JPH10509867A

JPH10509867A - ケル式血液型の遺伝子型決定のための診断法及びキット

Info

Publication number: JPH10509867A
Application number: JP8516237A
Authority: JP
Inventors: スーヒーリー; コルヴィンエルレッドマン
Original assignee: ザニューヨークブラッドセンターインコーポレイテッド
Priority date: 1994-11-10
Filing date: 1995-11-09
Publication date: 1998-09-29
Also published as: AU4235396A; EP1705255B1; EP1705255A3; DE69535023D1; ATE328113T1; DE69535023T2; EP0791076A1; EP0791076A4; EP1705255A2; EP0791076B1; WO1996015268A1; CA2204636A1; ATE513061T1; AU709728B2; CA2204636C

Abstract

(57)【要約】本発明は、ケル多型の分子的根拠を確定することにより、ケル遺伝子型を決定する診断法を提供する。特に本発明は、非常に正確で、従来の血清学的決定法に付随した問題点を克服している、K1/K2遺伝子型の決定法を提供する。本発明の診断法は、K1/K2核酸配列の増幅を使用することが好ましく、任意にK1-K2-に特異的な核酸配列の、制限酵素による区別して切断も使用する。更に本発明の方法のプローブ又はプライマーとして有用な核酸オリゴマーも、提供する。更に、ケル遺伝子型を決定するための診断用キットを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ケル式血液型の遺伝子型決定のための診断法及びキット発明の背景本発明は、ケル式血液型の遺伝子型を決定する方法に関する。更に詳細に述べると、本発明は、とりわけ、K1/K2、K6/K7、K10/K(-10)、及びK3/K4/K12の遺伝子型を決定する分子遺伝学的方法に関する。ケル式血液型システムは、周知であるが、20以上の異なる関連抗原を含む、血液抗原の複雑な群である。抗原K1（K、ケル）が、これらの23の公知の表現型の中で最も強力な免疫源であることは公知である。血清学的には、K1サブ遺伝子座は、高頻度抗原K2（K、セラノ(Cellano)）と対立遺伝子の関係がある。人口のおよそ９％が、K1赤血球表現型を有し、かつ不適合血液のシングルユニット(singl e unit)の輸血を受けたヒトの約５％において、K1に対する抗体が発現される（参照１）。新生児溶血性疾患(HDN)は、一般に、Rh(D)に対する母児同種異系免疫化に関連しているが、K1不適合性も、新生児において重篤な溶血性疾患を引き起こし得る (参照２〜７)。前回の妊娠によるK1感作は、その胎児がK1キャリヤである場合には、次回の妊娠時にHDN及び合併症を引き起こし得る。より稀なK2感作の場合にも、同様の問題が起こり得る。胎児のK1/K2遺伝子型の同定は、父親がK1/K2ヘテロ接合体である場合に特に重要である。母親は過去に感作されているので必ずホモ接合体であるので、K:1,2である父親を持つ胎児がHDNの危険性を伴う可能性は 50％である。この50％の危険率のために、このような妊娠における胎児のK1/K2 遺伝子型のホモ接合性またはヘテロ接合性を同定することは、それらを適切に管理する際の助けとするために重要になってくる。しかし、K1/K2以外のケル抗原に関して両親の遺伝子型を決定することも、妊娠の管理において意義があると考えることは重要である。ケル遺伝は、常染色体性及び相互優性であり、かつケルタンパク質の遺伝子(K EL)は、染色体7q33に位置している（参照８〜11）。ケル抗原は、高および低頻度の抗原を発現する対照をなす対になった対立遺伝子の５セットにコードされていることが明らかである。従って、K1(K)及びK2(K)は対立遺伝子の産物であり、K3(Kp^a)、K4(Kp^b)及びK21(Kp^c)；K6(Js^a)及びK7(Js^b)；K17及びK11；並びに K24及びK14も同様である。しかし、K12、K13、K18及びK22のようないくつかの高頻度抗原は、単独で発現される。ケル表現型の一部は、人種的又は民族的グループで分類される。例えば1958年に最初に報告されたK6は、アフリカ系アメリカ人においてより頻発し、シアトル（ワシントン州）で実施された研究においては、この群の19.5％までにおいて生じている（参照12）。同様にK10(Ul^a)は、フィンランド人において頻度が高い（参照13）。これらの様々な関係、及びこれらのケルシステムにおける位置は、情報の多い家系について血清学的に分析することによって、長年にわたって確立されている(参照14〜18)。分子クローニングを含む様々な研究は、ケル式血液型抗原が、赤血球細胞表面（参照26）に認められる93KDaのII型糖タンパク質（参照19〜25）上に保持されていることを証明している。このケルタンパク質は、短い、46個のアミノ酸であり、細胞質にN-末端ドメインがあり、かつ赤血球細胞の外側表面上に665個のアミノ酸からなる巨大なC-末端を有している。糖質は全て、N-結合型であり（参照 27）、おそらく、アスパラギンの93、115、191、345及び627の５部位に位置する。初期の生化学的研究では、ケル抗原は、立体配置がジスルフィド結合に大きく依存するようなタンパク質上に存在することが示唆されていた（参照28）。このケルタンパク質は、16個のシステイン残基を有し、１個は膜貫通領域にあり、及び15個は外側にある（参照25）。スルフヒドリル試薬による赤血球の還元は、ケル抗原の消失、及びいくつかの新たなエピトープ(neo-epitope)の露出をもたらす（参照28）。このケルタンパク質の抗原構造のマッピングも開始されている。最近開発された免疫学的試験法である、様々なケル抗原に対しモノクローナル抗体を使用する MAIEA法は、同定されたあるケル抗原が、その糖タンパク質の空間的に離れた領域に出現することを示している（参照26）。例えば、K1/K2、及びK6/K7ドメインは、互いに近接して出現する一方で、K3/K4エピトープは、異なる位置にあり、かつK18は更に別のタンパク質ドメインにある（参照29）。これまでのケル遺伝子型の決定は、ケル抗原の検出及び同定から導かれた推測の範囲に限られている。このような方法は、抗体、もしくはケルタンパク質又はその一部を識別し、かつこれらと相互作用するような他の化合物を利用している。例えば特定のケル抗原に特異的な各種抗体が、同定されている（参照13、22）。ケルタンパク質及び他の血液型抗原の凝集反応法が、米国特許第5,324,479号、第5,302,512号、第5,213,963号、第4,560,647号、第4,403,042号、第4,358,43 6号、及び第4,148,607号に開示されている。これらの方法は、発現されたタンパク質のプロフィールに関する情報をもたらすが、タンパク質の分子構造又は個々の分子遺伝学的構成(maKeup)に関する情報はもたらさない。ZelinsKiらは、マーカー遺伝子を用いる連鎖試験から、ケル遺伝子型を間接的に推定する方法を発表した（参照30）。しかしこのような方法は、ケル遺伝子型に関する限定的かつ間接的情報のみを提供する。更に一般にこれらの方法は、試験対象から血液試料を得ることが必要である。同じく胎児のケル表現型を決定するためには、胎児の血液試料が通常必要である。これは、胎児が出血しやすく、かつ死亡の可能性があるような、潜在的に危険な手技と関連している。これまでに発表された方法では、KEL遺伝子構造を基に、ケル遺伝子型を簡便かつ直接的に決定するような方法は明らかにされていない。その結果、ケル遺伝子型を安全かつ簡便に検出する方法が必要である。更に、血液試料採取の必要の無い、胎児におけるケル遺伝子型の決定法を提供することも所望である。羊膜細胞から採取したDNA試料を基にした試験は、臨床医に、胎児に害を及ぼすリスクをなくし、かつ抗ケル関連HDNの可能性をより正確に予測することをもたらすであろう。発明の要約本発明は、対象におけるケル式血液型の遺伝子型の鑑別決定のための診断法を提供する。この診断法は、ケル多型遺伝子座を含む核酸の供給源又は試料から、特有の核酸生成物を、ケル遺伝子型の特徴づけを可能にするのに十分な量生成することを含む。この方法は、１種以上のケル多型又はケル表現型に関して、ケル遺伝子型を決定するために使用することができる。好ましくはこの方法は、K1/K 2遺伝子型、K6/K7遺伝子型、K10/K(-10)遺伝子型、及び／又はK3/K4/K21遺伝子型を決定する、ケル多型遺伝子座を検出するように定められている。第一の好ましい実施態様において、本方法は下記の工程を含む：ケル多型の遺伝子座、好ましくは対象のゲノムDNAを含む核酸試料を選択的に切断し、１個以上の核酸断片を含む核酸生成物を、ケル遺伝子型の特徴づけに十分な量を提供する工程である。この方法は、K1/K2多型遺伝子座、K6/K7多型遺伝子座、K10/K(-1 0)多型遺伝子座、及びK3/K4/K21多型遺伝子座を含む核酸を、選択的に切断する工程を含むことが好ましい。 DNAの選択的切断は、該DNAをケル多型遺伝子座を基にして区別して切断する制限酵素による、試料核酸の消化によって達成される。いずれか適当な制限酵素を、所望のように使用することができる。K1/K2多型遺伝子座においては、好ましい制限酵素はBsmIである。K6/K7多型遺伝子座においては、好ましい制限酵素はM nlI及び／又はDdeIを含む。K10遺伝子型においては、好ましい制限酵素はAccIである。K3/K4/K21多型においては、好ましい制限酵素はNlaIII及び／又はPvuIIである。１種以上のケル多型性を識別することが所望である場合には、このような酵素の組合わせを使用することができる。この診断法は、好ましくは対象から得られたDNA試料から、ケルDNAを増幅することを含む。典型的にはこの増幅は、特異的ケル多型を決定する遺伝子座を含む核酸のみを増幅するようなプライマーを使用することを含む。プライマーは、K1 /K2多型遺伝子座、K6/K7多型遺伝子座、K10/K(-10)多型遺伝子座、及び／又はK3 /K4/K21多型遺伝子座を含む、特定のケル多型遺伝子座を含むDNAを、選択的に増幅するように選択することができる。制限酵素によるケル核酸の消化は、対象から得られた核酸を増幅した後に行うことが好ましいが、この消化をこのような増幅の前に行うこともできる。第二の好ましい実施態様において、本発明の診断法は、ケル多型遺伝子座を含む核酸試料を区別して増幅し、ケル遺伝子型の特徴づけに使用することができる核酸生成物を提供することを含む。ケル多型に関連した対立遺伝子セットの１個の特異的対立遺伝子をコードしている核酸を区別して増幅するようなプライマーによる増幅を可能にする鋳型として、この核酸試料を取扱うことが好ましい。プライマー又はプライマーセットを必要とする本発明の診断法において、これらのプライマー又はプライマーセットは、単一のプライマーを含むか、もしくは例えば多数のプライマー対を含むような、多数のプライマーを含むことができる。例えば好ましい態様において、本発明の方法は、K1 DNAを特異的に増幅するプライマー（K1対立遺伝子に特異的なプライマー）、K2 DNAを特異的に増幅するプライマー（K2対立遺伝子に特異的なプライマー）、及び各々K1及びK2 DNAの両方を増幅する２個のプライマー（対立遺伝子に非特異的なプライマー）を用いることができる。この態様においては、K1 DNA、K2 DNA、及びK1/K2 DNAに対応する、異なる大きさのPCR生成物が生成される。これらのPCR断片のパターンは、K1/K1 、K2/K2、及びK1/K2の遺伝子型間で異なる。プライマーには、K6遺伝子座及び／又はK7遺伝子座を含む核酸鋳型を、区別して増幅するものが含まれる。更にプライマーには、K10遺伝子座及び／又はK(-10 )遺伝子座を含む核酸鋳型を、区別して増幅するものが含まれる。同じくプライマーには、K3遺伝子座、K4遺伝子座、及び／又はK21遺伝子座に関連した核酸鋳型を、区別して増幅するものが含まれる。特に好ましい、K1を有する核酸に対し対立遺伝子が特異的であるオリゴヌクレオチドプライマーは、下記のヌクレオチド配列群から選択されたヌクレオチド配列を含む：ATA CTG ACT CAT CAG AAG TTT CAG CA(SEQ ID NO:1)、及びATA CTG A CT CAT CAG AAG TCT CAG CA(SEQ ID NO:2)、及びATA CTG ACT CAT CAG AAG TGT CAG CA(SEQ ID NO: )。特に好ましい、K2を有する核酸に対し対立遺伝子が特異的であるオリゴヌクレオチドプライマーは、下記のヌクレオチド配列である:TGG ACT TCC TTA AAC TTT AAC TGA AC(SEQ ID NO:3)。特に好ましい、K1及びK2を有する核酸に対し特異的である（しかし対立遺伝子は非特異的である）オリゴヌクレオチドプライマーは、下記のヌクレオチド配列群から選択されたヌクレオチド配列を含む：TTT AGT CCT CAC TCC CAT GCT TCC( SEQ ID NO:4)、及びTAT CAC ACA GGT GTC CTC TCT TCC(SEQ ID NO:5)、及びTTA GTC CTC ACT C-C CAT GCT TCC(SEQ ID NO: )、及びTCA CAC AGG TGT CCT CTC T TC C(SEQ ID NO: )である。これらのプライマーは、増幅のために対で使用することができる。特に好ましい、K6及びK7を有する核酸に対し特異的であるオリゴヌクレオチドプライマーは、下記のヌクレオチド配列群から選択されたヌクレオチド配列を含む：CTC ACC TAG GCA GCA CCA ACC CTA(SEQ ID NO: )、及びTTA CCT GGA GGG C AT GGT TGT CAC T(SEQ ID NO: )である。更に本発明の診断法は、好ましくは生成された核酸制限断片又は増幅生成物から情報を導くことを含む。好ましくは、この情報の誘導は、核酸生成物を分離し、ケル遺伝子型を特徴づける特異的情報をもたらす断片のパターンを提供することを含む。更に好ましくは、この分離は、K1/K2遺伝子型、K6/K7遺伝子型、K10/ K(-10)遺伝子型、及び／又はK3/K4/K21遺伝子型を特徴づける特異的情報を提供するような核酸生成物のパターンをもたらす。更に、ケル核酸生成物の一部又は全てを、例えば１種以上の生成物の印付け又は染色によって検出することが好ましい。生成物は、非特異的マーカー物質によって印付けることができる。このような物質は、それらの分離パターンを基にそれらの識別を可能にするために、該生成物の一部又はすべてを染色するように使用することができる。代わりにこの検出工程は、１種以上のケル核酸生成物を、選択的又は特異的形式で、１種以上のハイブリダイゼーションプローブで印付ける工程を含むことができる。好ましくはハイブリダイゼーションプローブ（複数）は、K1遺伝子座又はK2遺伝子座のような、興味深いケル多型遺伝子座を含む１種以上の核酸生成物を、特異的に印付けするものが使用される。本発明の分子遺伝学的方法は、一般に、ヒト対象又は患者から採取した生物学的試料から、核酸、好ましくはゲノムDNAを得ることを伴う。典型的には血液試料が好ましいが、赤芽球組織を含む他種の組織試料も有用である。特に好ましい実施態様において、本発明は、胎児におけるK1/K2ケル式血液型の遺伝子型の決定法を提供する。この実施態様において、好ましい組織試料は、羊水又は漿膜絨毛の試料を含む。本発明は更に、ケルのゲノムDNA、mRNA又はcDNAのような、ケルをベースにした核酸の多型領域と少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を有する、ケルをベースにした核酸オリゴマーを提供する。特に本発明は、K1 DNAと実質的に相補的である核酸配列を有する核酸オリゴマーに加え、K2 DNAと実質的に相補的である核酸配列を有するオリゴマーを提供する。好ましくは、本発明のオリゴマーは、興味深い領域に対し完全に相補的である。更に、本発明は、ケルのゲノムDNA、mRNA、又はcDNAのような、ケルをベースにした核酸の多型領域と実質的に相同である核酸配列を有する核酸オリゴマーを提供する。特に本発明は、K1 DNAと実質的に相同である核酸配列を有する核酸オリゴマーに加え、実質的にK2 DNAと相同である核酸配列を有するオリゴマーを提供する。本発明のこれらのオリゴマー類は、ケルをベースにした核酸の標的部分と、少なくとも一部が完全に相同であるような核酸配列を含むことが好ましい。