JPH10509586A

JPH10509586A - 機能的に破壊されたインターロイキン−１β変換酵素遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物

Info

Publication number: JPH10509586A
Application number: JP8513317A
Authority: JP
Inventors: セスハドリー，タラ; リー，ピン; アレン，ヘイミッシュ; バーナジー，スブハシス; パスキント，マイケル
Original assignee: ベーアーエスエフアクツィエンゲゼルシャフト
Priority date: 1994-10-14
Filing date: 1995-10-13
Publication date: 1998-09-22
Also published as: EP0786007A1; CA2202549C; CA2202549A1; WO1996012025A1; US6100445A

Abstract

(57)【要約】内因性インターロイキン１β変換酵素（ＩＣＥ）遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が機能的に破壊されている体細胞及び生殖細胞を有するトランスジェニック非ヒト動物を提供する。この動物は、ＩＣＥ遺伝子破壊についてヘテロ接合であってよいが、一層好ましくは、ホモ接合であり、好ましくはマウスである。ホモ接合型動物においては、成熟インターロイキン１β及びインターロイキン１αの分泌が、突然変異してない動物に比較して、実質的に減少している。この発明の動物を陽性対照として用いて、ＩＣＥインヒビターの効力を評価し、ＩＣＥインヒビターで治療し得る病状を同定することができる。機能的に破壊された内因性ＩＣＥ遺伝子を有するが、ヒトＩＣＥ遺伝子を用いて再構築されたトランスジェニック非ヒト動物も提供する。この動物を用いて、ヒトＩＣＥをイン・ビボで阻害する薬剤を同定することができる。宿主細胞内の内因性ＩＣＥ遺伝子を機能的に破壊するための核酸構築物、その核酸構築物を含む組換えベクター、及びその核酸構築物が導入された宿主細胞も又、この発明により包含される。

Description

【発明の詳細な説明】機能的に破壊されたインターロイキン−１β変換酵素遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物発明の背景インターロイキン１は、生物学的活性の広いスペクトルを有するサイトカインである（総説としては、例えば、Dinarello，C.A．及びWolff，S.M.(1933)New E ng.J.Med.328:106-113;及びDinarello，C.A.(1993)Trends in Pharmacol.Sci.14 :155-159を参照されたい）。ＩＬ−１は、２つの構造的に関連したポリペプチドインターロイキン−１α（ＩＬ−１α）とインターロイキン−１β（ＩＬ−１β ）とからなる。これらの２つの形態のＩＬ−１は、異なる遺伝子によりコードされ、２７〜３３％しかアミノ酸同一性を有しないが、それらは同じレセプターと相互作用して類似の活性を有する。熱、睡眠、神経性無食欲症及び低血圧症の誘導は、ＩＬ−１に帰する生物学的機能の内にある。ＩＬ−１は又、リウマチ様関節炎、敗血症性ショック、炎症性腸疾患及びインシュリン依存性糖尿病真性糖尿病を含む炎症性疾患及び自己免疫疾患の病態生理学にも関係する。ＩＬ−１αは、特に、乾癬の病態生理学に関係してきた。ＩＬ−１は又、感染因子に対する免疫応答及び骨髄性白血病の病因における役割を演じると考えられる。ＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両者は、約３１ｋＤａの前駆体分子として合成され、それは次いでプロセッシングを受けて約１７ｋＤａの成熟型になる。ＩＬ− １αとＩＬ−１βは、ＩＬ−１αの前駆体型（プレＩＬ−１α）は生物学的に活性であり、成熟ＩＬ−１α（ｍａｔＩＬ−１α）の殆どは細胞結合したままでいるのに、ＩＬ−１βの前駆体型（プレＩＬ−１β）は活性になるには開裂されて成熟型にならなければならず、ＩＬ−１βの成熟型（ｍａｔＩＬ−１β）は細胞から分泌されるという点で異なっている。ある細胞型のみがプレＩＬ−１βのプロセッシングを行ない、ｍａｔＩＬ−１βを分泌する。単球及びマクロファージが最も効率のよいＩＬ−１βの生産者であり分泌者である（ＩＬ−１βは、これらの細胞型の活性化の際に産生されるＩＬ−１の最も豊富な型である）。プレＩＬ−１βを開裂してｍａｔＩＬ−１βにする細胞内酵素は同定されておりインターロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ）と呼ばれている（Thornberry等(1 992)Nature 356:768-774; Ceretti,D.P.等(1992)Science 256:97-100）。ＩＣＥは、不活性型のＩＬ−１βをＡｓｐ¹¹⁶残基とＡｌａ¹¹⁷残基との間で開裂して活性な１７ｋＤａ型を遊離させるシステインプロテアーゼである。ＩＣＥは、前には、ＩＬ−１αのプロセッシング又は分泌に関係していなかった。更に、他のプロテアーゼ例えばエラスターゼ及びカテプシンＧが、イン・ビトロでプレＩＬ− １βを開裂してｍａｔＩＬ−１βを生じる（例えば、Black,R.A.等(1988)J.Biol .Cher.263:9437-9942;及びHazuda,D.J．等(1990)J.Biol.Chem.265:6318-6322を参照されたい）ので、ＩＣＥが、イン・ビボで生物的に活性なＩＬ−１βの生成の原因である主要な又は唯一の酵素であるか否かは未知である。ＩＬ−１βの開裂に加えて、ＩＣＥは、アポトーシス即ちプログラムされた細胞死に関与し得るという証拠がある。第１に、ラットの繊維芽細胞系統におけるＩＣＥの過剰発現は、アポトーシスを引き起こした。このアポトーシスは、ｂｃ１−２遺伝子（プログラムされた細胞死を阻止することのできる哺乳動物のオンコジーン）の産物により又はＩＣＥの特異的インヒビターをコードする牛痘ウイルスｃｒｍＡ遺伝子の産物によりブロックすることができた（Yuan,J．等(1993) Cell 75:641-652; Ray,C.A．等(1992)Cell 69:597-604; Miura,M．等(1993)Cell 75:653-660）。更に、ＩＣＥインヒビターｃｒｍＡのニワトリ後根神経節ニューロンへのマイクロインジェクションは、神経成長因子欠乏により誘導される細胞死を阻止した（Gagliardini,V.等(1994)Science 263:826）。これらの観察は、ＩＣＥが単にプレＩＬ−１βをｍａｔＩＬ−βに開裂するだけでなく一層広範囲の生物学的機能を有することを示唆する。これは、更に、ＩＣＥ遺伝子突然変異が、正常な生物学的発生及び生存能力を阻害する重大な有害な効果を有し得るであろうことを示唆する。多くの病状における見かけ上有害なＩＬ−１の役割の故に、ＩＬ−１の産生又は作用を減じることを目的とした治療ストラテジーが、提案されている。ｍａｔＩＬ−１βの産生及び分泌を阻止する１つのアプローチは、特異的ＩＣＥインヒビターを用いてＩＣＥ活性をブロックすることである。ＩＣＥインヒビターを同定してそれらの効力を評価するためには、ＩＣＥインヒビターの活性を評価する対照となる標準対照用の動物及び細胞が必要である。更に、ヒトＩＣＥのインヒビターをイン・ビトロ又はイン・ビボでスクリーニングすることのできるモデルシステムが必要である。更に、ＩＬ−１は、多くの病気の病理に関係しているが、ＩＬ−１が関与する病状の範囲は、完全には決定されていない。従って、病状におけるＩＬ−１α及び／又はβの関与を評価し、それにより、ＩＣＥインヒビターにより治療し得る病状を同定するためのモデルシステムが必要である。発明の要約この発明は、内因性のインターロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ）遺伝子の対立遺伝子の少なくとも一方の好ましくは両方の機能的破壊を有する体細胞及び生殖細胞を有する非ヒト動物に関するものである。従って、この発明は、突然変異したＩＣＥ遺伝子を有しそれ故にＩＣＥ活性を欠く生存可能な動物を提供する。これらの動物は、野生型対照用動物において正常な量のｍａｔＩＬ−１βを生成する刺激に応答して、実質的に減じた量の成熟インターロイキン−１β（ｍａｔＩＬ−１β）を生成する。これらの動物は、更に、野生型対照用動物において正常な量のｍａｔＩＬ−１αを生成する刺激に対する応答における、成熟インターロイキン−ＩＬ−１α（ｍａｔＩＬ−１α）の顕著且つ予想外の減少により特徴付けられる。更に、この発明の動物は、その病理が少なくとも部分的にＩＬ−１により媒介される病気に対する耐性を示す。この発明の動物は、例えば、ＩＣＥインヒビターを評価するための標準的対照として、正常なヒトＩＣＥ遺伝子を提供し、それにより、ヒトＩＣＥインヒビターをイン・ビボでスクリーニングするためのモデルシステムを造り、ＩＣＥインヒビターを用いる治療のための病状を同定するためのレシピエントとして有用である。この発明のトランスジェニック非ヒト動物において、ＩＣＥ遺伝子は、好ましくは、内因性対立遺伝子と、その動物の胚幹細胞前駆体に導入された突然変異したＩＣＥ遺伝子（又はその部分）との間での相同組換えにより破壊される。次いで、胚幹細胞前駆体を発生させて、機能的に破壊されたＩＣＥ遺伝子を有する動物を生成する。この動物は、機能的に破壊された１つのＩＣＥ遺伝子の対立遺伝子を有し（即ち、この動物は、この突然変異についてヘテロ接合であり得る）、又は一層好ましくは、この動物は、機能的に破壊された両ＩＣＥ遺伝子の対立遺伝子を有する（即ち、この動物は、この突然変異についてホモ接合であってよい）。この発明の一具体例において、ＩＣＥ遺伝子の両対立遺伝子の機能的破壊は、その動物の細胞におけるＩＣＥ遺伝子産物の発現が、突然変異してない動物に比べて、実質的に存在しない動物を生成する。他の具体例において、これらのＩＣＥ遺伝子の対立遺伝子は、変化した（即ち、変異した）ＩＣＥ遺伝子産物がその動物の細胞において産生されるように破壊することができる。この発明の機能的に破壊されたＩＣＥ遺伝子を有する好適な非ヒト動物は、マウスである。この発明のホモ接合体動物におけるＩＣＥ機能の本質的に完全な不活性化及びこの発明のヘテロ接合体動物におけるＩＣＥ機能の約５０％の阻害を仮定すれば、これらの動物は、ＩＣＥインヒビターの効果を評価するための正の対照として有用である。例えば、ｍａｔＩＬ−１βの産生を正常に誘導する刺激を、試験すべきＩＣＥインヒビターの存在下で、野生型動物（即ち、突然変異してないＩＣＥ遺伝子を有する動物）に施与して、その動物によるｍａｔＩＬ−１βの生成を測定することができる。野生型動物におけるｍａｔＩＬ−１β応答を、次いで、同様にｍａｔＩＬ−１β刺激を施与されたこの発明のヘテロ接合又はホモ接合体動物におけるｍａｔＩＬ−１β応答と比較して、試験インヒビターの最大ＩＣＥ阻害パーセントを測定することができる。更に、この発明の動物は、特定の病状がｍａｔＩＬ−１α及び／又はｍａｔＩＬ−１βの作用に関係するか否かを従ってＩＣＥインヒビターにより治療することができるか否かを決定するのに有用である。例えば、機能的に破壊されたＩＣＥ遺伝子を有するこの発明の動物において病状を誘発することを試みることができる。続いて、その動物のその病気に対する罹病性又は耐性を測定することができる。ＩＣＥインヒビターを用いて治療し得る病状を、その病状に対するこの発明の動物の耐性に基づいて同定することができる。