンズ表面から脂質付着物を除去する。 ３）オキシドリダクターゼ： オキシドリダクターゼの数多くのよく知られたパーソナルケア製品がある。最 も一般的なのはオキシダーゼ（通常はグルコースオキシダーゼ）とH₂O₂との生成 を確実にする基質（例えばグルコース）とであり、それらはペルオキシダーゼ（ 通常はラクトペルオキシダーゼ）による例えばSCN^-又はＩ^-の抗微生物剤（SCNO^{- 1} 又はＩ₂）に至る酸化を開始させる。この酵素複合体は天然では例えば乳及びだ 液に由来するものが知られる。 これは口内ケア製品（マウスリンス、歯みがき粉、チューイングガム）中の抗 微生物剤として商業的に利用され、その場合それらはグルコースを生成するアミ ログルコシダーゼと組合せても利用できうる。これらの剤は保存のための化粧品 においても知られる。 オキシダーゼとペルオキシダーゼとの組合せを含んで成る抗微生物剤はコンタ クトレンズの洗浄において公知である。 オキシドリダクターゼのその他の用途は酸化毛染め品におけるオキシダーゼ、 ペルオキシダーゼ及びラッカーゼの利用である。 更に、肌（及び毛髪）の表面上に形成されるフリーラジカルは肌の老化過程（ 毛髪の損傷）に関係することがわかっている。 フリーラジカルは脂肪膜、コラーゲン及び細胞の破壊を招きうる 連鎖反応を活性化する。フリーラジカルスキャベンジャー、例えばスーパーオキ サイドジスムターゼの化粧品への利用は公知である(R.L．Goldemberg，DCI，Nov .93，48-52)。 タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)もオキシドリダクターゼである。 それは毛髪のウェービング（毛髪のジスルフィド結合の還元及び再酸化）のため に、並びに損傷した毛髪の修復（この場合、その損傷は主に現存のジスルフィド 結合の還元である）のために利用されうる。 ４）グルカナーゼ／カルボヒドラーゼ 歯の表面上に形成される歯垢は主に多糖類より成る。それらは歯の表面性及び 微生物に付着する。多糖類は主にα−１，６−結合型グルコース（デキストラン ）及びα−１，３−結合型グルコース（ムタン）である。様々なタイプのグルカ ナーゼ、例えばムタナーゼ及びデキストラナーゼの利用は歯垢の加水分解を助け 、機械的作用により除去し易くする。 また、その他の種類の生物膜、例えばレンズケースにおいて形成される生物膜 はグルカナーゼの作用により除去できうる。 ５）抗微生物ポリペプチド 抗微生物ポリペプチドは化粧品、耐にきび製品、デオドラント及びシャンプー の保存の如き幅広い用途をもつ。食品及び飼料 本発明に係る抑制されたアレルゲン性をもつポリペプチドは食品及び飼料にお いて更に好適に利用されうる。特に関連するポリペプチドは、プロテアーゼ、β −グルカナーゼ、アミラーゼ、ペクチナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、フィター ゼ、キシラナーゼ及びリパーゼの群から選ばれる酵素である。ジッパードメインの利用 最後に、本発明はポリペプチドの抑制されたアレルゲン性のためのジッパード メインの利用に関連し、そしてそれは微生物により発現されたポリペプチドを自 己多量化できる任意の分子であってよい。 いくつかのジッパードメインの例が既に発表されている。 ある態様において、このジッパードメインはロイシンジッパーである。 ロイシンジッパーは任意の公知のロイシンジッパーであってよく、それはポリ ペプチドにグラフトされており、２個以上のロイシンジッパーの平行の一らせん コイルの会合の結果として自己多量化できる。 特定の態様において、ロイシンジッパーは酵母転写因子GCN4又はその改質体で ある。 ヘテロ二量化分子を得ることが所望されるなら、ジッパードメインは好都合に はFosロイシンジッパー及びJunロイシンジッパーでりうる。 本発明の別の態様において、ジッパードメインは四重らせん束又はその改質体 である。 ジッパードメインは好都合には洗剤、家庭用物品、農薬、パーソナルケア製品 、化粧品、香水、薬品、織物の処理のために用いられる組成物、食料及び飼料等 の中のポリペプチドのアレルゲン性を抑制するために利用されうる。 詳しくは、少なくとも一本のジッパードメインを含んで成るポリペプチドが上 記の組成物及び／又は例えば産業用途に好適に利用されうる。 本発明を以下の実施例において更に説明し、それは本発明の範囲を何ら限定す るものでもない。 方法及び材料宿主細胞： エッシェリヒア．コリJM105(Yanisch-Perronら、Gene，33，p.103-119，1985) エピキュリアン・コリ（Epicurian coli）XL−ブルー細胞（Stratagene Cloning Systems，Ca.，USA）エッシェリヒア・コリMC1061(Casadaban，M.J.ら、J．Mol ．Biol．138，p.179-207，1989)。ベクター： pFab３発現ベクターはpFab４の先租である(Orum，H.ら、Nucleic Acids Resea rch，21，p.4491-4498，1993)。このベクターはpelBシグナル配列(Leiら、J．of Bacteriol，vol.169，p.4379-4383，1987)を含む、それは誘導性lacZプロモー ターの制御下にある。pelBシグナルにおけるSfiI部位は所望の配列のクローニン グを可能にし、これにより遺伝生成物はシグナル配列とイン・フレームで発現さ れるであろう。 pFab３ベクターの一部はこの研究に関係ないため、それをSfiI及びXmaI消化に より除去した。これらの部位を次に下記の通り、PCRフラグメントの導入用の部 位として用いた。対照のpFab４と異なり、pFab３はlacZの開始コドンとpelBシグ ナルとの間に131bpの領域を含む。プライマー： Ａ−ターマミル（SEQ ID NO 9）： Ｂ−ターマミル(SEQ ID NO 10）： 下線を付したヌクレオチドはターマミル配列に相当する。 プライマーＡ−ターマミルはSfiI制限部位とpelBシグナルの最後の２個のコド ンとをも含む。プライマーＢ−ターマミルはリンカー配列(IgG3の短いヒンジド メイン)(Pluckthur，Aら、Biochemistry，31，p.1579-1584，1992)及びXmaIクロ ーニング部位を含む。プラスミド： pDN1528（PCT/DK94/00370）シグナル配列： pelB(Leiら、J．of Bacteriol，vol.169，p.4379-4383，1987)リンカー配列： IgG₃ヒンジの一部(Pluckthun，A．ら、Biochemistry，31，p.1579-1584，1992 )、 材料： fmol（商標）DNA−配列決定用システム（Cat.：#Q4100，Promega Corporation ，WI，USA）。 α−アミラーゼEPSアッセイ(Cat.：#1442295，Boehringer Mannheim GmbH，Ma nnheim，Germany)。酵素： Termamyl(登録商標）(Novo Nordisk A/Sより入手可能)。 Sfil（Cat.：#R6391，Promega Corporation，WI，USA）。 XmaI（Cat.：#R6491，Promega Corporation，WI，USA）。 SacI（Cat.：#R6061，Promega Corporation，WI，USA）。 T4-DNAリガーゼ（Cat.：#M1801，Promega Corporation，WI，USA）。 AmpliTag（登録商標）DNAポリメラーゼ(PartNo.：N8O1-0060，Perkin Elmer， Roche Molecular Systems，New Jersey，USA.)。溶液： PCR反応バッファー：dNTP（0.25mMづつ）、MgCl₂ 2.5mM及びｌｘのPCR反応バ ッファー−II（PartNo.