JPH10509585A - クラミジア・トラコマチス検出のための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 クラミジア・トラコマチスの増幅および特異的検出のためのオリゴヌクレオチドおよび方法。本発明は、クラミジア・トラコマチスのヌクレオチド配列を増幅できる増幅オリゴヌクレオチド、およびクラミジア・トラコマチスの核酸の特異的検出のためのヘルパーオリゴヌクレオチドに関する。また本発明は、本発明オリゴヌクレオチドの使用方法ならびにクラミジア・トラコマチスの検出に有用な特別な組合せおよびキットに関する。

Description

【発明の詳細な説明】 クラミジア・トラコマチス検出のための組成物および方法発明の分野 本明細書に記載され、クレイムされた発明は、例えば、喉の綿棒かきとり物、 組織試料、体液、および培養物からの試験試料中の細菌種クラミジア・トラコマ チス（Chlamydia trachomatis）由来の核酸の増幅および検出のための核酸プロ ーブ、ヘルパーオリゴヌクレオチドおよび増幅オリゴヌクレオチドの設計および 使用に関する。発明の背景 クラミジアは世界中で最も通常の動物病原菌に属する。これらのグラム陰性細 胞は、絶対的な細胞内生物であるという点で普通でない細菌である。それらは感 染細胞中で複製し、それら自身のエネルギーを代謝反応から作り出すことのでき る酵素を欠いていて、宿主により生産されたＡＴＰをそれら自身の必要のために 使用することにより宿主からエネルギーを奪う。 クラミジア・トラコマチスは、クラミジア属の３つの分類のうちの１つであり 、ヒトの病原菌である。American Society for Microbiology,Manual of Clinic al Microbiology(5th ed.1991)参照。クラミジア・トラコマチス株は、トラコー マ、封入体結膜炎、および性器管の疾病の不定期な病因を包含する。病因という ことについては、シー・トラコマチス（C.trachomatis）は世界中において性的 交渉により伝染する疾病の主要原因であり、男性の尿道炎および女性の子宮頸炎 を引き起こす。感染した女性は、出産の間にその子供に伝染させる可能性があり 、他の症状に混ざった肺炎または目の疾病を引き起こす。罹病個体におけるシー ・トラコマチス感染の初期検出は、必要な治療をを早くすることとなり、病原菌 の連鎖的伝染を防止することができる。 それゆえ、試験試料中、詳細にはヒトの臨床標本中のシー・トラコマチスの迅 速かつ特異的な検出のための核酸ハイブリダイゼーションプローブを提供するこ とが本発明の目的である。 本明細書の用語「試験試料」は、目的標的核酸の含有が疑わしい試料を意味し 、生物学的試料、尿、血液、乳、脊髄液、痰、唾液、糞便、肺吸引液、喉または 性器の綿棒かきとり物のごとき体液または排泄物、上記のものを１種またはそれ 以上含有する臨床標本、環境試料、食品試料および研究室試料を包含するが、こ れらに限らない。 核酸ハイブリダイゼーションは、あらかじめ決定しておいた反応条件下で完全 または部分的に相補的なヌクレオチド配列を有する２種の核酸鎖を、一緒にして 、特異的水素結合を伴った安定な２本鎖ハイブリッドを形成することによる方法 である。いずれかの核酸鎖はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮ Ａ）であってよい。よって、ハイブリダイゼーションは、ＲＮＡ：ＲＮＡハイブ リッド、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、またはＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを包 含する。 よって、本願の用語「ハイブリダイゼーション」は、完全または部分的に相補 的な２種の１本鎖核酸が逆平行で一緒になって２本鎖領域を有する安定な構造を 形成する能力をいう。時々ハイブリッドと呼ばれるこの２本鎖構造の２つの構成 鎖は水素結合によって互いに保持される。最も通常には、これらの水素結合は、 塩基アデニンおよびチミンまたはウラシル（ＡおよびＴまたはＵ）あるいはシト シンおよびグアニン（ＣおよびＧ）を含むヌクレオチド間で形成され、これらの 正しいペアーのメンバーでない塩基の間にも塩基対が形成されうる。正しくない 塩基対は当該分野においてよく知られている。例えば、The Biochemistry of th e Nucleic Acids(Adams et al.,eds.,1992)参照。 核酸ハイブリダイゼーションは、特定のヌクレオチド配列を有する標的核酸の 検出および定量のための通常の方法である。かかる方法は、生物の同定および分 類、感染症および遺伝学的異常の診断、食品および薬剤の試験、および犯罪容疑 の決定、ならびに他の事柄において有用である。典型的には、核酸ハイブリダイ ゼーションアッセイには、標的配列に相補的な核酸配列を有する標識オリゴヌク レオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いる。かかる標識は当該 分野においてよく知られており、放射性同位元素、酵素、または蛍光、発光もし くは化学発光基を包含しうる。出願人は、標識として化学発光アクリジニウムエ ステルの使用を好む。本願と共有のArnoldらの米国特許第５,１８５,４３９号参 照（参照により本明細書に記載されているものとみなす）。相補的領域における 水素結合による２つの鎖のアニーリングを可能にするのに適したハイブリダイゼ ーション条件下にて、標的配列を有する核酸を含有している疑いのある試料にプ ローブを接触させる。次いで、プローブは、試料中に存在する標的核酸にハイブ リダイゼーションする。ハイドロキシアパタイド吸着のごとき当該分野において よく知られた種々の方法により、得られたハイブリッド２本鎖を検出することが できる。ハイブリダイゼーションしていないプローブ上に存在する標識を選択的 に分解し、次いで、残存しているハイブリダイゼーションしたプローブに結合し ている標識量を測定することを含む方法もこれらの方法に包含され、この方法は 本願と共有のArnoldらの米国特許第５,２８３,１７４号に記載されており、該特 許を参照により本明細書に記載されているものと見なす。ハイブリダイゼーショ ン保護アッセイ（ＨＰＡ）と呼ばれる後者の方法は、出願が目下好んでいる方法 である。 用いる個々の標識の検出限界によっては、試験試料は、しばしば、核酸ハイブ リダイゼーションによる直接検出または定量を可能にする多量の核酸分子を含ん でいない。かかる場合、核酸ハイブリダイゼーションを用いて試験試料中の存在 または量を調べる前に、検出可能標的ヌクレオチド配列量を増加させる。この方 法は核酸増幅といわれ、標的核酸量の増加方法は標的核酸または標的ヌクレオチ ド配列の増幅といわれる。 増幅方法は、核酸ポリマー化反応において、標的ヌクレオチド配列を含む少な くとも１種の核酸鎖を鋳型として使用して標的ヌクレオチド配列を含む相補的な 第２の鎖を得る。生成した核酸を鋳型として用いてこの方法を連続サイクルでく り返すことにより、標的ヌクレオチド配列を有する多数の核酸分子が迅速に増加 する。 多くの増幅方法が記載されており、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば 、Mullisらの米国特許第４,６８３,１９５号参照）、および１工程またはそれ以 上の工程のインビトロ転写（ＲＮＡ合成）を用いる方法(例えば、Murakawa et a l.,DNA 7:287-295、BurgらのＰＣＴ出願ＷＯ８９／１０５０、GingerasらのＰＣ Ｔ出願ＷＯ８８／１０３１５、KacianおよびFultzの欧州特許出願第８９３１３ １５４号、McDonoughらのＰＣＴ出願ＷＯ９４／０３４７２、KacianらのＰＣＴ 出願ＷＯ９３／２２４６１、およびDattaguptaらの米国特許出願第０８／２１５ ，０８１号（米国に１９９４年３月１６日出願）参照）といった種々の具体例が これらの方法に含まれる。これらの文献の開示を参照により本明細書に記載され ているものとみなす。最後の２つの文献は本願と共有である。 大部分の核酸増幅方法は、オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプロ モーターープライマーを使用する。これらのプライマーまたはプロモーター−プ ライマーは比較的短い（好ましくは１０ないし１００ヌクレオチドの間、最も好 ましくは約１２ないし５０ヌクレオチドの間の長さ）１本鎖核酸分子であり、そ れらは、目的標的核酸のヌクレオチド配列領域の少なくとも一部に相補的なヌク レオチド配列を有するように、人の手によって化学的、生物学的または酵素的に 合成され、設計され、そして／または選択される。核酸鎖のハイブリダイゼーシ ョンを可能にする条件下でプライマーまたはプロモーター−プライマーを標的核 酸と一緒にした場合、プライマーまたはプロモーター−プライマーの少なくとも 一部が２本鎖の水素結合したハイブリッドを標的核酸とともに形成する。常にで はないがしばしば、かかるハイブリッドのはっきりとした特徴は、プライマーま たはプロモーター−プライマーがハイブリダイゼーションされつつも核酸ポリメ ラーゼによるプライマー伸長反応においてヌクレオチドと反応しうる遊離の３' ヒドロキシ基を有しているということである。しかしながら、遊離の３'ヒドロ キシル基は、プロモーターとして機能するプロモーター−プライマーには必要と されなくてもよい。 ２本鎖のプライマー：標的核酸ハイブリッドが核酸ポリメラーゼおよび必要な ヌクレオチド三リン酸と接触する場合、プライマー伸長反応が起こる。プライマ ーの利用可能な３'ヒドロキシル基は、核酸ポリメラーゼがプライマーの３'末端 へのヌクレオチド残基付加を特異的に開始することを可能にする。伸長中のプラ イマー生成物の配列は、標的核酸鋳型のヌクレオチド配列によって決定される。 かくして、最初のアニーリングまたはハイブリダイゼーションの領域において、 プライマーは相補的核酸鎖の合成を開始する。 「プロモーター−プライマー」は、遊離の３'ヒドロキシル基を有する場合に はその目的核酸標的に対する３'領域の相補性を有しているという点で、プライ マーとして機能しうる。さらに、プロモーター−プライマーは、標的核酸に相補 的でないヌクレオチド配列領域をその５'末端に有する。核酸ポリメラーゼの作 用によりこの領域が２本鎖となった場合(このとき、鋳型核酸の３'末端が伸長) 、２本鎖の非相補的領域は、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いるＲＮ Ａ合成のための開始部位として機能しうる。 標的ヌクレオチド配列のユニークさおよびハイブリダイゼーションアッセイに 必要な選択性の程度に応じて、プライマーまたはプロモーター−プライマーは、 ハイブリダイゼーションアッセイプローブとしても機能しうる。別法として、ハ イブリダイゼーションアッセイプローブまたは増幅オリゴヌクレオチドを、その 主要機能のみについて設計し使用してもよい。 ハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いて目的の標的核酸の存在を検 出および／または定量する。通常には、放射活性または発光原子または化学発光 部分のごとき検出可能な化学基でかかるプローブを標識する。出願人は、標識試 薬としてアクリジニウムエステル誘導体の使用を好む。ときどき、目的の標的核 酸は、通常には生物学的ソース由来のヌクレオチド配列とともに異なる核酸分子 の集団を含むであろう。例示目的のみであり、しかも限定するものではないが、 標的ヌクレオチド配列は、生物属の核酸に共有されている可能性があり（当該属 以外の生物によっては共有されていない）、そのいずれかの検出が望ましい。あ るいはまた、標的ヌクレオチド配列は特定の生物種またはその種の属する株に独 特のものである可能性もある。 すべてのプローブを標識する必要があるというわけではない。「ヘルパーオリ ゴヌクレオチド」または「ヘルパープローブ」と呼ばれるいくつかのハイブリダ イゼーションプローブは、個々の標識プローブがその標的ヌクレオチド配列に結 合するのを可能にするように設計されている。理論に拘束されるのを望まないが 、ヘルパープローブは、標的核酸中の分子間水素結合量を局部的に減少させるこ とにより標識プローブの結合を容易にし、かくして、標的ヌクレオチド配列の標 識プローブとの特異的ハイブリダイゼーションをより容易にすると考えられる。 標的プローブの結合部位および標的核酸の２次構造によっては、ヘルパープロー ブは標識プローブの結合部位近傍のヌクレオチド配列領域を指向するものであっ てもよく、それにもかかわらずプローブ結合に影響する結合部位から離れた領域 を指向するものであってもよい。ヘルパープローブは、本願と共有のHoganらの 米国特許第５,０３０,５５７号に記載されており、これを参照により本明細書に 記載されているものとみなす。 特定の核酸配列の存在を検出するための核酸ハイブリダイゼーションの使用に ついての記載は、Kohneらの米国特許第４,８５１,３３０号およびHoganらの国際 特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８７／０３００９にあり、これら両方の文献は本願と共有 であり、参照により本明細書に記載されているものとみなす。Hoganは、核酸ハ イブリダイゼーション法を用いて試料中の非ウイルス生物または非ウイルス生物 群の存在を決定する方法を記載している。 上記Hoganの文献は、特定の生物または生物群に属する標的リボゾームＲＮＡ （ｒＲＮＡ）ヌクレオチド配列のみを特異的に検出する多くのハイブリダイゼー ションプローブも記載している。 シー・トラコマチス検出用ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイプローブが 記載されている。Hyppia et al.,J.Gen.Microbiol.130:3159-3164(1984)には、 シー・トラコマチスからの６.７ｋｂのプラスミドの単離およびそのハイブリダ イゼーションプローブとしての使用が記載されている。Griffairs et al.,Res.M icrobiol.140:139-141(1989)、Ostergaard et al.,J.Clin.Microbiol.28:1254-1 260(1990)、McGarty et al.,Gut 32:1011-1015(1991)、Class et al.,J.Clin.Mi crobiol.29:42-45(1991)、Longiaruの欧州特許第４２０ ２６０号（出願番号 第９０１１８６２０.５）、およびLongiaruらの米国特許第５,２３２,８２９号 においては、増幅オリゴヌクレオチドと組み合わせたポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ ＣＲ）を用いるシー・トラコマチスのプラスミドヌクレオチド配列の増幅が記載 されている。シー・トラコマチスの主要外膜蛋白（ＭＯＭＰ）をコードする配列 の増幅は、Dutilh et al.,Res.Microbiol.140:7-16(1989)、Holland et al.,J.I nfect.Dis.162:984-987(1990)、Bobo et al.,J.Clin.Microbiol.28:1968-197(19 90)、Holland et al.,Infec.Immun.60:2040-2047(1992)、およびPalmer et al., J.Clin.Pathol.44:321-325(1991)により記載されている。Ossewaarde et al.,J. Clin.Microbiol.30:2122-2128(1992)およびRoosendaal et al.,J.Med.Microbiol .38:426-433(1993)には、プラスミドおよびＭＯＭＰ配列の増幅が記載されてい る。 本願と共有のHoganらのＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８７／０３００９、およ びShahらのＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１５１５９には、シー・トラコマチスの１ ６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡ配列の検出用プローブが記載されている。Naher et al.,Genitourin.Med.65:319-322(1989)、Kluyimans et al.,J.Clin.Microbiol.2 9:2685-2689(1991)、Scieux et al.,Res.Microbiol.143:755-765(1992)、および Holland et al.,Infect.Immun.（上記）には、シー・トラコマチスのｒＲＮＡに 指向されたプローブの使用が記載されている。Cheema et al.,Amer.J.Med.Sci.3 02:261-268(1991)には、クラミジアのリボゾームＤＮＡに指向されたプローブが 記載されている。