JPH10509434A - 生物学的物質の凍結保存と低温処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 個々の生命のある生物学的物質（例えば、細胞）あるいはそれらの予め設定可能な数の集合体を局在化された状態で凍結保存するために、上記物質は貯蔵容器から超冷却された基板１３上に例えば微小液滴器１１によって微小液滴１２の形で供給される。基板は冷却剤１５によって決定される温度に冷却されており、その表面はガス雰囲気または真空１４で覆われている。基板の表面は、それに衝突した微小液滴が凍結するような温度Ｔ１に保たれており、一方、基板表面は被測定成分を保持するように微小構造化されていて、上記被測定成分を保持することができる。基板あるいは微小液滴器の何れかを適当に移動させることによって、個々に微小液滴を供給することができ、また自由に選択可能な配列あるいは基板構造によって予め設定された配列をなしてサンプルの形に形成される。凍結した微小液滴と細胞をもった基板を−２７３℃近くの温度Ｔ２にし、また／あるいは処理装置１７によって物質の除去処理がなされるか、あるいは蒸着処理が行われる。深い冷凍状態では、機械的作用によって切除のような操作が行われ、あるいは基板表面に溶液と物質が付加される。解凍時には、基板表面は包被溶液の凍結点以上の温度Ｔ１に置かれ、微小液滴配列は予め設定された態様で解凍される。

Description

【発明の詳細な説明】 生物学的物質の凍結保存と低温処理方法 本発明は微視的物質、より詳しくは生物学的物質、単細胞、細胞形成物あるい は細胞構成要素あるいは二次元または三次元パターンにおいて予め決められた温 度プログラムに従って固定された高分子を低温状態で変化させ、また細胞の生命 力を維持させつつ再解凍させることによって低温保存するための方法および装置 に関するものである。 医学工学においては、細胞バンク（ｂａｎｋ）が設立されて１０年来、少なく とも低温保存物質の分野において活性プロセスを回復不能な状態に壊すことなく 所定の手法に従って細胞を凍結し、それらを再解凍する生物学的、薬学的研究が 一般に行われている。 この目的のために、細胞は主として溶液中に懸濁させ、また微小管中で凍結さ せている（アール．イアン フレッシュニー（Ｒ．Ｉａｎ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ） ：”動物性細胞培養（Ｔｉｅｒｉｓｃｈｅ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）”Ｗａ ｌｔｅｒｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ １９９０、２２１頁）。この溶液には氷の結晶 形成（例えばジメチルスルフォキサイド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ ）、グリセリン（ｇｌｙｃｅｒｉｎｅ）のような低温保存剤）に影響を与えるこ とができる好む物質が含まれている。 これらの技術は、成功した明らかな記録があり、適切に応用したとき実用上数 ％乃至１００％の間の生存率が得られる。非常に多くの従来の応用例では、解凍 後の細胞はまず最初に培養液に移される必要があり、またこの種の低温保存後の 生存率を高めるという点については大きな役割を果たしていないため、十分な量 の細胞を得る必要がある。 これに当てはまらない傾向が増加しているが、医学において細胞を得る方法の 観点からみれば、遺伝子学や分子生物学が益々選択的になっている。一例として 、少数の細胞の場合においてのみ所望の結果を作りだすことのできる活性細胞に ついての計画的遺伝子変更がある。スクリーニング法（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍ ｅｔｈｏｄｓ）によって、これらの細胞は分離され、さらなる応用に役立てられ ている。そのような応用の１つに、例えばガン治療のためのモノクロナール抗体 （ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）の製造に通常必要とされるハ イブリドーマ細胞調達（ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ｃｅｌｌ ｐｒｏｃｕｒｅｍｅ ｎｔ）（エズ．ジェイ．ダブリュ．ポラード（Ｅｄｓ．Ｊ．Ｗ．Ｐｏｌｌａｒｄ ）氏およびジェイ．エム．ウオーカー（Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ）氏の”分子生物 学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ）”Ｖｏｌ．５の６１９−６２１頁にあるビー．グスタフソン（Ｂ．Ｇｕｓｔａ ｆｓｓｏｎ）氏の”ハイブリドーマの凍結保存（Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｙａｔｉ ｏｎ ｏｆ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）”）がある。その中で、一般に細胞対（リ ンパ球、骨髄腫）から非常に僅かな細胞のみが形成、凍結保存されている。この 場合には、通常これらの僅かな細胞数を考慮して、特に凍結保存が限られた範囲 内でのみ行われるということである（アール．イアン フレッシュニー（Ｒ．Ｉ ａｎ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）：”動物性細胞培養（Ｔｉｅｒｉｓｃｈｅ Ｚｅｌｌ ｋｕｌｔｕｒｅｎ）”Ｗａｌｔｅｒｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ １９９０、２２１頁 ）。これは、少量の溶液の取り扱いにおいて，そして細胞を再び得ることにおい て大きな困難さを伴うからである。さらに、上記した方法によって必要とされる 懸濁技術によって個々に細胞を識別することができない。 細胞懸濁液中における凍結細胞の１つの大きな欠点は、溶液中における温度分 布の勾配である。これは単細胞に対する凍結条件が知られていないため、もしく は懸濁液中における単細胞の位置は特定されず、一定に止めることができないこ とにより大きく異なるためである（エム．ジェイ．アシュウッド−スミス（Ｍ． Ｊ．Ａｓｈｗｏｏｄ−Ｓｍｉｔｈ）氏およびジェイ．ファラント（Ｊ．Ｆａｒｒ ａｎｔ）氏”医学と生物学における低温保存（Ｌｏｗ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇ ｙ）”ケント（Ｋｅｎｔ）、英国（１９８０））。かくして、諸条件を再現し、 標準化することは単細胞を凍結保存することの継続的な作業にとって益々重要と なってきている。 特に、粘性のある細胞のための凍結保存の１つの修正された形態は基板表面上 に成長した細胞の保存である（エイ．ドイル（Ａ．Ｄｏｙｌｅ）、ジェイ．ビー ．グリフィス（Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ）、ディー．ジー．ニュエル（Ｄ． Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ）、細胞と組織培養（Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕ ｌｔｕｒｅ）、ジョン ウイリー＆ソンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎ ｓ）、４Ｃ：２．１頁にあるティー．大野（Ｔ．Ｏｈｎｏ）、”固定依存した細 胞を正常の位置で凍結させるための１つの簡単な方法（Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅ ｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎ ｓｉｔｕ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｏｆ ａｎｃｈｏｒａ ｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｓ）”）。この目的のために、一般に薄い 細胞層、所謂細胞単層は適当な基板（処理したガラスまたはプラスチック表面） 上に成長させ、引き続いて細胞菌叢（ｃｅｌｌ ｌａｗｎｓ）として凍結され、 解凍される。