JPH10509794A - 高処理量及び低流体容積要件を有するパッチ固定装置及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 生体組織のイオン移動シャネル上のある物質の作用を研究するのに使用されるパッチクランプ技術を実行するための装置、更に詳しくは、高いスループットを提供するためにＨＰＬＣ装置と共に使用されるような自動サンプラーを使用したパッチクランプ装置が開示される。本発明は更に、ごく少量のテストすべき物質とごく少量の液体キャリヤを用い、それによって、短時間で多くのテストを完了することができるようにすることができる新規なマイクロ灌流チャンバアセンブリを含む。本発明は更に広くは、高いスループットを提供し、かつ、ごく少量の溶液およびテストすべきサンプルしか必要としない化学物質をスクリーニングするための新規な電気生理学的薬剤取扱いおよび適用装備に関する。本発明は又、本発明の装置を使用するための幾つかの新規な手順を含む。

Description

【発明の詳細な説明】 高処理量及び低流体容積要件を有する パッチ固定装置及び方法 発明の背景 発明の分野 本発明は生体膜のイオン移動チャンネルを研究するのに利用されるパッチ固定 法を実施するための装置に関し、より詳細には、高処理量を有し、且つ化合物の ほんの僅かなテストサンプル、すなわち、ほんの少量の液体キャリヤを利用し、 個々の膜パッチについて短時間で多くのテストを実施することのできるかかるパ ッチ固定装置に言及する。本発明は化学物質又は化合物のスクリーニングのため に提示され、高処理量を提供し、且つテストすべき溶液及びサンプルの低容積で すむ新規な電気生理学薬取扱い及び適用にもっと広く言及する。本発明は又本発 明の装置を利用するためのいくつかの方法を含む。先行技術 マイクロピペットを使用して膜のパッチを電気的に隔離すること及び電圧−固 定条件下でそのパッチのイオンチャンネルを研究することの一般的な考えはプフ ルエガ アーチ（Ｐｆｌｕｅｇｅｒ Ａｒｃｈ）３７５；２１９−２７８，１９ ７８年「細胞外パッチ固定、生体膜の個々の開放チャンネルの中の電流を解明す る方法」にネーハー，サクマン，及びステインバックによって概説されている。 彼らが発見したことは、アセチルコリンを収容するピペット(ＡＣＨ)を筋肉細胞 膜の表面に押しつけることによって、彼らがＡＣＨ−活性イオンチャンネルの開 閉に帰する電流の不連続のジャンプを見ることができたことである。しかしなが ら、彼らの仕事がピペットのガラスと膜との間のシールの抵抗（１０−５０ＭΩ ）がチャンネルの抵抗（−１０ＧΩ）に対して大変小さい事実によって制限され た。かかるシールから生じる電気ノイズは抵抗に逆比例し、イオンチャンネルを 通る電流を分かり難くする程大きく、イオンチャンネルのコンダクタンスはＡＣ Ｈチャンネルのコンダクタンスよりも小さい。電気ノイズはまたピペットの 電圧を、生ずるシールを通る大電流により浴の値と異なる値に固定することを妨 げた。 ガラスピペットを火仕上げし、ピペットが細胞の表面と接触するときピペット の内部に僅かな吸引を付与することによって、ノイズ（大きさの程度）を生物学 的関心事の殆どのチャンネルを研究することができるレベルまで減じ、且つこれ らの研究をすることができる電圧範囲を大きく伸ばした大変高い抵抗（１−１０ ０ＧΩ）のシールを得ることができたことを発見した。この改良されたシールは 「ジガ−シール」と呼ばれ、ピペットは「パッチピペット」と呼ばれてきた。パ ッチ固定法を開発する仕事について、ネーハ及びサクマンは生理学及び医学部門 で１９９１ノーベル賞を授与された。 イオンチャンネルは細胞膜を横切る無機イオンの移動を引き起こす膜貫通型蛋 白質である。イオンチャンネルは活動電位、シナプス伝達、ホルモンの分泌、筋 肉の収縮等の発生およびタイミングのような種々の過程に関係する。多くの薬は それらの特殊な効果をイオンチャンネルの転形を経て発揮する。例は脳の電圧依 存Ｎａ⁺−チャンネルを遮断するフェニトイン及びラモトリジンのような抗てん かん化合物、スムースな筋肉細胞の電圧依存Ｃａ²⁺−チャンネルを遮 断するニ フェジピン及びジルチアゼムのような抗高血圧薬、及び膵臓の ＡＴＰＫ⁺− チャンネルを遮断するグリベンクラミド及びトルグタミドのようなインシュリン 放出の刺激薬である。イオン−チャンネル活性の化学的に誘導される転形に加え て、パッチ固定法により科学者は電圧依存チャンネル操作を行うことができた。 これらの方法はパッチピペットの電極の極性を調整すること、及び塩水組成を変 えて浴溶液中の自由イオンレベルを調整することを含む。 パッチ固定法は生物学及び医薬の主要な開発を代表する、と言うのはこのパッ チ固定法により単一のイオンチャンネル蛋白質の中を通るイオンの流れの測定を 可能にし、且つ又薬に対する単一のイオンチャンネル応答の研究を可能にするか らである。簡単に言えば、普通のパッチ固定法では、細い（直径が＜１μｍ）ガ ラス製ピペットが使用される。このパッチピペットの先端を細胞膜の表面に押し つける。ピペットの先端は細胞に対して気密にシールし、膜の小さなパッチ内の 数個のイオンチャンネル蛋白質を隔離する。これらのチャンネルの活性を電気的 に測定することができ（単一のチャンネル記録）、或いは別のやり方として、パ ッチ固定を破ることができて細胞膜全体のチャンネル活性の測定を可能にする（ 全体の細胞記録）。 単一チャンネル記録及びセル全体記録の両方の間、個々のチャンネル特殊型の 活性を、膜を横切って「電圧固定」を負荷することによってなお一層分解させる ことができる。フィードバック閉回路を使用することによって、「電圧固定」は 膜を横切って電圧勾配を負荷して全チャンネル活性を制限し不連続チャンネル特 殊型の溶解を可能にする。 そのような実験における溶解率及び電圧制御は見事であり、しばしば、ミリセ カンドの範囲であり、あるいは、マイクロセカンドの範囲ですらある。しかしな がら、薬学上のスクリーニングにおける一般的な方法としてのパッチ固定法の主 要な障害は、日当たり（典型的には１、２日程度）に試験することができる化合 物の数が限られていることである。また、セル及びパッチの周囲で行われる溶解 変化が非常に低速であるということが重要な障害となるかもしれない。 パッチ固定技術の処理量を決定する重要な制限は、溶解された化合物を灌流さ れたセルおよびパッチに導く供給装置の性質である。通常のパッチクランプの構 成において、セルは、生理塩水によって連続的に灌流された大きな実験チャンバ （０.２ないし２ｍｌ）の中に置かれる。次に、入口を少数の供給びんに連結さ れた弁に切り換えることによって化合物が与えられる。しかしながら、この従来 技術には多くの問題が存在する。第１に、化合物の数がアプリケーション装置に 一回に連結されるびんの数によって制限されることである。この数は通常６より 小さい。第２に、支持液体及び試験されるサンプルの必要な容量が極めて多いこ とである。第３に、セル及びパッチの周囲の溶解化合物を変化させるために必要 な時間が通常のパッチクランプ実験にしては長いことである。第４に、試験され る化合物の導入及びアプリケーションが非常に多くの手による操作及び中断を含 み、従ってセル／ピペット連結の完全性を危険にさらすことである。 Ｕ管や他の装置のようなチャンネルを調整した神経伝達体（neurotransmitter ）を活性化するための化合物を局部的なアプリケーションを行うための精巧な装 置の開発は、実際上のアプリケーション時間を、多くの場合受入れられる１０な い し１００ｍｓｅｃまで短縮させる。しかしながら、この速いアプリケーション装 置によって換えられなければならないバス溶液の容積はまったく大きく、多数の 化合物を一日にスクリーニングするための限られた容量となっている。このこと が目下、医療産業において、これらの手順をとることを制限している。重要な理 由は、Ｕ管を満たす供給装置の不撓性と小容積にある。これらの装置は従来のパ ッチ固定実験で使用される装置と事実上同じであり、それ故これらの装置の不便 さによってなお苦しめられている。 発明の目的 本発明によれば、驚くことにパッチ固定技術を自動サンプラーに組合わせる ことを可能としたが、特に、該技術が自動サンプラーから発生する振動や電気ノ イズのような障害に敏感でありせいぜい不可能すなわち不作動の組合せであると 見做されていたという事実により、この組合せは当業者に対し当初非自明であっ た。 