この発明の他の面は、機能的に破壊された内因性ＩＣＥ遺伝子を有するが異質のインターロイキン−１β変換酵素をコードするトランスジーン（即ち、他の種に由来するＩＣＥ）をもゲノム中に有して発現させるトランスジェニック非ヒト動物に関係する。好ましくは、この動物はマウスであり、異質のＩＣＥはヒトＩＣＥである。ヒトＩＣＥを用いて再構築したこの発明の動物を用いて、イン・ビボでヒトＩＣＥを阻止する薬剤を同定することができる。例えば、ｍａｔＩＬ− １βの産生を誘導する刺激を、試験すべき薬剤の存在及び不在において、この動物に施与して、その動物におけるｍａｔＩＬ−１β応答を測定することができる。ヒトＩＣＥをイン・ビボで阻止する薬剤を、その薬剤の不在時のｍａｔＩＬ− １β応答に比較して、その薬剤の存在時の減少したｍａｔＩＬ−１β応答に基づいて同定することができる。この発明の更に他の面は、宿主細胞中のＩＣＥ遺伝子を機能的に破壊するための核酸構築物に関係する。この核酸構築物は、ａ）相同でない置換部分；ｂ）その相同でない置換部分の上流に位置する第１の相同性領域（この第１の相同性領域は第１のＩＣＥ遺伝子配列との実質的同一性を有するヌクレオチド配列を有する）；及びｃ）相同でない置換部分の下流に位置する第２の相同性領域（この第２の相同性領域は第２のＩＣＥ遺伝子配列との実質的同一性を有するヌクレオチド配列を有し、この第２のＩＣＥ遺伝子配列は、天然の内因性ＩＣＥ遺伝子内の第１のＩＣＥ遺伝子配列の下流に位置を有する）を含む。更に、第１及び第２の相同性領域は、この核酸分子が宿主細胞内に導入された際に、その宿主細胞細胞内でのこの核酸構築物と内因性ＩＣＥ遺伝子との間の相同組換えのために十分な長さである。好適具体例において、相同でない置換部分は、陽性選択発現カセットを含み、好ましくは、調節要素に機能的に結合されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む。他の好適具体例において、この核酸構築物は又、上流又は下流の相同性領域から遠位の陰性選択発現カセットをも含む。好適な陰性選択カセットは、調節要素に機能的に結合された単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を含む。この発明の他の面は、この発明の核酸構築物が取り込まれた組換えベクターに関係する。この発明の更に別の面は、この発明の核酸構築物が導入され、それにより、その核酸構築物と宿主細胞の内因性ＩＣＥ遺伝子との間の相同組換えを与え、内因性ＩＣＥ遺伝子の機能的破壊を生じる宿主細胞に関係する。この宿主細胞は、ＩＣＥを正常に発現する哺乳動物細胞例えばヒトのマクロファージ若しくは単球又は多能性細胞例えばマウス胚性幹細胞であってよい。この核酸構築物が導入されて内因性ＩＣＥ遺伝子と相同組換えされた胚性幹細胞の更なる発生は、その胚性幹細胞の子孫であってそれ故ゲノム中にＩＣＥ遺伝子破壊を有する細胞を有するトランスジェニック非ヒト動物を生成する。次いで、ＩＣＥ遺伝子破壊を生殖細胞系列に有する動物を選択して交配させて、すべての体細胞及び生殖細胞にＩＣＥ遺伝子破壊を有する動物を生成することができる。次いで、かかるマウスを繁殖させて、ＩＣＥ遺伝子破壊についてホモ接合とすることができる。図面の簡単な説明図１は、内因性マウスＩＣＥ遺伝子、ＩＣＥターゲティング用構築物及び内因性ＩＣＥとＩＣＥターゲティング用構築物との間の相同組換えにより生成された変異したＩＣＥ対立遺伝子の図式表示である。図２は、野生型マウス（＋／＋）又はＩＣＥ遺伝子破壊についてヘテロ接合（＋／−）又はホモ接合（−／−）のマウスの脾臓細胞におけるＩＣＥｍＲＮＡの発現を示すノーザンブロットの写真であり、ＩＣＥ突然変異についてホモ接合の動物においては完全長の１．６ｋｂのＩＣＥ転写物の発現がないことを示している。図３は、野生型マウス（＋／＋）又はＩＣＥ遺伝子破壊についてヘテロ接合（＋／−）又はホモ接合（−／−）のマウスからチオグリコレート誘出されたマクロファージにおけるＩＣＥｐ４５蛋白質の発現を示すウエスタンブロットの写真であり、ＩＣＥ突然変異についてホモ接合の動物においてはＩＣＥｐ４５蛋白質の発現がないことを示している。図４は、ＬＰＳ処理を伴う又は伴わないパルス−チェース［³⁵Ｓ］メチオニン標識したマクロファージの細胞溶解物及び培地からのＩＬ−１α及びＩＬ−１β の免疫沈降の写真であり、ＩＣＥ突然変異についてホモ接合の動物においては、ｍａｔＩＬ−１βの分泌がないこと及びｍａｔＩＬ−１αの分泌が減少していることを示している。図５は、ＩＣＥ＋／＋マウス（０％ＩＣＥ阻害を示す）、ＩＣＥ＋／−マウス（５０％ＩＣＥ阻害を示す）及びＩＣＥ−／−マウス（１００％ＩＣＥ阻害を示す）におけるｍａｔＩＬ−１β放出量の標準曲線のグラフである。図６は、低二倍体細胞のパーセントにより測定した、ＩＣＥ＋／＋及び−／− マウス由来の胸腺細胞におけるアポトーシスのパーセントのグラフ表示であり、ＩＣＥ突然変異がアポトーシスを阻止しないことを示している。胸腺細胞は、未処理（培地）か、４℃でインキュベートする（低温）か、デキサメタゾンで処理するか又はガンマー線照射した。図７は、ＩＣＥ＋／＋及び−／−マウスの高投与量のＬＰＳで誘発した敗血症性ショック後の生存のグラフ表示であり、ＩＣＥ遺伝子突然変異についてホモ接合の動物が敗血症性ショックに耐性を示すことを示している。発明の詳細な説明この発明の１つの面は、内因性インターロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ）遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が機能的に破壊されている細胞を有する非ヒト動物に関係する。好ましくは、この動物の体細胞及び生殖細胞の両者は、機能的に破壊されたＩＣＥ遺伝子の対立遺伝子を有する。一層好ましくは、これらの体細胞及び生殖細胞は、機能的に破壊されたＩＣＥ遺伝子の両対立遺伝子を有する。ここで用いる場合、「機能的に破壊された」遺伝子は、その遺伝子の正常な機能を阻止する例えば正常のＩＣＥ遺伝子産物の発現を阻止するか又は正常量のＩＣＥ遺伝子産物の発現を阻止する突然変異を有する。この機能的破壊を引き起こす突然変異は、挿入、欠失又は点突然変異であってよい。一具体例において、ＩＣＥ遺伝子の両対立遺伝子は、ＩＣＥ遺伝子産物の発現が動物の細胞内で実質的に減少し又は存在しなくなるように機能的に破壊される。用語「実質的に減少し又は存在しない」は、正常なＩＣＥ遺伝子産物の本質的に検出不能な量が動物の細胞内で生成されることを意味することを意図している。この型の突然変異は又、当分野では、「ヌル突然変異」とも呼ばれ、かかるヌル突然変異を有する動物は、「ノックアウト動物」とも呼ばれる。他の具体例において、ＩＣＥ遺伝子の両対立遺伝子は、ＩＣＥ遺伝子産物の変化型が動物の細胞中で発現されるように機能的に破壊される。例えば、１つ以上の点突然変異又は欠失突然変異を、ＩＣＥ遺伝子中に導入して、それにより、そこにコードされているＩＣＥ遺伝子産物のアミノ酸配列を変えることができる。好適具体例において、ＩＣＥ遺伝子の対立遺伝子は、細胞中で、その対立遺伝子と、その細胞に導入された変異したＩＣＥ遺伝子又はその部分との間での相同組換えによって機能的に破壊される。この細胞は、ＩＣＥを正常に発現する分化した細胞型例えばマクロファージ若しくは単球又はマクロファージ様若しくは単球様細胞株（即ち、ＩＣＥの発現を含むこれらの細胞型の特性を有する細胞株）であってよい。或は、この細胞は、動物に発生することのできる多能性の前駆体細胞例えば胚性幹細胞であってよい。この細胞が胚性幹細胞である場合には、その細胞を、胚盤胞に導入して、その胚盤胞を養育動物中で発生させ、それにより、ＩＣＥ遺伝子の対立遺伝子が機能的に破壊されている体細胞及び生殖細胞を有する動物を生成することができる。かかる動物は、ここでは、「相同組換え体」動物と呼ぶ。この発明の好適な相同組換え体動物は、マウスである。相同組換え体の細胞又は動物を造るためには、導入された突然変異を有するＩＣＥ遺伝子又はその部分をコードするＤＮＡを含むターゲティング用ベクターを調製する。内因性ＩＣＥ遺伝子中にヌル突然変異を造るための好適なターゲティング用ベクターは、ＩＣＥをコードしないＤＮＡが挿入されたＩＣＥをコードするＤＮＡを含む。例えば、一具体例において、細胞中の内因性ＩＣＥ遺伝子を機能的に破壊するためのこの発明のターゲティング用ベクターは、下記を含む：ａ）相同でない置換部分；ｂ）この相同でない置換部分の上流に位置する第１の相同性領域（この第１の相同性領域は、第１のＩＣＥ遺伝子配列に実質的に同一なヌクレオチド配列を有する）；及びｃ）この相同でない置換部分の下流に位置する第２の相同性領域（この第２の相同性領域は、第２のＩＣＥ遺伝子配列に実質的に同一なヌクレオチド配列を有し、この第２のＩＣＥ遺伝子配列は、天然の内因性ＩＣＥ遺伝子中の第１のＩＣＥ遺伝子配列の下流に位置を有する）。従って、相同でない置換部分は、５’及び３’側で、ＩＣＥ遺伝子配列と実質的に同一性のヌクレオチド配列と隣接している。ＩＣＥ遺伝子配列に「実質的に同一性の」ヌクレオチド配列は、そのヌクレオチド配列と宿主細胞中の内因性ＩＣＥ遺伝子配列との間の相同組み換えを可能にするだけ十分にＩＣＥ遺伝子配列に対する相同性を有するヌクレオチド配列を記述することを意図している。典型的には、隣接相同性領域のヌクレオチド配列は、相同組換えの標的とされる内因性ＩＣＥ遺伝子のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、一層好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％同一である。最も好ましくは、これらの隣接相同性領域は、標的の内因性対立遺伝子と同系である（例えば、これらの隣接領域のＤＮＡは、ターゲティング用構築物を導入すべき細胞と同じ遺伝的バックグラウンドの細胞から単離される）。更に、このターゲティング用ベクターの隣接相同性領域は、ベクターを宿主細胞に導入した際のそのターゲティング用ベクターと宿主細胞内の内因性ＩＣＥ遺伝子との間での相同組換えのために十分な長さのものである。典型的には、これらの隣接相同性領域は、少なくとも１キロベースの長さであり、一層好ましくは、少なくとも数キロベースの長さである。典型的なターゲティング用ベクターは、陽性選択発現カセットを相同でない置換部分として有する。用語「陽性選択発現カセット」は、陽性選択マーカーの発現を制御する調節要素（例えば、プロモーター及びポリアデニル化配列）に機能的に結合した陽性選択マーカーをコードするヌクレオチド配列をいう。「陽性選択マーカー」は、そのマーカーを含む細胞の選択を可能にするが、そのマーカーを含まない細胞及び発現しない細胞は不利に選択される（例えば、選択剤によって殺される）。例えば、好適な陽性選択発現カセットには、プロモーター及びポリアデニル化シグナルに機能的に結合されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（「ｎｅｏ」）遺伝子が含まれる。ｎｅｏ遺伝子を有して発現する細胞は、選択剤Ｇ４１８に対する耐性を示す。陽性選択発現カセットに加えて、この発明のターゲティング用ベクターは、典型的には、上流又は下流の相同性領域（即ち、ＩＣＥをコードする配列と実質的に同一の領域）の遠位に位置する陰性選択発現ベクターをも含む。「陰性選択発現カセット」は、陰性選択マーカーの発現を制御する調節要素に機能的に結合された陰性選択マーカーをコードするヌクレオチド配列をいう。「陰性選択マーカー」は、そのマーカーを有する細胞に不利な選択を可能にし、例えばそのマーカーを含んで発現する細胞は選択剤によって殺されるが、その陰性選択マーカーを含まない細胞及び発現しない細胞は生存する。