JPH10509984A - キニジン抱合体およびイムノアッセイにおけるそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、キニジン誘導体及びそれから調製される免疫原性抱合体及びレポーター抱合体に関する。該免疫原性抱合体及びレポーター抱合体は、抗体を発生させるのに及びキニジンに対するイムノアッセイを実施するのに有用である。キニジンに対する粒子凝集イムノアッセイも提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 キニジン抱合体およびイムノアッセイにおけるそれらの使用 発明の分野 本発明は、キニジン抱合体、および試験サンプル中のキニジンを定量するイム ノアッセイへのそれらの適用に関し、さらに具体的には、抗キニジン抗体の産生 およびリポーター試薬を有する抱合体の合成に有用なキニジン誘導体に関する。 本発明はまた、親水リンカーを含有するキニジン抱合体の合成に有用なモノ保護 親水ジアミン試薬に関する。 従来の技術 抗原抗体反応のような特異結合反応が、体液中に存在する意図する種々の薬剤 または他の化合物を検出および/または定量するイムノアッセイに、広範囲に使 用されている。そのようなイムノアッセイは、ハプテンと同様に、タンパク質の ような多価抗原を決定するために開発された。 ハプテンは定義上、動物に投与した場合に分子があまりに小さ過ぎて抗体の産 生を刺激することができない、即ち、ハプテンはそれ自体では免疫原性ではない 。しかし、ハプテンを適切な担体分子に共有結合（抱合）させることによって免 疫原性にすることができることは、この分野において既知である。そのような免 疫原性抱合体の動物への投与は一般に、抗体のスペクトルの形成に導き、その抗 体の中には担体に固有の抗原部位（エピトープ）に向かうもの、および結合した ハプテン分子に向かうものがある。適切な担体は一般にポリ（アミノ酸）部分を 有し、ポリペプチド、タンパク質および糖タンパク質を含む。有用な担体の特定 の例は、キーホール・リムペット・ヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin ）（KLH）、ウシ血清アルブミン（BSA）、γ−グロブリンおよび植物グロブリン （例えば、カボチャ種子グロブリン）である。 抗ハプテン抗体を産生するために必要な免疫原性ハプテン担体抱合体の製造に 、種々の化学物質が使用されている。天然の担体は一般に、それぞれが反応性ア ミン基を有する実質的な数のリジン残基を有するので、１つの特に有用な方法は 、アミン反応性の官能性を有するハプテンまたはハプテン誘導体と担体との反応 を利用している。この方法の重要な点は、カルボキシル基で官能性にされたハプ テンまたはハプテン誘導体が、適切なアミン反応性中間体へ容易に変換されるこ とである。 本発明において意図するハプテンであるキニジンは、重要な薬理学的化合物で ある。心 房細動を有するマラリア患者がこれらの薬剤での治療の間に不整脈が治癒する場 合があることが偶然観察されたことから、抗不整脈剤としてのキニジンの価値が 発見された。 肝臓および/または腎臓疾患のない場合の、キニジンの生物学的半減期は約６ 時間である。この薬剤の一部は、腎臓によって未変化のまま排出され、残り部分 は、肝臓によって代謝されて、抗不整脈活性を有さない生成物になる。キニジン は、心筋への直接的影響によって、および伝導系への間接的影響によって、心臓 の速度およびリズム（rate and rhythm of the heart）に影響を及ぼす。キニジ ンは、心筋の、興奮性、伝導速度および収縮性を減少させる。 キニジンは、望ましくない胃腸副作用を生じることが多く、これらの副作用は 投与量に幾分関係している。血漿薬剤濃度を監視することによって、望ましくな い副作用を最少限にしつつ、適切な治療濃度を維持するのに有用な情報が得られ る。 しかし、天然キニジンは、前記のアミン反応性の官能性を有さないので、適切 なキニジン誘導体を合成する必要がある。キニジンに存在するC-10-C-11二重結 合は、開始するのに特に有用な部位を提供する。 Kobayashiら（Journal of Polymer Science: Polymer Letters Edition，vol. 20,85-90，Functional Plymer 9. Asymmetric Catalysis by New Cinchona Alk aloid Derivatives. Effect of C(3)Substituent on Asymmetric Induction，J ohn Wiley and Sons，Inc.，[1982]）は、キニジンのC-11部位に有機チオ基を有 するシンコナアルカロイド誘導体の合成を開示している。しかし、製造された誘 導体のいずれもが、本発明の目的に適した官能性を有していなかった。 1991年10月31日公開の国際特許公開番号第WO91/16322号を有する国際ＰＣＴ出 願、および1993年４月15日公開の国際特許公開番号第WO93/07142号を有する国際 ＰＣＴ出願は、不斉ヒドロキシル化触媒としてのキニジンおよびキニン誘導体の 使用を開示している。開示されている化合物は、キニジンのC-11部位が重要な制 御剤（a critical control agent）としてのスルホニルまたはスルホニル結合で 誘導されるキニジンの誘導体を含む。