JPH10509880A

JPH10509880A - 組織特異的複製のためのベクター

Info

Publication number: JPH10509880A
Application number: JP8519008A
Authority: JP
Inventors: ポールエル．ハレンベック，; ヤン−ニエンチャン，; ヤウェンエル．チャン，
Original assignee: ジェネティックセラピー，インコーポレイテッド
Priority date: 1994-11-28
Filing date: 1995-11-28
Publication date: 1998-09-29
Also published as: CA2206179C; CA2206179A1; NO972373L; FI972225A0; ES2258265T3; WO1996017053A1; FI972225A7; EP0791050A1; NO972373D0; EP0791050A4; AU716045B2; FI972225L; EP0791050B1; DE69534791T2; DE69534791D1; AU4504396A; ATE317895T1

Abstract

(57)【要約】本発明は、一般に、組換えベクター、および特にアデノウイルスベクターを用いる標的化遺伝子治療に関する。本発明は、特に、複製条件的ベクターおよびそれらを用いる方法に関する。このようなベクターは、標的組織において選択的に複製して、ベクター自体の存在により、またはベクターから発現され、組織全体に分配される異種遺伝子産物により利益を得る治療を提供し得る。このようなベクターにおいて、複製に必須な遺伝子は、異種の組織特異的な転写調節配列の制御下に配置される。従って、複製は、このベクターを用いて、転写調節配列による遺伝子の転写を誘導する因子が存在すること、またはこの遺伝子の転写を阻害する因子が存在しないことにより条件付けられる。従って、標的組織が選択的に処置され得る。

Description

【発明の詳細な説明】組織特異的複製のためのベクター発明の背景発明の分野本発明は、一般に、組換えベクター、および特にアデノウイルスベクターを用いる標的化された遺伝子治療に関する。本発明は特に、複製条件的ベクターおよびそれらを使用する方法に関する。このようなベクターは、標的組織において選択的に複製し得、ベクター自身の存在から、またはベクターから発現され、そして組織全体に分配される異種遺伝子産物から治療的利益を提供する。このようなベクターでは、複製に必須な遺伝子が、異種の組織特異的な転写調節配列の制御下に配置される。従って、複製は、転写調節配列による遺伝子の転写を誘導する因子の存在または転写調節配列による遺伝子の転写を阻害する因子の欠損に左右される。それ故、このベクターを用いて、標的組織は選択的に処置され得る。本発明はまた、転写調節配列によってベクター複製を許容する転写調節機能の存在または欠損について組織をスクリーニングするためにこのベクターを使用する方法に関する。本発明はまた、標的化された遺伝子治療に有用な組換え複製条件的ベクターを産生する細胞に関する。背景技術標的化ベクター外来遺伝子の治療的使用に関する主要な目標の１つは、高度な特異性を伴って細胞に標的化することである。一般的なアプローチは、DNA、DNA-タンパク質複合体、およびリポソームの全身性の導入を包含している。レトロウイルスのインサイチュ投与もまた、活発に複製している細胞に用いられている。しかし、細胞特異性の欠如または顕著に低い細胞特異性および非効率的な遺伝子転移のために、所望の遺伝子を生物中の特定の細胞に標的化することは、外来遺伝子に基づく治療に対して主要な障害である。従って、このような遺伝子の使用は限定されている。腫瘍細胞は、外来遺伝子を標的化する手段を提供することが特に望まれる細胞型である。本発明の実施態様では、腫瘍細胞に外来遺伝子を安全かつ効率的に送達するための組成物および方法が提供される。アデノウイルス全般アデノウイルスはエンベロープを有さない規則的な正二十面体（icosohedron ）である。タンパク質コート（キャプシド）は252個のキャプソメアから構成される。このキャプソメアのうち240個はヘキソンであり、そして12個はペントンである。アデノウイルスポリペプチドの詳細な構造研究のほとんどは、アデノウイルス２型および５型について行われている。ウイルスDNAは、アデノウイルス２については23.85×10⁶ダルトンであり、そして血清型に依存してサイズは僅かに変化する。このDNAは逆方向末端反復を有し、そしてこれらの長さは血清型に応じて変化する。複製サイクルは、初期（E）および後期（L）に分けられる。後期は、ウイルス DNA複製の開始を規定する。アデノウイルス構造タンパク質は、一般に後期の間に合成される。アデノウイルス感染の後、宿主DNAおよびタンパク質合成は、ほとんどの血清型に感染した細胞において阻害される。アデノウイルス２およびアデノウイルス５を用いるアデノウイルス溶菌サイクルは、非常に効率的であり、そして過剰のウイルスタンパク質の合成およびビリオン中に取り込まれないDNA とともに、感染細胞当たり約10,000ビリオンを生じる。初期のアデノウイルス転写は、相互関係のある生化学的事象の複雑な連鎖であるが、それは、ウイルスDN A複製の開始の前にウイルスRNAの合成を必須的に要する。アデノウイルスゲノムの機構はアデノウイルス群の全てにおいて類似し、そして特定の機能は、研究された各血清型について同一の位置に位置づけられている。初期の細胞質メッセンジャーRNAは、ウイルスDNA上の４つの規定された隣接しない領域に相補的である。これらの領域は命名されている（E1〜E4）。初期の転写物は、一連の即時型初期（E1a）領域、遅延型初期（E1b、E2a、E2b，E3、および E4）領域、および中期（IVa2.IX）領域に分類されている。 E1a領域は、ウイルス性および細胞性遺伝子の転写のトランス活性化(transact ivation)ならびに他の配列の転写抑制に関与する。E1a遺伝子は、他の全ての初期アデノウイルスメッセンジャーRNAに対して重要な制御機能を発揮する。正常な組織では、E1b、E2a、E2b、E3、またはE4領域を効率的に転写するために、活性なE1a産物が必要とされる。しかし、以下に考察されるように、E1a機能はバイパスされ得る。細胞は、E1a様機能を提供するように操作され得るか、またはそのような機能を天然に含み得る。ウイルスはまた、以下に記載されるように、この機能をバイパスするように操作され得る。 E1b領域は、感染後期のウイルス事象の正常な進行に必要とされる。E1b産物は宿主核中で作用する。E1b配列内に生成された変異は、減少した後期ウイルスmRN Aの蓄積、ならびにアデノウイルス感染の後期に通常観察される宿主の細胞輸送の阻害に障害を示す（Berkner，K.L.，Biotechniques 6:616-629(1988)）。E1b は、プロセシングおよび輸送がウイルスの後期遺伝子産物に有利にシフトされるように、宿主細胞の機能を変化させるために必要とされる。次いでこれらの産物は、ウイルスのパッケージングおよびビリオンの放出を生じる。E1bは、アポトーシスを防止する19kDタンパク質を産生する。E1bはまた、p53に結合する55kDタンパク質を産生する。アデノウイルスおよびそれらの複製に関する完全な総説については、Horwitz ，M.S.，Virology第２版、Fields，B.N.編、Raven Press Limited，New York(19 90)，60章，pp．1679-1721を参照のこと。組換え送達ベヒクルとしてのアデノウイルスアデノウイルスは、以下の理由により、適切な遺伝子送達のためのベクターとしての利点を提供する。アデノウイルスはヒト呼吸器系および消化管に向性を有する２本鎖DNAの非エンベロープウイルスである。アデノウイルスは穏やかなインフルエンザ様疾患を引き起こす。アデノウイルスベクターは、レセプター媒介エンドサイトーシスにより細胞に侵入する。大きな（36キロ塩基）ゲノムは、外来DNAが挿入され、そしてウイルスゲノムから発現されるように、複製に必須な遺伝子および必須でない領域の除去を可能にする。アデノウイルスは、インビボおよびインビトロにおいて広範な種々の細胞タイプに感染する。アデノウイルスは、遺伝子治療および異種の遺伝子の発現のためのベクターとして用いられている。アデノウイルスゲノムからのウイルスの遺伝子または外来遺伝子の発現は、複製している細胞を必要としない。アデノウイルスベクターは、宿主染色体中にまれにしか組み込まれない：アデノウイルスゲノムは、細胞の核内に染色体外エレメントとして残る。アデノウイルス感染とヒト悪性腫瘍との関連はない；弱毒化株が開発され、そして生ワクチンのためにヒトにおいて使用されている。遺伝子治療のためのアデノウイルスベクターの使用に関するより詳細な考察については、Berkner，K.L.，Biotechniques 6:616-629(1988)；Trapnell，B.C.， Advanced Drug Delivery Reviews 12:185-199(1993)を参照のこと。アデノウイルスベクターは、一般にこのウイルスのE1領域において欠損を有する。次いで、E1領域は目的のDNA配列に置換され得る。しかし、ヒト遺伝子治療に関する最近の論説において、「遺伝子転移ベクターとしてのアデノウイルスのの使用における主要な不利な点は、このウイルスベクターが一般に、遺伝子副体 (episomal)として残り、そして複製せず、従って、細胞分裂が娘細胞からのこのベクターのいずれ起こる喪失を導く」ことが指摘された（Morgan，R.A.ら、Annu al Review of Biochemistry 62:191-217(1993)）（強調される）。このベクターの非複製は、ほとんどまたは全ての標的細胞における発現を伴うことなくベクターのいずれ起こる喪失を導くだけでなく、ベクターを取り込む細胞において不十分な発現をも導く。なぜなら、発現を所望される遺伝子のコピーが最大の効果には不十分であるためである。遺伝子発現の不十分さは、全ての非複製送達ベクターの一般的な欠点である。従って、複数のコピーの遺伝子を提供し得、そしてそれによってより多量のその遺伝子産物を提供し得るベクターを導入することが望ましい。本発明は、組織特異的、特に腫瘍特異的に複製するベクター、複数のDNAコピー、およびそれによって増大した量の遺伝子産物を提供することにより、上記で考察された不利な点を解消する。アデノウイルスベクターの産生組換え遺伝子発現のためのアデノウイルスベクターは、ヒト胎児腎細胞株293 において産生されている（Graham，F.L.ら、J.Gen.Virol．36:59-72(1977)）。この細胞株（初期には、ヒトアデノウイルス５で形質転換された）は、現在ではアデノウイルス５ゲノムの左の末端を含有し、そしてE1を発現する。それ故、これらの細胞は、E1機能に欠損を有するアデノウイルス２およびアデノウイルス５の変異体の増殖を許容する。これらは、E1変異体の単離および伝播のために広範に使用されている。それ故、293細胞は、哺乳動物細胞におけるアデノウイルスベクターのヘルパー非依存性のクローニングおよび発現のために使用されている。