本発明の目的は、自動薬剤処理及びアプリケーション装置を提供し適応させる こと、さらにイオンチャンネル移送の結果を測定するために化学物質あるいは化 合物をスクリーニングする電子式生理学装置において該装置を利用することであ り、新規なこの装置は処理量が多く流体容量がと少ないものである。 本発明の目的はさらに、スクリーニングの速度を早くすることに加え、試験さ れるいかなる化合物の必要量も少なくし、これによって製薬会社の商業的スクリ ーニングに適した最初の電子的生理学試験装置を提供することである。 本発明の目的はさらに、極端に小さい容積のマイクロ灌流チャンバを有する新 規なマイクロ灌流チャンバ構造を提供することである。 本発明はさらに付加的な目的として、本発明による装置を利用するパッチ固定 技術を実施する新規な方法を提供することである。本発明の上述した及び他の目 的、利点、及び特徴的主要点は、実施例について添付図面と一緒に検討される以 下の説明から明らかになり、添付図面においては符合する参照番号が多数の図に わたって符合する要素を示している。 発明の概要 次いで、出願人が発明であると信じているものは、とりわけ、以下のものを、 単独で、或いは、組み合わせて、含む。 膜のイオン移動チャネル上の化合物のテストサンプルの作用を確認するための 装置であって、 テストサンプル溶液を収容するようになった複数の容器と、前記各容器から前 記テストサンプルを自動的に取り出し、これらのテストサンプルを受け器に排出 するための手段とを備えた自動サンプラーと、 支持液体を収容するようになった容器と、 テストサンプル溶液と、支持液体と、前記膜とを受け入れるようになった灌流 チャンバを有し、該灌流チャンバが、前記灌流チャンバ内に収容された溶液と電 気的に接触するようになった基準電極を備え、 前記自動サンプラーの受け器から前記テストサンプル溶液を、その容器から支 持液体を、前記灌流チャンバに移送するための手段と、前記テストサンプル及び 前記支持液体を前記灌流チャンバから取り去るための手段と、 内部に電極を備え、前記灌流チャンバ上に移動可能に位置決めされ、高電気抵 抗シールに、前記チャンバ内に位置決めされた前記膜のパッチの表面を提供する ようになったパッチ・ピペットと、 前記パッチ・ピペット電極及び前記基準電極に電気的に接続された、前記テス トサンプルを前記灌流チャンバに導入する前後に、前記両電極を流れる電流を測 定するための手段と、 を有する装置。 テストサンプル及び支持液体を前記灌流チャンバに移送するための手段が、前 記灌流チャンバ上に取付けられ、テストサンプル及び支持液体を前記灌流チャン バ内に放出するための孔を備えたＵ型管を有する、前記装置。 膜のイオン移動チャネル上の化合物のテストサンプルの作用を確認するための 装置であって、 テストサンプル溶液を収容するようになった複数の容器と、前記各容器から、 前記テストサンプルを自動的に取り出し、これらのテストサンプルを受け器に排 出するための手段とを備えた自動サンプラーと、 支持液体を収容するようになった容器と、 テストサンプル溶液と、支持液体と、前記膜とを受け入れるようになったマイ クロ灌流チャンバを有し、該マイクロ灌流チャンバの容積が約５マイクロリット ル乃至約５０マイクロリットルであり、前記マイクロ灌流チャンバが、該マイク ロ灌流チャンバに収容された溶液と電気的に接触するようになった基準電極を備 え、 前記自動サンプラーの受け器から前記テストサンプル溶液を、その容器から支 持液体を、前記マイクロ灌流チャンバに移送するための手段と、前記テストサン プル及び前記支持液体を前記マイクロ灌流チャンバから取り去るための手段と、 内部に電極を備え、前記マイクロ灌流チャンバ上に移動可能に位置決めされ、 高電気抵抗シールに、前記チャンバ内に位置決めされた前記膜のパッチの表面を 提供するようになったパッチ・ピペットと、 前記パッチ・ピペット電極及び前記基準電極に電気的に接続された、前記マイ クロ灌流チャンバへの前記テストサンプルの導入前後に、前記両電極を流れる電 流を測定する手段と、 を有する装置。 前記マイクロ灌流チャンバの容積が約１０マイクロリットル乃至約１５マイク ロリットルの範囲にある前記装置。 前記マイクロ灌流チャンバの容積が約１０マイクロリットル乃至約１２マイク ロリットルの範囲にある装置。 前記マイクロ灌流チャンバから廃液を吸い出すための手段を備えた装置。 前記容器から、前記テストサンプルを自動的に取り出し、これらのサンプルを 受け器に排出するための前記自動サンプラーの前記手段が、注入ポンプと該注入 ポンプに連結されたニードルを備えた装置。 前記マイクロ灌流チャンバに導入されたサンプルの容積を量的に確認するため の管状コイルが、前記テストサンプルを移送するための前記手段と直列に位置決 めされている装置。 また、マイクロ灌流チャンバアセンブリは、ベースと、このベースに設けられ た孔と、上記ベースの底の上の透明手段とを有し、これら孔および透明手段は、 マイクロ灌流チャンバの両側壁および底を形成するように協働しており、また、 マイクロ灌流チャンバアセンブリは、マイクロ灌流チャンバの中の液体と接触す るように配置された基準電極と、マイクロ灌流チャンバの中に液体を導入するた めの手段と、マイクロ灌流チャンバから液体を吸い出すための手段と、基準電極 を電気的な測定機器に電気的に接続するための手段とを有する。 このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、マイクロ灌流チャンバ の底を形成する透明手段は透明なカバーグラスである。 このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、上記ベースは、マイク ロ灌流チャンバの両側壁を形成する少なくとも上記孔の面の上に付着されたハロ ゲン化銀からなるコーティングを備えた銀を有し、これにより、マイクロ灌流チ ャンバの中に収容された液体と電気的に接触するようになった上記ベースの基準 電極を提供する。 このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、上記ベースは、マイク ロ灌流チャンバの両側壁を形成する少なくとも上記孔の面の上に付着された塩化 銀のコーティングを有する銀を備えている。 このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、上記ベースは、マイク ロ灌流チャンバの両側壁を含むその全ての面の上に付着された塩化銀のコーティ ングを備えた銀を有する。 このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、マイクロ灌流チャンバ は、円筒状、截頭円錐状、長円状である。 このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、マイクロ灌流チャンバ の容積は、約５マイクロリットルないし約５０マイクロリットルである。 このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、マイクロ灌流チャンバ の容積は、約１０マイクロリットルないし約１５マイクロリットルである。 このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、マイクロ灌流チャンバ の容積は、約１０マイクロリットルないし約１２マイクロリットルである。 マイクロ灌流チャンバアセンブリは、非導電性材料から作られたベースと、こ のベースに設けられた孔と、上記ベースの底の透明カバー手段とを有し、これら 孔および透明カバー手段は、マイクロ灌流チャンバの両側壁および底を形成する ように協働しており、また、マイクロ灌流チャンバアセンブリは、上記ベースに 設けられてマイクロ灌流チャンバの側壁を貫通して延び且つマイクロ灌流チャン バの中に収容された液体と電気的に接触するように配置された基準電極と、マイ クロ灌流チャンバに液体を導入するための手段と、マイクロ灌流チャンバから液 体を吸い出すための手段と、基準電極を電気的な測定機器に電気的に接続するた めの手段とを有する。 このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、上記ベースはプラスチ ック材料からなる。 このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、上記プラスチック材料 は、ポリメタクリル酸メチル、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、あるいはポリカ ーボネートである。 このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、上記基準電極は、粒状 の銀とハロゲン化銀との混合物によって囲まれた銀ワイヤからなる。 このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、上記基準電極は、粒状 の銀と塩化銀との混合物によって囲まれた銀ワイヤからなる。 このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、上記粒状の銀および塩 化銀は、上記銀ワイヤに付着されている。 このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、上記のマイクロ灌流チ ャンバに液体を導入するための手段は、上記ベースに設けられて、その近位端が マイクロ灌流チャンバと連通するチャンネルを形成するように上記透明カバー手 段と協働する溝と、上記ベースの頂に設けられて、上記チャンネルの遠位端と連 通し且つマイクロ灌流チャンバに液体を導入するために上記チャンネルに連結さ れた流入路を備えた孔とからなる。 このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、マイクロ灌流チャンバ の容積は約５マイクロリットルないし５０マイクロリットルである。 このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、マイクロ灌流チャンバ の容積は約１０マイクロリットルないし１５マイクロリットルである。 このようなマイクロ灌流チャンバアセンブリにおいて、マイクロ灌流チャンバ の容積は約１０マイクロリットルないし１２マイクロリットルである。 灌流チャンバに収容された膜のイオン移動チャネル上の化合物のテストサンプ ルの作用を確認する方法であって、内部に電極を有するパッチ・ピペットが前記 膜の表面でギガオームシールに係合したチップを有し、前記チャンバ内には前記 チャンバに収容された溶液と接触するようになった基準電極が設けられ、 移動特性がベースライン基準として確認されるべきイオンを含む支持液体を前 記チャンバに連続的又は定期的に導入し、 同じ支持液体に溶解された前記テストサンプルの１つを、テストサンプル溶液 を保持した複数の容器を有する自動サンプラーを用いて、前記チャンバに定期的 に装入し、 前記テストサンプルを前記チャンバに導入する前後の両方で、前記ピペット・ 電極と前記基準電極とに接続された電気測定手段回路を流れる電流を測定し、か かる手順を繰り返す、 灌流チャンバに収容された膜のイオン移動チャネル上の化合物のテストサンプ ルの作用を確認する方法と、 前記支持液体を前記灌流チャンバに連続的に導入し、過剰な支持液体を吸引し 、かつ、テストサンプルを前記支持液体の流れに定期的に導入して前記支持液体 と共に前記灌流チャンバに流入させるように前記自動サンプラーをプログラミン グするかかる方法と、 前記マイクロ灌流チャンバは、５マイクロリットルから約５０マイクロリット ルの容積を有するマイクロ灌流チャンバであるかかる方法と、 前記マイクロ灌流チャンバは、約１０マイクロリットルから約１５マイクロリ ットルの容積を有するマイクロ灌流チャンバであるかかる方法と、 前記マイクロ灌流チャンバは、約１０マイクロリットルから約１２マイクロリ ットルの容積を有するマイクロ灌流チャンバであるかかる方法と、 前記支持液体を前記灌流チャンバに定期的に導入し、過剰な支持液体を吸引し 、かつ、テストサンプルを前記支持液体の流れに定期的に導入して前記支持液体 とと共に前記灌流チャンバに流入させるように前記自動サンプラーをプログラミ ングするかかる方法と、 前記自動サンプラーの容器の幾つかは前記支持液体を収容し、かつ前記支持液 体および前記テストサンプルを順次前記灌流チャンバに導入するように前記自動 サンプラーをプログラミングするかかる方法と、 テストサンプルと支持液体の両方を少量ずつ用い、前記灌流チャンバは、約５ から５０マイクロリットルの容積を有するマイクロ灌流チャンバであり、前記自 動サンプラーの容器の幾つかは前記支持液体を収容し、前記自動ンプラーは初め に前記容器の１つから１容量の支持溶液を吸引し、この支持溶液を前記マイクロ 灌流チャンバに入れ、前記自動サンプラーは前記容器の１つからテストサンプル を順次吸引し、このテストサンプルをマイクロ灌流チャンバに入れて前記チャン バ内の前記支持液体と置換し、前記支持液体が前記マイクロ灌流チャンバ内にあ るときと、前記テストサンプルが前記マイクロ灌流チャンバ内にあるときの両方 で電気測定を行うかかる方法と、 前記マイクロ灌流チャンバの容積は、約１０マイクロリットルから約１５マイ クロリットルであるかかる方法と、 前記マイクロ灌流チャンバの容積は、約１０マイクロリットルから約１２マイ クロリットルであるかかる方法と、 前記電極に外部電流を印加して基準電流を所望の値にもたらすかかる方法と、 前記電極に外部電流を印加して基準電流を所望の値にもたらすかかる方法と、 が提供される。 図面の説明 図１は、本発明のいくつかの実施形態を実施する際に組み合わせて用いられる 構成要素の集成装置全体の略図である。 図２は、本発明の連続流れ法を実施する際に用いられる場合の装置の一部の略 図である。 図３は、本発明のＵ型管法を実施する際に用いられる場合の改造された装置の 一部の略図である。 図４は、本発明の停止流れ法を実施する際に用いられる場合の改造された装置 の一部の略図である。 図５は、本発明の一実施態様にかかるマイクロ灌流チャンバ・プレートの平面 図である。 図６は、図５の６−６線における図５に示すマイクロ灌流チャンバ・プレート の横断面図である。 図７は、本発明の別の実施態様にかかるマイクロ灌流チャンバ・プレートアセ ンブリの平面図である。 図８は、図７に示されるアセンブリのマイクロ灌流チャンバ・プレートの平面 図である。 図９は、図７に示されるアセンブリのマイクロ灌流チャンバ・プレートの底面 図である。 図１０は、図８の１０−１０線における横断面図である。 図１１は、電圧依存性カルシウムチャネルに対する基準化合物の影響を表示す るグラフである。 図１２は、カルシウム活性化カリウムチャネルに対するテスト化合物の影響を 表示するグラフである。 好ましい実施形態の説明 本発明は、自動サンプラー、例えば、ＨＰＬＣ装置とともに用いられる自動サ ンプラーを利用したパッチ固定法を実施する装置を提供するものであり、数多く の実験を、短時間の間に、実施する非常に迅速な手段を提供するものである。本 発明はまた、少量のテストサンプルおよび少量の支持液体のみを利用して、パッ チ固定実験を実施可能にするものである。また、本発明は、非常に少量のテスト サンプルおよび非常に少量の支持液体のみを利用しつつ、パッチ固定研究を支え ることのできるマイクロ灌流チャンバのためのいくつかの新規な構造を提供する ものである。本発明はまた、新規な装置を利用して、パッチ固定実験を実施する ためのいくつかの異なった手法を提供するものである。 図１を参照すると、本発明を実施するための構成要素のアセンブリ全体が示さ れている。図示の装置は、「連続流れ法」と呼ばれる本発明の実施態様を実施す るのに用いられるよう特に設計されている。しかしながら、このアセンブリは、 わずかな設計変更によって、以下に説明する本発明の他の実施態様を実施するた めに利用することができる。構成要素のアセンブリ１０は、ファラディ・ケージ １４を支持するエア・テーブル１２を有している。ファラディ・ケージ１４内に は、テーブルトップ１８を支持するブリッジ１６が設けられている。一般に、Ｈ ＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）装置とともに用いられ、複式連結バルブ ２２を備えた自動サンプラー２０(ギルソンモデル（Gilson Model）231sl)が、 注入ポンプ２４および蠕動ポンプ２６（ギルソンモデル（Gilson Model）Minipl us 3)とともに、テーブルトップ１８上に取付けられている。テスト化合物溶液 が、自動サンプラー・トレー２１内に配置されたサンプル容器２８内に含まれて いる。自動サンプラー２０の構成部品であるニードル３０が、容器２８間で横方 向および鉛直方向に移動可能に設けられている。ニードル３０をすすぎ洗いする のに用いられた溶液を収集するすすぎステーション２３が設けられている。注入 ポート３２が、多連結形バルブ２２と連通している。