例えば、好適な陰性選択発現カセットには、プロモーター及びポリアデニル化シグナルに機能的に結合された単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（「ｔｋ」）遺伝子が含まれる。ｔｋ遺伝子を含んで発現する細胞は、例えば、選択剤ガンシクロバーにより殺され得る。このターゲティング用ベクターの構成は、相同組換え体を選択するための「陽性／陰性」選択技術の利用を可能にし：このターゲティングベクターが導入されて陽性選択マーカーを含んで発現するが陰性選択マーカーを失った細胞が選択される。従って、これらの細胞は、相同でない置換部分のＤＮＡ（例えば、挿入されたｎｅｏ遺伝子）を有するが、ターゲティング用ベクター中でそれらの遠位に位置する陰性選択マーカーをコードするＤＮＡを、おそらく、ターゲティング用ベクターと内因性ＩＣＥ遺伝子との間の相同組換えの結果として失っている。好適具体例において、ターゲティング用ベクターは、マウスのＩＣＥ（ｍＩＣＥ）遺伝子配列に対する実質的同一性を有する隣接相同性領域を含み、それにより、マウス宿主細胞（例えば、マウス胚性幹細胞）中の内因性マウスＩＣＥ遺伝子を相同組換えの標的とする。このターゲティング用ベクターの隣接相同性領域として用いられるマウスＩＣＥゲノムＤＮＡは、マウスゲノムＤＮＡライブラリーから、マウスＩＣＥｃＤＮＡの全部又は部分を含むｃＤＮＡプローブを用いてこのライブラリーをスクリーニングすることにより、標準的技術を用いて単離することができる。好ましくは、スクリーニングされるゲノムＤＮＡライブラリーは、ターゲティング用ベクターでトランスフェクトされる細胞と同系の細胞から調製する。例えば、マウスの１２９／Ｓｖ株（Stratageneから市販されている）由来のゲノムライブラリーをスクリーニングして、１２９／Ｓｖから誘導したＤ３胚性幹細胞株に対するトランスフェクションのためのターゲティング用ベクターにおいて用いるためのマウスＩＣＥゲノムＤＮＡを単離することができる。このマウスＩＣＥｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びマウスＩＣＥ蛋白質の配列は、Nett等(1992)J.Immunol.149:3254-3259 に開示されており、それぞれ SEQ ID NO:１５及び１６に示してある。このマウスＩＣＥ遺伝子の構造及び完全なヌクレオチド配列は、Casano,F.J．等(1994)Genomics 20:474-481 に開示されている。マウスＩＣＥ遺伝子のゲノム構造及び制限地図を、図１に示す。内因性マウスＩＣＥ遺伝子を機能的に破壊するためのターゲティング用ベクターを造るためには、相同でない置換部分（例えば、ｎｅｏ遺伝子）は、好ましくは、ターゲティング用ベクター中のマウスＩＣＥ遺伝子のエキソン６中に挿入する。相同でない置換部分は、好ましくは、上流では、エキソン１〜５と隣接し、下流では、エキソン７及び、このマウスＩＣＥ遺伝子のエキソン７とエキソン８との間のイントロンの部分と隣接する。しかしながら、相同でない置換部分をＩＣＥ遺伝しないの他の位置に挿入して種々の相同性領域と隣接させ、それにより、その遺伝子を機能的に破壊することができるということは、当業者には認められよう。マウスＩＣＥ遺伝子の機能的破壊のためのターゲティング用ベクターの構築は、実施例１に更にて詳細に説明する。ｍＩＣＥ遺伝子配列の機能的破壊は、完全長のｍＩＣＥｍＲＮＡ転写物の発現を（例えば、ｎｅｏ遺伝子の挿入により）阻止することができ、ｍＩＣＥの変化した形態をコードするｍＩＣＥｍＲＮＡ転写物の発現へと導き得る。或は、ヒト宿主細胞（例えば、マクロファージ又は単球）中のヒトＩＣＥ（ｈＩＣＥ）遺伝子を相同組換えの標的とするためには、ターゲティング用ベクターは、ヒトＩＣＥ遺伝子配列に対する実質的同一性を有する隣接相同性領域を含む。ヒトＩＣＥゲノムＤＮＡ配列は、ヒトゲノムＤＮＡライブラリーを、ヒトＩＣＥｃＤＮＡの全部又は部分を含むｃＤＮＡプローブを用いてスクリーニングすることにより、標準的技術を用いて単離することができる。ヒトＩＣＥｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びＩＣＥ蛋白質の予想アミノ酸配列は、Thornberry等(1992) Nature 356:768-774及びＰＣＴ国際公開第ＷＯ９１／１５５７７号に開示されており、それぞれ、SEQ ID NO:１７及び１８に示してある。マウスＩＣＥ遺伝子について記載したように、ヒト細胞におけるヒトＩＣＥ遺伝子配列の機能的破壊は、完全長のｈＩＣＥｍＲＮＡ転写物の発現を阻止することができ又は、ｈＩＣＥの変化した形態をコードするｈＩＣＥｍＲＮＡ転写物の発現へと導き得る。宿主細胞中の内因性ＩＣＥ遺伝子の対立遺伝子を機能的に破壊するためには、この発明のターゲティング用ベクターを、ＩＣＥを正常に発現する宿主細胞例えば分化した細胞又は胚性幹細胞に導入して、相同組換え体を選択する。ターゲティング用ベクターは、外因性ＤＮＡの導入に適した当分野で公知の幾つかの技術の何れかによって宿主細胞に導入することができる（例えば、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、マイクロインジェクション、リポフェクション等）が、最も好ましくは、エレクトロポレーションによって宿主細胞に導入する。このベクターを宿主細胞に導入した後に、その細胞を、導入したターゲティング用ベクターと内因性ＩＣＥ遺伝子との間での相同組換えを可能にするのに十分な期間及び条件にて培養する。宿主細胞を（例えば、上記の陽性／陰性選択技術により）選択して、内因性ＩＣＥ遺伝子座における相同組換えについて、標準的技術（例えば、正常な内因性対立遺伝子を相同組換え型対立遺伝子から区別するプローブを用いるサザーンハイブリダイゼーション）によりスクリーニングする。ＩＣＥ遺伝子破壊についてホモ接合の細胞（例えば、マクロファージ又は単球）を造るためには、Mortensen,R.N.等(1992)Mol.Cell.Biol.12:2391-2395のＧ４１８エスカレーション法を、ヘテロ接合細胞において用いることができる。或は、野生型宿主細胞の第１の対立遺伝子を、１つのマーカー（例えば、Ｇ４１８耐性）を用いて選択される第１の相同組換え事象により破壊することができ、次いで、これらのヘテロ接合細胞の第２の対立遺伝子を、異なるマーカー（例えば、ハイグロマイシン耐性）を用いて選択される第２の相同組換え事象により破壊することができる（例えば、TERiele,H.(1990)Nature 348:649-651を参照されたい）。この発明の相同組換え動物を造るためには、機能的に破壊された１つのＩＣＥ遺伝子の対立遺伝子を有する胚性幹細胞を、胚盤胞に導入し、その胚盤胞を、偽妊娠養育母親に移植して、胎児を妊娠期間満了まで発生させる。その結果生成した動物は、この胚性幹細胞に由来する子孫の細胞を有するキメラである。この胚性幹細胞が生殖細胞に寄与しているキメラ動物を、野生型動物と交配させて、それにより、すべての体細胞及び生殖細胞におけるＩＣＥ遺伝子破壊についてヘテロ接合の動物を生成することができる。このヘテロ接合動物を、次いで、交配させて、ＩＣＥ遺伝子破壊についてホモ接合の（即ち、機能的に破壊されたＩＣＥ遺伝子の両対立遺伝子を有する）動物を造ることができる。これらの動物は、イン・ビボスクリーニングアッセイのための対照用又は試験用動物として用いることができる（以下に、一層詳細に記載）。更に、ＩＣＥ遺伝子破壊についてホモ接合の動物の細胞を、これらの動物から単離して、イン・ビトロスクリーニングアッセイでの使用のために培養することができる。例えば、ＩＣＥを正常に発現する腹膜滲出液マクロファージ（例えば、チオグリコレート誘出したもの）を、これらの動物から、標準的技術によって単離することができる。更に、不滅化細胞株を、この動物の細胞から、細胞不滅化のための標準的技術を用いて、例えばこれらの細胞の、ｍｙｃ、ｒａｓ又はＳＶ４０ラージＴ抗原をコードする発現ベクターでのトランスフェクションにより調製することができる。マウスＩＣＥ遺伝子を相同組換えにより機能的に破壊するためのターゲティング用ベクター及び方法論は、実施例１〜３において一層詳細に説明する。ターゲティング用ベクター及び方法論の更なる説明については、例えば、Thomas,K.R. 等(1986)Cell 44:419-428; Thomas,K.R.等(1987)Cell 51:503-512; Thomas,K.R. 等(1992)Mol.Cell.Biol.12:2919-2923; Deng,C．及びCapecchi,M.R.(1992)Mol. Cell.Biol.12:3365-3371; Hasty,P.等(1992)Mol.Cell.Biol.12:2464-2474; Li, E.等(1992)Cell 69:915; Zhang,H．等(1994)Mol.Cell.Biol.14:2404-2410; Brad ley,A．Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach， E.J.Robertson 編、（IRL、Oxford，1987）113-152 頁; ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９１／１１３５４号；ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９１／０１１４０号；ＰＣＴ第ＷＯ９１／１９７９６号；ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９２／２０８０８号；及びＰＣＴ国際公開第ＷＯ９３／０４１６９号を参照されたい。ＩＣＥ遺伝子の両コピーは、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９３／１６１７７号に記載された方法によって機能的に破壊することができる。更に、レコンビナーゼを用いて、ＩＣＥ遺伝子を、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９３／２２４４３号に記載された相同組換えにより機能的に破壊することができる。ＩＣＥ遺伝子の対立遺伝子におけるヌル突然変異の導入を与えることに加えて、類似の技術を用いて、点突然変異又は欠失をＩＣＥ遺伝子の対立遺伝子中に導入することができる。例えば、点突然変異を、マウスＩＣＥ遺伝子のエキソン６中に、ＩＣＥの活性部位のシステインをコードするコドンに、単独で又は、活性部位のアミノ酸残基をコードするコドンに導入された１つ以上の点突然変異と共に導入することができる。例えば、マウスＩＣＥの活性部位のシステイン（アミノ酸位置２８４）又はヒトＩＣＥの活性部位のシステイン（アミノ酸位置２８５）を突然変異させて、ＩＣＥプロテアーゼ活性を廃止し又はその基質特異性を変えることができる。更に、Ｐ１カルボキシレート結合ポケットを含む４つのアミノ酸残基の１つ以上を突然変異させることができる。ヒトＩＣＥにおいては、活性部位ポケットのアミノ酸残基は、Ａｒｇ¹⁷⁹、Ｇｌｎ²⁸³、Ａｒｇ³⁴¹及びＳｅｒ³⁴⁷であり（Walker,N.P.C．等(1994)Cell 78:343-352 に開示されたヒトＩＣＥの結晶構造の説明を参照されたい）、これらの残基は、マウスＩＣＥにおいて保存されている。点突然変異又は欠失突然変異を、ＩＣＥ遺伝子の対立遺伝子中に、例えば「ヒット・アンド・ラン」相同組換え手順により（Valancius,V.及び Smithies,O.(1991)Mol.Cell.Biol.11:1402; 及びHasty,P.等(1991)Nature 350:2 43-246に記載のように）又は二重置換相同組換え点順により（Wu,H．