：N808-0009，Perkin Elmer，Roche Molecular Systems ，New Jersey，USA）。 T4-DNAリガーゼバッファー（Cat.：#M1801，Promega Corporation，WI，USA） 。 SOC培地 （Sambrook，J．ら、1989，Molecular Cloning. A Laboratory Manual．第２版。Cold Spring Harbor Laboratory，New York，USA）。 2xTY培地 （Ausubel，F.M.ら（編）、1994。 LB−アガー Current Protocols in Molecular Biology，Jo hn Wiley & Sons，Inc．and Greene Publishin g Associates，Inc.，New York，USA)。 PEG-8000(Cat.：#p2139，Sigma Chemical Company，MO，USA)。 PBSウイーン20 Ausubel，F.M．ら（編）、1994。 アルカリホスファターゼバッファー(pH＝9.0)。 NaCl 5.844ｇ MgCl₂ ：6H₂O 1.02ｇ ジエタノールアミン 10.51ｇ pHを9.0にHClで合わせ、そしてMilli-Q水を１リットルとなるように加える。 停止液 EDTA二ナトリウム 74.44ｇ K₂HPO₄ 174.2ｇ NAH₃ 0.2ｇ pHを10に約22.5ｇのKOHで合わせ、Milli-Q水で１リットルにする。装置： Bio-Rad E.コリパルサー(#165-2103，Bio-Rad Laboratories，Ca.，USA)。 水平11.14アガロースゲル装置（#580-1068IL，Life Thechnologies，Inc.，MD ，USA）。 Applied Biosystems 394 DNA/RNAシンセサイザー(Applied Biosystems，CA，U SA)。 サーモサイクラーVarius V 45（Hans Landgraf，GmbH，Langenhagen，Germany ）。 Mini-PROTEAN II電気泳動セル(#165-2940，Bio-Rad Laboratories，Ca,．USA) 。 セミドライエレクトロブロッター（JKA-Biotech，Denmark）。 HiTrap（商標）キレートカラム（Code no.17-0409-01，Pharmacia LKB，Biote chnology AB，Uppsala，Sweden）。 ELISAリーダー：Ceres 900 HDi。 方法： 全ての汎用の技術はSambrook，J.らMolecular Cloning．A Laboratory Manual ．第２版、Cold Spring Harbor Laboratory，New York，USA,1989、及び／又はA usubel，F.M.ら（編）、Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc．and Greene Publishing Associates，Inc.，New York，USA，199 4に記載の通りに実施する。 Geneclean II手順（BIO IOI，Inc.，CA，USA）。Termamyl （登録商標）をコードする遺伝子のPCR増幅 PCR反応を50μｌの容量のPCR反応バッファー、１mMづつのプライマーＡ−及び Ｂ−ターマミル、並びに10ngのDNA鋳型の中で実施する。 反応混合物に鉱物油をかぶせ、そして94℃で５分保存する。次い で0.5μｌのAmpliTaq(登録商標)(５Ｕ／μｌ)を加える。この混合物を70℃のア ニーリング温度に５分保ち、そして72℃の伸長温度は２分保つ。 この一次インキュベーションの後、PCRサーモサイクラーVarius V45を用い、 この混合物を30回のサイクル（94℃で１分、70℃で１分、72℃で１分）にかけ、 次いで、72℃で10分のインキュベートする。GCN4 に由来するロイシンジッパー及びリンカーをコードする配列の調製 ４種のオリゴヌクレオチドを、Applied Biosystems 394 DNA/RNAシンセサイザ ーで、その供給者のプロトコールに従って合成する。合成後、そのオリゴヌクレ オチドをAusubel，F.M．ら前掲、1994に従って変性ポリアクリルアミドゲル電気 泳動を利用して精製する。20pmolづつのオリゴヌクレオチドを全容量40μｌの10 0mMのNaClの中で混合し、95℃で５分のインキュベーションによりアニーリング し、そして３時間かけてゆっくりと16℃にまで冷却し、このアニーリング混合物 をライゲーションに用いる。４種のオリゴヌクレオチドは下記の通りである：アンチセンスZip Cys(1)(XmaI-SacI)(SEQ ID NO 3) アンチセンスZip(2)，(XmaI-SacI)(SEQ ID NO 4) センスZip(1)，(XmaI-SacI)(SEQ ID NO 5) センスZip Cys(2)，(XmaI-SacI)(SEQ ID NO 6) Ｐは５′末端にホスホリル基をもつオリゴヌクレオチドを意味する。XL −１ブルーＥ．コリの形質転換 形質転換はエレクトロポレーションにより実施する。この目的のため、エピキ ュラン−コリXL１−ブルー・エレクトロポレーション・コンピテント細胞を使用 し、80μｌの細胞当り３μｌのライゲーションDNAを使用する。エレクトロポレ ーションは25μＦ，2.5kV及び200 Ohmに設定したBio-Rad Ｅ．コリパルサーを用 いて実施する。Ｅ．コリJM105の形質転換 Ｅ．コリJM105の形質転換は100μｌのヒートショック・コンピテント細胞当り ３μｌのライゲーション混合物を加えることにより行う。この細胞の調製及び形 質転換はSambrookら1989前掲に本質的に記載の通りにして行う。ペリプラズマポリペプチドの発現及び単離 Ｅ．コリJM105におけるTermamyl（登録商標）ダイマーの発現は下記の通りに 実施する。100μｇ／mlのアンビシリン及び１％のＤ（＋）グルコースを有する ２ＸのTY培地中のpAZ-1プラスミドを担持するJM105の一夜培養物を、単一のコロ ニーをその培地に移し、そしてこれを37℃で16時間強力に撹拌しながらインキュ ベーションすることにより調製する。その100μｌを100μｇ／mlのアンピシリン 及び0.1％のＤ（＋）−グルコースを有する100mlの２ＸのTY培地の出発培養物と して用い、それを１ｌの振盪フラスコの中で37℃で強力に撹拌しながらインキュ ベーションする。OD550＝1.0に 到達したら、その温度で30℃に調節し、そして発現をイソプロピル−β−Ｄ−チ オガラクトピラノシド（IPTG）の１〜５mMの内の最終濃度に至る添加により誘導 する。誘導を５時間にわたり行い、次いで細胞を軽い遠心分離によりペレット化 し、そして細胞のペリプラズマ写空間内に存在するポリペプチドの放出のために 浸透圧ショックを与える。これはNeu，H.C．及びHeppel，L.A.，J．Biol．Chem ．240，p.3685-3692，1965の手順に従って実施できる。発現したTermamy(登録商標)−ジッパードメインの特性決定 pAZ-1プラスミドを抱える誘導及び未誘導細胞のペリプラズマ画分をSDS-PAGE ゲル４〜20％アクリルアミド(Laemmli，Nature，227，p.680，1970)上で、Mini- Protean II（Bio-Rad Laboratories，Richmond，Ca，USA）を用いて分析する。 サンプルを還元剤ジチオスレイトール入りで及び抜きで泳動させる。Clelands試 薬とも呼ばれるジチオスレイトール(DTT)はジスルフィド結合を定量的に還元で きる還元剤である(Cleland，W.W.，Biochemistry，3，p.480，1964)。