本発明の核酸オリゴマーは、標的核酸配列の存在を、このような標的配列との結合又はハイブダイズによって同定するための、ハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。従って、これらの核酸オリゴマーは、蛍光標識物、高電子密度物質、レポーター部分、特異的又は非特異的結合部分、もしくは当該技術分野で公知である他の検出可能な部分のような、検出可能なマーカー部分との結合によって、検出可能であるように標識される。本発明のオリゴマーは、任意に、更に標的核酸配列と架橋結合することが可能であるような反応基を含むことができる。その上本発明のオリゴマーは、そのオリゴマーを固定するために、例えばゲル又は樹脂などの支持体物質と結合することができる。本発明のオリゴマーは、ケル多型遺伝子座を含むケル核酸領域と、特異的に結合するか、もしくはその延長を引き起こすような、増幅プライマーとしても使用することができる。好ましいプライマーは、K1/K2遺伝子座、K6/K7遺伝子座、K1 0/K(-10)遺伝子座、及び／又はK3/K4/K21遺伝子座を含むケル核酸と結合するか、もしくはその延長を引き起こす。更に、K1/K2多型を特徴づけている遺伝子座の同定は、該ケルタンパク質のK1 ドメイン又はK2ドメインに対し実質的に相同であるようなアミノ酸配列を含むケルをベースにしたポリペプチドの調製を可能にしている。これらのポリペプチドは、天然の原料から誘導されかつ実質的に精製されるか、もしくは所望の実質的に純粋な形状に合成される。このようなポリペプチドは、同じく検出可能であるように標識され、反応基に付着され、かつ当該技術分野において公知の方法で支持体に結合される。本発明のポリペプチドは、例えば対象又は患者における同種異系免疫化を検出するためのプローブとして有用である。このようなアッセイにおいて、該ポリペプチドは、K1抗原と実質的に相同であり、かつ抗K1抗体と特異的に反応することが可能な免疫学的プロフィールを示すアミノ酸配列を含むことができる。従って別の実施態様において、本発明は、ケル抗原、好ましくはK1抗原に対する患者の同種異系免疫化を検出する診断法を提供する。この実施態様において、この方法は、患者又は対象から血液試料を採取すること、及びポリペプチドプローブで、該試料の免疫反応性のパラメーターを測定することを含む。このポリペプチドプローブは、ケルタンパク質のK1/K2ドメインと実質的に相同であるアミノ酸配列を含むことが好ましい。更にこのポリペプチドプローブは、該試料中に存在する抗K1抗体と特異的に反応することが望ましい。本発明は更に、K6、K10 に加え、K3及びK21を含む、他のケル抗原に対する、対象の同種異系免疫化の検出のための類似の方法を可能にする。別の実施態様においては、患者の組織試料中のケル式血液型の遺伝子型を決定するための診断用キットが提供される。この実施態様において、本発明は、例えばK1及びK2に特異的な配列のような、標的核酸配列を検出することによって、ケル式血液型の遺伝子型を決定するための診断キットを提供する。このキットは、増幅プライマー、すなわちK1及びK2に特異的な配列と結合するか、もしくはその延長を引き起こすようなオリゴヌクレオチドを含んでいる。更にこのin vitro用キットは、多数のウェルを備え、K1及びK2標的配列に対し実質的に相補的な核酸配列を有するオリゴヌクレオチド捕獲(capture)プローブが結合されている微量滴定プレートのような、容器を備えている。あるいは本発明は、K1及びK2のような、特定のケル抗原に特異的な標的核酸配列を検出することによって、ケル式血液型遺伝子型を決定する診断キットを提供する。この実施態様において、キットは下記を備えている： (a) 第一のPCRプライマーは、K1に特異的な配列に結合するか又は延長を引き起こすようなオリゴヌクレオチドであり、かつ第二のPCRプライマーは、K2に特異的な配列に結合するか又は延長を引き起こすようなオリゴヌクレオチドであるような、第一及び第二のPCRプライマーを含むプライマーセット；及び (b) 多数のウェルを有し、該標的配列と実質的に相補的な核酸配列を有するオリゴヌクレオチド捕獲プローブが結合されている微量滴定プレートのような容器である。本発明は更に、ケル核酸配列を運搬する組換え発現ベクターを提供する。本発明は、ケル多型部位をコードしているタンパク質の一部を含むケルタンパク質の少なくとも一部をコードしている核酸配列を含む発現ベクターを提供する。特に本発明は、その細胞表面にK1タンパク質を発現するような形質転換細胞又は形質転換体を産生するために、細胞に形質転換をもたらすK1 cDNAを運搬する発現ベクターを提供する。ベクター類は、K6 cDNAを運搬するベクター、並びにK3又はK 21 cDNAを運搬するベクターも提供され、それぞれ、細胞を形質転換し、K6、並びにK3及びK21を発現する。更に本発明は、修飾され（すなわち形質転換され）、その細胞表面にタンパク質を発現するような安定した細胞系に加え、このようなタンパク質を発現するための細胞系の形質転換法を提供する。K1の発現については、このようなタンパク質は、好ましくは少なくともK1ドメインを含み、更に好ましくはこのタンパク質はK1タンパク質である。同様にK6、並びにK3及びK21 の発現については、発現されたタンパク質は、好ましくはそれぞれ、K6、並びに K3及びK21ドメインを含み；更に好ましくは、これらのタンパク質は、それぞれ、K6、K3又はK21タンパク質である。本発明は更に、本発明に従って産生された形質転換細胞系によって発現されたケル抗原に対する少なくとも１種の抗体の生成を含むことにより、ケル抗原に特異的な抗体の調製法を提供する。この抗体は、ポリクローナル抗体が意図されているが、モノクローナル抗体又はその抗原結合領域のような、単一の特異性であることが好ましい。従って、本発明の結果として今回、患者のケル遺伝子型の鑑別決定のための安全かつ簡便な診断法が提供された。特に、血液試料を採取する必要のない、子宮内胎児のケル遺伝子型を決定する方法が提供されている。羊水から得られたDNA 由来の、ケル遺伝子型、特にK1/K2遺伝子型の決定を基本とした試験は、臨床医に、被験胎児の危険性の低下をもたらす。更に、この新規診断法は、新生児の抗 -K-に関連した溶血性疾患の可能性の正確な予測を可能にする。本発明のこれら及び他の利点は、本願明細書において述べられている詳細な説明及び実施例によって理解されるであろう。これらの詳細な説明及び実施例は、本発明の理解を助けるが、本発明の範囲の限定を意図するものではない。図面の簡単な説明本発明の好ましい実施態様は、具体化及び説明を目的として選択されているが、あらゆる点で本発明の範囲の限定を意図するものではない。本発明のある態様の好ましい実施態様を、下記の添付図面に示す：図１は、ケルエクソンの遺伝子座を示すケル遺伝子地図、及びエクソンの位置を確定するために使用されたクローン間の関係、更には該ケル遺伝子の制限部位を示す。図2A-2Dは、該ケル遺伝子のエクソンのヌクレオチド配列を示す。図３は、該ケル遺伝子の5'フランキング領域及びエクソン１を示す。図４は、該ケル遺伝子の5'フランキング領域のプロモーター活性を図示するオートラジオグラムを示す。図５は、該遺伝子の各種クローンから選られたケル遺伝子の3'末端の比較を示す。図６は、該ケル遺伝子の特異的断片に対応する増幅されたDNAの区別的分離を図示している、臭化エチジウム／アガロースゲルを示す。図７は、K1 DNA及びK2 DNAの対応する部分の比較を示す。図８は、本発明の方法に従った、K1 DNA及びK2 DNAに対応する増幅されたDNA の区別的分離を図示している、臭化エチジウム／アガロースゲルを示す。図９は、本発明の方法に従って得られたPCR生成物の、臭化エチジウム／アガロースゲル電気泳動による分析を示す。図10は、K6 DNA及びK7 DNAの対応する部分の比較を示す。図11は、本発明の方法に従って得られたK6/K7 PCR生成物の、臭化エチジウム／アガロースゲル電気泳動による分析を示す。図12は、本発明の方法に従って得られたK6/K7 PCR生成物の、臭化エチジウム／アガロースゲル電気泳動による分析を示す。図13は、K10 DNA及びK(-10)DNAの対応する部分の比較を示す。図14は、K3 DNA、K4 DNA、及びK21 DNAの対応する部分の比較を示す。発明の詳細な説明ケル式血液型システムは、その抗原性の複雑さによって特徴づけられる（参照 18）。異なる20以上の抗原が、ケルシステムによるものとされている。これらの抗原の大部分は、独立に発現される他のケル抗原と共に、高及び低頻度抗原の５種の対照をなすセットに編成されている。この抗原の多様性の分子的根拠については、これまで理解されてはいない。本発明では、KEL遺伝子の構造及びその19 種のエクソンの境界を説明し、各種ケル表現型の分子的特徴付けを可能にした。各種ケル表現型の分子的根拠は、これまで確立されていない。KEL遺伝子の構造が研究され、かつケルタンパク質をコードしている19種のエクソンが始めて同定されたことで、今回は、ケル遺伝子型の多型性の分子的根拠が確立された。特にK1/K2多型性及びその遺伝子座は、K1/K1 DNAのエクソンを配列決定し、これをK2/K2配列と比較することによって決定されている。予想外のこととして、K 1遺伝子型のエクソン６における塩基置換が、アミノ酸の変更を予期することがわかった。更にこの塩基置換は、40以上の異なる試料を試験する際に使用されるような制限酵素切断部位を形成し、この塩基置換が、K1遺伝子型を同定するということを確認した。該ケル抗原群の別のものであるK6（Js^aとしても公知である）は、高頻度K7抗原と対立遺伝子の関係にある、低頻度赤血球抗原である。K6は、全人口の1.0％未満に出現するが、アフリカ系アメリカ人の19.5％もが、K6抗原キャリアである。我々は、今回、K:6,-7であるヒトのケル遺伝子(KEL)の19種のエクソンを配列決定することによって、K6/K7多型における多型の分子的根拠を決定した。K:6,- 7 DNAから得られた配列を、K:6,7 DNAの配列と比較することで、エクソン17に、ロイシンからプロリンへのアミノ酸の変更を予期させるような、予想外の塩基置換が示された。この塩基の変化は、制限酵素切断部位の欠失も生じる。K7における別の塩基の変更は、発現されたタンパク質に変化を生じないサイレント(silen t)であるが、これはK6/K7遺伝子型を識別するために利用することができる、別の制限酵素切断部位の欠失を生じる。 K10（Ul^a）抗原は、対応する血清学的に検出可能な高頻度抗原がない、低頻度ケル抗原である。従って、野生型表現型（ここではK(-10)と称す）は、K10抗原の欠損によって特徴づけられる。今回エクソン13において、K10多型残基の分子的根拠が決定された。nt 1601での点突然変異は、グルタミン酸からバリンへのアミノ酸の変更が予測されることがわかった。この塩基の変更は、同様に本発明に従ってK10遺伝子型を決定するために使用することができる、新たな制限酵素切断部位を生じる。別のケル遺伝子型の対照をなす対立遺伝子のセットは、K3/K4/K21(Kp^a/Kp^b/Kp^c )セットである。KEL遺伝子に関する我々の研究では、意外にもこのセットの３種の対立遺伝子を、エクソン８における２個の隣接するヌクレオチドの変更を基にして識別することができ、これらは各々、該ケルタンパク質のアミノ酸配列の同位置での、個別のアミノ酸の変更を予測することを明らかにした。更にこれらの塩基変更は、各々、該遺伝子において、新規かつ個別の制限酵素切断部位を生じる。最も認められるケル表現型は、K:-1,2,-3,4,-6,7,9,11,12,14,18,19,22である。今回我々は、一般的ケル表現型を有するヒトのKEL遺伝子の19種のエクソンを定義した。ケル多型の分子的根拠を決定するために、我々は、ケルの19種のエクソンを増幅すると思われる一連のプライマーを設計した。その後我々は、高及び低頻度抗原の様々な組合わせを発現している複数のヒトのDNA配列を比較し、抗原発現において認められた変異に関連している可能性がある配列の変異を決定した。例えば我々は、K1/K1及びK2/K2 DNAのDNA配列を比較した。異なるアミノ酸をコードしていると思われる単なる塩基の変更が、エクソン６において認められ、共通の(consensus)N-グリコシル化部分で、スレオニンからメチオニンへと変更していた(Asn．X.Thr→Met)。この変更は、この部位でのN-結合型グリコシル化を妨げるであろう。一般的表現型のケルタンパク質のアミノ酸配列を基に、６種の可能性のあるN-グリコシル化部位、すなわちアスパラギン残基93,115,191,345 ,627及び724が示された。しかし742位のアスパラギンは、これがAsn.Pro.Ser.配列の一部であり、かつアスパラギン及びセリン／スレオニン間のプロリンの存在が、N-グシコシル化を阻害する（参照31）ために、おそらくグリコシル化されないであろう。いずれの場合においても、193位のスレオニンからメチオニンへの変更は、アスパラギン191のグリコシル化を阻害するであろう。従って、K1タンパク質は、５個の糖部分の代わりに、多くても４個で構成されるであろう。糖側鎖の欠如は、免疫原性を生じるタンパク質の異なる部位を露出し得る。赤血球表面タンパク質におけるグリコシル化の欠損は、血液型表現型の変更をもたらすことができる。WebbグリコホリンC変異体も、N-グリカンが欠如している（参照3 2〜33）。エクソン６におけるCからTへの点突然変異も、新たな制限酵素切断部位で、周知の制限エンドヌクレアーゼであるBsmIによって切断される、5'-GAATGCT-3'を生じることも今回わかった。制限酵素による消化を用いて、K1/K1及びK2/K2ホモ接合体、並びにK1/K2ヘテロ接合体の識別を可能にし、診断用遺伝子型操作の開発をもたらす。理論的にまとめることは欲しないが、非常に稀に、ケル抗原を全く発現しない赤血球細胞が認められることは、公知である。K₀(null)として公知の表現型において、該赤血球細胞は、その細胞膜上に全くケルタンパク質を有さないことが明らかである。しかし我々の実験室での予備実験では、K₀であるヒト２名が、末梢血中にケルのmRNAを有していること、並びにこの開始ATGコドンからポリA鎖までのmRNAの配列は、一般的ケル表現型を有するヒトから得られたmRNAと同一であることを示している。これは、K2及び一部K₀のヒトの19種のエクソンの塩基配列が同一であることを指摘している。従って、エクソン６のPCR増幅、及びBsmI処理による遺伝子型決定は、K₀のヒトのK2遺伝子型を示すことができる。血清学的分析は、容易にK₀ホモ接合体は検出するが、K₀ヘテロ接合体は、K2又はK1として血清学的には同定されず、かつBamI分析は、更なる分離をもたらさない。おそらく同様のことが、全てのケル関連抗原の発現が弱められるような、Kmod表現型においても生じるであろう。それにもかかわらず、K₀及びKmod表現型は非常に稀であるので、実用を目的とした場合の、このようなあいまいな表現型の臨床的意義は少ない。K₀ヘテロ接合体は、表現型としてのものであり、従って臨床的にはK1又はK2ホモ接合体と同等である。K1に感作された妊娠において一般に重要なことは、胎児がK1のキャリアであるかどうかを確認することである。本発明の方法は、 K1遺伝子の同定を含む、ケル遺伝子型の同定を可能にする。更に我々は、今回、K:6,-7であるヒトのケル遺伝子(KEL)の19種のエクソンを配列決定することによって、K6/K7の対立遺伝子のセットの多型性（“K6/K7多型 ”）の分子的根拠を決定した。K:6,-7 DNAから得られた配列を、K:6,7 DNAのものと比較すると、エクソン17のnt 1910での、TからCへの塩基置換が示され、これはK7のロイシンからK6のプロリンへのアミノ酸の変更が予期された。nt 191 0でのTからCへの置換は、K7において認められるMnlIの制限酵素切断部位を除外した。111個の塩基対である、TからCへの置換に及ぶエクソン17のPCR-増幅生成物の分析は、MnlIによって行った。K6表現型を有する８名の血縁関係のないヒトについて試験したところ、全員、nt 1910でのTからCへの置換を有していた。エクソン17におけるnt 2019でのAからGへの別の塩基置換も認められたが、この点突然変異は、異なるアミノ酸はコードしていなかった。それにもかかわらずこの置換は、新たなDdeI制限酵素切断部位を生じることがわかった。従って、これらの塩基置換は、本発明でK7からK6を識別するための診断的方法をもたらす。 K3/K4/K21多型の分子的根拠も特徴づけられている。単一コドンにおける個別の２個の変化が、K4から、K3又はK21のいずれかへのタンパク質発現の変化に関連していることがわかった。更に同様の変化が、野生型K4核酸と異なるように、 K3及びK21核酸を特異的に特徴づける新規かつ独特な制限酵素切断部位をコードしている。K3の場合は、C 961 T置換が、Arg 281 Glnの変更をもたらす。