JPH10509864A

JPH10509864A - ｔａｇＡ遺伝子、ならびに消化性潰瘍および胃ガンの形成素因の検出方法

Info

Publication number: JPH10509864A
Application number: JP8512113A
Authority: JP
Inventors: ティモシーエル．カバー，; マーティンジェイ．ブラザー，; ハリークリーンソウス，; ムラリケイ．アール．ツムル，
Original assignee: バンダービルトユニバーシティ; オラバックス，インコーポレイテッド
Priority date: 1994-09-30
Filing date: 1995-09-29
Publication date: 1998-09-29
Also published as: CN1166858A; US5733740A; US5876943A; EP0783579A2; MX9702335A; ATE276365T1; CA2201353A1; NO971473L; WO1996010639A2; NO971473D0; FI971326A7; DE69533514D1; AU703075B2; FI971326A0; DE69533514T2; ES2231792T3; HUT76730A; CZ96697A3; WO1996010639A3; US6153390A

Abstract

(57)【要約】本発明は、約120〜128キロダルトンのHelicobacter pyloriの抗原またはそれらの抗原性フラグメントをコードする単離された核酸を提供し、ここでこの抗原は消化性潰瘍形成に関連している。本発明はまた、被験体において120〜128キロダルトンの抗原を有するHelicobacter pylori株の存在を検出する方法を提供し、この方法は、その被験体由来の抗体含有試料を検出可能な量の本発明のtagA抗原または抗原性ポリペプチドと接触させる工程、およびその抗原またはフラグメントと抗体との結合を検出する工程を包含する。TagA抗原を発現する株の検出は、消化性潰瘍形成および胃ガンの素因の指標である。機能的TagA抗原を発現しないH．pylori変異株もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 tagA遺伝子、ならびに消化性潰瘍および胃ガンの形成素因の検出方法発明の背景 Helicobacter pyloriは、それが引き起こす慢性胃炎が消化性潰瘍疾患を発生させる危険因子であるということで、現在、ヒトの重要な病原体として認識されている。Helicobacter pyloriによる持続的な感染が、胃腺ガン（１、２）、特に遠位の胃の胃ガン（３〜５）を発生させる危険因子であるという増加する証拠もまた存在する。その証拠は、ネスティッドケースコントロール（nested case- control）研究（４、５、10）を含む疫学的調査に主に由来し（６〜９）、そして分子的研究および薬理学的研究が、その生物学的根拠（plausibility）を支持する（11）。しかし、本質的にすべての感染した人々が胃炎を発生するにもかかわらず、H．pylori感染の臨床的結果はほんのわずかの人々にしか認められない。また、H．pylori感染は、胃ガン患者に高度に広がっているが、H．pylori感染者のほとんどには、これらの新生物は全く発生しない（12）。従って、H．pylor i感染者におけるより正確に危険を決定する他の因子を同定することが重要である。遺伝子レベルでは、H．pylori株は高度の多様性（13〜15）を示すが、ほとんどの表現型的性質はよく保存されている。さらに、個人は、１種より多い株に感染し得る（4,15）。従って、胃ガン発生の危険に影響を及ぼし得るH.pylori株の特性を分離することが重要である。表現型の均一性の２つの例外が、現在、認識されている。第一には、H．pylor i株の約50〜60％がインビトロで液胞化細胞毒素を産生し（20,39）、そして毒素の産生が消化性潰瘍に関連すること（40）である。第二には、還元ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［SDS-PAGE］で約120〜128キロダルトン(kDa)で移動する抗原性タンパク質が産生されるかどうかに不均一性があることである(20)。このタンパク質（TagAまたはCagAと交換可能に呼ばれる）のさらに最近の測定では、140 kDa程度の分子量を生じている。毒素の活性は87K Daタンパク質によって媒介される(23,41)が、毒素の産生自体は抗原性の120〜12 8kDaタンパク質の存在に関連する（20）。先行する研究によって、約60〜80％の H．pylori単離株が120〜128kDaタンパク質を発現することが見いだされている(2 0,42)。特に、120〜128kDaタンパク質に対する抗体の、血清または粘膜分泌物のいずれかにおける存在が、消化性潰瘍形成の存在に関連する（18,20）。現在に至るまで、毒素産生、潰瘍または胃ガンと、120〜128kDa抗原との関連に関してはわずかしか知られていなかった。これは、今まで、120〜128kDa抗原の初期の視覚化(visualization)の後、これをさらに特徴づけることができなかったためである。先行する研究では、120〜128kDa抗原はウェスタンブロット法で視覚化されたが、実際には他の特徴付けは行われなかった(20)。この抗原がウェスタンブロット法で視覚化されることが容易であるのと対照的に、この120〜128kDaバンドは銀染色のような他の方法では容易には視覚化されなかった（Coverら、1990（20 ）の図２）。この現象は、この抗原が他のH．pyloriタンパク質と比べて微量しか存在しないことで説明される。最近、Gersteneckerら(43)は、陽性のヒトコントロール血清と反応するおよそ120kDaのH．pylori由来のタンパク質を単離したことを報告した。しかし、実際にはこの抗原の特徴付け（N-末端配列決定など）はまったく行われていない。精製が困難であるにも関わらず、本発明はこの遺伝子のクローニングおよび配列、ならびに120〜128kDaタンパク質をコードする推定アミノ酸配列を提供する。このデータは、120〜128kDa抗原の精製を必要としない別の方法を用いて得られた。本発明はまた、診断、治療、および予防のための組成物、および方法も提供する。イムブロット研究は、tagA⁺株に感染した人が、そこからtagA^-株が単離された人より、より高い程度の胃炎および上皮細胞損傷を有することを示唆する（18）。tagA⁺ H.pylori株に感染した人は、未感染の人およびtagA^-株に感染した患者に比べて、胃バイオプシーにおけるIL-1α、IL-1β、およびIL-8の増強された発現を有する（19）。炎症および上皮損傷の強さはともに、胃ガンの病因に関与し得る（１）。従って、これに関してtagAを発現する H.pylori株の重要性を調査する必要がある。本発明は、tagAの組換えフラグメントに基づいた新規の血清学的アッセイ、および胃ガンの形成素因を決定する方法を提供することにより、これらの必要性を満たす。発明の要旨本発明は、Helicobacter pyloriの約120〜128キロダルトンの抗原をコードする単離された核酸、またはその抗原性フラグメントを提供し、ここでこの抗原は消化性潰瘍および胃ガンに関連する。本発明はまた、120〜128キロダルトン抗原を有するHelicobacter pylori株の、被験体における存在を検出する方法を提供し、この方法は、被験体由来の抗体含有試料を、検出可能な量の本発明のTagA抗原またはそのフラグメントと接触させる工程、およびこのフラグメントと抗体との反応を検出する工程を包含する。図面の簡単な説明図１は、プラスミドpMC1、pMC2、およびpMC3の物理的地図を示す。pMC3の下の大きな矢印は、tagA遺伝子の位置、ならびに欠失変異およびイムノブロット法によって決定した転写の方向を表す。小さい矢印は、エキソヌクレアーゼIII由来フラグメントから配列決定したDNAの鎖および範囲を表す。制限エンドヌクレアーゼ切断部位：B、BglII；Ba、BamHI；E、EcoRI；H，HindIII；N、NdeI；S、Sac I。図２は、H．pylori変異株の構築に使用したpMC3:kmの制限地図を示す。pILL60 0由来のkmカセットを、pMC3のNdeI部位に連結して、pMC3:kmを作製した。矢印は短縮型2577 bp tagAオープンリーディングフレームを含むオープンリーディングフレームを表す。制限部位はE、EcoRI；B、BglII；H，HindIII；Ba、BamHI；N、 NdeI；S、SacI；Sm、SmaIである。pMC4は、pMC3の2.9kb EcoRI〜SacIフラグメントを表す。図３は、プラスミドpMC3、pYB2、およびpUT2の物理的地図を示す。pUT2の下の大きな矢印は、tagA遺伝子の位置、ならびに欠失変異およびイムノブロット法によって決定した転写の方向を表す。制限エンドヌクレアーゼ切断部位：B、BglII ；Ba、BamHI；E、EcoRI；EV、EcoRV；H，HindIII；N、NdeI；S、SacI；X；XbaI。図４は、オーバーラップする遺伝子融合物を作製するのに用いたtagA由来のDN Aフラグメントの物理的地図を示す。矢印は、転写の方向を表す。各産物の大きさを示す。白い箱状の範囲は、反復ヌクレオチド領域を有する遺伝子の範囲およびこのタンパク質の免疫原性エピトープを発現すると決定された遺伝子の範囲を表す。発明の詳細な説明核酸本発明は、消化性潰瘍に関連するH．pyloriの約120〜128kDa抗原またはフラグメント（TagA）をコードする、単離された核酸を提供する。「単離」とは、天然に存在する生物中において見いだされる他の核酸、タンパク質、およびその他の細胞成分から、臨床診断または他の科学的プロトコルに有用であるために十分に分離されること意味する。120〜128kDa抗原をコードする核酸は、天然tagA遺伝子であり得、この遺伝子は120〜128kDa抗原を発現するH．pyloriの株に特異的である。「特異的」とは、バックグラウンドより高い有意な程度で、抗原を発現しないH.pylori株由来の核酸とハイブリダイズしない、単離された配列を意味する。このような単離された核酸の例は、4821塩基対挿入物に含まれるヌクレオチド 1072から4614を含む3543塩基対のオープンリーディングフレームである（配列番号３）。完全長tagA遺伝子を有するプラスミドを含む細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（1230 Parklawn Drive、Rockville MD 20852）にATC C受託番号69273として寄託されている。この単離されたH.pylori-特異的核酸は、以下にさらに記載されるように、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼ連鎖反応、およびハイブリダイゼーションのような方法で120〜128 kDa抗原を発現するH.pyloriを検出するために用いられ得る。この核酸またはそのフラグメントは、適切な発現ベクターおよび宿主中に存在し得、さらに本明細書中で記載されるように、完全長TagAタンパク質を産生するために利用され得る。 120〜128 kDa抗原の抗原性フラグメントをコードする核酸の例は、3648塩基対挿入物に含まれるヌクレオチド1072から3648を含む2577塩基対の短縮型オープンリーディングフレームである（配列番号１）。この特異的な核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、およびハイブリダイゼーションのような方法で 120〜128 kDa抗原を有するH.pyloriを検出するために用いられ得る。あるいは、 3648塩基対配列は、適切な宿主中のベクターの中に存在し得、TagAの抗原性フラグメントを産生するために用いられ得る。 120〜128kDa抗原の抗原性フラグメントをコードする核酸の別の例は、配列番号１および３のヌクレオチド1921から3648を含むtagA遺伝子の組換えフラグメント(orv220)である（実施例４）。この特定の核酸は、120〜128kDa抗原を発現するH．pylori株を、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、およびハイブリダイゼーションなどの方法で検出するために使用され得る。あるいは、この核酸は、適切な宿主におけるベクター中に存在し得、そしてTagAの抗原性フラグメントを生産するために使用され得る。 TagAの別の抗原性フラグメントをコードする核酸は、例示の核酸を得るための本明細書中に記載される手順に従い、ルーチンの方法およびルーチンの量の実験を用いて、当業者によって得られ得る。既知の単離された核酸の核酸フラグメントを得るための、制限消化のような他の方法を、より大きなコーディング配列に適用して、抗原の別のフラグメントをコードする核酸を得ることができる。このようにして得られた核酸は、本明細書中の実施例に従って、抗原性、特異性などについてルーチン的にスクリーニングされ得る。 TagAまたはその抗原性フラグメントをコードする例示の核酸のヌクレオチド配列における変更もまた、その核酸によってコードされるポリペプチドの抗原性が維持される限りは、意図される。同様に、プライマーまたはプローブとして使用される核酸は、選択的または特異的ハイブリダイゼーションのために十分な相補性塩基が存在する限りは、置換され得る(44)。 TagA抗原をコードする核酸の別の例は、遺伝子コードの縮重に基づいて得られる、この抗原の別のコーディング配列である。TagA抗原の１つのアミノ酸配列（配列番号３）が提供されれば、当業者はその抗原または抗原のフラグメントをコードするヌクレオチド配列を決定し得、そして既存の手法を用いてその核酸を生産し得る。配列表において配列番号３として定義されるヌクレオチド配列中に含まれるヌクレオチド1072から4614を含む核酸に、ポリメラーゼ連鎖反応条件下で選択的にハイブリダイズする単離された核酸もまた、意図される。本明細書で用いられる用語「選択的に」は、PCR条件下で、バックグラウンドまたはランダムハイブリダイゼーションから識別できるレベルで、リファレンスの核酸とハイブリダイズするが、バックグラウンドまたはランダムハイブリダイゼーションから明確に識別できるレベルで選択された他の核酸ともハイブリダイズし得る核酸についていう。選択的にハイブリダイズする核酸は、上記核酸と相補的であり得る。ハイブリダイズする配列の同一性および長さは、その特定の配列の意図される用途に基づいて選択され得る。プライマーとして使用される場合、本発明は、所望の領域を増幅すべく、別々の領域に選択的にハイブリダイズする、少なくとも２つの核酸を含む組成物を提供する。PCR条件の例は、本明細書中で提供され、当該分野で周知であり、そしてPCR試薬および装置の供給者によって教示される。