この方法は、細胞成長がランダムに生じ、またこの場合、単細胞が 低温時間の期間を越えて１ケ所に集中することが困難であるという欠点を有して いる。これまで、所謂微小滴定板（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅｓ）が成 長のために用いられてきたので、局部的に確立した条件は達成されていない。こ のことに加えてこの方法は、粘性のある細胞の成長にのみ適用されている。 強力に冷却されている雰囲気（イー．エル．ベンデッチ（Ｅ．Ｌ．Ｂｅｎｄｅ ｔｔｉ）およびピー．ファバード（Ｐ．Ｆａｖａｒｄ）による”フリーズエッチ ング、技術と応用（Ｆｒｅｅｚｅ−ｅｔｃｈｉｎｇ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａ ｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）”、Ｓｏｃ．Ｆｒａｎｃ．Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｅ ｌｅｃｔｒｏｎｉｑｕｅ、パリ １９７３、８１−１００頁にある、エッチ．プ ラットナー（Ｈ．Ｐｌａｔｔｎｅｒ）、ダブリュ．ダブリュ．シュミット−フミ アン（Ｗ．Ｗ．Ｓｃｈｍｉｔｔ−Ｆｕｍｉａｎ）およびエル．バックマン（Ｌ． Ｂａｃｈｍａｎｎ）、”スプレーフリージングによる単細胞の凍結固定（Ｃｒｙ ｏｆｉｘａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｇｌｅ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｓｐｒａｙ−ｆｒ ｅｅｚｉｎｇ）”）中でノズルから微小液滴に細胞をスプレーできること、そし てこの技術（１０，０００℃／Ｓを越えない冷却速度）によって急速凍結できる ことは、凍結保存される細胞の電子顕微鏡観察（ジェイ．アール．ハリス（Ｊ． Ｒ．Ｈａｒｒｉｓ）、生物学における電子顕微鏡観察（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉ ｃｒｏｓｃｏｐｙ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、アイアールエル プレス（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）（１９９１））として知られ、用いられている。しかしながら、 この方法は、位置関係を特定せずに貯蔵容器あるいは低温流体中に細胞が落下す るという欠点を有している。このため、細胞の明確な結合とそれらの個々の識別 は不可能である。 この構成において、微小液滴噴出装置が用いられることは、例えば小液滴のイ ンクを用いる（ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ）、あるいはまた表面に粘着性のある他の 液体を供給する印刷機械の場合において知られている。また、微小液滴に細胞を 噴射させる手順は知られており、またこの手順が細胞選別システム（エム．アー ル．メラムド（Ｍ．Ｒ．Ｍｅｌａｍｅｄ）、ティー．リンドモ（Ｔ．Ｌｉｎｄｍ ｏ）およびエム．エル．メンデルゾーン（Ｍ．Ｌ．Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ）（Ｅ ｄｓ．）、”流動細胞測定と選別（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｓ ｏｒｔｉｎｇ）”、ジェイ．ウイリー（Ｊ．Ｗｉｌｅｙ）、ニューヨーク（１９ ９０）、１７１−１７９頁）において使用されることも知られている。この構成 において、細胞は微小液滴の形で個々に噴射され、偏向装置（例えば、電場（ｅ ｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄ））によって空間的（ｓｐａｔｉａｌｌｙ）に選別 され、収集容器に収集され、または細胞培養基板に供給される。また、ここで大 きめの量の細胞（１，０００から１，０００，０００の細胞）は比較的大きな容 器に選別されるので対象物の個々の操作は不可能である。 上記の先行技術に対して、本発明は微視的物質、より詳しくは生物学的物質、 単細胞、細胞形成物または構成要素あるいは高分子懸濁液が再生産的に凍結され 、配列され、固定されること、後刻それらの生命力が持続している間に処理し、 再解凍することのできる方法と装置を提供することを目的とするものであり、こ れは凍結したそして凍結保存した物質の個々の識別を可能にしようとするもので ある。 この目的は請求の範囲１と１７に記載されているような主要件によって達成さ れる。幾つかの有利な実施態様は従属する各請求の範囲から理解することができ 、これらの実施態様は温度制御され、また適用可能であれば微小構造の基板表面 上で微小液滴に生物学的物質を明確に固定することについての理論的な概念を実 証し、詳述するものであり、またこれらは請求の範囲１と１７の基礎をなす特徴 によって特定されるように、固相状態における表面層または細胞を修正し、さら にそれらの貯蔵とその後の解凍を修正することができる。 ここに定義された生物学的物質、より詳しくは細胞の明確な固定化は、微小液 滴噴出装置による噴射（ｓｈｏｏｔｉｎｇ）もしくは毛細管または担体チップ（ ｃａｒｒｉｅｒ ｔｉｐ）による位置決めによって行われる。後者の場合、生物 学的物質を含む微小液滴を、例えば毛細管の先端に接触させるか毛細管の先端で 発生させる。毛細管や担体チップは基板の表面に対して制御された速度で動かす ことが可能である。 本発明の装置と方法に関する取扱いは請求の範囲２４に説明されている。 包被溶液に含まれている微視的物質の選択あるいはグループ化によって、ある いは包被溶液の分配によって、また物質あるいは高分子をカプセル化すること、 または微小液滴（ピコリットル（ｐｉｃｏｌｉｔｅｒｓ）から数マイクロリット ルまで）中に純粋な包被溶液を分配することによって、それらを温度Ｔ１にセッ トした基板表面に供給するに当たって、温度Ｔ１は基板表面に衝突した微小液滴 をその場所に接着させ、凍結させるように制御され、これによって微小液滴に含 まれている微視的物質あるいは高分子は凍結保存される。 この意味において、生物学的物質は、より詳しくは単細胞、細胞形成物または 細胞構成要素であるべきことが理解される。基板の冷却速度である温度Ｔ１を数 ℃／分から数千℃／秒になるように選択し、制御することによって、衝突する微 小液滴の冷却を行うことができる。選択と基板表面への供給を時間的、空間的に 制御することによって、微小液滴とその中に入っている物質は相互におよび基板 に対して明確に指定された状態で固定することができる。微小液滴を供給した後 、基板を予め決められた温度変化状況（ｐｒｏｆｉｌｅｓ）に従って貯蔵温度Ｔ ２もしくは処理温度Ｔ３にする。この温度は経験的に−８０℃以下、時には−１ ９６℃の範囲にする。短時間の貯蔵と処理には、高い温度を用いることができる が、いずれの場合も包被溶液の凍結点以下である。 包被溶液としては、主として任意の溶液、混合溶液、血清あるいは培養液でよ いことが判っている。生物学的物質の包被溶液としては、その生命力を守るもの であることが要求され、これに対して、高分子としては全ての任意の溶液や混合 溶液が使用可能である。加えて、これらの包被溶液はカプセル化した微視的物質 に関する限り、その大きさが微小液滴、即ち、より詳しくはリポソーム（ｌｉｐ ｏｓｏｍｅｓ）、ラテックス粒子あるいは他の微小粒子を含む微小液滴の大きさ より小さいどのような形式の物質も含まれる。上記した物質がない場合の１つだ けあるいは幾つかの化学的組成からなる包被溶液でも、その用語の目的とする意 味から使用できることを意図している。 基板表面の温度制御は既知の冷却素子（ペルチエル素子（Ｐｅｌｔｉｅｒ ｅ ｌｅｍｅｎｔ））によって、または低温液体（例えば液体窒素）と接触させるこ とによって行うことが望ましい。噴射した包被溶液の温度は生物学的物質にとっ て生理学的範囲内であるようにすべきである。 生物学的物質の選択し、供給するために使用される１つの好ましい装置は、特 にピエゾ効果（ｐｉｅｚｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）の原理に基づく微 小液滴噴出装置である。