Pollard et al.,Mol.Cell.Probes 3:383-389(1989)、Roosenda al,（上記）、およびClaas et al.,Eur.J.Clin.Microbiol.Infec.Dis.9:864-868 (1990)には、クラミジア種の１６Ｓ リボゾームサブユニット由来のヌクレオチ ド配列の増幅が記載されている。発明の概要 本発明は、シー・トラコマチスのｒＲＮＡまたはそれをコードしているＤＮＡ の特定領域に相補的であるように、あるいはシー・トラコマチスのｒＲＮＡまた はｒＤＮＡヌクレオチド配列を有する、必須としてなる、またはそれよりなるオ リゴヌクレオチドまたは核酸に相補的であるように設計された増幅オリゴヌクレ オチド、ヘルパーオリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドハイブリダイ ゼーションアッセイプローブを開示し、クレイムする。 本発明ハイブリダイゼーションプローブは、標的核酸の選択的検出を可能にす る条件下で特定の標的ヌクレオチド配列を有する分子の領域中の標的核酸にハイ ブリダイゼーションするように設計されている。 本発明増幅オリゴヌクレオチドは、標的ヌクレオチド配列の３'側（標的核酸 について）に存在する標的核酸の領域にハイブリダイゼーションするように設計 および／または選択されている。それゆえ、ハイブリダイゼーションした増幅オ リゴヌクレオチドは、標的核酸の少なくとも一部に相補的な核酸鎖の合成を可能 にする。形成期の鎖も標的ヌクレオチド配列を含んでいる。増幅オリゴヌクレオ チドは、本明細書記載のハイブリダイゼーションアッセイプローブと同等の高度 な特異性を標的核酸に対して有していてもよく、また有していなくてもよい。例 えば、増幅オリゴヌクレオチドは種特異的でなくてもよいが、属または科特異的 であってよい。しかしながら、増幅生成物（アンプリコン）を種特異的ハイブリ ダイゼーションアッセイプローブを用いて検出するかぎり、絶対的な特異性の欠 如は、シー・トラコマチスの検出における増幅オリゴヌクレオチドの有用性を無 に帰することはないであろう。 よって、本発明増幅オリゴヌクレオチド、ヘルパーオリゴヌクレオチドおよび ハイブリダイゼーションプローブの基本的かつ新規な特性は、適当なハイブリダ イゼーション条件下で、非標的核酸または核酸領域よりも標的シー・トラコマチ ス核酸のあらかじめ決められた領域に優先的にハイブリダイゼーションする能力 である。この特異性は、標的核酸の領域のヌクレオチド配列と、水素結合したハ イブリダイゼーション複合体に含まれる増幅ヌクレオチドまたはハイブリダイゼ ーションプローブとの間の相補性の程度ならびにハイブリダイゼーション反応条 件の関数である。また本発明は、ハイブリダイゼーションプローブまたは増幅オ リゴヌクレオチドと、それらに特異的な標的核酸との間に形成された２本鎖核酸 ハイブリッド分子を開示しクレイムする。標識プローブと標的核酸分子との間に 形成されたハイブリッドはシー・トラコマチスの検出および／または定量に有用 である。なぜなら、これらの構造は、ハイブリダイゼーション反応後にハイブリ ダイゼーションしていない標識プローブから物理的または化学的に識別されうる からであり、かくして、プローブ上の標識は元の試料中の標的核酸の存在を示す 唯一のものであるからである。 同様に、増幅オリゴヌクレオチドとそれらに特異的な標的核酸配列領域との間 に形成された本発明ハイブリッドは、少なくとも１ラウンドのＤＮＡ合成、ＲＮ Ａ転写、またはそれらの両方のための開始部位を提供する。次いで、以下に詳述 するように、検出可能なハイブリッド分子を形成するハイブリダイゼーションア ッセイプローブを用いて、生じた増幅核酸配列領域を検出する。よって、両方の タイプのハイブリッド分子は本発明対象を得ることに有用である。 それゆえ、シー・トラコマチスの標的ヌクレオチド配列を増幅しうる増幅オリ ゴヌクレオチドを提供することが本発明の１の目的である。シー・トラコマチス の標的ヌクレオチド配列は、シー・トラコマチス、好ましくはシー・トラコマチ ス核酸、およびそれに完全に相補的なヌクレオチド配列中に含まれるＤＮＡまた はＲＮＡ中に存在するヌクレオチド配列である。好ましくは、増幅オリゴヌクレ オチドが結合する核酸配列領域は密接に関連した細菌種には存在しない。しかし ながら、シー・トラコマチスの核酸の増幅を可能にし、あるいはシー・トラコマ チスの検出のために特異的なハイブリダイゼーションアッセイプローブの結合を 促進するためには、増幅オリゴヌクレオチドも、ヘルパーオリゴヌクレオチドも 、種特異的であることを必要としない。 よって、試験試料中の他の微生物からシー・トラコマチスを識別しうるオリゴ ヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブを開示することが本発明 のもう１つの目的である。これらのプローブはシー・トラコマチスの核酸に対し て高度の特異性を有し、シー・ニューモニエ（C.pneumoniae）またはシー・シッ タシ（C.psittaci）のごとき密接に関連した生物由来の核酸への同じプローブの ハイブリダイゼーションには不利なハイブリダイゼーション条件下でシー・トラ コマチスの核酸にハイブリダイゼーションするであろう。よって、標識プローブ の使用により、これらの生物を含む試験試料中のシー・トラコマチスの特異的検 出または定量が可能になる。これらのプローブを単独でハイブリダイゼーション アッセイに使用してもよく、また、ヘルパーオリゴヌクレオチドと組み合わせて 使用してもよい。未増幅標的核酸の検出にハイブリダイゼーションアッセイプロ ーブを直接使用してもよく、また、核酸増幅により得られたシー・トラコマチス のヌクレオチド配列を有する核酸を検出するためにこれを使用してもよい。 シー・トラコマチスの核酸に指向されたハイブリダイゼーションアッセイプロ ーブおよびヘルパーオリゴヌクレオチドの使用により、子宮頚管または尿道の綿 棒かきとり物あるいは他の試料由来の試験試料中のシー・トラコマチスの迅速、 特異的かつ再現性のある同定を可能にすることが本発明のもう１つの目的である 。 試験試料中のシー・トラコマチスの標的ヌクレオチド配列を有する核酸分子数 を増加させることにより、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ感度を上昇させ ることが本発明のもう１つの目的である。 シー・トラコマチスの核酸にハイブリダイゼーションしうるヘルパーオリゴヌ クレオチドを用いることにより、シー・トラコマチス特異的ハイブリダイゼーシ ョンアッセイプローブのその標的核酸へのハイブリダイゼーション率を向上させ 、また、得られたハイブリッドの安定性を向上させ、そのことにより標識プロー ブのその標的への結合を容易にする組成物を提供することが本発明のもう１つの 目的である。好ましい具体例の説明および最良のモードの定義 下記用語は、明細書中で特に示さないかぎり、以下に示す意味を有する。 「標的核酸」は、標的ヌクレオチド配列を有する１本鎖または２本鎖核酸を意 味する。 「オリゴヌクレオチド」は、長さ２ヌクレオチドよりも長い、好ましくは長さ １０ないし１００ヌクレオチド、最も好ましくは長さ１２ないし５０ヌクレオチ ドの１本鎖ヌクレオチドポリマーを意味する。かかるオリゴヌクレオチドはホス ホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、あるいは他の稀なまたは天然に存 在しない結合により結合されていてもよい。さらにそのうえ、オリゴヌクレオチ ドは普通でないヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分を有していてもよい。本 明細書定義のオリゴヌクレオチドは核酸、好ましくはＤＮＡであるが、ＲＮＡで あってもよく、あるいは共有結合したリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌク レオチドの組み合わせを有していてもよい。当業者に知られた方法、例えば、化 学合成または生化学的合成により、および例えば細菌またはレトロウイルスベク ターのような組み換え核酸分子からのインビトロまたはインビボ発現により、一 定配列のオリゴヌクレオチドプローブおよび増幅オリゴヌクレオチドを製造する ことができる。本開示により強調されるように、オリゴヌクレオチドは染色体Ｄ ＮＡまたはそのインビボ転写物からなるものではない。 「標的核酸配列」、「標的ヌクレオチド配列」または「標的配列」は、１本鎖 標的核酸分子のヌクレオチド配列およびそれに完全に相補的なデオキシリボヌク レオチドまたはリボヌクレオチド配列の全部または一部を含む特に望ましいデオ キシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を意味する。 「実質的に類似」のヌクレオチド配列とは、特定の核酸配列と比較した場合に 、同一のヌクレオチド配列、あるいは２０％未満のミスマッチ、欠失および／ま たは付加を有するヌクレオチド配列（ＲＮＡまたはＤＮＡ同等ヌクレオチドを除 く）である。実質的に類似のヌクレオチド配列は、標的核酸に相補的な８個未満 の付加ヌクレオチドを有するであろうし、リファレンスヌクレオチド配列よりも ４ヌクレオチド未満短いであろう。さらに、実質的に類似のヌクレオチド配列を 有するオリゴヌクレオチドは、厳密なハイブリダイゼーション条件下にて特定の 核酸配列に完全に相補的なヌクレオチド配列を有する核酸との安定なハイブリッ ドを形成しうる。 「厳密な」ハイブリダイゼーションアッセイ条件とは、特異的なハイブリダイ ゼーションアッセイプローブが標的核酸（好ましくは、シー・トラコマチスのｒ ＲＮＡまたはｒＤＮＡ）にハイブリダイゼーションすることができ、他の微生物 （例えば、クラミジア・ニューモニエおよびクラミジア・シッタシ）またはヒト のいずれか由来の試験試料中に存在する他の核酸とは有意にハイブリダイゼー ションしない条件をいう。ＧＣ含量およびプローブ長、ハイブリダイゼーション 温度、ハイブリダイゼーション試薬または溶液の組成、ならびに要求されるハイ ブリダイゼーション特異性の程度を包含するファクターに応じてこれらの条件を 変更できることが理解されるであろう。特に厳密なハイブリダイゼーション条件 の例は後の開示にある。 「プローブ」は、検出が必要な核酸配列に部分的または完全に相補的な配列を 有していて、厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれに安定にハイブリダイ ゼーションする１本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。群または種特異的プロー ブの場合、プローブは、厳密なハイブリダイゼーション条件下で標的核酸に安定 にハイブリダイゼーションする能力を有し、系統発生論的な群または種の外側に ある生物由来の核酸のごとき非標的核酸には安定にハイブリダイゼーションしな い。厳密なハイブリダイゼーション条件下でプローブに必要な特異性を変化させ ない限り、プローブは標的核酸に相補的でない領域を有していてもよいが、これ を必要とはしない。かかる相補的でない領域が存在する場合、それらはＲＮＡ転 写のための５'プロモーター配列および／または結合部位を有していてもよく、 また、プローブ上に触媒活性部位またはヘアピン構造のごとき所望２次構造また は３次構造、あるいはそれら両方を付与する配列を含んでいてもよい。プローブ が標的配列にハイブリダイゼーションしたことの検出または確認に使用できる放 射性同位元素、蛍光または化学発光部分のごときレポーター基部分で、酵素また は他のリガンドで、プローブを標識してもよい。プローブの１の用法はハイブリ ダイゼーションアッセイプローブとしての使用である。インビボまたはインビト ロ治療用オリゴヌクレオチドとして、あるいは病的な細胞、感染細胞または病原 性細胞において遺伝子転写、ｍＲＮＡスプライシングまたは翻訳をブロックまた は阻害するアンチセンス剤としてプローブを使用してもよい。 本開示に用いる語句、特定配列の群「から選択される配列を必須としてなる核 酸配列を有するプローブ（またはオリゴヌクレオチド）」は、厳密なハイブリダ イゼーション条件下において、基本的かつ新規な特性として、プローブが当該群 に含まれる核酸配列の１つに正確に相補的なヌクレオチド配列を有するヌクレオ チド配列領域において核酸と安定なハイブリッドを形成することを意味する。こ の定義における正確な相補性は対応ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を包含する。 「核酸ハイブリッド」または「ハイブリッド」は、好ましくは長さ１０ないし １００ヌクレオチト、最も好ましくは長さ１２ないし５０ヌクレオチドの２本鎖 水素結合領域を含む核酸構造を意味し、各鎖は互いに完全に相補的で、厳密なハ イブリダイゼーション条件下においてその領域は十分に安定であり、化学発光ま たは蛍光検出、オートラジオグラフィー、またはゲル電気泳動を包含する手段（ これらの手段に限らない）により検出される。かかるハイブリッドはＲＮＡ：Ｒ ＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、またはＤＮＡ：ＤＮＡ２本鎖分子を含みうる。 「相補的」は、２つの１本鎖核酸の類似領域のヌクレオチド配列または同じ１ 本鎖核酸の別の領域が、厳密なハイブリダイゼーション条件下にて、１本鎖がハ イブリダイゼーションして安定な２本鎖水素結合領域となること可能にするヌク レオチド塩基組成を有することを意味する。１本鎖領域のヌクレオチドの一続き の配列が一連の「正しい」水素結合塩基対を他の１本鎖領域のヌクレオチドの類 似配列とともに形成して、ＡがＵまたはＴと対になり、ＣがＧと対になる場合、 ヌクレオチド配列は「完全に」相補的である。 「保存的に修飾された変種」は、第１の核酸の第１のヌクレオチド配列領域に 相補的なヌクレオチド配列を有する核酸またはオリゴヌクレオチドを意味する。 ここに、第１のヌクレオチド配列領域は、第２の「リファレンス」核酸中に含ま れる第２のヌクレオチド配列領域に完全に相補的である。保存的に修飾された変 種は４個未満の付加ヌクレオチドを有し、あるいはリファレンス核酸よりも４ヌ クレオチド未満短い。かかる保存的に修飾された変種は、リファレンスヌクレオ チド配列よりも４ヌクレオチド以上長い５'側の相補的でないヌクレオチドを有 していてもよいことが理解されるであろう。保存的に修飾された変種は、厳密な ハイブリダイゼーション条件下で、シー・トラコマチスのヌクレオチド配列を有 する標的核酸領域と安定なハイブリッドを形成するであろう。 「増幅オリゴヌクレオチド」は、標的ヌクレオチド配列領域にハイブリダイゼ ーションでき、そのことにより核酸合成のためのプライマーとして、あるいは ＲＮＡ合成の開始のためのプロモーター鋳型（例えば、相補的な鎖の合成、その ことによる機能的プロモーター配列の形成のための）として、あるいはそれらの 両方として作用しうるオリゴヌクレオチドを意味する。ＲＮＡ合成を開始するた めに増幅オリゴヌクレオチドを設計する場合、オリゴヌクレオチドは、標的核酸 に相補的でないがＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６ ＲＮ Ａポリメラーゼ）によって認識されるヌクレオチド配列領域を有していてもよい 。増幅オリゴヌクレオチドは、プライマー伸長を防止または伸長量を減少させる ためにブロックされた３'末端を有していてもよく、有していなくてもよい。好 ましくは、本明細書定義の増幅オリゴヌクレオチドは長さ１２ないし１００ヌク レオチド、より好ましくは長さ約１５ないし５０ヌクレオチドである。 「核酸増幅」または「標的増幅」は、少なくとも１の標的核酸配列を有する核 酸分子の数を増加させることを意味する。 「アンチセンス」または「負のセンス」は、リファレンス核酸配列に相補的ま たは実質的に相補的な核酸配列を有することを意味する。 「センス」、「同じセンス」または「正のセンス」は、リファレンス核酸配列 と同一または実質的に同一の核酸配列を有することを意味する。 「ヘルパーオリゴヌクレオチド」は、通常には、標識ハイブリダイゼーション アッセイプローブとは異なる位置において標的核酸とハイブリダイゼーションし 、そのことにより、標識プローブのハイブリダイゼーション率が上昇、または標的 ：標識プローブのハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）が上昇、あるいはそれらの両 方が上昇するように設計された未標識プローブを意味する。発明の詳細な説明 本発明は、シー・トラコマチスの核酸の特異的検出のための増幅オリゴヌクレ オチド、ヘルパーオリゴヌクレオチドおよびハイブリダイゼーションアッセイプ ローブに指向される。本明細書に開示されクレイムされたすべてのオリゴヌクレ オチドは共通して、それらがシー・トラコマチスの核酸のオリゴヌクレオチド配 列領域に相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列領域を有するという 事実を共有している。ハイブリダイゼーション条件およびプローブ／プライマーの設計 本発明増幅オリゴヌクレオチドまたはハイブリダイゼーションプローブが、試 験試料中に存在する疑いのある他の非標的核酸よりもシー・トラコマチスのヌク レオチド配列を有する核酸に優先的にハイブリダイゼーションするように、ハイ ブリダイゼーション反応条件、最も重要にはハイブリダイゼーション温度および ハイブリダイゼーション溶液中の塩濃度を選択することができる。