配列表において配列番号３として定義されるヌクレオチド配列中に含まれるヌクレオチド1072から4614を含む核酸に、ストリンジェントさの条件(stringency condition）（６×SSC、0.5%ドデシル硫酸ナトリウム、５×デンハルト溶液を含む緩衝液中で68℃、16時間、および0.5×SSC中、60℃での洗浄）下で特異的にハイブリダイズする、単離された核酸もまた意図される（実施例１、サザンハイブリダイゼーション）。他のハイブリダイゼーション条件の例もまた提供される。特異的なハイブリダイゼーション条件は、リファレンスの核酸以外の核酸とハイブリダイズする核酸を除外する。従って、ハイブリダイズする核酸は、上記核酸のセグメントまたはそのすべてに相補的であり得、あるいはこれが他の天然由来の核酸に結合することを妨げるに十分な相補性を、ハイブリダイズされる核酸に対して有し得る。核酸がハイブリダイズする配列は、ヌクレオチド配列および個別の配列の利用性に基づいて選択され得る。例えば、特異的にハイブリダイズする核酸は、それがハイブリダイズする核酸を有する生物の存在の検出のためのプローブとして使用され得る。あるいは、ハイブリダイズする核酸は、本明細書中で提供されるTagAのフラグメントをコードし得る。ストリンジェントな条件下でH．pylori TagAをコードする核酸とハイブリダイズし、そしてそれがハイブリダイズする配列番号３の核酸のセグメントおよび鎖に対する少なくとも70％の相補性を有する、単離された核酸もまた提供される。本発明のハイブリダイズする核酸は、それがハイブリダイズする例示の配列のセグメントおよび鎖に対して、少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、および99%の相補性を有し得る。この核酸は、少なくとも18から4000ヌクレオチド長の範囲であり得る。従って、この核酸は、別のtagA⁺株由来のTagAをコードし得、あるいはtagA⁺ H pyloriの存在を検出するためのプローブまたはプライマーとして使用され得る。本発明は、H．pyloriのこれらの核酸の例を提供し、それゆえ、特定の条件下で、特異的にハイブリダイズする核酸を非特異的にハイブリダイズする核酸から識別するために必要とされる相補性の程度が、各核酸について明確に決定され得る。核酸は、意図される用途（例えば、各々、コーディング配列またはプライマー／プローブとして）に応じて、二本鎖または一本鎖であり得る。特異的にハイブリダイズする核酸は、無関係のタンパク質をコードする核酸にはハイブリダイズしないこともまた、明白であるはずである。当業者は、全長遺伝子ならびにより短いヌクレオチドフラグメントを合成するためのルーチンの方法を用いて、本発明の核酸を容易に得ることができる。例えば、配列表において提供されるような核酸を得るための手法が、本出願中で具体的に提供される。さらに、重大な改変なしに使用され得るさらなる方法が、当該分野で提供される。Ferrettiら(75)およびWosnickら(76)は、既知配列の遺伝子の合成のためのルーチンの方法を示す。より詳細には、Ferrettiらは、1057塩基対の合成ウシロドプシン遺伝子の合成オリゴヌクレオチドからの合成を教示する。この合成遺伝子は、既知配列に忠実であり（第603頁、第１文）、この遺伝子合成法の信頼性を証明した。さらに、Wosnickらは、トウモロコシグルタチオン- トランスフェラーゼ(GST)遺伝子の、効率的な１段階アニーリング／連結プロトコルを用いての合成を教示する。この手法もまた100％の忠実度で完全な合成遺伝子を生産し、これはこのプロトコールのルーチン的性質を証明する。抗原本発明の核酸でコードされ、精製された抗原性ポリペプチドもまた意図される。本明細書中で使用される「精製（された）」とは、抗原を混入物または細胞成分から区別するために、抗原が、通常その抗原とともに存在する混入物または細胞成分を十分に含んでいないことを意味する。従って、精製された抗原性ポリペプチドは十分に混入物から分離されるので、これは、臨床的診断または他の実験室プロトコルに使用され得る。本発明の、精製された約120〜128kDaの完全長の抗原、および抗原性フラグメントもまた、本明細書中で「抗原」、は「TagA抗原」または「cagA抗原」と称する。特に、約130kDaの完全長TagA抗原性ポリペプチド（配列番号４）は、4821塩基対のクローン化された挿入物内の3543塩基対のオープンリーディングフレームでコードされ、配列表の配列番号３として定義されるヌクレオチド配列に含まれるヌクレオチド1072から4614によりコードされるアミノ酸から本質的に構成される。 TagAの約96kDaの抗原性フラグメントは、3648塩基対のクローン化された挿入物内の2577塩基対のオープンリーディングフレームでコードされ、配列表の配列番号１として定義されるヌクレオチド配列に含まれるヌクレオチド1072から3648 によりコードされるアミノ酸から本質的に構成される。 TagAの別の抗原性フラグメントは、オープンリーディングフレーム（orv220）でコードされ、配列表の配列番号１として定義されるヌクレオチド配列に含まれるヌクレオチド1921から3648によりコードされるアミノ酸から本質的に構成される。抗原の抗原性フラグメントは、血清抗体と反応するか、または動物中の免疫応答を誘発し得るエピトープを含むタンパク質の領域を決定するために、エピトープマッピングの日常的な技術をTagAタンパク質に適用することによって選択され得る。ひとたびエピトープが選択されると、エピトープを含有する抗原性ポリペプチドは、直接合成され得るか、または標準的な方法により、発現系においてポリペプチドをコードする核酸のクローニングにより組換え的に産生され得る。あるいは、抗原の抗原性フラグメントは、抗原全体またはより大きなフラグメントから、化学的または機械的切断によって単離され得る。このようにして得られた精製フラグメントは、本明細書中で教示される方法によって、その抗原性および特異性を決定するためにテストされ得る。抗原性フラグメントは、抗体と反応性する（結合する）抗原アミノ酸配列由来の、少なくとも約５個の連続したアミノ酸のアミノ酸配列として定義される。ひとたび抗原性ポリペプチドのアミノ酸配列が提供されると、抗原性ポリペプチドは、天然抗原のアミノ酸配列に対応するが、誘導される配列中の特定のアミノ酸残基の置換、挿入または欠失の形式の改変を伴うように設計され得る。改変は、溶解性のような特定の付加的性質を提供するように設計された配列に抗原結合する工程を包含し得る。改変は、特定の付加的性質を提供する他のアミノ酸を含み得る。付加的性質としては、例えば、ジスルフィド結合し得るアミノ酸を除去／付加する、生体での寿命を増加させる、酵素的活性を変化させる、または胃の酸性度との交互作用を変化させる性質がある。いずれの場合も、ペプチドは生物活性的性質、例えば、抗原性、免疫原性、特異性等を有さなければならない。このように設計されたポリペプチドは、本明細書中で使用され、記載される方法により、抗原性、免疫原性、および特異性についてテストされ得る。次いで、これらのポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を用いて合成され得る。従って、TagA抗原の例示的な配列に由来する非常に多数のポリペプチドの合成または精製が可能である。免疫原性の決定精製抗原性ポリペプチドをテストして、それらの免疫原性および特異性を決定し得る。簡単に述べると、種々の濃度の推定の免疫原性的に特異的なフラグメントを調製して、動物に投与し、そして各濃度に対する動物の免疫学的な応答(例えば、抗体の産生または細胞媒介免疫)を測定する。投与する抗原の量は、被験体(例えば、ヒトまたはモルモット)、被験体の状態、被験体のサイズなどに依存する。その後、抗原をこのように接種された動物を、バクテリアに曝して特定の抗原性フラグメントのワクチン効果を測定し得る。フラグメントの特異性を、接種された動物由来の血清、他の体液またはリンパ球を他の極めて関連するバクテリアとの交差反応性についてテストすることによって確かめ得る。ベクターおよび宿主本発明の核酸を含むベクターもまた提供される。本発明のベクターは、宿主において、核酸によってコードされるポリペプチドを発現させることに適切であり得る。ベクターおよび宿主の特定の例を下記の実施例において提供する。抗原の発現に有用な多数のE．coli発現ベクターが、当業者には公知である。使用に適した他の微生物宿主には、Bacillus subtilusのような桿菌、およびSal monella、Serratiaのような他の腸内細菌科、および種々のPseudomonas種が包含される。これらの原核生物宿主中においてもまた、発現ベクターを作成し得る。これらは、代表的には、宿主細胞と適合し得る発現制御配列（例えば複製起点）を含む。さらに、ラクトースプロモーター系、トリプトファン(Trp)プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、またはλファージ由来のプロモーター系のような、数多くの多様な周知のプロモーターのいずれかである。プロモーターは、代表的には、必要に応じてオペレーター配列により発現を制御し、そして例えば、転写ならびに翻訳を開始および終了するためのリボソーム結合部位配列を有する。必要ならば、Metコドンを5'に、そして抗原にインフレームで挿入することにより、アミノ末端メチオニンが提供され得る。また、抗原のカルボキシ末端の伸長部は、標準的なオリゴヌクレオチド変異誘発手順によって除去され得る。さらに、酵母発現が使用され得る。酵母発現系にはいくつかの利点がある。第１に、酵母分泌系で産生されたタンパク質が、正しいジスルフィド対形成を示すという証拠が存在する。第２に、翻訳後のグリコシル化が、酵母分泌系によって効率的に行われる。Saccharomyces cerevisiaeプレプロα因子リーダー領域（MF α-1遺伝子でコードされる）が、酵母からタンパク質を分泌させるために日常的に使用される（45）。プレプロα因子のリーダー領域は、シグナルペプチドおよびKEX2遺伝子でコードされる酵母プロテアーゼのための認識領域を含むプロセグメント(pro-segment)を含有する：この酵素は、Lys-Argジペプチド切断シグナル配列のカルボキシル側で前駆体タンパク質を切断する。抗原をコードする配列は、プレプロα因子のリーダー領域にインフレームで融合され得る。この構築物は、次いで、アルコールデヒドロゲナーゼＩプロモーターまたは解糖系プロモーターのような、強力な転写プロモーターの制御下に置かれる。抗原をコードする配列に翻訳終止コドンが続き、これに転写終止シグナルが続く。あるいは、抗原をコードする配列は、アフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質の精製を容易するために使用される第２のタンパク質（例えば、Sj26またはβ−ガラクトシダーゼ）をコードする配列に融合され得る。融合タンパク質成分を分離するためのプロテアーゼ切断部位の挿入は、酵母での発現に使用される構築物に適用可能である。哺乳動物細胞は、折り畳みおよびシステイン対形成のような重要な翻訳後の修飾、複雑な炭水化物構造の付加、および活性タンパク質の分泌に好都合な環境において、タンパク質の発現を可能にする。哺乳動物細胞中で抗原を発現するために有用なベクターは、抗原をコードする配列を強力なウイルスプロモーターとポリアデニル化シグナルとの間に挿入することによって特徴付けられる。ベクターは、選択マーカーとして使用するために、ゲンタマイシンまたはメトトレキセートのいずれかの耐性を与える遺伝子を含み得る。抗原および免疫反応性フラグメントをコードする配列は、メトトレキセート耐性をコードするベクターを用いてチャイニーズハムスター卵巣細胞株に導入され得る。形質転換された細胞中のベクターDNAの存在はサザン分析により確認され得、そして抗原をコードする配列に対応するRNAの産生はノーザン分析により確認され得る。完全なヒトタンパク質を分泌し得る多数の他の適切な宿主細胞株が当該分野で開発されており、そしてそれには、上記のCHO細胞株、HeLa細胞、ミエローマ細胞株、Jurkat細胞などが包含される。これらの細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、エンハンサー、および必須な情報処理部位（例えば、リボソーム結合部位、RN Aスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列）のような発現制御配列を包含し得る。好適な発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、SV40、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなどに由来するプロモーターである。目的のDNAセグメントを含むベクターは周知の方法によって宿主細胞中に転移され得、この方法は細胞性宿主のタイプに依存して変更される。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは原核生物細胞に一般的に使用され、他方、リン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションは他の細胞性宿主に使用され得る。ヒトγーインターフェロン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、凝固因子 VIII、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、プロテアーゼネキシン(Nexinl)、および好酸球主要塩基性タンパク質の発現のために開発されたベクターと同様の、哺乳動物細胞での抗原の発現のための他のベクターが用いられ得る。さらに、ベクターは、哺乳動物細胞（例えば、COS7）中に挿入されたDNAの発現に使用可能なCMVプロモーター配列およびポリアデニル化シグナルを包含し得る。配列が発現制御配列に作動可能に連結された後（すなわち、発現制御配列が機能することを確実にする位置に置かれた後）、DNA配列は宿主中で発現され得る。これらの発現ベクターは、代表的には、宿主生物中でエピソームまたは宿主染色体DNAの組み込み部分のいずれかとして複製可能である。通常、発現ベクターは、選択マーカー（例えば、テトラサイクリン耐性またはハイグロマイシン耐性）を含み得、所望のDNA配列によって形質転換されたこれらの細胞の検出および／または選択を可能にする（例えば、米国特許第第4,704,362号を参照のこと）。改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、コードされたポリペプチド産物が産生されるように、コード配列の転写（発現配列）および翻訳を容易にする配列を含み得る。このようなポリヌクレオチドの構築は当該分野で周知である。例えば、このようなポリヌクレオチドは、プロモーター、転写終止部位（原核生物発現宿主におけるポリアデニル化部位）、リボソーム結合部位、および必要に応じて、真核生物発現宿主において使用されるエンハンサー、および必要に応じて、ベクターの複製に必要な配列を包含し得る。精製抗体 TagA抗原または抗原性フラグメントと特異的に結合する精製モノクローナル抗体もまた提供する。