一枚のゲ ルはクマジーブリリアントブルーG250によりNeuhoffら、Electrophoresis，9，p .255-262，1988)に従って染色し、そして他方のゲルはポリペプチドをPVDF膜lmo billin-P（Cat.：#IPVH 20200，Millipore Corporation，MA，USA）に対するセ ミドライエレクトロブロッターを用いるブロッティングのために用いる。これら の膜を第一抗体としてのTermamyl（登録商標）に対してウサギにおいて生起させ た抗−ターマミル抗体(Ausubel，F.F.ら第11章、第12及び13欄、前掲、1994記載 )及び第二抗体としての抗−ウサギIgG西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲー ト（Cat.：L42007，medac，GmbH，Hamburg，Germany）を用いてプロービングす る。これらのポリペプチドはECL(商標)ウェスタンブロッティング検出試薬(Cat. ：#RPN2106，Amersham Int.，Buckinghamshire，England)で検出 し、そして常用のＸ線フィルム上で発光を記録する。Termamyl （登録商標）ジッパーダイマーの精製 発現したTermamyl（登録商標）ジッパーダイマーを発酵培養液から精製した。 これはアフィニティータッグとして付加されたポリ-Hisテールを用いて行った。 より詳しくは、精製は５mlのHiTrap（商標）キレートカラムを用い、その供給者 の推奨に従って実施する。IMAC（固定化金属アフィニティークロマトグラフィー ）手順についての更なる詳細はYipら(1994)Molecular Biotechnology vol.1,p.1 51-164; Fatiadiら(1987)，CRC Critical Rev．Anal．Chem．18，p.1-44に記載 されている。タンパク質決定 Termamyl（登録商標）ジッパードメインサンプルの精製及び分析後、スペクト ル測定を行う。280nmでのサンプルの光学密度をサンプルのタンパク質濃度の計 算のために用いた。この目的のため、ランベール・ベールの法則をTermamyl（登 録商標）ジッパーダイマーの算定タンパク質励起係数と共に、Gillら、Analytic al Biochemistry，182，p.319-326，1989に記載のこれについての原理を利用し て用いた。IgG₁ 陽性モルモットの決定のためのELISA手順 ELISAマイクロタイタープレートを炭酸バッファー中のウサギ抗−Termamyl（ 登録商標）AAN4080K 452-453 １：4000でコーティングし、そして４℃で一夜イ ンキュベーションする。翌日、プレートを２％のBSAで時間ブロキングし、そし てPBSツイーン20で３回洗う。Termamyl（登録商標）PPX3328 １μｇ酵素タンパ ク質／mlをプレートに加え、１時間インキュベーションし、次いでPBSツイーン2 0で３回洗った。 モルモットサンプルを全て25μｌの血清及び25μｌのPBSバッフ ァーの入ったELISAプレートに加え、３時間インキュベーションし、そしてPBSツ イーン20で３回洗う。 次いでヤギ抗−モルモットIgG₁(PBSバッファーに１：4000に希釈)をプレート に加え、１時間インキュベーションし、そしてPBSツイン20で３回洗う。アルカ リホスファターゼウサギ抗−ヤギを加え（１：8000に希釈）、そして１時間イン キュベーションし、PBSツイーン20で２回、そしてジエタノールアミンバッファ ーで１回洗う。 アルカリホスファターゼをｐ−ニトロフェニルホスフェートで37℃で30分かけ て発色させ、そしてEDTAを含むカルシウム／ナトリウムバッファー（pH＝10）で 停止させ、そしてELISAリーダーを用いてOD405/650で測定する。 ６組の二重ブラインドを全てのELISAプレートに含ませる。 陽性及び陰性血清値は平均ブラインド値に２倍の標準偏差を足した値として計 算する。これは95％の精度を供する。 この検査はNovo Nordisk A/Sより注問に応じて入手できるED-951542により詳 しく記載されている。 実施例 実施例１Termamyl （登録商標）をコードする遺伝子のPCR増幅及びクローニング プライマーＡ−ターマミル及びＢ−ターマミルをデザインし、そしてApplied Biosystems 394 DNA/RNAシンセサイザーで合成した。 Termamyl（登録商標）をコードする遺伝子を鋳型としてTermamyl（登録商標） をコードする遺伝子を含むプラスミドpDN1528を用いてPCR増幅させた。 1.5kbのフラグメントのPCR生成物をGeneclean-II手順(BIO IOI，Inc.，Ca.，U SA)に従う調製アガロース電気泳動により精製した。 実施例２PCR 生成物のクローニング Termamyl（登録商標）をコードする配列を含む精製した1.5kbのDNAフラグメン トを10ＵのSfiI／１μｇのDNAで50℃で２時間かけて消化した。その際、反応混 合物に鉱物油をかぶせておいた。 Geneclean-II手順に従い、DNAフラグメントを10ＵのXmaI／１μｇのDNAにより 37℃で２時間かけて更に消化した。消化したDNAを再びGeneclean-II手順を用い て精製し、そして調製しておいたSfiI及びXmaI消化pFab3に最後にライゲーショ ンさせた。10μｌのライゲーション混合物には0.2μｇのインサートDNA及び0.2 μｇの消化ベクターpFab3を含ませた。このライゲーションは１ＵのT4-DNAリガ ーゼにより16℃で２時間及び４℃で14時間行った。 ライゲーションした材料を上記の通りエピキュリアン・コリXL 1−ブルーエレ クトロポレーションコンピテント細胞を形質転換させるのに用いた。 実施例３適切なクローンの同定 エレクトロポレーションの直後、１mlの調製したばかりのSOC培地を加え、そ して形質転換細胞を37℃で１時間強力に振盪し、100μｇ／mlのアンピシリン及 び12.5μｇ／mlのテトラサイクリンを含むLB−アガープレート上に入れ、そして 37℃で一夜インキュベーションした。翌日、クローンをランダムに拾い、100μ ｇ／mlのアンピシリン及び12.5μｇ／mlのテトラサイクリンを含む14mlのポリプ ロピレンチューブに移した。37℃での一夜のインキュベーション及 び250rpmでの振盪後、プラスミドDNAミニプレップをSambrookら1989に記載の通 りに調製した。単離したプラスミドDNAをSfiI及びXmaIによる消化により分析し 、そして消化したプラスミドDNAを１％のアガロース、１％のTBEゲル上で分析し た。 1.5kbのDNAフラグメントの出現は適正なフラグメントサイズを含むクローンの 存在を示した。クローニングした遺伝子の更なる確認を、Promega Corporation 由来のfmol（商標）DNA配列決定システムを用い、DNA配列決定として行った。Te rmamyl（登録商標）の 実施例４ロイシンジッパー 酵母転写アクチベーターGCN4のロイシンジッパーをコード(O'SheaらCcience， 243，p.538-542，1989)、そして更にはシステインアミノ酸残基を含む柔軟性Ｃ 末端伸長ペプチドをもコードする配列の導入は、４本の重複オリゴヌクレオチド を用いて実施した（方法の章参照）。 ライゲーションのため、５μｌのアニーリング混合物をT4-DNAリガーゼバッフ ァーに加え、それに５％のPEG-8000、１単位のT4-DNA ライゲーションした材料を上記の通り、Ｅ．コリJM105を形質転換するために 用いた。 実施例５Termamyl （登録商標）ロイシンジッパー構築体を含むクローンの同定 形質転換の直後、１mlの調製したばかりのSOC培地を加え、そして細胞を37℃ で１時間強力に振盪し、選択プレートに入れ、そして37℃で一夜インキュベーシ ョンした。 翌日、クローンをランダムに拾い、100μｇ／mlのアンピシリンを含む２mlのL B培地を含む14mlのポリプロピレンチューブに移した。