注入ポンプ２４は、ダクト ４０によってニードル３０に結合されており、これにより、動作時においては、 ニードル３０は、自動サンプラー・トレー２１内の特定の位置で、測定された量 の液体をあらかじめ選択されたサンプル容器２８から吸い上げる。ニードル３０ はテストされるべきサンプル溶液を吸い込むと、注入ポート３２まで移動してこ の中にサンプルを注入する。 例えば、生理食塩水のような流体を収容する支持流体容器３４が、ファラディ ・ケージ１４内に設けられている。廃棄物収集容器３６もまた、ファラディ・ケ ージ１４内に設けられている。流体をアセンブリの種々の構成要素間で移送する ために、複数のダクトが、これら種々の構成要素を互いに連結している。たとえ ば、ダクト３８が支持流体容器３４を蠕動ポンプ２６に、ダクト３９が支持流体 容器３４を注入ポンプ２４に、ダクト４０がニードル３０を注入ポンプ２４に、 ダクト４２がバルブ２２を廃棄物収集容器３６に、ダクト４４が蠕動ポンプ２６ を多連結形バルブ２２に、ダクト４８が注入ポート３２を多連結形バルブ２２に 、ダクト５０がすすぎステーション２３を廃棄物収集容器３６に、ダクト５２が 蠕動ポンプ２６を廃棄物容器３６に、それぞれ、連結している。 ステージ５６を有する顕微鏡５４（Nomarski optics,Olympus model EPC-9)が 別のテーブル上に、倒立状態に取付けられている。顕微鏡それ自体は、テーブル の可動部分に取り付けられている。少なくとも一つの電子式マイクロマニプレー タ５８(Eppendorf)もまた、顕微鏡のステージ５６上に取付けられ、プレ増幅器 （ヘッドステージ）６１および従来型パッチピペット６２が取り付けられたパッ チピペット電極ホルダ６０を支持しており、これは、電圧及び電流固定ループを 完成するよう他の電極を保持するのが好ましい。マイクロ灌流チャンバ７２を含 むマイクロ灌流チャンバ・プレート６４が顕微鏡ステージ５６に取り付けられて いる。供給ダクト６６が多連結バルブ２２からの出口をマイクロ灌流チャンバ・ プレート６４の入口に連結し、廃棄物ダクト６８がマイクロ灌流チャンバ・プレ ート６４の廃棄物ポートを廃棄物を除去するための真空源に連結している。デッ ドスペースをできるだけ少なくするためには、バルブ２２の出口からマイクロ灌 流チャンバ７２までの距離は１０ｃｍである。パッチピペット６３内の電極と基 準電極は、いずれもプレ増幅器（ヘッドステージ）６１に接続されている。電線 ７６がプレ増幅器（ヘッドステージ）６１を電圧増幅器７８に接続している。電 線７７が、マイクロ灌流チャンバ７２内の基準電極をプレ増幅器（ヘッドステー ジ）６１に接続している。その他の電圧または電流固定電極用電線は、プレ増幅 器（ヘッドステージ）６１によって所望の電流または電圧勾配を達成するよう設 計された増幅器に接続される。電圧増幅器７８はコンピュータ８０に電気的に接 続され、コンピュータは、テスト中の膜または細胞のイオンチャネル蛋白質をイ オンが通過したことを指示する電気的インパルスを測定するのに用いられる。パ ッチピペットホルダ６０を備えた電子式マイクロマニプレータ５８は、顕微鏡ス テージ５６の右側部に取り付けられている。 細胞または膜に対してハッキリとした適用を得るため、そしてわずかな量のテ ストサンプルおよび支持液体のみを利用するために、バルブ２２の出口は、マイ クロ灌流チャンバにできるだけ近接して、あるいは、Ｕ型管が用いられる場合に は、このＵ型管にできるだけ近接して配置すべきである。したがって、自動サン プラーはそれ自体、図１に示されるように、ファラディ・ケージ内で、パッチ固 定増幅器７８のヘッドステージ（前置増幅器）６１及びテスト中の膜と接触して いるパッチピペット６２に近接して配置されている。これにより、潜在的に深刻 な２つの問題が生じる。 １）電気ノイズ。交流電圧で動作させる必要のある任意の装置をファラディ・ ケージ内に導入すると、５０ヘルツまたは６０ヘルツの電磁放射線源が生じるこ とになる。これは、パッチピペット６２内の電極（アンテナとして動作する）に よってピックアップされやすく、したがって、電流信号が妨害される。しかしな がら、設備全体のすべての金属パーツを慎重に共通の高品質の接地用導体にアー スすることにより、この問題は本質的に解決されることになる。過度の電気ノイ ズの発生を避けるためには、自動サンプラー２０の重要な部品をアースして、遮 蔽するよう特に気配りする必要がある。他の自動サンプラーを用いる場合、これ らは、図１に示される設備で用いたギルソンモデルと比較して、効果的にアース することは一層困難であるかもしれないが、これら自動サンプラーを別のファラ ディ・ケージ内に遮蔽することが必要になる場合がある。 ２）振動。振動は、ニードル３０がサンプル容器２８相互間で移動するとき、 自動サンプラー２０によって生じる。これには、次の２つの言外の意味がある。 (1)ピペット６２に伝達される振動は、細胞取付け記録モードおよび細胞全体の 記録モード中のギガシール（ギガオーム級のシール）を必然的に破壊することに なる。(2)弱い機械的振動でも、これが電流信号中に見える低周波電気ノイズに 変換される場合がある。しかしながら、図１に示されるブリッジ形設備では、こ れら両方の問題は回避される。 本手法は、イオンチャネルを有する膜をマイクロ灌流チャンバ７２内に置くこ とによって実施される。好ましくは、培養細胞を載せた小さなカバーガラス７４ （２.８ｍｍ）をマイクロ灌流チャンバ７２内に挿入することにより、パッチ固 定法が実施される。次いで、パッチ電極ピペット６２を、カバーガラス７４上に 支持された膜と接触するようになるまで、マイクロ灌流チャンバ７２内へ下降さ せる。ギガシール（ギガオーム）がパッチピペット６２の端部と生体膜との間に 形成されるまで、吸引力をパッチピペット６２に及ぼす。テストが、次いで実施 される。電気信号が、プレ増幅器（ヘッドステージ）６１に取り付けられたパッ チピペット６２内の電極によって検出され、次いで、電線７６によって図１に示 す 電圧増幅器７８およびコンピュータ８０に伝送される。マイクロ灌流チャンバ内 の溶液と接触している基準電極(図示せず)がプレ増幅器（ヘッドステージ）６１ の接地端子に接続されている。 パッチ固定手法においては、テストされるべき化合物に適したプロトコールに 応じて、種々の支持溶液を使用できる。カルシウム活性化カリウムチャンネルの 記録に用いられる標準溶液は、１４０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ₂１ｍＭ のＭｇＣｌ₂、１.３ｍＭのＥＧＴＡ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含んでいる。この 組成を用いると、溶液中の遊離カルシウムの濃度が０.３ｍＭになる。ＥＧＴＡ 濃度を１.０７ｍＭに変えることにより、カルシウムイオンにより誘起されるＫ −チャネル活性化を達成でき、その結果、溶液中の遊離カルシウム濃度は１.０ ｍＭとなる。テスト化合物は、選択したアッセイのプロトコールに応じて、支持 溶液中に溶解される。すべてのテスト化合物溶液および生理食塩水は、本装置で 使用する前に瀘過される。 本発明の方法を連続流れに使用した場合には、図１を参照すると、支持液体の 連続流が蠕動ポンプ２６によって得られる。定期的に、自動サンプラー２０は選 択したサンプルバイアル２８から、特定量のテスト化合物を吸引し、これを注入 ポート３２を経て、管状ループ７０内へ導入する（全ループ充填方式）。サンプ ル体積、ループ容積、流量は任意である。導入後、多連結形バルブ２２の出口が 切り替わり、ループ内容物がバルブからマルチ灌流プレートまでのダクト６６に よって、マイクロ灌流チャンバ７２内へ導かれ、この灌流チャンバ７２から、過 剰の流体が吸出しによって除去される。テスト化合物を操作する時間は、ループ サイズ及び流量によって決定される。化合物のウォッシュアウト(washout)は注 入の時間間隔によって随意的に決定される。自動サンプラーはあらかじめ定めら れたプログラムに従って、チャンバ溶液を自動的に取り替える。ウォッシュアウ ト期間の間にテストされる化合物の数は、選択したプロトコールに応じて様々で ある。 従来の連続流れ方式と比較した場合の本発明の連続流れ方式の特定の利点は次 の通りである。 (1) テスト溶質の自動切替え。 (2) 自動サンプラーとパッチ固定増幅器との間の大きな範囲で融通性のある調 整。 (3) 化合物操作の融通性、実験中のプログラムの変更等。 (4) 化合物のテスト直前における化合物の自動溶解（これは不安定な物質にと って重要である）。 (5) 個々の操作ごとの間のキャリーオーバを回避するためのニードル及び注入 ポートの自動すすぎ。 図２を参照すると、図１に示される装置を用いる本発明の連続流れ法の詳細が 概略的に示されている。動作原理を説明すると、蠕動ポンプ２６によって生理食 塩水または他の支持液体を、定常状態で、バルブ２２を通じ、マイクロ灌流チャ ンバ７２に圧送する。また、流体を真空によって、ダクト６８を経て、マイクロ 灌流チャンバ７２から連続的に吸い出す。操作手順は次のように連続して行われ る。 ａ）少量の空気を、注入ポンプ２４によって、ニードル３０内へ吸引する。 ｂ）ニードル３０をサンプルバイアル２８まで移動させ、特定量のサンプルを 吸い込ませる。 ｃ）ニードル３０を注入ポート３２まで移動させ、管状ループ７０にサンプル を導入させる（通常は、ループ容積の３倍であり、過剰量は多連結形バルブ２２ の出口５を通して排出する）。 ｄ）多連結形バルブ２２は注入モードに切り替わり、管状ループ７０の内容物 は、バルブ２２からマイクロ灌流チャンバ７２までのダクト６６内に注入される 。 ｅ）多連結形バルブバルブ２２は連続流れモードに切り替わり、生理食塩水は 、分取されたサンプルのテストの後も、流れ続ける。 ｆ）次の操作が開始される前に、ニードル３０をすすぎステーション２３内で すすぎ洗いする（両側部に対してリザーバ溶液による灌流）。リザーバ溶液を、 支持液体容器からのダクト３９を通って、支持流体容器３４から吸い上げ、ニー ドル３０を通じて、すすぎステーション２３で廃棄する。注入ポート３２を、リ ザーバ食塩水をバルブ２２内へ導入することによって、出口５を通して、廃棄さ れた廃棄物溶液を用いて、すすぎ洗いする。 図３を参照すると、本発明の別の実施態様が示されており、この実施態様はＵ 型管法を実施するのに利用される。この自実施態様の方法を実施するのに利用さ れる構成要素は、図１に示されるものと実質的に同一である。ただし、テストサ ンプルを、Ｕ型管８２の底部に設けられた孔８３を通じて、灌流チャンバ７３内 に放出する点が異なっている。 Ｕ型管方式のような従来型の迅速操作方式は、自動サンプラーを含む本発明の 装置によって容易に実施される。細胞を、上述の連続流れ法で用いた灌流チャン バよりもやや大きな灌流チャンバ内に置く。これによって、Ｕ型管の位置決めが 容易になる。自動サンプラーは、上述の連続流れ法で動作するのとほとんど同じ 仕方で、Ｕ型管法でも動作する。膜は、蠕動ポンプ２６により、蠕動ポンプ２６ から灌流チャンバ７３までのダクト６７を通って、定常状態で圧送される標準生 理食塩水により連続的に灌流される（このダクトは、多連結形バルブ２２を通ら ない）。また、流体は、ダクト６８及び蠕動ポンプを経て、灌流チャンバ７３か ら連続的に吸い出される。蠕動ポンプはまた、標準生理食塩水をＵ型管８２中へ 連続的に圧送する。流体は、多連結形バルブ２２を通り、ダクト６４を介して、 Ｕ型管に圧送される。流体の流れに起因して、Ｕ型管内の圧力が減少するので、 少量の流体が灌流チャンバ７３から孔８３を通って、Ｕ型管内へ吸い出される。 連続流れ法におけるように、薬剤サンプルを管状ループ７０内へ導入する。多連 結形バルブ２２は注入モードに切り替わり、管状ループ７０の内容物は、多連結 形バルブ２２の出口ポートから、Ｕ型管８２までのダクト６９内へ注入される。 Ｕ型管８２の出口に設けられた電磁バルブ８４を閉じると、Ｕ型管内の圧力が上 昇し、その結果、薬剤サンプルの一部が孔８３を通って、灌流チャンバ７３内へ 圧送される。薬剤サンプルのテスト完了後、バルブ８４を再び開き、孔８３を通 る薬剤サンプルがそれ以上流れないようにする。灌流チャンバの連続吸出しによ り、薬剤サンプルが灌流チャンバから迅速に灌流される。 操作時間は随意であり、これはバルブの閉鎖期間によって決定される。Ｕ型管 を用いるには、図３に示されるような大きな実験用灌流チャンバが必要である。 Ｕ型管を、別個のマイクロマニピレータ上に置き、顕微鏡で見ながら、誘導して 位置決めする。 Ｕ型管方式の利点は、これが、トランスミッタにより調整されるチャネルの検 討に必要な迅速な操作時間と自動サンプラーの大容量で容積が小さいという要求 とを兼ね備えていることである。 図３は、Ｕ型管方式で生じる際のフローパターンを示している。このパターン は、上述の連続流れ法のパターンと本質的には同一である。動作原理を説明する と、蠕動ポンプ２６により、食塩水を、蠕動ポンプ２６から灌流チャンバ７３ま でのダクト６７を通って、定常状態で圧送する（このダクトは、多連結形バルブ ２２を通らない）。また、流体を、ダクト６８及び蠕動ポンプを経て、灌流チャ ンバ７３から連続的に吸い出す。蠕動ポンプはまた、標準生理食塩水をＵ型管８ ２内へ連続的に圧送する。流体は、多連結形バルブ２２を通り、ダクト６９を介 して、Ｕ型管に圧送される。一般的操作手順は次の通りである。 ａ）少量の空気を図１に示される注入ポンプ２４によって、ニードル３０内へ 吸引する。 ｂ）ニードル３０をサンプルバイアル２８まで移動させ、特定量のサンプルを 吸い込ませる。 ｃ）ニードル３０を注入ポート３２まで移動させ、管状ループ７０にサンプル を導入させる（通常は、ループ容積の３倍であり、過剰量は出口５を通って排出 される）。 ｄ）多連結形バルブ２２は注入モードに切り替わり、管状ループ７０の内容物 は、多連結形バルブ２２の出口ポートからＵ型管８２までのダクト６９内に注入 される。 ｅ）操作は、電磁バルブ８４によるＵ型管出口の閉鎖によって生じる。 ｆ）電磁バルブ８４を再び開くと、標準生理食塩水の流れがＵ型管内のサンプ ルにとって代わる。サンプル溶液は、ダクト６７から圧送され、ダクト６８を通 って吸引される標準生理食塩水の連続流れによって、灌流チャンバ７３から灌流 される。 ｇ）次の操作を開始する前に、ニードル３０をすすぎステーション内ですすぎ 洗いする（両側部に対してリザーバ溶液による灌流）。リザーバ食塩水をバルブ ２２に導入することにより、注入ポート３２を出口５から廃棄される廃棄物溶液 によりすすぎ洗いする。 溶液の量及びテスト化合物に関する要件を絶対最少限に制限するためには、本 発明による停止流れ法(stop flow technique)が開発された。 図４を参照すると、停止流れ法を実施するための構成要素のうち、いくつかが わずかに修正された構成が示されている。注入ポート３２、多連結形バルブ２２ および管類を含むデッドスペースの総量が、ここでは特に重要である。したがっ て、管状ループ７０は、短い真っ直ぐな管片８６で置き換えられている。その目 的は、テスト溶液の経路を短くし、それによって、必要な溶液の量を少なくする ことにある。溶液の量は、バルブの入口および出口の特定の連結法（非ループ方 式）によって、１５マイクロリットルまで減少される。この修正例では、自動サ ンプラーの動作は、ＨＰＬＣ自動サンプラーで用いられた動作原理とは多少異な る。しかしながら、一般原理は単純であり、自動サンプラーは、特定量をサンプ ルバイアルから吸い込み、これを、マイクロ灌流チャンバ１００内に直接導入す る。このプロセスは次のように実施される。 ａ）少量の空気を、図１に示される注入ポンプ２４によって、ニードル３０内 へ吸引する。 ｂ）図１に示される蠕動ポンプ２６を注入直前に自動的に作動させ、マイクロ 灌流チャンバ１００内の過剰の流体を吸い出す。 ｃ）ニードル３０をサンプルバイアル２８まで移動させ、テスト溶液（コント ロール溶液＋テスト化合物）または食塩水だけを２００マイクロリットル吸い込 ませる。 ｄ）ニードル３０を注入ポートまで移動させる。サンプラーのオプションとし ての「部分ループ充填方式」を用いて、注入された最初の２０マイクロリットル （これは、空気を含んでいる場合がある）を廃棄物バルブ出口５及びダクト４２ を通して排出する。 ｅ）バルブを切り替え、ダクト６８によりチャンバ１００から過剰流体を連続 的に吸出しつつ、残りの１８０マイクロリットルの溶液をマイクロ灌流チャンバ １００に直接導入する（導入時間は１５秒であるが、原理的には任意である）。 ｆ）注入後、ポンプおよび液体の流れを所望の期間にわたって停止させ、イオ ン移送量を指示する手段として必要な電気的測定値を取り、その値をコンピュー タによって記録する。 ｇ）次の操作を開始する前に、ニードル３０をすすぎステーション内ですすぎ 洗いする（両側部に対してリザーバ溶液による灌流）。リザーバ食塩水をバルブ ２２の出口５の中へ導入することによって、注入ポートをすすぎ洗いする。 停止流れ方式の利点は主として、要求されるサンプルの量が非常に少ないこと （全体で最高２２０マイクロリットル）である。