塩濃度の低下 および／または温度の上昇（厳密性の上昇と呼ばれる）により、２本鎖ハイブリ ッド分子において対になったヌクレオチド塩基間の水素結合が破壊されるため核 酸ハイブリダイゼーションの程度が減少する。このプロセスを融解と呼ぶ。 一般的に言えば、最も安定なハイブリッドは、最大数の一続きの完全にマッチ した（すなわち、水素結合した）ヌクレオチド塩基対を有するハイブリッドであ る。よって、通常には、かかるハイブリッドは、ハイブリダイゼーション条件の 厳密さが上昇した際に最後に融解すると考えられる。しかしながら、１個または それ以上のミスマッチした「正しくない」または不完全な塩基対を有する２本鎖 核酸領域（核酸のヌクレオチド配列における当該位置において弱い塩基対または 存在しない塩基対を生じる）は、比較的高い厳密性の条件下でもやはり十分に安 定で、試験試料中に存在する他の非標的核酸と交差反応することなく、ハイブリ ダイゼーションアッセイにおいて核酸ハイブリッドの検出を可能にする。 それゆえ、標的生物の核酸と非標的であるがその一方で密接に関連した生物の 核酸との間の配列の相違の程度、ならびに特定の増幅オリゴヌクレオチドまたは ハイブリダイゼーションプローブのヌクレオチド配列と標的核酸のヌクレオチド 配列との間の相補性の相違によって、プローブと標識間の１個またはそれ以上の ミスマッチは、必ずしも非標的核酸よりも標的核酸にハイブリダイゼーションす るオリゴヌクレオチドの能力を無に帰するものではない。 プローブ：標的ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ、一定の反応混合物中の２本鎖 分子の半分が１本鎖の変性状態となっている温度として定義される）と、試験試 料中に存在すると考えられるが検出する必要のない系統発生論的に最も密接に関 連した生物のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡとプローブ間に形成されるミスマッチした ハイブリッドのＴｍとの間の相違を最大にするように、本発明ハイブリダイゼー ションアッセイプローブを選定し、選択し、そして／または設計した。未標識増 幅オリゴヌクレオチドおよびヘルパーオリゴヌクレオチドは、本発明において有 用な標識ハイブリダイゼーションアッセイプローブのようなかかる極端な特異性 を必要としないが、一般的には、それらは、他の核酸よりも１またはそれ以上の 生物の標的核酸に優先的にハイブリダイゼーションするように、同様の方法で設 計される。 シー・トラコマチスおよびシー・シッタシおよびシー・ニューモニエのごとき 密接の関連した生物のｒＲＮＡのヌクレオチド配列は公表されたソースから得ら れ、あるいは当該分野においてよく知られた核酸配列決定法を用いて出願人によ り独自に決定された。例えば、Lane et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.82:6955(1985) 参照。 これらの種々の生物のｒＲＮＡ配列を並置比較することにより、出願人は、比 較的種間で異なる特定の不連続領域を見いだした。標的生物であるシー・トラコ マチスと「非標的」生物、例えば、シー・シッタシおよびシー・ニューモニエと の間で最高のヌクレオチド配列の相違を示した領域を、種特異的ハイブリダイゼ ーションアッセイプローブの設計のための可能性のある標的領域として選択した 。 推定上ユニークな可能性のある標的ヌクレオチド配列を単に同定することは、 当該配列を含むシー・トラコマチスのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに機能的に種特異 的ハイブリダイゼーションアッセイプローブをハイブリダイゼーションさせうる ことを保証するものではない。種々の他のファクターにより、種特異的プローブ に対する標的部位としての核酸の位置の適当性が決定されるであろう。例えば、 可能性のある標的ヌクレオチド配列のＧＣ含量の増加（したがって２本鎖プロー ブ：標的ハイブリッドの増加）は、一般的には、ハイブリッドの安定性およびＴ ｍを上昇させる。１種またはそれ以上の「非標的」生物と同じである配列領域中 の一続きのヌクレオチド数も安定性に影響し、よって、シー・トラコマチスの ｒＲＮＡに完全に相補的なプローブと非標的生物（複数）のｒＲＮＡヌクレオチ ド配列を有する核酸との間で部分的にミスマッチしたハイブイリッドのＴｍにも 影響する。よって、２つのハイブリッドの融解温度の相違が十分に大きくない場 合、通常には少なくとも２ないし５℃である場合、プローブは、ユニークな領域 を標的としているにもかかわらず種特異的でなくてもよい。 所望ハイブリダイゼーション温度およびハイブリダイゼーション溶液組成（例 えば、塩濃度）は、２本鎖ハイブリッドの安定性に大きく影響する２つの条件で ある。群または種特異的プローブを構築する際に、これらの条件を考慮しなけれ ばならない。ハイブリッド核酸の熱安定性は反応混合物のイオン強度に伴って上 昇する。一方、ホルムアミド、尿素、ジメチルスルホキシドおよびアルコール類 のような水素結合を破壊する化学試薬はハイブリッドの熱安定性を大きく低下さ せうる。 標的に対するプローブの特異性を最大にするために、高い厳密性の条件下で標 的にハイブリダイゼーションするように本発明の主題のプローブを設計した。か かる条件下で、高度の相補性を有するただ１本鎖核酸のみが互いにハイブリダイ ゼーションするであろう。かかる高度の相補性を有しない１本鎖核酸はハイブリ ッドを形成しない傾向があるだろう。したがって、アッセイ条件の厳密さ（すな わち、温度およびイオン強度）は、ハイブリッドを形成するための２つの核酸鎖 間に存在すべき相補性の程度を決定しうる。本発明に関しては、プローブと標的 核酸との間に形成されるハイブリッドと、プローブと存在する１本鎖非標的核酸 との間に形成される可能性のあるハイブリッドとの間の安定性の相違を最大にす るように厳密性を選択する。 非標的配列に対するＧおよびＣの豊富な相同領域を避け、できるだけ非標的配 列に対する不安定化ミスマッチを多く含むようにプローブを構築することにより 、そして非標的生物の配列に完全に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブ 長を最小にすることにより、正しいプローブの特異性を設計することができる。 標的核酸配列の長さ、したがってプローブ配列の全長も、特異性にとり重要で ある。いくつかの場合、特定の「可変」領域において、位置および長さの異なる 数個のヌクレオチド配列が存在する可能性があり、それらを種特異的プローブ標 的として用いてもよい。いくつかの場合、種特異的プローブを特定のｒＲＮＡ可 変領域に対して設計できない。なぜなら、配列領域がプローブにアクセス不可能 であるか、または他の理由による。完全には相補的でない核酸がハイブリダイゼ ーションすることは可能であるが、一般的には、完全に相同的な塩基配列の最長 部分がハイブリッドの安定性を決定するであろう。異なる長さで異なる塩基組成 のオリゴヌクレオチドプローブを用いてもよい。 ハイブリダイゼーションを阻害する強力な分子内構造を形成する標的領域はあ まり好ましくない領域である。同様に、過度の自己相補性を生じるプローブの設 計を避けるべきである。上で説明したように、ハイブリダイゼーションは、水素 結合した２本鎖ハイブリッドを形成する２つの相補的１本鎖核酸の会合である。 よって、２つの鎖の一方または両方が、全体的にまたは部分的に分子内または分 子間結合に関与している場合、新たな分子間プローブ：標的ハイブリッドの形成 に関与する可能性は少ない。例えば、リボゾームＲＮＡ分子は水素結合による非 常に安定な分子内ヘリックスおよび２次構造を形成することが知られている。プ ローブとのハイブリダイゼーションまで標的配列の重要な部分が１本鎖状態のま まであるようにハイブリダイゼーションアッセイを計画することにより、プロー ブと標的との間のハイブリダイゼーション率および程度を大いに向上させること ができる。このことを行う１の方法は、比較的分子内水素結合に関与しない配列 を標的ヌクレオチド配列として選択することによる。別法として、あるいはさら に、ハイブリダイゼーションアッセイプローブとのハイブリダイゼーションに使 用しやすい標的部位を作ることのできるヘルパーオリゴヌクレオチドとともに、 ハイブリダイゼーションアッセイプローブをプローブミックス中に使用してもよ い。かかるヘルパープローブは広く記載されている。 標的核酸に完全にマッチしたオリゴヌクレオチドの融解温度についての推定値 を提供する多くの公式が利用できる。１のかかる公式： Ｔｍ＝８１.５＋１６.６（ｌｏｇ₁₀［Ｎａ⁺］）＋０.４１（フラクションＧ＋Ｃ ） −（６００／Ｎ） ［式中、Ｎ＝ヌクレオチド数で示したオリゴヌクレオチド長］ は、約１４ないし７０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドのＴｍに関する 良好な推定値を提供する。かかる計算から、スクリーニング法を用いてＴｍの実 験的証明または「微調整」を行うことができる（ハイブリダイゼーションおよび オリゴヌクレオチドプローブに関するさらなる情報については、例えば、Sambro ok et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Sprong Harbor Labor atory Press 1989)参照、この文献（第１１章）を参照により本明細書に記載さ れているものとみなす）。また、この文献は、ハイブリッドのＴｍに対するミス マッチの影響についての推定も提供する。核酸の増幅 好ましくは、本発明の増幅オリゴヌクレオチドはオリゴデオキシヌクレオチド であり、核酸ポリメラーゼによる特異的プライマー伸長生成物の合成にための鋳 型としての使用に十分な長さである。プローブの設計について本当のことである が、反応温度、プライマーの構造および塩基組成、ならびにプライマーの用い方 を包含するいくつかのファクターについて最適プライマー長を考慮すべきである 。例えば、最適特異性に関しては、標的核酸配列の複雑さにもよるが、一般的に はオリゴヌクレオチドプライマーは少なくとも約１２ヌクレオチドを含むべきで ある。かかる特異性が必須でない場合、短いプライマーを使用してもよい。かか る場合、低温で反応を行って鋳型核酸との安定なハイブリッド複合体を形成する ことが望ましいかもしれない。 本発明増幅オリゴヌクレオチドと組み合わせて用いる核酸ポリメラーゼとは、 リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、あるいはそれらの両方を共 有結合核酸ポリマーまたは鎖にする化学的、物理的または生物学的な剤をいう。 核酸ポリメラーゼの例は、ＤＮＡ指向ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ指向ＤＮＡポ リメラーゼ、および／またはＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素である。 ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型に依存する様式で５'から３'方向の核酸合成を引き 起こす。２本鎖核酸における２つの鎖が逆方向であるので、この方向は、鋳型の ３'領域から鋳型の５'領域への方向である。ＤＮＡ指向ＤＮＡポリメラーゼの例 は、イー・コリ（E.coli）・ＤＮＡポリメラーゼＩ、サーマス・アクアチカス（ Thermus aquaticus）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）、およびバチ ルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）由来の耐熱性 ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ）である。ＲＮＡ指向ＤＮＡポリメラーゼの例は、 種々のレトロウイルス逆転写酵素、例えばＭＭＬＶ逆転写酵素またはＡＭＶ逆転 写酵素である。 大部分の核酸増幅反応の間において、核酸ポリメラーゼは、標的核酸を鋳型と して用いてプライマーの３'末端にヌクレオチド残基を付加し、かくして、標的 核酸の領域に部分的または完全に相補的なヌクレオチド配列を有する第２の核酸 鎖を合成する。多くの核酸増幅反応において、生じた２本鎖構造を含む２つの鎖 を化学的または物理的手段により分離して増幅反応が進行するようにしなければ ならない。別法として、新たに合成された鎖を消化することなく元の標的鎖の一 部または全部を消化する核酸分解酵素の使用により、新たに合成された鋳型鎖を 第２のプライマーまたはプロモーター−プライマーとのハイブリダイゼーション に利用可能とすることもできる。このようにして、当該プロセスを多サイクル繰 り返して行って、標的ヌクレオチド配列を有する多数の核酸分子を得ることがで きる。 第１または第２の増幅オリゴヌクレオチドのいずれか、あるいはそれらの両方 はプロモーター−プライマーであってもよい。通常には、かかるプロモーター− プライマーは、標的核酸分子またはプライマー伸長生成物の配列に相補的でない ヌクレオチド配列を含んでいる。これらの相補的でない配列は増幅オリゴヌクレ オチド上の相補的配列の５'側に存在していてもよく、さらに核酸ポリメラーゼ 作用により２本鎖が作られる場合にはＲＮＡ合成開始のための位置を提供しても よい。よって、用意したプロモーターが標的核酸配列の多数のＲＮＡコピーのイ ンビトロ転写を可能にするものであってもよい。本明細書中でプライマーという 場合、特に明確に示さないかぎり、プロモーター−プライマーのプライマー態様 を含む。 いくつかの増幅系において、例えば、Dattaguptaらの上記文献における増幅系 において、増幅オリゴヌクレオチドは鎖の置換を促進する５'非相補的ヌクレオ チドを含んでいてもよい。さらにそのうえ、５'エキソヌクレアーゼ活性を有す る核酸ポリメラーゼと組み合わせて使用する場合、増幅オリゴヌクレオチドは酵 素消化を回避するためにその５'末端に修飾を有していてもよい。別法として、 例えば、５'ヌクレアーゼドメインを伴わない活性ポリメラーゼフラグメントを 生じるプロテアーゼで処理することにより核酸ポリメラーゼを修飾して５'エキ ソヌクレアーゼ活性を除去してもよい。かかる場合、オリゴヌクレオチドをその ５'末端において修飾する必要はない。オリゴヌクレオチドの調製 オリゴヌクレオチドは共有結合したヌクレオチドサブユニットからできている 。ヌクレオチドサブユニットの糖基はリボース、デオキシリボース、またはＯ− メチルリボースのごときそれらの修飾誘導体であってよい。ヌクレオチドサブユ ニットは、例えば、ホスホジエステル結合、修飾結合によって、あるいはオリゴ ヌクレオチドのハイブリダイゼーションを妨害しない非ヌクレオチド部分によっ て結合されていてもよい。修飾結合は、標準的なホスホジエステル結合がホスホ オチオエート結合またはメチルホスホネート結合のごとき別の結合で置き換えら れた結合を包含する。上述のごとく、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ として使用する場合、好ましくは、オリゴヌクレオチドはアクリジニウムエステ ルまたは放射性同位元素のごときレポーター基を含んでいて標的配列へのプロー ブのハイブリダイゼーションの同定を容易にする。 当該分野で知られた方法により、すべての本発明増幅オリゴヌクレオチドを容 易に調製することができる。好ましくは、固相法を用いてプライマーを合成する 。例えば、Carruthersらは、標準的なホスホラミダイト固相化学を用いてホスホ ジエステル結合によりヌクレオチドを結合することを記載している（Methods in Enzymology,第143巻,287ページ(1987)）。同様に、Bhattは、ホスホロチオエー ト結合を含むオリゴヌクレオチドの合成方法を記載している（本発明と共有のBh attの米国特許第５,２５２,７２３号）。また、KlemらのＰＣＴ出願ＷＯ／９２ ／１７８６４には、メチルホスホネート結合を含む異なる結合を有するオリゴヌ クレオチドの合成が記載されている。これら３つの文献を参照により本明細書に 記載されているものとみなす。さらに、オリゴヌクレオチドの有機合成法は当業 者に知られており、すでに参照により本明細書に記載されているものとみなした Sambrookらの上記文献に記載されている。 ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、増幅オリゴヌクレオチドまたはヘ ルパーオリゴヌクレオチドであるにせよ、すべての本発明オリゴヌクレオチドを 化学基で修飾して、その品質を向上させ、あるいは増幅生成物の特徴づけを容易 にすることができる。例えば、ある種のポリメラーゼの核酸分解活性に対してオ リゴヌクレオチドを耐性とするホスホロチオエートまたはメチルホスホネート基 を有するオリゴヌクレオチドのごとき骨格を修飾されたオリゴヌクレオチドは、 増幅または他の反応におけるかかる酵素の使用を可能にする。修飾のさらにもう １つの例は、プライマーのハイブリダイゼーションまたは伸長を妨害しないヌク レオチド間またはオリゴヌクレオチド末端に含まれる非ヌクレオチドリンカー（ 例えば、Arnoldらの欧州特許出願第８８３０８７６６−０号、参照により本明細 書に記載されているものとみなす）の使用を包含する。