抗体は、抗原の特有のエピトープと特異的に結合し得、これはまた、他の生物のエピトープと結合し得る。用語「結合する」は、周知の抗原/ 抗体結合、および抗原との他の非ランダム結合を意味する。「特異的に結合する」は、本明細書で使用される場合、抗体、またはある特定の抗原(この場合、TagA 抗原)以外の任意の抗原と実質的に交差反応しないリガンドを記述する。抗体は実施例に記載のように作製され得る(HarlowおよびLane(46)もまた参照)。簡単に述べると、精製抗原は、所定量でそして免疫応答を誘発するに十分な間隔で動物に注射され得る。ポリクローナル抗体は直接精製され得る。あるいは、その動物の脾臓細胞を不死化細胞株と融合させ、そしてモノクローナル抗体分泌についてスクリーニングし得る。従って、抗原と特異的に結合する非ヒトポリクローナル抗体は、本発明の範囲にある。抗原と特異的に結合するリガンドもまた意図される。リガンドは、抗体のフラグメント、またはTagA抗原のエピトープと結合するよう設計されたより小さな分子であり得る。抗体またはリガンドは、基質に結合し得るか、または検出可能な部分で標識され得るか、あるいは結合しかつ標識され得る。本発明の組成物を用いて意図される検出可能な部分は、下記の診断的方法の記載において挙げたものであり、蛍光マーカー、酵素マーカーおよび放射性マーカーを含む。基質に結合した抗原基質に結合した精製TagA抗原もまた提供される。抗原はまた、精製抗体またはリガンドに結合し得る。抗体は、標準的な方法によって、そして本明細書に記載のように得られるモノクローナル抗体であり得る。血清学的検出(診断)方法抗原による抗体の検出本発明は、被験体において、120〜128kDa抗原を有するH．pylori株の存在を検出する方法であって、この被験体の抗体含有サンプルを、検出可能な量の本発明のTagAまたはTagA抗原性フラグメントと接触させる工程、およびこのTagAまたはフラグメントとこの被験体によって産生される抗体との結合反応を検出する工程 (この結合が毒性H.pylori株の存在またはこの毒性H.pylori株による以前の感染を示す)、を包含する方法を提供する。この検出および疾病素質(predisposition )方法において使用され得る多くの日常的な免疫学的アッセイが存在する。下記に実施例を提供する。抗体/リガンドによる抗原の検出抗原を有するH.pyloriを検出する方法の１つの例は、被験体由来の液体または組織サンプルを、抗原と特異的に反応し得る所定量の精製抗体と接触させること、および抗体と抗原との結合を検出することによって実行される。抗原は、抗原を含む無傷な細胞に存在するか、あるいは抗原のフラグメントであることを意図される。本明細書中で意図されるように、抗体には、抗原に結合する任意のリガンド、例えば、無傷な抗体、抗体のフラグメント、または抗原との反応性を有する他の試薬が包含される。この方法の液体サンプルは、抗原または抗原を含有する細胞を含む任意の体液、例えば、血液、血漿、血清、唾液および尿を包含する。体液の他の可能な例には、痰、粘液、胃液などが含まれる。 ELISA 免疫アッセイ(例えば、免疫蛍光アッセイ(IFA)、酵素結合免疫吸着アッセイ(E LISA)およびイムノブロット)は、抗原の検出を達成するために容易に適合され得る。抗原の検出に効果的なELISA法は、例えば以下の通りであり得る：(１)基質に抗体を結合させる；(２)結合した抗体と、抗原を含有する液体または組織サンプルとを接触させる；(３)これを、検出可能な部分(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素またはアルカリホスファターゼ酵素)に結合した二次抗体と接触させる；(４)これを、酵素の基質と接触させる；(５)これを、発色試薬と接触させる；(６)色の変化を検出する。この方法は、抗体および抗原を検出するために容易に改変され得る。競合阻害アッセイ TagAを発現するH.pyloriまたは以前のH.pylori感染の検出に有用であり得る別の免疫学的技術は、TagA抗原と特異的に反応し得る抗体の検出のためにモノクローナル抗体(MAb)を利用する。簡単に述べると、被験体由来の血清または他の体液を、基質に結合した抗原(例えば、ELISA 96ウェルプレート)と反応させる。過剰の血清を完全に洗い流す。次いで、標識した(酵素結合、蛍光、放射活性など) モノクローナル抗体を、前に反応させた抗原−血清抗体複合体と反応させる。モノクローナル抗体結合の阻害量を、コントロール(患者の血清抗体なし)と比較して測定する。モノクローナル抗体阻害の程度は、特定の変種または菌株の非常に特異的なテストである。なぜなら、これはモノクローナル抗体の結合特異性に基づくからである。MAbはまた、IFAによる細胞における直接的な検出に使用され得る。微小凝集テスト微小凝集テストもまた、被験体においてTagAを有するH.pylori株の存在を検出するために使用され得る。簡単に述べると、ラテックスビーズ(または赤血球)を抗原でコートし、そして被験体由来のサンプルと混合させると、抗原と特異的に反応し得る組織または体液中の抗体が抗原と反応し、凝集が生じる。凝集した抗原−抗体複合体は、肉眼または分光光度計によって視認され得る沈殿物を形成する。上記テストの改変型において、抗原と特異的に反応し得る抗体は、ビーズ、および組織または体液中の抗原と結合し、それによって検出され得る。サンドイッチアッセイ／フローサイトメトリー／免疫沈降法さらに、典型的なサンドイッチアッセイにおけるのと同様に、抗体を基質に結合し得、そして抗原と反応させ得る。その後、第２の標識抗体を第１の抗体により認識されなかったエピトープに結合させ、そしてこの第２の抗体を検出する。本発明は、毒性のH．pyloriまたは以前のH．pylori感染を検出するためのTagA抗原を提供するので、フローサイトメトリーおよび免疫沈降法のような、他の血清学的方法もまた、検出方法として使用し得る。本明細書中で教示される診断方法において、抗原は基質に結合し得、そして血清、尿、唾液、または胃液のような液体サンプルにより抗原を接触させる。このサンプルは、患者から直接に採取され得るか、あるいは部分的に精製された形態であり得る。このようにして、抗原に特異的な抗体（一次抗体）は、結合した抗原と特異的に反応する。その後、一次抗体の検出を増強するために、検出可能な部分と結合した、あるいは検出可能な部分により標識された二次抗体を添加し得る。一般に、抗原の異なるエピトープに特異的に反応性であるか、あるいはリガンドまたは反応した抗体と非特異的に反応性である二次抗体または他のリガンドが、一次抗体の複数の部位と反応するその能力のために選択され得る。従って、例えば、いくつかの分子の二次抗体は、各一次抗体と反応し得、この一次抗体をより検出可能にする。検出可能な部分検出可能な部分は、沈殿または変色の可視的検出、顕微鏡による可視的検出、または分光法、放射測定(radiometric mesurement)などによる自動化検出を可能にする。検出可能な部分の例には、フルオレセインおよびローダミン（蛍光顕微鏡用）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（光学顕微鏡または電子顕微鏡のいずれか、および生化学的検出）、ビオチン−ストレプトアビジン（光学顕微鏡または電子顕微鏡用）、アルカリホスファターゼ（変色による生化学的検出用）、および放射性同位体（放射線写真用）が包含される。使用される検出法および検出部分は、例えば、上記の列記あるいは他の適切な例から、このような選択に適用される標準的な基準によって選択され得る(46)。疾患または疾患に対する素因の検出消化性潰瘍形成本明細書中で提供される精製TagA抗原は消化性潰瘍形成に関連しているので、本発明はまた、被験体における消化性潰瘍形成の素因を決定する方法を提供する。この方法は、上記の、TagA抗原を発現するH．pyloriを検出するための方法、またはTagA抗原に対して特異的な抗体を検出するための方法、またはTagA抗原に対する特異的抗体を検出する方法によって達成され得る。TagA抗原またはTagA特異的抗体の存在は、被験体の消化性潰瘍形成に対する素因を示す。tagA⁺株の特異的核酸を検出するための下記の方法もまた、使用され得る。胃ガン本明細書中で提供される精製TagAタンパク質は胃ガンに関連しているので、本発明はまた、被験体における胃ガンの素因を検出する方法を提供する。この方法は、上記の、tagA⁺ H．pylori株を検出するための方法、またはTagA抗原に対して特異的な抗体を検出するための方法、またはTagA抗原に対する特異的抗体を検出するための方法によって達成され得る。TagA抗原またはTagA特異的抗体の存在は、被験体の胃ガンに対する素因を示す。実施例４は、裏付けとなるヒトのデータ、および本方法を実施するための特定のプロトコル例を提供する。tagA⁺株の特異的核酸を検出するための下記の方法もまた、使用され得る。治療方法本発明の組成物を用いて被験体中の消化性潰瘍を処置する方法が提供される。例えば、このような方法のひとつでは、H．pyloriの約120〜128kDaの抗原と特異的に反応するリガンド（例えば、抗体または抗体フラグメント）が、被験体中の抗原と結合し、かつ被験体の臨床的症状を改善するために充分な量で、被験体に投与される。このような改善は、リガンドが炎症および細胞損傷を誘導することにおける抗原の通常の機能を阻害する結果である。リガンドは、この抗原と特異的に反応する精製されたモノクローナル抗体、ヒト以外の動物由来の精製されたポリクローナル抗体、またはこの抗原との特異的反応性を有する他の試薬であり得る。さらに、細胞毒性部分は、標準的方法によってこのリガンド/抗体に結合され得る。細胞毒性部分の例には、リシンＡ鎖、ジフテリア毒素、および放射性同位体が包含される。被験体中の消化性潰瘍を処置する他の方法は、H．pyloriの120〜128kDa抗原に対するレセプターのためにリガンド／アンタゴニストを、レセプターと反応し、かつレセプターへの120〜128kDa抗原の結合を妨げるために充分な量で、被験体に投与することを包含する。従って、レセプターのアンタゴニストは、意図される。この結果は、被験体の臨床状態を改善する。あるいは、この処置方法は、Ta gAレセプターのアナログを、TagA抗原と競合的に結合し、その結果、TagA抗原がその野生型レセプターに結合することを阻害する量で被験体に投与することを包含し得る。このレセプターは、上皮細胞、炎症細胞、または内皮細胞のような胃十二指腸粘膜に存在する細胞上に局在化する。 TagAの発現は胃ガンと関連していると明らかにされているので、上記の処置法は、胃ガンの処置または予防に適用可能である。変異生物本発明はまた、tagA遺伝子産物が非機能性になったH．pylori変異株を提供する。この変異体は、tagAを発現し得ないか、または非機能性TagA抗原を発現し得るかのいずれかである。ひとつの例では、H．pylori変異株は、実施例２に記載されるように、TagA抗原のコード配列内で置換変異をなすことによって得られる。本発明はこの抗原をコードする核酸を提供するので、この抗原のコード配列を変異させる他の方法は、本明細書中で意図される他の変異株を得るために使用され得る。本発明のH．pylori変異株の例は、84-183:M22で示され、そしてアメリカンタイプカルチャーコレクション(1230 Parklawn Drive，Rockville，MD 2085 2)に、ATCC受託番号55359として寄託されている。さらなる同質遺伝子型の(isogenic)変異体は、例えば、その遺伝子を非機能性にするか、あるいはその生物が非感染性であるほど少量でしか産生されないようにするために、tagA遺伝子内に核酸を挿入するか、あるいはtagA遺伝子の一部を欠失させることによって調製され得る。さらに、この抗原をコードする核酸のためのヌクレオチド配列を提供することによって、本発明は、所望の効果を有する特定の点変異を作成することを可能とする。欠失、挿入、または置換変異は、転写を妨げるか、あるいは転写産物を非機能性にするために、調節領域またはコード領域のいずれか内の遺伝子配列中で作成され得る。欠失変異体または挿入変異体を構築するためのこのようなアプローチのひとつは、Donnenberg法(47)による。tagA内の欠失は、0.2kbのBamH1-NdeIフラグメントの欠失、およびtagAクローンの再連結によって作製される。この変異体は、自殺ベクターpILL570中にクローン化される。Bacillus subtilisのsacB遺伝子もまた、この自殺ベクター中にクローン化され、条件致死表現型を提供する。この構築物はエレクトロポレーションによってH．pylori中に形質転換され、そしてスペクチノマイシン耐性によって形質転換体を選択する。自殺ベクターを含む部分二倍体(merodiploid)株、およびtagA遺伝子の変異バージョンは、第２の組換えが行われ、その結果ベクターを失った生物について直接選択するためにショ糖に曝される。変異体を作成するためのこれらの方法および他の周知の方法は、他の所望の変異体を得るために本明細書中で提供される核酸に適用し得る。同質遺伝子型でない変異体もまた、本発明の範囲内である。例えば、本発明によるtagA^-変異体でもある生きている弱毒化H．pyloriが提供される。tagA^-recA^- 変異株は、例えば、本明細書中の教示の方法、およびrecAについての米国特許出願番号第08/215,928号中の教示の方法により、tagA遺伝子およびrecA遺伝子の両方の挿入変異によって構築される。tagA^-vacA^-変異株は、例えば、tagAについての本明細書中の教示の方法、およびvacA変異体の生成を記載する米国特許出願番号第08/215,928号中の教示の方法により、tagA遺伝子およびvacA遺伝子の両方の挿入変異によって構築される。recA^-tagA^-vacA^-変異株は、例えば、recAおよびv acAについての本明細書中の教示の方法、および米国特許出願番号第08/215,928 号中の教示の方法により、recA遺伝子、tagA遺伝子およびvacA遺伝子の挿入変異によって構築される。遺伝子変異の周知のいずれかの方法を、本発明において使用して、H．pylori変異株を生成し得る。これらの株は、免疫原性を提供するものとして試験され得る。ワクチン本発明の抗原、抗原フラグメントまたはH．pylori変異体は、免疫原性量の抗原またはH．pylori変異体、および薬学的に受容可能なキャリアを含有するワクチンの構築に使用され得る。このワクチンは、抗原全体、完全なH．pylori、E． coliまたは他の株上の抗原であり得る。このワクチンは、次いで、消化性潰瘍形成、またはH．pylori感染による他の合併症（萎縮性胃炎、および胃の悪性新生物を包含する）を防ぐ方法において使用され得る。この抗原の免疫原性量は、標準的手順を用いて決定され得る。簡単に述べると、種々の濃度の、推定の特定の免疫活性エピトープを、調製し、動物に投与し、そして各濃度に対する動物の免疫学的応答（例えば、抗体の産生）を測定する。本発明のワクチンにおける薬学的に受容可能なキャリアは、生理食塩水または他の適切なキャリアを包含し得る(48)。