293細胞の細胞性DNAに組み込まれたE1遺伝子は、ウイルスベクターゲノムからこれらの遺伝子の欠失を許容するレベルで発現される。この欠失は、DNAが挿入され得る必須ではない領域を提供する。総説については、Young，C.S.H.ら、The Adenoviruses，Ginsberg，H.S．編、Plenum Press，New York and London(1984 )，pp．125-172を参照のこと。しかし、293細胞は、アデノウイルスベクターのプロデューサー細胞として厳しい制限を受けやすい。増殖速度が低い。力価が限定される（特にベクターが細胞に対して毒性を示す異種遺伝子産物を産生する場合）。ゲノムにおけるウイルスE1配列での組換えは、安全でない野生型ウイルスでの組換え能欠損ウイルスの汚染を導き得る。特定のウイルス調製物の質は、プラーク形成単位に対するウイルス粒子の比に関して貧弱である。さらに、この細胞株は、より高度に欠失した変異体の増殖を支持しない。なぜなら、細胞性ゲノムにおける他のウイルス遺伝子（さらなる欠失を補完するために必要とされる）（例えば、E4）との組み合わせにおけるE1の発現は、この細胞に対して毒性であるためである。それ故、ウイルスゲノム中に挿入され得る異種DNAの量は、これらの細胞中で制限される。従って、野生型組換え体を産生し得ず、そして高力価の質が高いウイルスを産生し得る細胞中で、遺伝子治療のためのアデノウイルスベクターを産生することが望ましい。本発明はこれらの制限を解消する。発明の要旨上記で論じた制限を考慮すると、本発明の一般的な目的は、組織特異的ベクター複製およびこの複製ベクターからの遺伝子発現のための新規なベクターを提供することである。従って、本発明は、複製に必須である遺伝子を含有するベクターに関し、この遺伝子は、異種の転写調節配列に作動可能に連結されており、それによりベクターは、その複製が、転写調節配列からの転写を可能にするトランスに作用する転写調節因子が存在すること、または転写調節配列からの転写を通常妨げる転写調節因子が存在しないことによって条件付けされるように作製される。従って、これらの調節配列は、標的組織においてベクターの複製が行われるように、その組織において特異的に活性化または脱抑制される。本発明の別の目的は、異常な組織の組織特異的処置を提供することである。従って、本発明のさらなる目的は、標的組織においてインビボでベクターを選択的に分配し、それにより、非複製ベクターで処置され得る細胞よりも多数の細胞が処置され、そして処置が非標的組織において回避されるかまたは有意に減少する方法を提供することである。従って、本発明の複製条件的ベクターを、ベクターの複製を可能にする転写調節因子を含有するか、またはこのベクターの複製を妨げる転写阻害因子が欠損している標的組織に導入することにより、標的組織中にベクターを選択的に分配する方法が提供される。組織特異的処置を提供するために、本発明の別の目的は、インビボで標的組織中にポリヌクレオチドを選択的に分配することである。従って、本発明は、ポリヌクレオチドを含有する本発明の複製条件的ベクターを、このベクターの複製を可能にする転写調節因子を含有するか、またはこのベクターの複製を妨げる転写阻害因子が欠損している標的組織中に導入することにより、ポリヌクレオチドをインビボで標的組織中に選択的に分配する方法に関する。組織特異的処置を提供するために、本発明のさらなる目的は、標的組織中に異種の遺伝子産物を選択的に分配することである。従って、本発明の複製条件的ベクターは、ベクター中で発現される遺伝子産物をコードする異種のDNA配列を含むように構築する。標的組織において、ベクターが複製される場合、所望の遺伝子産物の有効量がまた、標的組織において産生される。本発明の別の目的は、本発明のベクターにより処置され得る異常な組織を同定する方法を提供することである。従って、本発明のさらなる目的は、本発明の複製条件的ベクターがベクターに含まれる転写調節配列により複製され得る組織を同定することである。従って、本発明はさらに、本発明の複製条件的ベクターを所定の異常な組織に曝す方法に関する。組織がベクターの複製を可能にする転写調節因子を含有するか、またはベクターの複製を妨げる転写阻害因子が組織において欠損しているならば、ベクターの複製が生じ、そして検出され得る。このような組織の同定後、この組織の標的化された処置は、インビボでのこの組織における組織特異的転写およびその後のベクター複製によりもたらされ得る。従って、ベクターの組織処置に対する有用性をアッセイするための方法が提供される。この方法は、患者から組織生検を取り出す工程、生検を組織培養に外植する工程、複製条件的ベクターを生検の細胞に導入する工程、および細胞におけるベクター複製についてアッセイする工程を包含する。本発明の別の目的は、ベクターを産生するためのプロデューサー細胞株を提供することである。好ましくは、細胞株は、以下の１またはそれ以上の特性を有する：高力価のウイルス産生、ベクターにおいて発現される異種遺伝子産物による毒性効果に対する耐性、ウイルス調製で混入するおよび組み込まれたウイルス配列とベクター配列との間の組換えから生じる野生型ウイルスの産生がないこと、高密度でかつ懸濁状態の増殖、無制限の継代可能性、高い増殖速度、およびウイルスの機能が損なわれており、かつ異種DNAの大きな部分を収容し得る、高度に欠失したウイルスの増殖を可能にすることによる。従って、本発明のさらなる実施態様において、本発明の複製条件的ベクターを含有する細胞株が提供され、この細胞株の細胞は、ベクターの複製を可能にする転写調節因子を含むか、またはベクターの複製を妨げる転写阻害因子が欠損している。本発明のさらなる実施態様において、細胞株は、複製されたベクターの核酸コピーを含有する。他の実施態様において、細胞株は、細胞中での複製条件的ベクターの複製により細胞中で産生されたビリオンを含有する。さらなる実施態様において、複製条件的ベクターまたはビリオンを産生するための方法が提供され、この方法は、上記のプロデューサー細胞株を培養する工程および細胞からベクターまたはビリオンを回収する工程を包含する。なおさらなる実施態様において、野生型ビリオンを含まない複製条件的ビリオンまたは野生型ベクターを含まないウイルスベクターを産生するための方法が提供され、この方法は、上記のプロデューサー細胞株を培養する工程および細胞から複製欠損性のビリオンまたはベクターを回収する工程を包含する。処置および診断の好ましい方法において、組織は、異常に増殖している組織、および特に腫瘍組織である。しかし、この方法はまた、本明細書中に記載の他の異常組織に関する。本発明の好ましい実施態様において、複製条件的ベクターは、DNA腫瘍ウイルスベクターである。さらに好ましい実施態様において、DNA腫瘍ウイルスベクターは、ヘルペスウイルス、パポバウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、および肝炎ウイルスベクターからなる群より選択されるベクターである。最も好ましい実施態様において、ベクターはアデノウイルスベクターである。しかし、組織特異的転写調節配列に作動可能に連結され得る複製に必須な遺伝子を含有するのであれば、潜在的には任意のウイルス供給源が有用であることを理解されたい。処置および診断のさらなる方法において、ベクターは、感染により組織中に導入され得る。複製は、ベクター核酸複製単独であり得るか、またはウイルス複製（すなわち、ビリオン産生）もまた含み得る。従って、DNAまたはビリオンのいずれか、またはその両方が、標的組織中に分配され得る。本発明のさらに好ましい実施態様において、アデノウイルスE1領域における遺伝子が、組織特異的転写調節配列に作動可能に連結される。好ましくは、E1aまたはE1b遺伝子が、組織特異的転写調節配列に作動可能に連結される。本発明のさらなる実施態様において、ベクターは、異種遺伝子産物をコードする。この異種遺伝子産物は、標的組織中で複製するベクターから発現される。処置方法のさらなる実施態様において、異種遺伝子産物は、標的組織に対して毒性である。この方法のさらなる実施態様において、異種遺伝子産物は、非毒性プロドラッグに作用して、非毒性プロドラッグを標的組織に対して毒性である形態に変換し得る。好ましくは、トキシンは、高腫瘍活性を有するか、または細胞増殖を排除する。本発明の好ましい実施態様において、転写調節配列は、プロモーターである。好ましいプロモーターは、癌胎児性抗原（CEA）、DE3、α-フェトプロテイン（A FP）、Erb-B2、表面活性物質および特に肺表面活性物質、ならびにチロシナーゼのプロモーターを包含するが、これらに限定されない。しかし、必須遺伝子の転写を制御する任意の遺伝制御領域は、この遺伝子を活性化（または脱抑制）するために用いられ得る。従って、他の遺伝制御エレメント（例えば、エンハンサー、抑制的配列、およびサイレンサー）は、標的細胞におけるベクターの複製を調節するために用いられ得る。遺伝エレメントが、宿主細胞において、および処置方法に関しては、非標的細胞においてではなく、この因子により活性化、脱抑制、増強、またはさもなければ遺伝的に調節されることのみが必要である。好ましいエンハンサーは、DF3乳癌特異的エンハンサー、ならびにウイルスおよびステロイドレセプターファミリー由来のエンハンサーを包含する。他の好ましい転写調節配列は、NF1、SP1、AP1、およびFOS/JUNを包含する。さらに好ましい実施態様において、プロモーターは、標的組織中で因子により必ずしも活性化されないが、しかし標的組織中に存在する因子により脱抑制される。従って、標的組織において、抑制が解除される。転写調節因子は、内因性ウイルス配列（例えば、サイトメガロウイルス（CMV ）、HIV、エプスタインバールウイルス（EBV）、単純ヘルペスウイルス（HSV）、SV40、ならびに哺乳動物、特にヒトにおいて病原性であるような他のウイルスに由来する配列）により産生されるトランスアクチベーター因子を包含するが、これらに限定されない。このようなベクターを作製する方法は、当業者に周知である。当該技術は、特定のコード配列に欠失または改変、そして所望のコード領域の発現が異種の転写調節配列の制御下にあるような異種の転写制御配列への作動可能な連結を有する組換えベクターの構築を適切に教示する。多くのウイルス配列は、組織特異的な複製および発現のためのベクターを構築するために、選択の遺伝子を同定し、そして適切な周知の技術（例えば、ウイルスと欠失されたまたはさもなければ改変されたプラスミドとの相同的組換え）を用いることが日常的なことであるように、適切にマップされている。図面の簡単な説明図１．pAVE1a02iのクローン化：pAVSAFP.TK1を、NheI/MunIで消化した。10667 bpのフラグメントを単離した。pSE280-E1を、SpeI/MunIで消化した。3397bpのフラグメントを単離した。単離したフラグメントを連結して、pAVE1a02iを形成した。図2A〜2C．ヘパトーマ特異的AFPプロモーターから発現されるE1aを有する組換えアデノウイルスのPCR同定。図2Aは、ウイルスプラークが、E1aに作動可能に連結したAFPプロモーターを含むウイルスゲノムにより産生されることを示す。図2 Bは、野生型ウイルスの混入がなかったことを示す。