増幅オリゴヌクレオチド は所望の修飾および天然ヌクレオチドの混合物を含んでいてもよく、さらにリボ ヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとの混合物を含んでいてもよい。 本発明と共有のMcDonoughらの米国特許出願第０７／９２５,４０５号（参照に より本明細書に記載されているものとみなす）により記載されたように、増幅オ リゴヌクレオチドの３'末端をブロックしてＤＮＡ合成を阻害または防止しても よい。３'をブロックされた異なるプロモーター−プライマーの混合物、または ３'をブロックされたプロモーター−プライマーと３'をブロックされていないプ ロモーター−プライマーとの混合物は、該文献に記載されたように、核酸増幅効 率を向上させうる。 上に開示したように、オリゴヌクレオチドの５'末端を修飾して、ある種の核 酸ポリメラーゼに存在する５'−エキソヌクレアーゼ活性に耐性としてもよい。 例えば、すでに参照により本明細書に記載されているものとみなした「非ヌクレ オチド結合試薬（Non-Nucleotide Linking Reagents）」というタイトルのArnol dらの上記特許に記載されたような方法を用いて、非ヌクレオチド基をプライマ ーの末端５'ヌクレオチドに付加することにより、かかる修飾を行うことができ る。シー・トラコマチスのｒＲＮＡおよびｒＤＮＡの修飾 本発明増幅オリゴヌクレオチドは特定のシー・トラコマチスの２３Ｓまたは１ ６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列あるいはそれらのｒＤＮＡ対応物に指向されて おり、少なくとも１種のシー・トラコマチス特異的標的ヌクレオチド配列領域の 増幅を起こさせる。本明細書記載の増幅オリゴヌクレオチドは２つのセットの増 幅オリゴヌクレオチドを含む。第１のセットの増幅オリゴヌクレオチドのメンバ ーは、下記ヌクレオチド配列： ２３Ｓ ｒＲＮＡ特異的 １６Ｓ ｒＲＮＡ特異的 のうちの１つを有するｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ領域（あるいはチミンのかわりに ウラシルを有するかかる配列のＲＮＡバージョン）とハイブリダイゼーションす るであろう。 これらの増幅オリゴヌクレオチドの好ましい具体例は下記配列： ２３Ｓ ｒＲＮＡ特異的 １６Ｓ ｒＲＮＡ特異的 あるいはチミンのかわりにウラシルを有するこれらの配列のＲＮＡバージョンを 有するか、またはこれらを必須としてなる。これらのオリゴヌクレオチドは、Ｒ ＮＡポリメラーゼに結合し、標的核酸を鋳型として用いるＲＮＡ転写を指令しう るプロモーター配列を含むさらなる非相補的塩基をその５'末端に有していても よい。 好ましくは、配列番号：１２を有する核酸領域を標的とする増幅オリゴヌクレ オチドを配列番号：１３および／または１４の領域を標的とする増幅オリゴヌク レオチドと組み合わせて使用し、配列番号：１５を有する核酸領域を標的とする 増幅オリゴヌクレオチドを配列番号：１６を有する核酸領域を標的とする増幅オ リゴヌクレオチドと組み合わせて使用し、配列番号：４５を有する核酸領域を標 的とする増幅オリゴヌクレオチドを配列番号：５１を有する核酸領域を標的とす る増幅オリゴヌクレオチドと組み合わせて使用する。よって、好ましい具体例に おいて、配列番号：４の増幅オリゴヌクレオチドを配列番号：５および／または ６の増幅オリゴヌクレオチドとともに使用し、配列番号：７の増幅オリゴヌクレ オチドを配列番号：８の増幅オリゴヌクレオチドとともに使用し、配列番号：４ ４の増幅オリゴヌクレオチドを配列番号：５０の増幅オリゴヌクレオチドととも に使用する。 第２のセットを含む増幅オリゴヌクレオチドは特定のシー・トラコマチスの２ ３Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列、またはそれらのｒＤＮＡ対応物に指向されて おり、少なくとも１の標的ヌクレオチド配列領域と境を接している。これらの増 幅オリゴヌクレオチドを、第１のセットの増幅オリゴヌクレオチドと同じ方法で 使用してもよく、例えば、プライマーペアー、ネスティッドプライマーペアーの メンバーとして、あるいはＲＮＡポリメラーゼ開始部位として使用してもよい。 しかしながら、それらは、後に詳述する等温鎖置換（isothermal strand displa cement）核酸増幅系における好ましい使用方法において第１のセットのメンバー と異なる。これらのオリゴヌクレオチドは、下記ヌクレオチド配列： あるいはチミンのかわりにウラシルを有するかかる配列のＲＮＡバージョンの１ つにハイブリダイゼーションするであろう。 第２のセットの増幅オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの好ましい 具体例は下記ヌクレオチド配列： ならびにチミンのかわりにウラシルを有するこれらの配列のＲＮＡバージョンを 有する。最も好ましい具体例において、これらのオリゴヌクレオチドはさらなる 非相補的ヌクレオチトをその５'末端に有し、プライマー伸長生成物の置換をさ らに促進する。 すべての本発明増幅オリゴヌクレオチドは、未修飾ヌクレオチド配列、あるい は上記配列に対して欠失または付加を含む配列を有していてもよい。しかしなが ら、さらに、あるいはこれとは別に、増幅オリゴヌクレオチドは、ブロックされ 、そして／または修飾された３'および／または５'末端、あるいはＲＮＡポリメ ラーゼにより認識される特異的ヌクレオチド配列（例えば、Ｔ７、Ｔ３またはＳ Ｐ６ＲＮＡポリメラーゼの対するプロモーター配列）の付加、を包含する付加、 ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写の開始または伸長を引き起こしまたは促進 する配列領域の付加、あるいは分子内塩基対を提供し核酸の２次もしくは３次構 造の形成を促進しうる配列領域の付加を包含する付加（これらの付加に限らない ）を有していてもよい。 KacianおよびFultz（上記文献）、Dattaguptaら（上記文献）、およびSninsky らの米国特許第５,０７９,３５１号（いずれも参照により本明細書に記載されて いるものと見なす。それらの最初の２つは本発明と共有である）により記載され たポリメラーゼ連鎖反応またはＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼおよび ＲＮＡｓｅ Ｈ活性を用いる核酸増幅法において増幅オリゴヌクレオチドを使用 する。 増幅された標的配列を検出するために種々の方法が使用できる。例えば、ヌク レオチド基質またはプライマーは、新たに合成されるＤＮＡ中に取り込まれる検 出可能標識を含んでいてもよい。次いで、得られた標識増幅生成物を未使用ヌク レオチドまたはプライマーから分離することができ、分離された生成物フラクシ ョン中の標識を検出する。 有用な検出可能標識として役立ちうる物質は当該分野においてよく知られてお り、放射性同位元素、蛍光化合物、化学発光化合物、発色基、ならびに直接検出 できないが標識された形態の特異的結合パートナー、例えば、それぞれアビジン および抗体との反応により検出されうるビオチンおよびハプテンのごときリガン ドを包含する。 別のアプローチは、検出可能な核酸プローブとのハイブリダイゼーションによ る増幅生成物を検出し、得られた標識ハイブリッドを慣用的方法で測定すること である。好ましい使用において、化学発光アクリジニウムエステル標識核酸プロ ーブを標的配列にハイブリダイゼーションさせ、未ハイブリダイゼーションプロ ーブ上に存在するアクリジニウムエステルを加水分解し、次いで、残存アクリジ ニウムエステルから生じる化学発光をルミノメーターで測定することにより生成 物をアッセイすることができる。例えば、Arnoldらの上記文献、ＰＣＴ出願ＵＳ ８８／０２７４６、ArnoldおよびNelsonの米国特許第５,２８３,１７４号、なら びにNelsonらの「非アイソトープＤＮＡプローブ法（Non-Isotopic DNA Probe T echnologies）」（Academic Press,San Diego（KRICKA編 1992年）参照（これら の文献を参照により本明細書に記載されているものとみなし、はじめの２つは本 発明と共有である）。シー・トラコマチスのｒＲＮＡおよびｒＤＮＡに対するオリゴヌクレオチドハイ ブリダイゼーションアッセイプローブ 本明細書に開示されクレイムされているオリゴヌクレオチドハイブリダイゼー ションアッセイプローブは、系統発生論的に密接な関連のある細菌種、好ましく は、シー・シッタシおよびシー・ニューモニエの核酸よりも、シー・トラコマチ スのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡヌクレオチド配列を含む標的核酸に優先的にハイブ リダイゼーションすることができる。シー・トラコマチスおよび上記系統発生論 的に密接に関連した種のリボゾームＲＮＡの対応領域のヌクレオチド配列の比較 に基づいて、これらのハイブリダイゼーションアッセイプローブを設計し、選択 および／または選定した。 本発明ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、下記標的ｒＤＮＡヌクレ オチド配列： またはそれらに完全に相補的なヌクレオチド配列、 あるいはチミンのかわりにウラシルを有するそれらのＲＮＡバージョン に相補的である。 これらのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブの好ま しい具体例は下記ヌクレオチド配列： およびチミンのかわりにウラシルを有するそれらのＲＮＡバージョン を有する。 好ましくは、本発明オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプロ ーブを、放射性同位元素、蛍光もしくは化学発光部分、酵素もしくは他のリガン ドのごとき検出可能標識で標識するが、それらの標識は、プローブが標的配列に ハイブリダイゼーションしたことの検出または確認に使用することができるもの である。出願人は、標識として化学発光アクリジニウムエステルの使用を好む。 本発明と共有であり、参照により本明細書に記載されているものとみなされるAr noldらの米国特許第５,１８５,４３９号参照。相補的部分における水素結合によ る２つの鎖のアニーリングを可能にするのに適したハイブリダイゼーション条件 下にて標的配列を有する核酸を含有する疑いのある試料とアッセイプローブを混 合する。プローブを１またはそれ以上の未標識ヘルパーオリゴヌクレオチドと組 み合わせて、標的クラミジア・トラコマチスのヌクレオチド配列を有する核酸へ の結合を容易にしてもよい。次いで、プローブは試料中に存在する標的核酸にハ イブリダイゼーションする。ヒドロキシアパタイト吸着および放射活性モニタリ ングのごとき当該分野でよく知られた種々の方法によって、得られたハイブリッ ド２本鎖を分離し検出することができる。本発明と共有であり、参照により本明 細書に記載されているものとみなされるArnoldらの米国特許第５,２８３,１７４ 号に開示されたような、未ハイブリダイゼーションプローブ上に存在する標識を 選択的に分解し、次いで、残存するハイブリダイゼーションしたプローブに結合 した標識量を測定することを含む方法も、これらの方法に包含される。出願人は この後者の方法を好む。シー・トラコマチスの検出に使用するヘルパーオリゴヌクレオチド 特異的ヘルパーオリゴヌクレオチドを用いて、標的核酸へのハイブリダイゼー ションアッセイプローブのハイブリダイゼーションを容易にした。ヘルパーオリ ゴヌクレオチドは、本願と共有のHoganおよびMillimanの米国特許第５,０３０, ５５７号に記載されており、これを参照により本明細書に記載されているものと みなす。シー・トラコマチスの特異的検出を容易にする特異的ヘルパーオリゴヌ クレオチドは、下記シー・トラコマチスのヌクレオチド配列： およびチミンをウラシルで置換したそれらのＲＮＡバージョン に相補的なヌクレオチド配列を有する。 このヘルパーオリゴヌクレオチドの好ましい具体例は、下記ヌクレオチド配列 ： を有するオリゴヌクレオチドである。 一般的には、厳密なハイブリダイゼーション条件下でヘルパーオリゴヌクレオ チドを用いることができるが、必ずしもそれらの選択性において種特異的である とは限らない。すなわち、ヘルパーオリゴヌクレオチドに対する標的ヌクレオチ ド配列は、必ずしも種シー・トラコマチスに対するユニークなものであるとは限 らない。 好ましくは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブを増幅オリゴヌクレオ チドと組み合わせて用いることができ、さらにシー・トラコマチスの検出用ヘル パーオリゴヌクレオチドとともに用いることができる。好ましい組み合わせにお いて、示されたヌクレオチド配列を有する本発明オリゴヌクレオチドを下記組み 合わせにおいてシー・トラコマチスの検出のために使用する。 シー・トラコマチス増幅用プライマー配置において用いる増幅オリゴヌクレオチ ドの好ましい使用方法 すべての本発明増幅オリゴヌクレオチドを上記方法および下記実施例に開示の ごときシー・トラコマチス核酸の増幅のための多くの核酸増幅法と組み合わせて 用いることができるが、好ましい具体例において、本願と共有で参照により本開 示の一部とされるDattaguptaらの上記文献に開示されたように、リボゾームヌク レオチド配列番号：３０ないし４２を有する核酸を標的とする増幅オリゴヌクレ オチドをプライマー配置（primer array）において一緒に使用する。そこに開示 された修飾法によれば、サーモサイクリングまたは各プライマー伸長反応後の２ つの鎖の一方の分解を必要とせずに、プライマー配置を用いて１つの標的核酸配 列を増幅することができる。 好ましい使用において、配列番号：１７から２９までを有する増幅オリゴヌク レオチドは、５'から３'方向のエキソヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラー ゼと組み合わせて使用するプライマー配置を含む。最初の標的核酸（シー・トラ コマチスのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ）に相補的なヌクレオチド配列を有する第１ のサブセットのプライマー（配列番号：１７〜２３を有する）およびシー・トラ コマチスの標的ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡの領域の同じセンスのヌクレオチド配列 を有する第２のサブセットの各プライマー（配列番号：２４〜２９を有する）か らプライマー配置を作る。これら２つのサブセットのプライマーを、それぞれ相 補性プライマーおよびセンスプライマーという。各プライマーのヌクレオチド配 列は鋳型の正しい配列を反映している必要はないが、一定の増幅条件下で鋳型鎖 と安定なハイブリッドを形成できなくてはならない。新たに形成された各プライ マー伸長生成物は、いったん置換されると、それ自身さらなる核酸合成のための 鋳型として作用することができる。そのうえ、当該方法に用いる核酸ポリメラー ゼが一定ハイブリダイゼーションおよび鎖置換温度において活性があるかぎり、 その一定温度および反応条件において増幅反応が起こりうる。 このプライマー配置の増幅オリゴヌクレオチドをDattaguptaらの上記文献の好 ましい方法に使用する場合、ハイブリダイゼーションした相補的プライマー間の 距離が好ましくは１ないし２００ヌクレオチド、最も好ましくは２ないし１０ヌ クレオチドとなるように、相補的サブセットのプライマーの各メンバーは標的シ ー・トラコマチス核酸のあらかじめ決められた位置にハイブリダイゼーションす る。適当な反応条件下での核酸ポリメラーゼ（好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼ ）およびヌクレオチド三リン酸（好ましくは、デオキシリボヌクレオチド三リン 酸）の添加により、プライマー配置を含むオリゴヌクレオチドの３'末端へのヌ クレオチド付加が開始しうる。 理論に拘束されることを望むのではないが、出願人は、この増幅反応は以下の 様式で進行すると信ずる。形成期の核酸鎖が別のプライマーが元々ハイブリダイ ゼーションしていた位置まで伸長する場合（そして今度はそこから第２の形成期 の鎖が伸長する）、新たに形成された鎖は、しばしば、第２の鎖の５'末端にお いて第２の鎖と置換し、かくして、第１の形成期の鎖のさらなる伸長のための鋳 型としてその下に存在する標的核酸鎖を利用可能とする。一方、第２の形成期の 鎖は伸長に伴って第３の形成期の鎖と置換し、そのようなことが続いて起こって 、存在する相補的プライマーと同数の形成期の鎖が生じることとなる。増幅が望 まれる標的ヌクレオチド配列の部分の３'側（標的核酸に対して）の標的核酸に 結合するようにこれらすべてのプライマーを設計する。 形成期の鎖が標的ヌクレオチド配列を通過して伸長した場合、それらはプライ マー配置の「センスプライマー」サブセットのためのハイブリダイゼーション基 質を提供するヌクレオチド配列を含むであろう。また、同じ極性のプライマーが １ないし２００ヌクレオチド離れて存在するようにこれらのプライマーを設計す る。