この塩基置換は、同じく新たなNlaIII制限酵素切断部位を形成する。K21の場合は、G 9 62 A置換が、Arg 281 Glnをコードしている。この置換も、新たなPvuII制限酵素切断部位を生じる。従って、K3及びK21遺伝子型からK4遺伝子型を識別することは、本発明の診断法を利用することによって可能である。本願明細書において本発明をより明確かつ正確に説明するために、特定の技術用語に関する取り決めが、下記の考察において採用される。これらの取り決めは、本発明の説明を補助するための実際的意味を提供することを意図しているが、限定を意図するものではなく、かつ当業者は、その他及び追加の解釈も含み得ることを理解するであろう。本願明細書において使用される、用語“制限酵素断片長多型”又は“RFLP”とは、該ゲノム全体に無作為に分布されていて、かつゲノムDNAの消化により、異なる個人について、異なる制限エンドヌクレアーゼパターンを形成するようなDN Aヌクレオチド配列の差異を意味する。加えて“制限部位”とは、制限酵素が核酸を切断する核酸部位を意味する。制限酵素による核酸の切断は、“制限断片 ”と称される核酸の小片を産生する。突然変異又は対立性の結果、制限部位が得られるかもしくは失われる場合には、この制限断片パターンは変動し、その部位に関する情報をもたらす。 “多型性”又は“DNA多型”は、特定のDNA配列の２種以上の変異が、同じ品種 (interbreeding)集団の中に共存する状態を意味する。多型性の差異は、点突然変異、遺伝子再編成又は可変スプライシングに起因し得るアミノ酸配列の差異によって生じる。“対立遺伝子”は、互いに多型性変異体であり、かつそのゲノム内の所定の遺伝子座に一方ずつ生じるような遺伝子である。ケルタンパク質をコードしている遺伝子は、“ケル遺伝子”と称される。ケルタンパク質の特異的ドメインをコードしているケル遺伝子の領域は、“ケル遺伝子座”と称される。例えば、本発明の結果、K1抗原及びK2抗原が、ケル遺伝子の対立遺伝子によってコードされていることが確認されている。更に詳細に述べると、K1抗原及びK2抗原は、ケルタンパク質の同一ドメインの別の型であり、ここでは単一のアミノ酸置換が認められ、K1抗原を含むケルタンパク質及びK2抗原を含むケルタンパク質の間の差異を生じる。今回この単一のアミノ酸置換は、ケル遺伝子の単一のヌクレオチド置換から生じることがわかった。従って、このヌクレオチド変異部位を含むケル遺伝子部分は、“K1/K2遺伝子座”と称される。このK1/K2遺伝子座がK1抗原をコードしている場合には、このケル遺伝子の領域は、“K1遺伝子座”と称される。このK1/K2遺伝子座がK2抗原をコードしている場合には、ケル遺伝子のこの領域は“K2遺伝子座”と称される。K1/K2遺伝子座は、“K1/K2多型”、すなわちK1及びK2抗原間に認められた表現型の差異を、決定するかもしくは特徴づけるような部位又は遺伝子座とも称される。同様に他のケル遺伝子座は、K6/K7、K10/K(-10)、及びK3/K4/K21多型のような、他のケル多型を決定するかもしくは特徴づける。本発明の目的については、興味深い特定のドメインを含むケルタンパク質は、該タンパク質の他のドメインとは関わりなく、そのドメインで示され得る。従って、ケルタンパク質がK1抗原の原因となるドメインを含む場合は、このタンパク質は、“K1タンパク質”と称されるのに対し、K2抗原又はK2ドメインを含むケルタンパク質は、“K2タンパク質”と称される。同様の分析を用いて、K1タンパク質をコードしているDNAは、該DNAが更に他のケルドメインをコードしているかどうかに関わりなく“K1 DNA”と称される一方で、K2タンパク質をコードしている DNAは、“K2 DNA”と称される。同様に、他のケル関連の又はケルベースの染色体DNA（エクソン及びイントロン、並びにそれらの一部を含む）、核酸鋳型、核酸転写物、更にはcDNAも、状況又は用途に応じて、同様に、K1/K2、K1、又はK2 と称されることが理解される。同様の考察が、K6/K7、K10、及びK3/K4/K21抗原のような、このケルシステムの他の抗原の状況においても適用される。本発明の結果として、ケル遺伝子の多型を検出するために使用することができる核酸オリゴマー又はオリゴヌクレオチドを含む、プローブ及び／又はプライマーを設計することが可能である。この目的に適したプローブ又はプライマーは、ヌクレオチド配列の点突然変異が、多型を特徴とするケル遺伝子産物の変化をもたらすような部位又は領域を含むケル遺伝子の領域を、区別してハブリダイズするか、もしくはこれに対し特異的である。従って、これらのプローブ又はプライマーは、より高頻度の対立遺伝子とハイブリダイズするものに加え、より低頻度の対立遺伝子とハイブリダイズするものを含む。特定の用途において、ヘテロ接合性の存在を明示することが望ましい。このような場合、２種以上の対立遺伝子及び／又は遺伝子座を区別して検出することが可能であるような、プローブ又はプライマーの組合わせが有用であることがわかっている。例えば本発明のプローブは、これがケルDNAの限定された領域を特異的に認識するならば、ケルDNAと結合するか、もしくはハイブリダイズするということができる。プローブが、K1 DNAとハイブリダイズすると考えられる“K1プローブ” のような、特異的対立遺伝子とハイブリダイズするといわれる場合には、より正確さが求められる。本発明のプライマーは、ケルDNAの限定された領域と結合するか、もしくはその延長を引き起こす場合には、ケルDNAを特異的に増幅するということができる。従って、プライマーがK1/K2遺伝子座を含む領域を区別して増幅する場合には、プライマーは、K1/K2 DNAを特異的に増幅する。従って、K1/K2プライマーは、 K1/K2遺伝子座を含むDNAを増幅するが、K1 DNA及びK2 DNAの両方を、非選択的に増幅する。他方で、プライマーが、K1 DNAのような対立遺伝子に関連したDN Aのみを特異的に増幅する場合は、K1のような、特定の対立遺伝子に対し特異的である（K1プライマー）一方で、K2に特異的なプライマー（K2プライマー）は、 K2 DNAのみを特異的に増幅する。同様の考察を、該ケルシステムの他の多型にも適用する。プローブは、単一のヌクレオチド修飾のみによって区別する、２種の対立遺伝子を区別することが可能であることが特に好ましい。プローブ及びプライマーを選択的に構成することにより、並びにハイブリダイゼーション又は他の実験条件を調節することにより、ハイブリダイゼーションの特異性を制御することが可能であることは、当該技術分野において公知である。しかし、いくらか低い選択性でハイブリダイズするプローブを使用することが望ましいような状況もある。従ってこれは、本発明のプローブ又はプライマーが、特有のケル配列に対して“実質的に相補的”といわれるような特定の状況の範囲内である。高度の正確さが必要な状況においては、プローブ又はプライマーは、オリゴマーが特異的標的配列以外の配列と結合する可能性が非常に低い場合にのみ、標的配列と実質的に相補的である。別の状況においては、プローブ又はプライマーは、独自のハイブリダイゼーションの確率が実質的に1.0未満である場合に、標的配列に対して実質的に相補的であると考えられる。従って、本発明のプローブ又はプライマーは、該方法のパラメーターの必要なストリンジェンシーに応じて、標的領域に対して、それが完全に相補的であるか、もしくはわずかに部分的に相補的であるような場合に、標的領域に対して“実質的に相補的”であり得る。従って、本発明は、前述のケル遺伝子座の一部又は全てとハイブリダイズするようなプローブ及びプライマーを提供する。このようなプローブは、ケル遺伝子又はその転写物の特徴づけが所望である場合に有用である。更に本発明は、染色体DNAのケル遺伝子座中の１個以上のイントロンの一部又は全てを含む、プローブ及びプライマーを提供する。このようなプローブは、ケル遺伝子それ自身が特徴づけられることが望ましく、かつに特定の個人の遺伝子構造に関して更なる情報が得られることが望ましい場合に、有用である。本発明のプローブ又はプライマーは、更にそのヌクレオチド配列の一部として、標的配列に隣接又は近傍のあらゆる領域に対し、実質的に相補的でない領域も含む。従って、本発明のプローブ又はプライマーのいずれかにおいて、プローブ又はプライマーの少なくとも一部は、該標的セグメントに対し実質的に相補的である。 “増幅”は、鋳型核酸配列を、指数的に増幅することによって、微量の特定の核酸配列を検出する、いずれかの分子生物学的方法を意味する。DNA及びRNAの増幅、並びにDNAから増幅されたRNAの生成、又はその逆の生成に関する技術は、公知である。特に、増幅技術は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、及びリガーゼ連鎖反応(LCR)のような技術を含む。PCRは、高感度の技術として公知であり、かつ広範に使用されている。LCRは、非常に特異的であることが公知であり、点突然変異を検出することが可能である。ある環境においては、検出精度を改善するために、これら２種の技術を組合わせることが望ましい。PCRは、周知の技術であり、かつ例えばInnisらの論文（参照34）に記載されている。LCRは、より最近に開発されたものであり、Landegrenらの論文（参照35）及びBaranyらの論文（参照3 6）に記載されている。LCRキットは、ストラータジーン社から入手可能である。他の増幅技術を、本発明の方法に従って使用することも期待される。 “プライマー”は、天然、クローン化された、又は合成されたかのいずれかのオリゴヌクレオチドを意味し、これは、増幅技術により、標的又は鋳型の核酸配列を指数的に増幅するために、核酸合成を開始することが可能である。PCRに関しては、プライマーは、核酸鎖に対し相補的なプライマー延長生成物の合成が誘導される、すなわち適当なバッファー及び適温で、４種の異なるヌクレオシド三リン酸及び重合開始剤（すなわちDNAポリメラーゼ又は逆転写酵素）が存在するような条件下で、DNA合成の開始点として作用する。LCRに関しては、プライマーは、標的核酸へのアニーリング及び隣接プライマーへの結合により、増幅の鋳型として利用することが可能である。更にLCRの目的については、該プライマーは一般に、一本鎖標的分子へにアニーリングし、及びそれらを互いに結合することができるような、隣接する相補的オリゴヌクレオチドの１対のセットを含む。DN AのLCR増幅については、プライマーは、隣接する相補的オリゴヌクレオチドを２セット含む。プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドであることが好ましく、かつ増幅において最大の効果を挙げるためには一本鎖であるが、二本鎖であることもできる。プライマーが二本鎖である場合には、延長生成物を調製するために使用する以前に、これを最初に処理して、その鎖を解離する。典型的には、LCRプライマーは、二本鎖である。プライマーの正確な長さは、多くの因子によって決まるが、通常は15〜25個の範囲のヌクレオシドである。短いプライマー分子では一般に、該鋳型との十分に安定したハイブリッド複合体を形成するために、比較的低い温度が求められる。プライマーは、該鋳型の配列を正確に反映する必要はないが、鋳型とのハイブリダイズに十分な程に相補的でなければならない。該プライマーに組込まれることができる相補的でない配列の例は、制限酵素認識部位をコードしている配列である（米国特許第4,800,159号参照）。本願明細書において使用された“プライマー”は、特に増幅される標的領域の一方又は両方の末端に関する情報が、いくらか不明確である場合には、１種以上のプライマーを意味する。例えば、核酸配列が、タンパク質配列から推定された場合には、操作可能な“プライマー”は、実際には遺伝暗号の縮重をもとにした、可能なコドンの変異の一部又は全てを表す配列を含むプライマーオリゴヌクレオチドの集合体を含んでいる。この集合体の中の１個のプライマーオリゴヌクレオチドは、該標的配列の末端と相同であろう。同様に“保存された”領域が、集団の中の多型の顕著なレベルを示すならば、近隣配列を増幅するようなプライマーの混合物が調製される。本発明のプライマー又はプローブは、所望であるならば、分光分析的、光化学的、生化学的、免疫学的、又は化学的手段によって検出可能な標識物を組込むことによって、標識することができる。例えば有用な標識物は、³²P、蛍光染料、高電子密度試薬、酵素のようなリポーター分子（ELISAにおいて一般的に使用される）、ビオチン、もしくは抗血清又はモノクローナル抗体が入手できるようなハプテン又はタンパク質である。標識物は、プライマーの“捕獲体”として使用することもでき、その結果プライマー又は増幅されたDNAのいずれかの、固形支持体上での固定化が容易になる。 “オリゴヌクレオチド”又は“核酸オリゴマー”は、プライマー、プローブ、検出される核酸断片、核酸制御剤、及び非標識のブロックオリゴマーを意味し、かつ２個以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドからなる分子と定義される。本発明の核酸オリゴマーは、デオキシリボ核酸(DNA)又はリボ核酸( RNA)の一本鎖オリゴマーであってよい。オリゴヌクレオチドの正確な大きさは、多くの因子、及び該オリゴヌクレオチドの最終的な機能又は用途によって決まるであろう。このオリゴデオキシリボヌクレオチド及びオリゴリボヌクレオチドは、天然の材料から、公知の方法によって得るか、もしくは誘導することができる。代わりに、このオリゴヌクレオチドを、当該技術分野において公知の方法で、合成的に生成することもできる。このような方法は、例えば、適当な配列のクローニング及び切断、並びにNarangらのホスホトリエステル法（参照37）；Brown らのホスホジエステル法（参照38）；Beaucageらのジエチルホスホラミジテ法（参照39）；及び米国特許第4,458,066号の固形支持体法のような方法による直接的化学合成を含む。これらのオリゴマーは、遺伝子型決定法への人工物の混入を避けるために、少なくとも実質的に精製されることが好ましい。更に本発明は、ケル遺伝子に関連したかもしくは由来した遺伝物質の、一部又は全てに対し、構造的に相同であるオリゴヌクレオチドを提供する。オリゴマーが、そのヌクレオチド配列が変動するにもかかわらず、表現型が比較されるアミノ酸配列と同一であるようなアミノ酸配列をコードする場合には、他方に対しこのオリゴマーは”実質的に相同である”といわれる。従って発現の際に、配列がケル表現型へのシフトを生じる場合は、この配列は実質的には相同ではない。他方で、同じ遺伝子座又はサブ遺伝子座をコードしている２種の配列が同一ではないにもかかわらず、該ケルタンパク質の表現型で区別できない変異の一部又は全てに対応している配列をコードしているような場合は、これらは実質的に相同である。従って、K1ドメインをコードしている配列及びK2ドメインをコードしている配列は、たとえこれらがこれまでわかっているように、単一のヌクレオチド置換により異なるとしても、実質的には相同ではない。対照的に、コードされた遺伝子産物におけるアミノ酸シフトを生じないようなヌクレオチド配列の変動は、実質的に相同であり得る。本発明の方法は、対象のケル遺伝子型の１種以上の態様の決定をもたらす分子遺伝学的方法である。この方法は一般に、ヒト対象又は患者の生物学的試料から、DNA又は他の核酸を得ることを含む。典型的にはこの方法は、血液試料を必要とするが、赤芽球組織を含む他種の組織試料も有用である。この方法は、ケル遺伝子型についてあらゆる個体を試験するために、使用することができる。しかし特に好ましい実施態様において、本発明は、胎児におけるケル式血液型の遺伝子型を決定する方法を提供する。この実施態様において好ましい組織試料は、羊水試料を含む。しかしこのような試料は、血液銀行のような標本ライブラリー又は組織保管施設から、もしくは法医学的証拠などから入手することができると考えられる。従って本方法は、独自の又は代用のきかない試料について使用することができ、もしくは多数の試料のスクリーニングに使用することもできる。一般に本発明の方法は、核酸試料から少なくとも１種の特有の核酸生成物を生成することを含む。この核酸試料は、ケル遺伝子型が決定されることが所望である対象から採取されるか又は誘導され、かつあらかじめ正確な配列又は構造が明確にされる必要はないが、ケル多型遺伝子座を含むヌクレオチド配列を含むことが好ましい。好ましい実施態様において、この核酸試料は、対象のゲノムDNAを含む。本発明の方法は、特異的ケル遺伝子型を特徴とする核酸生成物を、ケル遺伝子型の少なくとも１種の態様を特徴づけるのに十分な量生成する。好ましくは本発明の方法は、K1及びK2；K6及びK7；並びにK3、K4及びK21のような、ケル多型の対立遺伝子の識別をもたらすか；もしくは野生型K(-10)からK10を区別するような、特有の核酸生成物を生成する。