同様に、 これらの誘導体も、本発明の目的に適した官能性を有さない。 特に、キニジンのイムノアッセイに有用な、合成免疫原性抱合体またはリポー ター試薬（例えば、粒子試薬）のための、キニジン誘導体の製造または使用につ いて、前記文献のいずれもが記載も提案もしていない。 キニジン抱合体および、試験サンプル中のキニジンを定量するイムノアッセイ への、および、特に、キニジン濃度の時宜を得た正確な監視を可能にするために 抗キニジン抗体を産性するのに有用なキニジン誘導体への、キニジン抱合体の適 用が、必要とされている。 発明の要旨 本発明は、１つの態様として、構造Ｉを有する化合物を有し、この化合物は分 子内塩IIとして表すこともでき、または、分子外塩IIIとして分離することもで きる： ［式中、xは1-2であり、Ａ−は、クロリドイオン、４−トルエンスルホネートイ オン、３−メルカプトプロピオネートイオンなどのようなアニオンである。］ ｘ＝２のとき、構造ＩまたはIIの化合物は、キニジン酸誘導体No.１（Quinidine Acid Derivative，No.1）の頭辞語である「ＱＡＤ−１」と称される。この化合 物の適切な化学名は、11-（２−カルボキシエチルチオ）ジヒドロキニジンであ る。 他の態様は、特許請求されている化合物と担体との免疫原性抱合体であり、特 に、担体 は、ポリ（アミノ酸）、タンパク質および糖タンパク質から成る群から選択され る。 他の態様は、特許請求されている化合物とリポーター試薬との抱合体である。 リポーター試薬は、サンプル中に容易に定量できるリポーター試薬量を許容する ある種の化学的または物理的特性を有する試薬であると定義される。ラテックス 粒子、発蛍光団、化学発光物質、発色団、放射性物質および酵素が、一般的なリ ポーター試薬である。適切に構成されたアッセイにおいては、意図する薬剤また は他の化合物とリポーター試薬との抱合体を用いて、サンプル中の薬剤の量とサ ンプル中のリポーター試薬の量（容易に測定される）とを関係づけることができ る。 他の態様は、特許請求された化合物とリポーター試薬との抱合体であり、より 詳しくは、特許請求された化合物が親水リンカーによってリポーター試薬に結合 している抱合体である。 他の態様は、親水リンカー部分を薬剤とリポーター試薬との抱合体に導入する のに有用な、モノ保護親水ジアミンの種類である。 本発明の他の態様は、試験サンプル中のキニジンの存在および/または量を検 査するイムノアッセイであり、このイムノアッセイの段階には、 （ａ）特許請求された化合物とリポーターとの抱合体から成るリポーター試薬 、試験サンプル、および凝集剤を混合する段階；続いて、 （ｂ）既知のいずれかの凝集イムノアッセイフォーマットを実施する段階； が含まれる。 図面の簡単な説明 本出願の一部を構成する添付の図面を参照して、下記の詳細な説明を考慮する ことによって、本発明がさらによく理解されるであろう。 図１は、種々のQAD-1タンパク質免疫原性抱合体で免疫化されたマウスが、抗 キニジン抗体を産生したことを示している。この図について、実施例３にさらに 詳細に記載されている。 図２は、濁り抑制試験のデータのプロットであり、溶液中の遊離キニジンが、 抗体の限定量に対して、粒子結合キニジンと競合することを示している。この図 について、実施例３にさらに詳細に記載されている。 図３は、キニジン濁り抑制イムノアッセイにおける標準曲線を示す。これにつ いて、実 施例６のパートＢにおいて、さらに詳細に記載されている。 発明の詳細な説明 本発明は、キニジン誘導体、それから製造される免疫原性抱合体、免疫原性抱 合体によって導き出される抗体、キニジンとリポーター試薬との抱合体、および イムノアッセイにおけるそれらの使用に関する。 本発明は、究極的に、２つの最終試薬の製造に関係している：抗キニジン抗体 およびキニジン−ラテックス粒子。どちらの最終試薬も、体液中のキニジンの存 在および量を検査するアッセイ系の成分である。 本発明においては、カルボキシル官能化キニジン誘導体が、チオール官能化カ ルボン酸と原子間に位置する二重結合C-10-C-11との反応によって合成される。 フリーラジカル化学物質を用いる、チオールの二重結合への付加が既知である。 例えば、QAD-1と称される誘導体は、2，2'−アゾビス（イソブチロニトリル）（ AIBN）を開始フリーラジカル源として用いて、３−メルカプトプロピオン酸（3- MPA）をキニジン二重結合にフリーラジカル付加することによって製造される。 この反応は、数段階で起こるものとして視覚化することができる。下記反応式に おいて点は不対電子を表し、QCH=CH₂はキニジンを表す。 １．ラジカル発生（開始）。 ２．チオールラジカルを形成する、炭素から硫黄へのラジカル転移。 ３．チオールラジカルのキニジン二重結合への付加。 ４．炭素から硫黄へのラジカル転移。 ５．段階３および４の反応が何回も繰り返されて、反応物を充分な収量のQAD-1 に変換する。 本発明のカルボキシル官能化キニジン誘導体を、担体と結合させて、免疫原を 製造することができる。第一段階は、カルボキシル基をアミン反応性基に変換す ることを含む。カルボキシル官能化試薬のアミン反応試薬への変換方法は、当業 者に既知である。形式的に、カルボン酸基中のヒドロキシル基が、陰性または電 子引き取り（electron−withdrawing）原子または基で置き換えられ、それによ って、部分陽電荷が隣接するカルボニル炭素原子に誘導される。 