この場合、この微小液滴噴出装置と基板表面とを時間的 、空間的に互いに自由に選択可能に位置決めし、また選択および処理を時間的に 制御することにより、微小液滴を基板面上の望ましい構造もしくは位置に供給す ることができる。これらの微小液滴噴出装置によって、再生可能で指定された凍 結保存のために充分な同じ大きさの微小液滴を生成することができる。 別の実施例では、包被溶液、従ってカプセル化した微視的物質および高分子は 既知の好ましいスプレー法でエアゾール（霧状の微小液滴）中に送り込まれる。 エアゾールは、冷却した表面上にスプレーされ、そこに薄い凍結層が形成される 。ここでも、また、時間的、空間的に供給を制御することができる。時間的、空 間的な組織化は特に基板表面上における二次元あるいは三次元構成の微小液滴と して理解されることを意図したもので、この場合、微小液滴は同じまたは異なっ た包被溶液でもよく、および／または同じあるいは異なった微視的物質と高分子 を含むこともできる。 包被溶液を凍結することにより、本発明による技術的教示は異なる生物学的物 質や高分子あるいは再生可能で、特定され、固定され、整列された異なる包被溶 液の三次元構造を生成するのに適している。この自由な組み合わせはこれまでな し得なかった安定した構造を生成することができる。 基板表面に供給された組成を解凍することによって、組成の種々の成分を互い に作用させることができ、これによって化学反応を連続的に生起させ、もしくは 生物学的物質を互いに作用させ、あるいは環境の変化に応じて作用させることが でき、あるいは凍結が行われるのとは別の状況のもとで生物学的物質の解凍のみ を行わせることができる。このような凍結状態と解凍状態との間の非対称（ａｓ ｙｍｍｅｔｒｉｅｓ）は、既知の凍結法では一部は自動的に生ずるが、ここで述 べた方法のような変化および信頼性のある反復が生ずることはない。 細胞を有する微小液滴が供給される基板はガラス、プラスチック、金属、半導 体、セラミックスもしくは温度勾配に対して調和した他の物質で作られることも ある。最も簡単な場合、基板は互いに決められた間隔で液滴が供給される滑らか で、組織化されていない基板である。 しかしながら、便宜上基板の表面は、一方では細胞が局在化（ｌｏｃａｌｉｚ ｅｄ）され、引き戻され（ｒｅｔｒａｃｅｄ）、他方では細胞を分離し、選択的 に感知しもしくは凍結と解凍工程を維持する構造となっている。これに関して、 特に基板は半導体技術において行われている方法で作られた数平方ミリメートル から最大数平方センチメートル（例えば、半導体ウエハ、半導体チップ）の大き さであることが必要である。 特に、それらの良好な温度伝達特性とミクロン（μm）やサブミクロンの範囲 での三次元構造をとるためには、他の半導体基板におけると同じようにシリコン およびその酸化物から作られたものであればよく、下地の物質として他の金属や セラミックスであってもよい。この意味から微小構造体は、単一のパターンであ ると考えられ、また基板表面に窪み、溝、ブリッジ、貫通孔もしくは突起が交互 に連なったパターンであるとも考えられ、その大きさは概して細胞もしくは微小 液滴の大きさに相当するもので、繊細もしくは粗く作られたものがよい。動物細 胞としての代表的な大きさは５乃至１００μｍである。バクテリア、マイコプラ ズマ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ウイルスもしくは類似の小粒子構造体の場合、 ミクロンやサブミクロンの範囲内に含まれるものである。 本発明におけるこれらの構造体は次の要件を満たすものである。 相互に微小液滴を機械的に定義すること（例えば液滴の拡がりを防ぐこと）、 とりわけ、基板表面を完全に液体で濡らして解凍することに関してあるいは前に 施した液滴が位置している個所に、さらに微小液滴（細胞を有するまたは有しな い）を供給するために三次元の位置決めをするに関してそれらの個々の特質を維 持すること。 例えば電極、光学的あるいは他のセンサーなどの感知素子を設けること。 基板表面に対する観察者への指示のための数字、マス目、ラインなどのような 識別標識（ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍａｒｋｉｎｇ）を設けること。 指定された凍結物質を除去するための素子を支持すること、あるいは液滴で占 められた表面にさらに層を形成するための素子を支持すること。これらの例は微 小液滴の高さを越えるか、またはそれ以下の微小液滴の配列間の壁であり、その 最大高さは機械的または他の切除手段によって除去または形成される凍結層の高 さである。 解凍後、対象物を決められた位置（例えば極微小電極で発生する電場ケージ（ ｃａｇｅｓ））に設置（ｍｏｕｎｔｉｎｇ）し、あるいはその対象物を指定可能 な位置（例えば注入システムにて微小溝中）にまで物質を移動させる。 微小実験の機能を満足させるように凍結または解凍の前後における複雑な測定 、計量あるいは培養システムとして基板をさらに使用する。これは通常の半導体 チップ（ＦＥＴｓやＬＥＤｓのようなポンプ、センサー、能動要素を含んでいる ）を半導体基板に一体化するか、あるいはハイブリッドなシステムとして、ある いはこのような半導体チップを直接利用によって達成される。 凍結後、微小液滴の表面部分を修正し、破壊し、、または再構成する（例えば 、レーザーによる切断、またはさらに微小液滴を噴射すること）。 （例えば局在化されたテンサイド コーティング（ｔｅｎｓｉｄｅ ｃｏａｔ ｉｎｇｓ）、アムフォーター コーティング（ａｍｐｈｏｔｅｒ ｃｏａｔｉｎ ｇｓ）により）マイクロメータ・スケール上の親水性／疎水性バランスを設定し 、あるいは表面に勾配またはパターンを発生させる。 光学的、分光学的または他の測定もしくは評価単位（例えば空間的溶解、吸収 性について）に適合させる。 幾何学的な規格化または定量評価方法の自動化およびそれらの効率のよい技術 的、経済的な製品（例えば、マスクによって同一の配列を生成する）。 低温状態において、微視的物質、細胞、微小液滴を局在化させる素子を構成す る。それらの検知を含む。これに関しては氷中および冷却剤中で可視化する蛍光 マーク構造あるいは電極システムが考えられる、 別の基板（構造的、非構造的な）の適用を可能とし、あるいは凍結した微小液 滴構造のサンドイッチ構造のような外被を設けること。 本発明によれば、１またはそれ以上の冷却温度で、すでに微小液滴あるいは細 胞が供給された基板を修正することができる。かくして、細胞に液滴を噴射する と同時に微小液滴噴出システムによって同じ位置に流体をさらに供給して積み重 ねもしくは並置することができる。これは細胞が凍結期間中に接触する溶液組成 が、解凍中に全体的に異なった組成を有する溶液に置換されるという利点を有し ている。細胞の凍結保存を行う他の方法では、溶液組成の不均整をこの程度の可 変性および三次元的にすることは不可能である。 これまで可能であった最も早い凍結スピードに加えて、非常に低温度（−１０ ０〜−２７３℃）に基板を冷却すること。液滴の寸法と基板表面への衝突時の変 形によって、またその構造によって、数℃／秒乃至数千℃／秒の冷却速度を達成 することができる。 対応する基板の１つの特徴ある利点は、それらの加熱および冷却による滅菌性 であり、また通常臨床的に行われている超音波、無菌状態に隔離する手段でそれ らの清掃を行うことの応用である。 本発明の１つの本質的な特徴は、基板表面上の微小液滴の分布をパターン化し 、その結果として微小物質を配列することである。かくして、異なる細胞を少な い数で凍結させることができるだけでなく、多数を直接に並置させることができ るが、その相互作用は解凍後まで始まらない。よって、この方法と装置は医薬／ 診断学的試験だけでなく生物工学的／製薬的試験、それらの適用前に行われるセ ンサー・チップの準備、細胞の生命の固定化保持に変化を与えることなく、それ らを長期間に亘って保存し、さらにそれらを処理するのに適している。 市販の微小液滴噴出装置、特にピエゾ電気の原理による装置を使用して、ＫＨ ｚ範囲の周波数で噴射が行われ、それによって自動パターン化およびコンピュー タ制御によるターゲットの配列が行われ、さらに大きな細胞の計数（毎秒数百万 ）を迅速且つ正確に行うことができる。さらに、例えば電子印刷や前述の細胞選 別システムにおいてすでに使用されている制御可能な電極システムによって、微 小液滴を早い応答速度で偏向することも考えられる。表面に微小液滴を自由に接 近させることに加えて、凍結状態で微小液滴あるいは細胞の物質を除去すること 、このような物質を交換すること、あるいはこのような物質を他の物質（例えば 遺伝物質、酵素、膜材料等）で補足することが可能である。