37℃で一夜のインキュベ ーション及び250rpmでの振盪の後、プラスミドDNAミニプレップをSambrookら、 前掲、1989に従って調製した。単離したプラスミドDNAをNruI（ロイシンジッパ ーDNAフラグメントにより導入）により分析し、消化及び未消化プラスミドDNAを １％のアガロース、１ｘのTBEゲル上で分析した。NruI消化サンプル中の4606bp の線形プラスミドの出現はロイシンジッパーフラグメントを含んで成るクローン の存在を示唆した。クローニングしたフラグメントの更なる確認は、Promega Co rporation由来のfmol（商標）DNA配列決定用システムを用いる配列決定により行 った。 実施例６二量化Termamyl（登録商標）の発現 プラスミドpAZ-1を抱えるJM105細胞を上記の通りにして融合ポリペプチドpelB シグナル−Termamyl（登録商標）−リンカー一ロイシンジッパーを発現するよう に誘導した。各融合ポリペプチドは発現中にその他の同一の融合ポリペプチドと 二量化する。ペリプラズマの中に存在するタンパク質を遊離させるために細胞を 浸透圧ショックにかけた。誘導化及び未誘導細胞の双方に由来する単離体のアリ コートをSDS-PAGEで分析した。サンプルを還元(DTTを含むサンプル)及び非還元( DTT抜きのサンプル)条件下で分析した。ポリペプチドバンドをクマジーブルー染 料による染色により識別化した。誘導細胞の非還元サンプルは、未誘導細胞のサ ンプルの中には存在しない明確なバンドを約120kDaにおいて示した（図３参照） 。誘導細胞由来の還元サンプルは約60kDaにおいて明確なバンドを示し、一方そ のとき、120kDaにはバンドはなかった（図４参照）。未誘導細胞のサンプルにお いて、60kDaのバンドが認められた。上記と類似 のゲルを、上記の通り、ウェスタンブロット手順を介してタンパク質をPVDP膜に 移すために用いた。120kDaのバンドの非還元サンプルはTermamyl（登録商標）と して特異的に認識され、ダイマーとしてのTermamyl（登録商標）の発現を確証し た（図５参照）。 実施例７未精製Termamyl−ダイマーのα−アミラーゼ活性 Termamyl（登録商標）−ダイマーのα−アミラーゼ活性についての試験として 、ペリプラズマ単離体のサンプルを分析した。電気泳動分析により、このサンプ ルは約0.5mg／mlのTermamyl（登録商標）−ダイマーを含むことが推定された。 サンプルの希釈系列をα−アミラーゼアッセイにおいて試験し（材料及び方法の 章参照）、そして既知の活性のTermamyl（登録商標）の希釈系列として比較した 。このアッセイは、ダイマーが野生型の活性の50％以上を保持することを示した 。 実施例８精製用タッグの導入 間にインフレーム挿入としてTermamyl（登録商標）−ジッパータンパク質のＣ末 端部分に精製用タッグを導入した。これはXa因子部位及びアミノ酸配列His-His- Hisより成るＣ−末端テールを有するTermamyl（登録商標）−ジッパータンパク 質をコードするヌクレオチド配列をもたらす（配列データー参照）。この目的の ために４種のオリゴヌクレオチドを使用した（以下参照）。 Applied Biosystems 394 DNA/RNAシンセサイザーで、その供給者のプロトコー ルに従い、４種のオリゴヌクレオチドを合成した。合成後、そのオリゴヌクレオ チドをAusubel，F.M.ら、前掲、1994に従う変性ポリアクリルアミドゲル電気泳 動を利用して精製した。 20pmolづつのオリゴヌクレオチドを全容量40μｌの100mMのNaClと混合し、95 ℃で５分のインキュベーションによりアニーリングし、そして３時間かけて16℃ にゆっくりと冷却した。このアニーリング混合物をライゲーションのために用い た。４種類のオリゴヌクレオチドは下記の通りであった：アンチセンスZip-Xa-His(XmaI-SacI)(SEQ ID NO 7) アンチセンスZip，(XmaI-SacI)(SEQ ID NO 4) センスZip，(XmaI-SacI)(SEQ ID NO 5) センスZip-Xa-His，(XmaI-SacI)(SEQ ID NO 8) Ｐは５′末端にホスホリル基を有するオリゴヌクレオチドを示す。 オリゴヌクレオチドはハイブリダイズしたときに突き出しを有す 他方がSacI部位に対合する。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチ ン及びコンピテントＥ．コリJM105の形質転換は、実施例４並びに材料及び方法 の章に本質的に記載の通りにして行った。 この形質転換より、陽性クローンが実施例５記載の通りにして同 定され、そして再びDNA配列をDNA配列決定により確認した。更に、ダイマーTerm amyl（登録商標）を実施例６に記載の通りにして発現させた。 実施例９ダイマーTermamyl（登録商標）のアレルゲン性追跡 20匹のDunkin Hartleyモルモットを、Novo Nordisk A/Sより注問に応じて入手 できるED-9513462に記載の通りにして、1.0μｇのTermamyl（登録商標）モノマ ー及び1.0μｇのTermamyl（登録商標）ダイマーの気管内投与にかけた。 全モルモットを上記のELISA手順を利用し、８日間にわたりIgG₁の生産につい て試験した（アレルギー反応を示唆）。 図６は追跡期間中にIgG₁陽性と認められたDunkin Hartleyモルモットの数を示 す。 図６から、全追跡期間にわたってIgG₁陽性とされたモルモットの数は、Termam yl（登録商標）モノマーと比べ、Termamyl（登録商標）ダイマーに関して少ない ことがわかる。これは、Termamyl（登録商標）のアレルゲン性が、Termamyl（登 録商標）をジッパードメインに複合させることにより抑制できることを証明する 。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９６年１２月９日 【補正内容】 請求の範囲 １．抑制されたアレルゲン性を有する微生物酵素を製造するための、 ａ）前記酵素を製造できる微生物を培養する、そして ｂ）前記酵素を実質的に純粋な状態で回収する、 ことによる方法であって、ここで前記微生物が、発現されたポリペプチド分子 が自己多量化するような態様において改良されているものである、前記方法。 ２．前記微生物が、互いに作用可能式に連結された少なくとも一本のポリペプ チド及び少なくとも一本のジッパードメインをコードする少なくとも一本のDNA 配列を含んで成る１又は複数種のDNA構築体の導入により改良されたものである 、請求項１記載の方法。 ３．前記ジッパードメインが２，３，４，５，６又は７つのらせんを含んで成 るαらせん束である、請求項２記載の方法。 ４．前記ジッパードメインがポリ（Ｌ−グルタミン）リピートの極性ジッパー である、請求項１及び２記載の方法。 ５．前記ジッパードメインが両性らせん束を含んで成る、請求項２〜３のいづ れか１項記載の方法。 ６．前記ジッパードメインがロイシンジッパー又はその改質体である、請求項 ２，３及び５のいづれか１項記載の方法。 ７．前記ジッパードメインがヘテロダイマーの形成をもたらす、請求項６記載 の方法。 ８．一のロイシンジッパーがFosロイシンジッパーであり、そして他方がJunロ イシンジッパーである、請求項７記載の方法。 ９．システインが前記ロイシンジッパーの中に含まれている、請求項６〜８の いづれか１項記載の方法。 10．前記ジッパードメインがアンチパラレルの四重らせん束又はその改質体で ある、請求項２，３及び５のいづれか１項記載の方法。 11．前記DNA構築体が、前記ポリペプチドをコードするDNA配列と前記ジッパー ドメインをコードするDNA配列との間に作用可能式に挿入されたリンカー配列を 含んで成る、請求項１〜10のいづれか１項記載の方法。 12．