ある好ましい実施態様において本発明の診断法は、ケル多型遺伝子座を含む核酸を区別して切断又は消化する制限酵素への、ケルDNAの暴露を含む。典型的にはこの制限酵素は、大きさが独特であり、かつ一貫した理論を基に特異的ケル対立遺伝子と連結することができるような、少なくとも１種の制限断片を含む核酸生成物を生成する。例えばこの制限酵素は、多型セットのひとつの対立遺伝子を、このセットの他の対立遺伝子を消化することなく、消化することができる。あるいいはこの制限酵素は、無傷のまま残されかつそのために認識可能なものを除いて、該セット中の対立遺伝子を切断する。多くの制限酵素が、当該技術分野において公知であり、かつこの方法で少なくとも１種の独特かつ特有の断片を生成するような制限酵素のいずれかを、本発明の方法のこの実施態様に従い使用することができる。 K1/K2の識別について好ましい制限酵素は、今回意外にも明らかになった、K1 DNAには生じるが、K2 DNAには生じないような制限部位で切断する、BsmIである。従ってBsmIは、K1 DNAは切断するが、K2 DNAは無傷のまま残す。K6/K7の多型について、好ましい制限酵素は、MnlI及びDdeIであり、これらは予想外にK7 DNA は切断するが、K6 DNAは切断しない。K10については、好ましい制限酵素は、Acc lであり、これは予想外にK10 DNAは切断するが、野生型K(-10)DNAはその遺伝子座では切断しない。K3/K4/K21群においては、好ましい制限酵素は、意外にもK3( Kp^a)DNAのみを切断するNlaIII、及び／又は意外にもK21（Kp^c）DNAのみを切断するPvuIIであり；K4(Kp)DNAはこれらの酵素のいずれによっても切断されない。所望であるならば、これら又は他の酵素の組合わせを使用することができる。別の好ましい実施態様において、本発明の診断法は、ケル多型遺伝子座を含む DNAを区別して増幅する。好ましくは、このケルDNAは、ケル多型に関連した対立遺伝子のセットの中で、特定の対立遺伝子を区別して増幅するようなプライマーによって増幅される。例えば、適当な増幅プライマーを慎重に選択することによって、K1遺伝子座を含むDNAは増幅され、独特な増幅生成物を産生するが、K2遺伝子座を含むDNAはあらゆる実質的度合いにおいて増幅されない。代わりに、対立遺伝子の有無を決定するために分析することができるような増幅生成物の独特のセットを生成するようなプライマーのセットを、使用することができる。例えば、K1に特異的なプライマーは、K1遺伝子型を特徴とする生成物を生成することができ、かつK2プライマーは、K2遺伝子型を特徴とする生成物を生成することができる。他のケル多型の別の対立遺伝子も、適当なプライマーを選択することによって区別して増幅することができる。前述の増幅生成物（複数）が、ケル遺伝子型の所望の態様を特徴づけるという条件で、プライマーのいずれかの組合わせを、本実施態様において使用することができる。好ましいプライマーのセットは、下記を含む：K1及びK2 DNAを区別して増幅するプライマー；K1及びK2 DNAを区別して増幅するプライマー；K6及びK7 DNAを区別して増幅するプライマー;K10及びK(-10)DNAを区別して増幅するプライマー；K3、K4及びK21 DNAを区別して増幅するプライマー；並びにこれらの組み合わせである。適当なプライマーの組合わせを用いることによって、制限酵素によるDNAの消化のあらゆる必要条件を伴うことなく、DNAの特定の断片を増幅し、ケル遺伝子型を特徴づけるのに十分量の生成物を提供することは、この方法の利点のひとつである。しかしながら、DNA断片を識別するセットを提供するプライマーを使用すること、並びに制限酵素による該断片の選択的切断によって、生成物の識別、及びケル遺伝子型の結果的特徴づけを補うことは、本発明の範囲である。これは特に、いくつかの断片の選択的切断のあいまいさは解決されるが、技術的限界により、これらの断片を完全に分離又は識別することができないような状況において有用である。本発明の診断法は典型的には、消化されたDNA又はRNA断片もしくは増幅された DNA又はRNA生成物のような核酸生成物を、ケル遺伝子型を特徴づけるのに十分な量生じる。この核酸の小片は、該断片の少なくとも一部を他から識別するようことができるようなそれらの配列及び／又は大きさに関する情報を有するので、このような特徴付けを可能にする。これらの断片の特徴の識別は、当該技術分野において公知の方法のいずれかによって利用される。例えば断片は、物理的特徴を基に、他から分離することができる。非常に好ましい特徴の識別は、分子量である。その断片の特異的かつ特有の分子量は、制限酵素による部位特異的切断によって、直接決定される。特定のプライマー類は、特異的分子量を有する増幅生成物を生成することができる。これらの断片は、分子量に加え、正味の分子電荷を基に分離するポリアクリルアミドゲル電気泳動のような方法により、互いに分離することができる。このような技術は、ケル遺伝子型の決定を可能にする情報の豊富な断片のパターンをもたらす。更にケル核酸生成物は、それらの配列の同一性を基に、互いに識別することができる。特異的プローブを、公知の方法に従って、特異的断片と、特異的又は独特にハイブリダイズするために使用することができる。いくつかのプローブの識別用標識により、特定のケル多型に特異的断片の有無を確定することができる。代わりに、断片の分離後に、公知の方法で、特異的又は非特異的に断片の一部又は全てを印付け又は染色することによって、これらの検出を可能にすることができる。臭化エチジウムのような、様々な配列に非特異的なマーカー物質が、公知である。ハイブリダイゼーションプローブを、試験可能なシステム中の特異的ケル核酸の有無の検出に使用することができる。ハイブリダイゼーション技術を基にした診断用試験は、非常に特異的かつ高感度の両方であることができ、ケル遺伝子型の特徴づけに関する情報を提供する。このような技術は、例えばGlicK BR及びPa sternaK JJの論文（分子生物工学：組換えDNAの原理及び利用、ASMプレス社、ワシントンD.C.、192-201頁(1994)）に発表されている（参照40）。好ましい実施態様において、診断法は下記の工程を含む： (a) 患者の組織試料からDNAを得る工程； (b) このDNAを、特異的ケル多型を特徴づけるか又は決定するようなDNAを特異的に増幅するようなプライマー又はプライマーのセットを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって、増幅する工程； (c) この増幅されたDNAを、ケルDNAを区別して切断する制限酵素によって、選択的に切断し、DNA断片パターンを生成する工程；及び (d) これらのDNA断片を、分子量で分離し、DNA断片のパターンを作成する工程であり、この方法において、該DNA断片のパターンは、特異的ケル多型に関する患者のケル遺伝子型を特徴づける特異的情報を提供する。別の好ましい実施態様においては、診断法は下記の工程を含む： (a) 患者の組織試料からDNAを得る工程； (b) このDNAを、ケル対立遺伝子のセット中の１種の対立遺伝子のDNAのみを増幅するような少なくとも１種のプライマーを含むプライマー又はプライマーのセットを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって、増幅する工程； (c) この増幅されたDNAを、分子量で分離し、DNA断片のパターンを作成する工程であり、この方法において、該DNA断片のパターンは、特異的ケル多型に関する患者の遺伝子型を特徴づける特異的情報を提供する。更に別の実施態様においては、診断法は下記の工程を含む： (a) 患者の組織試料からDNAを得る工程； (b) このDNAを、ケル対立遺伝子のセット中の１種のDNAのみを増幅するようなプライマーのセットを用いるリガーゼ連鎖反応によって増幅し、DNA断片のパターンを作成する工程；及び (c) これらのDNA断片を、分子量で分離し、DNA断片のパターンを作成する工程であり、この方法において、該DNA断片のパターンは、該ケル多型に関する患者の遺伝子型を特徴づける特異的情報を提供する。これら以外の別の実施態様においては、診断法は下記の工程を含む： (a) 患者の組織試料からDNAを得る工程； (b) このDNAを、ケル対立遺伝子のセット中の少なくとも１種の対立遺伝子のDNA を区別して切断するような制限酵素により、選択的に切断し、DNA断片のパターンを作成する工程； (c) これらのDNA断片を、該対立遺伝子セットのDNAのみを増幅するようなプライマー又はプライマーセットを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって、増幅する工程；及び (d) この増幅されたDNAを、分子量で分離し、DNA断片のパターンを作成する工程であり、この方法において、該DNA断片のパターンは、該ケル多型に関する患者の遺伝子型を特徴づける特異的情報を提供する。更に別の実施態様においては、診断法は下記の工程を含む： (a) 患者の組織試料からDNAを得る工程； (b) このDNAを、K1 DNA及びK2 DNAを区別して切断するような制限酵素に晒し、D NA断片のパターンを作成する工程； (c) これらのDNA断片を分子量で分離し、DNA断片のパターンを作成する工程：及び (d)このK1 DNA及び／又はK2 DNAの存在を、検出可能である標識されたケルcDNA プローブを用いて決定する工程であり、この方法において、該DNA断片のパターンは、患者のK1/K2遺伝子型を特徴づける特異的情報を提供する。このような方法は、例えば当該技術分野で公知であるサザンブロット法を含む。代わりとなる実施態様において、本発明は、K1又はK2に特異的な標的核酸を検出する診断法を提供する。この実施態様においては、この方法は下記の工程を含む： (a) 患者の組織試料から核酸フラクションを得る工程； (b) この核酸フラクションにおいて、該ケルタンパク質の少なくとも一部をコードし、かつK1/K2多型を特徴づける部位を含む標的核酸の存在を確認する工程である。この方法において、該標的核酸の存在は、K1 DNA又はK2 DNA、もしくはこれらの転写物と特異的に結合するか、又はハイブリダイズすることが公知であるような核酸配列を有するプローブ核酸によって、確認される。この方法で有用なプローブ核酸は、本願明細書に記載されたケルをベースにしたオリゴマー類のいずれかであることができ、検出可能であるように標識されるか、もしくは支持体に付着されたものを含む。この方法は、染色体又はゲノムDNA、mRNA、及びcDNA である標的核酸、更にはケルタンパク質のK1/K2ドメインをコードしている核酸の他の関連形を検出するために使用することができる。このような方法は、例えば、当該技術分野において公知である、ドットブロット法を含む。更に別の実施態様においては、本発明は、ケル式血液型の遺伝子型を決定する方法を提供する。この実施態様において、方法は下記の工程を含む： (a) 公知のケルエクソン又はそれらの転写物の少なくとも一部に実質的に対応している、プローブ核酸配列を選択する工程で、ここにおいて公知のケルエクソンが、ケル多型の遺伝子座を含み、かつ特異的ケル対立遺伝子をコードしている工程； (b) このプローブ核酸配列と、ケル多型遺伝子座に関する未知の表現型を有する対象から採取又は誘導された試料核酸配列を、該核酸配列が顕著に相補的である場合にハイブリダイゼーションを生じるような条件下で、接触する工程；及び (c) このプローブ核酸配列及び試料核酸配列の間のハイブリダイゼーションの量を測定する工程である。この実施態様において、顕著に相補的である配列から生じた量に一致する、ハイブリダイゼーション量の検出は、該対象が、検査している特異的ケル対立遺伝子を有することを示している。他方で、ハイブリダイゼーションの異常に低い量が検出されると、該対象が、検査している特異的ケル対立遺伝子を有さないことを示す。本発明は更に、ケル核酸配列を有する組換え発現ベクターを提供する。このようなベクター類は、細胞、特に酵母及びヒト細胞のような真核細胞の形質転換をもたらし、このような細胞に、異種タンパク質生成物を出現させる。本発明は、ケル多型部位をコードしているタンパク質の一部を含むような、ケルタンパク質の少なくとも一部をコードしている核酸配列を持つ発現ベクターを提供する。特に、本発明は、細胞の形質転換をもたらすK1 cDNAを運搬し、その細胞表面にK1 タンパク質を発現している形質転換細胞又は形質転換体を生じる発現ベクターを提供する。K6 cDNAを運搬するベクターに加え、K10 cDNAを運搬するベクター、及びK3又はK21 cDNAを運搬するベクターも提供され、それぞれ、細胞を形質転換し、K6、K10、K3及びK21を発現する。本発明は更に、その細胞表面にタンパク質を発現するように、修飾された（すなわち形質転換された）安定した細胞系に加え、このようなタンパク質を発現するように細胞系を形質転換する方法を提供する。K1の発現については、このようなタンパク質は少なくともK1ドメインを含むことが好ましく、このタンパク質がK1タンパク質であることが更に好ましい。同様に、K6、K10、更にK3及びK21の発現に関して、発現されたタンパク質は、それぞれ、K6、K10、K3又はK21ドメインを含むことが好ましく；タンパク質が、それぞれ、K6、K10、K3又はK21タンパク質であることが更に好ましい。組換え発現ベクターの調製法、及びこのようなベクターを用いる細胞系の形質転換の方法は、当該技術分野において公知であり、かつ一般的には内容が本願明細書に引用として組込まれている、GlicK BR及びPasternaK JJの論文（分子生物工学：組換えDN Aの原理及び利用、ASMプレス社、ワシントンD.C.、第５章(1994)）に記載されている（参照40）。本発明のケル遺伝子型の決定法は、特に胎児のケル遺伝子型を決定する際に有用である。本願明細書に記載された分子遺伝学的方法は、胎児の羊膜細胞から得られたDNA試料に、容易に適用することができ、かつ胎児のケル遺伝子型を決定するために有用である。本発明の方法は、同じくヒトに関する分子遺伝学的情報が望まれるような、様々な別の状況においても有用である。例えば、本発明の方法は、法医学的試料から、個人の特定に関する情報を得ることが所望であるような状況において有用である。あるいは本発明の方法は、父親であることが疑わしい又は争われているような状況において、父親の決定を可能にする遺伝的情報を得るために有用である。更に本発明の方法は、輸血不適合を避けるための、輸血レシピエントのケル遺伝子型の決定、及び貯蔵された血液のケル遺伝子型のスクリーニングに有用である。本発明のペプチドをベースにした方法は、特にK1のようなケル抗原に対するヒトの同種異系免疫化の決定において有用である。このような同種異系免疫化に関する情報は、将来の妊娠に伴う危険性について女性にアドバイスする際に有用であると期待される。本発明の方法の他の用途は、当業者自身で提案されるであろう。更に本発明の遺伝子型を特徴づける方法は、対立遺伝子のケルファミリーの一部又は全てを説明するために、選択して行うことができる。この方法はまた、抗原のケルファミリーの一部又は全ての表現型を決定することに組み合わせて行うことができる。従って、制限酵素を用いるゲノム解析と組合わせた血清学的試験を用いることによって、ケル遺伝子型を確認することが可能である。このような血清学的試験の工程は、前述のゲノム試験に先立って、試験と平行して、又は試験後のいずれかに行うことができる。更に試験法の計画は、例えばある稀な遺伝子型の可能性を除外するか又は伴うような、予備的不完全な結果を基にすることができる。本発明のRh遺伝子型決定法と共に、他のマーカー又は血液型について、遺伝子型を試験することも所望である。例えば、Rh遺伝子型の決定に関する、 1995年に出願された米国特許出願第08/ 号に記載された遺伝子型決定法（事件整理番号454-5）を、本発明の方法と共に行い、妊娠の潜在的障害について、幅広い多様な助言を提供することができる。一般に、本発明の診断法、組成物及びキットは、様々な公知の医学的試験及びアッセイと共に利用し、臨床医が入手可能な患者に関する情報を増しかつ捕捉することが期待されている。例えば WalKer RHらが編集した技術マニュアル（第10版、米国血液銀行協会、アーリントン、バージニア(1990)）を参照（参照41）。下記の実施例は、本発明の一層の理解を助けることを意図するものである。使用された特定の物質及び条件は、本発明を更に詳細に説明することを意図するものであり、その正当な範囲を限定するものではない。本願明細書に記載された各実施例において、使用された分子生物学的技術は、一般に当該技術分野において容認された方法に従って行った。例えば、その内容が本願明細書に参照として引用されている、SambrooKらの論文（参照42）、及び Innisらの論文（参照34）を参照。