図2Cは、AV1lacZ DNAの混入が無かったことを示す。図3A〜3F．AFPプロモーターから発現されたE1aを有する組織特異的アデノウイルス。この実験は、ウイルスAVAFPE1aで感染させた後の細胞変性効果および細胞死の拡散を示す。図3A〜3Cは、それぞれ、A549.30、A549、およびHuH 7細胞における非感染コントロールを示す。図3D〜3Fは、それぞれ、A549.30、A549、およびHuH 7細胞におけるウイルスでの感染結果を示す。好ましい実施態様の詳細な説明定義用語「異常に増殖している」は、細胞を異常に蓄積するような、通常に機能する相対物よりも高い有糸分裂指数を有する細胞を意味することが意図される。用語「抗腫瘍活性」は、腫瘍の増殖を阻害、妨害、または破壊する、任意の活性を意味することが意図される。用語「分配する」は、ベクターおよびそれに付随する異種の遺伝子（産物）（ベクター上に存在する場合）の、標的組織、および特に、異常に増殖している組織（良性、または悪性の）への分布を意味することが意図される。この分配の目的は、ベクター、遺伝子産物、または遺伝子産物の効果（例えば、バイスタンダー(bystander)効果によるように）を、実質的に全ての標的組織を処置するために、標的組織の実質的に全てまたはかなりの数の細胞に送達することである。用語「エンハンサー」は、当該分野で認識されている意味に従って用いられる。これは、真核生物および特定の真核生物ウイルスにおいて見出される配列を意味し、この配列は、研究されている遺伝子から数キロ塩基までに位置した（どちらの方向においても）場合に、遺伝子からの転写を増大し得る。これらの配列は、通常、該当する遺伝子の5'側（上流）にある場合、エンハンサーとして作用する。しかし、いくつかのエンハンサーは、遺伝子の3'側（下流）に配置される場合に、活性である。いくつかの場合には、エンハンサーエレメントは、（既知の）プロモーターなしで、遺伝子からの転写を活性化し得る。用語「機能的不活性化」は、遺伝子産物の正常な活性を妨げる遺伝的な障害を意味することが意図される。従って、機能的不活性化は、遺伝子産物をコードする遺伝子における変異から生じ得る。このような障害は、挿入、欠失、および塩基変化を包含する。あるいは、機能的不活性化は、正常な遺伝子産物と、上記の遺伝子産物に結合するか、またはさもなければ機能的活性を妨げる１またはそれ以上の別の細胞遺伝子産物との異常な相互作用により起こり得る。従って、この遺伝子産物は、正常な遺伝子より生産されるタンパク質であり得るが、しかし、２次因子との相互作用のために、その通常および正常の機能を行い得ない。用語「複製に必須な遺伝子」は、その転写が、標的細胞において複製するためのベクターに必要とされる遺伝子配列をいう。用語「遺伝子産物」は、DNA、RNA、タンパク質、ペプチド、またはウイルス粒子を意味することが意図される。従って、分配は、本発明の目的のために、これらの構成要素のいずれかのものである。用語「異種の」は、天然のベクターゲノム中に見出されないDNA配列を意味する。「異種の転写調節配列」に関しては、「異種の」は、転写調節配列が、ベクターの複製に必須な遺伝子のDNA配列に、天然には連結されないことを示す。用語「プロモーター」は、当該分野で認識されている意味に従って用いられる。これは、RNAポリメラーゼを結合し、そして酵素を適正な転写開始部位に指向させる、通常は遺伝子のコード配列またはオペロンの上流にある、DNA領域を意味する。用語「複製(replication)」は、ベクターの複製(duplication)を意味する。この複製は、ウイルスの場合には、核酸のレベルまたは感染性ウイルス粒子のレベルにおいて起こり得る。DNAウイルスの場合には、核酸レベルにおける複製はDNA 複製である。RNAウイルスの場合には、核酸複製は、プラス鎖またはマイナス鎖（または両方）への複製である。例えばレトロウイルスの場合には、核酸レベルにおける複製は、cDNAの生産およびさらにRNAウイルスゲノムの生産を含む。この必須の特性は、元来のウイルスベクターの核酸コピーである。しかし、複製はまた、感染性のDNAまたはRNAウイルス粒子の形成を包含する。このような粒子は、所定の標的組織内の細胞を連続的に感染し得、従って標的組織の全てまたはかなりの部分にベクターを分配し得る。用語「複製条件的ベクター」は、組織内に導入された場合、そのベクター内の転写調節配列がその組織内で活性化または脱抑制されなければ、複製しないベクターをいう。すなわち、複製は、その転写調節配列による転写に依存する。このようなベクターは、以下のようにして改変されたため、記載のように複製条件的である。複製に必須な遺伝子は、その遺伝子の転写が通常異種の転写調節配列に依存する転写調節配列を置換することにより改変された。この転写調節配列は、転写調節因子の存在または転写調節阻害因子の欠損に依存する。これらの因子の所定の組織内における存在、またはこのような阻害因子の所定の組織内における欠損は、複製条件付き制限を提供する。従って、天然の転写調節配列は、異種の転写調節配列と置換され得る。あるいは、天然の転写調節配列は、部分的な除去（欠失）または他の変異（１またはそれ以上の塩基変化、挿入、反転など）により、無能化され得るか、または機能障害とされ得る。遺伝子配列は、コード配列であり得る。これは、１またはそれ以上のオープンリーディングフレームおよびイントロン配列を含み得る。しかしこのような配列は、コード配列に限定されず、RNAに転写される配列を包含する。ここでは、RNA がそれ自身ベクターの複製に必須である。この必須の特性は、その遺伝子配列の転写が天然の転写調節配列に依存しないことである。用語「サイレンサー」は、当該分野で認識されている意味において用いられ、遺伝子から数キロ塩基以内に位置した場合にその遺伝子の転写を減少または沈黙させ得る、真核ウイルスおよび真核細胞において見出される配列を意味する。用語「組織特異的」は、複製に必須な遺伝子が、作動可能に連結されている転写調節配列が、その組織内で複製が進行するように、その組織において特異的に機能することを意味する。これは、その組織内で、転写調節配列を活性化する正の転写因子の存在により起こり得、そして非標的組織内では起こり得ない。これはまた、非標的組織に通常存在する転写阻害因子の欠損により起こり得、そして転写調節配列の結果として転写を妨げ得る。従って、転写が起こる場合、それは、この標的組織において、ベクターの複製およびそれに伴う機能が起こるように、複製に必須な遺伝子に進行する。本明細書中に記載のように、組織特異性は、正常な組織の異常な相対物の処置において特に関係がある。このような相対物は、肝臓組織および肝臓癌、胸部組織および乳癌、メラノーマ、ならびに正常皮膚組織を包含するが、これらに限定されない。組織特異性はまた、異なる組織型の正常組織中に散在した異常組織型の存在（例えば、結腸癌、乳癌などの、例えば肝臓のような組織への転移の場合）を包含する。この場合、標的組織は異常組織であり、そして組織特異性は、正常組織中に散在した異常組織にベクター複製が制限されることを反映する。また、組織特異性は、処置に関しては、インビボに特に関係があると理解される。しかし、本明細書中で記載するように、エクスビボ処置および組織置換もまた、本発明に従って組織特異性の概念内にある。用語「転写調節機能」または「転写調節因子」は、その存在が本明細書中に記載の異種の転写調節配列を活性化するか、またはその欠損が本明細書中に記載の転写調節配列の結果として転写を可能にする任意の細胞機能を意味することが意図される。所定の標的組織において、「転写調節因子を欠損する」組織または転写調節因子が「欠損(deficient)」する組織とは、その標的組織における因子の欠損または因子の機能的不活性化のいずれかをいい得ることが理解される。用語「転写調節配列」は、当該分野で認識されている意味に従って用いられる。これは、その配列により、連結された遺伝子に特定の細胞においてアップレギュレートまたはダウンレギュレートのいずれかを引き起こし得る任意のDNA配列を意味することが意図される。本発明の１つの実施態様では、天然の転写調節配列がベクターから完全に欠失され、異種の転写調節配列と置換される。転写調節配列は、複製に必須な遺伝子のコード領域に近接し得るか、またはそこから離され得る。従って、プロモーターの場合、プロモーターは、一般にコード領域に近接する。しかしエンハンサーの場合には、エンハンサーは、例えば、エンハンサーとコード領域との間に介在DNA配列が存在するように、コード領域からある距離で見出され得る。いくつかの場合では、天然の転写調節配列はベクター上に残存するが、複製に必須な遺伝子の転写に関して非機能的である。転写調節配列の種々の組み合わせが、ベクター中に含まれ得る。１またはそれ以上が異種性であり得る。さらに、１またはそれ以上が組織特異性を有し得る。例えば、単一の転写調節配列は、１より多くの複製に必須な遺伝子による複製の駆動に用いられ得る。これは、例えば、これらの遺伝子の１つの遺伝子産物が、さらなる遺伝子(単数または複数)の転写を駆動する場合である。１つの例は、E1 aコード配列（E1aプロモーターを欠失した）および完全なE1b遺伝子を含有するカセットに連結された異種のプロモーターである。このようなカスケードにおいては、ただ１つの異種の転写調節配列が必要であり得る。しかし、遺伝子が独立に（別個に）制御される場合、１より多くのこのような遺伝子が複製の制御に望ましいならば、１より多くの転写調節配列が用いられ得る。従って、本発明のベクターはまた、転写調節配列の組み合わせを含み得、ここでは１より多くの異種の転写調節配列が存在するが、しかしこれらの１つまたはそれ以上は組織特異的ではない。例えば、１つの転写調節配列は、基底(basal) レベルの構成的な転写調節配列であり得る。例えば、組織特異的エンハンサーは、基底レベルの構成性プロモーターと組み合わされ得る。ベクター本発明の好ましいベクターは、アデノウイルスベクターである。本発明の好ましい実施態様において、アデノウイルスベクターは、E1領域における遺伝子と連結された組織特異的転写調節配列を含む。１つの実施態様において、E1aおよびE1bの両方が異種の組織特異的転写調節配列に作動可能に連結される。別の実施態様において、E1aのみが連結され；E1bは完全なままである。なお別の実施態様において、E1bは連結され、そしてE1aは完全なままであるか、または欠失される。いずれの場合においても、１またはそれ以上の組織特異的およびプロモーター特異的細胞転写調節因子は、プロモーターに機能的に連結されたE1aおよび/またはE1b遺伝子の転写によりウイルス複製を続行させる。さらに、E1b機能の１つまたは両方のいずれかは、転写調節配列に連結され得る。別の実施態様において、アデノウイルスベクターは、異種の転写調節配列の制御下で複製に必須な他の任意の遺伝子(例えば、E2〜E4)とともに提供される。本発明はさらに、E1a、E1b 19kDa遺伝子、またはE1b 55kDa遺伝子のいずれか、あるいはそれらのいくつかの組合せが改変された、複製に必要とされるアデノウイルスの必須の領域のみを有するプラスミドおよびベクターの使用に関する。任意の構造遺伝子を欠損したこのようなプラスミドは、DNA複製を受け得る。