これは、完全な微小 液滴あるいは基板を覆って、ともに非常に小さい（ミクロン、ナノメートル）領 域および表面領域に供給することもできる。また、この場合、物質を微小液滴噴 出装置によって供給することも含まれている。さらにターゲット上にエアゾール または気相からの供給、またはガス雰囲気におけるスパッタリングまたは真空蒸 着を適用することもできる。 また、凍結流体の切除は真空中で行うことができる。この方法は凍結乾燥や凍 結エッチングで行うことができる。 界面における機械的安定性または特定の表面特性を得るために、温度Ｔ１（微 小液滴が存在する場合あるいは存在しない場合）を調整する前後において、所定 の表面層上で基板の本体に超薄膜が形成され、それによって混和可能および／ま たは混和不能、あるいは非混和液体領域が解凍、ミーニング（ｍｅａｎｉｎｇ） 後、例えば親水性液体から疎水性液体に変化させ、さらに厚く形成した物質とベ ースとなる液滴との間を結合する薄い接触層を含ませることができる。 また、この方法は一方の層の上に他方の層を形成する形で、あるいは分離層に よって互いに絶縁された形で幾つかの細胞層を形成することもできる。基板上の 小さな表面領域上に幾つかの異なる保存液（媒体）を並置させることができ、こ れによって溶液組成を微小な配列として試験することができ、また必要があれば 、異なった濃度（例えば異なる組成について）の物質を引き続いて供給すること によって試験することができる。これらの試験方法の１つの応用例は薬品、殺虫 剤、もしくは汚染物質のスクリーニングである。 この発明の方法の１つの重要な特徴は、包被溶液の凍結温度から殆ど絶対零度 にまで下げるような広い温度範囲内で、この方法に含まれる複数のステップをシ フトすることができることである。この温度範囲は微小生命組織中あるいはその 周囲で、通常流動性あるいは半流動性にある物質（細胞質（ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ａ ｅｔｃ））を固体状態に変換できるような範囲である。この範囲によって、 生理学的温度で自動的に生命力が失われる結果となり、また時間的な理由から不 可能とされていた細胞上および細胞内の操作、処理が可能になる。細胞を固体状 態に移すことにより、何らの時間的な制約もなく、また生命組織の生命力を維持 しながら、生命システム組織を実質的に変化させることができる。これを以下で は”低温細胞外科学”と称す。 本発明の好ましい実施態様を添付した図面に基づいて以下詳述する。 図１は装置の構成を模型的に示す断面図である。微小液滴噴出装置１１から単 細胞もしくは少数の細胞が微小液滴の形の包被溶液１２と共に噴射され、基板表 面１３上に高速度でガス相を通して衝突する。容器１６内にある低温液体１５に よって基板１３は通常包被溶媒の凍結点以下の温度Ｔ１に維持されている。基板 の冷却装置は、微小液滴が破裂したり、実質的に容積を失うことなく基板表面１ ３に衝突して凍結接着されるように、微小液滴噴出装置１１によって較正される 。温度Ｔ１が低く選定されると、それだけ液滴中に存在する細胞の凍結作用は速 くなる。加えて、この処理方法は基板表面を微小構造化（ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃ ｔｕｒｉｎｇ）すること（例えば、実効表面積を拡げること）によって影響を受 ける。 直径が約５０μｍの液滴の大きさ（栄養剤の溶液）については、温度Ｔ１＝− １９６℃に対して約−１００℃までのは冷却はミリ秒（ｍｓ）の範囲あるいはそ れより速く、従って細胞凍結保存においては、これまで使用されてきた殆どすべ ての温度プログラムが可能で、基板温度Ｔ１を変えることによって、また表面構 造と特性（Ｔ伝導率）を変えることによって達成できる。 微小液滴を配列（ａｒｒａｙ）すること、従って細胞が保存されるようにする ために、基板１３および／または微小液滴噴出装置１１が相互に関連してシフト されるが、微小液滴はガス相を通して飛翔中に偏向される。 基板１３に微小液滴を供給した後、基板１３は次の処理が実行される温度Ｔ３ にされる。この処理は、例えば機械的処理手段１７によって行われるか、あるい は貯蔵が温度Ｔ２で行われる。一般に、これは細胞貯蔵のために通常行われてい る低温貯蔵（ｃｒｙｏｂａｎｋｓ）の温度（−８０乃至−２７３℃）である。 解凍時には、次のように変更された装置を再度用いることによって行われる。 即ち、冷却剤１５の代わりに基板１３は直接付着された装置（サーミスタもしく は他の部分加熱素子）によるか、あるいは温められた流体によって一般に包被溶 液の凍結点以上の温度Ｔ１にされる。加熱処理は微小液滴噴出装置１１（例えば 栄養物溶液）から熱い微小液滴を噴射することによって行なうこともできる。 しかし、マイクロ波、赤外線（レーザー）照射、もしくは基板の誘導加熱のよ うな他の加熱手段を用いることもできる。また、この処理は制御可能な状態で行 われ、当然非常に短時間で行われる。 続く図２から図１６は基板表面の微視的な断面を示している。図示の構造体の 大きさは数ミクロンから数ミリメートルまで、好ましくは数１０ミクロンの大き さである。しかし、それらは例えば高分子を適用する場合は、サブミクロンの範 囲になることもある。 図２、図３および図４は基板表面２３、３２、４１上における微小液滴２２、 ３１、４４の可能な配列を示している。図２は細胞２１が存在する各微小液滴２ ２の（７×７＝４９）の正方形配列を示している。図３は各々が他の微小液滴と 接する４個の微小液滴３１からなる８個の集合体の配列を示しており、各微小液 滴中に細胞が存在する。 図４は感知あるいは機械的特定を助けるために、構造素子４２、４３間に４個 の液滴４４からなる２個の集合体と１個の液滴４４を示している。特定された素 子４３は、例えば低温状態において測定信号を供給する電極とすることができる 。特定された素子４２は、例えば温度センサーとすることができる。図示されて いる素子の大きさはミクロンとサブミクロンの範囲内である。 図５は、ガラス、プラスチック、半導体あるいは金属材料の基板を含む表面組 成のない基板５３の断面を示している。噴射された各微小液滴５１は１個の細胞 、１個の細胞器官もしくは１つの細胞集合体５２を含んでいる。 選択された温度Ｔ１に依存して微小液滴はその最初の形態から逸脱した形態で 凍結される。本発明によれば、微小液滴の位置決めに続いて、真空処理工程が実 行され、この真空処理工程では温度Ｔ１に従って包被溶液が漸増的に蒸発し、も しくは昇華することのできる選択された真空下に液滴を伴った基板表面が曝され る。 図６は、微小液滴６２が噴射された個々の微小構造体（ほぼ液滴寸法の窪み６ １）をもった基板６３の断面を示している。 図７は、図６に示したような配列（基板７３と細胞７２を有する微小液滴）を 示している。ここで、上記の状態とは異なって、第２の微小液滴７１は各微小液 滴に向けて噴射される。この微小液滴７１は細胞を含むこともあれば、他の溶媒 からなることもある。構造体の深さあるいは選択した温度Ｔ１に依存して、２個 あるいはそれ以上の微小液滴が他方の液滴上に置かれる。最大５０個の液滴から なる液滴列を生成することができ、この液滴列は凍結状態では機械的に安定した 状態にある。 図８は、厚みのある構造をもった基板８５の断面を示しており、その窪み内で 電極８４相互間には細胞８３を有する微小液滴が存在している。ウエブ（ｗｅｂ ｓ）８１の上には同種のあるいは異種の細胞８２を有する微小液滴が同じように 、例えば他の溶液で適用されている。この配列の基本的な形態は、薬品もしくは 汚染物質を遮蔽するために用いられる既に調製されたテストチップのそれに対応 するものである。微小液滴が解凍されるまで、また表面領域全体を濡らす溶液が 供給されるまで、２種類の細胞が接触したり、活性化されることはない。細胞と 細胞の間の相互作用は微小電極８４によって検出される。 図９は、決められた高さ９４の内壁によって境界が画定された窪みを有する基 板９３の断面を示している。これらの壁は非常に浅いので、微小液滴９１は部分 ９２だけ基板９３の平坦な表面（点線で示している）を越えて突出している。こ の突出部分は、低温状態で微小機械装置（ミクロトームに類似するもの）を用い て割る、研磨する、あるいは切り取ることによって、もしくはレーザービームを 用いて切除または爆破される。