より好ましくは、１ないし１０ヌクレオチド離れて存在するようにプライマ ーを離す。相補的プライマーと同様、これらのプライマーはある種の伸長および 鎖置換を受けるというのが出願人の考えである。相補的プライマーおよびセンス プライマーのサブセットの伸長と鎖置換とが一緒になった効果は、反応混合物中 の標的ヌクレオチド配列を有する核酸数の非常に迅速な増加を引き起こす。 各プライマーのセットのメンバーは核酸鎖の鋳型依存的合成のための開始点と して用いられ、それらは同じセンスの隣のプライマーの伸長により生じる合成鎖 の置換を促進すると考えられる。よって、鎖置換および核酸合成は１工程で行わ れると考えられる。このことは驚くべき知見であり、出願人は、その工程が進行 する正確な機構をはっきりと知らない。 核酸合成中の鎖置換を引き起こすためには単一センスの２つのプライマーのみ が必要であるが、好ましくは、相補的なプライマーおよびセンスプライマーの両 方を含むプライマー配置を用いて最初の核酸鋳型およびその相補鎖の両方を増幅 し、標的核酸配列を有する核酸の指数的増幅を引き起こす。 好ましくは、この方法に用いる核酸ポリメラーゼは５'エキソヌクレアーゼ活 性を欠くものであり、イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント のごとき酵素が作動するよりも高温で当該方法を行う。反応は３７℃よりも４３ ℃で効果的に行われる。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは当該分野において知られて おり（例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよびバチルス・ステアロサーモフィ ルス由来のＤＮＡポリメラーゼ）、５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を欠くこれ らの酵素のクレノウ−タイプの蛋白分解フラグメントが作られ、報告されている 。本発明増幅オリゴヌクレオチドと組み合わせてこの増幅方法を用いた場合の最 適効率は、５０℃ないし７０℃の間の温度で得られる。 配列番号：１７から２９までの配列を有することにより例示されるすべての増 幅オリゴヌクレオチドは、好ましい方法を用いる場合でさえも、標的シー・トラ コマチス核酸の増幅には１のプライマー配置中で一緒に使用される必要がない。 好ましくは、このプライマー配置から選択された少なくとも２個の相補的プライ マーおよび少なくとも２個のセンスプライマーを一緒に用いて、最初の鋳型核酸 上に含まれる標的配列およびその相補鎖を増幅する。しかしながら、増幅の程度 はプライマー数の増加とともに増大することが見いだされており、相補的プライ マーのセットおよびセンスプライマーのセットはそれぞれ２個よりも多いプライ マーを含む。最も好ましい具体例において、少なくとも４個のセンスプライマー および４個の相補的プライマーを用いるか、あるいは少なくとも７個のセンスプ ライマーおよび少なくとも６個の相補的プライマーを用いる。 本発明の具体例についての以下の実施例は説明のためだけのものであり、本発 明の範囲を何ら限定するものでない。実施例１ ： この実施例において、異なる量の精製シー・トラコマチス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ −８８６）のｒＲＮＡを、シー・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的なヌク レオチド配列を有する負のセンスの２個のオリゴヌクレオチドを用いて増幅した 。シー・トラコマチスから標的２３Ｓ ｒＲＮＡを得て（Gilsen et al.,Biochem istry 13:2633(1974)参照）、バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８.３）、３７.５ｍＭ ＫＣｌ、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ＤＴＴ）中 に希釈した。それぞれ配列番号：４のヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチドの ５'末端に共有結合した配列番号：４３のヌクレオチド配列のＴ７ ＲＮＡポリメ ラーゼプロモーターを含む２種のプロモーター−プライマーを合成した。 遊離の３'末端ヒドロキシル基を有する該プロモーター−プライマーの１つを 合成し、１の反応につき２ピコモル使用した。プライマー伸長をブロックまたは 減少させるために３'末端に共有結合したアルカンジオール基を有する第２のプ ロモーター−プライマーを合成し、１の反応につき１３ピコモル使用した。プラ イマーおよび種々の量の標的核酸を９５℃で１５分加熱し、次いで４２℃まで冷 却し、次いで９００ユニットのMoloney Murine白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）の逆 転写酵素および４００ユニットのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを溶液に添加した。 最終増幅混合物は５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８.５）、３５ｍＭ 塩化カ リウム、４ｍＭ ＧＴＰ、４ｍＭ ＡＴＰ、４ｍＭ ＵＴＰ、４ｍＭ ＣＴＰ、 １ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＴＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、１ｍＭ ｄＧＴＰ、 ２０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２０ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システインおよび５％グ リセロールを含んでいた。４２℃で２時間インキュベーション後、配列番号：２ の配列を有する未標識ヘルパープローブを含有するプローブミックス中の配列番 号：１の配列を有するアクリジニウムエステル標識プローブと１００μｌの増幅 反応混合物とのハイブリダイゼーションにより、増幅をアッセイした。０.０５ Ｍ コハク酸リチウム（ｐＨ５）、０.６Ｍ ＬｉＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ラウリ ル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、１０ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、 １０ｍＭ エチレングリコールビス（ベーターアミノエチルエステル）Ｎ,Ｎ,Ｎ ',Ｎ'四酢酸（ＥＧＴＡ）を含有する溶液中、６０℃で１５分ハイブリダイゼー ションを行った。０.１５Ｍ 四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８.５）、１％ ℃で５〜７分インキュベーションし、次いで室温まで冷却し、次いでGen-Probe ルミノメーターは２つの試薬を自動的に注入し、第１の試薬は１ｍＭ硝酸および ０.１％過酸化水素を含み、第２の試薬は１Ｎ水酸化ナトリウムを含んでいた。 アッセイ結果は相対光ユニット（ＲＬＵ）で示され、それはルミノメーターによ り検出された光子数の測定値である。各反応を３系で行い、結果を下に示す。 これらのデータは、少なくとも０.０２５ｐｇ程度のシー・トラコマチス核酸 の増幅が成功し、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいてバックグラウン ドの６００倍以上のシグナルレベルで検出が可能であることを示す。実施例２ ： この実施例において、同じヌクレオチド配列の２種のプロモーター−プライマ ーを再度使用した。増幅およびハイブリダイゼーション反応条件は本質的に実施 例１と同じであるが、以下の相違があった。 配列番号：４３のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を５'末端に、そ して配列番号：７のヌクレオチド配列の標的ハイブリダイゼーション領域を３' 末端に有する各プロモーター−プライマーを合成した。遊離の３'−ヒドロキシ ル基を有する１のプロモーター−プライマーを合成し、１の反応につき２ピコモ ル使用した。３'−アルカンジオール修飾基を有するもう一方のプロモーター− プライマーを合成し、１の反応につき１３ピコモル使用した。増幅条件は実施例 １記載のものと同じであった。４２℃で２時間インキュベーション後、２０μｌ の増幅反応物を、配列番号：３のヌクレオチド配列のアクリジニウムエステル標 識プローブを用いてアッセイした。標的核酸を含有する反応物３系で反応させ、 負の対照を２系で反応させた。 表２：配列番号：７の標的結合ヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを 用いるシー・トラコマチス ＲＮＡの増幅、次いで、配列番号：３のヌクレオト ド配列のプローブによる検出 実施例３： この実施例は、逆方向のプライマーおよびプロモーター−プライマーを用いる シー・トラコマチス ｒＲＮＡの増幅を示す。増幅およびハイブリダイゼーショ ン反応条件は本質的に実施例１に記載したものと同じであるが、以下の変更を行 った。配列番号：４のヌクレオチド配列の標的結合配列領域の５'末端にＴ７プ ロモーター配列（配列番号：４３）を有する１のプロモーター−プライマーを合 成した。配列番号：５または配列番号：６のいずれかの配列を有するプライマー １５ｐｍｏｌを含有する反応物において、１の反応につきこのプロモーター−プ ライマーを１５ｐｍｏｌ用いた。４２℃で２時間インキュベーション後、実施例 １に記載のごとく、配列番号：１のアクリジニウムエステル標識プローブおよび 配列番号：２の未標識ヘルパーオリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼーシ ョンにより２０μｌの反応物をアッセイした。標的含有反応物の反応を３系で行 い、標的不含対照の反応を２系で行った。結果をＲＬＵで下に示す。 表３：配列番号：４のプロモーター−プライマーおよび配列番号：５または配列 番号：６のプライマーを用いるシー・トラコマチス ｒＲＮＡの増幅、次いで、 配列番号：１のプローブでの検出 実施例４： 配列番号：４からなり、５'末端に実施例１のＴ７プロモーター配列を有する １５ｐｍｏｌのプロモーター−プライマー、ならびに配列番号：６の配列を有す る１５ｐｍｏｌのプライマーを用いて異なる量のシー・トラコマチス ｒＲＮＡ を増幅することにより、増幅および検出系の感度を調べた。増幅およびハイブリ ダイゼーション反応を本質的に実施例１と同様に行った。増幅反応後、実施例１ に記載のごとく、配列番号：１のアクリジニウムエステル標識プローブおよび配 列番号：２の未標識ヘルパーオリゴヌクレオチドを用いて１００μｌの増幅反応 物をアッセイした。２系または３系で反応を行い、結果を下に示す。結果を実施 例５で論じる。 表４：シー・トラコマチス ＲＮＡの増幅、次いで、配列番号：１のプローブで の検出 実施例５： 下記の相違を除き、本質的に実施例１と同様に増幅およびハイブリダイゼーシ ョン反応を行った。配列番号：７の配列を有し、５'末端に実施例１のＴ７プロ モーター配列を含むプロモーター−プライマー、ならびに配列番号：８のプライ マーを用いてシー・トラコマチス ｒＲＮＡを増幅した。配列番号：３のアクリ ジニウムエステル標識プローブを用いて１μｌの増幅核酸をアッセイした。 表５：配列番号：７の配列を含むプロモーター−プライマーおよび配列番号：８ からなるプライマーを用いるシー・トラコマチス ｒＲＮＡ増幅、次いで、配列 番号：３からなるプローブの検出 この実験および先の実験から得られたデータは、５'末端に結合したＴ７プロ モーターヌクレオチド配列を含む配列番号：４の標的結合領域を有するプロモー ター−プライマーを配列番号：５または配列番号：６と対にして用いて増幅し、 その後、配列番号：１の標識プローブおよび配列番号：２のヘルパーオリゴヌク レオチドを用いて検出することにより、あるいはＴ７プロモーター配列を含む配 列番号：７のプライマーを配列番号：８と対にして用いて、次いで配列番号：３ のプローブを用いて検出することにより、シー・トラコマチス ｒＲＮＡが検出 されたことを示す。実施例６ ： この実施例は、増幅および検出アッセイの反応性および特異性を示す。すべて の既知の異なるシー・トラコマチス血液型亜型からリボゾームＲＮＡを単離精製 した。５'末端の共有結合した実施例１のＴ７プロモーター配列を有する配列番 号：４のプロモーター−プライマーを１の反応あたり３０ｐｍｏｌ、ならびに配 列番号：６のプライマーを１の反応あたり３０ｐｍｏｌを用いてこれらのｒＲＮ Ａ種を増幅した。実施例１記載の増幅混合物を用いて、０.０５ｐｇのｒＲＮＡ を含有する単一の反応物および０.００５ｐｇのｒＲＮＡを含有する２系の反応 物で反応を行った。試料を９５℃で５分間加熱し、次いで４２℃まで冷却し、９ ００ユニットのＭＭＬＶ逆転写酵素および４００ユニットのＴ７ ＲＮＡポリメ ラーゼを各反応物に添加した。４２℃で２時間インキュベーション 後、配列番号：１のアクリジニウムエステル標識ハイブリダイゼーションアッセ イプローブおよび配列番号：２の未標識ヘルパープローブを用い、実施例１記載 のハイブリダイゼーション条件を用いて１００μｌの増幅核酸を検出した。結果 をＲＬＵで示す。 表６：配列番号：６のＴ７プロモータープライマーを有する配列番号：４のプロ モータープライマー、配列番号：１の標識プローブおよび配列番号：２のヘルパ ープローブを用いる、異なる血液型亜型のシー・トラコマチス ｒＲＮＡの増幅 および検出 データは、増幅オリゴヌクレオチドおよびプローブによりすべての血液型亜型 のシー・トラコマチスが増幅され検出されたことを示す。そのうえ、細胞１個あ たり約２０００コピーの２３Ｓ ｒＲＮＡが存在すると考えられる。このことは 、細胞１個あたり約３ｘ１０^-21モルの２３Ｓ ｒＲＮＡとなる。この実施例は、 本発明増幅オリゴヌクレオチドを用いると３ｘ１０^-21モルのｒＲＮＡを検出で きることを示すので、これらの増幅オリゴヌクレオチドは１つの試料につき１個 のクラミジア・トラコマチスのｒＲＮＡ標的ヌクレオチド配列を増幅できること が理解されよう。このことは、ゲノム（リボゾームよりもむしろ）の核酸配列に 指向されたプライマーの増幅感度よりも明らかに優れている。実施例７ ： この実施例において、実施例６に示す増幅オリゴヌクレオチドを用いて３ｘ１ ０^-20モルのシー・トラコマチス、シー・ニューモニエまたはシー・シッタシ由 来の精製ＲＮＡを個々に増幅し、次いで、上記のごとく配列番号：１のプローブ で検出を行った。データは、クラミジアの密接に関連した種由来のＲＮＡはシー ・トラコマチスの検出が可能な条件下では検出されなかったことを示す。また、 結果は、実施例６に示すように鋭敏な感度でシー・トラコマチスの各既知血液型 亜型を検出しうる同一の増幅オリゴヌクレオチドは、シー・トラコマチスの核酸 およびその密接な既知系統発生論的近縁種クラミジア・シッタシおよびクラミジ ア・ニューモニエの核酸間の識別も可能であることを示す。 表７：配列番号：４および６の配列を含むプライマーでの増幅、次いで、配列番 号：１のプローブでの特異性 実施例８： この実施例は、配列番号：３０〜４２の標的ヌクレオチド配列に結合しうる本 発明増幅オリゴヌクレオチドの１の具体例に関する。以下の実施例は本発明オリ ゴヌクレオチドの種々の具体例および使用を示すものであるが、本発明の範囲は かかる実施例に限定されない。 この実施例は、まずＤＮＡ鋳型を作り、次いで、プライマー配置および５'− エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼを用いて鋳型を増幅することによる リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）標的核酸の増幅を説明する。ｒＲＮＡからのＤＮ Ａ鋳型の生成および鋳型の増幅を、ＤＮＡ鋳型の生成および増幅に必要な試薬の 入った同じ反応容器で行った。 この実施例に用いたプライマー配置は１３個のプライマーを含んでいた。上記 の標準的ホスホラミダイト化学によりプライマーを調製した。プライマーのうち ７個は相補的プライマーである（ｒＲＮＡ標的に関して）。これらのプライマー は以下の核酸配列を有する： プライマーのうち６個はセンスプライマーである（ｒＲＮＡ標的に関して）。 これらのプライマーは以下の核酸配列を有する： 標的２３Ｓ ｒＲＮＡをシー・トラコマチスから得て（Glisen et al.，Bioche mistry 13:2633(1974)参照）、バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８.３）、３７.５ｍＭ ＫＣｌ、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ＤＴＴ）で 希釈した。２０μｌのバッファー（７％ ＤＭＳＯ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ ｌ（ｐＨ８.