従って、本発明のベクターは、本質的に、転写調節配列およびベクターの複製に必須な１またはそれ以上の遺伝子からなり得る。ウイルスベクターの場合には、ベクターは、転写調節配列およびウイルスの複製または生活環機能に必須な遺伝子または遺伝子群から本質的になり得る。さらに、これらのベクターはまた、このようなベクターが処置のための発現ベクターとして意図される場合、１またはそれ以上の毒性異種遺伝子産物をコードするDNA配列から本質的になり得ることもまた理解される。より広範な実施様態において、ベクターは、別のDNA腫瘍ウイルスに由来する。このようなウイルスは、一般的にヘルペスウイルス(例えば、エプスタインバールウイルス、サイトメガロウイルス、帯状疱疹、および単純ヘルペス)、パピローマウイルス、パポバウイルス(例えば、ポリオーマおよびSV40)ならびに肝炎ウイルスを含むが、これらに制限されない。好ましい別のウイルスは、任意のウイルス群から選択される。ここで、ウイルスの複製について必須な遺伝子は、組織特異的転写調節配列の制御下に位置され得る。全ての血清型が含まれる。従って、このようなウイルスの唯一の共通特性は、それらが標的組織に形質導入可能であり、遺伝子操作可能であり、そして複製しない場合、非毒性であることである。適切なウイルス遺伝子は、ウイルスベクターまたはウイルスの複製に必須な遺伝子である。遺伝子の例として、ヒトパピローマウイルスの16および18のE6およびE7領域、SV40のＴ抗原ならびにCMV即時初期遺伝子、レトロウイルスなどからのポリメラーゼが含まれるが、これらに制限されない。本質的に、これらはウイルスの生活環に必要な任意の遺伝子を含む。さらなる実施態様において、ベクターはRNAウイルスに由来する。なおさらなる実施態様において、ベクターはレトロウイルスに由来する。しかし、任意の潜在的な複製ベクターは、本明細書中に開示された本質的な設計に従って作製され、そして使用され得ることが理解される。本明細書中に記載されたベクターは、標準的な分子生物学的技術を用いて構築され得る。このようなベクターの構築のための標準的な技術は、当業者には周知であり、そしてSambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spr ing Harbor,New York(1989)または広く入手可能な組換えDNA技術に関する任意の無数の研究マニュアルのような参考文献において見出され得る。種々のストラテジーが、DNAフラグメントの連結のために利用可能であり、その選択はDNAフラグメントの末端特性に依存し、そして当業者により容易に決定され得る。好ましい実施態様において、アデノウイルスベクターは、標準技術に従って５ ’末端で始まる「臨界左末端因子」を含むシャトルプラスミドの構築により最初に構築される。これは、アデノウイルス5'ITR、アデノウイルスキャプシド形成シグナル、およびE1aエンハンサー配列；プロモーター（アデノウイルスプロモーターまたは外来プロモーターであり得る）；３部からなるリーダー配列、マルチクローニング部位（これは本明細書中に記載されたようなものであり得る）；ポリＡシグナル；ならびにアデノウイルスゲノムのセグメントに対応するDNAセグメントを含む。このようなDNAセグメントは、改変または変異アデノウイルスを用いる相同的組換えのための基質として働く。プラスミドはまた、選択可能なマーカーおよび複製起点を含み得る。複製起点は、細菌の複製起点であり得る。このようなシャトルプラスミドの代表的な例は、本明細書中で考察されているようなpAVS6を含む。Trapnell,Bら、Adv．Drug Deliv.Rev 12:185-189(1994) を参照のこと。次いで、異種の遺伝子を含む所望のDNA配列は、プラスミドベクターを生成するためにマルチクローニング部位に挿入され得る。次いで、この構築物を用いてアデノウイルスベクターを生成する。次いで、相同的組換えは、改変または変異アデノウイルスを用いて達成され得る。このようなウイルスでは、１またはそれ以上の天然の転写調節配列が欠失され、そして所望の転写調節配列で置き換えられている。このような相同的組換えは、CaPO₄沈澱によるヘルパー細胞株へのプラスミドベクターおよび改変アデノウイルスの同時トランスフェクションにより、達成され得る。このような相同的組換えにより、１またはそれ以上の天然の調節配列を有さないアデノウイルスDNAを含むベクターが形成される。次いで、このベクターは、ウイルス複製のためのヘルパー細胞株にトランスフェクトされ、そして感染性ウイルス粒子が産生され得る。トランスフェクションは、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈澱、マイクロインジェクションにより、またはプロテオリポソームを通して行われ得る。ベクターは、異種遺伝子を含むDNA配列のクローニングベクターへの挿入を容易にするためのマルチクローニング部位を含み得る。一般に、マルチクローニング部位は、「まれな」制限酵素部位；すなわち10,000塩基対毎に約１つから100, 000塩基対毎に約１つまでの頻度で真核生物遺伝子に見出される部位を含む。従って、適切なベクターは、マルチクローニング部位中の適切な制限部位で、標準的な技術によりクローニングベクターを切断し、次いで、異種遺伝子を含むDNA 配列をクローニングベクター中に連結することにより形成される。異種遺伝子産物をコードするDNA配列は、適切なプロモーターの制御下に位置される。使用され得る適切なプロモーターは、アデノウイルスプロモーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）、または異種プロモーター（例えば、サイトメガロウイルスプロモーター）；ラウス肉腫ウイルスプロモーター、誘導性プロモーター（例えば、マウス乳房腫瘍ウイルス(MMTV)プロモーター、メタロチオネインプロモーター）；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ApoEプロモーター；およびApoAIプロモーターを含むが、これらに限定されない。しかし、本発明の範囲は、特定の外来遺伝子またはプロモーターに制限されないことを理解されるべきである。１つの実施態様において、アデノウイルスは、本明細書中に含まれる教示とともに、Ketnerら、Proc.Nat.Acad.Sci.91:6186-6190(1994)に記載された方法に従って、アデノウイルスゲノムを含む酵母人工染色体を用いることにより構築され得る。この実施態様において、アデノウイルス酵母人工染色体は、アデノウイルスDNAとアデノウイルス左および右ゲノム末端セグメントを保有する酵母人工染色体プラスミドベクターとの間のインビボ相同的組換えにより産生される。次いで、異種遺伝子を含むDNA配列は、アデノウイルスDNA中にクローン化され得る。次いで、改変アデノウイルスゲノムは、感染性アデノウイルス粒子を産生するのに用いられるためにアデノウイルス酵母人工染色体から切り出される。次いで、感染性ウイルス粒子は、宿主にインビボで投与され得る。宿主は、哺乳動物、非ヒト霊長類、およびヒト宿主を含む動物宿主であり得る。ウイルス粒子は、患者への投与に適切な薬学的に受容可能なキャリアーと組み合わせて投与され得る。キャリアーは、液体キャリアー（例えば、生理食塩水）、または固体キャリアー（例えば、マイクロキャリアービーズ）であり得る。処置好ましい実施態様において、本方法は、特に、複製条件的アデノウイルスベクターの標的組織への導入に関する。このベクターは、標的組織の細胞中で選択的に複製する。この複製は、ウイルス遺伝子が作動可能に連結される転写調節配列の機能によって調節され、この遺伝子は、ベクターの複製に必要である。従って、標的組織において、標的組織中のどちらかの細胞機能が転写を可能にするために、複製が生じ得る。あるいは、転写を正常に妨害または阻害する標的組織における細胞機能には欠損がある。このような機能の存在または欠如は、周りの組織への影響を最小限にしながら、特定の組織の処置を可能にする選択性を提供する。従って、本発明は、与えられた組織にインビボでポリヌクレオチドを選択的に分配し、非標的組織中の分配を有意に減少または回避する方法を提供する。このポリヌクレオチドを、与えられた組織に選択的に分配される複製条件的ベクターに提供する。本発明はまた、与えられた組織中に遺伝子産物を選択的に発現し、非標的組織または非腫瘍組織中の発現を回避または有意に減少させる方法を提供する。本発明は、非複製ベクターを用いて達成し得る数よりも多い標的細胞に上記のものを分配する方法を提供する。連続的な感染は、標的組織中の全てのまたは実質上全ての細胞に到達するように、「ドミノ効果」を提供する。従って、この方法により、ポリヌクレオチド、ベクター、または遺伝子産物に最初に曝露した細胞に加え、細胞に到達することが可能となる。このような処置は、手術による介入が実行可能でない場合、特に必要である。例えば、神経組織と親密に関連した異常組織を有する患者において、手術は、排除され得るか、または非常に危険であり得る。さらに、多発性転移または微視的な転移の場合、手術は実行可能ではない。標的組織において、DNA複製のみが生じ得る。ビリオンへのベクターDNAのパッケージングをもたらす後期ウイルス機能もまた生じ得る。このベクターは裸のDNAとしてまたは包膜（感染性ウイルス粒子またはビリオンとして）手段により標的組織に導入され得る。後者の場合、分配は、実質上全ての娘細胞またはかなりの数の娘細胞が感染されるように、ウイルスによる組織中の細胞の連続的な感染によって達成される。組織特異性は、組織の正常部分を避けるが一方、特定の組織型の異常部分を標的化すること、または異常組織を処置するが一方、この異常組織と異なる型の周囲の組織を回避することについて特に関連している。例えば、本発明のベクターは、肝臓への転移を処置するのに有用である。１つの特定の例は大腸癌であり、これはしばしば肝臓に転移する。大腸癌が肝臓に転移した場合でさえ、CEAプロモーターは、転移の細胞中で活性であるが、正常な肝細胞では活性ではないことが見い出されている。従って、正常な成人肝臓は、大腸癌CEA特異的プロモーターに連結された複製に必須なウイルス遺伝子を有するウイルスの複製を支持するべきではない。複製は、一次癌細胞中で起こるべきである。別の例は、乳癌であり、これもまた肝臓に移転する。この場合、DF3ムチンエンハンサーは、E1aおよびE2aの両方のような複製に必須な遺伝子に連結される。複製は、乳癌中で起こるべきであって、正常な肝臓中で起こるべきではない。さらなる例は、α-フェトプロテインプロモーターであり、これは肝細胞癌腫において活性である。このプロモーターは、複製に必須な遺伝子に連結される。このプロモーターは、肝細胞の癌腫においてのみ活性であることが見い出されている。従って、このプロモーターに連結される複製に必須な遺伝子を有するウイルスが、使用される。複製は、肝細胞癌腫に限定されるべきである。さらなる例は、チロシナーゼプロモーターである。このプロモーターは、複製に必須な遺伝子に連結される。複製は、メラノーマ中で起こるべきであり、正常な皮膚中で起こるべきではない。各々の場合において、複製は、正常な細胞中ではなく、異常な細胞中で期待される。本発明のさらなる実施態様において、ベクターは、組織細胞中のベクターから発現される異種遺伝子産物をコードする。