等(1994)Pr oc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2819-2823 に記載のように）導入することができる。従って、他の具体例において、この発明は、変化したＩＣＥ遺伝子産物を発現する相同組換え型の細胞及び動物（例えば、ヒト細胞又は非ヒト動物）を提供する。実施例４に一層詳細に説明するように、ＩＣＥ遺伝子のヌル突然変異についてホモ接合の相同組換え動物の細胞による成熟インターロイキン−１β（ｍａｔＩＬ−１β）の分泌は、変異してない野生型対照用動物（即ち、ＩＣＥ遺伝子の対立遺伝子が機能的に破壊されていない同種の動物）と比較して、実質的に減少する。ｍａｔＩＬ−１β生成に関して、用語「実質的に減少」は、この発明のホモ接合の細胞又は動物により生成されるｍａｔＩＬ−１βの量が、変異してない同種の野生型動物により生成される量より少なくとも５０％少なく、一層好ましくは７５％少なく、尚一層好ましくは９０％減よりも少ないことを意味することを意図している。好適具体例においては、これらの細胞又は動物により生成されるｍａｔＩＬ−１βのレベルは、本質的に、標準的技術例えば市販の酵素結合免疫吸着剤アッセイにより検出不能である。ＩＣＥ遺伝子破壊についてヘテロ接合の動物は、ホモ接合の動物の約半分のｍａｔＩＬ−１βレベルを示す。例えば、ｍａｔＩＬ−１β生成が本質的にホモ接合動物においては、野生型動物に比べて検出不能（即ち、約１００％減少）であるならば、ヘテロ接合動物におけるｍａｔＩＬ−１βレベルは、野生型レベルから約５０％減少している。更に、ＩＣＥ遺伝子破壊についてホモ接合の動物においては、成熟インターロイキン−１α（ｍａｔＩＬ−１α）の分泌が、予想外に且つ実質的に、変異してない野生型対照用動物に比べて減少する。ＩＬ−１α分泌に関して、用語「実質的に減少」は、ホモ接合の変異型動物において又はその動物から誘導された細胞により分泌されるｍａｔＩＬ−１αの量が、同種の変異してない対照用動物において分泌されるｍａｔＩＬ−１αの量より少なくとも２５％少なく、一層好ましくは少なくとも５０％少なく、尚一層好ましくは少なくとも７５％少ないことを意味することを意図している。前の研究は、ｍａｔＩＬ−１αの分泌におけるＩＣＥの役割を示唆しなかったが；ここに記載した結果は、ＩＣＥによるプレＩＬ −１βの開裂により生成されるＩＣＥ及び／又はｍａｔＩＬ−１βが正常量のＩＬ−１αの生成及び／又は放出に必要であることを示す。従って、この発明の細胞及び動物は、予想外にも、ｍａｔＩＬ−１α並びにｍａｔＩＬ−１βの効果の研究に適用することができる。この発明の動物並びにそれらから導かれる細胞の特徴及び性質は、以下の数節において一層詳細に説明するように、それらを、広範囲の応用について有用なものとする。この発明の動物及び細胞の利用１．一具体例において、この発明の動物又はそれから導いた細胞は、ＩＣＥインヒビターの効力を評価するための陽性対照用動物として用いられる。本発明以前においては、スクリーニングアッセイにおいてＩＣＥインヒビターを評価することのできる陽性標準はなかった。この発明のホモ接合及びヘテロ接合動物は、かかる標準を提供する。ＩＣＥインヒビターの効力を同定して評価するスクリーニングアッセイにおいて、このインヒビターで処理してない野生型動物（又は、それから導いた細胞）は、０％阻害標準として使用され、ＩＣＥ遺伝子破壊についてヘテロ接合の動物（又は、それから導いた細胞）は、５０％阻害標準として使用され、ＩＣＥ遺伝子破壊についてホモ接合の動物（又は、それから導いた細胞）は、１００％阻害標準として使用される。ＩＣＥインヒビターで処理した患者におけるＩＣＥ活性の量を、次いで、これらの標準に対して評価する。この発明の動物又はそれから導いた細胞の、ＩＣＥインヒビター（例えば、ＩＣＥインヒビターＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ、テトラペプチドアルデヒド）の効力を標準化する陽性対照としての利用は、実施例４及び図５において一層詳細に説明する。２．この発明の動物又はそれから導いた細胞は又、ＩＣＥインヒビターを、ＩＣＥ自身以外の標的（例えば、ＩＣＥイソ型）に対するこのインヒビターの作用から生じる副作用又は毒性についてスクリーニングするのにも用いることができる。例えば、ＩＣＥインヒビターをＩＣＥヌル突然変異についてホモ接合のこの発明の動物に投与し、生じる結果をモニターしてこのインヒビターの副作用又は毒性を評価する。この動物がＩＣＥインヒビターの正常の標的（即ち、活性なＩＣＥ蛋白質）を欠いているので、このインヒビターのＩＣＥヌル変異体への投与に際して認められる効果は、他の標的（例えば、ＩＣＥイソ型）に対するＩＣＥ阻害の副作用に帰することができる。従って、この発明の動物は、これらの副作用をこのインヒビターのＩＣＥ作用に対する直接的効果から区別するのに有用である。３．この発明の動物は又、イン・ビボスクリーニングアッセイにおいて用いて、ｍａｔＩＬ−１α及び／又はｍａｔＩＬ−１βが病因において役割を演じる病気を同定することもできる。かかるスクリーニングアッセイは、更に、ＩＣＥインヒビターにより治療することのできる病気を同定するために有用である。この発明の動物は、ｍａｔＩＬ−１βの有意に減じたレベルを有するだけでなく、実質的に減少した量のｍａｔＩＬ−１αを分泌するので、これらの動物は、予想外にも、特定の病状（例えば、乾癬）におけるＩＬ−１αの役割を評価するために適用することができる。ｍａｔＩＬ−１α及び／又はｍａｔＩＬ−１β分泌が関係し、それ故、ＩＣＥインヒビターにより治療可能な病状を同定するために、ＩＣＥ遺伝子破壊についてホモ接合のこの発明の動物においてその病状を誘導する試みを行なう。一具体例において、その病状を誘導する試みは、その動物に、野生型動物にその病状を誘導する刺激を施与することを含む（例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）の投与による敗血症性ショックの誘導）。他の具体例においては、この病状を誘導する試みは、この発明の動物を、遺伝的に特定の病気にかかり易い他の動物と交配させることを含む。これらの動物を、少なくとも、それらが、ＩＣＥヌル突然変異についてホモ接合になるまで交雑させる。例えば、この発明の動物を、特定の自己免疫疾患にかかり易い動物と交配させて、ＩＬ−１のその自己免疫疾患の病理への関与を評価し、ＩＣＥインヒビターがその自己免疫疾患の治療に有効であり得るか否かを測定することができる。遺伝的に特定の自己免疫疾患にかかり易いマウスの系統の例には、紅斑性狼瘡のモデルであるＭＲＬ／１ｐｒマウス（Cohen,P.L. 等(1991)Ann.Rev.Immunol.9:243-269）及びインシュリン依存性真性糖尿病のモデルであるＮＯＤマウス（Rossinni,A.A.(1985)Ann.Rev.Immunol.3:289-320）が含まれる。この発明の動物と交配させることのできる他のマウス系統（及びそれらの罹病性）の非制限的例には、ＤＢＡ／１（コラーゲン誘発される関節炎；リウマチ様関節炎のモデル）（Wooley,P.H．等(1981)J.Exp.Med.154:688-700）、ＢＡＬＢ／ｃ（プロテオグリカン誘発される関節炎及び脊椎炎；リウマチ様関節炎及び強直性脊椎炎のモデル）（Glant,T.T.等(1987)Arthritis Rheum.30:201-2 12）、ＰＬ／Ｊ（実験的自己免疫性脳脊髄炎；多発性硬化症のモデル）（Fritz, R.B.等(1983)J.Immunol.130:191-194）、ＮＺＢ／ＫＮ（多発性関節炎；リウマチ様関節炎及び骨関節症のモデル）（Nakamura,K．等(1991)Arthritis Rheum.34 :171-179）、Ｃ５７ＢＬ（骨関節症；Pataki,A．等(1990) Agents Actions 29:201-209）、ＳＴＲ／ＯＲＴ（多発性関節炎；リウマチ様関節炎及び骨関節症のモデル）（Dunham,J．等(1990)J.Orthop.Res.8:101-104）及びＴｓｋ／＋（全身性硬化症；Siracusa,L.D．等(1993)Genomics 17:748-751）が含まれる。ＭＨＣ関連疾患モデル用には、その病気にかかり易いＭＨＣハプロタイプを維持する交雑子孫を選択する。遺伝的に特定の病気にかかり易い多くのマウス系統を、Jackson Laboratory（メイン、Bar Harbor 在）その他の商業的及び学術的起源から入手することができる。次いで、これらの交雑動物に、その病状が自発的に誘発され又は実験的に誘発する。このＩＣＥヌル突然変異動物における病状の誘発に続いて、この動物のこの病状に対する罹病性又は耐性を測定する。この病状に対するこの動物の、野生型動物と比較しての耐性は、この病状の病理がｍａｔＩＬ−１α及び／又はｍａｔＩＬ−１βの作用と関係すること及びそれ故この病状がＩＣＥインヒビターを用いて治療可能であることを示す。この有用性の例として、実施例６は、ホモ接合のＩＣＥヌル変異型マウスがＬＰＳ誘発される敗血症性ショック、ＩＬ−１がその病理に関与することが以前に含意された病気に耐性であることを示す。従って、ＩＬ−１の作用に関係があると考えられる病気のモデルを用いて、その病気に対するホモ接合のＩＣＥヌル突然変異体の耐性を示した。この発明の動物は又、特定の病状の病態生理学がｍａｔＩＬ−１α又はｍａｔＩＬ−１βの何れかに関係するか否かを決定するために用いることもできる。ｍａｔＩＬ−１α又はｍａｔＩＬ−１β（これらの両者は、ＩＣＥ−／−動物において減少している）の発現は、ＩＣＥ−／−動物において、一の又は他のサイトカインの成熟型をコードするトランスジーンを標準的技術によってＩＣＥ−／− 動物のゲノム中に導入することにより回復することができる。例えば、適当な調節要素に機能的に結合されたＩＬ−１α又はβの成熟型をコードする核酸構築物を、ＩＣＥ−／−動物から得た受精卵母細胞に注入することができる。この方法において、主としてｍａｔＩＬ−１α又はｍａｔＩＬ−１βの何れかを発現するＩＣＥ−／−動物を造ることができる。次いで、これらの動物に病状を誘発してその病気の病態生理学におけるＩＬ−１α又はβの特異的役割を評価することができる。４．他の具体例においては、ＩＣＥヌル突然変異についてホモ接合のこの発明の動物又はそれから導いた細胞を、ヒトＩのＣＥ遺伝子を用いて再構成して、ヒトＩＣＥ遺伝子産物を発現する非ヒト細胞又は動物を造る。次いで、これらの細胞及び動物を用いて、培養細胞又は動物においてイン・ビボで、ヒトＩＣＥの活性を阻害する薬剤を同定するための化合物をスクリーニングすることができる。ヒトＩＣＥ再構成された動物は、ヒトＩＣＥをコードする核酸を、この発明の動物から得た胚性前駆体細胞のゲノム中に導入し、それらの胚性細胞を、トランスジェニックの相同組換え動物を造るための標準的技術を用いて発生させることにより作成するすることができる。ヒトＩＣＥをコードする核酸を、（例えば、ヒトＩＣＥ遺伝子構築物の、ＩＣＥ欠損動物から得た受精卵母細胞へのマイクロインジェクションによって）ＩＣＥ欠損動物のゲノム中にランダムにインテグレートすることができ、又はこの核酸を、相同組換えによって、内因性ＩＣＥ遺伝子座にインテグレートさせることができる（即ち、ヌル突然変異を有する内因性ＩＣＥ遺伝子を外部から導入したヒトＩＣＥ遺伝子により置き換えることができる）。このヒトＩＣＥ遺伝子構築物は、ＩＣＥポリペプチドの組織特異的な調節された発現又はこの哺乳動物の細胞におけるヒトＩＣＥポリペプチドの構成的発現を可能にする上流及び／又は下流の調節要素を含むことができる。この発明のヒトＩＣＥ再構築された動物も又、ヒトＩＣＥポリペプチドを発現する非ヒト細胞の源を提供する。