前記DNA配列がプロテアーゼ（金属、酸性、中性又はアルカリ性）、リパ ーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リアーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ、プル ラナーゼ、ポリガラクシロナーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼ、オキシドリダク ターゼ、トランスグルタミナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、フィターゼ及びペル オキシダーゼを含んで成る群から選ばれる少なくとも一種の酵素をコードする、 請求項１〜11記載の方法。 13．前記DNA配列が約５kDa〜150kDa、好ましくは20kDa〜100kDa、特に20kDa〜 80kDaの分子量を有するポリペプチドをコードする、請求項１〜12のいづれか１ 項記載の方法。 14．前記酵素がTermamyl（登録商標）である、請求項１〜13のいづれか１項記 載の方法。 15．前記多量化が二量化である、請求項１〜14のいづれか１項記載の方法。 16．前記多量化が三量化である、請求項１〜14のいづれか１項記載の方法。 17．前記多量化が四量化である、請求項１〜14のいづれか１項記載の方法。 18．前記微生物が細菌、酵母又は糸状菌である、請求項１〜17のいづれか１項 記載の方法。 19．前記細菌が、グラム陽性菌、例えばバチルスの株、例えばＢ．スブチリス 、Ｂ．リシェニホルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステアロサーモフ ィルス、Ｂ．アルカロフィルス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．コアギュラ ンス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．ロータス、Ｂ．メガテリウムもしくはＢ．スリ ンジエンシスの株、又はストレプトマイセスの株、例えば、Ｓ．リビダンス、Ｓ ．ミュリナスもしくはＳ．グリセウスの株、あるいはグラム陰性菌、例えばエッ シェリヒア・コリを含んで成る群から選ばれる、請求項18記載の方法。 20．前記宿主細胞がＢ．リシェニホルミス又はＥ．コリである、請求項19記載 の方法。 21．前記酵母が、サッカロマイセス種もしくはシゾサッカロマイセス種、特に サッカロマイセス・セレビジエもしくはサッカロマイセス・クルイベリの株、又 はクルイベロマイセスの株、例えばＫ．ラクチス、ハンセヌラ、例えばＨ．ポリ モルファ、又はピシア、特にＰ．パストリスを含んで成る群から選ばれる、請求 項18記載の方法。 22．前記糸状菌が、アスペルギルス種、ニューロスポラ種、フサリウム種又は トリコデルマ種、特にＡ．オリザ、Ａ．ニドゥランスもしくはＡ．ニガー、又は Ｆ．オキシスポルムの株を含んで成る群から選ばれる、請求項18記載の方法。 23．互いに作用可能式に連結した、少なくとも一本のポリペプチド及び少なく とも一本のジッパードメインをコードするDNA配列を含んで成る抑制されたアレ ルゲン性を有するポリペプチドで製造するためのDNA構築体。 24．親酵素をコードするDNAと前記ジッパードメインをコードするDNAとの間に 作用可能式に挿入されたリンカー配列を含んで成る 、請求項23記載のDNA構築体。 25．発現されたときに少なくとも一種の酵素活性を示すDNA配列を含んで成る 、請求項23及び24記載のDNA構築体。 26．プロテアーゼ（金属、酸性、中性又はアルカリ性）、リパーゼ、セルラー ゼ、アミラーゼ、リアーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ、プルラナーゼ、ポリ ガラクシロナーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼ、オキシドリダクターゼ、トラン スグルタミナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、フィターゼ及びペルオキシダーゼを 含んで成る群から選ばれる酵素を発現できる、請求項25記載のDNA構築体。 27．前記DNA配列が約５kDa〜150kDa、好ましくは20kDa〜100kDa、特に20kDa〜 80kDaの分子量を有するポリペプチドをコードする、請求項23〜26のいづれか１ 項記載のDNA構築体。 28．前記酵素がTermamyl（登録商標）である、請求項23〜27のいづれか１項記 載のDNA構築体。 29．SEQ ID No.１に示すDNA配列を含んで成る、請求項23〜28のいづれか１項 に記載のDNA構築体。 30．請求項23〜29のいづれか１項記載のDNA構築体を含んで成る、組換ベクタ ー又は形質転換ビヒクル。 31．前記DNA構築体が分泌シグナルに作用可能式に連結されている、請求項30 記載のベクター。 32．前記DNA構築体がアフィニティータッグをコードする配列を含んで成る、 請求項30及び31記載のベクター。 33．前記ベクターがpAZ-1プラスミドである、請求項30〜32のいづれか１項記 載のベクター。 34．請求項23〜29のいづれか１項記載のDNA構築体又は請求項30〜33のいづれ か１項記載の組換ベクター又は発現ベクターを含んで成る細胞。 35．前記細胞が細菌、酵母又は糸状菌である、請求項34記載の細胞。 36．前記細菌が、グラム陽性菌、例えばバチルスの株、例えばＢ．スブチリス 、Ｂ．リシェニホルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステアロサーモフ ィルス、Ｂ．アルカロフィルス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．コアギュラ ンス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．ロータス、Ｂ．メガテリウムもしくはＢ．スリ ンジエンシスの株、又はストレプトマイセスの株、例えば、Ｓ．リビダンス、Ｓ ．ミュリナスもしくはＳ．グリセウスの株、あるいはグラム陰性菌、例えばエッ シェリヒア・コリを含んで成る群から選ばれる、請求項35記載の細胞。 37．前記宿主細胞がＢ．リシェニホルミス又はＥ．コリである、請求項36記載 の細胞。 38．前記酵母が、サッカロマイセス種もしくはシゾサッカロマイセス種、特に サッカロマイセス・セレビジエもしくはサッカロマイセス・クルイベリの株、又 はクルイベロマイセスの株、例えばＫ．ラクチス、ハンセヌラ、例えばＨ．ポリ モルファ、又はピシア、特にＰ．パストリスを含んで成る群から選ばれる、請求 項35記載の細胞。 39．前記糸状菌が、アスペルギルス種、ニューロスポラ種、フサリウム種又は トリコデルマ種、特にＡ．オリザ、Ａ．ニドゥランスもしくはＡ．ニガー、又は Ｆ．オキシスポルムの株を含んで成る群から選ばれる、請求項35記載の細胞。 40．請求項１〜22のいづれかに従って製造された、抑制されたアレルゲン性を 有する、酵素活性を示す微生物産生型ポリペプチド。 41．２〜10個のポリペプチド分子を含んで成る、請求項40記載のポリペプチド 。 42．二量体である、請求項41記載のポリペプチド。 43．三量体である、請求項41記載のポリペプチド。 44．四量体である、請求項41記載のポリペプチド。 45．プロテアーゼ（金属、酸性、中性又はアルカリ性）、リパーゼ、セルラー ゼ、アミラーゼ、リアーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ、プルラナーゼ、ポリ ガラクシロナーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼ、オキシドリダクターゼ、トラン スグルタミナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、フィターゼ及びペルオキシダーゼを 含んで成る群から選ばれる酵素により発揮される少なくとも一種の酵素活性を示 す、請求項40〜44のいづれか１項記載のポリペプチド。 