異種遺伝子産物は、標的組織中の細胞に対して毒性を持ち得るか、または別の所望する性質を与えられ得る。ベクター自身が組織中に分配されるので、ベクターにより産生された遺伝子は、全組織中に分配され得る。あるいは、遺伝子産物の発現は、局在化され得るが、バイスタンダー効果またはケモカインのような長期間の効果を有する分子の産生のために、その効果をさらに遠くへまで及ぼし得る。この遺伝子産物は、RNA （例えば、アンチセンスRNAもしくはリボザイム）、またはタンパク質であり得る。有毒な産物の例には、ガンシクロビルに関連するチミジンキナーゼがあるが、これに限定されない。広範な毒性効果が可能である。毒性効果は、直接的または間接的であり得る。間接的効果は、プロドラッグを直接的に有毒な薬物に変換することによって得られ得る。例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼは、ガンシクロビルをリン酸化し、ヌクレオチドトキシンリン酸ガンシクロビルを産生する。この化合物は、鎖ターミネーターおよびDNAポリメラーゼインヒビターとして機能し、DNA 合成を妨害するので、細胞毒性がある。別の例は、5'-フルオロシトシンを抗癌剤5'-フルオロウラシルに変換するシトシンデアミナーゼの使用である。このような「自殺」遺伝子の議論について、Blaese,R.M.ら、Eur.J.Cancer 304：1190- 1193(1994)を参照のこと。直接的な毒素は、ジフテリア毒（Brietmanら、Mol.Cell Biol．10：474-479(1 990)）、シュードモナス毒、サイトカイン（Blankenstein,T.ら、J.Exp.Med.173 ：1047-1052(1991)、Colombo,M.P.ら、J.Exp.Med．173：889-897(1991)、Leone, A.ら、Cell 65：25-35(1991)）、アンチセンスRNAおよびリボザイム（Zaia,J.A. ら、Ann.N.Y.Acad.Sci．660：95-106(1992)）、腫瘍ワクチン化遺伝子、およびリボザイムをコードするDNAを含むが、この限りではない。本発明に従って、因子（このような因子の発現によって標的組織または腫瘍細胞の増殖の阻害、妨害、または破壊を提供し得る）は、ネガティブ選択性マーカー；すなわち、化学療法剤または相互作用因子と組み合わせて、標的細胞の増殖を阻害、妨害、または破壊する物質であり得る。従って、ネガティブ選択性マーカーの細胞の導入によって、相互作用因子は、宿主に投与される。この相互作用因子は、ネガティブ選択性マーカーと相互作用し、標的細胞の増殖を妨害、阻害、または破壊する。使用され得るネガティブ選択性マーカーは、チミジンキナーゼおよびシトシンデアミナーゼを含むが、これらに限定されない。１つの実施態様において、ネガティブ選択性マーカーは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、サイトメガロウイルスチミジンキナーゼ、および水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼからなる群より選択されたウイルス性チミジンキナーゼである。ウイルス性チミジンキナーゼを使用する場合、相互作用因子または化学療法剤は、好ましくは、ヌクレオシドアナログであり、例えば、ガンシクロビル、アシクロビル、および１ -２-デオキシ-２-フルオロ-β-D-アラビノフラノシル-５-ヨウドウラシル(FIAU) からなる群より選択された因子である。このような相互作用因子は、基質として、ウイルス性チミジンキナーゼにより効果的に利用され、そしてこのような相互作用因子は、従って、ウイルス性チミジンキナーゼを発現する腫瘍細胞のDNA中へ致命的に組み込まれ、その結果、標的細胞の死を招く。シトシンデアミナーゼがネガティブ選択性マーカーである場合、好ましい相互作用因子は、５-フルオロシトシンである。シトシンデアミナーゼは、５-フルオロシトシンを高い細胞毒性を持つ５-フルオロウラシルに変換する。従って、シトシンデアミナーゼ遺伝子を発現する標的細胞は、５-フルオロシトシンを５-フルオロウラシルに変換し、そして死滅する。相互作用因子は、標的細胞の増殖を阻害、妨害、または破壊するのに効果的な量で投与される。例えば、相互作用因子は、体重および患者に対する全毒性に基づいた量で投与される。好ましくは、この相互作用因子は、例えば、静脈内投与、非経口投与、腹膜内投与、または筋肉内投与のように、全身に投与される。本発明のベクターがネガティブ選択性マーカーを誘導し、そしてインビボで組織または腫瘍に投与される場合、「バイスタンダー効果」は、すなわち、ネガティブ選択性マーカーをコードする核酸配列を本来形質導入しなかった細胞が、相互作用因子の投与によって死滅し得るという結果が得られ得る。本発明の範囲がいかなる理論的な理由によって制限されることを意図しないが、形質導入された細胞は、相互作用因子によって細胞外で作用するか、または隣接する非標的細胞によって取り込まれるのいずれかのネガティブ選択性マーカーの拡散可能な形態を産生し得る。そして非標的細胞は、次いで、相互作用因子の作用に感受可能になる。また、ネガティブ選択性マーカーおよび相互作用因子のうち１つまたは両方が、標的細胞間に感染されることが可能である。１つの実施態様において、腫瘍細胞の増殖の阻害、妨害、または破壊を提供する因子は、サイトカインである。１つの実施態様において、このサイトカインは、インターロイキンである。用い得る他のサイトカインは、インターフェロンおよびコロニー刺激因子（例えば、GM-CSF）を含む。インターロイキンは、インターロイキン-１、インターロイキン-１β、およびインターロイキン２〜15を含むが、これらに限定されない。１つの実施態様において、インターロイキンは、インターロイキン-２である。本発明の好ましい実施態様において、標的組織は、異常に増殖し、そして好ましくは、腫瘍組織である。ベクターまたはウイルスは、全組織または全腫瘍塊中に分配される。全ての腫瘍は、本発明の方法による処置に適し得る。腫瘍のタイプは、造血系、膵臓、神経系、肝臓、胃腸、内分泌系、胆管、同肺系、頭および首、軟組織肉腫および癌腫、皮膚、および生殖系などを含むが、これらに限定されない。処置に好ましい腫瘍は、正常組織に比べて、比較的に高い分裂指数を有する腫瘍である。好ましい腫瘍は、固形腫瘍であり、そして特に、脳の腫瘍であり、最も好ましくは、グリオーマである。本方法はまた、他の異常な細胞、例えば、インビボで任意の有害な細胞または所望ではない任意の細胞を標的化するために使用され得る。広範な例として、自己免疫病、再狭窄、および傷組織形成を引き起こす細胞を含む。さらに、処置は、エクスビボであり得る。腫瘍細胞のエクスビボでの形質導入は、現行のウイルス送達系の持つ多くの問題を克服する。組織は無菌的な条件で採集し、機械的および/または酵素的に分離し、適切な培地において無菌的な条件で培養する。エンドトキシンおよび細菌の汚染を有しないことが証明されたベクター調製物を、標準的なプロトコルを用いて無菌的条件下でインビトロで細胞を形質導入するために用いる。培養中の細胞に対するウイルスの接近能力は、目下インビボでの注入より優れ、そして本質的に全ての細胞中へのベクターウイルス配列の導入を可能にする。ウイルス含有培地の除去の後、細胞は直ちに患者に戻すか、または機能または無菌性を試験する間に、培養において数日間維持される。例えば、高コレステロール血症を有する患者の治療は、肝臓の一部を取り出し、肝細胞を培養基に外植し、それらをレトロウイルスに曝露することによって、遺伝的に改変し、そして肝臓へ直した細胞を再注入することにより、成功した（ Grossmanら、1994）。ウイルスの形質導入はまた、実験医学の領域で潜在的な用途を有する。免疫系機能の生物学的修飾因子（例えば、IL-2、Ifn-γ、GM-CSF、またはB7共刺激タンパク質）の一時的な発現は、癌患者の抗腫瘍応答を誘発する可能な手段として提案されている。より広範な実施態様において、ベクターは別のDNA腫瘍ウイルスに由来する。このようなウイルスは、一般に、ヘルペスウイルス（例えば、エプスタイン-バールウイルス、サイトメガロウイルス、帯状疱疹、および単純ヘルペス）、パピローマウイルス、パポバウイルス（例えば、ポリオーマおよびSV40）および肝炎ウイルスを含むが、これらに限定されない。適切なウイルス遺伝子は、ウイルスベクターまたはウイルスの複製に必須な遺伝子である。遺伝子の例は、ヒト乳頭腫ウイルス16および18のE6およびE7領域、 SV40のT抗原、およびCMV即時型初期遺伝子、レトロウイルス由来のポリメラーゼなどを含むが、これらに限定されない。本質的に、これらは、ウイルスの生活環に必要な任意の遺伝子を含む。さらなる実施態様において、ベクターは、RNAウイルスに由来する。さらなる別の実施態様において、このベクターは、レトロウイルスに由来する。しかし、潜在的に任意の複製ベクターは、本明細書中で開示される本質的な設計に従って、作成および使用され得ることが理解される。診断本発明のベクターが、患者由来の特定の組織において複製するかどうかを知ることは重要である。ベクターの複製が、治療のために有益であることが明らかであるなら、本明細書中に開示される治療に最も良好に応答する患者に対して、スクリーニングが提供される。有害であることが明らかであるなら、その処置に対して有害な応答を有する患者の処置の防止に対するスクリーニングがある。現在、一般的に使用される非生物学的アッセイは、発現スクリーニング、PCR、および配列決定のみである。これらは、しばしば、偽陰性の結果をもたらし、時間を浪費し、費用がかかり、そして最良の場合に遺伝子の状態についての情報を与えるのみで、それらの生物学的機能についての情報は与えない。従って、方法は、異常組織を同定するため、複製条件的ベクターの複製が可能とする転写因子を含む細胞または転写の阻害因子に対する欠損のある細胞を同定するために提供される。この方法においては、組織の生検が移植され、複製条件的ベクターが、生検の細胞に導入され、そして細胞におけるベクターDNAの複製が定量される。従って、方法は、ベクター複製を可能とする因子の存在に対して、または転写を阻害する因子の欠失に対して、組織をスクリーニングするために提供される。このようなスクリーニングは、とりわけ処置の前に、組織中で複製される特定のベクターを用いる処置を受け入れることのできる組織を同定するために有用である。従って、方法は、患者由来の組織生検を除去すること、組織培養へその生検を移植すること、その生検へ複製条件的ベクターを導入すること、および生検の細胞中でのベクター複製をアッセイすることにより、処置のためのベクターの有用性をアッセイするために提供される。組織の試験またはスクリーニングは、ベクターが感染性のビリオンを形成することが可能である場合、ベクターの核酸複製またはウイルス複製のためのアッセイを含む。従って、本発明は、ベクターの複製を可能とする転写調節機能のため、または通常ウイルスベクターの複製を防ぐこれらの機能の欠如のために、腫瘍をスクリーニングするための方法を提供する。しかし、どんな異常組織も、核酸またはウイルス複製のアッセイにより上記の機能に対してスクリーニングされ得る。