かかる細胞（例えば、マクロファージ又は単球）は、この動物から単離することができ、必要であれば、標準的技術により、不滅化することができる。ヒトＩＣＥポリペプチドを発現する細胞を有するこの発明の非ヒト動物を用いて、イン・ビボでヒトＩＣＥ機能を阻止し得る化合物を同定するための薬剤をスクリーニングすることができる。例えば、化合物のパネルを、個々に、この動物（例えば、マウス）に、ｍａｔＩＬ−１βの生成を正常に誘導する刺激と共に投与することができる。ｍａｔＩＬ−１β生成を誘導するために用い得る刺激の非制限的例には、リポ多糖（ＬＰＳ）が含まれる（単独で、又はアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ザイモサン及びカラギーナンを伴う）。次いで、試験化合物の存在及び不在において、ｍａｔＩＬ−１βの生成を評価することができる。この動物におけるｍａｔＩＬ−１βの生成は、直接又は間接に評価することができる。好ましくは、ｍａｔＩＬ−１β生成は、この動物の少なくとも１種の生物学的液体におけるｍａｔＩＬ−１β蛋白質の量を測定することにより、直接測定する。例えば、ｍａｔＩＬ−１βレベルを、これらの動物の血清、血漿若しくは腹膜腔液にて測定し又はこの動物からの空気嚢洗液若しくは組織房滲出液にて測定することができる。或は、ｍａｔＩＬ−１β生成を、その動物におけるｍａｔＩＬ −１β関連症状（例えば、嗜眠、震え、起毛等）を測定することにより直接測定することができる。動物（例えば、ＬＰＳ処理した動物）におけるｍａｔＩＬ− １β生成を評価する方法は、実施例６に、更に詳細に説明する。ヒトＩＣＥ再構成された動物を用いてＩＣＥインヒビターをスクリーニングする場合には、試験薬剤の存在下での減少したｍａｔＩＬ−１β生成を、その薬剤がヒトＩＣＥの活性をイン・ビボで阻害することの指標として用いる。或は、ｍａｔＩＬ−１ β生成に対するこれらの化合物の効果を、イン・ビトロで、これらの化合物をｍａｔＩＬ−１βの生成を正常に誘導する刺激と共にヒトＩＣＥ再構成された動物から得た細胞とインキュベートして、生成されたｍａｔＩＬ−１βの量を測定することによりスクリーニングすることができる。５．この発明の動物又はそれらから導いた細胞を用いて、正常のＩＣＥバックグラウンドの不在においてＩＣＥ相同物又はイソ型を同定し及び／又はクローン化することができる。この発明のホモ接合のノックアウト動物のノーザンハイブリダイゼーション分析は、ＩＣＥプローブと弱くハイブリダイズする少なくとも１つのバンドを示し（図２参照。実施例３に説明あり）、ＩＣＥ遺伝子と関連する配列を有するｍＲＮＡが（これらの配列は、ｍａｔＩＬ−１β生成において破壊されたＩＣＥ遺伝子を補償しないのに）この動物において依然発現されていることを示唆している。従って、この発明のホモ接合動物の細胞から単離したｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡライブラリーを、ＩＣＥｃＤＮＡプローブを用いてスクリーニングして、破壊されたＩＣＥ遺伝子と配列において関係するｃＤＮＡを単離することができる。６．この発明の動物を用いて、多数の突然変異を有する更なる動物を造ることができる。一具体例において、この発明の動物を他のヌル突然変異を有する動物と交配して二重（又は三重等）のノックアウト動物を造る。他の具体例においては、この発明の動物を用いて、更なる遺伝子の機能的破壊のためのターゲティング用ベクターを導入することのできる胚性幹細胞を造る。かかる方法において、多数のＩＣＥ／ＩＣＥ相同物欠損を有する動物を造ることができる。例えば、ＩＣＥ相同物（例えば、上記の第５節に従って又は他の分子生物学的方法により同定されるもの）をコードする遺伝子を機能的に破壊し、その破壊されたＩＣＥ相同物遺伝子を有する動物を破壊されたＩＣＥ遺伝子を有するこの発明の動物と交配し、それにより、二重のＩＣＥ／ＩＣＥ相同物ノックアウト動物を造ることができる。これらの多重ＩＣＥ欠損動物を用いて、その動物中の残りのＩＣＥ相同物に対するＩＣＥインヒビターの効力を評価することができる。更に、多重ＩＣＥ欠損動物における残りのＩＣＥ相同物の病状における役割を評価することができる。ＩＣＥノックアウト動物は又、他のノックアウト又はトランスジェニック動物と交配して、種々の病状における欠損遺伝子産物の役割を調べることができる。この発明の動物と交配して病状を調べることのできる当分野で公知のノックアウト及びトランスジェニック動物（並びにそれらの罹病性）の非制限的例には、インターロイキン２（ＩＬ−２）ノックアウト（炎症性腸疾患）（Sadlack,B.等(1 993)Cell 75:253-261）、Ｔ細胞レセプターノックアウト（炎症性腸疾患）（Mom baerts,P.等(1993)Cell 75:275-282）、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラス IIノックアウト（炎症性腸疾患）（Mombaerts,P.等(1993)Cell 75:275-282）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）ノックアウト（炎症性腸疾患）（Kuhn,R．等(1993)Cell 75:263-274）、ＴＧＦβ１ノックアウト（多臓器炎症）（Shull,M .M.等(1992)Nature 359:693-699）、ＴＮＦαトランスジェニック（関節炎）（K effer,J．等(1991)EMBO J.10:4025-4031）及びＴＮＦαトランスジェニック−Ｔ細胞特異的（ＴＮＦαの全身性毒性）（Probert,L.等(1993)J.Immunol.151:1894 -1906）が含まれる。病状は、これらの二重（三重等）のノックアウト又はトランスジェニック動物において、自発的に誘発され又は実験的に誘発して、その病気における変質した遺伝子産物の関与を評価することができる。７．この発明の動物は又、特定の物質がＩＣＥの基質であるか否かを決定するのにも有用である。ＩＣＥは、プロＩＬ−１βをｍａｔＩＬ−１βに開裂するが、他の内因性の基質の蛋白質分解にも関与し得るシステインプロテアーゼである。推定上の基質の前駆体型がＩＣＥによって成熟型に開裂されるか否かを評価するためには、ＩＣＥ欠損動物において、その推定上の基質の成熟型の存否を測定する。ＩＣＥの開裂生成物である推定上の基質の成熟型は、この発明のＩＣＥ欠損動物においては、実質的に減少し又は存在しないであろう。８．この発明の動物は又、コンジェニック野生型動物から移植された組織のレシピエントとして用いて、検出可能な活性を有するＩＣＥ相同物又はＩＣＥイソ型を発現する組織を同定することもできる。このように同定されたＩＣＥ相同物又はイソ型は、その組織から単離することができ及び／又は標準的分子生物学的技術によってクローン化することができる。この発明は、更に、下記の実施例により説明されるが、それらは、限定するものと解釈すべきではない。この出願中で引用されているすべての参考文献並びに公開された特許及び特許出願の内容を、参考として本明細書中に援用する。実施例１：ＩＣＥ遺伝子ターゲティング用ベクターの構築一部のマウスＩＣＥｃＤＮＡクローンを、マウスのマクロファージｃＤＮＡライブラリー（Stratageneから購入）から、完全長のヒトＩＣＥコード配列（T.Gh ayur博士の好意による提供）をプローブとして用いて、標準的技術により単離した。次いで、このマウスＩＣＥｃＤＮＡ断片をプローブとして用いて、マウスの１２９／Ｓｖ系統から作成したゲノムＤＮＡライブラリー（Stratageneより購入；R.Jaenisch博士から提供された更なるライブラリー）を、再び標準的技術を用いてスクリーニングした。単離されたマウスＩＣＥゲノムクローンを、次いで、制限地図作製、部分的ＤＮＡ配列決定及びターゲティング用ベクターの構築のためにプラスミッドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Stratageneより購入）中にサブクローン化した。このマウスＩＣＥ遺伝子は、エキソン６中にコードされるシステインプロテアーゼの特徴的な活性部位システインを有する１０エキソンよりなった。このＩＣＥ遺伝子を機能的に破壊するために、相同でないＤＮＡがエキソン６中に挿入されたターゲティング用ベクターを調製した（プロセスにおいてＩＣＥコード配列の３１ｂｐを削除し、残りの下流のＩＣＥコード配列を翻訳開始に関してフレームからはずす）。従って、もし何れかの翻訳生成物がＩＣＥ遺伝子の別のスプライシングを受けた転写物から形成されるようなことがあれば、それらは、活性部位システイン残基を含まないであろう。ＩＣＥターゲティング用ベクターを、プラスミッドｐＰＮＴ（Mulligan博士の好意による提供）を用いて構築した。このプラスミッドは、ホスホグリセロキナーゼプロモーターの制御下のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子及び同プロモーターの制御下の単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）遺伝子を有する。エキソン６の部分と下流の配列を含む２．２ｋｂのＳｐｈＩ−ＮｏｔＩＩＣＥ断片をゲノムクローンから単離して、次の配列を有する２つのオリゴヌクレオチドを用いて作成したＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩアダプターを用いて、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ部位にサブクローン化した：5'GATCCGAACCCCTTCGCATG3'（SEQ ID NO:１）及び5'CGAAGGGGTTCG3'（SEQ ID NO:２）。この２．２ｋｂのＩＣＥ断片を、次いで、ＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ断片として単離し、ＮｏｔＩ末端をクレノーを用いて充填した。この断片を、ｐＰＮＴ中に、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ部位に、ＥｃｏＲＩ部位を充填した後に挿入し、そうして、この断片を、５’末端ではｎｅｏ遺伝子の後ろの適当な位置に、３’末端ではチミジンキナーゼ遺伝子の前の適当な位置に置いた。このプラスミッドは、ｐＰＮＴ３’ＩＣＥという。ＩＣＥ上流配列並びにエキソン１〜５を含み且つエキソン６の途中で終了する６．５ｋｂのＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ断片をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にサブクローン化し、次いで、ＮｏｔＩ−ＸｈｏＩ断片として切り出して、ｐＰＮＴ３’ＩＣＥベクター中にｎｅｏ遺伝子の５ ’側に挿入した。この最終的ターゲティング用構築物において、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｐｈＩ部位内に含まれる３１ｂｐＩＣＥ配列をエキソン６から削除した。ＩＣＥ遺伝子ターゲティング用ベクターを、図１に図式表示する。陽性選択ｎｅｏ遺伝子は、ＩＣＥ配列のエキソン６内に、ＩＣＥ遺伝子と同じ向きで位置されるが、陰性選択ＨＳＶｔｋ遺伝子はこの構築物の３’末端にある。この構成は、相同組換えに対する陽性及び陰性選択アプローチを可能にした（Mansour,S.L. 等(1988)Nature 336:348）。胚性幹細胞中へのトランスフェクション前に、このプラスミッドをＮｏｔＩ消化によって線状化した。実施例２：胚性幹細胞のトランスフェクション及び分析Ｄ３胚性幹細胞（Doestschman,T.C.