それによって、細胞内の部分を露出させ、物質（ 例えば、遺伝因子物質）を与え、物質（例えば細胞核）を除去することが非常に 望ましく、また／あるいは、さらに細胞生命の保持に適用できる例えば脂質、高 分子等を与えることによって解凍中および解凍後に細胞を再密閉する条件を作り 出すことが望ましい。なかでもこの方法は、低温細胞外科的処置のための出発点 として考えられるべきものである。 図１０は、窪みを有し、各窪み内に細胞１０２を含む微小液滴１０１が存在し ている基板１０３の断面を示している。このシステムを物理的に安定させ、蒸発 を防ぐ手段として解凍中に溶媒組成に影響を及ぼし、あるいは界面領域（親水性 ／疎水性）を画定するように作用する非常に薄い膜（分子の大きさの）からなる 層１０４によって当該システムは覆われている。しかしながら、この層は、解凍 後は薄層１０４に細胞を付着させて取出すことができる物質であってもよい。ま た、層はマイクロメータの範囲であると考えられる。 図１１は上面に層をなして微小液滴１１１が形成された基板１１３の断面を示 している。各微小液滴１１１は細胞を保有しており、また層１１１、１１５、１ １６によって覆われている。これによって、層、微小液滴あるいは細胞は同じ種 類または異なった種類とすることができる。この方法は、例えば解凍工程中に引 続き凍結防止剤を供給するのに都合がよい。これらの物質はしばしば細胞に損傷 を与えるので、低温状態において細胞との相互作用が起こる可能性のない解凍ま では必要としない。この方法によれば、高い細胞生存率を達成することができる 。 図１２は、窪みを有し、その窪み内に細胞１２２を保有した微小液滴が形成さ れた解凍後の基板１２３の断面を示している。細胞１２２は自由溶液１２１中に 浮かんでおり、必要に応じて絶縁層１２５によって電気的に絶縁された電極１２ ４によって上記自由溶液１２１中の電界領域で感知される。解凍後は同じような 微小素子を用いることによって細胞は基板上を動くことができ、また指定された 位置に保持される。 図１３ａは基板１３１の窪みの拡大断面図を示しており、その窪み内に微小液 滴１３３、１３４が存在し、各微小液滴の中には細胞１３２が低温保存されてい る。包被溶液と細胞の用いることのできる凍結点以下の適当な温度において、液 滴のキャップと細胞の部分１３４、１３５を機械的に、あるいは幾つかの他の形 式のマイクロカッター（面研磨体、ｐｌａｎｅ ｇｒｉｎｄｉｎｇ ｂｏｄｙ） によって除去することができる。切断レベルは窪みの深さによって決定される。 切断表面積のおおよその大きさは、例えば生物細胞の場合には一般に数μｍ²と することができる。しかしながら、より小さな開口、あるいは１０乃至１００μ ｍ²の範囲の開口であることも考えられる。最も簡単な場合、除去した液滴キャ ップは棄てられ、図１３ｂに示すように切断された表面には１つあるいはそれ以 上の薄層が形成される。細胞表面は、例えば親脂性（ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ）を 呈する溶液１３６あるいは脂質二重層もしくは脂質多重層に対応する溶液１３６ によってその境界領域を僅かに越えて覆われている。同様に、局部的にあるいは 広い表面積を覆ってしっかりとしたシールとして、対応する物質の薄い膜を形成 することもできる。さらに解凍中、一連の層を安定化させるために、例えば親水 性／疎水性の一連の層１３７を形成してもよい。既に述べたような微小液滴噴出 装置を用いて層や溶液を供給することができるが、ガス相等からの噴霧状化付着 によって行うこともできる。 この方法で十分な投薬と部分的な適用が確保される。解凍時には、各層の相互 作用あるいは浸透によって、さらに解凍温度を上下に揺動させることによって界 面を安定化させることができ、それによって前に物理的に用いた細胞を閉塞して 、その間細胞を活性状態に保つことができる。 図１３ｃにおいて、図１３ｂに示した層１３６、１３７に加えて微小液滴１３ ８が開口した細胞表面あるいはその近くに前もって供給されている。これには細 胞の代謝をうながす物質を含有している。このような物質としては、遺伝物質、 高分子、遺伝標識物質（ｍａｒｋｅｒ ｓｕｂｓｕｔａｎｃｅ）、アイソトープ もしくは人工体（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｂｏｄｉｅｓ）を用いることができる 。 図１３ｄは図１３ｃに述べたような溶媒液滴１３８を供給し、その後基板の全 表面が溶液１３６で覆われたものを示している。この溶液１３６は所定位置で凍 結し、解凍時に後から設けられた細胞キャップ１３５と微小液滴１３４の元の部 分に規則正しく結合する。全ての処理は凍結状態で実行され、この場合氷結晶の 移動性成長は生じないので、一般に−８０℃以下の温度であることが好ましい。 図１４ａには所定位置で凍結した微小液滴１４３の大部分１４４が切除され、 それらの中に細胞１４２、１４５が存在しているものが示されている。切除レベ ルは壁面１４１の高さで決まり、細胞壁と膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）１４５は顕微 鏡でみてきれいに切断されている。この場合、図１３に示した状態とは異なって 、切除した部分１４４、１４５、１４６は廃棄されることなく、同様に処理され た別の微小液滴の上に配置して使用される。このような２つの細胞部分１４２、 １４７と液滴部分１４３、１４８の処理によって得られた結果が図１４ｂに断面 の形で示されている。２つの部分をよりよく合体させるために、多分残っている 開口（図示していない）を閉鎖する位置にもってくる前に、２つの微小液滴の結 合表面に別の層を形成する必要がある場合がある。細胞内の楕円の部分は細胞器 官（ｃｅｌｌ ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ）である。 図１４ｃと図１４ｄは、さらに細胞−生物学的、医学的処理に適した他の２つ の形式の処理を示している。即ち、１つの場合は細胞物質から微小容量１４９ａ を除去し、細胞器官（ｏｒｇａｎｅｌｌｅ）、人工体あるいは他の細胞区画（ｃ ｅｌｌ ｃｏｍｐａｒｔｉｍｅｎｔ）１４９ｂが挿入される。また、他の場合に は、細胞区画（この場合細胞核１４９ｃを除去した状態にて示した）を除去し、 除去した容量を別の物質１４９ｄと置き換えられる。これは一般的に生理学的に 矛盾せず、幾つかの他の細胞の源とするすることができる。また、このことは解 凍後、細胞内部に耐性のある固体粒子あるいはガス空間が含まれていることを認 めるものである。これらの処理方法の応用分野としては、遺伝学、分子生物学、 生物工学、医学などがある。 図１５ａはすでに述べたように、細胞を開き、細胞物質の一部を除去し、別の 物質１５７および例えばバクテリアの細胞や単細胞の藻のような完全な細胞１５ ６を挿入したものが示されている。ここで、１５８は細胞器官（ｃｅｌｌ ｏｒ ｇａｎｅｌｌｅ）、１５２は細胞体、１５３は基板上の液滴部分、１５１は基板 上の肩部（ｂｅｒｍ）、１５５は切除した細胞部分、１５４は切除した液滴部分 を示す。 この方法では、一方が他方の上に配置された２つの液滴部分１５３、１５９相 互間、細胞部分１５２ａ、１５２ｂ相互間の侵入表面領域と接触表面領域は非常 に小さな領域（ミクロン領域あるいはサブミクロン領域である）であることは図 １５ｂから明らかである。この操作の目的は、細胞対、細胞融解（解凍後）、あ るいは一時的または永久的な細胞結合を形成することであり、その主たる応用は ハイブリドーマ工学である。 図１６ａは次の方法のステップによって得られる結果を断面図として示したも のである。 液滴物質１６２は既に述べたような方法で細胞表面を露出させ、浸食したりす ることなく基板１６１から除去される。細胞１６３の露出した表面上に、例えば 定められた微小液滴を噴射し、瞬時に凍結させることによって物質１６５が微量 投薬の形で局在的に供給される。これらの物質は、遺伝分子、結合蛋白質、酵素 、標識分子（ｍａｒｋｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、塩などを含み、これらは解 凍中および解凍に続いて表面に付着し、結合する。あるいは細胞または壁の近く の領域に近づこうとする傾向がある。解凍工程を安定化し、維持するためには、 さらにかなりの厚さに層（この場合、１６４で示した）を形成する必要がある。 また、この方法でこれらのステップを用いることにより、医学的、生物工学的あ るいは環境的に分類された技術的な応用が行われることを意図している。