実施例１ケル遺伝子の組織は以下の手順を用いて決定された。遺伝子ライブラリーのスクリーニング EMBL3 Sp6／T7中に構築されたヒト胎盤遺伝子ゲノムＤＮＡライブラリーを、クローンテック社(パロ・アルト(Palo Alto)、CA)から得た。このゲノムＤＮＡライブラリーは、ヒト胎盤ゲノムＤＮＡをSau3A1で部分的に消化し、そのフラグメントをベクターのBamHI部位にライゲートすることによって構築された。スクリーニングのために、λファージライブラリーを大腸菌(E．coli)のMN528株またはLE392株の中で増殖させ、平板培養した。そのＤＮＡをハイボンドＴＭ（Hybon dＴＭ）-N+膜（アマーシャム社、アーリントンハイツ、ＩＬ）上に載せ、標準の方法に従って（参照文献４３）、Kell・ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。このｃＤＮＡプローブを、商業的なキット（ベーリンガーマンハイム社、インディアナポリス、ＩＮ）を用いたランダムプライマー延長法(random primer e xtension)により、³²Pでラベルした。該プローブの比放射能は、略１×10⁸cpm／ μgであった。１４の陽性クローンが単離された。エキソンおよびイントロンの特性分析更に特徴分析を行うために、同定された１４の陽性クローンのうちの５種類(λ ２、λS、λB、λFおよびλE)が選択された。二つのクローン(λ2およびλE)はケル遺伝子の殆どに広がっており、約21.5Kbをカバーしている（図１を参照）。クローンλSが研究されたのは、これが５′隣接領域(5’flankingreg ion)のより多くにまで延出し、またクローンλ2から決定された配列を再確認するために役立つからである。クローンλBおよびλFが用いられたのは、これらは λEと重なっており、更にλFの小さな部分がλ2の３′末端と重なっているからである（図１を参照のこと）。これら５つのクローンは、先ずXhoI＋PstIおよびXhoI＋EcoRIで消化し、続いてＫｅｌｌ・ｃＤＮＡの種々の位置に特異的な異なったオリゴヌクレオチド類を用いたサザンブロット・ハイブリダイゼーションを行うことによってマッピングされた。次いで、このゲノムクローンを下記の酵素、即ち、Pst、EcoRI、BamHI 、BglIIおよびXhoIの夫々またはこれらの組合せで消化した。個々の遺伝子フラグメントをPUC18（ギブコＢＲＬ社、Gaithersburg、ＭＤ）またはpGEM-3Zf(+)（プロメガ社）の中にサブクローニングし、自動373AＤＮＡシーケンサー（アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティー、ＣＡ）で配列決定した。Ｋｅｌｌ・ｃＤＮＡ配列に関して決定されたエキソンおよびその隣接配列は、幾つかの短いイントロンと同様に、完全に配列決定された。一つの例外として、長いイントロンは、該イントロンの側面領域に由来するプライマーを用いたＰＣＲによってサイジングされた。エキソン１０およびエキソン１１の間の長いイントロンは、ＹＡＣクローンを鋳型に用い、λ２およびλＥから得た公知のイントロン配列に由来するプライマーを用いて部分的にサイジングされた。（７種類の酵母の人工染色体（ＹＡＣ）クローンは、ケルエキソン６に特異的なＰＣＲによって、染色体７ＤＮＡを富化されたＹＡＣ源から別々に単離された。イントロンのこの領域は、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型に用いたＰＣＲによって確認された。ゲノムクローン類の制限酵素によるマッピングおよびサザンブロット分析サブクローン類を、BamHI、EcoRIおよびPstIでマッピングした。異なったサイズの消化されたＤＮＡを、アガロースゲル電気泳動によって分離した。このＤＮＡフラグメントの幾つかについては、ケル・ｃＤＮＡの異なった位置に由来する³² Ｐ標識オリゴヌクレオチドを用いたサザンブロットによって更に分析し、またサブクローニングされた遺伝子フラグメントの入手可能な配列を用いて同定した。これらの手法を組合せることによって、BamHI、EcoRIおよびPstIの制限酵素地図の構築が可能になった。これら５つのゲノムクローンに由来するサブクローニングされたＫｅｌｌ遺伝子フラグメントの配列分析によって、ヒトケル遺伝子は、63ｂｐ（エキソン７）から288ｂｐ（エキソン１９）のサイズ範囲に亘る１９のエキソンを含むことが明らかになった。図１は、新たに決定された、制限酵素酵素部位を伴うヒトＫｅｌｌ遺伝子（ケル）の構造を示している。エキソン類の位置は黒く塗り潰したボックスで示されており、イントロンはエキソン類を連結する線で示されている。高さが異なる垂直の複数の線は、Ｋｅｌｌ遺伝子における制限酵素部位をマークしている。λファージ、即ちゲノムクローンが図の底部に示されている（λ2、λS、λE、λF）。商業的なゲノムライブラリーから得た二つのゲノムクローン、即ちクローンλ EおよびλFは、他のクローン類（λ2、λS）と比較して、相互に一致しない配列を与えている。クローン類λBおよびλFの５′切片は、λ2およびλSの３′切片と同一のはずであるが、配列分析の結果はこれらが異なっていることを示した。その理由は分かっていないが、多分、ゲノムライブラリーを調製する際のＤＮA 物質のライゲーションによるものであろう。これらの異なった領域は、図１に破線で描かれている。このサブクローニングおよび分析された制限酵素消化生成物は、ゲノムクローン類の上に示されている。夫々のサブクローンは、使用された制限酵素および当該サブクローンが導かれたゲノムクローンを示している。また、ＰＣＲで誘導された４種類のサブクローン類（ＰＣＲ２５、ＰＣＲ６、ＰＣＲ１およびＰＣＲ２０）も示されている。括弧の中において、夫々のＰＣＲ生成物は、それが増幅されたゲノムクローンを示している。λ2、λSおよびλEでカバーされない大きなイントロンの小さな切片は、ＹＡＣクローン（yWSS679）およびゲノムＤＮＡからのＰＣＲ生成物を配列決定することによって決定された。λ Fクローンはλ2クローンの３′をカバーしていても、この戦略が用いられた。これによって、我々はＫｅｌｌ遺伝子の全体をカバーし、エキソン１０とエキソン１１との間のイントロンを、曖昧さを伴うことなくサイジングすることが可能になった。全てのエキソン／イントロン接合ジャンクションは、５′ドナー -ｇｔ配列および３′アクセプター -ａｇ配列を含むことが分かった。イントロン類は、93 ｂｐから略６ｂｐのサイズに亘っており、１ｋｂよりも大きい６種類のイントロンがあった（図１および図２）。この長いイントロン類は完全には配列決定されなかったが、ＰＣＲでサイジングされた。クローンλBおよびλFの５′領域はクローンλ2およびλSの３′領域と重なると思われたが、実際はそうではなかったので、エキソン１０とエキソン１１との間のイントロン分析には曖昧さが存在した。クローンλBおよびλFのこれらの曖昧な領域は、図１に点線で示されている。この不確実性の故に、クローンλ2およびλEでカバーされない遺伝子の小さなギャップは、Ｋｅｌｌ遺伝子を含むＹＡＣクローンyWSS679のＰＣＲ増幅によってブリッジされた（図１）。このＰＣＲ増幅された領域のサイズは、更に、ＹＡＣクローンについて用いたのと同じプライマーを用いることにより、共通のＫｅｌｌフェノタイプの人から得たゲノムＤＮＡのＰＣＲによって確認された。全てのエキソンを配列決定し、クローンテックラボラトリーズ社から入手したヒト骨髄ライブラリーから単離された完全長のＫｅｌｌ・ｃＤＮＡの配列と比較した。このライブラリーのＫｅｌｌフェノタイプは未知であった。公表されたＫｅｌｌ・ｃＤＮＡの配列（参照文献１４）と比較して、エキソン３の４塩基における相違が注目された。これらの相違は、最初の研究における配列決定の誤りによるものであった。この訂正された配列は、受付番号M64943号で、ＥＭＢＬ／ジーンバンク・アップデート（国立バイオテクノロジー情報センター、ベテスダ(B ethesda)、ＭＤ）に提出された。一つの注目すべき相違は膜貫通領域における塩基置換であり、これはプロリンの代わりにロイシンをコードする。訂正された塩基配列は、図２に太字で示されている。図２Ａ〜２Ｄは、接合ジャンクション配列に隣接する中間のイントロンと共に、ヒトのＫｅｌｌタンパクをコードする個々のエキソンの配列を示している。個々のエキソンの塩基配列は大文字で示されており、隣接するイントロン配列は小文字で示されている。エキソンによってコードされるアミノ酸配列は、塩基配列の上に示されている。指示されたエキソンの下の左側の番号は、ｃＤＮＡ由来の塩基番号を意味する。左側および右側の他の番号は、ｃＤＮＡについて以前に記述された（参照文献２５）、アミノ酸残基および塩基を示している。イントロンのサイズは、エキソンの末端において特定されている。また、５′および３′のスプライス部位も示されている。遺伝子ＤＮＡライブラリーが構築されたヒトのＫｅｌｌフェノタイプは未知であるので、我々は、既知の共通フェノタイプ（Ｋ：−１，２，−３，４，−６，７）のヒトの抹消血液からＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡは、ＲＮＡ−ＰＣＲによって調製され、当該技術で公知の方法に従って配列決定された。その推定アミノ酸配列は、クローンテックのゲノムライブラリーから得た図２に示す配列と同一であった。既知のフェノタイプのヒトにおいて、Ｃ→Ｔの塩基の相違が二つの位置（ｎｔ1656および1664）で起きたが、これらの置換は予想されたアミノ酸を変化させなかった。興味があるのは、エキソン１が５′非翻訳領域を含んでおり、また開始メチオニンのみをコードしていることである。一つの膜貫通領域がエキソン３に位置しており、また亜鉛中性エンドペプチダーゼ(zinc neutral endopeptidases)（参照文献４３）の活性部位に見られるコンセンサス配列（ＨＥＸＸＨ）に従う５量体配列（ＨＥＬＩＨ）がエキソン１６にある（図２）。天然のタンパクのコード化領域は、１９のエキソンのうちの１８に存在している；第一のエキソンは５′非翻訳領域および開始メチオニンを含んでいる。第一のエキソン中に開始コドンのみを有する他の例が知られている（参照文献４４）。エキソン３には一つの膜貫通領域がコード化される一方、エキソン４〜１９は殆どの細胞外タンパクをコードしている。亜鉛メタロペプチダーゼ(zinc metall opeptidase）に独特なＨＥＸＸＨモチーフ（参照文献２９）は、68ｂｐのエキソン（エキソン１６）中にコード化されている。コンセンサス５量体配列に加えて、Ｋｅｌｌは、膜に結合した亜鉛中性エンドペプチダーゼ（ＥＣ24.11）（参照文献２５）のファミリーとの配列的および構造的な相同性を有しており、エンケファリナーゼ(enkephalinase)およびCALLAは該ファミリーの例である（参照文献４５〜４６）。CALLA遺伝子は、Ｋｅｌｌ遺伝子よりも大きく、約80ｋｂであり、２４のエキソンで構成されている（参照文献４７）。CALLAにおいて、推定の酵素活性部位はエキソン１９にコード化されており、CALLAのエキソン１８および１９の塩基配列をＫｅｌｌのエキソン１５および１６と比較すると、54.5％の塩基同一性が示される。実施例２転写開始部位ケル遺伝子の転写開始部位は、ヒト胎児ライブラリー（５′ＲＡＣＥレディーＴＭ(5’RACE ReadyＴＭ)ｃＤＮＡライブラリー、クローンテックラボラトリーズ、パロ・アルト、ＣＡ）を用いたｃＤＮＡ末端（５′ＲＡＣＥ）の迅速な増幅によって決定された。ポリ（Ａ）ＲＮＡの供給源は、妊娠22週および26週の２人の女性白人胎児からプールされた正常な肝臓であった。一本鎖ｃＤＮＡライブラリーは、プライマーとしてランダム６量体を用いた逆転写によって製造された。オリゴヌクレオチドアンカーの3'-NH₃-GGA GAC TTC CAA GGT CTT AGC TAT CAC T TA AGC AC-P-5’（配列ＩＤ番号６）をｃＤＮＡに連結した。５′ＲＡＣＥのために、Ｋｅｌｌ・ｃＤＮＡ上の二つの異なった位置に由来するプライマーを用いて、２セットの入れ子式ＰＣＲ反応(nested PCR reaction)を行った。第一のＰＣＲでは、５′ＲＡＣＥレディーＴＭｃＤＮＡを鋳型に用いた。一つのセット（ＰＣＲ１）に用いられたプライマーには、クローンテック社によって提供されたアンカープライマー（5'-CTG GTT CGG CCC ACC TCT GAA GGT TCC AGA ATC GAT A G-3'）（配列ＩＤ番号７）およびＫｅｌｌ・アンチセンスプライマー（5'-CTC G GC TCT TCC TCA CTT TGG TCC-3'、nt 132）（配列ＩＤ番号８）が含まれていた。他のセット（ＰＣＲ２）については、プライマーは、クローンテック社のアンカープライマー（配列ＩＤ番号７）およびＫｅｌｌ・アンチセンスプライマー(5 '-CTC TTG GCT CCA GAG AGT TCC CAT-3'、nt 178)（配列ＩＤ番号９）を含んでいた。第二の入れ子式ＰＣＲについては、第一のＰＣＲ反応の生成物が鋳型に用いられ、またクローンテック社のアンカープライマー（配列ＩＤ番号７）が両平行反応のためのセンスプライマーとして再度用いられた。ＰＣＲ１では、Ｋｅｌｌ・アンチセンスプライマー（5'-CCC ACC TTC CAT CTG TCT ATC TTC -3'、nt 1 09）（配列ＩＤ番号１０）が用いられた。ＰＣＲ２については、Ｋｅｌｌ・アンチセンス、nt 132、（配列ＩＤ番号８）が用いられた。ＰＣＲは、自動温度サイクラー（ミニサイクラー、ＭＪリサーチ社、ウオータータウン、ＭＡ）中において、94℃で３分、62℃で１分および72℃で30秒の初期サイクルを用いて行われた。サイクル２〜３０での条件は、94℃で30秒、62℃で 30秒および72℃で30秒であった。最後のサイクルにおいて、72℃での重合工程は 10分まで延長された。試薬の最終濃度は、50μＬの最終容量において、50mM KCl ，10mM Tris-HCl(pH9.0)，３mM MgCl₂，400nMの各プライマー，200μMの各ｄＮＴＰ，0.1％のトリトン-X100および2.5単位のｔａｑポリメラーゼであった。パーキン・エルマー社（ブランチバーグ、ＮＪ）のアンプリワックスＴＭ(Ampliwa x ＴＭ)を使用した「ホットスタート」法が用いられた。ＰＣＲ生成物は、0.8％の低融点アガロースゲル中での電気泳動によって分離され、溶出され、ノバジェン(Novagen)社（マジソン、ＷＩ）のpT7-Blue(R)プラスミドベクターに直接ライゲートされ、大腸菌ＤＨ５αＦ′に形質転換された。夫々のプライマーは、三つの異なったサイズの生成物を与えた。これらの生成物はサブクローニングされ、配列決定された。夫々のＰＣＲ反応から得られた最大の生成物は、開始コドンから120ｂｐ上流に５′末端を有していた。より短い二つのＰＣＲ生成物は、開始コドンから81ｂｐおよび30ｂｐ上流でそれぞれ終端していた。図３は、エキソン１を示すケル５′隣接領域のヌクレオチド配列、および可能なｃｉｓ調節要素を示している。有望なｃａｐ部位の上流の185ｂｐの領域が示されている。三つの可能な転写開始部位がＶでマークされている。ＧＡＴＡ−１、Ｓｐ１およびＣＡＣＣＣ領域についてのコンセンサス配列がボックスで囲まれている。ＰＣＲによってコピーされてＣＡＴ発現ベクターの中に配置された、-1 76〜-1の領域が示されている。開始メチオニンは太字で記載されている。５′RACE法および胎児肝臓由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡを用いることにより、三つの可能な転写開始部位が発見された。三つのｃａｐ部位のうちの第一の部位（開始ＡＴＧから120ｂｐ上流）はまた、ヒト骨ｃＤＮＡライブラリー（参照文献２５）からクローニングされたｃＤＮＡの５′末端であり、他の二つの部位はＳ１および開始コドンから30ｂｐ上流である。三つの部位は全て、二つの異なったＫｅｌｌ・ｃＤＮＡアンチセンスプライマーを用いて得られた。三つの位置は全てプリン塩基であるが、転写開始部位として作用し得るであろう。ＡＴＧから81 ｂｐおよび30ｂｐ上流にあるこれらの位置は、不完全な逆転写による人為的な産物である可能性もある。これがｃＤＮＡライブラリーの調製にランダム６量体が用いられた結果であることはありそうもない。しかし、二次ＲＮＡ構造は逆転写の未成熟終止(premature termination)をも起こすことができる。実施例３５′隣接領域の分析５′隣接領域の構成は、ＰｓｔＩを用いた消化（図１参照）に続いて、サブクローンλSをＤＮＡ配列決定することにより得られた。この５′隣接領域は、ヌクレオチド-176〜-1に亘っていると決定された。図５は、第一の可能な転写開始部位の上流の185ｂｐの配列を示している。この領域およびエキソン１の分析によって、ＴＡＴＡ配列はないことが示されるが、他の可能な幾つかの転写因子結合部位が注目された。