等(1985)J.Embryol.Exp.Morphol.87:27-45 ）を、１５％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、ペニシリン（５０ｕ／ｍｌ）／ストレプトマイシン（４０μｇ／ｍｌ）、非必須アミノ酸、１００μＭ２−メルカプトエタノール及び５００ｕ／ｍｌの白血病抑制因子を補ったダルベッコ改変イーグル培地で生育させたネオマイシン耐性の胚性繊維芽細胞フィーダー層上で培養した。培地は、毎日交換し、Ｄ３細胞は、３日毎にサブ培養した。８×１０⁶のＤ３細胞を、エレクトロポレーション（容量２５μＦで、４００Ｖ）により、２５μｇの線状化プラスミッドでトランスフェクトした。これらのトランスフェクトした細胞を、最初の５日間は、２×１０^-6Ｍガンシクロバー及び３００μｇ／ｍｌネオマイシン中で培養し、最後の３日間は、ネオマイシン単独にて培養した。これらのクローンを拡大した後に、細胞のアリコートを液体窒素中で凍結させた。内因性ＩＣＥ遺伝子とターゲティング用構築物との間での相同組換えが起きたクローンを同定するためのゲノムＤＮＡ分析用に、ＤＮＡを残りの細胞から調製した。ゲノムＤＮＡを調製するために、ＥＳ細胞クローンを、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、５ｍＭＥＤＴＡ、０．２％ＳＤＳ、２００ｍＭＮａＣｌ及び１００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ中で溶解させた。ＤＮＡを、イソプロパノール沈殿により回収して、１０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ８．０／０．１ｍＭＥＤＴＡにて可溶化した。相同組換えクローンを同定するために、これらのクローンから単離したゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲＶ及びＨａｅＩＩで又はＢａｍＨＩで消化した。制限消化の後に、そのＤＮＡを０．８％アガロースゲル上で分離して、ハイボンド−Ｎ膜上にブロットし、６５℃で、プローブＡ（ＥｃｏＲＶ−ＨａｅＩＩ消化用）又はプローブＢ（ＢａｍＨＩ消化用）とハイブリダイズさせた。プローブＡは、ターゲティング用ベクターの５’末端に近いＩＣＥ遺伝子の領域に結合する２．２ｋｂのＥｃｏＲＶ／ＸｈｏＩ断片である。プローブＢは、ターゲティング用ベクターの３’末端から遠いＩＣＥ遺伝子の領域に結合する１．２ｋｂのＸｍｎＩ／ＮｃｏＩ断片である。これらの２つのプローブのマウスＩＣＥ遺伝子内の位置を図１に示す。標準的ハイブリダイゼーションの後に、ブロットを、４０ｍＭＮａＰＯ₄（ｐＨ７．２）、１ｍＭＥＤＴＡ及び１％ＳＤＳで６５℃で洗い、Ｘ線フィルムに露出した。ＥｃｏＲＶ−ＨａｅＩＩで消化した野生型ＩＣＥ対立遺伝子へのプローブＡのハイブリダイゼーションは、約１３ｋｂの断片を生じたが、エキソン６中にｎｅｏ挿入を有する変異型ＩＣＥ対立遺伝子へのプローブＡのハイブリダイゼーションは、約１２ｋｂの断片を生じた。これらの２つの断片は、ハイブリダイゼーションブロットのオートラジオグラフィーにより容易に識別することができた。ＢａｍＨＩ消化に対して、プローブＢの野生型ＩＣＥ対立遺伝子へのプローブＢのハイブリダイゼーションは、約１５ｋｂの断片を生じたが、変異型ＩＣＥ対立遺伝子へのプローブＢのハイブリダイゼーションは、約１１ｋｂの断片を生じた。これらの２つの断片も又、オートラジオグラフィーにより容易に識別することができた。実施して分析した３つのＥＳ細胞トランスフェクション実験（全部で６００のｎｅｏ耐性クローンを生じた）の内で、唯一つのクローン（＃１６４）が、内因性ＩＣＥ遺伝子とターゲティング用ベクターとの間での相同組換えを受けたことが同定された。実施例３：ＩＣＥ欠損マウスの生成雌及び雄のＣ５７ＢＬ／６マウスを交配させて、胚盤胞を、妊娠３．５日目に単離した。クローン１６４（実施例２に記載）からの細胞を、胚盤胞当り１０〜１２細胞注入して、７〜８の胚盤胞を、偽妊娠の雌のＢ６Ｄ２Ｆ１の子宮に移植した。妊娠１８日目に帝王切開によって仔を分娩させ、ＢＡＬＢｃ養育母親中に移した。７０％より多くアグーチパッチを示す（クローン１６４の子孫の細胞を示す）１０匹の雄及び１匹の雌のキメラが誕生した。雄及び雌のキメラを雌及び雄のＣ５７ＢＬ／６マウスとそれぞれ交配させて、生殖細胞系統の伝達をアグーチコートカラーにより測定した。１１匹のすべてのキメラは、生殖細胞系統を通じてＩＣＥ遺伝子変異を伝えることができた。メンデル遺伝学から予想されるように、キメラをＣ５７ＢＬ／６マウスと交配させることにより導いたアグーチコートカラーを有する子孫の５０％（８６／１７３）は、ＩＣＥヌル突然変異に関してヘテロ接合であった。これらのヘテロ接合動物を交配させたが、やはりメンデル遺伝学から予想されるように、子孫の約２５％がＩＣＥヌル突然変異に関してホモ接合であった。これらの動物の遺伝子型分類を、ＥＳ細胞について実施例２に記載したように、尾からのゲノムＤＮＡを得て、ＥｃｏＲＶ及びＨａｅＩＩ又はＢａｍＨＩで消化し、そして、プローブＡ又はＢとハイブリダイズさせることにより達成した。平均の同腹子規模は、６匹であり、ホモ接合動物における両性の現れ方は等しかった。これらのＩＣＥ−／−マウスは、正常に発生し、健康に見え、且つ平均同腹子規模６で繁殖させることができた。従って、ＩＣＥ遺伝子におけるヌル突然変異は、胚発生又は初期発生に対する何らの悪影響も有しなかった。これらの成体動物において、明白な異常は識別されなかった。更に、８週齢のＩＣＥ＋／＋、＋／−及び−／−動物からの脾臓、肺、心臓、腎臓、肝臓、副腎、脳、胃腸系、膵臓、唾液腺、胸腺及び精巣を含むすべての主要器官の組織病理学的評価は、異常を示さなかった。このＩＣＥヌル突然変異は、末梢血中に存在する白血球、赤血球又は血小板の数に影響を有しなかった。更に、脾臓、胸腺及びリンパ節から単離した種々のＴ細胞サブセット（ＣＤ４⁺ＣＤ８⁺、ＣＤ４⁺ＣＤ８^-、ＣＤ４^-ＣＤ８⁺、ＣＤ４^-ＣＤ８^-）及びＢ細胞サブセット（Ｂ２２０⁺）において有意の差はなかった。ＩＣＥ−／−マウスは完全長のＩＣＥｍＲＮＡ転写物を発現しないことを確認するために、ＲＮＡを種々の組織から単離して、ＩＣＥｃＤＮＡプローブを用いる標準的ノーザンハイブリダイゼーションにより又は逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により分析した。ＲＮＡを、これらのマウスの種々の器官から、４Ｍグアニジニウムチオシアネートを用いて抽出し、その後、Samb rook等（Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第二版、Cold Spring Harb or Laboratory press(1989)）に記載されているように５．７ＭＣｓＣｌ中で遠心分離した。脾臓におけるＩＣＥｍＲＮＡの発現のノーザン分析の結果を、図２に示すが、完全長の１．６ｋｂのＩＣＥｍＲＮＡはＩＣＥ−／−マウスからの脾臓において検出可能でなかったことを示している。１〜１．２ｋｂのサイズ範囲の微弱なバンドが、一貫して、ＩＣＥ＋／＋、＋／−及び−／−動物において見られたが、このバンドは、ヘテロ接合及びホモ接合のレーンにおいて一層強く現われた。ＲＴ−ＰＣＲ分析用に、第１鎖ｃＤＮＡ合成を、ＧＩＢＣＯＢＲＬＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＳｙｓｔｅｍを用いて、製造者の指示に従って行なった。ＰＣＲを、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒを用いて、下記の表１に列挙したオリゴヌクレオチドプライマー及び次の条件を用いて、実施した：９５°３０秒を１サイクル；９４°３０秒、５４°３０秒、７２°１分を３０サイクル；及び７２°５分を１サイクル。ＰＣＲ生成物を、アガロースゲル上でエチジウムブロミドにより可視化した。ＩＣＥ遺伝子の種々の領域に結合する一連のプライマー対を下記の表１に示す：ネオマイシン遺伝子に対して特異的なプライマーは、ＩＣＥ＋／−及び−／−動物において転写物を検出したが、＋／＋動物においては検出しなかった。エキソン２に特異的な５’プライマー及びエキソン１０までの連続したエキソンの各々に特異的な一連の３’プライマーを用いて、エキソン２〜５を含む転写物のみがＩＣＥ−／−動物において検出された。ｎｅｏ遺伝子に特異的な５’プライマー及びエキソン７〜９に特異的な一連の３’プライマーも又、ＩＣＥ−／−及び＋／−動物において転写物を検出した。ノーザン及びＲＴ−ＰＣＴ分析の結果は、ホモ接合のＩＣＥ遺伝子破壊が、ＩＣＥ−／−マウスにおける検出可能な完全長のＩＣＥｍＲＮＡ転写物の不在を生じることを確認した。ＩＣＥ欠損マウスにおけるＩＣＥ蛋白質発現を試験するために、マクロファージ細胞溶解物についてウエスタンブロット分析を行なった。８週齢のマウスに１．５ｍｌのチオグリコレートメディウム（ミズーリ、St.Louis 在、Sigma Chemical Co ．より購入）を腹腔内注射した。腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）を、４〜５日後に採取した。マクロファージを、ＰＥＣより、血清を含まないＲＰＭＩ１６４０中でのプラスチックへの付着により、３７℃で２時間精製した。マクロファージ細胞溶解物を、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、次いで、ニトロセルロースフィルター（Amershamより購入）にトランスファーした。フィルターを、ＢＢＣ２、ヒトＩＣＥ蛋白質（アミノ酸残基１２０〜４０４）に対するウサギ抗体（５％ドライミルク及び０．２％ツイーン２０を含むＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌ）をプローブとして調べた。第２の西洋ワサビペルオキシダーゼ結合した抗ウサギ抗体（Amershamより購入）及びＡｍｅｒｓｈａｍＥＣＬシステムを製造者の指示に従って用いて、検出を行なった。結果を、図３に示す。４５ｋＤａのＩＣＥ前駆体蛋白質が、ＩＣＥ＋／＋及び＋／−マウスからのチオグリコレート誘出されたマクロファージ溶解物において検出されたが、陰性対照用のＮＩＨ３Ｔ３細胞からの溶解物又はＩＣＥ−／−マウスからのマクロファージ溶解物においては検出されなかった。これらの結果は、ホモ接合のＩＣＥ遺伝子破壊が、−／− マウスにおける検出可能なＩＣＥ蛋白質の不在を生じることを確認する。実施例４：ＩＣＥ遺伝子の破壊は、ＩＬ−１β及びＩＬ−１α分泌に影響するＩＣＥ遺伝子破壊のイン・ビトロでのＩＬ−１βのプロセッシング及び放出に対する効果を調べるために、チオグリコレート誘出したマクロファージを、プレＩＬ−１βの発現を誘導するためにイン・ビトロでリポ多糖（ＬＰＳ）で刺激し、次いで、マウスのマクロファージ由来のｍａｔＩＬ−１βの効率的プロセッシング及び放出を引き起こすことが前に示された（Hogquist,K.A．等(1991)Proc.N atl.Acad.Sci.USA 88:8485-8489:及びPerregaux,D.及びGabel,C.A.(1994)J.Biol .Chem.269:15195-15203）アデノシン酸リン酸（ＡＴＰ）で処理したＩＣＥ＋／＋、＋／−及び−／−マウスから得た。腹腔マクロファージを、本質的にHogqui st等（前出）により記載されたようにして、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０の１ｍｌ当たり１μｇのＬＰＳ（大腸菌株０１１１：Ｂ４、Calbiochem ）で、３７℃で４時間刺激し、次いで、ＡＴＰ（５ｍＭ、Sigma）で３０分間処理した。