この要求を満たすＸの構造のいくつかを下記に示す： 本発明の場合、ジスクシンイミジルカーボネートが、QAD-1をアミン反応性ス クシンイミジルエステルに変換するのに使用され、これが次に担体中のリジン（ アミン）基と反応して免疫原性抱合体（免疫原）が得られる。この免疫原は、既 知の抗体産生法またはスクリーニング法を用いて抗体を導き出すのに使用するこ とができる。例えば、免疫原を、適切な動物宿主に注射して、抗体の産生を刺激 することができる。このようにして産生された抗体は、ハプテンまたは近い関係 の類似体との特異的結合反応に直接使用するために採取することができ、または 、アフィニティークロマトグラフィーのような既知のいくつかの手段のいずれか によって、動物の血清から最初に精製することもできる。または、注射した宿主 から採取される免疫リンパ球を、本発明の抱合体を用いてスクリーニングして、 免疫原生抱合体に反応性の細胞を選択することができる。これらを次に、適切な 骨髄腫細胞と融合させて、モノクローナル抗体を産生することができるハイブリ ドーマを得る。細胞融合、選択、および増殖の方法が既知であり、一般的には、 KohlerらのNature,vol.256,495-497(1975)に記載の方法の改良法である。好まし くは、本発明の抗体は、ハイブリドーマ法を用いて作られるモノクローナル抗体 である。 試験サンプル中の遊離ハプテンの存在および/または量を検査するために、抗 体とそのハプテンとの特異的結合反応を利用するどのような既知のイムノアッセ イフォーマットにおいても、本発明の免疫原性抱合体を用いて作られる抗キニジ ン抗体を使用することができる。そのような既知のイムノアッセイフォーマット の例は、同種（homogeneous）、異種（heterogeneous）、競合および直接（非競 合）フォーマットを含む。 本発明の方法は、特許請求された化合物とリポーター試薬、特にラテックス粒 子、との結合を包含する。好ましい粒子は、ポリスチレンコア（core）、および エチレングリコールジメタクリレートと架橋されたポリ（グリシジルメタクリレ ート）シェル（shell）を有する粒子を含む。そのような粒子の製造および使用 について、Craigらの米国特許第4480042号に開示されており、そこに記載の内容 は本発明の一部を構成するものとする。これらの粒子の表面のエポキシド基が、 アミン、チオールなどと容易に反応し、これは、意図する種々の化合物をラテッ クス粒子に結合させるのに利用することができる特性であ る。特に、エポキシド基は、本発明に使用する親水ジアミンリンカーに存在する アミン基と反応する。これに関連して、アルデヒド、スクシンイミジルエステル およびアリルまたはベンジルハロゲン化合物のような他のアミン反応性基で官能 化されたラテックス粒子もまた、本発明のリポーター試薬として使用するのに適 している。 高度に親水性のリンカー（スペーサー（spacer）またはブリッジ（bridge）と 称される場合もある）を用いて、抱合体対の２成分を結合することによって、そ の意図する機能において抱合体のその後の性能が向上する場合が多いことが、当 業者に既知である。この効果のいくつかの例が下記文献に記載されている：（ａ ）W.A.FreyおよびD.M.Simons.Polyether polyamines as linking agents for pa rticle reagents useful in immunoassays. 1986 年4月8日発行の米国特許第45 81337 号；（ｂ）D.M.Simons,S.Y.Tseng およびD.M.Obzansky. Method for spe cific binding assys using areleasable ligand．1984 年7月26日発行、DuPont 、米国特許第5332679号；（ｃ）E.Akerblom，M.Dohlsten，C.Bryno，M.Mastej， I.Steringer，G.Hedlund，P.LandoおよびT.Kalland. Preparation and charact erization of conjugates of monoclonalantibodies and staphylococcal enter otoxin A using a new hydrophilic cross-linker. Bioconjugate Chem.4: 455 -466(1993)；（ｄ）E.Huber，D.Zdunek，C.KleinおよびR.Schenk.Hapten-Biotin -Konjugate und Ihre Verwendung．EP0451810A1，1991年4月10日（Boehringer M annheim）。２つの要素の組み合わせによって、有益な効果が生じると推定され る：立体障害の減少、および、親水リンカーと、抱合体の成分のどちらか一方ま たは後に添加される他の試薬に存在する疎水領域との、低い非特異性、非共有相 互作用。本発明の場合、そのような親水スペーサーの使用によって、キニジンア ッセイの精度が向上する。 オキシエチレン単位を有するジ−またはポリアミン試薬が、親水リンカーとし て使用するのに特に適している。