少なくとも二つのＧＡＴＡ −１部位が、ＣＡＣＣＣボックスに近接して存在する。Ｓｐ１およびＧＡＴＡ− １配列がエキソン１に存在している。５′隣接領域はプリンに富んだ領域を含んでいる。これら問題の領域が図３に示されている。 -176〜-1の５′隣接領域（図３）の転写活性は、プロモータのないｐＣＡＴベクターと比較した、トランスフェクトされたＫ562細胞でのＣＡＴ試験によって測定された。この方法において、第一のｃａｐ部位に対するヌクレオチド-176〜 -1に亘るＰＣＲ生成物が、プロメガ社から入手したｐＣＡＴ基本ベクター中にサブクローニングされた。次いで、赤白血病細胞系Ｘ562の細胞が、リポフェクチン法を使用してトランスフェクトされた。プロメガ社によろ提供されたプロトコールに従って、ＣＡＴベクターの構築、トランスフェクション、およびクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）活性が試験された。ＣＡＴ酵素活性は、［¹⁴Ｃ］−クロラムフェニコール（50〜60mCi／mmol、アマーシャム社、アーリントンハイツ、ＩＬ）を用いて測定された。反応生成物は、液体シンチレーションスペクトル分析によって測定され、また薄層クロマトグラフィーによって反応生成物を分析した。陰性対照として、プロモータのないｐＣＡＴ基本ベクターが用いられた。全ての細胞抽出物は、測定値を比較するために、タンパク分析によって正規化された。ＣＡＴレポータ遺伝子の前方に導入されると、５′隣接領域は、赤白血病細胞系Ｋ562中でプロモータ活性を示した。５′隣接領域を有するｐＣＡＴベクターは、１gの細胞抽出タンパク当たり略0.8単位のＣＡＴ活性を発現することが分かった。１単位のＣＡＴ酵素活性は、37℃において、クロラムフェニコールのアセテート１nmolを１分間で変換するのに必要な酵素の量として定義される。図４は、５′隣接領域のＣＡＴ活性を示している。48時間露出されたオートラジオグラムが示されている。レーン１は５′隣接領域を有するｐＣＡＴベクターを有しており、レーン２はプロモータのないｐＣＡＴ基本ベクターを有している。放射活性のブチリル化したクロラムフェニコールは「ｂＣｍ」で示されており、未反応のクロラムフェニコールは「Ｃｍ」で示されている。推定のプロモータ領域は、通常はｃａｐ部位に対して-25〜30ｎｔに位置する典型的なＴＡＴＡボックスを含んでいない（参照文献４８）。しかし、幾つかの赤血球特異的な遺伝子におけると同様に、ＧＡＴＡ−１因子のコンセンサス配列がプロモータ領域に見られた。加えて、可能なＳｐ１およびＧＡＴＡ−１結合部位がエキソン１に見られた。ＧＡＴＡ−１およびＳｐ１がケル遺伝子の発現を調節するかどうかは知られていないが、ＧＡＴＡ−１は赤血球遺伝子に共通しており（参照文献４９〜５５）、また造血前駆細胞において低レベルで発現し、赤血球の成熟の際に上方調節されることが知られている。これらの転写因子が赤血球組織特異性を定義するのであれば、それは、骨髄および胎児肝臓ではＫｅｌｌ転写が検出されたが、幾つかの非赤血球組織では検出されなかった我々のノーザンブロット研究の結果（参照文献８）と一致する。実施例４３′末端の分析エキソン１９は最大のＫｅｌｌエキソンであり、Ｃ末端の53アミノ酸をコードし、終止コドンから100ｂｐ下流のポリアデニル化信号を伴う３′非翻訳領域を含んでいる。以前のノーザンブロット分析によって、少量の大きなｍＲＮＡ（注目すべきは6.6ｋｂのもの）も観察されるが、骨髄および胎児肝臓における主要なＫｅｌｌ転写物は2.5ｋｂであることが示された（参照文献８）。最初にヒト骨髄ライブラリー由来のＫｅｌｌ・ｃＤＮＡをクローニングした際、我々は大きな（３ｋｂ）３′非翻訳領域を伴うｃＤＮＡを単離した（参照文献２５）。Ｋｅｌｌ遺伝子の３′末端構造を決定するために、グーセンス等(Goosens et al.)(参照文献５９)が記載したようにして抹消血液からＲＮＡを単離し、パーキンエルマーＲＮＡ・ＰＣＲキット（ロッシュ・モレキュラー・システムズ社、ブランチバーグ、ＮＪ）を用いた逆転写およびＰＣＲ増幅によってｃＤＮＡを調製した。第一鎖の合成は、アンカーされたオリゴｄ（Ｔ）１６プライマーを用いて開始された。Ｋｅｌｌ・ｃＤＮＡの３′末端のＰＣＲ増幅は、Ｋｅｌｌ・ｃＤＮＡのコード化配列由来のアンカープライマーおよびオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行われた。使用されたアンカー・アンチセンスプライマーは、オリゴ 5'-GACTCGAGTCGACAACGTT(T)１６-3'（配列ＩＤ番号１１）であり、Ｋｅｌｌ・ｃＤＮＡの３′末端コード化配列由来のセンスプライマーは、5'-ATGGGGAGACTGTCC TG-3'（配列ＩＤ番号１２）であった。約400ｂｐのＰＣＲ生成物が得られ、サブクローニングおよび配列決定がなされた。異なるサブクローン類の３′末端配列が図５に示されている。ヒト骨髄ライブラリー由来（上段）および共通Ｋｅｌｌフェノタイプをもった人の抹消血液由来（下段）の、ｃＤＮＡ塩基配列（ポリＡ領域の前）が示されている。（Ａ）はポリＡ領域を示している。抹消血液から得られた四つの異なったサブクローンの３′末端配列が、図５の底部に示されている。四つの全てのサブクローンは、終止コドンからポリアデニル化信号（AATAAA）まで同一の配列を有していた。３′末端において、ポリＡ配列が開始する前の塩基配列は長さが若干異なっている。ポリアデニル化信号と開裂部位との間の距離は変化することが知られている（参照文献６０）。ヒト骨髄ｃＤＮＡライブラリーから得られた三つの異なるＫｅｌｌ・ｃＤＮＡ（クローン 185,182および190）において、３′末端における同様の変化が観察された。一つのｃＤＮＡクローン（クローン191）、即ち、骨髄ライブラリーから得られた元の完全な長さのｃＤＮＡのみが、大きな３′非翻訳領域を含んでいた。このｃＤＮＡクローンに由来する３ｋｂの非翻訳フラグメントは、ヒトゲノムＤＮＡとハイブリダイズせず、それが外来ＤＮＡであることが示された。この外来フラグメントはEcoRI部位に続いており、多分線形であり、ライブラリーの調製の際に人為的に挿入されたものであろう。ＲＮＡ・ＰＣＲによる抹消血液中における転写物の３′切片の配列は、短い複数の非翻訳領域のみを検出し、これらはポリＡ微部の前の長さが若干変化した。ヒト骨髄由来の他のｃＤＮＡを分析したときに、同様の配列が得られた。大きなＫｅｌｌ転写物は、長いためにＲＮＡ・ＰＣＲ法を用いて増幅できなかったが、それらの存在はノーザン分析によって示された。大きな３′非翻訳領域を伴う多重転写物の発生は共通したものではなく、それらの機能は十分に理解されてはいないが、この３′非翻訳領域は発現の調節において役割を果たしていると考えられる（参照文献６１〜６２）。実施例５〜７ＤＮＡの調製実施例５〜７において、ＤＮＡは、血清学的にＫｅｌｌフェノタイプが決定された人から得た抹消血液から調製された。ＤＮＡは、抗凝固剤を用いて採取した１〜５ｍｌの全血から調製され、或いは1000×ｇの遠心分離によって赤血球を除去したときに得られたバフィーコートから調製された。両者の場合において、ジョン等(John et al.)が記載した方法（参照文献６３）が用いられた。カナダのフッター派の人々から幾つかのＤＮＡサンプルが得られ、これらの家族の血清学的研究によって、それらはＫ１またはＫ２の何れかについてホモ接合であることが示された。これらのサンプルにおいて、ＤＮＡはツェリンスキー等(Zelinski et al.)が記載したようにして単離された（参照文献３０）。ポリメラーゼ連鎖反応実施例５から７のために、ポリメラーゼ連鎖反応は次のようにして行われた：変性工程、アニーリング工程および重合工程は自動サーモサイクラー（ミニサイクラー、ＭＪリサーチ社、ウオータータウン、ＭＡ）中で行われた。94℃で３分、62℃で１分および72℃で30秒の初期サイクルを用いた。サイクル２〜３０での条件は、94℃で30秒、62℃で30秒および72℃で30秒であった。最後のサイクルにおいて、72℃での重合工程は10分まで延長された。試薬の最終濃度は、100μＬの最終容量において、50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH9.0)，３mM MgCl₂，350nMの各プライマー，200μＭの各ｄＮＴＰ，0.1％のトリトン-X100，100〜200ngのゲノムＤＮＡおよび2.5単位のｔａｑポリメラーゼであった。パーキン・エルマー社（ブランチバーグ、ＮＪ）のアンプリワックスＴＭ(Ampliwax ＴＭ)を使用した「ホットスタート」法が用いられた。ＰＣＲ生成物は、0.8％アガロースゲル中での電気泳動によって分離され、臭化エチジウム染色によって検出された。制限酵素消化最終ＰＣＲ反応混合物にBsmIを直接添加した。このＰＣＲ混合物（10μL）は、２μＬの35mM MgCl₂，１μＬの10mMメルカプトエタノールまたは10mM DTT，１ μＬの10×BsmI緩衝液、４μＬの水および２μＬの５単位／ｍＬBsmIを添加することにより、BsmI消化によって最適化された。この混合物を65℃で90分間インキュベートした。反応混合物中のＤＮＡを、0.8％アガロース中で電気泳動により分析した。他の試薬 Taq-ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰｓはプロメガ社（マジソン、ＷＩ）から購入した。Ｘ−Ｇａｌはアプリジーン社（プレザントン、ＣＡ）から購入した。ＤＮＡ・１ｋｂ梯子状標準、ＤＨ５αＦ株大腸菌コンピテント細胞、および低融点アガロースは、ベテスダリサーチラボラトリーズ社（ガイテルスバーグ、ＭＤ）から購入した。Ｔ４・ＤＮＡリガーゼおよびBsmIは、ニューイングランド・バイオラボズ（ベバーリー(Beverly)、ＭＡ）から購入した。ｐＴ７・blue（Ｒ）プラスミドベクターは、ノバジェン(Novagen)社（マジソン、ＷＩ）から購入した。ＤＮＡ精製のためのクイックスピンＴＭ(Quick Spin ＴＭ)カラム（G-50 セファデックス）は、ベーリンガーマンハイム社（インディアナポリス、ＩＮ）から購入した。実施例５Ｋ１およびＫ２ＤＮＡ配列の比較９対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて、１９のケルエキソンを増幅した。これらのプライマー対は、エキソンのリーディングフレームをカバーするために選択された。プライマーおよび標的エキソン（スパンニング領域）の配列は、表１に示されている。Ｋ１ホモ接合の人に由来するゲノムＤＮＡが、鋳型ＤＮＡとして用いられた。ＰＣＲ生成物は、0.8％アガロースゲル上での電気泳動によって分離され、臭化エチジウムで染色された。全ての場合に、0.48〜1.5ｋｂに亘る単一の生成物が得られた。図６は、ケルエキソンのＰＣＲ増幅を示している。図６のレーン１および１１は、１ｋｂのＤＮＡ梯子状標準である。レーン２〜１０は、プライマー対ＰＣＲ１，２，３，４，５，６，７，８および９のＰＣＲ生成物をこの順序で含んでいる。第一のプライマーはフォワード配列であり、第二のプライマーはアンチセンスプライマーである。ＰＣＲのアンチセンスプライマーの５′末端における２Ｇ塩基は、遺伝子中には存在せず、他の目的でのSmaI部位を作成するために追加されたものである。幾つかのＰＣＲ生成物は全体のエキソンをカバーなかった。これらエキソンは★でマークしてある。エキソン１のＰＣＲ生成物（ＰＣＲ１）およびエキソン１９のＰＣＲ生成物（ＰＣＲ９）は、全体の翻訳された領域を含んでいる。エキソン２は、重なったＰＣＲ生成物（ＰＣＲ１＆２）に亘っており、またエキソン１４はＰＣＲ７でカバーされていた。実施例６実施例１で得たＰＣＲ生成物は、次のプロトコールを用いて配列決定された。まず、2.8％の低融点アガロース上で分離されたＰＣＲ生成物を溶出し、ｐＴ７B lue（Ｒ）プラスミドベクターに連結し、大腸菌ＤＨａＦ′株に形質転換した。プラスミドＤＮＡは、アルカリ溶解法によって小スケールで調製され、クイックスピンＴＭ（G-50セファデックス）カラムを用いて精製された。サムブルック等 (Sambrook et al)（参照文献４２）に詳細に説明されている標準分子生物学の手法を用いた。ＤＮＡ配列決定は、自動化された装置（アプライド・バイオシステムズ社、モデル337A、バージョン1.2.0）によって行われた。配列決定された生成物は、以前に記述されたＫ２・ｃＤＮＡの配列（参照文献２５）と比較された。予想しなかったことだが、一つの塩基の変化を除いて、Ｋ１・ＤＮＡはＫ２・ＤＮＡと同じアミノ酸配列をコードすることが見出された。Ｋ１とＫ２との間のこの相違は、エキソン６におけるヌクレオチド701でのＣからＴへのシフトとして生じる。このＰＣＲ生成物であるＰＣＲ３（表１）は、エキソン５および６に亘っており、Ｋ２・ＤＮＡと比較したときに一つの塩基の相違を有していた。エキソン６の一部の塩基配列およびこれらがコードするアミノ酸は、図７に示されている。Ｋ２・ＤＮＡの配列は上段に、Ｋ１・ＤＮＡの配列は下段に示されている。長さが740ｂｐのＰＣＲ３生成物には、Ｋｅｌｌ・ｃＤＮＡの701位置に対応した、シトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への一つの置換が存在する。ＣからＴへの置換は太字でマークされ、且つ矢印で強調されている。この変化は、コンセンサスなＮ−グリコシル化部位（Asn．X．Thr）におけるスレオニンのメチオニンへの変化を予言する。Ｋ２におけるＮ-結合したグリコシル化モチーフ、およびＫ１における崩壊したモチーフには下線が付されている。この一つの塩基変化は、Ｋ１とＫ２との間のアミノ酸の変化をコードする唯一の相違であるので、この観察は、193位置でのスレオニンのメチオニンへの変化（Thr→Met）によって、Ｋ１を発現しているタンパクのアスパラギン191におけるＮ-グリコシル化が妨げられ、Ｋ１／Ｋ２多形が同定されるであろうことを示唆している。実施例７エキソン６におけるヌクレオチド位置701（nt701）でのＣからＴへの置換は、 BsmIに特異的な制限酵素部位を定義することが知られた、5'-GAATGCT-3'の配列を含む新たな配列を作り出す。その結果、エキソン５および６に亘る740ｂｐのＰＣＲ生成物（ＰＣＲ３）のBsmIでの処理は、Ｋ１／Ｋ２ゲノタイプを区別する手段を提供するとの仮説が成り立つ。BsmIでの消化を用いたＰＣＲ法において、Ｋ１／Ｋ１ゲノタイプは、540ｂｐおよび200ｂｐの２つのフラグメントを生じるはずであり；Ｋ２／Ｋ２ゲノタイプは、切断されていない740ｂｐのＰＣＲ生成物を生じるはずであり；Ｋ１／Ｋ２ヘテロ接合は、740ｂｐ、540ｂｐおよび200 ｂｐの３つのフラグメントを生じるはずである。この塩基変化によって実際にＫ１ゲノタイプが同定されることを確認するために、Ｋ１／Ｋ２フェノタイプが知られている４２人の異なった人において、この領域を分析した。ＰＣＲ３プライマー（表１）を用いて、種々のＫｅｌｌフェノタイプから得たＤＮＡのＰＣＲ増幅によりＰＣＲ生成物（740ｂｐ）を作成した。増幅の後、このサンプルをBsmIで処理し、0.8％アガロースゲル上での電気泳動により分離した。図８は、上記の実験で得られた結果を示している。ゲルレーンは次のように定義される。レーン１および２０は、１ｋｂの梯子状ＤＮＡ標準を含んでいる。レーン２は、Ｋ１ホモ接合由来の未処理ＰＣＲ３である。レーン３〜１９は、BsmIで処理された。全てのＫ２ホモ接合(Ｋ：−１，２)サンプルは、切断されていない740ｂｐ生成物を与えた。Ｋ１ホモ接合（Ｋ：１，−２）は、540ｂｐおよび200ｂｐのフラグメントのみを生じた。Ｋ１／Ｋ２ヘテロ接合（Ｋ：１，２）は、切断されていない740ｂｐの生成物、並びに小さい540ｂｐおよび200ｂｐの生成物の３つのバンドを有していた。試験された４２のＤＮＡサンプルのうち、１２のサンプルはＫ１ホモ接合またはＫ２ホモ接合であり、６つのサンプルはＫ１／Ｋ２ヘテロ接合であり、２４のサンプルＫ；−１，２フェノタイプであったが、優勢の低いまたは希なＫｅｌｌフェノタイプを含んでいた。これらには、Ｋ３，Ｋ６，Ｋｏ，Ｋ１４／ｋ２４ヘテロ接合、およびMcLeodフェノタイプを含まれていた。４２のうちの４０のサンプルにおいて、BsmIゲノタイピングは、赤血球の血清学的分析により決定されたＫｅｌｌフェノタイプと一致した。２つの場合には、ゲノタイピングは一つのサンプルをＫ：−１，２ホモ接合と同定し、他方をｋ：１，２ヘテロ接合と同定した。しかし、これら二つのサンプルは、血清学的には「弱い」Ｋ１フェノタイプを有するものとして同定された。上記で列記した他の優勢の低いまたは希なＫｅｌｌフェノタイプは、エキソン６の中にＣからＴへの塩基置換を有しており、この変化がＫ１／Ｋ２多形に特異的であることを示した。実施例８Ｋ１／Ｋ２ゲノタイプを差別的に決定する方法において、独特のプライマー混合物を用いてゲノムＤＮＡの試験サンプルを処理するポリメラーゼ連鎖反応が用いられた。