灌流チャンバ容積の約２０倍未 満の灌流が使用可能であれば、総容積をそれに応じて減少させることができる。 本発明に従って行った実験の示すところによれば、ちょうど１００マイクロリッ トル（全体で１４０マイクロリットル）注入することによって、９０％を越える 置換が得られる。このように少量しか要求されないため、多くの場合、合成によ り及び／又は天然物から単離される少量の化合物に基づく化学的ライブラリー全 体の電気生理学的テストが可能になる。 そのうえ、本発明によれば、きわめて小さなマイクロ灌流チャンバを有するマ イクロ灌流チャンバアセンブリのいくつかの実施態様が開発されている。これら マイクロ灌流チャンバの使用により、きわめて少量のテストサンプル及び支持液 体を分析し、それによりテスト操作に必要な時間を大幅に減少させることのでき る装置が得られる。 図５及び図６を参照すると、極小容積マイクロ灌流チャンバアセンブリ８８の 一実施形態が示されている。このチャンバは非常に小さなサイズのものなので、 ２本の電極を灌流チャンバ１００内に配置するにはスペースが不十分である。し たがって、基準電極は、チャンバ構造の一体部分でなければならない。図５及び 図６に示す実施形態では、チャンバアセンブリ８８は、薄い塩化銀層９２で被覆 された銀のディスク９０を有している。銀のディスク９０と塩化銀層９２とは協 働して、基準電極として作用する。銀のディスク９０は厚さが１mm、直径が６mm である。３mmの孔９４が、ディスクの中央に設けられており、マイクロ灌流チャ ンバ１００のキャビティを形成している。銀線９６が銀のディスク９０にハンダ 付けされている。塩化銀層９２を銀のディスク９０の表面に形成するには、銀の ディスク９０を塩化ナトリウム水溶液中に置き、別の銀線をカソードとして利用 するとともに、ディスクをアノードとして接続した状態でこのディスクを２時間 にわたって電気分解する。電極のショートを防止するために、少なくとも孔９４ の表面全体を塩化銀で被覆する必要がある。好ましくは、孔８４の表面を含め、 銀のディスク９０全体を塩化銀で被覆する。直径４０mm、厚さ０．１mmのカバー ガラス９８が、被覆された銀製ディスク９０の底面に、孔９４を覆って、接着さ れ、マイクロ灌流チャンバ１００の透明な底部を形成している。マイクロ灌流チ ャンバ１００の容積は、５マイクロリットルないし５０マイクロリットルである のがよい。マイクロ灌流チャンバの容積が１０マイクロリットルないし１５マイ クロリットルであると、一層望ましい結果が得られる。ただし、テストの対象で ある材料のほんのわずかなサンプルおよび少量の支持液体を利用して、各テスト の所要時間を短くするためには、好ましい範囲は１０マイクロリットル〜１２マ イクロリットルである。各種溶液は全て、入口１０２を通って、チャンバに入り 、出口１０４を通って、チャンバから吸い出される。 培養細胞を、標準培養器内の小さなカバーガラス（厚さ０.１mm、直径２.８mm ）７４上の単分子層内で成長させることができる。実験を行う前に、単一のカバ ーガラス７４を薄っぺらな鉗子でマイクロ灌流チャンバ１００の底部に移し、こ れに食塩水をかける。最終抵抗が２〜６ＭΩの標準型パッチ固定具である図１に 示されるパッチピペット６２を、図１、図２、図３および図４に示されるように 、上から下降させる。パッチピペット６２の中には銀−塩化銀電極６３が設けら れており、このパッチピペットは、ＨＥＫＡエレクトロニクス社により開発され た標準型のパッチピペット・ホルダー６０で支持されている。ピペット先端の直 径は、約１μｍである。したがって、吸引力によりピペットを充填したり、ピペ ットの再充填を行っても、溶液は、毛管作用による力に起因して、定位置にとど まる。ピペットとテストの際に用いられる膜との間のギガシールを生じさせるに は、わずかな吸引力を口で及ぼすだけでよい。パッチピペット６２内に設けられ ている電極６３は、プレ増幅器（ヘッドステージ）６３に電気的に接続され、プ レ増幅器は、コンピュータ８０に電気的に接続されたパッチ固定増幅器７８に電 気的に接続されている。銀線９６は、銀のディスク９０と塩化銀層９２とからな る基準電極に電気的に接続されている。基準電極は銀線９６に接続され、さらに 、銀 線は、プレ増幅器（ヘッドステージ）６１の接地端子に電気的に接続されている 。イオンチャネル移送に対するテスト中の各サンプルの影響は、パッチピペット ６２内に設けられている電極及び基準電極により、電流の形で測定され、コンピ ュータ８０で記録される。 図７、図８、図９および図１０を参照すると、別の実施態様におけるマイクロ 灌流チャンバアセンブリ１０６が示されている。図７に示されるように、アセン ブリ１０６は、顕微鏡ステージ５６の中央孔にぴったりと嵌まり込むように設計 された金属の支持ディスク１０８を有している。支持ディスク１０８に設けられ た孔内には、図８および図９に詳細に示されるマイクロ灌流チャンバ・ディスク １１０が設けられている。マイクロ灌流チャンバ・ディスク１１０の材質は非導 電性材料であるのが良く、その中には、メチルメタクリレート、ボリスチレン、 ポリ塩化ビニル、フェノールホルムアルデヒド、その他の多くの材料を含むプラ スチックがある。直径が約３mmの孔１１２がマイクロ灌流チャンバ・ディスク１ １０に設けられている。溝１１４がマイクロ灌流チャンバ・ディスク１１０の底 部に設けられ、カバーガラス１１６がディスク１１０の底部に接着されている。 カバーガラス１１６は、孔１１２と協働して、マイクロ灌流チャンバ１１８を形 成している。カバーガラス１１６は溝１１４と協働して、テストされるべき液体 サンプルと支持食塩水をマイクロ灌流チャンバ１１８内に導入するためのチャネ ル１１７を形成している。孔１２０がディスク１１０の上壁に設けられ、液体を チャネル１１７内に導入するためのポートとして機能している。管１２２が孔と 図１に示される自動サンプラーの多連結形バルブ２２とを結合している。小径の 銀−塩化銀ペレット電極１２４が、ディスク１１０の上面に設けられた溝１２６ に埋め込まれていて、基準電極として働く。ペレット電極１２４は、銀と塩化銀 の混合物を、カリフォルニア州所在のイン・ビーボー・メトリック社から入手し た銀線の周りに押し固めて形成したものである。電極１２４から延びる電線は、 図１に示す増幅器ヘッドステージ７８に直接接続されている。 たとえば、符号７２、１００または１１８で示されるマイクロ灌流チャンバか らの過剰流体の吸出しは、チャンバの全容量のうち、多くの部分が１秒ごとに吸 い出されるため、小さなチャンバの場合、特定の問題を提起する。ごく小さなプ ラスチックチューブ１２８（エッペンドルフ・ジローダー・チップ）を用いた非 常に滑らかな吸出し操作を利用することができ、これは液体表面レベルの変動を 回避する上で必要不可欠である。液体表面が変化しやすいと、変化するバックグ ラウンドノイズが生じ、また、細胞あるいはパッチに対する機械的応力が増大す る場合があり、それによって、記録期間が制限される。 以下の実施例により、本発明の実施方法に関する明確な理解が得られるであろ う。ただし、これら実施例は例示に過ぎず、本発明を限定するものではない。実施例１ 連続流れ法：ひよこの後根神経節細胞のカルシウム電流を、上述し、図７ない し図１０に図示したように、自動サンプラーと注入ポンプと蠕動ポンプと、容積 が１２マイクロリットルのマイクロ灌流チャンバとを有する装置を利用して、連 続流れ法を用い、全細胞記録法によって確認した。 Ｃａ²⁺電流を次のピペットおよび浴溶液を用いて他の電流から遮断した。 ピペット：ＣｓＣｌ（１００ｍＭ）、ＣｓＦ（２０ｍＭ）、ＥＧＴＡ（１０ｍ Ｍ）、ＭｇＣｌ₂（４ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）。 浴：ＮａＣｌ（１４０ｍＭ）、ＫＣｌ（４ｍＭ）、ＣａＣｌ₂（２ｍＭ）、Ｍ ｇＣｌ₂（１ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、ＴＴＸ（μＭ）。高カルシウム 濃度によりＫ⁺電流が遮断され、ＴＴＸ（テトロドトキシン）によりＮａ⁺電流が 遮断される。 電圧依存性カルシウムチャネルに対する５つの公知の標準剤であるフェニトイ ン、アミロリド(amiloride)、ω−コノトキシン(conotoxin)ＭＶＩＩＡ、ベイ(B ay)Ｋ−8644、ニフェジピン（nifedipine）の作用を次々にテストし、これを図 １１に報告している。図は、−７０ｍＶの静止電位から０ｍＶまでの５ミリセカ ンドの減極電圧段階により誘起された最大電流に関する一連の記録をを示してい る。