いくつかの特定の例は、以下のものである： H₂NCH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂NH₂ 1，8−ジアミノ−3，6−ジオキサオクタン DuPontコード名： DA-10 商品名： Jeffamine EDR-148 製造業者または入手源： Texaco Chemical Co. pKa（両アミン基が同じである）： 9.4 H₂NCH₂CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂CH₂NH₂ 1，10−ジアミノ−4，7−ジオキサデカン DuPontコード名： DA-12 製造業者または入手源： Tokyo Kasel，Inc.,911 N．Harborgate St.,Portla nd，OR pKa（両アミン基が同じである）： 9.98 H₂NCH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂NH₂ 1，11−ジアミノ−3，6，9 −トリオキサウンデカン DuPontコード名： DA-13 商品名： Jeffamine EDR-192 製造業者または入手源： Texaco Chemical Co. pKa（両アミン基が同じである）： 9.4 H₂NCH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂NH₂ 1，13−ジアミノ−4，7，10−トリオキサトリデカン DuPontコード名： DA-15 製造業者または入手源： Fluka pKa（両アミン基が同じである）： 10.02 前記物質のDuPontコード名において、「ＤＡ」はジアミンを意味し、数字は末 端水素原子を除いた鎖中の原子の数を意味する。それらの全ての炭化水素類似体 と比較してより低い、オキシエチレン鎖を有する分子に固有の非特異性、非共有 分子間相互作用が、物理的特性において、それ自体を明白に示す。例えば、DA-1 0は室温において液体であるが、その全ての炭化水素類似体、1，8-ジアミノオク タンは、52℃において固体融解である。 本発明のキニジン−親水スペーサー−リポーター試薬抱合体は、いくつかの方 法によって製造することができる。例えば、３段階法を使用することができる： （ａ）カルボキシル官能化薬剤誘導体（例えばQAD-1）を、アミン反応性誘導体 に変換し；（ｂ）アミン反応性薬剤誘導体を、親水ジアミンの１つのアミン基に 結合させ；（ｃ）そのようにして製造された抱合体を、アミン反応性リポーター 試薬と接触させ、それによって所望の薬剤− 親水スペーサー−リポーター試薬抱合体を形成する。または、（ａ）アミン反応 性リポーター試薬と親水ジアミンの１つのアミン基とを結合させ；（ｂ）カルボ キシル官能化薬剤誘導体を、アミン反応性誘導体に変換し；（ｃ）２つの試薬を 結合させて、所望の薬剤−親水スペーサー−リポーター試薬抱合体を形成する。 本発明の方法においては、カルボキシル官能化QAD-1が、ジスクシンイミジルカ ーボネートとの反応によって、アミン反応性スクシンイミジルエステルに変換さ れる。 前記の各親水ジアミンの２つのアミン基は、pKa 値、および種々のアミン反応 性試薬に対する同等の反応性を反映して、同等の塩基度を有する。そのようなジ アミンと限定量のアミン反応性試薬との反応は、常に２つの反応生成物および未 反応ジアミンを含有する混合物を生じる。 最終反応混合物中のこれらの各成分のモル画分は、初期化学量論比の関数である 。生成物の理論分布を表１に示す： ジ置換ジアミンに変換されるアミン反応性薬剤誘導体の量は、一般に損失され る。この誘導体が非常に高価または大量に合成することが困難である場合に、こ のことが重大な問題となる。化学量論比の関数としての薬剤誘導体の理論損失量 が表２に示されている。 生成物混合物および付随する有用な薬剤誘導体の損失は、アミン反応性薬剤誘 導体と半保護親水ジアミン、即ち、１つのアミン基が適切な保護基によって予め 封鎖された親水ジアミンとの反応を行うことによって回避することができる。前 記保護基は、アミン反応性 薬剤誘導体との反応に使用される全条件の間、無傷に維持されなければならない が、後に容易に除去できなけらばならない。本発明の場合、ｔ−ブトキシカルボ ニル（Boc）基が、満足のいく保護基であることが見い出された。ジ保護ジアミ ンおよび未反応ジアミンの両方を含まない、所望の半保護中間体を得る方法が開 発された。その方法は、下記の連続的段階を含む： （ａ）水性/有機媒体中、水酸化ナトリウムの存在下に、ジ−tert−ブチルジ カーボネート（Boc無水物）と過剰親水ジアミンとを反応させる； （ｂ）有機溶媒を除去して、系を本質的に水性相に変換する； （ｃ）本質的にすべての残留アミン基がプロトンを付加された形態であるよう にする水準に、水性相のpHを下げる； （ｄ）水性相を水不混和性有機溶媒で抽出して、非塩基性物質を除去する； （ｅ）残留アミン基の半分または半分以上が非プロトン付加形態で存在する水 準に、水性相のpHを上げる； （ｆ）水性相に塩を付加する； （ｇ）水性相を水不混和性有機溶媒で抽出する； （ｈ）有機相を分離する； （ｉ）有機相から溶媒を除去して、所望の生成物を得る。 半Boc親水ジアミン中間体を用いる、薬剤−親水スペーサー−リポーター試薬 抱合体の合成のために、モノ保護ジアミンを用いる例示的方法は、下記の通りで ある。 （ａ）カルボキシル官能化薬剤誘導体をアミン反応性誘導体に変換する。 （ｂ）アミン反応性薬剤誘導体を、モノ保護親水ジアミンの遊離アミン基に結 合させる。 （ｃ）保護基を除去する。 （ｄ）遊離アミンをアミン塩から開放する。 （ｅ）前記のように製造された薬剤−親水リンカー抱合体を、アミン反応性リ ポーター試薬（本発明においては、エポキシド官能化ラテックス粒子）と反応さ せる。 段階（ｄ）および（ｅ）は一般に、同じポット中で一緒に行うことができる。 ここに記載する薬剤−親水リンカー−リポーター試薬抱合体は、試験サンプル 中、キニジンのような薬剤の存在および/または量を検出するためにリポーター を使用するどのような既知のイムノアッセイフォーマットにも使用することがで きる。 本発明の薬剤−親水リンカー−粒子リポーター試薬（粒子試薬）を用いる好ま しいイムノアッセイフォーマットは、粒子強化濁度抑制イムノアッセイ（PETINI A）である。このイムノアッセイフォーマットは、意図する薬剤または他の化合 物が結合されている非常に小さいラテックス粒子（例えば、70nm）を使用する。 懸濁粒子の直径よりも大きい波長（例えば、340nm）を有する単色光で見たとき に、例えば、この懸濁液は本質的に透明である。最適条件下において、粒子上の 薬剤に特異的な抗体を付加することによって、粒子の凝集が起こる。これらの凝 集体は、光を散乱させて懸濁液を濁らせるのに充分な大きさ である。遊離薬剤を含有するサンプルが含まれる場合、遊離薬剤は、抗体に対し て、粒子結合薬剤と競合し、それによって、凝集の速度および程度の両方を抑制 する。このことが、サンプル中の薬剤の量を定量するための基礎を提供する。特 に、本発明のキニジン−親水スペーサー−粒子試薬および抗キニジン抗体は、体 液中に存在するキニジン量を検査する、急速、精密および正確なPETINIA法を可 能にする。 本発明のリポーター試薬を用いて行うことができる既知のイムノアッセイフォ ーマットの他の例は、直接的凝集粒子に基づくイムノアッセイ、酵素結合免疫吸 着イムノアッセイ、および蛍光に基づくイムノアッセイを含む。 下記実施例は、本発明を例示するものである。 実施例１ キニジン誘導体（QAD-1）の合成 電磁攪拌機、加熱マントル、還流冷却器、ならびに乾燥窒素の入口および出口 を備えた、250mL二首フラスコを、乾燥窒素で入念にフラッシュし、13.00g（0.0 40モル）のキニジン（Aldrich Chemical Co.，Inc．WI）、80mL のクロロホルム （VWR Scientific,Inc.，NJ）、および14mL （0.16モル）の３−メルカプトプ ロピオン酸（Aldrich Chemical Co.，Inc.，WI）を装填した。アゾビス（イソブ チロニトリル）（660mg；Polysciences，Inc.，PA）を550mg加え、混合物を12〜 15時間還流した。この期間の終了時に、追加のアゾビス（イソブチロニトリル） を加え、還流を12〜15時間継続した。 溶液を室温に冷まし、次に攪拌無水エーテル700mLを滴下した。粘着性沈殿物 が分離した。フラスコを氷浴で約30分間冷やし、次にエーテル層をデカントした 。残留物を沸騰エーテルで３回抽出し（各回ごとに500mLで抽出）、それによっ て残留物を微粉末にした（重量18g）。チオール含有量の分析によれば、この地 点での生成物が、QAD-1の3-メルカプトプロピオン酸（3-MPA）塩の実質量（サン プル1 mg当たりチオール0.594μモル（＝0.0594モル/100g））を含有することが 示され、これは、73%モル％QAD-1分子内塩および23モル％QAD-1:3-MPA分子外塩 に対応する。 不純生成物を80mLのクロロホルムに溶解し、溶液を250mLの水で覆った。pH電 極を水性層に挿入し、混合物をゆっくり攪拌し、pHが7.0 〜7.2 で安定するまで 固体炭酸水素ナトリウムを注意深く加えた。クロロホルム層を分離し、硫酸マグ ネシウムで乾燥し、攪拌無水エーテル650mLを滴下した。生成物が微細白色固形 物として分離し、濾過によって集め た。重量15.3g。チオール分析によって、この物質が、サンプル1 mg当たり0.042 μモルのチオールを含有することが示された。 前記物質をエタノール100mL中で30分間還流した（注：その物質は完全には溶 解しなかった）。次に、混合物を氷浴で２〜３時間冷やし、生成物を濾過によっ て集めた。重量11.7 g（理論値の75%）。チオール含有量は、サンプル1 mg当た りチオール0.030μモル（＝0.003 モル/100g）であり、98.7モル％QAD-1分子内 塩および1.3 モル％QAD-1:3-MPA分子外塩に対応する。 QAD-1は、クロロホルムに溶解し、その溶液を理論量の4-トルエンスルホン酸 を含有するエタノールとエーテルとの混合物に加えることによって、4-トルエン スルホネート分子外塩に変換することができる。 実施例２ キニジン−タンパク質抱合体の製造 使用したタンパク質は、キーホール・リムペット・ヘモシアニン（KLH）、ウ サギγグロブリン（RaIgG）、カボチャ種子グロブリン（PSG）、およびオボアル ブミンであった（全てSigma Chemical Co.，Inc.，MOから入手）。KLH、RaIgGお よびオボアルブミン溶液を、150mM炭酸水素ナトリウム溶液25mL中で攪拌したタ ンパク質（150mg）を数時間攪拌し、遠心分離にかけて不溶物質を除去する（必 要な場合）ことによって製造した。PSG溶液は、４Ｍ塩化ナトリウムを含有する1 50mM炭酸水素ナトリウム25mL中にPSG(105mg)を溶解させることによって、製造し た。 QAD-1スクシンイミジルエステルの原液の製造。