プロデューサー細胞本発明のさらなる実施態様において、本発明の複製条件付きベクターのその細胞中での複製により、その細胞中で産生されるビリオンを含有する細胞が提供される。従って、本発明は、インビボにおける標的化遺伝子治療用のさらなる使用のための条件付き組換え複製ベクターの効果的かつ安全な産生のための「プロデューサー細胞」を提供する。現在入手可能なプロデューサー細胞を用いる主要な問題の１つは、そのような細胞が、ゲノム中に複製するベクターのために機能を相補するウイルス配列を含むことである。その細胞がこのような配列を含むため、ゲノムのウイルス配列とウイルスベクター配列との間に相同的組換えが起こり得る。このような組換えは、そのベクターまたはそのプロデューサー細胞中で産生されるウイルス調製物に混入する野生型組換えウイルスを生じ得る。このような混入は、野生型ウイルスまたは野生型ベクターが次に非標的組織中で複製し得、そしてそれにより非標的細胞を障害あるいは殺傷するため、望ましくはない。従って、本発明のプロデューサー細胞の主要な利点の１つは、プロデューサー細胞が、細胞中で複製されるベクターにおいて見出された配列に、相同の内因性のウイルス配列を含まないことである。このような配列の欠如は、相同的組換え、および非標的組織に作用し得る野生型ウイルス組換え体の産生を回避する。従って、本発明は、本発明の複製条件的ベクターを細胞に導入する工程、（ここでこの細胞のゲノムは、ベクター配列を欠いている）、この細胞中でベクターを複製する工程、ビリオンを形成する工程、およびこの細胞からビリオンを精製する工程を包含する、細胞中で複製条件的ビリオンを構築、および産生するための方法を包含する。好ましいベクターは、DNAウイルスベクターであり、ヘルペスウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、肝炎ウイルスベクター、およびパポバウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。本発明の好ましい実施態様においては、そのビリオンはアデノウイルスビリオンであり、そしてベクターはアデノウイルスベクターである。本発明のさらなる実施態様においては、細胞は腫瘍細胞である。さらに好ましい実施態様においては、ベクターは、そのビリオンがまた遺伝子産物をコードし、そしてベクターまたはビリオンが遺伝子治療に使用される場合、その治療が非相同遺伝子産物の発現により容易になるように、異種遺伝子産物をコードする。あるいは、プロデューサー細胞は、ベクターにより自らコードされる異種遺伝子産物の産生のために使用され得る。ベクターがプロデューサー細胞中で複製する場合、その遺伝子産物は、その遺伝子産物をコードする遺伝子の多数のコピーから発現される。発現に続いて、その遺伝子産物は、従来の溶解手順によりプロデューサー細胞から精製され得るか、あるいは公知の方法により異種遺伝子に連結された適切な分泌シグナルによりプロデューサー細胞から分泌され得る。アデノウイルスベクターにより細胞の形質導入が記載されている。リン酸カルシウムによるプラスミドDNAの細胞へのトランスフェクション（Hanahan， D.，J．Mol．Biol．166:577(1983)）、リポフェクション（Feignerら、PNAS 84: 7413(1987)）、またはエレクトロポレーション（Seed，B.，Nature 329:840()）が記載されている。DNA、RNAおよびウイルス精製手順は記載される（Grahamら、 J．Gen．Virol．36：59-72(1977)）。プロデューサー細胞株の好ましい宿主には、HuH7、SW480、BIGF10、HepG2、MC F-7、およびSK-MEL2が挙げられるが、これらに限定されない。細胞株が誘導され得る原発腫瘍または存在する細胞株が、組織特異性転写調節配列により複製を可能とする能力に対して試験され得る。あらゆる原発腫瘍が、本発明のベクターに対してプロデューサー細胞に移植され得、そして生育され得た。その細胞が、内因性ベクター、あるいは、野生型ベクターまたはウイルスを産生するために、ベクターまたはウイルスと組換え得るウイルス配列を含まない限り、その細胞は宿主として潜在的に有用である。腫瘍細胞だけでなく、あらゆる細胞が潜在的に有用であることが理解される。プロデューサー細胞株、特にアデノウイルス産生株に対する最終的な目的は、野生型ベクターによる混入の可能性が少なく、最も高い収率でベクターを産生することである。収率は、感染された細胞の数に依存する。従って、増殖および感染する可能性のある細胞が多いほど、発生する可能性のあるウイルスが多くなる。従って、候補の細胞は、高い増殖速度を有し、そして高密度まで増殖する。その細胞はまた、ウイルスが容易にその細胞を感染できるように大量のウイルスレセプターを有すべきである。別の性質は、産生されたベクターの質である（すなわち、調製は大量の非感染ウイルス粒子を含有すべきでない）。従って、候補のプロデューサー細胞は、低い粒子−プラーク形成単位比を有した。従って、これらの細胞はプロデューサー細胞株を誘導するための好ましい細胞型である。主要な移植または公知の細胞株が使用され得る。従って、このような入手可能な細胞は、条件付き組換え複製ベクター、ウイルス、および遺伝子産物のためのプロデューサー細胞として役立ち得る。細胞へのベクターの導入培養中の細胞、ならびに動物またはヒト患者の細胞および組織へベクターを導入するための、種々の方法が開発されている。ベクターを哺乳動物細胞および他の動物細胞に導入する方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE −デキストラン技術、マイクロインジェクション、リポソーム媒介技術、カチオン性脂質ベース技術、ポリブレンを使用するトランスフェクション、プロトプラスト融合技術、エレクトロポレーションなどが挙げられる。これらの技術は、当業者に周知であり、多くの容易に入手可能な刊行物に記載され、そして広範に概説されている。その技術のいくつかは、Transcription and Translation、A Pra ctical Approach、Hames、B．D.およびHiggins、S．J.編集、IRL Press、Oxford (1984)（本明細書中に、その全体が参考として援用される）およびMolecular Cl oning、第２版、Maniatisら、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spr ing Harbor、New York(1989)（本明細書中に、その全体が参考として援用される）に概説されている。これらの技術のいくつかは、動物およびヒト患者における組織および細胞にベクターを導入するために使用されている。これらの中で主要なものは、全身投与およびインサイチュでの部位へ直接注射である。投与の経路およびベクターに依存して、その技術は、裸のDNA、カチオン性脂質と複合体化されたDNA、ウイルスベクター、およびベクタープロデューサー細胞株を、正常および異常細胞および組織に、一般的に標的部位に直接注射により導入するために使用されている。ポリヌクレオチド、ウイルス、および他のベクターを培養中の、動物内の、および患者内の細胞に導入するための前述の技術は、開発、試験、および産生、ならびに本発明に従うベクターの使用のために使用され得る。例えば、これらの方法により導入されるベクターを含有する細胞は、ベクターを産生するために使用され得る。さらに、ベクターを含有する細胞は、プロデューサー細胞として使用され得、そしてインサイチュにおけるベクターを産生するために、動物の細胞または組織に導入され得る。 DNAおよびウイルス複製のアッセイポリヌクレオチド、ウイルス、または他のベクターの複製は、周知の技術によりアッセイされ得る。細胞中のベクターの複製のためのアッセイは、一般的に、ポリヌクレオチド、ビリオンまたは感染性ウイルスを検出する工程を含む。この目的のために使用され得る種々の周知の方法は、細胞における所与の期間、ポリヌクレオチドに導入された、標識された基質の量を決定する工程を含む。複製がDNAポリヌクレオチドを伴う場合には、³H-チミジンが、しばしば、標識基質として使用される。この場合、複製の量は、細胞のDNAの大部分からベクターのDNAを分離すること、およびベクターDNAに特異的に取り込まれるトリチウムの量を測定することにより決定される。ポリヌクレオチドベクターの複製はまた、ポリヌクレオチドを放出するために、細胞を溶解または透過性にする工程、次いでそのポリヌクレオチドを単離する工程および回復されるDNAまたはRNAの直接定量する工程により検出され得る。ポリヌクレオチドの複製はまた、そのアッセイポリヌクレオチドに特異的なプライマーを用いる定量的PCRにより検出され得る。ビリオンは、当該分野に周知のEM計測技術、そのビリオンを単離する工程ならびにタンパク質および核酸含量を決定する工程、ならびにウイルス性ゲノムポリヌクレオチドまたはビリオンタンパク質を標識する工程、ならびにポリヌクレオチド量またはタンパク質量からビリオンの量を決定する工程によりアッセイされ得る。ビリオン全てが生育可能ではあり得ないこと、および感染力が重要である場合、感染力価は細胞変性効果またはプラークアッセイにより決定され得ることは周知である。これらの任意の周知技術のいくつかは、とりわけ、本発明に従い、細胞または組織におけるベクターの複製をアッセイするために使用され得る。それ以外のいくつかのベクターおよびそれ以外のいくつかの細胞または組織に対しては異なった技術がより適していることが認識される。これまで、本明細書中で本発明を一般的な用語で記載してきたが、以下の実施例を本発明を例示するために示す。実施例１〜４は、アデノウイルスベクター上の構成的なE1Aプロモーターの腫瘍特異的プロモーターでの置換を示す。この方法で作製された構築物は、腫瘍細胞においてのみ発現されるE1aタンパク質を有し、従って、腫瘍細胞においてのみ複製する。実施例１ E1aに結合した肝癌特異的プロモーター、α−フェトプロテインプロモーター α−フェトプロテインプロモーターは、肝癌細胞中で高度に活性であるが、成人肝細胞および他の成人組織中ではサイレントであることが先に明らかにされている。4.9kbのα−フェトプロテインプロモーター含有構築物を用いて、本プロモーターを誘導した。あるいは、入手可能な文献に基づいて本プロモーターを作製してもよい。 4.9kbのα−フェトプロテインプロモーターの制御下でTK遺伝子を有するアデノウイルスシャトルプラスミドpAVS21.TK1（図１）を、1995年５月18日付け出願の「癌特異的遺伝子発現を介する肝細胞性癌の遺伝子治療」と題するChiangらの米国特許出願の図11および12に記載される通りに正確に作製した（本明細書中において、その関連する教示内容を参考として援用する）。プラスミドpSE280-E1 （図１）をSpeIおよびMunIで切断し、これにMunIおよびNheIで切断したpAVS21.T K1を連結することによりE1aコード領域のみとE1b遺伝子の全てを含む制限断片を精製することによって、アデノウイルスシャトルプラスミド中でα−フェトプロテインプロモーターの制御下にあるE1a/E1b遺伝子を配置するpAVE1a02i（図１）をクローン化した。