アジュバントもまた、このワクチンのキャリアの一部であり得、この場合、アジュバントは、使用する抗原に基づく標準的な基準、投与の形態、および被験体によって選択され得る(48)。投与方法は、経口または舌下の手段、または注射によるものであり得、使用される特定のワクチン、および投与される被験体に依存する。上記から、このワクチンは予防または治療様式として使用され得ることが、理解され得る。従って、本発明は、H．pylori感染およびその関連疾患を、ワクチンを被験体に投与することにより予防するかまたは治療する方法を提供する。核酸検出(診断)方法 TagA抗原およびTagA抗原を有するH.pyloriの存在はまた、この抗原に特異的な核酸の存在を検出することにより決定され得る。この抗原のこれらの配列の特異性は、問題の遺伝子に対する類似性についてカタログ化されたヌクレオチド配列を検索するGenetics Computer Group(Madison、WI)のコンピュータープログラム Word SearchまたはFASTAを用いて、GenBank(コンピューター化されたデータベース)中のカタログ化された既知の配列とコンピュータによる比較を行うことにより決定され得る。抗原についての特異的な核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応またはリガーゼ連鎖反応のような核酸増幅技術を利用して検出され得る。あるいは、核酸は、直接ハイブリダイゼーションを利用して、または制限フラグメント長多型を利用することにより検出される。例えば、本発明は、TagA抗原を有するH．pyloriの存在を検出する方法を提供し、この方法は、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を伴うヌクレオチド配列の存在を確認することを包含する。さらに、抗原について特異的な核酸とのみハイブリダイズするPCRプライマーが利用され得る。増幅の存在は、抗原の存在を示す。別の実施態様では、DNAサンプルの制限フラグメントは、例えば、サンガーのddNTp配列決定法または7-デアザ-2'-デオキシグアノシン5'-三リン酸およびTaqポリメラーゼを用いて直接配列決定され得、そしてH．pyloriを検出するために既知の特徴的な(unique)配列と比較され得る。さらなる実施態様では、本発明は、上記の方法による選択的増幅によりtagAを有するH．pyloriの存在を検出する方法を提供する。さらに別の実施態様では、H．pyloriを、この特徴的な配列をtagA特異的核酸プローブと直接ハイブリダイズすることにより検出し得る。さらに、ヌクレオチド配列は、上記の方法によりハイブリダイゼーションの前に増幅され得る。一旦特定の可変配列が消化性潰瘍に関係することが示されると、これらの配列を検出する方法は、当該分野では標準的になる。直接プローブ法を用いる点変異または可変配列の検出は、例えば、合成的にまたはニックトランスレーションにより調製され得るオリゴヌクレオチドプローブの使用を含む。これらのプローブは、例えば、放射標識、酵素標識、蛍光標識、ビオチン-アビジン標識などを用いて、次のサザンブロットハイブリダイゼーション手順の実施例での可視化のために適切に標識され得る。標識プローブは、例えば、ニトロセルロースシートに結合したサンプルDNAと、十分に相補的な配列のみがハイブリダイズするような条件下で反応する。標識DNAプローブに相補的なDNA配列を有する領域は、再アニーリング反応の結果として自分自身を標識するようになる。このような標識化を示すフィルター領域は、次いで、例えば、オートラジオグラフィーにより可視化され得る。標識プローブは、例えば、ニトロセルロースに結合したDNAサンプルと、十分に相補的な配列のみがハイブリダイズするような条件下で反応する。ハイブリダイゼーションのストリンジェントさは、所定の鎖長に対して、通常Ti( プローブとその標的配列との間で形成されるハイブリッドの不可逆的融解温度) より５℃低い。20マーについて推奨されるハイブリダイゼーション温度は、約58 ℃である。洗浄温度は、調査中の配列に独特であり、そして各変異体について最適化する必要がある。リガーゼ連鎖反応(LCR)のような代替のプローブ技術は、ミスマッチプローブ、すなわち、変異点を除いて標的と十分に相補的であるプローブの使用を含む。標的配列を、次いで、十分に相補的であるオリゴヌクレオチド、およびミスマッチを含むオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドの両方と、この２つを区別し得る条件下でハイブリダイズさせる。反応条件を操作することにより、十分な相補性がある場合でのみ、ハイブリダイゼーションさせることが可能である。ミスマッチが存在する場合、ハイブリダイゼーションはかなり減少する。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、顕著な効率で特定のDNA配列を増幅する技術である。ポリメラーゼ（例えば、熱安定性酵素Taqポリメラーゼ）を用いて実施する、変性、プライマーアニーリングおよび伸長の繰返しサイクルにより、所望の DNA配列の濃度を指数的に増加させる。変異ヌクレオチド配列の情報が与えられれば、目的のDNAに近接する配列に相補的である合成オリゴヌクレオチドを調製し得る。各オリゴヌクレオチドは、２つの鎖の１つに相補的である。DNAを高温（例えば95℃）で変性し、次いでDNAは大過剰モルのオリゴヌクレオチドの存在下で再アニールさせ得る。その3'末端が相互に向かうように配向するオリゴヌクレオチドが、標的配列の反対鎖にハイブリダイズし、そして４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸の存在下で核酸テンプレートに沿って酵素的伸長を開始する。最終生成物は、次いで、別のサイクルのために再び変性される。この３段階のサイクルを数回繰り返した後、DNAセグメントの百万倍以上の増幅が達成され得る。得られるDNAは、次いで、任意の遺伝的改変を位置付けるために直接配列決定され得る。あるいは、改変DNAにのみ結合し得るオリゴヌクレオチドを調製することが可能であり得、その結果、変異が存在する場合、PCRによりこのDNAの増加のみが生じる。PCR後、直接的な可視化または対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを使用して、点変異に伴う疾患を検出し得る。あるいは、PCRによる特異的対立遺伝子増幅(PCR called amplification of specific alleles；PASA)の適用が使用され得る；これは、１個の塩基対が異なる対立遺伝子間の迅速かつ確実な区別を行うための分別増幅を使用する。高コピー数を達成するRNAポリメラーゼを利用する、3SRのような他の技術もまた、必要に応じて使用し得る。さらに別の方法では、PCRの次に、制限エンドヌクレアーゼ消化を行い、得られる生成物を続いて分析する。ヌクレオチド置換は、特定の制限エンドヌクレアーゼ部位を獲得し得るか、または喪失し得る。制限エンドヌクレアーゼ認識部位の獲得または喪失は、制限フラグメント長多型(RFLP)分析を用いるか、または目的の配列に達するPCR生成物中の多型制限エンドヌクレアーゼ部位の存在もしくは非存在の検出により、疾患関連変異の検出を容易にする。 RFLP分析のために、DNAを、例えば、tagAを有するH．pyloriを含むと疑われる被験体の、血液、胃標本、唾液、歯垢、その他の体液または便、あるいは被験体から単離されたH．pyloriから、および非毒性のH.pyloriが感染した被験体から得、制限エンドヌクレアーゼで消化し、続いてアガロースゲル電気泳動によりサイズに基づいて分離する。次いで、サザンブロット技術を用いて、標識プローブとのハイブリダイゼーションにより、エンドヌクレアーゼ消化産物を検出し得る。次いで、サザンブロットから得られるパターンを比較し得る。このようなアプローチを用いて、tagA DNAを、検出されるバンドの数を測定し、そしてこの数を重篤な疾患と関連しないH．pylori株からのDNAと比較することにより検出する。制限エンドヌクレアーゼはまた、tagA遺伝子内の変異を効果的に検出するために利用され得る。開示された変異部位でのヌクレオチド置換による付加的な制限部位の類似した作成は、遺伝コードへの参照および制限エンドヌクレアーゼにより認識されるヌクレオチド配列のリストにより容易に計算され得る。一本鎖立体配座解析(SSCA)は、少なくともいくつかの例で適切であり得る配列変化を検出する比較的迅速な方法を提供する。一般に、PCRおよびLCRのためのプライマーは、通常、約20bpの長さであり、そして好適な範囲は15bp〜25bpである。より良好な増幅は、両方のプライマーが同じ長さでそしてほぼ同一のヌクレオチド組成を有するときに得られる。PCR条件は、鎖の変性が、通常94℃で起こり、そしてプライマーからの伸長が通常72℃であることを包含し得る。アニーリング温度は調査される配列により変化する。反応時間の例は：２０分変性；アニーリング、伸長、および変性について２分、１分、１分の３５サイクル；および最後に５分の伸長工程である。特異的対立遺伝予のPCR増幅(PASA)は、単一塩基変異または多型を検出する迅速な方法である。PASA(対立遺伝子特異的増幅としても知られる)は、その１つが対立遺伝子特異的であるような２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いる増幅を含む。所望の対立遺伝子が効果的に増幅されるが、他の対立遺伝子（単数または複数）は、対立遺伝子に特異的なプライマーの3'末端またはその近傍の塩基とミスマッチするので増幅されにくい。このように、PASAまたはPAMSAの関連方法が本発明の変異配列を特異的に増幅するために使用され得る。このような増幅がH.pylori単離株または個体から得られた試料について行われる場合、それは、変異の存在を検出する方法として用いられ得る。上記のように、リガーゼ連鎖反応(LCR)として知られる方法を、単一塩基置換を首尾良く検出するために使用し得る。LCRプローブは、多数の異なる変異を同時にスクリーニングするために組み合わされるか、または複合され得る。従って LCRは、本願発明のように、同じ疾患に多数の変異が予想される場合に特に有用であり得る。抗原検出キット本発明は、TagA抗原を有するH.pylori株による感染の診断用のキットを提供する。より詳細には、このキットは、抗体またはその免疫反応性フラグメントと特異的に反応するTagA抗原の存在を検出し得る。このキットは、基質に結合する抗体、上記抗原と反応する二次抗体、および二次抗体の抗原への結合を検出するための試薬を含有し得る。このようなキットは、ELISAキットであり得、そして適切であれば、基質、一次および二次抗体、および任意の他の必要な試薬(例えば、上記の検出可能な成分、酵素基質、および発色剤)を含有し得る。あるいは、診断キットは、本明細書に記載の成分および試薬を一般に含むイムノブロットキットであり得る。抗体検出キット本発明の診断キットは、TagAと特異的に反応する一次抗体またはその抗原性フラグメントの存在を検出するために使用され得る。このキットは、基質に結合する抗原、TagA抗原と特異的に反応する抗体に反応性の二次抗体、および二次抗体の一次抗体への結合を検出するための試薬を含有し得る。このようなキットは、 ELISAキットであり得、そして適切であれば、基質、抗原、一次および二次抗体、および任意の他の必要な試薬(例えば、上記の検出可能な成分、酵素基質、および発色剤)を含有し得る。あるいは、診断キットは、本明細書に記載の成分および試薬を一般に含むイムノブロットキットであり得る。核酸検出(診断)キット一旦TagA抗原のヌクレオチド配列が決定されると、本発明の診断キットはまた、抗原に特異的なヌクレオチド配列を検出するように代替的に構築され得、基質、および核酸検出用試薬のような標準キット成分を含有する。H.pylori感染は、胃または十二指腸組織、ならびに胃液、尿、便、および唾液のような体液中の抗原に特異的な核酸を検出することにより診断され得るので、分析において、特異的核酸プローブ、プライマー、または制限フラグメント長多型のような、核酸検出法を利用するキットを構築し得ることは当業者に明らかである。診断キットは、さらに陽性および陰性コントロール試験を包含することが意図される。本発明の診断キット中に含まれる特定の試薬および他の成分は、キットで実施される特異的な診断方法に従って当業者が利用可能な試薬および他の成分から選択され得る。そのようなキットは、被験体からの組織および体液試料中の抗原を検出するために使用され得る。以下の実施例は例示の目的であり本発明を限定しない。それらは使用され得る代表的な実施例であり、当業者に公知の他の手法がそれに代わって使用され得る。実施例１ TagA抗原のクローニングおよび発現細菌株および生育条件。 H.pylori 84-183株(ATCC 53726)をTagA抗原遺伝子をクローン化するために用いた。ヒトからの32株のH.pylori臨床分離株を、（先にこの抗原を有することが示された株を含む）この遺伝子の保存および細胞毒素生産との相関を評価するために使用した(表１)。ストックカルチャーを、15%グリセロールを添加したBruce lla broth(BBL Microbiology Systems，Cockeysville，MD)中で-70℃にて維持した。H.pylori株を、微好気性の雰囲気(CampyPak-Plus(BBL)により生成)中、５% ウシ胎児血清を添加したBrucella broth中で37℃にて48時間培養した。形質転換およびタンパク質発現には、E.coli XLI-Blue株(Stratagene，La Jolla，CA)、H B101(ATCC 33694)、およびDH5α(Stratagene，La Jolla，CA)を、Luria-Bertoli (LB)培地で、37℃で振盪して培養した。アンピシリンを培地に添加する場合は最終濃度を100μg/mlとした。化学物質および酵素。イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)をSigma Chemical Co.(St. Louis，MO)から購入し、そして57μg/mlで使用し、そして5-ブロモ-4-クロロ-3- インドリル-β-D-ガラクトシド(X-GAL；最終濃度40μg/ml)を、Boehringer-Mann heim(Indianapolis，IN)から購入した。制限酵素、T4 DNAリガーゼ、E.coli DNA ポリメラーゼラージ(Klenow)フラグメントおよびSequenase^TMは、Promegaおよび United States Biochemicals(Cleveland，OH)から得た。[α-³²P]dATP(650 Ci/m mol)を、ICN Radiochemicals(Irvine，CA)から得た。遺伝学的技法およびヌクレオチド配列分析。 H.pylori 84-183から染色体DNAを得るために、この株を５%ウシ胎児血清を含むBrucella broth中で48時間培養し、細胞をペレット化し、そして100mM NaClを含む100mM Tris-HCl(pH7.2)に再懸濁した。