従って 、細胞のパラメータを測定することによって、解凍後環境的に有害な素子の影響 を調べるに当たって、細胞はセンサーのチップ内に存在する。これに関して、こ こで取り上げた方法は、液滴物質または細胞による架橋によって生じた空隙によ って立証されていることに注意すべきである。 図１６ｂは低温凍結した中に存在する微小液滴１６２と細胞１６３を処理する 方法におけるさらなるステップを説明するものである。ここでは、低温液滴ある いは細胞物質を噴射するときに使用される液滴１６６は、それが衝突する凍結物 質１６３、１６２の部分を簡単に液化することなしには凍結しないという事実を 利用している。この物質領域１６７がどの程度の大きさであるかは、基板の温度 と、さらに液滴の温度と両方の微小液滴の容積とに依存している。非常に低温の 基板と微小液滴１６６を凍結点近くで温度制御することにより、解凍域１６７は 分子の大きさになり、これに反して基板の温度が凍結点よりいくらか低い温度で 、微小液滴が高温では、最高１００℃の水溶液の場合、寸法は顕微鏡的に最大で 基板の表面積になる。両方共、ある定められた方法で基板表面上において混合相 、分子と微視的再構造あるいは結合ステップを実行するために利用することがで きる。 一実施例として生物学的物質を用いて説明した上記の方法と装置に関するステ ップは微小地形学、多区画反応化学の分野においても同様に応用できることが判 った。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９６年９月２７日 【補正内容】 請求の範囲 １．基板表面上の微視的物質、より詳しくは、生物学的物質、細胞形成物、単 細胞または細胞構成要素を冷凍保存および低温で処理する方法であって、 包被溶液を含んでいる少なくとも１つの貯蔵容器中に上記物質を導入する段階 と、 温度Ｔ１を有する上記基板表面を形成している温度制御されている基板ターゲ ットに上記少なくとも１つの貯蔵器から上記包被された物質を案内する段階と、 上記基板ターゲットに上記物質を固定的に接着する段階と、からなり、 特徴として、上記案内の期間中、上記物質は微小液滴が形成されるように上記 包被溶液によって囲まれており、そのために上記案内は上記微小液滴の動きを時 間的、位置的に制御できるようにされた微小液滴配置手段によって行われ、 上記固定的に接着された後、上記ターゲットの温度は貯蔵温度Ｔ２または処理 温度Ｔ３になるように調整され、上記装填処理された基板ターゲットは貯蔵およ び／または処理される、凍結保存および低温で処理する方法。 ２．上記物質の案内は微小液滴噴出装置によって行われ、また上記ターゲット に対する微小液滴の動きを１回の発射毎に移動させ、および／または上記微小液 滴噴出装置に対する上記ターゲットの位置を移動させることによって上記基板表 面に予め設定された間隔もしくはパターンで上記物質を接着させることを特徴と する請求の範囲１に記載の方法。 ３．１またはそれ以上のターゲット領域に複数の微小液滴噴出装置によって同 時にまたは順次に物質が噴射されることを特徴とする請求の範囲１または２に記 載の方法。 ４．上記温度Ｔ１が水の氷点以上であり、温度Ｔ２とＴ３が−２℃乃至−２７ ３℃の範囲内であることを特徴とする請求の範囲１乃至３の何れかに記載の方法 。 ５．微小液滴噴出装置による装填処理に先立って、上記基板ターゲットの表面 は部分的にあるいは全面に亘ってゲル、分子層、液体あるいは高分子、あるいは それらの複数または組合わせで被覆されることを特徴とする請求の範囲４に記載 の方法。 ６．上記の温度Ｔ１、Ｔ２およびＴ３が−５℃乃至−２７３℃の範囲内である ことを特徴とする請求の範囲１乃至３の何れかに記載の方法。 ７．上記基板ターゲットの表面に向かって飛翔中の上記物質と微小液滴は光学 的あるいは電気的に感知され、上記物質を伴った上記微小液滴の衝突位置は上記 感知によって得られたデータに関して可変であることを特徴とする請求の範囲１ 乃至６の何れかに記載の方法。 ８．上記装填処理された基板ターゲットの貯蔵および／または処理が液体窒素 または類似の低温液体またはそれのガス相のもとで行われることを特徴とする請 求の範囲１乃至７の何れかに記載の方法。 ９．全体の方法あるいはその方法の個々の作業ステップは常圧とは異なる 力 の下で実行されることを特徴とする請求の範囲１乃至８の何れかに記載の方法。 １０．貯蔵および／または処理に先立って、上記処理された基板ターゲットは さらに薄い層で被覆され、この薄い層は微小液滴噴出装置によって供給された凍 結した溶液で形成され、あるいは例えば噴霧、ガス相におけるスパッタリングあ るいは真空蒸着すること、によって生成される金属層とすることができる薄い層 であることを特徴とする請求の範囲１乃至９の何れかに記載の方法。 １１．低温状態における上記処理段階において、物質は除去され、および／ま たは細胞物質は光学的切除手段、凍結エッチング（ｆｒｅｅｚｅ ｅｔｃｈｉｎ ｇ）に類似した方法、あるいは真空下における蒸発によって物理的に切除される ことを特徴とする請求の範囲１乃至１０の何れかに記載の方法。 １２．低温状態において、合成、遺伝子あるいは細胞源であり、ある物質が供 給および／または置換され、あるいは解凍中または解凍後に開口細胞をその生命 を保ちつつ閉鎖する物質が供給されることを特徴とする請求の範囲１１に記載の 方法。 １３．上記物質が適応した状態の下で凍結乾燥されることを特徴とする請求の 範囲１乃至１２の何れかに記載の方法。 １４．細胞を有するまたは細胞を有しない、同じまたは異なった組成の数滴の 微小液滴が互いに低温的に固定されるか並置されることを特徴とする請求の範囲 １乃至１３の何れかに記載の方法。 １５．上記基板表面に形成された１つの層が上記細胞またはその固定状態にあ る部分を含んでいる上記微小液滴を切除することを特徴とする請求の範囲１乃至 １４の何れかに記載の方法。 １６．適当な位置で凍結される前および／または上記包被溶液の凍結点より高 い温度で上記ターゲットを加熱することによる解凍の後、上記細胞は電場の力に よって操作され、または上記包被溶液中に浮遊した状態で保持されることを特徴 とする請求の範囲１乃至１５の何れかに記載の方法。 １７．基板表面上の微視的物質、より詳しくは、生物学的物質、細胞形成物、 単細胞あるいは細胞構成要素を凍結保存および低温で処理する装置であって、特 徴として、時間的、位置的に制御された状態で包被された生物学的物質を含む包 被溶液の液滴を上記基板表面を形成する温度制御された基板上に噴出する微小液 滴噴出装置を有することを特徴とする冷凍保存と低温で処理するための装置。 １８．上記装置は上記供給された物質を貯蔵および／または操作する手段を含 んでいることを特徴とする請求の範囲１７に記載の装置。 １９．上記基板ターゲットは、より詳しくは微小電極、電子的感知素子あるい は電子的感知成分、窪み、突出部、貫通孔あるいは溝、あるいは波状、柱状、突 起、土塁状の微細構造を含む表面構造を有し、これらは上記表面の大きさを一般 にマイクロメートルまたはサブマイクロメートルの範囲に拡大していることを特 徴とする請求の範囲１７乃至１８に記載の装置。 ２０．上記微小液滴噴出装置および／または半導体材料、特にシリコンを基礎 とする半導体材料からなる上記基板ターゲットを有することを特徴とする請求の 範囲１７乃至１９の何れかに記載の装置。 ２１．噴射期間中、上記基板ターゲットは水の氷点以上の温度Ｔ１に保たれて おり、噴射後は冷却され、且つ−５℃乃至−２７３℃の範囲内に温度Ｔ２に温度 制御され、上記基板ターゲットは時間的に指定された温度プログラムに従って冷 却および／または加熱可能であり、例えば、より具体的には液体窒素を含む冷却 槽で、または上記冷却槽のガス雰囲気で冷却されることを特徴とする請求の範囲 １７乃至２０の何れかに記載の装置。 ２２．上記処理手段が、ミクロトームカッター、微小ドリル（ｍｉｃｒｏｄｒ ｉｌｌｉｎｇ）や研磨装置（フライス盤）（ｍｉｌｌｉｎｇ ｍａｃｈｉｎｅ） 、レーザービーム、あるいは他の素子からなり、これらの処理手段によって低温 状態にある上記物質を機械的、熱的または光学的に除去または切除することを特 徴とする請求の範囲１７乃至２１の何れかに記載の装置。 ２３．上記基板温度と微小液滴の温度が互いに独立して調整され、これらの温 度は噴射される微小液滴用の液滴溶液の凍結点以上よりもはるかに高いことを特 徴とする請求の範囲１７乃至２２の何れかに記載の装置。 ２４．