E1A ORFとE1bの全てを含むプラスミドSE280-E1を、1995年６月２日付け出願の「改良されたアデノウイルスベクターおよびプロデューサー細胞」と題する、Kadanらの米国特許出願第08/458,403号に記載されるように構築した（本明細書中において、その関連する教示内容を参考として援用する）。pA VE1a02iを標準的な方法で、293細胞中にAdd1327のClaI切断ラージフラグメントとともに同時トランスフェクトして、組換えウイルスを生産した。 E1a遺伝子に作動可能に連結された肝癌特異的AFPプロモーターを有するウイルスの構築 AV1lacZ4DNAの（ClaI切断）ラージフラグメントとシャトルプラスミド、pAVE1 a04i（図２を参照のこと）を293細胞中で相同的組換えすることによって、アデノウイルスAVE1a04iを構築した。プラスミドpAVE1a02iの構築は、上述の通りである。pAVE1a04iの構築は、pAVE1a02iとほとんど同一である。pAVE1a02iは全AFP プロモーターを含む。pAVE1a04iはこのプロモーターの誘導体を利用し、それは６つのサイレンサーエレメント(silencer elements)および重複したエンハンサー領域を有する。基底200塩基対AFPプロモーターのすぐ上流に、６コピーの遠位のサイレンサーを配置することによって、プラスミドpAF(AB)₂(S_d)₆-CATを構築した。サイレンサーエレメントのすぐ上流に、エンハンサーAB領域の２コピーを逆方向に配置する。エンハンサーエレメントから基底AFPプロモーターへと伸長している、このプロモーターを使用して、本明細書中に記載のシャトルプラスミドを有するAV/A FPショートE1aウイルスを作製した。遠位のサイレンサーエレメント、基底プロモーターおよびエンハンサーエレメントは、Nakabayashiら（Molec．& Cell．Bi ol．11:5885-5893（1991））に記載されたものである。プラスミドpAVE1a04iをSTBL2細胞中で増殖させ、トランスフェクションに使用する前に、標準的なセシウムバンディング法(cesium banding method)によって精製した。ゲノムAV1lacZ4 DNAをセシウム勾配により精製されたウイルス（本明細書中に記載）から単離した。このAV1lacZ4精製ウイルスをプロテイナーゼＫにより消化し、DNAをフェノール／クロロホルム抽出によって単離した。精製されたDNAをClaIによって消化し、ゲル電気泳動によりラージフラグメントを単離し、そして定量した。プラスミドpAVE1a04iの５μgおよびAV1lacZ4のClaI切断ラージフラグメントの2.5μgをリン酸カルシウム介在のトランスフェクション手順（ Promega、E1200kit）を使用して、293細胞中へ同時トランスフェクトした。トランスフェクションプレートを１％アガロースで重層し、プラークが形成するまでインキュベートした。プラークが形成されたら、それらを拾い、そして凍結および融解の交互のサイクル(５×)によりウイルスを500μlのIMEM培地中へ放出した。溶出したウイルスのプラークを、48時間、A30細胞上で再増幅し、次いで、PCR によるスクリーニングに使用するために、細胞を溶解した。プラスミドpAVE1a04i中のショートAFP（sAFP）プロモーターに特異的なプライマーを使用して、推定されているプラークを同定した。図2Aは、ウイルスのプラークが予想された分子量のsAFP特異的バンドを含み、そして、sAFPプライマーに特異的であることを示す。この組換えウイルスにAd5d1327（野性型）が混入していないことを確認するために、E1aプライマーを使用した。図2Bは、野性型ウイルスが存在せず、そしてpAVE1a04iプラスミドの配列が組換えウイルス中に存在したことを示す。図2Cは、AV1lacZ4がほとんど存在しなかったことを示す。このデータは、組織特異的プロモーターの制御下でE1aを有するウイルスの構築を示し、そしてウイルスがA30細胞中で複製可能であることを示す。個々のプラークをA30細胞中で増殖させ、AFPプロモーターの存在をPCRによって分析した（図２）。矢印は、PCRから生じたAFP特異的バンドを示す。この図は、このバンドが選択されたプラーク（L6、L10、L11、M1およびM2）中のウイルスのそれぞれに存在することを示す。この実験のコントロールは、このバンドを含んでいないと予想されるA30細胞溶解物であった。この実験はまた、プラスミドp AVE1a04i（それからウイルスが作製され、したがって、AFP特異的フラグメントを産生すべきシャトルプラスミド）とのPCR反応も包含した。それゆえ、図2Aにおいて、AFPプロモーターを含む組換えウイルスの存在が確認される。図2Bおよび2Cにおいては、これらの結果が個々のプラーク中の混入の結果でないことが確認される。図2Bでは、いずれの混入野性型ウイルスの存在をも検出するE1a特異的プライマーを使用している。矢印は、E1a特異的プライマーで産生されたバンドを示す。この図は、いずれの組換えウイルスも関連するバンドを産生しないことを示す。図2Cでは、ウイルスのプラーク中にAV1.lacZの混入がないことが確認される(なぜなら、このウイルスはAV1.lacZ DNAを使用して作製されているからである)。この図は、AV1.lacZ DNAを含むレーンのみが、このバンドを産生したことを示す。組織特異的ウイルスの複製このウイルス（「AVAFPE1a」）の細胞変性ウイルス溶解物を、A549.30細胞、A 549細胞、およびHuH 7細胞上で、10の対数で系列希釈した。A549.30細胞は、デキサメサゾンの存在下で、糖質コルチコイドレセプターエレメント（GRE）プロモーターからE1aを発現する。なぜなら、この構築物がこの細胞株のゲノム中に組み込まれているからである。したがって、いずれのE1a欠失ウイルスまたはE1a を発現しないいずれのウイルスもこの細胞株中で複製可能であるべきである。これはE1欠失ベクター（未発表）として先に明らかにされている。図3Aおよび3Dから明らかなように、AVAFPE1aベクターは、特徴的な細胞変性効果および細胞死の拡散によって示されるように、感染細胞中で複製する。A549細胞は、AFPを発現せず、そしてAFPプロモーターをトランス活性化し得ないはずである。さらに、A 549細胞はE1aを発現しない。したがって、AVAFPE1aは、この細胞株中で複製し得ないはずである。図3Bおよび3Eから明らかなように、非感染および感染ウェルのいずれも、試験された全ての希釈系で観察された特徴的な細胞変性効果または拡散を伴わずに同様に見える。HuH7細胞は、AFPを発現し、AFPプロモーターをトランス活性化し、そして、続く複製でE1aを作製すべきである。図3Cおよび3Fから明らかなように、AVAFPE1aは、細胞変性効果が示すように、明らかに複製する。さらに、感染したHuH7細胞のいくつかのウェルでは、複製は単一のプラークで開始し、それはウェルの残り部分に１週間以内に拡散した。細胞変性効果を示す全てのHuH7のウェルをPCRで試験し、野性型ウイルスおよびAV1LacZ4ウイルスを含有せず、そして、インタクトなAFPプロモーターを含むことを明らかにした。これらのデータは、AFPを発現する腫瘍細胞中で特に複製可能であるウイルスが構築されたことを明らかに示す。実施例２乳癌特異的DF3-ムチンエンハンサー DF3乳癌関連抗原（MUC1）は、ヒト乳癌において、高度に過剰発現する。この遺伝子の発現は転写レベルで調節されている。-485〜588のDNA配列は、ヒト乳癌細胞株MCF-7で実施される一過性のトランスフェクションアッセイにおいて、Her pesvirus TKプロモーターから誘導される基底プロモーターのすぐ上流に配置された場合、レポーター遺伝子CATの転写を10倍以上に増加させるために必要、かつ十分である。DNAのこの領域に結合する特異的転写因子もまた、乳癌細胞株MCF -7から誘導される細胞中に見い出されるが、非乳癌細胞株HL-60からは見いだされない。DNAの同じ領域が、レトロウイルス構築物またはアデノウイルス構築物に関連して、ＴK遺伝子の乳癌特異的発現を促進することが見いだされている。 -598から-485までのDF3エンハンサー（GenBankから入手）を、それらが重複し、そしてアニールするように合成された4つのオリゴヌクレオチドを構築することによって合成した。オリゴヌクレオチドを表１に示す。以後のクローニングを容易にするために、別の制限部位を両末端に付加した。１つの末端は、ベクター pTK-LucのSmaI部位中へクローニングを可能とするために平滑に保持された。このベクターは、種々の細胞で低いレベルの基底活性を示すHerpesvirus TK遺伝子の基底プロモーターを含む。これはこの基底プローモーターの供給源として使用された。他の末端は、クローニングを容易にするために、pTK-LucのBglII部位中に、重複したBglII部位を有していた。各オリゴヌクレオチドの1,000ngを、２分間、95℃で加熱し、数時間後、室温にまで冷却させることによって、総容量26.5μ lの、0.017M Tris、pH8.0、0.16M NaCl中でアニールした。最終的に、この混合物の１μlを標準的な条件によって、先にSmaI/BglII-およびグラス-ミルク(glas s-milk)（BIO 101）で精製したベクターの100ngと連結した。DH5α細胞（GIBCO ）への形質転換後、標準的な制限酵素消化により挿入物の存在についてコロニーをスクリーニングした。次いで、このベクターから誘導されたDNAをHindIIIで切断して、Klenowフラグメントで平滑化する。次いで、AscIで切断する。次いで、基底TKプロモーターに並んだDF3エンハンサーを含むこのフラグメントを、アガロースゲル電気泳動およびグラスミルクで精製し、そしてプラスミドpAVE1a02i に連結し、SpeIで切断し、そしてAscIで平滑末端とし、上記のように精製する。得られたプラスミドは、DF3エンハンサーおよび基底TKプロモーターの制御下でE 1A遺伝子産物を有し、そしてアデノウイルスシャトルプラスミド中に存在する。このプラスミド、pAVE1a03iの５μgを、Add1327由来のClaI切断フラグメントの右側のアームの５μgとともに、293細胞中へ同時トランスフェクトする。予期される組換ウイルスについて、プラークを標準的方法によってスクリーニングする。粗ウイルス溶解物を使用して、10のMOIでMCF-7を感染する。ウイルスのストックが、標準的方法により、乳癌細胞中で特異的に複製することを確認する。293 細胞におけるスケールアップと精製について記述されるように、ウイルスをMCF- 7細胞および／または293細胞中でスケールアップする。MCF-7のモードマウス(mo de mouse)モデルを使用して複製についてインビボでウイルスのストックを試験し、そしてネガティブコントロールとして、頸部癌（Hela）由来の腫瘍を使用する。野性型ウイルス中にのみ存在するオリジナルのE1AプロモーターのPCRアッセイにより、野性型ウイルスを生成する293細胞における組換え事象についてウイルスを試験する。他の種々のヒトおよびラット乳癌細胞株および関連しない細胞株もまた、試験した。