このプライマー混合物には次のプライマー類が含まれていた。ＭＫ１ＲプライマーはＫ１・ＤＮＡに特異的であり、長さが540ｂｐのＰＣＲ生成物を生じる。ＭＫ２ＦプライマーはＫ２・ＤＮＡに特異的であり、長さが24 0ｂｐのＰＣＲ生成物を生じる。他のプライマーであるＥＩ５ＦプライマーおよびＥＩ６ＲプライマーはＫ１／Ｋ２に特異的であり、長さが740ｂｐのＰＣＲ生成物を生じ、内部対照として用いられる。プライマー混合物には以下の濃度のプライマー類が含まれていた：20ng/μL M K1R; 20ng/μL MK2F; 30ng/μL EI5F; 30ng/μL EI6R。ＥＩ５ＦおよびＥＩ６Ｒプライマーは、二つの反応のためのＰＣＲに用いられるのに対して、ＭＫ１ＲおよびＭＫ２Ｆプライマーは夫々一つの反応だけに用いられる。プライマー類の濃度は、ＥＩ５ＦおよびＥＩ６Ｒプライマーが、反応の継続のために充分な量になるように調節される。血液サンプルは、ヒトのボランティアから入手された。ＤＮＡは、本明細書の他の箇所に記載された方法を用いて、血液サンプルのバフィーコート中に存在する白血球から単離された。反応管は、一つのアンプリワックスＴＭおよび25μLの第一の試薬カクテルを含むようにセットアップされた。第一の試薬カクテルには、2.5μLの10X緩衝液（プロメガ社、マジソン、ＷＩ）;４μLのdNTP；３μLの25mM MgCl₂；７μLのプライマー混合物；および8.5μLのＨ₂Ｏを含んでいた。これにより、25μL容積の予備反応混合物を得た。これらの予備混合物を80℃で５分間インキュベートし、加工する前に５分間室温に冷却した。このチューブの夫々に対して、23μLの第二の試薬カクテルを添加した。この第二の試薬カクテルは、2.5μLの10X緩衝液；３μLの25mM MgCl₂；17μLのＨ₂Ｏ；および0.5μLのｔａｑＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ社、５単位／μL）および２μLのＨ₂Ｏ中の100ngの単離されたゲノムＤＮＡを含んでいた。ＰＣＲ反応は、次のサイクルプログラムを用いて行われた。初期サイクルは、 94℃で３分、62℃で１分および72℃で30秒を含んでいた。サイクル２〜３０には夫々、94℃で30秒、62℃で30秒および72℃で30秒が含められた。最後のサイクルにおいて、72℃での重合工程は10分まで延長された。ＰＣＲの完了後に、当該技術で公表されているように、臭化エチジウム／アガロースゲル電気泳動を用いて増幅された生成物を解析した。この方法の結果は、図９に示されている。レーン１およびレーン１１は、既知サイズの混合ＤＮＡフラグメントを含む対照サンプルと同一である。レーン２〜４は、Ｋ１／Ｋ２ゲノタイプが既に知られている患者由来の内部対照サンプルを表している。対照レーン２は、540ｂｐおよび740ｂｐのフラグメントの存在を示しており、これは患者がホモ接合Ｋ１（Ｋ：１，−２）であることを示す。対照レーン３は、200ｂｐおよび740ｂｐのフラグメントの存在を示しており、これは患者がホモ接合Ｋ２（Ｋ：−１，２）であることを示す。対照レーン４は、Ｋ１／Ｋ２フラグメントの夫々、即ち、200ｂｐ、540ｂｐおよび740ｂｐのフラグメントの存在を示しており、これは患者がヘテロ接合（Ｋ：１，２）であることを示す。図９のレーン５〜７は、被検患者の家族から得たサンプルを表しており、レーン５およびレーン６は両親を表し、レーン７は胎児を表す。試験バンドと対照バンドとを比較することによって、レーン５に対応する親はヘテロ接合（Ｋ：１，２）であり、またレーン６に対応する親はホモ接合Ｋ２（Ｋ：−１，２）であることが明らかになる。胎児は明らかにホモ接合Ｋ２（Ｋ：−１，２）である。図９のレーン８〜１０は、他の被検患者の家族から得たサンプルを表している。レーン８に表されている第一の親はヘテロ接合（ｋ：１，２）であるのに対して、レーン９に表されている第二の親はホモ接合Ｋ２（ｋ：−１，２）である。レーン１０に表されている胎児は、ホモ接合Ｋ２（Ｋ：−１，２）として同定可能である。実施例７および８に与えられた実験データは、明らかに本発明の方法が診断的効力を有することを示している。これらの実施例は、三つのＫ１／Ｋ２ゲノタイプの夫々の個体が、Ｋ１・ＤＮＡとＫ２・ＤＮＡとの間の相違によって積極的に区別できることを示している。より詳しくいえば、新たに同定されたＫ１／Ｋ２多形の遺伝子座は、Ｋ１およびＫ２に特異的な核酸プローブを用いたＫｅｌｌ・ＤＮＡの増幅によって、並びに制限酵素でのＫ１／Ｋ２・ＤＮＡの差別的消化によって開発することができる。実施例９今回、思いがけずもＫ６／Ｋ７多形の分子的基礎が見出され、それは、Ｋｅｌｌタンパクのアミノ酸位置597におけるロイシン（Ｋ７）の代わりにプロリンをコードさせるエキソン１７での点突然変異によるものであることが示された。このアミノ酸置換は、Ｋｅｌｌタンパクの亜鉛結合推定酵素活性部位(zinc-bindin g putative enzyme active site)に極めて近接している。ＤＮＡの調製白血球ＤＮＡは、ジョン等が記載した方法（参照文献６３）に基づき、実施例５〜７に記載したようにして、Ｋ６フェノタイプをもった８人の関連のない個体の抹消血液から調製された。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ケル遺伝子の１９エキソンを複製および増幅するために用いたフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、その殆どが、この明細書の他の箇所で先に説明したものと同じである。若干の場合にのみ、配列決定を容易にするもっと小さいＰＣＲ生成物を製造するために、他のプライマーが設計された。エキソン１７および１８から807ｂｐの切片を増幅するために用いたフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、夫々、 5'-CTCACCTAGGCAGCACCAACCCTA-3'（配列ＩＤ番号）および 5'-CAGTGAGGACATCTGCAGAAGAGG-3'（配列ＩＤ番号）であった。使用したＰＣＲの条件は、サイクル数を35に増やしたことを除き、上記の実施例５〜７において先に説明したのと同じであった。ＤＮＡ配列決定ＰＣＲ生成物は、0.8％の低融点アガロース上でのゲル電気泳動によって分離された。溶出した後、ＤＮＡを直接配列決定し、またはpT7Blue(R)Tプラスミドベクター（ノバジーン社、マジソン、ウイスコンシン州）中にサブクローニングし、大腸菌のＤＨ５αＦ′株（ギブコＢＲＬライフテクノロジー社、ガイテルスバーグ、メリーランド州）に形質転換した。サブクローン化するときは、プラスミドＤＮＡをアルカリ溶解法によって小スケールで調製し、クイックスピンＴＭ（セファデックスＴＭＧ50）カラムを用いて精製した。標準の分子生物学区的方法を用いた。ＤＮＡ配列決定は、自動化された装置（モデル373A、バージョン1- 2.0、アプライド・バイオシステムズ社、フォスターシティー、ＣＡ）によって行った。ＰＣＲ生成物の制限酵素消化Ｋ６ゲノタイプについて点突然変異を含むことが予想されたエキソン１７の短い111ｂｐの配列が、ＰＣＲによって複製および増幅された。エキソン１７は、他の隣接するMnlI開裂部位を含んでいるので、エキソン１７の短い切片のみが複製された。ＰＣＲ反応のために、下記のオリゴヌクレオチドプライマーが用いられた。即ち、5'-CTCACCTAGGCAGCACCAACCCTA-3'（配列ＩＤ番号）（フォワードプライマー、実施例に記載したのと同じ）および5'-TTACCTGGAGGGCATGGTT GTCACT-3'（配列ＩＤ番号）（リバースプライマー）である。ＰＣＲ生成物（10pLの最終反応混合物）を10単位のMnlI（ニューイングランドバイオラボ社、ベバリー、マサチューセッツ州）で処理し、37℃で90分間インキュベートした。最終反応容積は２０μLであった。次いで、ＤＮＡを0.7％のアガロースゲル上での電気泳動によって分離し、1.65％のゲルツインＴＭ(GelTwinＴＭ）ブランドの表面活性剤［？］（J.T.ベーカー社、フィリップスバーグ、ニュージャージー州）を補充した。Ｋ６およびＫ７・ＤＮＡの配列決定Ｋ：６，−７のエキソン１９に対応するＰＣＲ生成物の塩基配列が、「野生型」のＤＮＡ（Ｋ：−６，７）と比較されたが、これは高い発生率でＫ７を含むＫｅｌｌフェノタイプを発現する（参照文献４３）。両者共に、エキソン１７に生じる二つの別々の塩基置換が注目された。この変化は図１０に模式的にされている。ｎｔ1919においてＴのＣへの変化が観察され、これはアミノ酸位置597でのロイシンの代わりにプロリンをコードする。他の塩基置換（ＡからＧ）がｎｔ20 19で観察されたが、この変化は異なったアミノ酸のコード化を生じない。 MnlI消化によるＫ６／Ｋ７多型の確認ｎｔ1920におけるＴからＣへの置換は、制限エンドヌクレアーゼMnlIの認識部位を除去する。従って、野生型のＫ７・ＤＮＡはMnlIに晒されるとこの点で開裂されるのに対して、低頻度のＫ６・ＤＮＡは影響を受けない。このこの明白な特徴は、この点突然変異を分析するために使用してもよく、またこの置換がＫ６ゲノタイプを同定するかどうかを決定するために用いてもよい。エキソン１７のこの領域に亘る111ｂｐの配列が、８人の関連のないＫ：６，−７およびＫ：−６，７の人から得たゲノムＤＮＡのＰＣＲ、およびMnlIでの処理によって得られた。Ｋ７（野生型）ＤＮＡはMnlI部位を含んでおり、MnlIで処理すると91ｂｐおよび20ｂｐの生成物を生じる。他方、Ｋ６ＰＣＲ生成物はMnlI処理によって開裂されず、111ｂｐの生成物は切断されないまま残る。従って、ヘテロ接合は未切断のＰＣＲ生成物および二つの小さいバンドの両者を与える。結果は図１１に示されている。関連のない７人のＫ６フェノタイプの人に由来するＰＣＲ生成物は全て、111ｂｐのバンドを示した。四つの例が示されている（レーン３，６，７，９）。全てＫ７フェノタイプの人に由来するＰＣＲ生成物は小さい91ｂｐの生成物を示したが（レーン４および８）、20ｂｐの生成物は、そのサイズが小さいために、臭化エチジウム染色によって検出することは困難であった。Ｋ：６，７ヘテロ接合（レーン５および１０）は、未切断の111ｂｐバンドおよび小さい91ｂｐのバンドの両方を示した。チンパンジーの赤血球は、Ｋ６（Ｊｓａ）抗原を有している（参照文献２７）。チンパンジー由来の一つのＤＮＡサンプルが分析され、それもまた111ｂｐの未切断ＰＣＲ生成物を生じ、そのパターンはｋ：６，−７ゲノタイプに一致した。この結果は、図１１二示したゲルにレーン１１として示されている。実施例１０Ｋ６／Ｋ７多形が更に研究され、ｎｔ2019での点突然変異に関連した第二の制限酵素開裂部位が同定された。これは無症状の突然変異であるが、ｎｔ1910で発現される突然変異に一貫して関連しているから、本発明に従って利用することができる。ＤＮＡは、実施例９で同定された７人の個体の抹消血液から、そこに記載したようにして調製された。ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定は、実施例９に記載したようにして行われた。807ｂｐのＰＣＲ生成物をDdeIで消化した。10マイクロリットル（10μＬ）のＰＣＲ生成物を、10〜20単位のDdeI（ニューイングランドバイオラボズ社、ベバリー、マサチューセッツ州）と共に37℃で90分間インキュベートし、酵素消化された混合物を、実施例９に記載したようにして、1.65％のゲルツインＴＭを補充した0.7％アガロースゲル上で分離した。ＰＣＲ生成物は幾つかのDdeI部位を有することが分かり、消化に際して複数のバンドが得られた。４人のＫ６フェノタイプの個体に由来するＤＮＡは、454,18 3および170ｂｐの三つ顕著なバンドを生じた（図１２、レーン３，６，７および９）。対照的に、Ｋ７フェノタイプは、454ｂｐのバンドが更に266ｂｐと188ｂｐの生成物に消化されたので（レーン４および８）、四つのバンド(266,188，18 3，および170ｂｐ)を生じた。188ｂｐおよび183ｂｐの生成物は十分に分離されず、ある時は一緒に移動する。二つのヘテロ接合体（レーン５および１０）は、五つのバンド（454、266、188、183、および170ｂｐ）を生じるので、Ｋ６およびＫ７ホモ接合から区別することができた。また、チンパンジーＤＮＡの一つのサンプルは、DdeIを用いて消化された。実施例９で上述したように、チンパンジーの赤血球はタイプＫ：６，−７を有している。図１２に示したように、454ｂｐの生成物はDdeIによって切断されなかったが、これもＫ：６，−７ゲノタイプと一致している。Ｋ６およびＫ７・ＤＮＡにおけるケル遺伝子のコード化領域の塩基配列を比較することによって、両者共エキソン１７で起きる２つの塩基の相違のみが示された。図１０を参照されたい。これらの塩基置換のうちの一つだけが、異なったアミノ酸をコードした。ｎｔ19 10におけるＴからＣへの変化は、アミノ酸残基597におけるロイシンをプロリンに変化させた。ｎt2019における他の塩基置換は、当該位置にロイシンを保持する無症状の突然変異である。実施例９および１０で説明した７人の無関係な個体の分析によってこれら塩基変化が示されたから、ｎｔ1910およびｎｔ2019における塩基置換の両者は、Ｋ：６，−７ゲノタイプに共通している。予想されたように、Ｋ：６，７ヘテロ接合は、野生型およびＫ：６，７配列の両者を有していた。Ｋｅｌｌタンパクが亜鉛エンドペプチダーゼのファミリーと共有している５量体コンセンサス配列、即ちＭＥＸＸＨは、アミノ酸残基581〜585に生じる。従って、この推定活性部位は、ロイシン（Ｋ７）からプロリン（Ｋ６）への変化を有する残基597に近接している。我々は、このアミノ酸変化がＫｅｌｌの推定酵素活性に影響するかどうかを予測できないが、その近接性は無視できない。ロイシンからプロリンへの変化が、二つのシステイン残基(図１０)の間に位置する残基で起き、Ｋ６においてCys.Pro.Ala.Cys配列を生じ、Ｋ７にCys.Leu.Ala.Cys.配列を生じることもまた興味深い。それらの明瞭な分子構造のために、プロリン残基はタンパク中で局部的な構造変化を誘導することができ、またヘリックスの形態を変化させることができる。この場合、それは二つのシステイン残基の間に位置しているから、プロリンはジスルヒド結合の再配置を起こすことができ、従ってタンパクの二次構造および三次構造を顕著に変化させて、新たなエピトープを露出させる。Ｋｅｌｌタンパクの二次構造のコンピュータに補助されたチョウ− ファスマン(Chou-Fasman)の分析によって、残基597でロイシンをプロリンで置換することは、実際に、当該領域について予想されるターン(turn)を変化させるであろうことが示される。なお、Ｋｅｌｌは１６のシステイン残基を有し、これらの残基のうちの１５は細胞外ドメインに存在し、一つは膜貫通領域に存在することに留意すべきである。これは、該タンパクが広範に折り畳まれることを示しており、還元剤によるＫｅｌｌ抗原の不活性化を示す初期の生化学的研究と一致している。全てのＫｅｌｌ抗原のうち、Ｋ６およびＫ７は、最低濃度(1-2mM)のジチオトレイトール（ＤＴＴ）で不活性化される抗原である。Ｋ１，Ｋ２，Ｋ３およびＫ２１のような他のＫｅｌl抗原は、不活性化のために遥かに高い濃度（100〜200mM）のＤＴＴを必要とする。 MAIEAと称する免疫学的方法は、Ｋｅｌｌエピトープ類の間の空間的関係をマッピングするために使用されてきた。この方法は、天然のＫｅｌｌタンパクにおいて、Ｋ６／Ｋ７がＫ１／Ｋ２エピトープに近接していることを予測した。Ｋ１／Ｋ２多形を識別する点突然変異はアミノ酸残基193に生じるのに対して、Ｋ６／Ｋ７についてのそれは直線的に離間しており、アミノ酸597に発生する。この見かけの矛盾は、再度、Ｋｅｌｌタンパクの折り畳まれた性質と、エピトープが突然変異点から遠くに移されることを指摘する。実施例９および１０に与えられた実験データもまた、本発明の診断的な効力を示している。特に、種々のＫ６／Ｋ７ゲノタイプを有する個体は、Ｋ６・ＤＮＡとＫ７・ＤＮＡとの間の相違に基づいて積極的に識別できる。より具体的には、新たに同定されたＫ６／Ｋ７多形の遺伝子座は、Ｋ６およびＫ７に特異的な核酸プローブを用いたＫｅｌｌ・ＤＮＡの増幅によって、並びに制限酵素でのＫ６／Ｋ７・ＤＮＡの差別的消化によって開発することができる。実施例１１更なる研究によって、ケル遺伝子のエキソン１３におけるｎｔ1601の一つのヌクレオチド置換が、Ｋ１０ゲノタイプに関連していることが明らかになった。Ｋ１０の分子的基礎は図１３に示されており、これはＫ１０多形遺伝子座における野生タイプのＫｅｌｌ・ＤＮＡのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列、並びにアミノ酸配列の変化（Glu 495 Val）を生じる点突然変異（A 1601 T）を与える。ｎｔ1601における点突然変異はＫ１０フェノタイプをもたらす。ＲＦＬＰ分析は、一般に、本明細書の他の箇所で説明した方法に従って行われた。ヌクレオチド置換は制限酵素AccIのための新たな開裂部位を形成して、Ｋ１０および野生型ＤＮＡからの増幅生成物の差別的検出と、結果的にはＫ１０ゲノタイプの差別的測定を可能にする。実施例１２ＲＦＬＰ法がＫ３／Ｋ４／Ｋ２１ゲノタイプの決定に使用できるかどうかを確立するために、Ｋ３／Ｋ４／Ｋ２１多形遺伝子座の分析が行われた。思いがけず、一つのコドンにおける二つの別々のヌクレオチド置換が、Ｋ３／Ｋ４／Ｋ２１遺伝子座の多形に関連することが研究によって明らかになった。Ｋ４の分子的基礎が図１４に示されており、これはＫ４・ＤＮＡのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列、並びにアミノ酸配列に変化を生じさせる点突然変異を提供している。ｎｔ961？における点突然変異（Ｃ→Ｔ）はアミノ酸配列における変化を生じ（A rg 281 Trp）、Ｋ３フェノタイプをもたらす。ｎｔ962における点突然変異（Ｇ →Ａ）はアミノ酸配列における変化を生じ（Arg 281 Gln）、Ｋ２１フェノタイプをもたらす。ＲＦＬＰ分析は、一般に、この明細書の他の箇所で説明した方法に従って行われた。Ｃ961 Ｔヌクレオチド置換は、制限酵素NleIIIのための新たな開裂部位を形成して、Ｋ３および野生型Ｋ４・ＤＮＡからの増幅生成物の差別的検出を可能にし、結果的にはＫ３／Ｋ４ゲノタイプの差別的測定を可能にする。また、Ｇ96 2Ａヌクレオチド置換は、制限酵素PvuIIのための新たな開裂部位を形成して、Ｋ２１および野生型Ｋ４・ＤＮＡからの増幅生成物の差別的検出と、結果的にはＫ２１／Ｋ４ゲノタイプの差別的測定とを可能にする。同時に、これらの制限部位の発見によって、Ｋ３／Ｋ４／Ｋ２１ゲノタイプを直接決定するための方法が可能になる。以上、現時点で本発明の好ましい実施例と思われるものを説明してきたが、当業者は、他の更なる実施例が本発明の精神を逸脱することなく可能であること、並びにこのような更なる変形および変更は全て、後述の請求範囲の真の範囲内に含まれるものであることを容易に理解するであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者レッドマンコルヴィンエルアメリカ合衆国ニューヨーク州 11010 フランクリンスクエアレンケンブールヴァード 187