46．約50kDa〜150kDa、好ましくは20kDa〜100kDa、特に20kDa〜80kDaの分子量 をモノマーポリペプチドが有する、請求項40〜45のいづれか１項記載のポリペプ チド。 47．前記酵素がα−アミラーゼ活性を示す、請求項40〜46のいづれか１項記載 のポリペプチド。 48．少なくとも一本のジッパードメインに結合又は連結された少なくとも一本 のポリペプチドに複合された、少なくとも一本のジッパードメインに結合又は連 結された少なくとも一本のポリペプチドを含んで成る、抑制されたアレルゲン性 を有する酵素活性を示すオリゴマーポリペプチド。 49．前記ジッパードメインがαらせん束を含んで成る、請求項48記載のオリゴ マーポリペプチド。 50．前記αらせん束が２，３，４，５，６又は７つのらせんを含んで成る、請 求項49記載のオリゴマーポリペプチド。 51．前記ジッパードメインが両性らせん束を含んで成る、請求項48〜50のいづ れか１項記載のオリゴマーポリペプチド。 52．前記ジッパードメインがポリ（Ｌ−グルタミン）リピートの 極性ジッパー又はその改質体である、請求項48記載のオリゴマーポリペプチド。 53．前記ジッパードメインがロイシンジッパー又はその改質体である、請求項 48〜51のいづれか１項記載のオリゴマーポリペプチド。 54．前記ジッパードメインがヘテロダイマーの形成をもたらす、請求項52及び 53記載のオリゴマーポリペプチド。 55．一のロイシンジッパーがFosロイシンジッパーであり、そして他方がJunロ イシンジッパーである、請求項54記載のオリゴマーポリペプチド。 56．システインが前記ロイシンジッパーの中に含まれている、請求項53〜55の いづれか１項記載のオリゴマーポリペプチド。 57．前記ジッパードメインがアンチパラレルの四重らせん束又はその改質体で ある、請求項48〜56のいづれか１項記載のオリゴマーポリペプチド。 58．前記DNA構築体が、前記ポリペプチドをコードするDNA配列と前記ジッパー ドメインをコードするDNA配列との間に作用可能式に挿入されたリンカー配列を 含んで成る、請求項48〜57のいづれか１項記載のオリゴマーポリペプチド。 59．前記ポリペプチドが、プロテアーゼ（金属、酸性、中性又はアルカリ性） 、リパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リアーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ 、プルラナーゼ、ポリガラクシロナーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼ、オキシド リダクターゼ、トランスグルタミナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、フィターゼ及 びペルオキシダーゼを含んで成る群から選ばれる酵素により発揮される少なくと も一種の酵素活性を示す、請求項48〜58のいづれか１項記載のオリゴマーポリペ プチド。 60．約50kDa〜150kDa、好ましくは20kDa〜100kDa、特に20kDa〜80kDaの分子量 をモノマーポリペプチドが有する、請求項48〜59のいづれか１項記載のオリゴマ ーポリペプチド。 61．前記酵素がα−アミラーゼ活性を示す、請求項59〜60のいづれか１項記載 のオリゴマーポリペプチド。 62．前記ジッパードメインが前記ポリペプチドに、そのポリペプチドのＣ−末 端において連結されている、請求項48〜58のいづれか１項記載のオリゴマーポリ ペプチド。 63．前記ジッパードメインが前記ポリペプチドに、そのポリペプチドのＮ−末 端において連結されている、請求項48〜58のいづれか１項記載のオリゴマーポリ ペプチド。 64．請求項40〜47のいづれか１項記載の少なくとも一種のポリペプチド及び／ 又は請求項48〜63のいづれか１項記載の少なくとも一種のポリペプチドを含んで 成る組成物。 65．洗剤、家庭用品、農業、パーソナルケア製品、化粧品、香水、薬品、織物 の処理用の組成物、食品及び／又は飼料に通常利用される成分を含んで成る、請 求項64記載の組成物。 66．ポリペプチドのアレルゲン性を抑制するためのジッパードメインの利用。 67．前記ジッパードメインがポリペプチド分子の多量化のために用いられる、 請求項66記載の利用。 68．請求項１〜22のいづれか１項に記載の方法のための、又は請求項48〜63の いづれか１項に記載のオリゴマーポリペプチドにおける、請求項66及び67記載の 利用。 69．前記ジッパードメインが２，３，４，５，６又は７つのαらせん束を含ん で成る、請求項66〜68のいづれか１項記載の利用。 70．前記ジッパードメインがポリ（Ｌ−グルタミン）リピートの 極性ジッパー又はその改質体である、請求項66〜68のいづれか１項記載の利用。 71．前記ジッパードメインが両性らせん束を含んで成る、請求項68及び69のい づれか１項記載の利用。 72．前記ジッパードメインがロイシンジッパー又はその改質体である、請求項 68，69及び71のいづれか１項記載の利用。 73．前記ロイシンジッパーがFos-Junロイシンジッパーである、請求項72記載 の利用。 74．システインがロイシンジッパーの中に含まれている、請求項72及び73のい づれか１項記載の利用。 75．前記ジッパードメインがアンチパラレルの四重らせん束又はその改質体で ある、請求項68，69及び71のいづれか１項記載の利用。 76．家庭用品における、請求項66〜75のいづれか１項記載の利用。 77．食器洗剤及び石けんバーを含む洗剤における、請求項66〜75のいづれか１ 項記載の利用。 78．パーソナルケア製品における、請求項66〜75のいづれか１項記載の利用。 79．義歯及び歯のための洗浄製品を含む口内ケア製品における、請求項78記載 の利用。 80．クリーム及びローションを含む肌ケア製品における、請求項78記載の利用 。 81．シャンプーを含むヘアーケア又はヘアートリートメント製品における、請 求項78記載の利用。 82．コンタクトレンズ洗浄用製品における、請求項78記載の利用。 83．化粧品における、請求項66〜75のいづれか１項記載の利用。 84．薬品における、請求項66〜75のいづれか１項記載の利用。 85．農薬における、請求項66〜75のいづれか１項記載の利用。 86．食品及び飼料における、請求項66〜75のいづれか１項記載の利用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 7/46 Ａ６１Ｋ 7/46 Ｚ 7/48 7/48 Ｃ１１Ｄ 3/386 Ｃ１１Ｄ 3/386 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 1/21 9/00 9/00 Ｇ０２Ｃ 13/00 Ｇ０２Ｃ 13/00 // Ｄ０６Ｍ 15/15 Ｄ０６Ｍ 15/15 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，Ｂ Ｙ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．抑制されたアレルゲン性を有するポリペプチドを製造するための、 ａ）前記ポリペプチドを製造できる微生物を培養する、そして ｂ）前記ポリペプチドを実質的に純粋な状態で回収する、 ことによる方法であって、ここで前記微生物が、発現されたポリペプチドが自 己多量化するような態様において改良されているものである、前記方法。 ２．前記微生物が、互いに作用可能式に連結された少なくとも一本のポリペプ チド及び少なくとも一本のジッパードメインをコードする少なくとも一本のDNA 配列を含んで成る１又は複数種のDNA構築体の導入により改良されたものである 、請求項１記載の方法。 ３．前記ジッパードメインが２，３，４，５，６又は７つのらせんを含んで成 るαらせん束である、請求項２記載の方法。 ４．前記ジッパードメインがポリ（Ｌ−グルタミン）リピートの極性ジッパー である、請求項１及び２記載の方法。 ５．前記ジッパードメインが両性らせん束を含んで成る、請求項２〜３のいづ れか１項記載の方法。 ６．前記ジッパードメインがロイシンジッパー又はその改質体である、請求項 ２，３及び５のいづれか１項記載の方法。 ７．前記ジッパードメインがヘテロダイマーの形成をもたらす、請求項６記載 の方法。 ８．一のロイシンジッパーがFosロイシンジッパーであり、そして他方がJunロ イシンジッパーである、請求項７記載の方法。 ９．システインが前記ロイシンジッパーの中に含まれている、請求項６〜８の いづれか１項記載の方法。 10．前記ジッパードメインがアンチパラレルの四重らせん束又はその改質体で ある、請求項２，３及び５のいづれか１項記載の方法。 11．前記DNA構築体が、前記ポリペプチドをコードするDNA配列と前記ジッパー ドメインをコードするDNA配列との間に作用可能式に挿入されたリンカー配列を 含んで成る、請求項１〜10のいづれか１項記載の方法。 12．前記DNA配列が酵素をコードする、請求項１〜11のいづれか１項記載の方 法。 13．前記DNA配列がプロテアーゼ（金属、酸性、中性又はアルカリ性）、リパ ーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リアーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ、プル ラナーゼ、ポリガラクシロナーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼ、オキシドリダク ターゼ、トランスグルタミナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、フィターゼ及びペル オキシダーゼを含んで成る群から選ばれる少なくとも一種の酵素をコードする、 請求項12記載の方法。 14．前記DNA配列が約５kDa〜150kDa、好ましくは20kDa〜100kDa、特に20kDa〜 80kDaの分子量を有するポリペプチドをコードする、請求項１〜13のいづれか１ 項記載の方法。 15．前記酵素がTermamyl（登録商標）である、請求項１〜14のいづれか１項記 載の方法。 16．前記多量化が二量化である、請求項１〜15のいづれか１項記載の方法。 17．前記多量化が三量化である、請求項１〜15のいづれか１項記載の方法。 18．前記多量化が四量化である、請求項１〜15のいづれか１項記載の方法。 19．前記微生物が細菌、酵母又は糸状菌である、請求項１〜18のいづれか１項 記載の方法。 20．前記細菌が、グラム陽性菌、例えばバチルスの株、例えばＢ．スブチリス 、Ｂ．リシェニホルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステアロサーモフ ィルス、Ｂ．アルカロフィルス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．コアギュラ ンス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．ロータス、Ｂ．メガテリウムもしくはＢ．スリ ンジエンシスの株、又はストレプトマイセスの株、例えば、Ｓ．リビダンス、Ｓ ．ミュリナスもしくはＳ．グリセウスの株、あるいはグラム陰性菌、例えばエッ シェリヒア・コリを含んで成る群から選ばれる、請求項19記載の方法。 21．前記宿主細胞がＢ．リシェニホルミス又はＥ．コリである、請求項20記載 の方法。 22．前記酵母が、サッカロマイセス種もしくはシゾサッカロマイセス種、特に サッカロマイセス・セレビジエもしくはサッカロマイセス・クルイベリの株、又 はクルイベロマイセスの株、例えばＫ．ラクチス、ハンセヌラ、例えばＨ．ポリ モルファ、又はピシア、特にＰ．パストリスを含んで成る群から選ばれる、請求 項19記載の方法。 23．前記糸状菌が、アスペルギルス種、ニューロスポラ種、フサリウム種又は トリコデルマ種、特にＡ．オリザ、Ａ．ニドゥランスもしくはＡ．ニガー、又は Ｆ．オキシスポルムの株を含んで成る群から選ばれる、請求項19記載の方法。 24．互いに作用可能式に連結した、少なくとも一本のポリペプチド及び少なく とも一本のジッパードメインをコードするDNA配列を含んで成る抑制されたアレ ルゲン性を有するポリペプチドで製造するためのDNA構築体。 25．親ポリペプチドをコードするDNAと前記ジッパードメインをコードするDNA との間に作用可能式に挿入されたリンカー配列を含んで成る、請求項24記載のDN A構築体。 26．発現されたときに少なくとも一種の酵素活性を示すDNA配列を含んで成る 、請求項24及び25記載のDNA構築体。 27．プロテアーゼ（金属、酸性、中性又はアルカリ性）、リパーゼ、セルラー ゼ、アミラーゼ、リアーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ、プルラナーゼ、ポリ ガラクシロナーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼ、オキシドリダクターゼ、トラン スグルタミナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、フィターゼ及びペルオキシダーゼを 含んで成る群から選ばれる酵素を発現できる、請求項26記載のDNA構築体。 28．前記DNA配列が約５kDa〜150kDa、好ましくは20kDa〜100kDa、特に20kDa〜 80kDaの分子量を有するポリペプチドをコードする、請求項24〜27のいづれか１ 項記載のDNA構築体。 29．前記酵素がTermamyl（登録商標）である、請求項24〜28のいづれか１項記 載のDNA構築体。 30．SEQ ID No.１に示すDNA配列を含んで成る、請求項24〜29のいづれか１項 に記載のDNA構築体。 31．請求項24〜30のいづれか１項記載のDNA構築体を含んで成る、組換ベクタ ー又は形質転換ビヒクル。 32．前記DNA構築体が分泌シグナルに作用可能式に連結されている、請求項31 記載のベクター。 33．前記DNA構築体がアフィニティータッグをコードする配列を含んで成る、 請求項31及び32記載のベクター。 34．前記ベクターがpAZ-1プラスミドである、請求項31〜33のいづれか１項記 載のベクター。 35．請求項24〜30のいづれか１項記載のDNA構築体又は請求項31 〜34のいづれか１項記載の組換ベクター又は発現ベクターを含んで成る細胞。 36．前記細胞が細菌、酵母又は糸状菌である、請求項35記載の細胞。 37．前記細菌が、グラム陽性菌、例えばバチルスの株、例えばＢ．スブチリス 、Ｂ．リシェニホルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステアロサーモフ ィルス、Ｂ．アルカロフィルス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．コアギュラ ンス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．ロータス、Ｂ．メガテリウムもしくはＢ．スリ ンジエンシスの株、又はストレプトマイセスの株、例えば、Ｓ．リビダンス、Ｓ ．ミュリナスもしくはＳ．グリセウスの株、あるいはグラム陰性菌、例えばエッ シェリヒア・コリを含んで成る群から選ばれる、請求項36記載の細胞。 38．前記宿主細胞がＢ．リシェニホルミス又はＥ．コリである、請求項37記載 の細胞。 39．前記酵母が、サッカロマイセス種もしくはシゾサッカロマイセス種、特に サッカロマイセス・セレビジエもしくはサッカロマイセス・クルイベリの株、又 はクルイベロマイセスの株、例えばＫ．