３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ₂および２ｍＭ ＤＴＴ ）中で異なる量のｒＲＮＡ標的をプライマー（各７ピコモル）と混合し、６０℃ で３０分インキュベーションしてプライマーをプレハイブリダイゼーションさせ た。次いで、プレハイブリダイゼーションしたプライマーを０.２ｍＭ ＡＴＰ 、０.２ｍＭ ＴＴＰ、０.２ｍＭ ＧＴＰ、０.２ｍＭ ＣＴＰ、２００ユニッ トのMoloney Murine白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）、およびバチ ルス・ステアロサーモフィルス（Ｂｓｔ）のＤＮＡポリメラーゼＩの大ズブチリ シンフラグメントとして得られる５'エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラー ゼ２ユニットに曝露した。増幅を３７℃で６０分行い、次いで、６０℃で１２０ 分行った。 次いで、９５℃で５分間インキュベーションすることにより増幅生成物を変性 させ、Nelsonらの上記文献に従って、アクリジニウムエステル標識プローブを用 いてアッセイした。Nelsonらにより記載されたようにしてアクリジニウムエステ ルでのプローブ標識を行った。配列番号：４４に対応する核酸配列を有するよう にシー・トラコマチス特異的アクリジニウムエステル標識プローブを合成した。 １００μｌのハイブリダイゼーションバッファー（１００ｍＭ コハク酸リチウ ム（ｐＨ５.２）、８％ ドデシル硫酸リチウム、１.５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ .５ｍＭ ＥＧＴＡ）中で、アクリジニウム標識プローブ（２ｘ１０^-11モル）を 増幅生成物とともに６０℃で５分インキュベーションした。次いで、アルカリ溶 液（０.１５Ｍ 四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ７．６）および５％（ｖ／ｖ） により未ハイブリダイゼーションプローブ上のアクリジニウムエステルを加水分 解した。残存化学発光をルミノメーターで測定した。表８に示す結果は標的核酸 の増幅を示す。 これらのデータは、プライマー配置フォーマット中の配列番号：３０〜４２と ハイブリダイゼーションしうる本発明増幅オリゴヌクレオチドの使用は、がシー ・トラコマチス標的ヌクレオチド配列を有する核酸の増加を引き起こすことを示 す。また当該実施例は、この実験においてプライマー配置は少なくとも４ｘ１０^-19 モル程度の少量の標的ＲＮＡを検出可能に増幅しうることも示す。実施例９ ： この実施例は、臨床標本（ヒト・子宮頸管綿棒かきとり物）中に存在するシー ・トラコマチスｒＲＮＡ標的ヌクレオチド配列の増幅を説明する。この実施例に 用いたオリゴヌクレオチド、増幅手順、および検出手順は実施例８に記載したの と同じであった。使用試料のタイプおよび試料調製において、この実施例は実施 例 ８と異なる。 子宮頸管綿棒かきとり物試料を集め、アニオン性界面活性剤含有緩衝液（６０ ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ６.８）、６％ ドデシル硫酸リチウム、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび２ｍＭ ＥＧＴＡ）に懸濁した。臨床標本に２ｘ１０^-18モル の２３Ｓ シー・トラコマチス ｒＲＮＡを加え、プライマー配置を含む増幅オリ ゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせた。実施例８に記載のごとく標的 核酸を増幅し、検出した。臨床試料中の標的核酸の増幅がうまく行われた。増幅 ＲＮＡを添加した試料のハイブリダイゼーションアッセイにおいて得られたシグ ナル量は、シー・トラコマチスｒＲＮＡを添加しなかった臨床標本を含む同様の 混合物中において検知されるシグナルの５０倍以上であった。実施例１０ ： シー・シッタシおよびシー・ニューモニエの２３Ｓ ｒＲＮＡよりもシー・ト ラコマチスの２３Ｓ ｒＲＮＡに優先的にハイブリダイゼーションするように配 列番号：４および６のプライマーを設計した。異なる増幅フォーマットにおける シー・トラコマチスに対するプライマーの特異性を示すために、それらをポリメ ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライマーとして試験した。５ｍＭ ＭｇＣ ｌ₂、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８.３）、１ｍＭ ｄＴＴＰ、１ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＧＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、２０ユニ ットのＲＮａｓｉｎ、６０ユニットのＭＭＬＶ逆転写酵素および配列番号：４の プライマーに対する結合部位の下流にハイブリダイゼーションするように設計さ れた配列番号：１０３ ＧＴＣＧＣＣＴＧＧＧ ＣＣＡＴＴＴＣＴＣＴＧＣＧＧＣ ＣＣＣＣＣ ＧＧＧＧのシー・トラコマチス ｒＲＮＡに相補的なプライマー１０ ０ｐｍｏｌを含有する２０μｌの溶液中で各クラミジアｒＲＮＡ（０.００８ｘ １０^-15モル）を４２℃で１５分、次いで９５℃で１０分、最後に８０℃で３分 インキュベーションした。２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８.３）、２.５ユニットのＴａｑポリメラーゼ、５' 末端の配列番号：４３のＴ７プロモーター配列および配列番号： ４の３'プライマー配列を有するプロモーター−プライマー５０ｐｍｏｌ、およ び配列番号：６のプライマー５０ｐｍｏｌを含有する溶液をこの溶液に添加した 。対照として、シー・ニューモニエｒＲＮＡ配列領域に相補的な標的結合領域を 有するプライマーおよびプロモーター−プライマーのペアーを同様の増幅フォー マットに使用した。プロモーター−プライマーのプロモーター領域は５'末端に 同じＴ７プロモーター配列を有していた。選択した核酸増幅フォーマットがＰＣ Ｒであったため、プロモーター配列は増幅反応に必要でなかった。反応混合物を ３５回サーモサイクルさせ（５５℃で０.５分、７２℃で１分、次いで９５℃で １分）、その後、最後に７２℃で７分インキュベーションし、次いで、ハイブリ ダイゼーションまたはゲル分析の前に４℃まで冷却した。各反応混合物２０μｌ を、Ｔｒｉｓホウ酸ＥＤＴＡバッファーを用いる２％アガロースゲル上の電気泳 動により分析し、次いで、臭化エチジウム染色した。紫外線下で核酸を可視化し た。結果を以下にまとめる： 表９：ＰＣＲを使用した場合の配列番号：４および６を有する増幅オリゴヌクレ オチドの標的特異性 これらの結果は、選択したハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：４お よび６の配列を有するシー・トラコマチスのプライマーは特異的にシー・トラコ マチスの核酸を増幅するが、シー・ニューモニエまたはシー・シッタシの ｒＲＮＡ配列を増幅しないことを示す。実施例１１ ： ３'部分に配列番号：５０のヌクレオチド配列を有し、５'末端の配列番号：１ ０６のＴ７プロモーター配列を有する３０ｐｍｏｌのプロモーター−プライマー 、ならびに配列番号：４４の配列を有する３０ｐｍｏｌのプライマーを用いて異 なる量のシー・トラコマチスのｒＲＮＡを増幅することにより、シー・トラコマ チスの１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列に指向された増幅および検出系の感度 について説明する。特に断らないかぎり、増幅およびハイブリダイゼーション反 応を実施例１記載のごとく行った。増幅反応後、実施例１記載のごとく配列番号 ：４６の配列を有するアクリジニウムエステル標識プローブおよび配列番号：４ ８の配列を有する未標識ヘルパーオリゴヌクレオチドを用いて２０μｌの増幅反 応物をアッセイした。反応を３系で行った。結果を以下に示す。 表１０：１６Ｓ ｒＲＮＡに指向された配列番号：４３および４４のオリゴヌク レオチドを用いるシー・トラコマチスのＲＮＡの増幅、次いで、配列番号：４６ のプローブでの検出 結果は、１個のクラミジア・トラコマチス細胞中に含まれるｒＲＮＡに近いレ ベルでの溶液中におけるシー・トラコマチス核酸を増幅し存在を検出する、プロ ーブおよびシー・トラコマチスの１６Ｓ ｒＲＮＡに指向された増幅オリゴヌク レオチドの能力を示す。実施例１２ ： 種々の生物から得た細胞溶解物または精製ＲＮＡのいずれかを実施例１１記載 の増幅オリゴヌクレオチドを用いて増幅することにより、クラミジア・トラコマ チスの１６Ｓ ｒＲＮＡに指向された増幅および検出系の特異性を示した。検出 すべく選択された生物は、ヒトの尿道および生殖器管から普通に単離される生物 ならびに系統発生論的に交差する部分を示す生物の範囲内である。各試料は少な くとも２５００００個の細胞に相当する細胞溶解物または２ｘ１０^-15モルの精 製ＲＮＡのいずれかを含んでいた。実施例１１記載のごとく、これを増幅反応に 供した。配列番号：４６のプローブおよび配列番号：４８の未標識ヘルパープロ ーブを用いて実施例１記載のごとく核酸ハイブリダイゼーションを行うことによ り全部で１００μｌの反応物をアッセイした。下表１１および１２に示す結果は ３系の平均である。 実施例１３： ＭＭＬＶ逆転写酵素を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）フォーマットに おいて配列番号：４４および５０の配列のプライマーを試験した。５ｍＭ Ｍｇ Ｃｌ₂、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８.３）、１ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＧＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、２０ユニットのＲＮａｓｉ ｎ、５０ユニットのＭＭＬＶ逆転写酵素および１ナノモルのランダムヌクレオチ ドヘキサマー［Boehringer Mannheimから購入］を含有する２０μｌの溶液中で クラミジアのｒＲＮＡ（２ｘ１０^-16モル）を４２℃で１５分、次いで９５℃で １０分、最後に８０℃で３分インキュベーションした。１.２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８.３）、２.５ユニッ トのＴａｑポリメラーゼ、５'末端に配列番号：１０６のＴ７プロモーターを有 し３'末端に配列番号：５０の標的結合領域を有するプロモーター−プライマー ５０ｐｍｏｌ、および配列番号：４４のプライマー５０ｐｍｏｌを含有する８０ μｌの溶液をこの溶液に添加した。反応混合物を３５回サイクルさせ（５５℃で ０.５分、７２℃で１分、次いで９５℃で１分）、その後、最後に７２℃で７分 インキュベーションし、次いで、ハイブリダイゼーションまたはゲル分析の前に ４℃まで冷却した。Ｔｒｉｓホウ酸ＥＤＴＡバッファーを用いる２％アガロース ゲル上での電気泳動、次いで、臭化エチジウム染色を用いる核酸可視化により各 反応物２０μｌを分析した。 次いで、配列番号：４６のアクリジニウムエステル標識プローブおよび配列番 号：４８のヘルパープローブを用いて反応混合物をアッセイした。結果を下表１ ３に示す。 これらの結果は、密接に関連した生物由来の大量のＲＮＡを含む試料において さえもクラミジア・トラコマチスを特異的に検出する、プローブ／ヘルパーオリ ゴヌクレオチドの組み合わせの能力を示す。実施例１４ ： この実施例は、単一のヌクレオチド配列であるプロモーター−プライマーのク ラミジア・トラコマチスの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を増幅する能力を示す。この実 験において、種々の量の精製シー・トラコマチス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−８８６） のｒＲＮＡを、シー・トラコマチスの１６Ｓ ｒＲＮＡに相補的なヌクレオチド 配列を有する負のセンスの２種のオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。それぞ れ配列番号；５０のオリゴヌクレオチドの５'末端に共有結合した配列番号：１ ０６のＴ７プロモーターヌクレオチド配列を含む２種のプロモーター−プライマ ーを合成した。 遊離の３'末端ヒドロキシル基を有するプロモーター−プライマーの１つを合 成し、１の反応につき２ｐｍｏｌ使用した。プライマー伸長をブロックまたは伸 長量を減少させるために３'末端に共有結合したアルカンジオール基を有する第 ２のプロモーター−プライマーを合成し、１の反応につき１３ｐｍｏｌ使用した 。実施例１記載のごとく増幅反応およびハイブリダイゼーションアッセイを行っ た。アクリジニウムエステル標識プローブは配列番号：４６のヌクレオチド配列 からなっており、配列番号：４８の未標識ヘルパープローブとともに使用した。 結果は、各条件での３系の平均値である。 表１４：配列番号：１０６のＴ７プロモーターおよび配列番号：５０の標的結合 領域を有する、ブロックされたプロモーター−プライマーおよびブロックされて いないプロモーター−プライマーを用いる１６Ｓ ｒＲＮＡの増幅 上記の種々の実施例に示した具体例は、本明細書記載のオリゴヌクレオチドは クラミジア・トラコマチスの核酸を増幅および／または検出する能力を有し、ク ラミジア・トラコマチスをその既知の系統発生論的に最も近縁した種から識別し うることを確認するものである。本明細書記載の実施例は、本発明を上記開示具 体例に限定するものではない。さらなる具体例は以下の請求の範囲の範囲内であ る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スピンゴラ，マーク アメリカ合衆国87108ニューメキシコ州 アルバカーキ、チュラ・ビスタ・プレイス 207番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．１価カチオンの０.８Ｍ溶液、６０℃、１５分間に相当するハイブリダイ ゼーション条件下にて、クラミジア・トラコマチスのｒＲＮＡまたは該ｒＲＮＡ をコードしているＤＮＡ由来であり ａ）配列番号：１ ｂ）配列番号：９ ｃ）配列番号：３ ｄ）配列番号：１０ ｅ）配列番号：４６ ｆ）配列番号：４７および ｇ）チミンのかわりにウラシルを有するそれらのＲＮＡ同等物 からなる群より選択される第１のヌクレオチド配列を有するヌクレオチドポリマ ーの特定領域と検出可能で安定なハイブリッドを形成するオリゴヌクレオチドハ イブリダイゼーションアッセイプローブであって、該ハイブリダイゼーション条 件下でクラミジア・シッタシまたはクラミジア・ニューモニエの核酸と検出可能 で安定なハイブリッドを形成しないプローブ。 ２．該第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列が ａ）ＤＮＡ、および ｂ）チミンのかわりにウラシルを有するそのＲＮＡ同等物 からなる群より選択されることを条件として、該第１のヌクレオチド配列が配列 番号：１である場合には配列番号：９の第２のヌクレオチド配列を有し、第１の ヌクレオチド配列が配列番号：９である場合には配列番号：１の第２のヌクレオ チド配列を有し、第１のヌクレオチド配列が配列番号：３である場合には配列番 号：１０の第２のヌクレオチド配列を有し、第１のヌクレオチド配列が配列番号 ：１０である場合には配列番号：３の第２のヌクレオチド配列を有する請求項１ のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブ。 ３．１価カチオンの０.８Ｍ溶液、６０℃、１５分間に相当するハイブリダイ ゼーション条件下にて、クラミジア・シッタシまたはクラミジア・ニューモニエ 由来の核酸よりもクラミジア・トラコマチス由来の核酸に検出可能にハイブリダ イゼーションするであろうオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイ プローブであって、 ａ）配列番号：１ ｂ）配列番号：９ ｃ）配列番号：３ ｄ）配列番号：１０ ｅ）配列番号：４６ ｆ）配列番号：４７、および 保存的に修飾されたそれらの変種 からなる群より選択されるプローブ。 ４．ａ）配列番号：１または保存的に修飾された配列番号：１の変種のヌクレ オチド配列を有するオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプロー ブ、および ｂ）少なくとも１のヘルパーオリゴヌクレオチド を含む、クラミジア・トラコマチスの特異的検出のためのプローブミックス。 ５．該ハイブリダイゼーションアッセイプローブのヌクレオチド配列が配列番 号：１からなるものである請求項４のプローブミックス。 ６．１価カチオンの０.８Ｍ溶液、６０℃、１５分間に相当するハイブリダイ ゼーション条件下にて、 クラミジア・トラコマチス由来のヌクレオチド配列を有し ａ）配列番号：１１、および ｂ）ウラシルのかわりにチミンを有するそのＲＮＡ同等物 からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチドポリマーの特 定領域と該ヘルパープローブが安定なハイブリッドを形成するものである請求項 ４のプローブミックス。 ７．該ヘルパープローブが、群： ａ）配列番号：２、および ｂ）保存的に修飾されたその変種 から選択されるヌクレオチド配列を有するものである請求項４のプローブミック ス。 ８．該ヘルパープローブのヌクレオチド配列が配列番号：２からなるものであ る請求項４のプローブミックス。 ９．ａ）配列番号：４６または保存的に修飾された配列番号：４６の変種のヌ クレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプ ローブ、および ｂ）少なくとも１のヘルパーオリゴヌクレオチド を含む、クラミジア・トラコマチスの特異的検出のためのプローブミックス。 １０．該ハイブリダイゼーションアッセイプローブのヌクレオチド配列が配列 番号：４６からなるものである請求項９のプローブミックス。 １１．１価カチオンの０.８Ｍ溶液、６０℃、１５分間に相当するハイブリダ イゼーション条件下にて、 クラミジア・トラコマチス由来のヌクレオチド配列を有し ａ）配列番号：４９、および ｂ）ウラシルのかわりにチミンを有するそのＲＮＡ同等物 からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチドポリマーの特 定領域と該ヘルパープローブが安定なハイブリッドを形成するものである請求項 ９のプローブミックス。 １２．該ヘルパープローブが、群： ａ）配列番号：４８、および ｂ）保存的に修飾されたその変種 から選択されるヌクレオチド配列を有するものである請求項９のプローブミック ス。 １３．１価カチオンの０.８Ｍ溶液、６０℃、１５分間に相当するハイブリダ イゼーション条件下にて、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイ プローブと、クラミジア・トラコマチス由来で下記配列： ａ）配列番号：１ ｂ）配列番号：９ ｃ）配列番号：３ ｄ）配列番号：１０ ｅ）配列番号：４６ ｆ）配列番号：４７ ｇ）チミンのかわりにウラシルを有するＲＮＡ同等物 からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する試験試料中に存在するヌク レオチドポリマーの特定領域との間に形成される検出可能で安定な核酸ハイブリ ッドであって、そのようにして形成されたハイブリッドの検出がクラミジア・ト ラコマチスの核酸の存在を示し、試料中に存在するとしてもクラミジア・シッタ シおよび／またはクラミジア・ニューモニエの存在を示さないものであるハイブ リッド。 １４．下記ａ）〜ｃ）： ａ）１価カチオンの０.８Ｍ溶液、６０℃、１５分間に相当するハイブリダイゼ ーション条件下にて、クラミジア・トラコマチスのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡにハ イブリダイゼーションし、非クラミジア細菌のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡにハイブ リダイゼーションしない第１のオリゴヌクレオチドに試料を接触させ、該オリゴ ヌクレオチドはクラミジア・トラコマチスのｒＲＮＡの領域または該ｒＲＮＡを コードしているＤＮＡの領域に相補的であり ｉ）配列番号：１ ｉｉ）配列番号：９ ｉｉｉ）配列番号：３ ｉｖ）配列番号：１０ ｖ）配列番号：４６ ｖｉ）配列番号：４７、および ｖｉｉ）チミンのかわりにウラシルを有するそれらのＲＮＡバージョン からなる群より選択されるものであり、 ｂ）該試料および該オリゴヌクレオチドに該ハイブリダイゼーション条件を適用 して、クラミジア・トラコマチスのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ配列をコードしてい る核酸が存在する場合にはこれに該オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーショ ンさせて安定なハイブリッドを形成させ、次いで ｃ）試料中に存在する場合には、試料中のクラミジア・トラコマチスの核酸の存 在を示すものとして該ハイブリッドを検出する を含む、試料中のクラミジア・トラコマチスの核酸の存在の検出方法。 １５．クラミジア・トラコマチスのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ配列をコードして いる該核酸が第２のオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーシヨンし、該第１の オリゴヌクレオチドおよび該第２のオリゴヌクレオチドはともに配列番号：１お よび配列番号：２のヌクレオチド配列または保存的に修飾されたそれらの変種配 列を有するオリゴヌクレオチドを含むものである請求項１４の方法。 １６．該第１のオリゴヌクレオチドが配列番号：３のヌクレオチド配列または 保存的に修飾されたその変種配列を有するものである請求項１４の方法。 １７．該第１のオリゴヌクレオチドが配列番号：１０のヌクレオチド配列また は保存的に修飾されたその変種配列を有するものである請求項１４の方法。 １８．該第１のオリゴヌクレオチドが配列番号：９のヌクレオチド配列または 保存的に修飾されたその変種配列を有するものである請求項１４の方法。 １９．該第１のオリゴヌクレオチドが配列番号：４６のヌクレオチド配列また は保存的に修飾されたその変種配列を有するものである請求項１４の方法。 ２０．該クラミジア・トラコマチスのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ配列をコードし ている該核酸が該第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションし、該第 １のオリゴヌクレオチドおよび該第２のオリゴヌクレオチドがともに配列番号： ４６および配列番号：４８のヌクレオチド配列または保存的に修飾されたそれら の変種配列を有するオリゴヌクレオチドを含むものである請求項１４の方法。 ２１．該第１のオリゴヌクレオチドが配列番号：４７のヌクレオチド配列また は保存的に修飾されたその変種配列を有するものである請求項１４の方法。 ２２．下記ａ）、ｂ）： ａ）ｉ）配列番号：９ ｉｉ）配列番号：１２ ｉｉｉ）配列番号：５ ｉｖ）配列番号：６ ｖ）配列番号：１１ ｖｉ）チミンのかわりにウラシルを有するこれらの配列のＲＮＡ同等物 からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するクラミジア・トラコマチス の核酸の領域に結合するか、あるいは該領域を通過するポリマー化を引き起こす であろう少なくとも１の増幅オリゴヌクレオチドを用いてクラミジア・トラコマ チスの核酸を増幅し、次いで ｂ）１価カチオンの０.８Ｍ溶液、６０℃、１５分間に相当するハイブリダイゼ ーション条件下で、クラミジア・シッタシおよびクラミジア・ニューモニエの核 酸よりもクラミジア・トラコマチスの核酸と特異的にハイブリダイゼーションす るであろうオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブを用い て増幅核酸を検出する を含むクラミジア・トラコマチスの検出方法。 ２３．クラミジア・シッタシおよびクラミジア・ニューモニエの核酸への該オ リゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを促進しないハイブリダイゼーショ ン条件下で、該増幅オリゴヌクレオチドがクラミジア・トラコマチスの核酸にハ イブリダイゼーションしうるものである請求項２２の方法。 ２４．１つまたはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチドが、配列番号：４、配列 番号：６および保存的に修飾されたそれらの変種からなる群より選択されるヌク レオチド配列を有するものである請求項２３の方法。 ２５．該増幅オリゴヌクレオチドの１つまたはそれ以上のものが、ＲＮＡポリ メラーゼによるＲＮＡ合成を開始させうる５'非相補的ヌクレオチド配列を有す るものである請求項２２の方法。 ２６．該増幅オリゴヌクレオチドの１つまたはそれ以上のものが ａ）配列番号：４３ ｂ）配列番号：１０６ ｃ）配列番号：１０４ ｄ）配列番号：１０７、および ｅ）チミンのかわりにウラシルを有するそれらのＲＮＡバージョン からなる群より選択されるヌクレオチド配列に実質的に類似した５'非相補的ヌ クレオチド配列を有するものである請求項２５の方法。 ２７．該増幅工程が同じまたは実質的に類似したヌクレオチド配列の増幅オリ ゴヌクレオチドの少なくとも１つの集団の使用を含むものであり、該増幅オリゴ ヌクレオチドの下位集団が、３'末端における伸長を行う核酸ポリメラーゼの能 力を低下または除去する３'末端における修飾を有するオリゴヌクレオチドから なるものである請求項２５の方法。 ２８．該増幅工程が少なくとも２つの増幅オリゴヌクレオチドの使用を含むも のであり、それらのうち１つまたはそれ以上が ａ）配列番号：４ ｂ）配列番号：５ ｃ）配列番号：６、および ｄ）チミンのかわりにウラシルを有するそれらのＲＮＡ同等物 からなる群より選択されるヌクレオチド配列に実質的に類似したヌクレオチド配 列を有するものであり、該１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドが、ＲＮＡ ポリメラーゼによるＲＮＡ合成を開始しうる５'非相補的配列を有していてもよ いものである請求項２２の方法。 ２９．該増幅工程が、少なくとも２つの異なる増幅オリゴヌクレオチドの使用 を含むものであり、それぞれが ａ）配列番号：４ ｂ）配列番号：５ ｃ）配列番号：６、および ｄ）チミンのかわりにウラシルを有するそれらのＲＮＡ同等物 からなる群より選択されるヌクレオチド配列に実質的に類似したヌクレオチド配 列を有するものであり、該異なるオリゴヌクレオチドが、ＲＮＡポリメラーゼに よるＲＮＡ合成を開始させうる５'非相補的配列を有していてもよいものであり 、該異なる増幅オリゴヌクレオチドが同じ配列番号に実質的に類似したものでな い請求項２２の方法。 ３０．ハイブリダイゼーションアッセイプローブが ａ）配列番号：１、および ｂ）チミンのかわりにウラシルを有するそのＲＮＡ同等物 からなる群より選択されるヌクレオチド配列に実質的に類似したヌクレオチド配 列を有するものである請求項２２の方法。 ３１．該検出工程が、配列番号：２およびチミンのかわりにウラシルを有する そのＲＮＡ同等物からなる群より選択されるヌクレオチド配列に実質的に類似し たヌクレオチド配列を有するヘルパーオリゴヌクレオチドの使用をさらに含むも のである請求項２２の方法。 ３２．下記ａ）、ｂ）： ａ）ｉ）配列番号：１ ｉｉ）配列番号：４ ｉｉｉ）配列番号：１３ ｉｖ）配列番号：１４、および ｖ）チミンのかわりにウラシルを有するこれらの配列のＲＮＡ同等物 からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するクラミジア・トラコマチス の核酸の領域に結合するか、あるいは該領域を通過するポリマー化を引き起こす であろう少なくとも１の増幅オリゴヌクレオチドを用いてクラミジア・トラコマ チスの核酸を増幅し、次いで ｂ）１価カチオンの０.８Ｍ溶液、６０℃、１５分間に相当するハイブリダイゼ ーション条件下にて、クラミジア・シッタシおよびクラミジア・ニューモニエの 核酸よりもクラミジア・トラコマチスの核酸と特異的にハイブリダイゼーション するであろうオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブを用 いて増幅核酸を検出する を含むクラミジア・トラコマチスの検出方法。 ３３．クラミジア・シッタシおよびクラミジア・ニューモニエの核酸への該オ リゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを促進しないハイブリダイゼーショ ン条件下にて、該増幅オリゴヌクレオチドがクラミジア・トラコマチスの核酸に ハイブリダイゼーションしうるものである請求項３２の方法。 ３４．１つまたはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチドが、配列番号：４、配列 番号：６および保存的に修飾されたそれらの変種からなる群より選択されるヌク レオチド配列を有するものである請求項３３の方法。 ３５．該増幅オリゴヌクレオチドの１つまたはそれ以上のものが、ＲＮＡポリ メラーゼによるＲＮＡ合成を開始させうる５'非相補的ヌクレオチド配列を有す るものである請求項３２の方法。 ３６．該増幅オリゴヌクレオチドの１つまたはそれ以上のものが ａ）配列番号：４３ ｂ）配列番号：１０６ ｃ）配列番号：１０４ ｄ）配列番号：１０７、および ｅ）チミンのかわりにウラシルを有するそれらのＲＮＡバージョン からなる群より選択されるヌクレオチド配列に実質的に類似した５'非相補的ヌ クレオチド配列を有するものである請求項３５の方法。 ３７．該増幅工程が、同じまたは実質的に類似したヌクレオチド配列の増幅オ リゴヌクレオチドの少なくとも１つの集団の使用を含むものであり、該増幅オリ ゴヌクレオチドの下位集団が、３'末端における伸長を行う核酸ポリメラーゼの 能力を低下または除去する３'末端における修飾を有するオリゴヌクレオチドか らなるものである請求項３５の方法。 ３８．該増幅工程が、２つまたはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチドの使用を 含むものであり、それらのうち少なくとも１つが ａ）配列番号：４ ｂ）配列番号：５ ｃ）配列番号：６、および ｄ）チミンのかわりにウラシルを有するそれらのＲＮＡ同等物 からなる群より選択されるヌクレオチド配列に実質的に類似したヌクレオチド配 列を有するものである請求項３２の方法。 ３９．該増幅工程が、少なくとも２つの異なる増幅オリゴヌクレオチドの使用 を含むものであり、それぞれが ａ）配列番号：４ ｂ）配列番号：５ ｃ）配列番号：６ ｄ）チミンのかわりにウラシルを有するそれらのＲＮＡ同等物 からなる群より選択されるヌクレオチド配列に実質的に類似したヌクレオチド配 列を有するものであり、該異なる増幅オリゴヌクレオチドが同じ配列番号に実質 的に類似したものでない請求項３２の方法。 ４０．ハイブリダイゼーションアッセイプローブが ａ）配列番号：９、および ｂ）チミンのかわりにウラシルを有するそのＲＮＡ同等物 からなる群より選択されるヌクレオチド配列に実質的に類似したヌクレオチド配 列を有するものである請求項３２の方法。 ４１．該検出工程が、ヘルパーオリゴヌクレオチドの使用をさらに含むもので ある請求項３２の方法。 ４２．下記ａ）、ｂ）： ａ）ｉ）配列番号：３ ｉｉ）配列番号：８ ｉｉｉ）配列番号：１５、および ｉｖ）チミンのかわりにウラシルを有するこれらの配列のＲＮＡ同等物 からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するクラミジア・トラコマチス の核酸の領域に結合するか、あるいは該領域を通過するポリマー化を引き起こす であろう少なくとも１の増幅オリゴヌクレオチドを用いてクラミジア・トラコマ チスの核酸を増幅し、次いで ｂ）１価カチオンの０.８Ｍ溶液、６０℃、１５分間に相当するハイブリダイゼ ーション条件下にて、クラミジア・シッタシおよびクラミジア・ニューモニエの 核酸よりもクラミジア・トラコマチスの核酸と特異的にハイブリダイゼーション するであろうオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブを用 いて増幅核酸を検出する を含むクラミジア・トラコマチスの検出方法。 ４３．該増幅オリゴヌクレオチドの１つまたはそれ以上のものが、ＲＮＡポリ メラーゼによるＲＮＡ合成を開始させうる５'非相補的ヌクレオチド配列を有す るものである請求項４２の方法。 ４４．該増幅オリゴヌクレオチドの１つまたはそれ以上のものが ａ）配列番号：４３ ｂ）配列番号：１０６ ｃ）配列番号：１０４ ｄ）配列番号：１０７、および ｅ）チミンのかわりにウラシルを有するそれらのＲＮＡバージョン からなる群より選択されるヌクレオチド配列に実質的に類似した５'非相補的ヌ クレオチド配列を有するものである請求項４３の方法。 ４５．該増幅工程が、同じまたは実質的に類似したヌクレオチド配列の増幅オ リゴヌクレオチドの少なくとも１つの集団の使用を含むものであり、該増幅オリ ゴヌクレオチドの下位集団が、３'末端における伸長を行う核酸ポリメラーゼの 能力を低下または除去する３'末端における修飾を有するオリゴヌクレオチドか らなるものである請求項４３の方法。 ４６．該増幅工程が、２つまたはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチドの使用を 含むものであり、それらのうち少なくとも１つが ａ）配列番号：７ ｂ）配列番号：８、および ｃ）チミンのかわりにウラシルを有するそれらのＲＮＡ同等物 からなる群より選択されるヌクレオチド配列に実質的に類似したヌクレオチド配 列を有するものである請求項４２の方法。 ４７．