化合物を５００マイクロリットルのアリコートで灌流した。フェニトインと アミロリドを、それぞれ、時間軸上の０分、１５分の時点で注入したが、これら はいずれも、電流には影響を及ぼさず、これにより、カルシウムイオンチャネル に対する影響がないことがわかる。３０分の時点で、ω−コノトキシンＭＶＩＩ Ａの５００マイクロリットルアリコートを注入した。ω−コノトキシン ＭＶＩＩＡは、グラフ上に記録されている電流の変調により明らかなように、Ｎ 型のカルシウムチャネルに対して親和性を有する。グラフは又、これから明らか にわかるようなウォッシュアウトはないので、ω−コノトキシンＭＶＩＩＡ結合 は非可逆的であったことを示している。ベイＫ−8644は、経時的にみて、ウォッ シュアウトから明らかなように、Ｌ型カルシウムチャネルを可逆的に刺激する。 ニフェジピンはＬ型カルシウムチャネルを遮断する。 したがって、本発明は、周知の生理活性を有する化合物による灌流操作に対す るパッチ固定法隔離式膜イオンチャネルの応答を確認する際に有用であることが 判明している。この結果は、５つの化合物が、単一の膜標本を用いて、１時間に 過ぎない時間でテストされたことを示し、また、生理的反応の有効範囲を示して いる。実際には、操作期間だけでなく操作の間のウォッシュアウト期間を含む未 知の化合物のスクリーニングは短く、従って、１０ないし２０の化合物を１時間 でスクリーニングできる。（特に実施例２参照）。実施例２ 停止流れ方式：培養した人の冠状平滑筋細胞のカリウム電流を、上述し、図７ ないし図１０に図示したように、自動サンプラーと注入ポンプと蠕動ポンプと容 積が１２マイクロリットルのマイクロ灌流チャンバとを有する装置を利用し、停 止流れ方式を用いて、摘出裏返しパッチ法（excised inside out patch）により 確認した。 ピペットおよび浴溶液の組成は次の通りである。 ピペット：ＫＣｌ（１４０ｍＭ）、ＣａＣｌ₂（１ｍＭ）、ＭｇＣｌ₂（１ｍＭ ）、ＥＧＴＡ（1.３ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）。 浴：ＫＣｌ（１４０ｍＭ）、ＣａＣｌ₂（１ｍＭ）、ＭｇＣｌ₂（１ｍＭ）、１ .０７ｍＭ〜２.０ｍＭのＥＧＴＡ。遊離Ｃａ²⁺濃度をＥＧＴＡの濃度によって求 めた。全てのテスト化合物を０.３μＭの遊離Ｃａ²⁺とともに浴溶液中に溶解さ せた。 カルシウム活性化カリウムチャネルに対する未知化合物の作用をテストし、図 １２に報告している。実験プロトコールでは、食塩水（黒丸で示す）を用いて、 間欠式ウォッシュアウト法（intermittent washout）で、未知化合物（白丸で示 す）を、次々に灌流した（３００マイクロリットル）。各操作を２分間にわたり 続け、これは６つのデータ点として報告されている。パッチには多チャネルが存 在し、これらの活性を、遊離カルシウム濃度が低い（０.３μＭ）の浴溶液によ って、低レベル（全活性のうち２０％）に調節した。このレベルは、未知のテス ト化合物の考えられる活性化効果と遮断効果の両方を検出できるよう選択された 。種々の時間間隔を置いて、濃度が１μＭの遊離カルシウムイオン（□で示す） を含む食塩水を用いて、灌流法で活性化を誘起した。０．５μＭの遊離カルシウ ムイオンを含む食塩水を用いた灌流操作を最後にテストした（＊で示す）。１μ Ｍの濃度における２５の未知化合物のこのテストでは、基底カルシウム活性化カ リウム電流からの変化を誘起した化合物はなかったが、膜標本のカリウムチャネ ルは、カルシウム濃度が高い（１.０μＭ）食塩水にさらされると特徴的な高い カリウム電流を示した。 したがって、本発明は、少量のテスト化合物を迅速かつ連続して分析できる方 式を提供するものであることが判明している。このテストは、２５を越える数の 未知化合物を２時間の間にスクリーニングしたことに鑑みて注目に値する。この テストは、高濃度のカルシウムイオンを含む食塩水による灌流方式において誘起 されるＫチャネルの間欠的な完全活性化によって実証された。この高いカルシウ ム誘起カリウム電流は、膜標本から得ることができる電流応答の範囲を示し、活 性化合物を検出するのに必要な感度を明示している。 本発明は、パッチ固定法を実施する際、ＨＰＬＣ自動サンプラーを用いる新規 な方法を提供する。これにより、多数のテストを比較的短時間で実施できる。本 発明は又、非常に小さなマイクロ灌流チャンバを含む新規なマイクロ灌流チャン バアセンブリを使用しており、それによって、非常に少量のテストサンプル溶液 及び支持溶液を利用すればよく、しかも、各テストに必要な時間が短縮される。 また、本発明は、別の利点をもたらすパッチ固定法を実施するためのいくつかの 新規な手法を含んでいる。本発明は更に、非常に小さなチャンバを利用し、一体 形電極を有する新規なマイクロ灌流チャンバ構造を含んでいる。 以下の請求の範囲において、「膜」という用語は、全細胞または部分的な細胞 膜を示すものとして用いられている。 本発明の好ましい実施形態を添付の図面に示すと共に上述したが、当業者であ れば、本発明の精神又は範囲から逸脱すること無く本発明の多くの設計変更例、 改造例、構成要素の置換例及び他の均等例を想到できるので、開示した実施態様 そのもの、又は、図示説明した作用方法そのものに限定されないことが理解され るべきであり、したがって、本発明の範囲は、特許請求の範囲に記載された事項 にのみ基づいて定められるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．膜のイオン移動チャネル上の化合物のテストサンプルの作用を確認する装置 であって、 テストサンプル溶液を収容可能な複数の容器と、前記各容器から、前記テス トサンプルを自動的に取り出し、受け器に排出する手段を備えた自動サンプラー と、 支持液体を収容可能な容器と、 テストサンプル溶液、支持液体および前記膜を受け入れ可能な灌流チャンバ であって、該チャンバ内に含まれる溶液と電気的に接触可能な基準電極を備えた 灌流チャンバと、 前記自動サンプラーの受け器から、前記テストサンプル溶液を、その容器か ら支持液体を、前記灌流チャンバに移送する手段と、前記テストサンプルおよび 前記支持液体を、前記灌流チャンバから取り去る手段と、 その内部に電極を備え、前記灌流チャンバ上を移動可能に位置し、高電気抵 抗シールに、前記チャンバ内に位置している前記膜のパッチの表面を提供するパ ッチ・ピペットと、 前記パッチ・ピペット電極および前記基準電極に電気的に接続され、前記テ ストサンプルを前記灌流チャンバに導入する前後に、前記両電極を流れる電流を 測定する手段 を備えた装置。 ２．テストサンプルおよび支持液体を前記灌流チャンバに移送する手段が、前記 灌流チャンバ上に取付けられ、テストサンプルおよび支持液体を前記灌流チャン バ内に放出する孔を有するＵ型管を備えた請求の範囲第１項に記載の装置。 ３．膜のイオン移動チャネル上の化合物のテストサンプルの作用を確認する装置 であって、 テストサンプル溶液を収容可能な複数の容器と、前記各容器から、前記テス トサンプルを自動的に取り出し、受け器に排出する手段を備えた自動サンプラー と、 支持液体を収容可能な容器と、 テストサンプル溶液、支持液体および前記膜を受け入れ可能なマイクロ灌流 チャンバであって、その容積が約５マイクロリットルないし約５０マイクロリッ トルで、該チャンバ内に含まれる溶液と電気的に接触可能な基準電極を備えたマ イクロ灌流チャンバと、 前記自動サンプラーの受け器から、前記テストサンプル溶液を、その容器か ら支持液体を、前記マイクロ灌流チャンバに移送する手段と、前記テストサンプ ルおよび前記支持液体を、前記マイクロ灌流チャンバから取り去る手段と、 その内部に電極を備え、前記マイクロ灌流チャンバ上を移動可能に位置し、 高電気抵抗シールに、前記チャンバ内に位置している前記膜のパッチの表面を提 供するパッチ・ピペットと、 前記パッチ・ピペット電極および前記基準電極に電気的に接続され、前記テ ストサンプルを前記マイクロ灌流チャンバに導入する前後に、前記両電極を流れ る電流を測定する手段 を備えた装置。 ４．前記マイクロ灌流チャンバの容積が約１０マイクロリットルないし約１５マ イクロリットルの範囲にある請求の範囲第３項に記載の装置。 ５．前記マイクロ灌流チャンバの容積が約１０マイクロリットルないし約１２マ イクロリットルの範囲にある請求の範囲第３項に記載の装置。 ６．さらに、前記マイクロ灌流チャンバから廃液を吸い出す手段を備えた請求の 範囲第３項に記載の装置。 ７．