医学的、生物学的、製薬的あるいは他の目的に使用することができる細 胞バンク（ｂａｎｋ）のために細胞を凍結保存し、あるいは医学的診断学、環境 工学および薬剤研究における試験チップ、センサー、スクリーニング素子として 基板を生産するための請求の範囲１乃至２３の何れかに記載の方法あるいは装置 の使用法。 【手続補正書】 【提出日】１９９７年４月２８日 【補正内容】 請求の範囲 １．基板表面上の 微視的物質、より詳しくは、生物学的物質、細胞形成物、 単細胞または細胞構成要素を凍結保存および低温で処理する方法であって、 包被溶液を含んでいる少なくとも１つの貯蔵容器中に上記物質を導入する段階 と、 温度Ｔ１を有する上記基板表面を形成している温度制御されている基板ターゲ ットに上記少なくとも一つの貯蔵容器から上記包被された物質を案内する段階と 、 上記基板ターゲットに上記物質を固定的に接着する段階と、 からなり、特徴として、 上記案内の期間中、上記物質は、微小液滴が形成されるように上記包被溶液に よって囲まれており、そのために上記案内は上記微小液滴の動きを時間的、位置 的に制御できるようにされた少なくとも１つの微小液滴配置手段によって行われ 、上記固定的接着の後、上記ターゲットの温度は貯蔵温度Ｔ２または処理温度Ｔ ３に調整され、また装填処理された上記基板ターゲットは貯蔵および／または処 理される、凍結保存および低温で処理する方法。 ２．上記微小液滴配置手段が微小液滴噴出装置であり、上記物質の上記案内が 、ターゲットに対して１滴ずづ微小液滴の動きの方向を変化させること、および ／または微小液滴噴出装置に対して上記ターゲットの動きを変化させることによ って行われて、それによって上記物質が定められた間隔もしくはパターンで上記 表面に接着されることを特徴とする請求の範囲１に記載の方法。 ３．１つまたはそれ以上のターゲット領域に複数の微小液滴噴出装置によって 同時にまたは順次に物質を噴射させることを特徴とする請求の範囲１または２に 記載の方法。 ４．上記温度Ｔ１が水の氷点より高く、温度Ｔ２とＴ３が−２℃から−２７３ ℃の範囲内であることを特徴とする請求の範囲１乃至３の何れかに記載の方法。 ５．装填処理に先立って、上記基板ターゲットの表面は微小液滴噴出装置によ って部分的にもしくは全面に一種類のゲル、分子層、流動体、高分子あるいはそ れらの複数の種類または組み合わされたもので被覆されることを特徴とする請求 の範囲４に記載の方法。 ６．上記の温度Ｔ１、Ｔ２およびＴ３が−５℃から−２７３℃の範囲内である ことを特徴とする請求の範囲１乃至３の何れかに記載の方法。 ７．上記基板ターゲットの表面に向かう飛翔中に上記物質と微小液滴が光学的 あるいは電気的に感知され、上記物質および上記微小液滴の衝突位置が上記感知 によって得られたデータに応じて変えられることを特徴とする請求の範囲１乃至 ６の何れかに記載の方法。 ８．上記装填処理された基板ターゲットの貯蔵および／または処理が液体窒素 または類似の低温液体またはそれのガス相の中で行われることを特徴とする請求 の範囲１乃至７の何れかに記載の方法。 ９．方法全体あるいはその個々の作業段階が常圧とは異なるる圧力の下で実行 されることを特徴とする請求の範囲１乃至８の何れかに記載の方法。 １０．貯蔵および／または処理に先立って、上記装填処理された基板ターゲッ トはさらに薄い層が被覆され、この薄い層は微小液滴噴出装置によって形成され た凍結した溶液により形成され、あるいは上記薄い層は、また金属製であっても よく、これは例えば噴霧、ガス相におけるスパッタリングあるいは真空蒸着する ことによって生成されることを特徴とする請求の範囲１乃至９の何れかに記載の 方法。 １１．上記物質が適応した条件下で凍結乾燥されることを特徴とする請求の範 囲１乃至１０の何れかに記載の方法。 １２．細胞を有するまたは細胞を有しない、同じまたは異なった組成の数滴の 微小液滴が互に低温的に固定されるか並置されることを特徴とする請求の範囲１ 乃至１１の何れかに記載の方法。 １３．貯蔵および／または処理のため、１つの層が上記基板表面に形成され、 この層によって、固定状態にある上記細胞あるいはその部分を含む上記微小液滴 の切除可能となることを特徴とする請求の範囲１乃至１２の何れかに記載の方法 。 １４．適当な位置で凍結される前および／または上記包被溶液の氷点より高い 温度で上記ターゲットを加熱することによる解凍の後上記細胞は電場の力（ｅｌ ｅｃｔｒｉｃａｌ ｆｉｅｌｄ ｆｏｒｃｅ）によって操作され、または上記包 被溶液中に浮遊した状態で保持されることを特徴とする請求の範囲１乃至１３の 何れかに記載の方法。 １５．基板表面上の 微視的物質、より詳しくは、生物学的物質、細胞形成物 、単細胞または細胞構成要素を低温で処理する方法であって、 凍結状態で上記基板表面上に上記物質を固定的に接着する段階と、 物質材料を除去することを含み、上記物質を処理する段階と、 を含むことを特徴とする上記低温で処理する方法。 １６．上記物質が生物学的細胞または細胞形成物または細胞構成要素であり、 上記処理が細胞材料の除去を含むことを特徴とする請求の範囲１５に記載の方法 。 １７．材料の上記除去もしくは低減は機械的除去、光学的切除、凍結エッチン グおよび／または真空中での蒸発によって行なうことを特徴とする請求の範囲１ ５または１６の何れかに記載の方法。 １８．さらに、追加の物質がさらに形成され、および／または置換される段階 を含み、上記追加物質が合成的、遺伝子的または細胞源からなるものであり、ま たは上記追加物質が解凍中または解凍後に開口した細胞を、その活性を保持しつ つ塞ぐようにされていることを特徴とする請求の範囲１５乃至１７の何れかに記 載の方法。 １９．上記固定的接着が請求の範囲１乃至１４のうちの１つの方法によって得 られるものであることを特徴とする請求の範囲１５乃至 ８の何れかに記載の方 法。 ２０．基板表面上の微視的物質、より詳しくは、生物学的物質、細胞形成物、 単細胞あるいは細胞構成要素を凍結保存および低温で処理する装置であって、上 記基板表面を形成する温度制御された基板ターゲット上に包被された生物学的物 質を含む包被溶液の液滴を時間的、位置的に制御して噴射するための微小液滴噴 出装置を有することを特徴とする上記凍結保存および低温で処理する装置。 ２１．上記装置が供給された物質を貯蔵しおよび／または操作する処理手段を 含んでいることを特徴とする請求の範囲２０に記載の装置。 ２２．上記基板ターゲットが、より詳しくは微小電極、電子感知素子あるいは 電子感知構成要素、窪み、突出物、貫通孔あるいは溝を含む表面構造をもち、も しくは上記表面の寸法を代表的にはミクロン（μm）またはサブミクロンの範囲 で拡大する波状、柱状（ｃｏｌｕｍｎｓ）、突起、土塁構造（ｂｅｒｍｓ）のよ うな微細な構造もつことを特徴とする請求の範囲２０または２１に記載の装置。 ２３．上記微小液滴装置および／または上記基板ターゲットが半導体材料、特 にシリコンを基礎とするもので形成されていることを特徴とする請求の範囲２０ 乃至２２の何れかに記載の装置。 ２４．噴射期間中、上記基板ターゲットは、水の氷点以上の温度より高いか、 もしくは−５℃から−２７３℃の範囲にある温度Ｔ１をもち、噴射後は冷却され て−５℃から−２７３℃の範囲内に貯蔵温度Ｔ２になるように温度制御すること ができ、また上記基板ターゲットは、時間を定めた温度プログラムに従って冷却 および／または加熱可能であり、例えば冷却剤槽、特に液体窒素を含むもので、 または上記冷却剤槽のガス雰囲気で冷却することができることを特徴とする請求 の範囲１７乃至２０の何れかに記載の装置。 ２５．上記処理手段が、ミクロトームカッター、微小ドリル（ｍｉｃｒｏｄｒ ｉｌｌｉｎｇ）、微小研磨装置（フライス盤）、レーザービーム、あるいは上記 微小液滴や細胞の低温状態において機械的、熱的または光学的に物質を除去また は切除することのできる幾つかの他の要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）からなることを特 徴とする請求の範囲２０乃至２４の何れかに記載の装置。 ２６．上記基板温度と上記液滴の温度が互いに独立して調整され、これらの温 度は噴射される微小液滴用の液滴溶液の凍結点よりもはるかに高いことを特徴と する請求の範囲２０乃至２５の何れかに記載の装置。 ２７．基板表面上の微視的物質、より詳しくは、生物学的物質、細胞形成物、 単細胞あるいは細胞構成要素を低温で処理する装置であって、物質が上記基板表 面上に凍結した状態で固定的に接着されるように基板温度を調節する手段と、物 質材料を除去するように構成されている処理手段とを有することを特徴とする低 温で処理するための装置。 ２８．