細胞を100mM Tris-HCl(pH8.8)中の1% SDSを用いて溶解した。クロロホルム−フェノール抽出の後、染色体DNAを100%エタノールで沈澱させた。プラスミドをBirnboimおよびDoly(49)の急速アルカリ抽出法により単離し、そして精製を800mM NaClおよび6.5%ポリエチレングリコールの存在下での沈澱により完結した。逐次順序欠失(sequential ordered deletion s)を含む他のすべての標準的な分子遺伝学的技法を、(50)に記載のように行った。ヌクレオチド配列を、二本鎖DNAテンプレートおよび先に記載された(51)ようにジデオキシ鎖ターミネーション法を用いて両鎖について明確に決定した。オリゴヌクレオチドプライマーは、Milligen 7500 DNA合成機を用いて、製造者のプロトコルに従い、Vanderbilt University DNA Core Facilityにより合成された。ヌクレオチド配列を編集し、そしてDNA-Starプログラム(DNA Star，Inc.，Mad ison，WI)を使用して分析した；推定されるプロモーターおよびシャイン・ダルガルノ配列をコンセンサス配列(52)との比較により同定した。 H.pyloriからのゲノムライブラリーの構築。 84-183株の染色体DNAを超音波処理により剪断し、そして得られたフラグメントを0.7%の低融点アガロースゲル上で電気泳動した。２〜10kbサイズ範囲のフラグメントを切除し、T4 DNAポリメラーゼで処理して平滑末端とし、そしてリン酸化EcoRIオクタマーリンカー(New England Biolabs，Beverly，MA)に連結した。このDNAをEcoRIで切断し、そして製造者のプロトコルに従ってλZapIIベクターのEcoRIアームに連結した。ライゲーション混合物をGigapack IIaパッケージングミックス(Stratagene)に添加し、そしてXL1-blue細胞(ラムダZapII)またはY10 88(ラムダgt11)細胞上で力価を調べた。増幅されたファージライブラリーを、H. pylori感染者からの吸着血清を用いて、またはプラークハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。 H.pylori特異的遺伝子のクローニング。 H.pylori感染者からの120〜128kDa抗原を強く認識する血清を、120〜128kDaのバンドを生成しないH.pylori 86-313株およびE.coli細胞で吸着し、非特異的反応の可能性を減らし、次いで増幅λZapIIファージライブラリー(53)からの遺伝子バンクをスクリーニングするために用いた。このバンクは約４×10⁴個の挿入物を含む。増幅ファージライブラリーを、42℃、2.5時間でXLI Blue細胞上で約1 0⁵のプラークを成長させ、予め10mM IPTGを含浸したニトロセルロースフィルターを重層し、そして37℃で２時間インキュベートすることによりスクリーニングした。このフィルターを、次いで吸着血清でスクリーニングし、９個の反応性クローンを検出した。陽性のプラークを、次いでプラーク精製し、そしてこれらの感染E.coli細胞から溶解液を調製した。この溶解液を吸着血清を用いてイムノブロットし、そして組換えタンパク質を発現するクローンを保存した。吸着ヒト血清を用いてイムノブロットすることにより、各XL1-Blue溶解液は、プラスミドpM C1、pMC2、またはpMC3にそれぞれ対応する、約75、85、または96kDaのいずれかで移動する強い免疫反応性バンドを示した。３つの代表的なクローンから、クローン化DNA挿入物を含むpBluescriptプラスミドを、(54)に詳述されるように、ヘルパーファージを同時感染することにより切り出し、そして新鮮XL1-Blue細胞を形質転換した。プラスミド精製の後、制限酵素切断地図を生成し、そしてプラスミドをさらなる特徴付けに用いた。平行する研究で、H.pylori 84-183のDNAのλgt11ライブラリーから同じ方法で４つのクローンを単離し、そして４つの陽性クローンの１つからのDNA挿入物を、既知のフランキングλgt11配列を基礎とするプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)により増幅した。４つの陽性プラークから組換えファージDNAを精製し、そしてそれぞれは0.6kb挿入物を含んでいた。２つのクローン(λYB1およびλYB2) からの溶解液のイムノブロット分析は、吸着ヒト抗血清と反応する類似のサイズの130kDaのバンドを示した。この130kDaタンパク質が、組換えファージにより融合タンパク質として合成されるか否かを決定するために、λYB1から調製した細胞溶解液をβ-ガラクトシダーゼ特異的抗血清を用いてイムノブロット分析に供した。示された交差反応性は、組換えクローンλYB1が、λgt11β-ガラクトシダーゼラージ(116kDa)フラグメントとH.pyloriオープンリーディングフレームとの融合物を含むことを示す。λYB1挿入物をpUC19中にクローン化したが、組換え体 (pYB1)はタンパク質を少しも発現しなかった。ゲル電気泳動およびイムノブロット分析。組換えラムダgt11，λZapII、またはpBluescriptを有するE.coliからの溶解液を、SDS-PAGEおよび吸着ヒト血清を用いるイムノブロッティングにより分析した。不連続ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE) を前述のように(55)、4.5%スタッキングゲルおよび7.0%分離ゲルを用いることにより実施した。３μgのタンパク質を含む試料を各ゲルレーンに適用した。電気泳動の後、ゲルを固定化し、そしてタンパク質を、Oakleyらの改変銀染色法(56) により解像した。タンパク質を含む濃縮培養上清液を試料緩衝液中に希釈し、そしてMini-PROTEAN IIスラブセル(Bio-Rad Laboratories，Richmond，Calif.)中のポリアクリルアミドゲルの表面上に重層した。電気泳動の後、タンパク質を、１ampで１時間の電気ブロッティングによりニトロセルロース紙に移した。非特異的結合をブロックした後、ニトロセルロース紙を、1:100希釈の血清試料と室温で１時間インキュベートした。ヤギ抗ヒトIgGのアルカリホスファターゼ複合体(Tago，Inc.，Burlingame，Calif.)を、1：2,000希釈で、二次抗体として用いた。サザンハイブリダイゼーション。 H.pyloriまたはC.jejuni染色体DNAを、HindIII、またはEcoRIおよびBamHIのいずれかで消化し、そして得られたフラグメントを、0.04M Tris-酢酸-2mM EDTA緩衝液(pH8.2)中の0.7%アガロースゲル上で電気泳動した。すべてのハイブリダイゼーション条件および手順は全く(50)に記載のとおりである。プローブを、ランダムヘキサマーを用いてプライマー伸長により放射性標識した(57)。ハイブリダイゼーションを、68℃で16時間、６×SSC(1×SSCは0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム)、0.5%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、５×Denhardt溶液(１×Denha rdt溶液は、0.02%フィコール、0.02%ポリビニルピロリドン、0.02%ウシ血清アルブミン)、および100μg/mlサケ精子DNAを含む緩衝液中で行った。ブロットを、0 .5×SSC中、60℃で洗浄し、そしてXAR-2 X線フィルム(Eastman Kodak，Rocheste r，NY)に感光させた。コロニーハイブリダイゼーション。 H.pylori株を、トリプチカーゼ大豆血液寒天平板(BBL)上で生育させ、そしてこれらコロニーのレプリカコピーをニトロセルロースフィルターに移した。各フィルターを、0.2M NaOH/1.5M NaClで飽和した３mm Whatmanペーパー上に置いた。３分後、フィルターを0.4M Tris-Cl(pH7.6)/２×SSCで３分間、次いで２×SSC で３分間飽和した３mm Whatmanペーパーに移した。このコロニーブロットフィルターを真空オーブン中で、80℃で90分間乾燥し、そして(50)に記載のように、放射標識したpMC3とハイブリダイズした。細胞毒素生産。 H.pyloriブロス培養上清液を限外濾過により30倍濃縮し、0.2μMフィルターを通過させ、そしてHeLa細胞とインキュベートした。手短には、H.pylori株を、37 ℃で、細胞毒素活性を強力にするために10 mMの塩化アンモニウムを添加した5% の規定のウシ胎児血清(Hyclone，Logan，Utah)を含むbrucella broth(BBL，M icrobiology Systems，Cockeysville，MD.)中で培養した。ブロス培養物を、100 rpmの旋回シェーカー上で、72時間、微好気性の雰囲気中でインキュベートした。培養物を、3,000×gで15分間遠心分離し、そして細胞を含まない上清液を-70 ℃で保存した。融解後、上清液を30-kDa限外濾過膜を用いることにより30倍濃縮し、そして保持液を0.22μmポアサイズフィルターを通過させることにより滅菌した。毒性アッセイを96-ウェルマイクロタイタープレート(Falcon; Becton Dic kinson and Co.，Lincoln Park，N.J.)中で総容量100μl中で行ったことを除いて、先に記載されたように(39)、これらの濃縮培養上清液(CCS)を、HeLa細胞(Al lison O'Brien，Uniformed Services University of the Health Sciences，Bet hesda，Md.から得た)と、1:10から1:320までの２倍希釈液中でインキュベートした。 HeLa細胞の液胞化を、ニュートラルレッドの取り込みアッセイを用いて定量した。手短には、0.5%の精製グレードのニュートラルレッド(Sigma Chemical Co., St.Louis，Mo.)のストック溶液を、0.9%の生理食塩水中で調製し、そしてWhatma n no.1濾紙で濾過した。染色溶液を、各実験の前に、10%ウシ胎児血清を含むEag le培地中でストック溶液を1:10に希釈することにより調製した。24時間試験試料とインキュベートした後、HeLa細胞を重層した培地を取り除き、そして４分間ウエル当たり100μlの染色溶液で置き換えた。細胞を、ウェル当たり150μlの0.9% の生理食塩水で２回洗浄し、そしてニュートラルレッドを、ウェルあたり100μl の酸性アルコールを添加して細胞から抽出した(58)。ウェルの540nmの吸光度(OD )を、MR700酵素結合免疫吸着アッセイ検定法(Dynatech，Alexandria，VA.)を用いることにより測定した。すべてのアッセイは３連で行った。全ての実験で、培地のみとインキュベートした細胞を含むウェルの平均ODは、0.130より低い(平均、0.101±0.007)であった；このバックグラウンドODを、実験ウェルのODから引き正味のODを得た。試験した32株のH.pyloriのうち、15株がこのアッセイで測定されるように液胞化細胞毒素を生成した（表３）。 pBluescript挿入物のマッピング。 EcoRI消化の後、プラスミドpMC1、pMC2、およびpMC3は、それぞれ、約2.5、2. 7、および3.6 kbのDNA挿入物を含むことが見出された。組換えプラスミドの制限エンドヌクレアーゼ処理の分析により、３つすべてにおいて、保存された1.2kb HindIII消化フラグメントを同定した(図１)。このように、さらなる研究は、最も大きい挿入物を含むpMC3に集中した。エキソヌクレアーゼIII消化により生成した欠失変異の分析は、オープンリーディングフレーム(ORF)の向きとおよその位置を同定した(図１、大きい矢印)。 pMC3およびpYB1の配列分析。 pMC3中の3.6kb挿入物の配列を決定するために、エキソヌクレアーゼIIIを用いるプラスミドの一連の一組になった(nested)順番の欠失(図１)を、記載されているように行った(50)。全体で、3648bpを示す完全pMC3挿入物に対する配列を両方の鎖について決定した(配列番号１)。このヌクレオチドを各行の右に番号付ける。配列番号１の859番目の残基でグリシンをコードするヌクレオチドは、クローニングプロセスのアーチファクトであり、tagA遺伝子の一部ではない。配列番号２は、配列番号１で示された核酸の推定アミノ酸配列を提供する。ヌクレオチド1072で開始する長いオープンリーディングフレームは、挿入物の終末まで続く。反対方向の２つの他のオープンリーディングフレームは645bpおよび264bpで始まる。推定アミノ酸をヌクレオチドの下に示す。可能なリボソーム結合部位(シャイン・ダルガルノ配列；SD)、および推定プロモーターエレメント(-35および-10配列)を示す。300塩基を超える単一のORFのみが６つの可能なリーディングフレームのすべてにおいて見出された。このORFは、859アミノ酸のta gA抗原をコードし、分子量96,022の予想されるタンパク質(配列番号２)を生じる。このORFから推定される転写の方向はまた、先に欠失変異体を用いて決定された方向と一致する。しかし、翻訳終止シグナルがなく、pMC3中のORFは短縮型であることを示している。短縮型フラグメントは塩基性アミノ酸に富み(表２)、そして予想される等電点は8.0である。可能なリボソーム結合部位(AGGAG)は、ORF の6bp上流で終わる。翻訳開始部位の112bp上流の配列は、Pribnowコンセンサスプロモーター配列TATNATN(HawleyおよびMcClure)に類似するプロモーター配列TA TAGT(配列番号１)を示す。この推定の-10領域は、sigma-70プロモーターに似ており、-35領域、ATGCCAを伴い、この配列は、対応するコンセンサス配列、TTGAC A(52) と６塩基のうち４塩基を共有する。短縮型ポリペプチドの推定されるアミノ酸組成を表２に示す。２つのより小さなORFを(それぞれ反対方向に進む)また同定した(配列番号１) 。第１番目は、79アミノ酸のポリペプチドをコードし、645bpで始まるが明確なシャイン・ダルガルノ配列または予想されるプロモーター配列が先行しない。第２番目のORFは、264bpで始まり、そして挿入物の末端の前の88アミノ酸をコードする。この短縮型ORFは、シャイン・ダルガルノ配列が先行し、そして翻訳開始部位の90bp上流の配列TTTGATは、-10コンセンサスプロモーター部位に似ており、- 35コンセンサス配列(52)と６塩基のうち５塩基を共有する配列TTGTCAが続く。 pYB1中の0.6kb挿入物を、実験から得られた挿入配列を基にした付加的なプライマーと共に、既知のλgt11フランキング配列の正方向および逆方向プライマーの両方を用いて配列決定した。620bpのpYB1配列の最初の464塩基は、pMC3の末端と重複するが、このORFはなお続く。