TK遺伝子は、E3領域に挿入され、そしてそこに存在するE1 A依存性プロモーターによるか、あるいはRSVまたはCMVプロモーターの制御下のいずれかでTKを活動させ得る。実施例３メラノーマ特異的チロシナーゼプロモーター PCRプライマーおよびPCRを使用して、マウスゲノムDNAからチロシナーゼ遺伝子の800bp上流のDNAフラグメントをクローン化した。これには、Stratogeneが記載のように、PFUおよび記載のプライマーを用いた。得られたPCRフラグメントを pCRSCRIPT中へクローン化し、次いで、この新規プラミドをAscI/SpeIで消化し、 pAVE1a01iをAscI/SpeIで消化し、そしてこの２つを互いに連結することによって、pAVE1a02i中へ再クローン化した。チロシナーゼプロモーターの制御下でE1a/E 1bを有する最終的シャトルプラスミド、pAVE1a04iを利用して、上記と同様に組換ウイルスを作製する。実施例４結腸癌特異的CEAプロモーター CEAプロモーターを上記したようにヒトゲノムDNAからクローン化し、表１に示されるプライマーを使用して、pAVE1a01iプラスミド中へ同様な方法でクローン化した。最終的シャトルプラスミド、pAVE1a05iを使用して、上記したように、組換ウイルスを作製する。実施例５Ａ．アデノウイルスベクター上のE2aプロモーターと腫瘍特異的プロモーターとの置換上記のように作製した構築物は、（腫瘍細胞のみで発現するウイルス複製に必須な）E2aタンパク質を有する。したがって、このベクターの複製は、腫瘍細胞においてのみ生じる。(上記実施例中の)これらの４つの極めて特異的なプロモーター全てを使用して、その腫瘍特異的プロモーターの制御下で、pSE280-E2a（19 95年６月２日出願の米国特許出願、Kaydenら、「改良されたアデノウイルスベクターおよびプロデューサー細胞」）から得たE2aコード領域を配置する。得られたプラスミドを、標準的相同的組換え方法を使用して、Add1327で組換える。最終ウイルスを先の特許出願に記載の細胞株中、または腫瘍特異的細胞株中で増殖させる。E2aタンパク質は化学量論的量を必要とするため、広範囲にわたる複製の程度を調節する能力を有する。このことは治療に好ましい。使用された方法は、E1aについて記載したものと同じである。相違点は、使用されるシャトルプラスミドが、腫瘍特異的プロモーターの制御下にE2aを配置し、それを、E2aおよび E3遺伝子を欠失したウイルスのバックボーン(backbone)へ（相同的組換えにより）戻すことである。Ｂ．腫瘍特異的複製コンピテントベクターへの他の治療用毒性遺伝子の置換 TK、サイトカインまたは治療用遺伝子のような遺伝子を標準的なプラスミドの構築および相同的組換えによって、ベクターのバックボーンのE3領域中へ配置させ得る。これらの遺伝子をE1a依存性プローモーターあるいはRSVまたはCMVのような構造プロモーターの制御下に配置させ得る。本明細書に引用された全ての特許、刊行物（発行された特許出願を含む）およびデータベース受託番号の開示内容は、これらの個々の特許、刊行物、およびデータベース受託番号が具体的かつ個別に示され、その全体が参考として援用されるのと同程度に、その全体が本明細書中において具体的に援用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 39/235 Ａ６１Ｋ 39/29 39/245 48/00 ＡＤＵ 39/29 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 48/00 ＡＤＵＡ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 37/50 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者チャン，ヤン−ニエンアメリカ合衆国メリーランド 21030, クッキーズビル，ワトキンズグレンコート 11 (72)発明者チャン，ヤウェンエル. アメリカ合衆国メリーランド 20854, ポトマック，ベッドフォードシャーアベニュー 11423

Claims

【特許請求の範囲】１．ベクターの複製に必須である遺伝子のコード領域に作動可能に連結された組織特異的転写調節配列を含む、組織特異的複製可能なベクター。２．前記転写調節配列が、プロモーターおよびエンハンサーからなる群より選択される、請求項１に記載のベクター。３．前記プロモーターが、α-フェトプロテイン、DF3、チロシナーゼ、CEA、表面活性物質、およびErbB2からなる群より選択される、請求項２に記載のベクター。４．前記ベクターが、DNA腫瘍ウイルスベクターである、請求項１に記載のベクター。５．前記DNA腫瘍ウイルスベクターが、ヘルペスウイルス、パポバウイルス、パピローマウイルス、肝炎ウイルス、およびパルボウイルスからなる群より選択される、請求項４に記載のベクター。６．前記DNA腫瘍ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項４に記載のベクター。７．前記コード領域が、E1a、E1b、ならびにE2およびE4コード領域からなる群より選択される、請求項６に記載のベクター。８．前記ベクターが、該ベクターから発現され得る異種コード配列を含む、請求項１に記載のベクター。９．インビボで組織においてポリヌクレオチドを分配する方法であって、該ポリヌクレオチドを含む複製条件的ベクターを該組織に導入する工程を包含し、ここで、該ベクターがベクターの複製に必須な遺伝子を含有し、該遺伝子のコード領域が、該組織において特異的に機能する転写調節配列に作動可能に連結されており、それにより、該ベクターの複製が該組織において生じ、該転写調節配列が機能しない組織においては生じない、方法。１０．前記転写調節配列が、プロモーターおよびエンハンサーからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。１１．前記プロモーターが、α-フェトプロテイン、DF3、チロシナーゼ、CEA、表面活性物質、およびErbB2からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。１２．前記組織が腫瘍組織である、請求項９に記載の方法。１３．前記ベクターが、DNA腫瘍ウイルスベクターである、請求項９に記載の方法。１４．前記DNA腫瘍ウイルスベクターが、ヘルペスウイルス、パポバウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、および肝炎ウイルスからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。１５．前記ベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項１４に記載の方法。１６．前記転写調節配列に作動可能に連結されている前記コード領域が、E1a、E 1b、E2およびE4コード領域からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。１７．前記ベクターが、異種遺伝子産物をコードし、そしてここで該ベクターが、該異種遺伝子産物を前記組織の細胞中で発現する、請求項９に記載の方法。１８．前記異種遺伝子産物が、前記組織の細胞において抗腫瘍活性を提供する、請求項１７に記載の方法。１９．組織特異的複製可能なベクターを含有する細胞であって、該ベクターは、該ベクターの複製に必須である遺伝子のコード領域に作動可能に連結される組織特異的転写調節配列を含み、ここで、該転写調節配列は、該細胞中で機能して該細胞中で該ベクターの複製が生じる、細胞。２０．前記転写調節配列が、プロモーターおよびエンハンサーからなる群より選択される、請求項１９に記載の細胞。２１．前記プロモーターが、α-フェトプロテイン、DF3、チロシナーゼ、CEA、表面活性物質、およびErbB2からなる群より選択される、請求項２０に記載の細胞。２２．前記細胞が腫瘍細胞である、請求項１９に記載の細胞。２３．前記ベクターが、DNA腫瘍ウイルスベクターである、請求項１９に記載の細胞。２４．前記DNA腫瘍ウイルスベクターが、ヘルペスウイルス、パポバウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、および肝炎ウイルスからなる群より選択される、請求項２３に記載の細胞。２５．前記ベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項２４に記載の細胞。２６．前記転写調節配列に作動可能に連結されている前記コード領域が、E1a、E 1b，E2、およびE4コード領域からなる群より選択される、請求項２５に記載の細胞。２７．前記ベクターが、異種遺伝子産物をコードし、そしてここで該ベクターが、該異種遺伝子産物を標的組織の細胞中で発現する、請求項１９に記載の細胞。２８．前記異種遺伝子産物が、前記組織の細胞において抗腫瘍活性を提供する、請求項２７に記載の細胞。２９．組織特異的複製可能なベクターを作製する方法であって、該ベクターは、該ベクターの複製に必須である遺伝子のコード領域に作動可能に連結された組織特異的転写調節配列を含有し、請求項１９に記載の細胞を培養する工程および該細胞から該ベクターを回収する工程を包含する、方法。３０．組織特異的複製可能なビリオンを含有する細胞であって、該ビリオンは、該ビリオンの複製に必須である遺伝子のコード領域に作動可能に連結された組織特異的転写調節配列を含有し、ここで、該転写調節配列は、該細胞中で機能して該細胞中で該ビリオンの複製を生じる、細胞。３１．前記転写調節配列が、プロモーターおよびエンハンサーからなる群より選択される、請求項３０に記載の細胞。３２．前記プロモーターが、α-フェトプロテイン、DF3、チロシナーゼ、CEA、表面活性物質、およびErbB2からなる群より選択される、請求項３１に記載の細胞。３３．前記細胞が腫瘍細胞である、請求項３０に記載の細胞。３４．前記ビリオンが、DNA腫瘍ウイルスビリオンである、請求項３０に記載の細胞。３５．前記DNA腫瘍ウイルスビリオンが、ヘルペスウイルス、パポバウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、および肝炎ウイルスからなる群より選択される、請求項３４に記載の細胞。３６．前記ビリオンが、アデノウイルスビリオンである、請求項３５に記載の細胞。３７．前記転写調節配列に作動可能に連結されている前記コード領域が、E1a，E 1b、E2、およびE4のコード領域からなる群より選択される、請求項３６に記載の細胞。３８．前記ビリオンが、異種遺伝子産物をコードし、そしてここで、該ビリオンが、該異種遺伝子産物を標的組織の細胞中で発現する、請求項３０に記載の細胞。３９．前記異種遺伝子産物が、前記組織の細胞において抗腫瘍活性を提供する、請求項３８に記載の細胞。４０．組織特異的複製可能なビリオンを作製する方法であって、該ビリオンは、該ビリオンの複製に必須である遺伝子のコード領域に作動可能に連結された組織特異的転写調節配列を含有し、請求項３０に記載の細胞を培養する工程および該細胞から該ビリオンを回収する工程を包含する、方法。