ラクチス、ハンセヌラ、例えばＨ．ポリ モルファ、又はピシア、特にＰ．パストリスを含んで成る群から選ばれる、請求 項36記載の細胞。 40．前記糸状菌が、アスペルギルス種、ニューロスポラ種、フサリウム種又は トリコデルマ種、特にＡ．オリザ、Ａ．ニドゥランスもしくはＡ．ニガー、又は Ｆ．オキシスポルムの株を含んで成る群から選ばれる、請求項36記載の細胞。 41．請求項１〜23のいづれかに従って製造された、抑制されたアレルゲン性を 有する微生物産生型ポリペプチド。 42．２〜10個のポリペプチド分子を含んで成る、請求項41記載のポリペプチド 。 43．二量体である、請求項42記載のポリペプチド。 44．三量体である、請求項42記載のポリペプチド。 45．四量体である、請求項42記載のポリペプチド。 46．酵素活性を示す、請求項41〜45のいづれか１項記載のポリペプチド。 47．プロテアーゼ（金属、酸性、中性又はアルカリ性）、リパーゼ、セルラー ゼ、アミラーゼ、リアーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ、プルラナーゼ、ポリ ガラクシロナーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼ、オキシドリダクターゼ、トラン スグルタミナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、フィターゼ及びペルオキシダーゼを 含んで成る群から選ばれる酵素により発揮される少なくとも一種の酵素活性を示 す、請求項46記載のポリペプチド。 48．約50kDa〜150kDa、好ましくは20kDa〜100kDa、特に20kDa〜80kDaの分子量 をモノマーポリペプチドが有する、請求項41〜47のいづれか１項記載のポリペプ チド。 49．前記酵素がα−アミラーゼ活性を示す、請求項41〜48のいづれか１項記載 のポリペプチド。 50．少なくとも一本のジッパードメインに結合又は連結された少なくとも一本 のポリペプチドに複合された、少なくとも一本のジッパードメインに結合又は連 結された少なくとも一本のポリペプチドを含んで成る、抑制されたアレルゲン性 を有するオリゴマーポリペプチド。 51．前記ジッパードメインがαらせん束を含んで成る、請求項50記載のオリゴ マーポリペプチド。 52．前記αらせん束が２，３，４，５，６又は７つのらせんを含 んで成る、請求項51記載のオリゴマーポリペプチド。 53．前記ジッパードメインが両性らせん束を含んで成る、請求項50〜52のいづ れか１項記載のオリゴマーポリペプチド。 54．前記ジッパードメインがポリ（Ｌ−グルタミン）リピートの極性ジッパー 又はその改質体である、請求項50記載のオリゴマーポリペプチド。 55．前記ジッパードメインがロイシンジッパー又はその改質体である、請求項 50〜53のいづれか１項記載のオリゴマーポリペプチド。 56．前記ジッパードメインがヘテロダイマーの形成をもたらす、請求項54及び 55記載のオリゴマーポリペプチド。 57．一のロイシンジッパーがFosロイシンジッパーであり、そして他方がJunロ イシンジッパーである、請求項56記載のオリゴマーポリペプチド。 58．システインが前記ロイシンジッパーの中に含まれている、請求項55〜57の いづれか１項記載のオリゴマーポリペプチド。 59．前記ジッパードメインがアンチパラレルの四重らせん束又はその改質体で ある、請求項50〜58のいづれか１項記載のオリゴマーポリペプチド。 60．前記DNA構築体が、前記ポリペプチドをコードするDNA配列と前記ジッパー ドメインをコードするDNA配列との間に作用可能式に挿入されたリンカー配列を 含んで成る、請求項50〜59のいづれか１項記載のオリゴマーポリペプチド。 61．前記ポリペプチドが酵素活性を示す、請求項50〜60のいづれか１項記載の オリゴマーポリペプチド。 62．前記ポリペプチドが、プロテアーゼ（金属、酸性、中性又はアルカリ性） 、リパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リアーゼ、キ シラナーゼ、ペクチナーゼ、プルラナーゼ、ポリガラクシロナーゼ、オキシダー ゼ、ラッカーゼ、オキシドリダクターゼ、トランスグルタミナーゼ、α−ガラク トシダーゼ、フィターゼ及びペルオキシダーゼを含んで成る群から選ばれる酵素 により発揮される少なくとも一種の酵素活性を示す、請求項61記載のオリゴマー ポリペプチド。 63．約50kDa〜150kDa、好ましくは20kDa〜100kDa、特に20kDa〜80kDaの分子量 をモノマーポリペプチドが有する、請求項61〜62のいづれか１項記載のオリゴマ ーポリペプチド。 64．前記酵素がα−アミラーゼ活性を示す、請求項61〜63のいづれか１項記載 のオリゴマーポリペプチド。 65．前記ジッパードメインが前記ポリペプチドに、そのポリペプチドのＣ−末 端において連結されている、請求項50〜59のいづれか１項記載のオリゴマーポリ ペプチド。 66．前記ジッパードメインが前記ポリペプチドに、そのポリペプチドのＮ−末 端において連結されている、請求項50〜59のいづれか１項記載のオリゴマーポリ ペプチド。 67．請求項41〜49のいづれか１項記載の少なくとも一種のポリペプチド及び／ 又は請求項50〜66のいづれか１項記載の少なくとも一種のポリペプチドを含んで 成る組成物。 68．洗剤、家庭用品、農業、パーソナルケア製品、化粧品、香水、薬品、織物 の処理用の組成物、食品及び／又は飼料に通常利用される成分を含んで成る、請 求項67記載の組成物。 69．ポリペプチドのアレルゲン性を抑制するためのジッパードメインの利用。 70．前記ジッパードメインがポリペプチド分子の多量化のために用いられる、 請求項69記載の利用。 71．請求項１〜23のいづれか１項に記載の方法のための、又は請求項50〜66の いづれか１項に記載のオリゴマーポリペプチドにおける、請求項69及び70記載の 利用。 72．前記ジッパードメインが２，３，４，５，６又は７つのαらせん束を含ん で成る、請求項69〜71のいづれか１項記載の利用。 73．前記ジッパードメインがポリ（Ｌ−グルタミン）リピートの極性ジッパー 又はその改質体である、請求項69〜71のいづれか１項記載の利用。 74．前記ジッパードメインが両性らせん束を含んで成る、請求項71及び72のい づれか１項記載の利用。 75．前記ジッパードメインがロイシンジッパー又はその改質体である、請求項 71，72及び74のいづれか１項記載の利用。 76．前記ロイシンジッパーがFos-Junロイシンジッパーである、請求項75記載 の利用。 77．システインがロイシンジッパーの中に含まれている、請求項75及び76のい づれか１項記載の利用。 78．前記ジッパードメインがアンチパラレルの四重らせん束又はその改質体で ある、請求項71，72及び74のいづれか１項記載の利用。 79．家庭用品における、請求項69〜78のいづれか１項記載の利用。 80．食器洗剤及び石けんバーを含む洗剤における、請求項69〜78のいづれか１ 項記載の利用。 81．パーソナルケア製品における、請求項69〜78のいづれか１項記載の利用。 82．義歯及び歯のための洗浄製品を含む口内ケア製品における、請求項81のい づれか１項記載の利用。 83．クリーム及びローションを含む肌ケア製品における、請求項81記載の利用 。 84．シャンプーを含むヘアーケア又はヘアートリートメント製品における、請 求項81記載の利用。 85．コンタクトレンズ洗浄用製品における、請求項81記載の利用。 86．化粧品における、請求項69〜78のいづれか１項記載の利用。 87．薬品における、請求項69〜78のいづれか１項記載の利用。 88．農薬における、請求項69〜78のいづれか１項記載の、利用。 89．食品及び飼料における、請求項69〜78のいづれか１項記載の利用。