該増幅工程が、２つの異なる増幅オリゴヌクレオチドの使用を含むもの であり、それぞれが ａ）配列番号：７ ｂ）配列番号：８、および ｃ）チミンのかわりにウラシルを有するそれらのＲＮＡ同等物 からなる群より選択されるヌクレオチド配列に実質的に類似したヌクレオチド配 列を有するものであり、該異なる増幅オリゴヌクレオチドのいずれもが同じ配列 番号に実質的に類似したものでない請求項４２の方法。 ４８．ハイブリダイゼーションアッセイプローブが ａ）配列番号：１０、および ｂ）チミンのかわりにウラシルを有するそのＲＮＡ同等物 からなる群より選択されるヌクレオチド配列に実質的に類似したヌクレオチド配 列を有するものである請求項４２の方法。 ４９．検出工程がヘルパーオリゴヌクレオチドの使用をさらに含むものである 請求項４２の方法。 ５０．下記ａ）、ｂ）： ａ）ｉ）配列番号：１０ ｉｉ）配列番号：７ ｉｉｉ）配列番号：１６、および ｉｖ）チミンのかわりにウラシルを有するこれらの配列のＲＮＡ同等物 からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するクラミジア・トラコマチス の核酸の領域に結合するか、あるいは該領域を通過するポリマー化を引き起こす であろう少なくとも１の増幅オリゴヌクレオチドを用いてクラミジア・トラコマ チスの核酸を増幅し、次いで ｂ）１価カチオンの０.８Ｍ溶液、６０℃、１５分間に相当するハイブリダイゼ ーション条件下にて、クラミジア・シッタシおよびクラミジア・ニューモニエの 核酸よりもクラミジア・トラコマチスの核酸と特異的にハイブリダイゼーション するであろうオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブを用 いて増幅核酸を検出する を含むクラミジア・トラコマチスの検出方法。 ５１．該増幅オリゴヌクレオチドの１つまたはそれ以上のものが、ＲＮＡポリ メラーゼによるＲＮＡ合成を開始させうる５'非相補的ヌクレオチド配列を有す るものである請求項５０の方法。 ５２．該増幅オリゴヌクレオチドの１つまたはそれ以上のものが ａ）配列番号：４３ ｂ）配列番号：１０６ ｃ）配列番号：１０４ ｄ）配列番号：１０７、および ｅ）チミンのかわりにウラシルを有するそれらのＲＮＡバージョン からなる群より選択されるヌクレオチド配列に実質的に類似した５'非相補的ヌ クレオチド配列を有するものである請求項５１の方法。 ５３．該増幅工程が、同じまたは実質的に類似したヌクレオチド配列の増幅オ リゴヌクレオチドの少なくとも１つの集団の使用を含むものであり、該増幅オリ ゴヌクレオチドの下位集団が、３'末端における伸長を行う核酸ポリメラーゼの 能力を低下または除去する３'末端における修飾を有するオリゴヌクレオチドか らなるものである請求項５１の方法。 ５４．該増幅工程が、２つまたはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチドの使用を 含むものであり、それらのうち少なくとも１つが ａ）配列番号：７ ｂ）配列番号：８、および ｃ）チミンのかわりにウラシルを有するそれらのＲＮＡ同等物 からなる群より選択されるヌクレオチド配列に実質的に類似したヌクレオチド配 列を有するものである請求項５０の方法。 ５５．該増幅工程が、２つの異なる増幅オリゴヌクレオチドの使用を含むもの であり、それぞれが ａ）配列番号：７ ｂ）配列番号：８、および ｃ）チミンのかわりにウラシルを有するそれらのＲＮＡ同等物 からなる群より選択されるヌクレオチド配列に実質的に類似したヌクレオチド配 列を有するものであり、該異なる増幅オリゴヌクレオチドが同じ配列番号に実質 的に類似したものでない請求項５０の方法。 ５６．ハイブリダイゼーションアッセイプローブが ａ）配列番号：３、および ｂ）チミンのかわりにウラシルを有するそのＲＮＡ同等物 からなる群より選択されるヌクレオチド配列に実質的に類似したヌクレオチド配 列を有するものである請求項５０の方法。 ５７．検出工程がヘルパーオリゴヌクレオチドの使用をさらに含むものである 請求項５０の方法。 ５８．下記ａ）、ｂ）： ａ）ｉ）配列番号：４６ ｉｉ）配列番号：４４ ｉｉｉ）配列番号：５１ ｉｖ）配列番号：４８、および ｖ）チミンのかわりにウラシルを有するこれらの配列のＲＮＡ同等物 からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するクラミジア・トラコマチス の核酸の領域に結合するか、あるいは該領域を通過するポリマー化を引き起こす であろう少なくとも１の増幅オリゴヌクレオチドを用いてクラミジア・トラコマ チスの核酸を増幅し、次いで ｂ）１価カチオンの０.８Ｍ溶液、６０℃、１５分間に相当するハイブリダイゼ ーション条件下にて、クラミジア・シッタシおよびクラミジア・ニューモニエの 核酸よりもクラミジア・トラコマチスの核酸と特異的にハイブリダイゼーション するであろうオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブを用 いて増幅核酸を検出する を含むクラミジア・トラコマチスの検出方法。 ５９．該増幅オリゴヌクレオチドの１つまたはそれ以上のものが、ＲＮＡポリ メラーゼによるＲＮＡ合成を開始させうる５'非相補的ヌクレオチド配列を有す るものである請求項５８の方法。 ６０．該増幅オリゴヌクレオチドの１つまたはそれ以上のものが、 ａ）配列番号：４３ ｂ）配列番号：１０６、および ｅ）チミンのかわりにウラシルを有するそれらのＲＮＡバージョン からなる群より選択されるヌクレオチド配列に実質的に類似した５'非相補的ヌ クレオチド配列を有するものである請求項５９の方法。 ６１．該増幅工程が、同じまたは実質的に類似したヌクレオチド配列の増幅オ リゴヌクレオチドの少なくとも１つの集団の使用を含むものであり、該増幅オリ ゴヌクレオチドの下位集団が、３'末端における伸長を行う核酸ポリメラーゼの 能力を低下または除去する３'末端における修飾を有するオリゴヌクレオチドか らなるものである請求項５９の方法。 ６２．該増幅工程が、２つまたはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチドの使用を 含むものであり、それらのうち少なくとも１つが ａ）配列番号：４４ ｂ）配列番号：５０、および ｃ）チミンのかわりにウラシルを有するそれらのＲＮＡ同等物 からなる群より選択されるヌクレオチド配列に実質的に類似したヌクレオチド配 列を有するものである請求項５８の方法。 ６３．該増幅工程が、２つの異なる増幅オリゴヌクレオチドの使用を含むもの であり、それぞれが ａ）配列番号：４４ ｂ）配列番号：５０、および ｃ）チミンのかわりにウラシルを有するそれらのＲＮＡ同等物 からなる群より選択されるヌクレオチド配列に実質的に類似したヌクレオチド配 列を有するものであり、該異なる増幅オリゴヌクレオチドが同じ配列番号に実質 的に類似したものでない請求項５８の方法。 ６４．ハイブリダイゼーションアッセイプローブが ａ）配列番号：４７、および ｂ）チミンのかわりにウラシルを有するそのＲＮＡ同等物 からなる群より選択されるヌクレオチド配列に実質的に類似したヌクレオチド配 列を有するものである請求項５８の方法。 ６５．該検出工程が、 ａ）配列番号：４８、および ｂ）チミンのかわりにウラシルを有するそのＲＮＡ同等物 からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するヘルパーオリゴヌクレオチ ドの使用をさらに含むものである請求項５８の方法。 ６６．下記ａ）、ｂ）： ａ）ｉ）配列番号：４７ ｉｉ）配列番号：４５ ｉｉｉ）配列番号：５０、および ｉｖ）チミンのかわりにウラシルを有するこれらの配列のＲＮＡ同等物 からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するクラミジア・トラコマチス の核酸の領域に結合するか、あるいは該領域を通過するポリマー化を引き起こす であろう少なくとも１の増幅オリゴヌクレオチドを用いてクラミジア・トラコマ チスの核酸を増幅し、次いで ｂ）１価カチオンの０.８Ｍ溶液、６０℃、１５分間に相当するハイブリダイゼ ーション条件下にて、クラミジア・シッタシおよびクラミジア・ニューモニエの 核酸よりもクラミジア・トラコマチスの核酸と特異的にハイブリダイゼーション するであろうオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブを用 いて増幅核酸を検出する を含むクラミジア・トラコマチスの検出方法。 ６７．該増幅オリゴヌクレオチドの１つまたはそれ以上のものが、ＲＮＡポリ メラーゼによるＲＮＡ合成を開始しうる５'非相補的ヌクレオチド配列を有する ものである請求項６６の方法。 ６８．該増幅オリゴヌクレオチドの１つまたはそれ以上のものが ａ）配列番号：４３ ｂ）配列番号：１０６、および ｃ）チミンのかわりにウラシルを有するそれらのＲＮＡバージョン からなる群より選択されるヌクレオチド配列に実質的に類似した５'非相補的ヌ クレオチド配列を有するものである請求項６７の方法。 ６９．該増幅工程が、同じまたは実質的に類似したヌクレオチド配列の増幅オ リゴヌクレオチドの少なくとも１つの集団の使用を含むものであり、該増幅オリ ゴヌクレオチドの下位集団が、３'末端における伸長を行う核酸ポリメラーゼの 能力を低下または除去する３'末端における修飾を有するオリゴヌクレオチドか らなるものである請求項６７の方法。 ７０．該増幅工程が、２つまたはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチドの使用を 含むものであり、それらのうち少なくとも１つが ａ）配列番号：４４ ｂ）配列番号：５０、および ｃ）チミンのかわりにウラシルを有するそれらのＲＮＡ同等物 からなる群より選択されるヌクレオチド配列に実質的に類似したヌクレオチド配 列を有するものである請求項６６の方法。 ７１．該増幅工程が、２つの異なる増幅オリゴヌクレオチドの使用を含むもの であり、それぞれが ａ）配列番号：４４ ｂ）配列番号：５０、および ｃ）チミンのかわりにウラシルを有するそれらのＲＮＡ同等物 からなる群より選択されるヌクレオチド配列に実質的に類似したヌクレオチド配 列を有するものであり、該異なる増幅オリゴヌクレオチドが同じ配列番号に実質 的に類似したものでない請求項６６の方法。 ７２．ハイブリダイゼーションアッセイプローブが ａ）配列番号：４６、および ｂ）チミンのかわりにウラシルを有するそのＲＮＡ同等物 からなる群より選択されるヌクレオチド配列に実質的に類似したヌクレオチド配 列を有するものである請求項６６の方法。 ７３．検出工程がヘルパーオリゴヌクレオチドの使用をさらに含むものである 請求項６６の方法。 ７４．クラミジア・シッタシおよびクラミジア・ニューモニエ由来の核酸より もクラミジア・トラコマチスの核酸を特異的に検出するための組成物であって、 ａ）ｉ）配列番号：７ ｉｉ）配列番号：８ ｉｉｉ）チミンのかわりにウラシルを有するこれらの配列のＲＮＡ同等物 からなる群より選択されるヌクレオチド配列に実質的に類似したヌクレオチド配 列を有する少なくとも１つの増幅オリゴヌクレオチド ｂ）ｉ）配列番号：３ ｉｉ）配列番号：１０ ｉｉｉ）チミンのかわりにウラシルを有するこれらの配列のＲＮＡ同等物 ｉｖ）ヌクレオチド三リン酸、および ｖ）少なくとも１つの核酸ポリマー化活性 からなる群より選択されるヌクレオチド配列に実質的に類似したヌクレオチド配 列を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセ イプローブ を含む組成物。 ７５．該増幅オリゴヌクレオチドの１つまたはそれ以上が、分子の３'末端を 伸長する核酸ポリメラーゼの能力を低下または除去する３'末端に対する修飾を 有する実質的に類似したヌクレオチド配列の核酸分子の下位集団を含むものであ る請求項７４の組成物。 ７６．クラミジア・シッタシおよびクラミジア・ニューモニエ由来の核酸より もクラミジア・トラコマチスの核酸を特異的に検出するための組成物であって、 ａ）ｉ）配列番号：４ ｉｉ）配列番号：５ ｉｉｉ）配列番号:６、および ｉｖ）チミンのかわりにウラシルを有するこれらの配列のＲＮＡ同等物 からなる群より選択されるヌクレオチド配列に実質的に類似したヌクレオチド配 列を有する少なくとも１つの増幅オリゴヌクレオチド ｂ）ｉ）配列番号：１ ｉｉ）配列番号：９ ｉｉｉ）チミンのかわりにウラシルを有するこれらの配列のＲＮＡ同等物 ｉｖ）ヌクレオチド三リン酸、および ｖ）少なくとも１つの核酸ポリマー化活性 からなる群より選択されるヌクレオチド配列に実質的に類似したヌクレオチド配 列を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセ イプローブ を含む組成物。 ７７．ａ）配列番号：２、および ｂ）チミンのかわりにウラシルを有するそのＲＮＡバージョン からなる群より選択される配列に実質的に類似したヌクレオチド配列を有するヘ ルパーオリゴヌクレオチドをさらに含む請求項７６の組成物。 ７８．該増幅オリゴヌクレオチドの１つまたはそれ以上が、分子の３'末端を 伸長する核酸ポリメラーゼの能力を低下または除去する３'末端に対する修飾を 有する実質的に類似したヌクレオチド配列の核酸分子の下位集団を含むものであ る請求項７６の組成物。 ７９．クラミジア・シッタシおよびクラミジア・ニューモニエ由来の核酸より もクラミジア・トラコマチスの核酸を特異的に検出するための組成物であって、 ａ）ｉ）配列番号：４４ ｉｉ）配列番号：５０ ｉｉｉ）チミンのかわりにウラシルを有するこれらの配列のＲＮＡ同等物 からなる群より選択されるヌクレオチド配列に実質的に類似したヌクレオチド配 列を有する少なくとも１つの増幅オリゴヌクレオチド ｂ）ｉ）配列番号：４６ ｉｉ）配列番号：４７ ｉｉｉ）チミンのかわりにウラシルを有するこれらの配列のＲＮＡ同等物 ｉｖ）ヌクレオチド三リン酸、および ｖ）少なくとも１つの核酸ポリマー化活性 からなる群より選択されるヌクレオチド配列に実質的に類似したヌクレオチド配 列を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセ イプローブ を含む組成物。 ８０．ａ）配列番号：４８、および ｂ）チミンのかわりにウラシルを有するそのＲＮＡバージョン からなる群より選択される配列に実質的に類似したヌクレオチド配列を有するヘ ルパーオリゴヌクレオチドをさらに含む請求項７９の組成物。 ８１．該増幅オリゴヌクレオチドの１つまたはそれ以上が、分子の３'末端を 伸長する核酸ポリメラーゼの能力を低下または除去する３'末端に対する修飾を 有する実質的に類似したヌクレオチド配列の核酸分子の下位集団を含むものであ る請求項７９の組成物。 ８２．ａ）配列番号：１７ ｂ）配列番号：１８ ｃ）配列番号：１９ ｄ）配列番号：２０ ｅ）配列番号：２１ ｆ）配列番号：２２ ｇ）配列番号：２３ ｈ）配列番号：２４ ｉ）配列番号：２５ ｊ）配列番号：２６ ｋ）配列番号：２７ ｌ）配列番号：２８、および ｍ）配列番号：２９ からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、クラミジア・トラコマチ ス由来の核酸の増幅のための増幅オリゴヌクレオチド。 ８３．請求項８２のオリゴヌクレオチドならびに配列番号：４４および配列番 号：４５からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼー ションアッセイプローブを含む、クラミジア・トラコマチス由来の核酸の増幅お よび特異的検出のための組成物。 ８４．同じセンスの少なくとも２つの増幅オリゴヌクレオチドを含むクラミジ ア・トラコマチス由来の核酸の増幅のためのプライマー配置であって、第１のセ ンスのプライマーが ａ）配列番号：１７ ｂ）配列番号：１８ ｃ）配列番号：１９ ｄ）配列番号：２０ ｅ）配列番号：２１ ｆ）配列番号：２２、および ｇ）配列番号：２３ からなる群より選択されるものであり、第２のセンスの増幅オリゴヌクレオチド が ｈ）配列番号：２４ ｉ）配列番号：２５ ｊ）配列番号：２６ ｋ）配列番号：２７ ｌ）配列番号：２８、および ｍ）配列番号：２９ からなる群より選択されるものであるプライマー配置。 ８５．該プライマー配置が下記ヌクレオチド配列： ａ）配列番号：１７ ｂ）配列番号：１８ ｃ）配列番号：１９ ｄ）配列番号：２０ ｅ）配列番号：２１ ｆ）配列番号：２２ ｇ）配列番号：２３ ｈ）配列番号：２４ ｉ）配列番号：２５ ｊ）配列番号：２６ ｋ）配列番号：２７ ｌ）配列番号：２８、および ｍ）配列番号：２９ の増幅オリゴヌクレオチドを含むものである請求項７９のプライマー配置。 ８６．請求項８５のプライマー配置ならびに配列番号：４４および配列番号： ４５からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのハイ ブリダイゼーションアッセイプローブを含む、クラミジア・トラコマチス由来の 核酸の増幅および特異的検出のための組成物。 ８７．ａ）配列番号：１７ ｂ）配列番号：１８ ｃ）配列番号：１９ ｄ）配列番号：２０ ｅ）配列番号：２１ ｆ）配列番号：２２ ｇ）配列番号：２３ ｈ）配列番号：２４ ｉ）配列番号：２５ ｊ）配列番号：２６ ｋ）配列番号：２７ ｌ）配列番号：２８、および ｍ）配列番号：２９ からなる群より選択されるヌクレオチト配列を有する２つまたはそれ以上の増幅 オリゴヌクレオチドを含む、クラミジア・トラコマチスの核酸の増幅のためのキ ット。