新鮮な培地を加えて、これらの細胞を更に３時間培養した。幾つかの実験において、テトラペプチドアルデヒドＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ（Bachem Biosc ience により注文製造）、ＩＣＥの特異的インヒビター、又はトリペプチドアルデヒドロイペプチン（Sigma）、ＩＣＥを阻害しない対照用プロテアーゼインヒビターが、培地中に５０μＭで存在した。これらのマクロファージのＬＰＳ及びＡＴＰ刺激後に、これらのペプチドインヒビターの不在又は存在下で、この培地中のＩＬ−１α及びβのレベルを、市販のＥＬＩＳＡアッセイ（PerSeptive Diagnostics）を用いて測定した。結果を、下記の表２にまとめる：ＩＣＥ＋／＋及び＋／−マウスは、ＬＰＳ及びＡＴＰでの刺激に際して、ＩＬ −１βを効率的に放出した（培地中に２０００〜４０００ｐｇ／ｍｌのレベル）が、ＩＣＥ−／−マウスは、本質的に、検出不能な量のＩＬ−１β（＜２０ｐｇ／ｍｌ）を培地中に放出した。予想外にも、ＩＬ−１αの放出も又、ＩＣＥ−／ −マクロファージからの放出が実質的に減少し、ホモ接合の細胞により放出されたＩＬ−１αのレベルは、野生型及びヘテロ接合型細胞から放出されるものの約２５％でしかなかった。ＩＣＥインヒビターＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯは、＋／＋及び＋／−マクロファージからのＩＬ−１βの放出を有意に阻止したが、ＩＬ−１αの放出は阻止せず、他方、対照用インヒビター、ロイペプチンは、ＩＬ−１β又はαの放出に有意の影響を与えなかった。Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯで処理したＬＰＳ処理したＩＣＥ＋／＋マクロファージにおいてＩＣＥ活性を阻止するこのインヒビターの効力を定量するために、このインヒビターの不在時にＬＰＳで処理したＩＣＥ＋／＋、＋／−及び−／−マクロファージにより放出されるｍａｔＩＬ−１βの量を標準対照として用いることができる。例えば、ＬＰＳ処理した＋／＋マクロファージにより放出されるｍａｔＩＬ−１βの量（４４２８±３６ｐｇ／ｍｌ）は０％阻害の標準として用いられ、ＬＰＳ処理した＋／−マクロファージにより放出されるｍａｔＩＬ−１βの量（１８７９±１８４ｐｇ／ｍｌ）は５０％阻害の標準として用いられ、そして、ＬＰＳ処理した−／−マクロファージにより放出されるｍａｔＩＬ−１βの量（約２０ｐｇ／ｍｌ）は１００％阻害の標準として用いられる。これらの結果を、図５にグラフ表示する。Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯの存在下でＬＰＳ処理したＩＣＥ＋／＋マクロファージから放出されたｍａｔＩＬ− １βの量（８３３±４０ｐｇ／ｍｌ）を、次いで、これらの標準と比較する。図５の標準グラフを用いて評価した場合、ＬＰＳ処理したＩＣＥ＋／＋マクロファージからのｍａｔＩＬ−１β放出のＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ（５０μＭ）によるパーセント阻害は、７８％である。ＩＣＥ欠損マウスにおけるＩＬ−１α及びβの放出を更に調べるために、これらの２つのサイトカインの免疫沈降を、パルス−チェース［³⁵Ｓ］メチオニン標識したマクロファージからの細胞溶解物及び培地について行なった。マクロファージをＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を用いて又は用いないで４時間処理し、［³⁵Ｓ］メチオニン（２００μＣｉ／ｍｌ、DuPont）を用いて第４時間目中パルスラベルした。標識細胞をＰＢＳで洗い、ＡＴＰ（５ｍＭ）で３０分間処理し、そして、培地を集め、新鮮な培地を加え、次いで、更なる３時間のチェースの後に採集した。細胞溶解物を、ＡＴＰの添加前（チェースの時刻０）又はＡＴＰ処理の３時間後（チェースの最後）に、１％トリトンＸ−１００、５０ｍＭトリス− ＨＣｌ（ｐＨ８）、１５０ｍＭＮａＣｌにプロテアーゼインヒビター［１ｍＭＥＧＴＡ、２５ｍＭヨードアセタミド、１００μｇ／ｍｌアプロチニン、１００μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌペプスタチン及び１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）（すべてSigma より購入）］を加えたものを用いて抽出することにより調製した。培地試料を、１％トリトンＸ −１００、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）にプロテアーゼインヒビターを加えたものに調整した。細胞溶解物及び培地試料を、通常のヤギ免疫グロブリン（Sigma）及びプロテインＧ−セファロース（Sigma）を用いてプレクリアした。免疫沈降を、マウスのＩＬ−１α又はＩＬ−１βに特異的なヤギ抗体（R&D Syst ems）を用いて実施した。プロテインＧ−セファロース上に結合した免疫沈降物を、１％トリトン、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１５０ｍＭＮａＣｌ及び１ｍＭＰＭＳＦを用いて５回洗い、次いで、１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分析した。これらの免疫沈降実験の結果を、図４に示す。これらの細胞溶解物の分析は、ＬＰＳによる３１ｋＤａのＩＬ−１α及び３４ｋＤａのＩＬ−１β前駆体の誘導が、細胞内で、Ｃ５７ＢＬ／６及びＩＣＥ−／−マクロファージにおいて同様であることを示し、ＩＣＥ遺伝子破壊がこれらのサイトカインの前駆体型の発現に影響しなかったことを示唆している（同様の結果が、ＩＣＥ＋／＋及び＋／−マクロファージについて観察された）。対照的に、この培地の分析は、分泌された１７ｋＤａの成熟ＩＬ−１β（ＩＣＥ−／−マウス由来のＬＰＳ刺激したマクロファージからのもの）がＡＴＰ処理の３０分後において検出可能でないことを示した。更なる３時間の培養において、ＡＴＰの除去後に、痕跡レベルの１７ｋＤａのＩＬ−１βが、ＩＣＥ−／−マクロファージの培地において見出された。３時間の時点におけるＩＬ−１αの免疫沈降は、ＩＬ−１αの３１ｋＤａの前駆体及び１５ｋＤａのプロセッシングを受けた形態の両者のレベルが、ＩＣＥ＋／＋又は＋／−マクロファージの培地において認められたレベルに比較して、ＩＣＥ−／−マクロファージの培地において有意に減少していることを示した。要約すれば、上記の実験は、ＩＣＥ−／−マウスからのマクロファージにおけるホモ接合のＩＣＥ遺伝子破壊が刺激後に分泌されるｍａｔＩＬ−１βの量を本質的に検出不能なレベルにまで減少させるが、ＩＣＥ＋／−マウスからのマクロファージにおけるヘテロ接合のＩＣＥ遺伝子破壊が刺激後に分泌されるｍａｔＩＬ−１βの量を野生型レベルの約５０％にまで減少させることを示している。更に、これらのＩＣＥ欠損動物は、分泌されたプレＩＬ−１α及びｍａｔＩＬ−１ αのレベルにおける予想外の顕著な減少を示し、ＩＬ−１αのプロセッシング及び／又は放出におけるＩＣＥ及び／又はＩＬ−１βの役割を示唆している。実施例５：ＩＣＥ遺伝子の破壊は、アポトーシスに影響しないＩＣＥ遺伝子の破壊が、ＩＣＥ−／−マウスにおけるアポトーシスに影響を有したか否かを調べるために、これらのマウスからの２つの細胞型、マクロファージ及び胸腺細胞を、イン・ビトロで、アポトーシスの受け易さについて試験した。マクロファージのＡＴＰ処理は、ＩＬ−１放出に加えて、アポトーシスを誘導することが報告されている（Hogquist,K.A．等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88 :8485-8489）ので、実施例４に記載のようにＡＴＰで処理したマクロファージを、アポトーシスの指標としてのＤＮＡ断片化について分析した。ＡＴＰ処理は、Ｃ５７ＢＬ／６及びＩＣＥ−／−マクロファージにおいて、等しく効率的にＤＮＡ断片化を誘導した。従って、ＩＣＥ欠損マクロファージは、ＡＴＰ誘導されるアポトーシスに関して損なわれているようには見えなかった。アポトーシスを、デキサメタゾン又はガンマー線照射にさらしたＩＣＥ−／− マウスからの胸腺細胞についても調べた。胸腺細胞を単離し、１０％ウシ胎児血清及び補足物を含むＲＰＭＩ中で、２×１０⁶細胞／ｍｌの濃度で、イン・ビトロで、４８ウェル組織培養プレート（Costar）中で、３７℃で、５％ＣＯ₂インキュベーター中でインキュベートした。それらを、１０^-6Ｍのデキサメタゾンと共に又は該剤なしでインキュベートし、又は培養前に５Ｇｙでガンマー線照射した。幾つかの細胞を４℃に保ってアポトーシスを妨げた。これらの細胞を、１８時間のイン・ビトロ培養の後に集め、下記のようにヨウ化プロピジウム染色を用いて低二倍体細胞の存在を測定することによりアポトーシスを分析した。これらの細胞を、７０％エタノールで１時間４℃で固定し、洗浄し、次いで、ＲＮアーゼ（０．５ｍｇ／ｍｌ）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（５０μｇ／ｍｌ）を用いて、Nicoletti,I.等(1991)J.Immunol.Methods 139:271-279 に記載されたように処理した。これらの細胞を、ＰＩ蛍光について、ＣｅｌｌＦｉｔソフトウェアを用いてＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターにて分析するまで、暗黒中に４ ℃で保存した。核の低二倍体染色を有する細胞のパーセントをアポトーシスの尺度として採用した（Nicoletti,I.等(1991)、前出）。図６に示したように、アポトーシスは、ＩＣＥ−／−胸腺細胞において、イン・ビトロでのデキサメタゾン又はガンマー線照射での処理の後に認められた。アポトーシス細胞のパーセントは、ＩＣＥ−／−マウス及び＋／＋マウスにおいて同様であった。従って、要約すれば、これらの試験した２つの細胞型におけるアポトーシスは、ＩＣＥ遺伝子の破壊によっては影響されなかった。ＩＣＥは、前に、アポトーシスの誘導に関連付けられたが（例えば、Gagliardini,V.(1994)Science を参照されたい）、ここに記載の結果は、ＩＣＥがアポトーシスに関係していないか又はＩＣＥ欠損マウスに未だ存在する他の蛋白質がアポトーシスに関してＩＣＥ欠損を補償し得ることを示唆している。実施例６：ＩＣＥ遺伝子の破壊は、ＬＰＳ誘導される敗血症性ショックに対する耐性を与える高投与量のＬＰＳの腹腔内注射は、ＩＬ−１及びＴＮＦ−α等の前炎症性サイトカインの広範な全身的な放出を誘導することが知られている。これらのサイトカインは、マウスにおける死へと導く敗血症性ショック又は全身性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ）の病因において非常に重要であると考えられる。ＩＣＥ欠損マウスがイン・ビボでのＩＬ−１生成に欠陥を有するかどうか及びこの欠陥が減少した全身性炎症応答へと導くのかどうかを研究するために、この高投与量ＬＰＳにより誘導されるＳＩＲＳのモデルにおけるＩＣＥ−／−マウスの死亡率を調べた。８〜１０週齢のマウスに、８００μｇのＬＰＳ（大腸菌血清型０１１１：Ｂ４、カリフォルニア、La Jolla在、Calbiochem Corporation）を腹腔内注射して、高投与量ＬＰＳ誘導された敗血症性ショックを誘導した。