QAD-1（12.45mg）、ジスクシ ンイミジルカーボネート（78.83mg）、乾燥ジメチルスルホキシド3344μＬおよ びトリエチルアミン45μＬを、風袋計量したバイアル（tared vial）中で合わせ た。溶液の合計重量は、3.963gであった。溶液を室温に1.5時間置いた。1000μ Ｌアリコートを計量することによって求めた溶液の密度は、1.0893mg/μＬであ った。反応が定量的であるとすれば、QAD-1スクシンイミジルエステルの濃度は 、（120.45×1.0893）/（430.56×3963）＝7.69×10^-5mmol/μＬである。 抱合体合成。QDA-1スクシンイミジルエステル原液を、指定された量の各タン パク質溶液に加えた：KLH（878μＬ）；PSG（878μＬ）；オボアルブミン（878 μＬ）；およびRaIgG（750μＬ）。溶液を一夜置き、次に150mM 炭酸水素ナトリ ウムの３変化（3 changes）、および燐酸塩緩衝生理食塩水の３変化に対して透析した。透析終了 時に、溶液は下記の外観を呈した：KLH抱合体、僅かに濁っている；γグロブリ ン抱合体、いくらかの沈殿物を含有する；RaIgG抱合体、多くの沈殿物を含有す る（低い塩濃度による）；オボアルブミン抱合体、清澄。 実施例３ 免疫化および抗体試験プロトコールの簡単な説明 ５匹の雌のBALB/cマウス３組に、キニジン−KLH抱合体、キニジン−ウサギγ グロブリン抱合体、およびキニジン−PSG抱合体それぞれの３用量を注射した。 各用量は、０日目に完全フロイント補助剤で、および28日目および56日目に不完 全フロイント補助剤で乳化した適切な抱合体から、構成された。免疫処置後42日 目および70日目にマウスから採血した。 キニジンへのマウスIgGの滴定量を、ELISA法によって求めた。プラスチックミ クロタイタープレート（Immulon II，Dynatech，Inc.，VA）を、キニジン−オボ アルブミン抱合体（0.1Mカーボネート中6 mg/mL 、pH9.6）で、室温で３時間、5 0μＬ/窪み（well）に被覆し、10mM燐酸塩緩衝生理食塩水（PBS）で３回洗浄し た。抗血清を、１％BSAおよび0.05％Tween20（PBT）（Sigma Chemical Co.，MO ）を含有するPBSで希釈し、抗原被覆プレートで３７℃で１時間インキュベート した。プレートをPBSで３回洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Zymed C o.，catalog no.61-6020，0.05％Tween20含有PBS中1:1000）で標識された抗マウ スIgGウサギ免疫ブロブリン（γ鎖特異性）50μＬ/窪みで、37℃で１時間インキ ュベートした。窪みをPBSで３回洗浄し、100 μＬ/窪みのペルオキシダーゼ基質 ABTS（2，2'-アジノ−ジ−（3-エチルベンズチアゾリンスルホネート）、ジアン モニウム塩）（Kierkegaard & Perry Co.，MD，catalog no．50-66-1）を加え、 室温で20分間置き、次に405nMにおける吸光を測定することによって、マウスIgG の存在を検出した。42日目に採取した血清に関する結果（図１参照）は、３つの 全ての抱合体が、免疫源の２用量後に、キニジン特異性IgG抗体の産生を導き出 すことを示した。（図１において、頭辞語「ＮＭＳ」は、対照標準として使用さ れた非免疫血清を意味する。） 遊離キニジンに対するマウス血清の反応性を、粒子強化濁度抑制イムノアッセ イ（PETINIA）によって求めた。それらの表面に共有結合したキニジンを有する ラテックス粒子（キニジン粒子試薬；QPR）を、下記実施例６に記載の方法と実 質的に同じ方法で製造 した。キニジン粒子試薬（QPR）を、100mM燐酸塩、pH6.9、0.4%GAFAC RE-610、 ４％ポリエチレングリコール8000から成る緩衝溶液（PGP緩衝液）中で１：100に 希釈した。キニジン−KLH抱合体（70日目）およびキニジン（Sigma Chemical Co .，MO; DMSO中10mg/mL）免疫化したマウスから採取した抗血清を、PGP緩衝液中 で希釈した。96窪み、平底マイクロタイタープレートの窪みの中で、50μＬの希 釈マウス血清（1:200）と200μＬの希釈キニジン粒子試薬（QPR）（1:1000）を 混合することによって、アッセイを開始した。抗血清と混合する前に、遊離キニ ジンを希釈キニジン粒子試薬に組み込むことによって、マウス血清によるキニジ ン粒子試薬の凝集が抑制された。図２は、サンプル中のキニジンのモル濃度に対 する透過率（％）を示す。このデータは、本発明において開示されているキニジ ン−タンパク質免疫原性抱合体で免疫化されたマウスが、溶液中の遊離キニジン と結合する抗体を産生することを示す。 実施例４ モノボシル化（MonoBocylated）親水ジアミン：Boc-DA-10の製造 機械攪拌機、温度計および滴下漏斗を備え、氷浴で冷やした２リットルフラス コに、68g（0.458モル）のDA-10、230mLの水、460mLのジオキサンおよび229mLの IN NaOHを装填した。温度が10℃未満になるまで混合物を攪拌した。溶液を激し く攪拌し、Boc無水物（50g ；0.227モル）を滴下し、その間フラスコの温度を10 ℃未満に維持した。添加終了後、混合物を室温に温め、一夜置いた。 