短縮型組換えTagA抗原の血清学的認識。示した事例に加えて、H.pylori84-183株由来のTagA抗原を認識するH.pylori感染者からの血清は、組換えポリペプチドを認識する。この分析のために、H.pylo riに感染していない６人から、および14人の感染者からの血清を研究した(84-18 3株からの120-128 kDa抗原を７つが認識しそして７つが認識しなかった)。pMC3 で形質転換されたE.coli XL1-Blueの溶解液およびイムノブロッティングを用いると、ヒト血清IgGにより96 kDa抗原が明確に認識された。全部で、ネイティブの120-128 kDaバンドを認識する７つの血清のうちの４つはまた、組換えタンパク質を強く認識するが、試験した13の血清はいずれも、120-128 kDaバンドを認識しない(p=0.007、Fisher検定、両側検定)。pMC3バンドに対する弱い反応を考慮すると、120-128 kDaバンドを認識する７つのすべての血清、および１３の非認識血清のうち３つは、組換えタンパク質と反応する(p=0.003、Fisher検定、両側検定)。このように、pMC3により生産される組換えタンパク質は、H.pylori 12 0-128 kDa抗原に対する抗体を検出するための血清学的アッセイに使用され得る。 tagA遺伝子の保存。他のH.pylori株がtagA遺伝子または相同配列を有するか否かを決定するために、32の株を、pMC3をプローブとして用いるコロニーハイブリダイゼーションにより研究した(表３)。これら株の19(59.3%)から陽性のシグナルを得た。これら株の全細胞のSDS-PAGEおよびイムノブロッティングは、32株の19(59.3%)が120-128 kDaでバンドを発現したことを示した。イムノブロットおよびコロニーハイブリダイセーションの知見は完全に相関した；このタンパク質を発現する19のH.pylo ri株のすべては、相同遺伝子を有し、これと比べてこのタンパク質を発現しない 13株では有さなかった(p＜0.001、Fisher検定、片側検定)。さらに、液胞化細胞毒素を生産する15株のすべては、pMC3ハイブリダイゼーションおよび120-128 kD aバンドの存在の両方を示した(表３)。 tagA遺伝子の制限フラグメント多型に関する情報、および各細菌ゲノム中に多重の相同遺伝子があるか否かの情報を得るために、４株のH.pyloriからゲノムDN Aを調製し、そしてpMC3をプローブとして用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。現在、120-128 kDaタンパク質を発現しそして陽性のコロニーハイブリダイゼーションを示す２株は、約1.2kbで、そしてより弱い3.0および3.3kbのバンドで移動するHindIII制限フラグメントと強くハイブリダイゼーションすることを示した。上記の表現型を示しそして陽性のコロニーハイブリダイゼーションを示した第３の株に対しては、プローブはサザン分析で、約1.1kbのバンドに強くハイブリダイズし；より弱いバンドは見られなかった。プローブと弱くハイブリダイズする0.5kb以下で移動するバンドが３株すべてに存在した。120-128 k Daタンパク質を発現せずそしてコロニーハイブリダイゼーションが陰性のH.pylo ri株、およびコントロールとして用いたC.jejuni株は、サザン分析ではハイブリダイゼーションしなかった。pMC3の、EcoRIおよびBamHIで消化した84-183株および60190株からの染色体DNAに対するハイブリダイゼーションはまた多型を示し、他の制限酵素で観察された異質性を確認した。これらの研究は、TagAの相同体が他のH.pylori株に存在するが、遺伝子内またはフランキング配列のいずれかで異質であることを示す。本発明の実施例は、重要なH.pylori抗原をコードする遺伝子の大部分を含むH. pyloriゲノムDNAのクローン化フラグメントを提供する。pMC3がtagA抗原をコードする遺伝子を含むという証拠は以下のように要約され得る：(i)すべてのH.pyl ori株でこのタンパク質または遺伝子のいずれも存在しない；(ii)120-128 kDaタンパク質を発現する株のみがpMC3とハイブリダイズし、そしてこのタンパク質を発現しない株はハイブリダイズしない；(iii)120-128 kDa抗原を認識するH.pylo ri感染者からの血清は、コントロール血清に比べより頻繁に組換えtagA生成物を顕著に認識する。 tagAの部分配列および２つの他のORFは、87 kDa細胞毒素からのN-末端または３つの内部配列と同一性を有さない。この知見は、120-128 kDaおよび87 kDaタンパク質が抗原性に関連しないという先の観察(41)と一致する。短縮型の推定遺伝子産物の比較では、既知のタンパク質との直接相同性はほとんどなかった。 tagA遺伝子または相同遺伝子は、研究されたH.pylori単離株の約60%中に存在するが他には存在しない。サザン分析により示されたように、ほんの少数の株が試験された場合でさえ、制限フラグメント多型の証拠が存在する。相同体が存在しないことは、120-128 kDaで抗原性のバンドの発現を欠くことと正確に相関する。このように、このバンドを欠く表現型は、転写または発現に関する欠陥に起因せず、関連する遺伝子が存在しないことに起因する。少なくとも短縮型のtagA遺伝子を含むゲノムDNAの存在は、細胞毒素生産と高度に関連する。tagA遺伝子を有する少数の株は、検出可能なレベルの細胞毒素を生産しない。この現象は、毒素を検出するための細胞培養アッセイにおけるやや最適な（suboptimal）感受性を反映し得るか、またはTagA抗原以外の因子が毒素活性に関連することを示し得る。イムノブロット研究により示されるように、pMC3生成物は、TagA抗原に対するヒト血清抗体の検出のための優れた診断試薬である。この組換えタンパク質の使用は、ネイティブな120-128 kDaタンパク質を生産するH.pylori株の感染者を決定するイムノアッセイの開発を補助するに十分な抗原を容易に提供し得、そして pMC3遺伝子産物に対して惹起された異種抗体はtagA抗原を生産する株を決定するために使用され得る。pMC3のDNA配列の知見は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用するための、またはPCR用のプライマーのためのオリゴヌクレオチドの構築を可能にする。そのような技法はまた、関連する遺伝子型を有する株に起因する感染の迅速検出のために使用される。欠失変異体の作成は、この遺伝子産物の役割の説明を可能にし、そして治療薬およびワクチン候補物質の両方を提供する。このような診断方法および変異体を本明細書に詳細に記載する。実施例２ Helicobacter pyloriのtagA-陰性株の構築および特徴付け細菌株、ベクター、および増殖条件。本研究で用いたH．pylori84-183株(ATCC 53726)は、Vanderbilt University C ampylobacter/Helicobacter研究室のカルチャーコレクション由来であり、そしてこの株が広範囲に特徴付けされていたので選択した。ストックカルチャーを、 15％グリセロールを加えたBrucellaブロス(BBL Microbiology Systems，Cockeys ville，MD)中で−70℃に維持した。H．pylori株を、５％胎児ウシ血清を添加したBrucellaブロス中で、または、ナリジキシン酸(50mg/リットル)、バンコマイシン(10mg/リットル）、ポリミキシンＢ(5000U/リットル）、およびトリメトプリム(5mg/リットル)を加えた血液寒天プレート上で、微好気性条件下、37℃で48 時間増殖させた。形質転換のために用いられるE．coliDH5α株(Stratagene，La Jolla，CA)を、LB培地で増殖させた。上記のように、pMC3は、pBluescript中の3 5kb挿入断片上に短縮型tagA遺伝子を含む。プラスミドpILL600(60)を、C．coli カナマイシン(Km)耐性遺伝子源として用いた。化学物質および酵素。必要な場合にはいつでも、最終濃度のアンピシリン(100μg/ml)および最終濃度のカナマイシン(50μg/ml)を用いた。制限酵素、T4 DNAリガーゼ、E．coli DN Aポリメラーゼの大(Klenow)フラグメントを、Promega and United States Bioch emicals(Cleveland，OH)から入手した。α-³²P-dATP(650 Ci/mmol)を、ICN Radi ochemicals(Irvine，CA)から入手した。遺伝学的技法。染色体DNAを上記のように調製した。プラスミドをBirnboimおよびDoly(49)の手法により単離した。他の全ての標準的分子遺伝学的技法を、(50)に記載されるように行った。ハイブリダイゼーション実験のプローブとして用いられるDNAフラグメントをゲル精製した。 H．pylori84-183株内へのkmカセットの導入。 E.coliカナマイシン耐性遺伝子を、pMC3の唯一のNdeI部位に挿入して、pMC3:k m(図２)を作製した。この構築物を、エレクトロポレーションにより、直接H．py lori84-183株内に挿入した。簡単に言えば、血液寒天プレート上で48時間増殖させたH．pylori細胞を集め、エレクトロポレーション緩衝液(15％グリセロール/ ５％蔗糖)中で３回洗浄し、そしてこの緩衝液200μl中に懸濁した。pMC3:km由来のプラスミドDNAを、BirnboimおよびDolyの迅速(微量調製用(mini-prep))アルカリ溶解法により単離し、そして細胞に添加し、氷上で５分間インキュベートした。細胞およびDNAを、ジーン−パルサー装置(Bio-Rad)内の0.2cmのエレクトロポレーションキュベットに移し、そして前記(61)のように、高電圧パルス(25F、2. 5kv、および200Ω)を与えた。エレクトロポレーションの後、細胞を400μlのLB 培地中に懸濁し、そして血液寒天プレート上に塗り付けた。このプレートを、微好気性条件下にて、37℃で24時間インキュベートし、次いで細胞を集め、50μg/ mlのカナマイシンを含有する血液寒天プレート上にプレートし、そして微好気性条件下で48時間インキュベートした。用いられるクローニングベクターは、H．pylori中では複製し得ず、カナマイシン含有培地での選別により、カナマイシン耐性組換え体を生じた。500ngのプラスミドDNAを用いたときには、約10¹⁰cfuのH．pylori から、3000個の形質転換体(10^-7)を得た。コロニーハイブリダイゼーション。エレクトロポレーションにより得られた50個のカナマイシン耐性形質転換体を、血液寒天プレート上で増殖させ、これらのコロニーのレプリカコピーをニトロセルロースフィルターに移した。各フィルターを、0.2M NaOH/1.5M NaClで飽和した３mM Whatman濾紙上に置いた。３分後、フィルターを0.4M Tris-HCl(pH7.6) /2×SSCで飽和した３mM Whatman濾紙に３分間移し、次いで2×SSCに３分間移した。上記のように、このコロニーブロットフィルターを、真空オーブン中で90分間80℃にて乾燥し、そして放射線標識したpBluescriptまたはkm耐性遺伝子でハイブリダイズした。このコロニーブロットを、60℃にて0.5×SSC中で洗浄し、そして XAR-2 Ｘ線フィルム(Eastman Kodak，Rochester，NY)に曝した。ゲル電気泳動およびイムノブロット分析。 pBluescript、pMC3またはpMC3:kmを有するE.coliの溶解物、あるいはH．pylor i細胞の溶解物を調製し、そしてSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE )により分析した。上記に詳細に記載したように、野生型および変異体１、21および22から誘導した全細胞抽出物のイムノブロッティングを行った。すなわち、上記のように、吸着されたヒト血清の1:300希釈液、および、二次抗体としてヤギ抗ヒト免疫グロブリンアルカリホスファターゼ複合体の1:2000希釈液を用いた。これらの研究により、同質遺伝子型変異体の株１、21、および22は、抗原性ta gA遺伝子産物を有さないことが示された。サザンハイブリダイゼーション。野生型H．pylori84-183株とカナマイシン耐性形質転換体M21およびM22とのサザンハイブリダイゼーションを行った。H．pyloriの染色体DNAをHindIIIまたはB amHIおよびSacIで消化し、そして得られたフラグメントを0.7％アガロースゲル上で電気泳動し、そしてナイロン製メンブレンに移した。プローブは、pMC4またはpILL600から誘導したゲル精製DNAフラグメントであり、そして上記のように、ランダムヘキサマーのオリゴヌクレオチドを用いてプライマー伸長法により放射線標識した。次いで、DNAをナイロン製メンブレンに移し、そして高ストリンジェントさの条件下、³²Ｐ標識したpMC4または1.3kb kmカセットとハイブリダイズさせた。6×SSC、0.5% SDS、5×Denhardt溶液、および100μg/mlサケ精子DNAの溶液中でハイブリダイゼーションを行い、そしてこのブロットを0.5×SSC/0.1％ SDS中で30分間60℃にて洗浄した。形質転換体の遺伝子型の特徴付け。 tagA遺伝子が形質転換体の株内で分断されるという遺伝学的証拠を提供するために、野生型84-183株ならびにH．pylori変異株21および22とから単離したDNAを、制限エンドヌクレアーゼHindIIIまたはBamHIおよびSacIで消化した。消化された DNAをアガロースゲル上で分離した後、このDNAをナイロン製メンブレンに移し、そしてtagAプローブであるpMC4にハイブリダイズした。このプローブは、野生型株においては、約20kbおよび1.0kbのBamHI−SacIフラグメントにハイブリダイズしたが、両変異体株においては、他のバンドの分断もなく、1.0kbのBamHI−SacI フラグメントが失われ、そして新たな2.3kbのハイブリダイズするフラグメントが観察された。同様に、カナマイシン耐性遺伝子の挿入のために、両変異体においては、1.2 kbのHindIIIフラグメントが失われ、そして2.2 kbのフラグメントが得られた。変異株21および22においては、カナマイシン遺伝子プローブは、2. 3 kbのBamHI−SacIおよび2.2 kbのHindIIIフラグメントとのみハイブリダイズした。このことは、置換がtagA遺伝子内で起こったことを示す。従って、株84-183 内のtagA遺伝子は、km遺伝子の挿入により変異誘発されていた。細胞毒素の産生。細胞毒素の産生を上記のようにアッセイし、そして結果を表４に示した。この結果は、完全なTagA抗原または完全なtagA遺伝子のいずれも液胞形成には必要でないことを示している。実施例３全長tagA遺伝子および遺伝子産物全長遺伝子のクローニングおよび配列決定。全長遺伝子を単離するために、次に、プローブとしてpYB1の0.6 kbのフラグメントを用いて、H．pylori 84-183のλZapIIライブラリーをスクリーニングした。