前記容器から、前記テストサンプルを自動的に取り出し、受け器に排出する 前記自動サンプラーの前記手段が、注入ポンプとそれに接続されたニードルを備 えた請求の範囲第３項に記載の装置。 ８．管状コイルが、前記マイクロ灌流チャンバの中に導入されたサンプルの体積 を定量的に測定するために前記テストサンプルを移送する手段と直列に配置され ている請求の範囲第３項に記載の装置。 ９．ベースと、前記ベースに設けられた孔と、前記ベースの底部にわたる透明手 段とを有し、前記孔及び前記透明手段は協働して、前記マイクロ灌流チャンバ の前記側壁と底部とを構成し、更に、前記チャンバ内の液体と接触するように配 置された基準電極と、液体を前記チャンバの中に導入する手段と、液体を前記チ ャンバから吸い出す手段と、前記基準電極を電気計測装置に電気的に接続する手 段とを有するマイクロ灌流チャンバアセンブリ。 10．前記チャンバの底部を形成する前記透明手段は、透明なカバーガラスである 請求の範囲第９項に記載のマイクロ灌流チャンバアセンブリ。 11．前記ベースは、少なくとも前記マイクロ灌流チャンバの側壁を構成する孔の 表面上に蒸着されたハロゲン化銀の被覆を有する銀を備え、それにより、前記チ ャンバ内に入っている液体と電気的に接触をするようになった前記ベースの基準 電極を提供する請求の範囲第９項に記載のマイクロ灌流チャンバアセンブリ。 12．前記ベースは、少なくとも前記マイクロ灌流チャンバの側壁を構成する孔の 表面上に蒸着された塩化銀の被覆を有する銀を備える請求の範囲第９項に記載の マイクロ灌流チャンバアセンブリ。 13．前記ベースは、前記チャンバの側壁を含む表面全体にわたって蒸着された塩 化銀の被覆を有する銀を備える請求の範囲第１２項に記載のマイクロ灌流チャン バアセンブリ。 14．前記マイクロ灌流チャンバは、円筒状、截頭円錐状、又は、楕円状である請 求の範囲第１３項に記載のマイクロ灌流チャンバアセンブリ。 15．前記マイクロ灌流チャンバの容積は、約５マイクロリットルないし約５０マ イクロリットルである請求の範囲第１３項に記載のマイクロ灌流チャンバアセン ブリ。 16．前記マイクロ灌流チャンバの容積は、約１０マイクロリットルないし約１５ マイクロリットルである請求の範囲第１３項に記載のマイクロ灌流チャンバアセ ンブリ。 17．マイクロ灌流チャンバの容積は、約１０マイクロリットルないし約１２マイ クロリットルである請求の範囲第１３項に記載のマイクロ灌流チャンバアセンブ リ。 18．非導電性材料で形成されたベースと、前記ベースに設けられた孔と、前記ベ ースの底部の透明カバー手段とを有し、前記孔と前記透明カバー手段は協働して 、前記マイクロ灌流チャンバの側壁と底部を構成し、更に、前記マイクロ灌流チ ャンバの側壁を貫通して前記ベースに設けられ、かつ、前記チャンバの中に入っ ている液体と電気的に接触するように配置された基準電極と、液体を前記チャン バに導入する手段と、液体を前記チャンバから吸い込む手段と、前記基準電極を 電気計測装置に電気的に接続する手段とを有するマイクロ灌流チャンバアセンブ リ。 19．前記ベースはプラスチック材料からなる請求の範囲第１８項に記載のマイク ロ灌流チャンバアセンブリ。 20．前記プラスチック材料が、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリ 塩化ビニル、又は、ポリカーボネートである請求の範囲第１９項に記載のマイク ロ灌流チャンバアセンブリ。 21．前記電極が、粒状の銀とハロゲン化銀との混合物により取り囲まれた銀製ワ イヤを有する請求の範囲第１８項に記載のマイクロ灌流チャンバアセンブリ。 22．前記電極が、粒状の銀と塩化銀との混合物によって取り囲まれた銀製ワイヤ を有する請求の範囲第１８項に記載のマイクロ灌流チャンバアセンブリ。 23．前記粒状の銀と塩化銀が前記銀製ワイヤに固定されている請求の範囲第２２ 項に記載のマイクロ灌流チャンバアセンブリ。 24．液体を前記マイクロ灌流チャンバの中に導入する前記手段は、前記チャンネ ルを構成するように前記透明カバー手段と協働する、前記ベースに設けられた溝 であり、前記チャンネルの近位端は、前記マイクロ灌流チャンバと連通しており 、更に、前記ベースの上に設けられた孔は、前記チャンネルの遠位端と連通し、 かつ、液体を前記マイクロ灌流チャンバの中に導入するために、そこに連結され た流入ダクトを持つようになっている請求の範囲第１８項に記載のマイクロ灌流 チャンバアセンブリ。 25．前記マイクロ灌流チャンバの容積は、約５マイクロリットルから約５０マイ クロリットルである請求の範囲第２４項に記載のマイクロ灌流チャンバアセンブ リ。 26．前記マイクロ灌流チャンバの容積は、約１０マイクロリットルから約１５マ イクロリットルである請求の範囲第２４項に記載のマイクロ灌流チャンバアセン ブリ。 27．前記マイクロ灌流チャンバの容積は、約１０マイクロリットルから約１２マ イクロリットルである請求の範囲第２４項に記載のマイクロ灌流チャンバアセン ブリ。 28．灌流チャンバに収容された膜のイオン移動チャネル上の化合物のテストサン プルの作用を確認する方法であって、内部に電極を有するパッチ・ピペットが前 記膜の表面でギガオームシールに係合したチップを有し、前記チャンバ内には前 記チャンバに収容された溶液と接触するようになった基準電極が設けられ、 移動特性がベースライン基準として確認されるべきイオンを含む支持液体を 前記チャンバに連続的又は定期的に導入し、 同じ支持液体に溶解された前記テストサンプルの１つを、テストサンプル溶 液を保持した複数の容器を有する自動サンプラーを用いて、前記チャンバに定期 的に装入し、 前記テストサンプルを前記チャンバに導入する前後の両方で、前記ピペット ・電極と前記基準電極とに接続された電気測定手段回路を流れる電流を測定し、 かかる手順を繰り返す、 灌流チャンバに収容された膜のイオン移動チャネル上の化合物のテストサン プルの作用を確認する方法。 29．前記支持液体を前記灌流チャンバに連続的に導入し、過剰な支持液体を吸引 し、かつ、テストサンプルを前記支持液体の流れに定期的に導入して前記支持液 体と共に前記灌流チャンバに流入させるように前記自動サンプラーをプログラミ ングする請求の範囲第２８項に記載の方法。 30．前記マイクロ灌流チャンバは、約５マイクロリットルから約５０マイクロリ ットルの容積を有するマイクロ灌流チャンバである請求の範囲第２９項に記載の 方法。 31．前記マイクロ灌流チャンバ、約１０マイクロリットルから約１５マイクロリ ットルの容積を有するマイクロ灌流チャンバである請求の範囲第２９項に記載の 方法。 32．前記マイクロ灌流チャンバは、約１０マイクロリットルから約１２マイクロ リットルの容積を有するマイクロ灌流チャンバである請求の範囲第２９項に記載 の方法。 33．前記支持液体を前記灌流チャンバに定期的に導入し、過剰な支持液体を吸引 し、かつ、テストサンプルを前記支持液体の流れに定期的に導入して前記支持液 体とと共に前記灌流チャンバに流入させるように前記自動サンプラーをプログラ ミングする請求の範囲第２８項に記載の方法。 34．前記自動サンプラーの容器の幾つかは前記支持液体を収容し、かつ前記支持 液体および前記テストサンプルを順次前記灌流チャンバに導入するように前記自 動サンプラーをプログラミングする請求の範囲第３３項に記載の方法。 35．テストサンプルと支持液体の両方をごく少量ずつ用い、前記灌流チャンバが 約５から５０マイクロリットルの容積を有するマイクロ灌流チャンバであり、前 記自動サンプラーの容器の幾つかは前記支持液体を収容し、前記自動ンプラーは 初めに前記容器の１つから１容量の支持溶液を吸引し、この支持溶液を前記マイ クロ灌流チャンバに入れ、前記自動サンプラーは前記容器の１つからテストサン プルを順次吸引し、このテストサンプルをマイクロ灌流チャンバに入れて前記チ ャンバ内の前記支持液体と置換し、前記支持液体が前記マイクロ灌流チャンバ内 にあるときと、前記テストサンプルが前記マイクロ灌流チャンバ内にあるときの 両方で電気測定を行う請求の範囲第２８項に記載の方法。 36 前記マイクロ灌流チャンバの容積は、約１０マイクロリットルから約１５マ イクロリットルである請求の範囲第３５項に記載の方法。 37．前記マイクロ灌流チャンバの容積は、約１０マイクロリットルから約１２マ イクロリットルである請求の範囲第３５項に記載の方法。 38．前記電極に外部電流を印加して基準電流を所望の値にもたらす請求の範囲第 ３２項に記載の方法。 39．前記電極に外部電流を印加して基準電流を所望の値にもたらす請求の範囲第 ３７項に記載の方法。