上記処理手段がミクロトームカッター、微小ドリル、微小研磨装置（フ ライス盤）、レーザービームあるいは低温状態において機械的、熱的、光学的に 物質を除去または切除することのできる幾つかの他の要素からなることを特徴と する請求の範囲２７に記載の装置。 ２９．医学的、生物学的、製薬的あるいは他の目的に使用することができる細 胞バンク（ｂａｎｋ）のために細胞を凍結保存するための、あるいは医学的診断 学、環境工学および薬剤研究における試験片、センサー、スクリーニング素子と しての基板を生産するための請求の範囲１乃至２８の何れかに記載の方法あるい は装置の使用法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハーゲドルン， ロルフ ドイツ連邦共和国 デー−13057 ベルリ ン バルテイナー・シユトラーセ 16 (72)発明者 ミユラー， トルシユテン ドイツ連邦共和国 デー−12439 ベルリ ン ハルトリーゲルシユトラーセ 100 (72)発明者 ホビツツ， シユテフエン ドイツ連邦共和国 デー−01309 ドレス デン ボルムザー・シユトラーセ 58 (72)発明者 バーグナー， ベルント ドイツ連邦共和国 デー−25582 ルーフ ト ホーエ・シユトラーセ 11 (72)発明者 ホーフマン， ウルリツヒ ドイツ連邦共和国 デー−25524 イツエ ホー ゲシユビスター−シヨル−アレー 249

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．微視的物質、より詳しくは生物学的物質、細胞結合体、単細胞または細胞 構成要素を基板表面上で凍結保存および低温処理する方法であって、 特徴として、包被溶媒を含む少なくとも１個の貯蔵容器中に上記物質を導入す る段階と、 少なくとも１個の微小液滴配置手段によって、温度Ｔ１を有する上記基板表面 を形成している温度制御された基板ターゲットに上記少なくとも１個の貯蔵容器 から時間的、位置的に制御された状態で包被された物質を案内する段階と、 ターゲットの温度を貯蔵温度Ｔ２あるいは処理温度Ｔ３に調整しながら、上記 基板ターゲット上に上記物質を固定的に接着させる段階と、 上記のように処理された基板ターゲットを貯蔵および／または処理する段階と 、からなる上記冷凍保存および低温処理する方法。 ２．上記物質の案内は微小液滴噴出装置によって行われ、また上記ターゲット に対する微小液滴の動きを１回の発射毎に移動させ、および／または上記微小液 滴噴出装置に対する上記ターゲットの位置を移動させることによって上記基板表 面に予め設定された間隔もしくはパターンで上記物質を接着させることを特徴と する請求の範囲１に記載の方法。 ３．１またはそれ以上のターゲット領域に複数の微小液滴噴出装置によって同 時にまたは順次に物質が噴射されることを特徴とする請求の範囲１または２に記 載の方法。 ４．上記温度Ｔ１が水の氷点以上であり、温度Ｔ２とＴ３が−２℃乃至−２７ ３℃の範囲内であることを特徴とする請求の範囲１乃至３の何れかに記載の方法 。 ５．微小液滴噴出装置による装填処理に先立って、上記基板ターゲットの表面 は部分的にあるいは全面に亘ってゲル、分子層、液体あるいは高分子、あるいは それらの複数または組合わせで被覆されることを特徴とする請求の範囲４に記載 の方法。 ６．上記の温度Ｔ１、Ｔ２およびＴ３が−５℃乃至−２７３℃の範囲内である ことを特徴とする請求の範囲１乃至３の何れかに記載の方法。 ７．上記基板ターゲットの表面に向かって飛翔中の上記物質と微小液滴は光学 的あるいは電気的に感知され、上記物質を伴った上記微小液滴の衝突位置は上記 感知によって得られたデータに関して可変であることを特徴とする請求の範囲１ 乃至６の何れかに記載の方法。 ８．上記装填処理された基板ターゲットの貯蔵および／または処理が液体窒素 または類似の低温液体またはそれのガス相のもとで行われることを特徴とする請 求の範囲１乃至７の何れかに記載の方法。 ９．全体の方法あるいはその方法の個々の作業ステップは常圧とは異なる力の 下で実行されることを特徴とする請求の範囲１乃至８の何れかに記載の方法。 １０．貯蔵および／または処理に先立って、上記処理された基板ターゲットは さらに薄い層で被覆され、この薄い層は微小液滴噴出装置によって供給された凍 結した溶液で形成され、あるいは例えば噴霧、ガス相におけるスパッタリングあ るいは真空蒸着すること、によって生成される金属層とすることができる薄い層 であることを特徴とする請求の範囲１乃至９の何れかに記載の方法。 １１．低温状態における上記処理段階において、物質は除去され、および／ま たは細胞物質は光学的切除手段、凍結エッチング（ｆｒｅｅｚｅ ｅｔｃｈｉｎ ｇ）に類似した方法、あるいは真空下における蒸発によって物理的に切除される ことを特徴とする請求の範囲１乃至１０の何れかに記載の方法。 １２．低温状態において、合成、遺伝子あるいは細胞源であり、ある物質が供 給および／または置換され、あるいは解凍中または解凍後に開口細胞をその生命 を保ちつつ閉鎖する物質が供給されることを特徴とする請求の範囲１１に記載の 方法。 １３．上記物質が適応した状態の下で凍結乾燥されることを特徴とする請求の 範囲１乃至１２の何れかに記載の方法。 １４．細胞を有するまたは細胞を有しない、同じまたは異なった組成の数滴の 微小液滴が互いに低温的に固定されるか並置されることを特徴とする請求の範囲 １乃至１３の何れかに記載の方法。 １５．上記基板表面に形成された１つの層が上記細胞またはその固定状態にあ る部分を含んでいる上記微小液滴を切除することを特徴とする請求の範囲１乃至 １４の何れかに記載の方法。 １６．適当な位置で凍結される前および／または上記包被溶液の凍結点より高 い温度で上記ターゲットを加熱することによる解凍の後、上記細胞は電場の力に よって操作され、または上記包被溶液中に浮遊した状態で保持されることを特徴 とする請求の範囲１乃至１５の何れかに記載の方法。 １７．基板表面上の微視的物質、より詳しくは、生物学的物質、細胞形成物、 単細胞あるいは細胞構成要素を凍結保存および低温で処理する装置であって、特 徴として、時間的、位置的に制御された状態で包被された生物学的物質を含む包 被溶液の液滴を上記基板表面を形成する温度制御された基板上に噴出する微小液 滴噴出装置を有することを特徴とする冷凍保存と低温で処理するための装置。 １８．上記装置は上記供給された物質を貯蔵および／または操作する手段を含 んでいることを特徴とする請求の範囲１７に記載の装置。 １９．上記基板ターゲットは、より詳しくは微小電極、電子的感知素子あるい は電子的感知成分、窪み、突出部、貫通孔あるいは溝、あるいは波状、柱状、突 起、土塁状の微細構造を含む表面構造を有し、これらは上記表面の大きさを一般 にマイクロメートルまたはサブマイクロメートルの範囲に拡大していることを特 徴とする請求の範囲１７乃至１８に記載の装置。 ２０．上記微小液滴噴出装置および／または半導体材料、特にシリコンを基礎 とする半導体材料からなる上記基板ターゲットを有することを特徴とする請求の 範囲１７乃至１９の何れかに記載の装置。 ２１．噴射期間中、上記基板ターゲットは水の氷点以上の温度Ｔ１に保たれて おり、噴射後は冷却され、且つ−５℃乃至−２７３℃の範囲内に温度Ｔ２に温度 制御され、上記基板ターゲットは時間的に指定された温度プログラムに従って冷 却および／または加熱可能であり、例えば、より具体的には液体窒素を含む冷却 槽で、または上記冷却槽のガス雰囲気で冷却されることを特徴とする請求の範囲 １７乃至２０の何れかに記載の装置。 ２２．上記処理手段が、ミクロトームカッター、微小ドリル（ｍｉｃｒｏｄｒ ｉｌｌｉｎｇ）や研磨装置（フライス盤）（ｍｉｌｌｉｎｇ ｍａｃｈｉｎｅ） 、レーザービーム、あるいは他の素子からなり、これらの処理手段によって低温 状態にある上記物質を機械的、熱的または光学的に除去または切除することを特 徴とする請求の範囲１７乃至２１の何れかに記載の装置。 ２３．上記基板温度と微小液滴の温度が互いに独立して調整され、これらの温 度は噴射される微小液滴用の液滴溶液の凍結点以上よりもはるかに高いことを特 徴とする請求の範囲１７乃至２２の何れかに記載の装置。 ２４．医学的、生物学的、製薬的あるいは他の目的に使用することができる細 胞バンク（ｂａｎｋ）のために細胞を凍結保存し、あるいは医学的診断学、環境 工学および薬剤研究における試験チップ、センサー、スクリーニング素子として 基板を生産するための請求の範囲１乃至２３の何れかに記載の方法あるいは装置 の使用法。