５個の陽性プラークを精製し、そしてクローニングされたDNA挿入断片を含むp Bluescriptプラスミドを、ヘルパーファージと同時感染することにより切り出した。５個の陽性クローンはそれぞれ、２〜３kbのDNA挿入断片を含んでいた（データは未掲載）。2.7 kbの挿入断片を含む、pYB2と命名されるクローンをさらなる研究のために選び、そして制限酵素地図を作成した（図３）。pYB2の2.7 kbの挿入断片のいずれかの末端に始まる一連の集団欠失(nested deletion)を、エキソヌクレアーゼIIIを用いて行った。pYB2の重複欠失クローンを用いて、両鎖の1969b pの配列を決定した。予想したとおり、この配列（配列番号３、ヌクレオチド286 4位で始まる）の最初の785塩基は、pMC3の末端と重複していた。可能な全てのリーディングフレームにおいてpMC3、pYB1、およびpYB2から得られた完全なヌクレオチド配列を翻訳することにより、1072位のATGコドンから開始し、そして4,615 位のTAAコドンにより終止する3,543個のヌクレオチドの単一のオープンリーディングフレームが明らかになった。この配列は、1181個のアミノ酸残基のタンパク質（配列番号４）をコードし、そして推定ポリペプチドの分子量の計算値は131, 517ダルトンである。mRNA中で潜在的なステム−ループ構造を形成し得、そして転写終結部位（ΔＧ＝−14.4Kcal)として働き得る配列は、ヌクレオチド4642〜4 674位まで伸びている（配列番号３）。 TagAポリペプチドと他のタンパク質との相同性。 Swiss.Prot バージョン21およびNBRF-PIRタンパク質データバンクの検索により、全長TagA抗原(配列番号:4)との顕著な相同性は示されなかった。しかし、最も高いスコアを有する相同性の中には、葉緑体H⁺−輸送性ATPシンターゼ(62,63) 、および16.8％および17.3％の同一性を有するナトリウムチャンネルタンパク質 (74)、ならびに、残基１〜482位と123〜1182位との間の領域において、それぞれ 50％および42.6％保存されたアミノ酸があった。pMC3に含まれる他の２つのORF のアミノ酸配列をタンパク質データベースと比較した場合、顕著な相同性は観察されなかった。 TagAの塩基性アミノ酸の含有量［141個のリジン(11.9％)および117個のアスパラギン(9.9％)］は非常に高く、そしてペプチドの等電点の予測値(8.89)と一致した。ハイドロパシープロットにより、推定タンパク質は、主に親水性であることが示された。このタンパク質の一次構造の興味ある特徴は、ホモポリマー性アミノ酸配列の構造、最も顕著には、ポリアスパラギン（配列番号:4、3705位）が存在することである。このアスパラギンに富む領域を種々のタンパク質配列データベースと比較して調査したところ、酵母(64,65,66,67,68,69,70)ならびにマラリア原虫(Plasmodium)(71)のヌクレオチド結合性タンパク質由来の配列と強い相同性があった。ポリアスパラギンはまた、Kluyveromyces var.lactisのlac9遺伝子(72)およびSaccharomyces cerevisiaeのカリウム輸送タンパク質(TRK1)(73)の DNA結合性調節産生物中に見出される。全長tagA遺伝子の構築。全長tagA遺伝子を構築するために、pMC3およびpYB2の両方に位置する唯一のSa cI制限酵素部位を利用した（図３）。まず、pMC3の3.6 kb tagAフラグメントを、lacZプロモーターの制御下でpUC19ベクター内にクローニングし、pUT1を生成した。次に、pYB2由来の2.6 kb SacIフラグメントを、SacI消化されたpUT1内にクローニングした。正確な方向性を有するクローンを選別し、これをpUT2と命名した。同一ではあるがpGEM3zベクター内に存在するクローン(pEM3)を、ブダペスト条約の要件に従って、受託番号69273としてATCCに寄託した。pUT2またはpEM3 を含むE．coli細胞は、免疫反応性H．pyloriの128kDaのタンパク質を発現した。ウェスタンブロッティング法による組換えTagAタンパク質に対するヒトの血清学的応答の検出。ヒト血清が全長組換えTagAタンパク質と反応するかどうかを決定するために、 pEM3含有細胞由来の溶解物を７％アクリルアミドゲル上で電気泳動し、そしてニトロセルロース濾紙上にエレクトロブロットした。10人のH．pylori感染したヒトおよび10人の非感染のヒトに由来する血清を1:100に希釈し、そして組換えタンパク質との反応性について試験した。７人のH．pylori感染した人に由来する血清は、TagAタンパク質を認識し、これに対して、10人の感染していない人のうちの１人に由来する血清がTagAタンパク質を認識した(p=0.01、片側Fisherの精度検定)。従って、組換え全長タンパク質は、H．pyloriに対するヒトの応答を評価するのに有用な抗原であった。実施例４胃の腺ガン発症の増加した危険性と関連するtagAを所有するH.pylori株この実施例は、Helicobacter pylori感染がtagA⁺株に起因するか否かを決定するための血清学的アッセイを記載する。この血清IgGアッセイは、組換えtagAフラグメントであるorv220を用い、臨床的に規定された集団で用いられるとき、94 .4％の感度および92.5％の特異性を有することが見出された。本実施例はまた、H.pylori感染が胃ガン危険性と関連することを示す。Hawaii の日系アメリカ人のグループ(cohort)から得られた血清標本を、最終的に(血清標本を収集した13年後)胃ガンを発症した103人のH.pylroli感染者、および同一期間内にガンを発症しなかった人由来の103の適合したH.pylroli感染コントロール標本の研究において使用した。TagAに対する血清抗体が、観察期間の間の胃ガン発症の1.9倍(0.9〜4.0、p=0.08)増加した危険性と関連した。遠位の胃の腸管型のガンを有する75人の中で、オッズ比(OR)は、2.3(1.0〜5.2、p=0.056)であった。若年(72歳未満)および腫瘍診断の後期の各々が、TagA陽性と有意に関連した。以下の結果は、組換えtagA産物に対する血清抗体の存在が、感染性H.pylori株のtagAの状態を正確に決定し、しかもtagA⁺株による感染が、胃ガン、特に遠位の胃に影響する腸管型の発症の増強された危険性と関連することを示す。確認研究のための患者の選択。 TagA血清学的アッセイの有用性を決定するために、H.pyloriの状態が先に規定された(9,22〜24)181人からの血清を調査した。非感染者(n=115)は、内視鏡検査を受け、そしてバイオプシーを受けて、急速ウレアーゼ試験(rapid urease test )により、または組織学的検査によりH.pylori感染を示さなかった；すべての患者はまた、H.pyloriに対する血清IgGについての標準化された酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)において、陰性の血清学的性状を有していた(25)。115人の非感染患者を、任意に参照群(n=35)と試験群(n=80)とに分けた。感染者は、バイオプシーにおける培養でH.pyloriが得られた者であった；これら66人の患者は、十二指腸潰瘍(n=14)、胃潰瘍(n=6)、胃炎のみ(n=36)、または他の診断(n=10)を含んだ。患者の各々について、単一の単離株を評価し、先に記載されたように(6,24) 、遺伝子特異的なプローブとのコロニーハイブリダイゼーションによりtagAの状態を決定した。ハイブリダイゼーションアッセイを基に、36人の患者がtagA⁺株に感染し、そして30人の患者がtagA^-株に感染していると規定した。すべての血清を使用するまで-20℃で保存した。ガン研究のための患者の選択。本研究における患者はすべて、先に記載された日本−Hawaii研究グループの一部分であった。1968〜1989の21年の期間の間に、病理学的に確認された胃ガンの 109の事例が同定され、そして先の血清学的試験は、これら患者のうち103人が、 1960年代のそれらの当初の血清提出時にH.pyloriで感染されていたことを示した (5)。これらの事例について103人の適合したコントロールのうち、83人がH.pylo ri感染であった。残りの20人のH.pylori感染事例の各々について、３人のさらなるコントロールが、先の基準(5)に従って同定された。H.pylori感染が存在したか否かを決定するための血清学(serology)をコード付けした試料において行い、そして陽性者から、１人のH.pylori感染コントロールを、20人の適合していない事例の各々について無作為に選択した。本研究は、総計、胃ガンを発症した103 人のH.pylori感染者、およびH.pyloriに感染しながらも研究期間の間に胃ガンを発症しなかったそれらの103人の適合したコントロールから構成された。組換えTA抗原の調製。 pMC3中でクローン化されたtagAの塩基1921〜3648を含む1.7kbのBamHIフラグメント(16)を、pET15b(Novagen、Madison WI)の、T7プロモーターの下流のBamHI部位中にサブクローン化した。このプラスミド(pORV220)を用いて、lacUV5プロモーター制御下のT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を含むλDE3溶原菌であるE.coli宿主株BL21(26)を形質転換した。溶原菌の増殖培養へのIPTGの添加はT7ポリメラーゼを誘導し、組換えプラスミド上の標的DNAを転写する。このベクターは、N末端ヒスチジン-タグを有するTagAフラグメントからなる融合タンパク質の転写的に調節された発現を可能にする。この融合タンパク質は、600の残基(24ベクター＋57 6挿入片)からなり、そして66.4kDaの推定分子量を有する。このタンパク質を、ニッケルキレート化樹脂を用いて、誘導されたブロス培養液の溶菌液から精製し、そして記載されたように(27)イミダゾールを用いて溶出した。血清学的方法。 H.pyloriに対する血清IgGの存在を、先に記載のように(5)、Pyloristatキット (Biowhittaker、Walkersville、MD)を用いてELISAにより決定した。TagA ELISA について、抗原、患者血清、および抗ヒトIgG結合体の最適濃度を、チェックボード滴定により決定した。orv220について、最適抗原濃度は５μg/mlであり、そして100μのアリコートを、96ウェルのマイクロタイタープレート中のウェルに入れた。ヒト血清の最適希釈は1:100であり、そして西洋ワサビベルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIgGを1:4000の希釈で用いた。血清学的方法のその他の詳細は、類似のアッセイ(23,25)で記載されたのとちょうど同じである。統計解析。平均を比較するために対の試料のためのt検定を用い、そして患者とコントロール被験体との間の種々の特性の分布を比較するためにMcNemarの検定を用いた。TagAアッセイの結果を基にした胃ガンに対するオッズ比(OR)は、条件付きロジスティック回帰法(conditional logistic regression method)(29)から得た。危険性の論理(logit)における線形トレンドのための検定は、グループ分けしたTag A試験結果(１、２、３、または４の四分位数によりコード付けした)の使用により、条件付きロジスティック回帰モデルに由来した。条件付きロジスティック回帰のすべてのモデルを、反復最大尤度法および比例危険回帰モデル(30)の特殊適用を用いることにより適合させた。tagA⁺株に関連した胃ガンの起因する危険性の推定は、Walterの方法(31)に基づいた。レシーバーオペレーター特性(ROC)曲線を構築し、感度および特異性の推定を要約した(32)。 orv220を用いるTagA血清学の診断精度。 TagA血清学の先の研究は、E.coli細胞溶菌液から精製された組換え抗原を用いた(21)。この抗原の精製は煩雑で長時間を要するので、重複するtagA遺伝子フラグメントが、別の原核生物発現系中で融合タンパク質として発現された。予備研究は、ovr220が、現在までに研究されたTagAフラグメントを基礎にしたいくつかの候補抗原の中で最高のものを発現することを示した。短縮型タンパク質を、全長のtagAORFをコードするpEM3で形質転換されたE.coli株から精製された抗原と比較した。線形回帰解析により、41人(19人の感染者および22人の非感染者)についての血清IgG結果は、２つの異なる抗原を用いるアッセイ間で密接に相関した( r=0.96、p＜0.001)。非感染者についての平均値＋2SDの同じ閾値を用いて、orv2 20抗原は、22人の非感染者のうち21人(95％)について陰性の結果を与え；そして例外は弱陽性であった。19人のH.pylori感染者について、orv220を用いた結果は、pEM3抗原に対するのとちょうど同じであった(12が陽性および７が陰性)。従って、orv220によりコードされた66.4kDaのTagAフラグメントとの血清学的反応性は、より大きなTagAフラグメントを用いて検出された反応性とほぼ同じであった。アッセイを確立するために、H.pyloriに感染していないことが知られる36人からの血清を参照として用い、そして複数の実施の後、平均値＋１区間標準偏差に基づく閾値を確立した。平行して、80人の非感染者、tagA⁺に感染していることが知られる36人、および得られたH.pylori単離株がtagA^-のみである30人の第２の群から血清を試験した。非感染者についての光学密度比が参照群のそれとほぼ同一であったことは驚くにあたらない。対照的に、tagA⁺株の感染者についての値は有意に高かった(StudentのT検定、p＜0.001、片側)。tagA^-株が唯一単離される人から得られた30の血清の間では、二山分布が観察された。27の血清について、値は非感染者の２つの群の値と同様であったが、３つの血清についての値はずっと高く、そしてtagA⁺株に感染した患者についての値と同様であった。診断アッセイで使用するための閾値を確立するために、いくつかの光学密度比カットオフ値の精度を調べた(表５)。全体的に、35人の非感染(参照)患者についての平均値＋３区間標準偏差を用いたとき、最高の精度が得られ、94.4％の感度および92.5％の特異性であった。このタイプの閾値を将来の研究のすべてに用いた。レシーバーオペレーター特性(ROC)曲線を基礎にして、orv220を用いるとtag A状態の高レベル識別があった。抗体レベルの安定性評価。 TagA産物に対する血清抗体が、慢性H.pylori感染の経過にわたって持続するか否かを決定するために、H.pylori感染に関連した臨床および疫学特徴について先に研究されたグループ(28)の一部分であった36人の疫学者(epidemiologist)由来の対の血清標本を評価した。平均して、7.59年離れた標本を得、そして標準のH. pylori ELISA(28)における値を、TagA ELISAにおける値と比較した。 