ほとんどのジオキサンを、回転式蒸発器中で、反応混合物から除去し、その結 果、油状層が分離した。混合物を、1M硫酸水素ナトリウム（約730mLが必要とさ れる）でpH7に調節し、エーテル100mLで３回抽出した。エーテル抽出物を廃棄し た。 50% 水酸化ナトリウム溶液で、水性相のpHを9.4に調節し、塩化ナトリウム175 gを加え（ほぼ半飽和）、クロロホルム100mLで３回、ブライン溶液を抽出した。 必要であれば、各抽出後にpHを9.4に再調節した。クロロホルム抽出物を集め、 硫酸マグネシウム上で乾燥させた。この段階が終了に近づくにつれて、水浴の温 度を45℃に上昇させて、回転式蒸発器中で、クロロホルムをできる限り完全に除 去した。残留物の重量は25.74g（理論量＝42.6g）であり、収率（未精製）は60. 4％であった。酸滴定によって求めたアミン含有量が表４に示されている。 実施例５ キニジン−親水リンカー抱合体の製造 方法Ａ． QAD-1とDA-10との直接結合 化学量論比：DSC/QAD-1モル比＝1.10；DA-10/QAD-1モル比＝3.00。 溶液１． QAD-1（107.65mg、0.2500ミリモル）およびジスクシンイミジルカ ーボネート（DSC; 70.46mg、0.2750ミリモル）を4mLバイアルに入れ、3.0mLの乾 燥DMSOを加え、全てのものが溶解するまで混合物を攪拌した。次に、トリエチル アミン（38μＬ）を加え、溶液を室温に１時間置いた（バイアルキャップを定期 的に弛めて、圧力を開放した）。 溶液２． 12mLバイアル＋キャップをラベル付けし、最近似ミリグラムまで風 袋計量した。DA-10（111.2mg 、0.7503ミリモル）、1.25mLのDMSO、および電磁 攪拌バーをバイアルに加えた。 溶液３． 溶液２を激しく攪拌し、次の液滴を加える前に各液滴が均質に混ざ るように、溶液１を慎重に滴下した。乾燥DMSOの４つの250μＬアリコートで、 バイアルを濯いで定量的変換が確実に行われるようにし、最終溶液を１時間攪拌 した。電磁攪拌バーをバイアル中の液体の液面よりも上に上げ（外部磁石を使用 ）、新たな乾燥DMSO（合計1.00mL）で 濯ぎ、次にバイアルから取り除いた。バイアルとそのキャップを秤の上に置き、 乾燥DMSOを加えることによって、内容物の合計重量を7.646gに調節した。全ての 反応が定量的であり、モノおよびジ置換アミンの理論分布が関係するという前提 に基づいて、約3×10-⁵ミリモル/μＬの最終抱合体濃度が得られるように、試薬 の量を選択した。 方法Ｂ．QAD-1とBoc-DA-10との結合および脱保護 QAD-1（107.65mg、0.2500ミリモル）およびトリエチルアミン（38μＬ）をク ロロホルム2mL中に溶解した。ジスクシンイミジルカーボネート（DSL; 70.46mg 、0.2750ミリモル）をアセトリトリル2mL中に溶解した（注：DSC はクロロホル ム中で不溶性である）。QAD-1溶液を、激しく攪拌したDSC溶液に滴下した。添加 終了後、攪拌を３時間継続し、次に、アセトニトリル2mL中のBoc-DA-10（62.08m g ；0.2500ミリモル）およびトリエチルアミン（38μＬ）の溶液を、全て一度に 加えた。混合物を３時間攪拌し、次に、減圧下に蒸留して乾燥させた。10mLの１ ：１塩化メチレン/トリフルオロ酢酸を、残留物に加え、混合物を30分間攪拌し 、次に減圧下に蒸留して乾燥させた。残留物を、8250μＬのジメチルスルホキシ ドに溶解した。全て反応が定量的であるという前提に基づいて、約3×10^-5ミリ モル/μＬの最終抱合体濃度が得られるように、試薬の量を選択した。 実施例６ Ａ．キニジン−親水リンカー−リポーター試薬抱合体（キニジン粒子試薬；QPR ）:QAD-1-DA-10抱合体とエポキシド官能ラテックス粒子との結合 定義：PRM（particle raw material）（粒子原料）は、本発明の一部を構成す るCraigらの米国特許第4480042号に記載のように製造される、架橋ポリ（グリシ ジルメタクリレート）で被覆されたポリスチレンコアーから粒子が構成されてい るポリマーラテックスである。GAFACはGAFACRE-610であり、以前はGAF Corporat ionによって販売されていたが、現在では、Rhone Poulenc，Collegeville，PA, からRhodafac RE-610の商品名で入手される。結合緩衝液は、100mM炭酸ナトリウ ム/炭酸水素ナトリウム、pH9.5である。洗浄緩衝液は、1%GAFAC含有、pH7.4の15 mM燐酸ナトリウムである。貯蔵緩衝液は、0.5%GAFAC含有、pH7.4の15mM燐酸塩で ある。 下記試薬を、50mL試験管反応器に連続的に加えた：8.04mLの脱イオン水、10mL の結合緩衝液、3.6mLのPRM（固形物含有量20.3%；粒子寸法、70nm）、1.25mLの1 0%GAFAC、1.8mL（一般的）のキニジン−親水リンカー抱合体（実施例５、Ａまた はＢより）、およ び0.32mLの10%DA-10水溶液。溶液のpHを9.5に調節し、反応管を70℃で18時間イ ンキュベートした。得られるキニジン−親水リンカー−リポーター粒子試薬を、 遠心分離器で、５℃で２時間分離した（Sorvall RC28S，F28/13ローターで27500 rpm）。上澄み液をデカントし、粒子試薬ペレットを、水洗緩衝液25mL中に懸濁 させた。