Claims

【特許請求の範囲】１．ケル遺伝子型を特徴づけるのに十分な量のケル多型遺伝子座を含む核酸試料から、特有の核酸生成物を生成する工程を含む、対象のケル遺伝子型を決定するための診断法。２．K1及び／又はK2遺伝子型を特徴とする核酸生成物の生成を含む、請求の範囲第１項記載の診断法。３．K6及び／又はK7遺伝子型を特徴とする核酸生成物の生成を含む、請求の範囲第１項記載の診断法。４．K10及び／又はK(-10)遺伝子型を特徴とする核酸生成物の生成を含む、請求の範囲第１項記載の診断法。５．K3、K4、及び／又はK21遺伝子型を特徴とする核酸生成物の生成を含む、請求の範囲第１項記載の診断法。６．前記生成工程が下記を含む、請求の範囲第１項記載の診断法：前述の核酸試料を選択的に切断し、ケル遺伝子型を特徴とする少なくとも１個の切断断片を含む特有の核酸生成物を提供する工程。７．前記選択的切断工程が、該ケル多型遺伝子座を基に該核酸試料を区別して切断するような制限酵素による、該核酸試料の消化を含む、請求の範囲第６項記載の診断法。８．前記核酸試料が、ケルK1/K2多型遺伝子座を含み、かつ前記制限酵素が、Bsm Iを含む、請求の範囲第７項記載の診断法。９．前記核酸試料が、ケルK6/K7多型遺伝子座を含み、かつ前記制限酵素が、Mnl I、DdeI、又はこれらの組合わせを含む、請求の範囲第７項記載の診断法。 10．前記核酸試料が、ケルK10/K(-10)多型遺伝子座を含み、かつ前記制限酵素が、AccIを含む、請求の範囲第７項記載の診断法。 11．前記核酸試料が、ケルK3/K4/K21多型遺伝子座を含み、かつ前記制限酵素が、NlaIII、PvuII、又はこれらの組合わせを含む、請求の範囲第７項記載の診断法。 12．前記生成工程が、更に核酸の増幅を含む、請求の範囲第２項記載の診断法。 13．前記増幅工程が、前述の選択的切断工程前の該核酸試料の増幅を含む、請求の範囲第12項記載の診断法。 14．前記増幅工程が、前述の選択的切断工程後の該核酸生成物の増幅を含む、請求の範囲第12項記載の診断法。 15．前記増幅工程が、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、又はこれらの組合わせによる核酸の増幅を含む、請求の範囲第12項記載の診断法。 16．前記生成工程が、該核酸試料を区別して増幅し、該特有の核酸生成物を提供する工程を含む、請求の範囲第１項記載の診断法。 17．前記区別的増幅工程が、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応又はこれらの組合わせにより、該核酸試料を区別して増幅することを含む、請求の範囲第 16項記載の診断法。 18．前記区別的増幅工程が、ケル多型の対立遺伝子を選択的に増幅するプライマーを用いる、該核酸試料の増幅を含む、請求の範囲第16項記載の診断法。 19．前記区別的増幅工程が、K1/K2多型の対立遺伝子を区別して増幅するような、対立遺伝子に特異的なプライマーを用いる、該核酸試料の増幅を含む、請求の範囲第18項記載の診断法。 20．前記区別的増幅工程が、K6/K7多型の対立遺伝子を区別して増幅するような、対立遺伝子に特異的なプライマーを用いる、該核酸試料の増幅を含む、請求の範囲第18項記載の診断法。 21．前記区別的増幅工程が、K10/K(-10)多型の対立遺伝子を区別して増幅するような、対立遺伝子に特異的なプライマーを用いる、該核酸試料の増幅を含む、請求の範囲第18項記載の診断法。 22．前記区別的増幅工程が、K3/K4/21多型の対立遺伝子を区別して増幅するような、対立遺伝子に特異的なプライマーを用いる、該核酸試料の増幅を含む、請求の範囲第18項記載の診断法。 23．前記対立遺伝子に特異的なプライマーが、ATA CTG ACT CAT CAG AAG TTT CA G CA(SEQ ID NO:1)、ATA CTG ACT CAT CAG AAG TCT CAG CA(SEQ ID NO:2)、及び ATA CTG ACT CAT CAG AAG TGT CAG CA(SEQ ID NO: )からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む、請求の範囲第19項記載の診断法。 24．前記対立遺伝子に特異的なプライマーが、TGG ACT TCC TTA AAC TTT AAC TG A AC(SEQ ID NO:3)のヌクレオチド配列を含む、請求の範囲第19項記載の診断法。 25．前記プライマーが、TTT AGT CCT CAC TCC CAT GCT TCC(SEQ ID NO:4)、及び TAT CAC ACA GGT GTC CTC TCT TCC(SEQ ID NO:5)、TTA GTC CTC ACT C-C CAT GC T TCC(SEQ ID NO: )、及びTCA CAC AGG TGT CCT CTC TTC C(SEQ ID NO: )からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む、請求の範囲第18項記載の診断法。 26．更に前記核酸生成物から、ケル遺伝子型を特徴づける情報を得ることを含む、請求の範囲第１項記載の診断法。 27．前記核酸生成物が、１種以上の核酸断片を含み；かつ前述の情報を得る工程が、前記１種以上の核酸断片を分離し、断片パターンを提供する工程を含み、ここにおいて該断片パターンは、該対象のケル遺伝子型を特徴づける特異的情報を提供する、請求の範囲第26項記載の診断法。 28．前記分離工程が、K1/K2遺伝子型を特徴づける特異的情報を提供する断片パターンをもたらす、請求の範囲第27項記載の診断法。 29．前記分離工程が、K6/K7遺伝子型を特徴づける特異的情報を提供する断片パターンをもたらす、請求の範囲第27項記載の診断法。 30．前記分離工程が、K10/K(-10)遺伝子型を特徴づける特異的情報を提供する断片パターンをもたらす、請求の範囲第27項記載の診断法。 31．前記分離工程が、K3/K4/K21遺伝子型を特徴づける特異的情報を提供する断片パターンをもたらす、請求の範囲第27項記載の診断法。 32．前記情報を得る工程が、更に該断片パターンにおいて１種以上の核酸断片を検出することを含む、請求の範囲第27項記載の診断法。 33．前記検出工程が、前述の１種以上の核酸断片を、非特異的マーカー物質で印付けることを含む、請求の範囲第32項記載の診断法。 34．前記検出工程が、前述の１種以上の核酸断片を、１種以上のハイブリダイゼーションプローブで特異的に印付けすることを含み、かつここにおいてこれらの各ハイブリダイゼーションプローブは、単一の核酸断片に対する特異性を有する、請求の範囲第32項記載の診断法。 35．前記各ハイブリダイゼーションプローブが、検出可能であるように標識される、請求の範囲第34項記載の診断法。 36．更に前記対象のケルでない遺伝子型を決定することを含む、請求の範囲第１項記載の診断法。 37．更に前記対象のケル表現型を決定することを含む、請求の範囲第１項記載の診断法。 38．前記決定工程が、血清学的試験による、該対象のケル表現型を決定することを含む、請求の範囲第37項記載の診断法。 39．更に対象からDNA試料を採取することを含む、請求の範囲第１項記載の診断法。 40．前記DNA試料が、ゲノムDNAを含む、請求の範囲第39項記載の診断法。 41．前記採取工程が、該対象の赤芽球組織を含む生物学的試料からDNA試料を得ることを含む、請求の範囲第39項記載の診断法。 42．前記生物学的試料が、羊水又は漿膜絨毛を含み、かつここで該対象は、子宮内の胎児である、請求の範囲第41項記載の診断法。 43．前記生物学的試料が、血液試料を含む、請求の範囲第41項記載の診断法。 44．ケル核酸の多型領域に対し、少なくとも実質的に相補的である核酸配列を含む、核酸オリゴマー。 45．前記多型領域が、K1遺伝子座を含む、請求の範囲第44項記載の核酸オリゴマー。 47．前記ケル対立遺伝子が、K2遺伝子座を含む、請求の範囲第44項記載の核酸オリゴマー。 48．前記オリゴマーが、検出可能であるように標識された、請求の範囲第44項記載の核酸オリゴマー。 49．前記オリゴマーが、支持体に付着している、請求の範囲第44項記載の核酸オリゴマー。 50．前記核酸配列が、ケル核酸の該領域に対し完全に相補的である、請求の範囲第44項記載の核酸オリゴマー。 51．ケル核酸の多型領域対し少なくとも実質的に相同である、核酸配列を含む、核酸オリゴマー。 52．前記多型領域が、K1遺伝子座を含む、請求の範囲第51項記載の核酸オリゴマー。 53．前記多型領域が、K2遺伝子座を含む、請求の範囲第51項記載の核酸オリゴマー。 54．前記オリゴマーが、検出可能であるように標識された、請求の範囲第51項記載の核酸オリゴマー。 55．前記オリゴマーが、支持体に付着している、請求の範囲第51項記載の核酸オリゴマー。 56．前記核酸配列が、前述のケル核酸の多型領域と完全に相同である、請求の範囲第51項記載の核酸オリゴマー。 57．ケル多型遺伝子座を含むケル核酸領域と、特異的に結合するか、もしくはその延長を引き起こすような核酸オリゴマーを含む、核酸プライマー。 58．前記核酸オリゴマーが、K1/K2多型遺伝子座を含むケル核酸と、特異的に結合するか、もしくはその延長を引き起こす、請求の範囲第57項記載の核酸プライマー。 59．前記核酸オリゴマーが、K6/K7多型遺伝子座を含むケル核酸と、特異的に結合するか、もしくはその延長を引き起こす、請求の範囲第57項記載の核酸プライマー。 60．前記核酸オリゴマーが、K10/K(-10)多型遺伝子座を含むケル核酸と、特異的に結合するか、もしくはその延長を引き起こす、請求の範囲第57項記載の核酸プライマー。 61．前記核酸オリゴマーが、K3/K4/K21多型遺伝子座を含むケル核酸と、特異的に結合するか、もしくはその延長を引き起こす、請求の範囲第57項記載の核酸プライマー。 62．ケルタンパク質の少なくとも一部と、少なくとも実質的に相同であるアミノ酸配列を含む、ケルをベースにしたポリペプチドで、前記部分が、K1ドメイン、 K6ドメイン、K10ドメイン、K3ドメイン及びK21ドメインからなる群から選択されたケルドメインを特異的に特徴づける、ケルをベースにしたポリペプチド。 63．前記ポリペプチドが、検出可能であるように標識された、請求の範囲第62項記載のケルをベースにしたポリペプチド。 64．前記ポリペプチドが、支持体に付着している、請求の範囲第62項記載のケルをベースにしたポリペプチド。 65．前記アミノ酸配列が、該ケルタンパク質のアミノ酸192に相当する位置に、メチオニン残基を有する、請求の範囲第62項記載のケルをベースにしたポリペプチド。 66．前記アミノ酸配列が、該ケルタンパク質のアミノ酸597に相当する位置に、プロリン残基を有する、請求の範囲第62項記載のケルをベースにしたポリペプチド。 67．前記アミノ酸配列が、該ケルタンパク質のアミノ酸496に相当する位置に、バリン残基を有する、請求の範囲第62項記載のケルをベースにしたポリペプチド。 68．前記アミノ酸配列が、該ケルタンパク質のアミノ酸281に相当する位置に、トリプトファン残基を有する、請求の範囲第62項記載のケルをベースにしたポリペプチド。 69．前記アミノ酸配列が、該ケルタンパク質のアミノ酸281に相当する位置に、グルタミン残基を有する、請求の範囲第62項記載のケルをベースにしたポリペプチド。 70．ケル抗原に対する患者の同種免疫化を検出する診断法で：ペプチドプローブで、患者の血液試料の免疫反応性のパラメーターを測定する工程を含み、ここにおいて、該ペプチドプローブは、該ケルタンパク質の一部と少なくとも実質的に相同であるアミノ酸配列を含み、かつ該ペプチドプローブは、試料中の抗ケル抗体と特異的に反応するような、診断法。 71．前記アミノ酸配列が、K1、K6、K10、K3、K21、及びそれらの組合わせからなる群から選択されたドメインで特異的に特徴づけられるケルタンパク質の一部と少なくとも実質的に相同である、請求の範囲第70項記載の診断法。 72．下記を含む、ケル遺伝子型を区別して決定するための診断用キット： (a) ケル多型遺伝子座を含むケル核酸領域を、特異的に増幅する、プライマー；及び (b) 容器。 73．前記キットが更に、ケル多型遺伝子座を含むケル核酸を選択的に切断し、ケル核酸断片を提供するような、制限エンドヌクレアーゼを含む、請求の範囲第72 項記載の診断用キット。 74．ケル多型遺伝子座に特異的な標的核酸配列を検出することによって、ケル式血液型の遺伝子型を決定するための診断用キットで、下記を含むキット： (a) 第一のPCRプライマーは、第一のケル対立遺伝子に特異的な配列と結合するか、もしくは延長を生じるオリゴヌクレオチドであり、かつ第二のPCRプライマーは、第二のケル対立遺伝子に特異的な配列と結合するか、もしくは延長を生じるオリゴヌクレオチドであるような、第一及び第二のPCRプライマーを含むプライマーセット；及び (b) 多数のウェルを有し、かつ該標識配列に対し実質的に相補的である核酸配列を有するオリゴヌクレオチド捕獲プローブが結合している、微量滴定プレート。 75．細胞を形質転換し、ケルタンパク質の発現を引き起こすことが可能で、ケルタンパク質の少なくとも一部をコードしている核酸配列を有する発現ベクターを含む、組換え発現ベクター。 76．前記核酸配列が、K1 DNA、K6 DNA、K10 DNA、K3 DNA及びK21 DNAからなる群から選択された配列に相当する配列を含む、請求の範囲第75項記載の組換え発現ベクター。 77．形質転換細胞を生成するために、請求の範囲第75項記載の組換え発現ベクターにより、細胞を形質転換すること、並びにこの形質転換細胞から、安定した形質転換細胞系を確立することを含む、ケルタンパク質を発現するために形質転換細胞系を生成する方法。 78．請求の範囲第77項記載の方法に従って生成された、形質転換細胞系。 79．請求の範囲第77項に従って生成された形質転換細胞系によって発現されたケル抗原に対する、少なくとも１種の抗体の産生を誘導することを含む、ケル遺伝子座に特異的な抗体の調製法。 80．K1 cDNAを含む、K1タンパク質をコードしている配列、K6 cDNAを含む、K6タンパク質をコードしている配列、K10 cDNAを含む、K10タンパク質をコードしている配列、K3 cDNAを含む、K3タンパク質をコードしている配列、K21 cDNAを含む、K21タンパク質をコードしている配列、及びそれらの組合わせからなる群から選択された、ケル核酸配列。