この投与量のＬＰＳ（８００μ ｇ）は、前に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて１００％の死亡率を引き起こすことが見出された。これらのマウスを、４日間にわたって毎日少なくとも２回監視し、その後は定期的に監視した。すべてのＩＣＥ＋／＋マウスは、高投与量のＬＰＳに対して３０時間以内に死亡した。対照的に、ＩＣＥ−／−マウスは、ＬＰＳの致死性効果に対して高度に耐性であり、７０％のマウスが７日後まで生存した。この生存の結果を図７にグラフ表示する。図７のデータは、全部で２８匹の−／−マウス及び１９匹の＋／＋マウスを用いる３つの独立の実験からの合わせたものである。これらの結果は、−／−マウスの生存が、＋／＋マウスと比較して、有意に増加したこと（カイ二乗検定によるｐ＜０．００１）を示している。少数の死亡したＩＣＥ−／−マウスは、ＩＣＥ＋／＋マウスと比較して遅く死亡しており、前者のグループの内での最初の死亡は、各実験において約４５時間目に起きた。これらのＩＣＥ−／ −マウスは、内毒血症例えば嗜眠、起毛及び軽い熱による震えの徴候を、ＬＰＳ注射後の最初の数日間にわたって示した。しかしながら、これらの徴候は、同時点におけるＩＣＥ＋／＋マウスにおけるものと比較すると一層軽かった。ＬＰＳ誘導されたＳＩＲＳを受けたマウスの循環中への炎症性サイトカインの放出も調べた。ＬＰＳ注射の４時間後に、これらの動物から採血（１００μｌ）し、十分な量の試料を得るために同性で同じ遺伝子型の動物からの血漿をプールしてサイトカインについて分析した。未処理の並びにＬＰＳ処理したＩＣＥ＋／＋及び−／−マウスの血漿中のサイトカイン濃度の評価を、市販のＥＬＩＳＡキットを用いて得た。マウスＩＬ−１α、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αの評価用のＥＬＩＳＡキットを、Genzyme Corporation（マサチューセッツ、Cambridge在）より購入した。マウスＩＬ−６の評価用のＥＬＩＳＡキットを、Biosource Inter-nati onal（カリフォルニア、Camarillo 在）より購入した。これらの製造者の支持に従ってこれらのキットに記載された方法及びアッセイに用いるための希釈を用いた場合、ＩＬ−１β及びＩＬ−１αについての検出限界は、それぞれ、２０ｐｇ／ｍｌ及び３０ｐｇ／ｍｌであった。３つの実験の内の１つからの代表的なサイトカインのデータを、下記の表３に示す：ＩＬ−１βは、３つの別々の実験において、ＬＰＳを注射したＩＣＥ−／−マウスの血漿において検出不能であったが、このサイトカインは、各実験において、ＩＣＥ＋／＋マウスにおいては高レベルで検出可能であった。実施例４に記載のイン・ビトロでＬＰＳ及びＡＴＰで刺激したマクロファージを用いて観察された結果と一致して、ＬＰＳ処理したＩＣＥ−／−マウスの血漿中のＩＬ−１αのレベルは、ＩＣＥ＋／＋マウスと比較して、予想外にも非常に低く又は検出不能であった。ＴＮＦα及びＩＬ−６は、ＩＣＥ−／−マウスにおいて容易に検出可能であり、それらの濃度レベルは、ＩＣＥ＋／＋マウスにおけるより幾らか低いだけであった。雌のＩＣＥ＋／＋マウスは、雄のＩＣＥ＋／＋マウスと比較して、一層高いＩＬ−１β及びＩＬ−１αレベルを有したが、ＳＩＲＳによる死に関する死亡時刻又は罹病性は、何れの遺伝子型においても性別と関係しなかった。上記の結果は、ＩＣＥ−／−マウスが高投与量ＬＰＳ注射により誘導された敗血症性ショックの致死的効果に対して高度に耐性であることを示している。これらの実験結果は、実施例４でマクロファージによるｍａｔＩＬ−１β生成に関して記載したことと合わせて、ＩＣＥが、イン・ビボでのｍａｔＩＬ−１βの生成の原因である主要なプロテアーゼであることを決定的に示している。同等物当業者は、ここに記載した発明の特定の具体例に対する多くの同等物を認識し又は常例的実験を用いて確認することができるであろう。かかる同等物は、後述の請求の範囲に含まれるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｐ 21/00 5/00 Ｂ (72)発明者リー，ピンアメリカ合衆国 02181 マサチューセッツ，ウェルズリー，サウスウッドサイドアベニュー 15 (72)発明者アレン，ヘイミッシュアメリカ合衆国 01545 マサチューセッツ，シュルーズベリー，イースタンポイントドライブ 47 (72)発明者バーナジー，スブハシスアメリカ合衆国 01545 マサチューセッツ，シュルーズベリー，ハップグッドウェイ 35 (72)発明者パスキント，マイケルアメリカ合衆国 02140 マサチューセッツ，ケンブリッジ，フォレストストリート 19エイ

Claims

【特許請求の範囲】１．内因性インターロイキン１β変換酵素（ＩＣＥ）遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が機能的に破壊されている体細胞及び生殖細胞を有するトランスジェニック非ヒト動物。２．ＩＣＥ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が、その対立遺伝子と、動物の胚性幹細胞前駆体に導入された突然変異型ＩＣＥ遺伝子又はその部分との間での相同組換えによって機能的に破壊されている、請求項１に記載の動物。３．内因性ＩＣＥ遺伝子の両対立遺伝子が機能的に破壊された、体細胞及び生殖細胞を有する、請求項２に記載の動物。４．マウスである、請求項１に記載の動物。５．マウスである、請求項３に記載の動物。６．ＩＣＥ遺伝子の対立遺伝子の機能的破壊が、同種の突然変異してない動物と比較して、動物の細胞における実質的に減じたＩＣＥ蛋白質の発現又は同蛋白質の不在を生じる、請求項３に記載の動物。７．ＩＣＥ遺伝子の対立遺伝子の機能的破壊が、同種の突然変異してない動物と比較して、動物の細胞における変化したＩＣＥ蛋白質の発現を生じる、請求項３に記載の動物。８．成熟インターロイキン１βの生成が、同種の突然変異してない動物と比較して、実質的に減少している、請求項６に記載の動物。９．成熟インターロイキン１αの分泌が、同種の突然変異してない動物と比較して、実質的に減少している、請求項６に記載の動物。１０．異種のＩＣＥ蛋白質をコードするトランスジーンを更に含む、請求項３に記載の動物。１１．異種ＩＣＥ遺伝子がヒトのＩＣＥ遺伝子である、請求項１０に記載の動物。１２．宿主細胞中の内因性インターロイキン１β変換酵素（ＩＣＥ）遺伝子を機能的に破壊するための核酸構築物であって、該核酸構築物は：ａ）相同でない置換部分；ｂ）相同でない置換部分の上流に位置する第１の相同性領域（この第１の相同性領域は、第１のＩＣＥ遺伝子配列に対する実質的同一性を有するヌクレオチド配列を有する）；及びｃ）相同でない置換部分の下流に位置する第２の相同性領域（この第２の相同性領域は、第２のＩＣＥ遺伝子配列に対する実質的同一性を有するヌクレオチド配列を有し、第２のＩＣＥ遺伝子配列は、天然の内因性ＩＣＥ遺伝子において、第１のＩＣＥ遺伝子配列の下流に位置を有する）；を含み、ここに、第１及び第２の相同性領域は、この核酸分子を宿主細胞内に導入したときに、核酸構築物と宿主細胞内の内因性ＩＣＥ遺伝子との間での相同組換えに十分な長さのものである、上記の核酸構築物。１３．相同でない置換部分が陽性選択発現カセットを含む、請求項１２に記載の核酸構築物。１４．陽性選択発現カセットが、少なくとも１つの調節要素に機能的に結合されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む、請求項１３に記載の核酸構築物。１５．上流又は下流の相同性領域から遠位である陰性選択発現カセットを更に含む、請求項１２に記載の核酸構築物。１６．陰性選択発現カセットが、少なくとも１つの調節要素に機能的に結合された単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を含む、請求項１５に記載の核酸構築物。１７．相同でない置換部分がＩＣＥ遺伝子のエキソン６内に位置する、請求項１２に記載の核酸構築物。１８．相同でない置換部分の上流に位置する第１の相同性領域がＩＣＥ遺伝子のエキソン１、２、３、４及び５を含む、請求項１７に記載の核酸構築物。１９．相同でない置換部分の下流に位置する第２の相同性領域がＩＣＥ遺伝子のエキソン７及びエキソン７と８の間のイントロンの少なくとも一部分を含む、請求項１７に記載の核酸構築物。２０．請求項１２に記載の核酸分子を含む組換えベクター。２１．請求項１２に記載の核酸分子を導入した宿主細胞。２２．哺乳動物宿主細胞である、請求項２１に記載の宿主細胞。２３．マクロファージ、マクロファージ様細胞、単球又は単球様細胞よりなる群から選択される細胞である、請求項２２に記載の宿主細胞。２４．胚性幹細胞である、請求項２２に記載の宿主細胞。２５．ヒトの細胞である、請求項２２に記載の宿主細胞。２６．マウスの細胞である、請求項２２に記載の宿主細胞。２７．マウスの細胞である、請求項２４に記載の宿主細胞。２８．請求項２７に記載の胚性幹細胞の子孫である体細胞及び生殖細胞を有するトランスジェニック非ヒト動物。２９．インターロイキン１β変換酵素（ＩＣＥ）インヒビターを用いて治療し得る病状を同定するための方法であって、該方法は：ａ）内因性ＩＣＥ遺伝子の両対立遺伝子が機能的に破壊された体細胞及び生殖細胞を有するトランスジェニック非ヒト動物においてその病状を誘導することを試みること；そしてｂ）その動物のその病状に対する罹病性又は耐性を測定することを含み、ここに、その動物の、同種の突然変異してない動物と比較しての、その病状に対する耐性は、その病状がＩＣＥインヒビターを用いて治療可能であることを示す、上記の方法。３０．野生型動物において病状を誘導する刺激をトランスジェニック動物に施与する、請求項２９に記載の方法。３１．トランスジェニックを、その病状にかかり易い第２の動物と交配させる、請求項２９に記載の方法。３２．第２の動物が、ＭＲＬ／１ｐｒ、ＮＯＤ、ＤＢＡ／１、ＢＡＬＢ／ｃ、ＰＬ／Ｊ、ＮＺＢ／ＫＮ、Ｃ５７ＢＬ、ＳＴＲ／ＯＲＴ、Ｔｓｋ／＋、インターロイキン２欠損、Ｔ細胞レセプター欠損、主要組織適合性複合体クラスII欠損、インターロイキン１０欠損、ＴＧＦβ１欠損及びＴＮＦαトランスジェニックよりなる群から選択する系統のマウスである、請求項３１に記載の方法。３３．イン・ビボでヒトのインターロイキン１β変換酵素（ＩＣＥ）を阻害する薬剤を同定するための方法であって、該方法は：ａ）内因性ＩＣＥ遺伝子の両対立遺伝子が機能的に破壊されているがヒトＩＣＥトランスジーンを有して機能的ヒトＩＣＥ遺伝子産物を発現する細胞を有するトランスジェニック非ヒト動物に成熟インターロイキン１β（ｍａｔＩＬ−１β ）の生成を誘導する刺激を、試験すべき薬剤の存在及び不在において施与すること；及びｂ）この動物におけるｍａｔＩＬ−１βの生成を直接又は間接に測定することを含み、ここに、この薬剤の不在時のｍａｔＩＬ−１βの生成と比較しての、この薬剤の存在時の減少したｍａｔＩＬ−１β生成は、この薬剤がイン・ビボでヒトＩＣＥを阻害することを示す、上記の方法。３４．動物における成熟インターロイキン１βの生成を誘導する刺激がリポ多糖である、請求項３３に記載の方法。３５．動物における成熟インターロイキン１βの生成を誘導する刺激がリポ多糖及びアデノシン三リン酸である、請求項３３に記載の方法。３６．動物における成熟インターロイキン１βの生成を誘導する刺激がザイモサン又はカラギーナンである、請求項３３に記載の方法。３７．動物におけるｍａｔＩＬ−１βの生成を、その動物の少なくとも１種の生物学的液体中のｍａｔＩＬ−１β蛋白質の量を測定することにより測定する、請求項３３に記載の方法。３８．生物学的液体を、血清、血漿、腹膜腔液体、空気嚢洗液及び組織房滲出液よりなる群から選択する、請求項３７に記載の方法。