遠心分離/洗浄段階を２回繰り返し、最終粒子試薬ペレットを、貯蔵緩 衝液25mL中に再度懸濁させた。QPRと称されるこの試薬は、３％固形物含有量を 有する。 Ｂ．キニジン粒子試薬（QPR）を使用するアッセイ 定義：アッセイ緩衝液は、ｍＭ燐酸塩緩衝液、0.4%GAFAC、pH7.0 、0.002%チ メロサールである（エチルメルクリチオサリチル酸、ナトリウム塩）（Aldrich Chemical Co.,Inc．WI）。粒子使用液は、キニジン粒子試薬（QPR;３％固形物） をアッセイ緩衝液で1:80に希釈することによって製造される。KohlerおよびMils tein，Nature，256:495-497(1975)に開示の方法と実質的に同じ、既知の標準ハ イブリドーマ法を用いて、培養室で製造される精製抗キニジンモノクローナル抗 体である。抗体希釈剤は、50mM燐酸塩緩衝液、75mM塩化ナトリウム、0.1%アジ化 ナトリウム、および0.05% チメロサール、pH7.0である。抗体使用液は、抗体原 液を抗体希釈剤で1:80の割合に希釈することによって製造される。 NJ）を用いて、キニジンの濃度を求めるための標準曲線を発生させた。５μＬ/ 試験の （discrete clinical analyzer system）と共に使用するための、E.I.du Pont d e 光度計の試薬窪みに装填した。20μＬ/試験の量の抗体使用液を、Cobas分光光度 計の開始試薬窪みに装填した。Cobasは、アッセイを37℃で行うように設定され た。サンプルを初めに混合し、粒子使用液で30秒間インキュベートした。340nm における吸光を測定し、ブランクとして使用した。次に、抗体使用液（出発試薬 ）を加えることによって、凝集反応を開始した。吸光エンドポイントを、220秒 において測定した。２つの吸光値の差が、サンプルによって発生する信号を構成 した。図３は、エンドポイント（EP）吸光（220秒後のミリ吸光単位）対、カリ ブレーター（calibrator）中の遊離キニジンの濃度（μｇ/ｍＬ）のプロットを 示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．C-11位に結合した担体を有する、式： で示される化合物のキニジン−担体免疫原性抱合体。 ２．式： [式中、x=1または2] で示されるキニジン誘導体およびその塩。 ３．キニジン誘導体が、式： [式中、x=1または2] を有する、請求項１に記載のキニジン−誘導体担体免疫原性抱合体。 ４．担体が、ポリ（アミノ酸）、タンパク質、炭水化物、ラテックス粒子、お よび糖タンパク質から成る群から選択される、請求項１に記載のキニジン−担体 免疫原性抱合体。 ５．担体が、キーホール・リムペット・ヘモシアニン（KLH）、γ−グロブリ ン、およびカボチャ種子グロブリン（PSG）から成る群から選択される、請求項 １に記載のキニジン−担体免疫原性抱合体。 ６．請求項１に記載の免疫原性抱合体に対して製造される抗キニジン抗体。 ７．キニジン誘導体が、キニジン分子のC-11位においてリンカーと結合してい る、キニジン−リンカー−リポーター免疫原性抱合体。 ８．-NH(CH₂)mO (CH₂CH₂O)n (CH₂)mNH- ［式中、m=2または3、およびn=1〜10］ から成るリンカーを介して、キニジンがリポーターに結合している請求項７に記 載の抱合体。 ９．n=1または2である請求項８に記載の抱合体。 １０．キニジン誘導体が、式： ［式中、x=1または２］ で示される請求項７に記載の抱合体。 １１．リポーターが、ラテッスク粒子、発蛍光団、化学発光物質、発色団、放 射性物質および酵素から成る群から選択される請求項７に記載の抱合体。 １２．リポーターがラテックス粒子である請求項７に記載の抱合体。 １３．構造式：Pr-NH (CH₂)mO (CH₂CH₂O) n(CH₂) mNH₂［式中、Prはアミン保 護基、m=2または3、n=1-10］ を有するモノ保護親水ジアミン試薬。 １４．n=1または2である請求項１３に記載のモノ保護親水ジアミン試薬。 １５．アミン保護基がtert−ブトキシカルボニル（t-Boc）である請求項１３ に記載のモノ保護親水ジアミン試薬。 １６．下記段階： （ａ）水性/有機媒体中、水酸化ナトリウムの存在下に、ジ−tert−ブチルジ カーボネートと過剰親水ジアミンとを反応させる； （ｂ）媒体の有機溶媒を、媒体の水性相から分離する； （ｃ）水性相のｐＨを下げることによって、本質的に全ての残留アミン基にプ ロトン付加する； （ｄ）水不混和性有機溶媒を水性相に加えて、段階（ｃ）の生成物から非塩基 性物質を除去する； （ｅ）塩基を加えて水性相のpHを上げて、残留アミン基の少なくとも半分が非 プロトン付加であるようにする； （ｆ）段階（ｅ）の水性相に塩を加える； （ｇ）水性相を水不混和性有機溶媒で抽出する； （ｈ）有機相を水性相から分離する；および （ｉ）有機相から溶媒を除去して、所望の生成物を得る； を含んで成る、請求項１３に記載のモノ−t-Boc保護親水ジアミン試薬の合成方 法。 １７．下記段階： （ａ）構造式：Pr-NH (CH₂)mO (CH₂CH₂O) _n (CH₂) mN H₂ ［式中、Prはtert−ブトキシカルボニル］ を有するモノ保護親水ジアミンリポーター試薬、試験サンプル、および凝集剤を 混合し；続いて、 （ｂ）既知の凝集イムノアッセイフォーマットを実施する； を含んで成る、試験サンプル中のキニジンの存在および/または量を検査するイ ムノアッセイ。