36人の参加者のうち、陽性から陰性抗体状態へ、またはその逆に血清転換(ser oconverte)した者はいなかった。第１の血清および第２の血清により生じた平均光学密度スコアは非常に類似していた(0.217対0.249;p=0.3、両側t検定;表６)。胃ガンとtagA陽性度との関連。 TagAまたはその抗原性フラグメントを用いて、TagAを保有するH.pylori株の感染者を検出するアッセイを開発し、本発明は、tagA⁺株による感染が胃ガン発症の危険性と関連することを示す。21年の観察期間にわたって胃ガンを発症した10 9人の日系アメリカ人患者の初期の研究(5)からは、103人が、ガンの診断の平均1 3年前に彼らから得られた血清標本を基礎にして、H.pylori感染であることが見出された。これら事例の各々は、同年齢の、かつH.pylori感染でもあった同じグループからのコントロールに適合した；胃ガンを発症した103人のH.pylori感染者およびそれらの年齢が適合したコントロールの特性を表７に示す。２つの個人群は、人口統計特性および実験値に関して類似であった。この集団について、TagAに対する血清抗体の存在(即ちtagA陽性H.pylori株の感染)が、ガン発症の増加した危険性と関連した(OR=1.9、p=0.08)(表８)。101例の遠位の胃のガンおよびそれらのコントロールに限った解析は、予想されたように高度に類似の値を示した(OR=1.8、p=0.11)。遠位のガンの事例を、腫瘍の組織学的型により階級化したとき、腸管型と最も強い関連があったが(OR=2.3、p=0.0 56)、拡散型とはなかった(OR=1.0、p=1.0)；３人が中間の組織学的パターンを有していた。TagA ELISAにおける陽性度は、血清を得たときとガンの診断との間のインターバルの間の血清転換の結果ではなく、ガンを発症する危険性におけるファクターであるTagA抗体応答の大きさでもなかった。H.pylori感染者の集団において、tagAの存在は、胃ガンについては28％の起因する危険性(95％ C.I.=0〜57 ％)と関連していた。TagAに対するIgG抗体のレベルと、保存されたH.pylori抗原に対するIgGのレベルとの間には関連はなかった。 TagA抗体分析を、胃ガンが診断された患者の年齢により階級化した。TagA血清陽性度は、72歳未満で診断された52人についての胃ガン危険性の3.0倍(95％ C.I .=1.0〜9.3; p=0.057)の増加と関連していた。対照的に、診断時点で72歳以上であった51人については、関連は有意ではなかった(OR=1.3、95％ C.I.=0.5〜3.5) 。TagA血清陽性度は、進行期の腫瘍(３または４)を発症する危険性と関連していたが(OR=2.6、95％ C.I.=1.1〜6.2; p=0.03)、より早い期(１または２)とは関連していなかった(OR=1.0)。TagA血清陽性度と関連した胃ガン発症の危険性は、被験体を出生の順序または同胞群のサイズに従って階級化したときは増加しなかった。上記のOR値のいくつかは、保存的両側有意性分析を用いても統計的に有意ではないが、片側分析を用いると、すべてのガンおよび腸管型ガンとの関連は統計的有意性(それぞれp=0.04および0.028)に達することが示される。さらに、２つの群間での危険性における検出されない差異、アッセイの完全精度の欠如、およびこの感染に対する患者間応答の変動が、有意性を欠くことの説明の助けとなり得た。多重感染。２つのH.pylori株による同時の胃感染が、10〜13％の頻度で報告されており（ 14，15）、そして３つの異なる株による同時感染もまた観察されている（33）。最初の確認研究では、各患者から単一のコロニーのみが取り出されたので、多重感染について調査する機会はなかった。しかし、tagA^-株のみが単離された個人の30人の内の３人（10％）がTagAに対して高レベルの血清学的応答をしていたことは、これらの個人がtagA⁺株で同時感染されたことを示唆する。tagA^-指標株および第２のtagA⁺株による同時感染の組合せのみ（その逆ではない）が、コロニー試験と血清学的アッセイとの間で二分した結果を示し得たことから、このデータは、多重感染の頻度が以前に報告された頻度（これは少数のバイオプシーに基づく(4，15)）よりも実質的に高くあり得ることを示唆する。本実施例はさらに、H.pylori感染に関する非侵襲的血清学的アッセイの利用を支持する。なぜなら、それらは、本質的には胃全体をサンプリングする包括的なアッセイであることが示されているからである。対照的に、バイオプシーに基づく技術は、胃の粘膜の微細な画分（<<１％）のみをサンプリングする。TagAは免疫優性な抗原であるので（17）、血清学的アッセイは、tagA+生物による感染（たとえその数がtagA^-単離株と比較して少くても）を検出する能力を潜在的に有する。より攻撃的な腫瘍（診断されたときにより若い年齢、より末期）のサブセットとの関連、および基礎をなす仮説とこのデータとの一貫性は、TagA生物学の多数の事実によりさらに支持されるように、この作用が事実であることを示す。第１に、tagA⁺株による感染は、増強された上皮細胞の損傷（腫瘍形成を促進しているか、またはおそらく開始している胃の表面上皮細胞への損傷）と関連する（18 ,19）。第２に、cagA⁺株による感染は、より程度の高い胃の炎症と関連し（8，1 9）、そしてIL-1およびIL-8のような前炎症誘発性（pro-inflammatory）サイトカインの増強された発現と関連する（19，35）。これらは、上皮の損傷の一因となり得る。第３に、ほとんどのtagA⁺株はまた、液胞形成型サイトトキシン活性（vacuolating cytotoxin activity）を発現する（16，17）。血清中和抗体により評価されるサイトトキシンの発現は、胃ガンに関連し得る（36）。最後に、腸管型胃ガンは、拡散型の胃ガンよりも増大した炎症および萎縮性の胃炎に高度に関連する（37，38）。保存されたH.pylori抗原に対する高力価の抗体応答は、胃ガンの危険性に関連することが示されている（5，8）。この現象の１つの解釈は、高い抗体レベルは、炎症（活性な炎症は腫瘍形成事象の前兆であると考えられている）の程度についての指標であるということである（１）。胃ガンと抗TagA抗体レベルとの厳密な相関性の欠如は、過剰整合性（overmatching）を反映し得る。なぜなら、H.py loriに感染した個人のみが選択され、その個人全員がいくらかの程度の炎症を有したからである。いずれにせよ、これらの知見の重要性は、TagA陽性が、ガンを生じなかったH.pylori感染コントロールの78％において存在したという観察により加味されなければならない。従って、tagA⁺株での感染は、腫瘍形成のプロセスに関する因子として知られているが、腫瘍形成に対して、必要でも、十分でもない。ある株におけるtagAの存在は、それ自身が炎症または腫瘍形成プロセスに関連する隣接した遺伝子または特定の表現型に関するマーカーであり得る。それにも関わらず、本実施例は、特定のH.pylori株が、胃ガンの特異な危険性に関連することを示す。要旨。 tagA⁺株に感染したことが知られる個人の間に、広範な血清学的反応性が存在したが、非感染個人の反応性とは実質的に重なり合うことはなかった。抗菌治療法の不在下での数年にわたるこの結果の安定性は、本発明のTagAアッセイの有用性をさらに示す。 H.pyloriのtagA⁺株による感染を検出するための正確なアッセイを提供してきたが、本発明はまた、tagA⁺株による感染が、胃ガンの発生に関する危険因子であるという決定を許容した。tagA⁺株による感染は、tagA^-株による感染と比較して、引き続く21年間にわたって胃ガンが発生する危険性をほぼ倍加し、そしてこの作用は、腸管型の新生物を生じた個人においてより顕著であった。精製TagAおよびTagAの抗原性フラグメントを提供し、そしてTagAを発現する株による感染が胃ガンに対する素因を示すことを示してきたが、本発明の発見にはさらなる用途が存在し得る。本出願を通して種々の刊行物が引用される。これらの刊行物の開示は、本発明に関する技術分野の状況をより完全に記載するために、その全体が、本明細書により本出願中に参考として援用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＣＬＡ６１Ｋ 39/106 ＡＤＵ 39/106 ＡＤＵ 37/02 ＡＣＬ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ブラザー，マーティンジェイ. アメリカ合衆国テネシー 37205−2308, ナッシュビル，ダーデンプレイス 733 (72)発明者クリーンソウス，ハリーアメリカ合衆国マサチューセッツ 02139，ケンブリッジ，アルバニーストリート 230 (72)発明者ツムル，ムラリケイ．アール. アメリカ合衆国テネシー 37212，ナッシュビル，フェアファックスアベニュー 2121

Claims

【特許請求の範囲】１．約120〜128キロダルトンのHelicobacter pyloriの抗原またはその抗原性フラグメントをコードする単離された核酸であって、ここで該抗原は消化性潰瘍形成と関連している、単離された核酸。２．請求項１に記載の核酸を含有する、ベクター。３．前記核酸によりコードされるポリペプチドを発現するために適切な宿主中にある請求項２に記載のベクター。４．配列表の配列番号３で規定されるヌクレオチド配列に含まれるヌクレオチド1072から4614を含有する、請求項１に記載の核酸。５．配列表の配列番号１で規定されるヌクレオチド配列に含まれるヌクレオチド1072から3648を含有する、請求項１に記載の核酸。６．配列表の配列番号１で規定されるヌクレオチド配列に含まれるヌクレオチド1921から3648を含有する、請求項１に記載の核酸。７．ポリメラーゼ連鎖反応条件下で請求項４に記載の核酸と選択的にハイブリダイズする、単離された核酸。８．以下のストリンジェントさの条件下で請求項４に記載の核酸とハイブリダイズする、単離された核酸：６×SSC、0.5％ドデシル硫酸ナトリウム、５×Denhardt溶液を含有する緩衝液中で68℃、16時間； 0.5×SSC中の60℃での洗浄。９．請求項１に記載の核酸によりコードされる、精製された抗原性ポリペプチド。１０．前記ポリペプチドが、配列表の配列番号３で規定されるヌクレオチド配列に含まれるヌクレオチド1072から4614によりコードされるアミノ酸から本質的になる、請求項９に記載の抗原性ポリペプチド。１１．前記ポリペプチドが、配列表の配列番号１で規定されるヌクレオチド配列に含まれるヌクレオチド1072から3648によりコードされるアミノ酸から本質的になる、請求項９に記載の抗原性ポリペプチド。１２．前記ポリペプチドが、配列表の配列番号１で規定されるヌクレオチド配列に含まれるヌクレオチド1921から3648によりコードされるアミノ酸から本質的になる、請求項９に記載の抗原性ポリペプチド。１３．被験体において、120〜128キロダルトンの抗原を有するHelicobacter p ylori株の存在を検出する方法であって、以下の工程を包含する、方法：ａ．該被験体由来の抗体含有試料を、検出可能な量の請求項１０に記載のポリペプチドと接触させる工程；ｂ．該ポリペプチドと該抗体との結合を検出する工程であって、該反応はHe licobacter pylori株の存在を示す、工程。１４．被験体において、120〜128キロダルトンの抗原を有するHelicobacter p ylori株の存在を検出する方法であって、以下の工程を包含する、方法：ａ．該被験体由来の抗体含有試料を、検出可能な量の請求項１１に記載のポリペプチドと接触させる工程；ｂ．該ポリペプチドと該抗体との結合を検出する工程であって、該結合はHe licobacter pylori株の存在を示す、工程。１５．被験体において、120〜128キロダルトンの抗原を有するHelicobacter p ylori株の存在を検出する方法であって、以下の工程を包含する、方法：ａ．該被験体由来の抗体含有試料を、検出可能な量の請求項１２に記載のポリペプチドと接触させる工程；ｂ．該ポリペプチドと該抗体との結合を検出する工程であって、該結合はHe licobacter pylori株の存在を示す、工程。１６．被験体において、消化性潰瘍形成に対する素因を決定する方法であって、以下の工程を包含する、方法：ａ．該被験体由来の抗体含有試料を、検出可能な量の請求項１０に記載のポリペプチドと接触させる工程；ｂ．該ポリペプチドと該抗体との結合を検出する工程であって、該結合は該被験体の消化性潰瘍形成に対する素因を示す工程。１７．被験体において、消化性潰瘍形成に対する素因を決定する方法であって、以下の工程を包含する、方法：ａ．該被験体由来の抗体含有試料を、検出可能な量の請求項１１に記載のポリペプチドと接触させる工程；ｂ．該ポリペプチドと該抗体との結合を検出する工程であって、該結合は該被験体の消化性潰瘍形成に対する素因を示す工程。１８．被験体において、消化性潰瘍形成に対する素因を決定する方法であって、以下の工程を包含する、方法：ａ．該被験体由来の抗体含有試料を、検出可能な量の請求項１２に記載のポリペプチドと接触させる工程；ｂ．該ポリペプチドと該抗体との結合を検出する工程であって、該結合は該被験体の消化性潰瘍形成に対する素因を示す工程。１９．被験体において、胃ガンに対する素因を決定する方法であって、以下の工程を包含する、方法：ａ．該被験体由来の抗体含有試料を、検出可能な量の請求項１０に記載のポリペプチドと接触させる工程；およびｂ．該ポリペプチドと該抗体との結合を検出する工程であって、該結合は該被験体の胃ガンに対する素因を示す工程。２０．被験体において、胃ガンに対する素因を決定する方法であって、以下の工程を包含する、方法：ａ．該被験体由来の抗体含有試料を、検出可能な量の請求項１１に記載のポリペプチドと接触させる工程；およびｂ．該ポリペプチドと該抗体との結合を検出する工程であって、該結合は該被験体の胃ガンに対する素因を示す工程。２１．被験体において、胃ガンに対する素因を決定する方法であって、以下の工程を包含する、方法：ａ．該被験体由来の抗体含有試料を、検出可能な量の請求項１２に記載のポリペプチドと接触させる工程；およびｂ．該ポリペプチドと該抗体との結合を検出する工程であって、該結合は該被験体の胃ガンに対する素因を示す工程。２２．被験体において、消化性潰瘍形成に関連するHelicobacter pyloriの存在を検出する方法であって、請求項１に記載の核酸の存在を検出する工程を包含する、方法。２３．薬学的に受容可能なキャリア中にある、請求項９に記載のポリペプチド。２４．請求項１に記載の核酸の産物が非機能性とされる、Helicobacter pylor i変異株。２５．前記Helicobacter pyloriがアメリカンタイプカルチャーコレクションにATCC受託番号55359で寄託されている、請求項２４に記載のHelicobacter pylo ri株。２６．薬学的に受容可能なキャリア中にある、請求項２４に記載のHelicobact er pylori変異株。