JPH10510207A

JPH10510207A - 隔離剤

Info

Publication number: JPH10510207A
Application number: JP8517441A
Authority: JP
Inventors: ニュー，ロジャー，ランダル，チャールズ; カービー，クリストファー，ジョン
Original assignee: コーテックスリミテッド
Priority date: 1994-12-09
Filing date: 1995-12-08
Publication date: 1998-10-06
Also published as: FI972411L; CN1169114A; CA2207274A1; GB9424901D0; FI972411A7; NO972607D0; NO972607L; MX9704272A; AU4183496A; IL116311A0; FI972411A0; EP0796086A1; ZA9510459B; WO1996017594A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、疎水性相及び疎水性相が分散する親水性相の間の直接的な相互作用を抑制する物質の使用を提供するものである。このような物質が添加される親水性物質からなる単相の疎水性調製物の調製方法もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】隔離剤本発明は、一般的には溶解しない疎水性相を親水性相に分散させる際の疎水性相における、該疎水性相に可溶化される、親水性分子の保持を補助する特定の化合物の使用に関するものである。特に、本発明は、一般的には溶解しない疎水性相における親水性高分子の保持を補助することを目的とする上記物質の使用に関するものである。製薬科学において、食品技術または化粧品工業において等、数多く用途について、タンパク質及び同様の高分子を用いた研究は、それらの親水性及び高い極性により脂質相と相互作用するまたは脂質相中に取り込まれることができる範囲が制限されるため、問題を有する。多くの自然界の機構は、脂質のバリアー（例えば、皮膚、細胞膜）を利用しており、内部のコンパートメントへの親水性分子の接近を阻害している；脂質媒介物中にタンパク質を分散することが可能になることによって、生物学的システムにこのような高分子を取り込むための新規なルートを開発でき、これにより、タンパク質を含む脂質媒質が、バリアーの疎水性成分を排除せずに、これらの成分を組み込むことができる。水性の媒質ではなく油相における親水性物質の分散液は、温度が介在する変性、加水分解、光感受性等に関する安定性を増すという点でさらに長所を有する。水溶液より広範な温度範囲にわたって流動性を維持し、またはより高い粘性を有することにより物理的な損傷に対してより大きな保護が得られる油が選ばれる。混合相のシステムにおいては、油中に疎水性物質が導入されることによって、油内及び水相内双方における、他の物質との相互に有害な相互作用−例えば、酸化 −が制限できる。高分子及び油双方を含む配合物の例はあり、その一例がＥＰ−Ａ−０３６６２７７号に開示されている。上記公報に開示されている配合物は、疎水性相がカイロミクロンまたはカイロミクロン形成脂質を含む、疎水性及び親水性相を有する乳濁液である。しかしながら、高分子は疎水性相ではなく親水性相に溶解する。ＥＰ−Ａ−０５２１９９４号は、レシチンと会合する生物学的に活性のある材料またはインビボにおいてレシチンの前駆体として作用することができる化合物からなる高分子の経口投与に適した組成物に関するものである。例示されたすべての組成物は親水性及び親油性相からなる配合物である。再度繰り返すが、上記従来の文献では、高分子は親油性相ではなく親水性相に溶解する。上述した配合物は確かに高分子及び油を含んではいるが、すべての場合において、高分子は初期には親油性相ではなく親水性相に溶解することは重要である。真に油中に高分子を溶解した溶液を形成する試みは限られた範囲でしか成功していない。オカハタ(Okahata)ら（ジェーケムソクケムコミュン(J．Chem．Soc． Chem．Commun.)、１９８８年、１３９２〜１３９４）には、疎水性溶剤中にタンパク質を可溶化させる方法が開示される。しかしながら、上記方法によって製造される両親媒性分子によって囲まれるタンパク質のアレイにおいて、著者らは、両親媒性分子は水素結合によってまたは静電的相互作用を介して液状媒質中でタンパク質と反応して固体の沈殿物を形成すると記載している。ＵＫ特許出願番号９３２３５８８．５号には、親水性物質を一般的に溶解しない疎水性溶剤中に可溶化できる方法が開示されている。上記方法は、親水性物質をある条件下で両親媒性物質(amphiphile)と混合すると、得られる組成物は油等の親油性溶剤中に容易に溶解するという驚くべき発見によるものである。しかしながら、このような方法による産物の１つの可能性のある問題としては、例えば、水等の、親水性相における単相の疎水性調製物の分散による、乳濁液の製造におけるその使用に関するものがある。このような分散液では、少なくとも場合によっては、可溶化される親水性物質が親水性相中に「漏れる」即ち可溶化プロセスを逆行させる傾向にあるであろう。したがって、上記作用を抑制し、このような疎水性相自体が後に親水性相中に分散される際でさえ親水性物質を疎水性相中に保持させる必要が存在する。驚くべきことに、化合物によっては疎水性相中に可溶化される親水性物質及び乳濁液等の該疎水性相が後に分散される親水性相の間の直接的な相互作用の度合いを減少できることが発見された。したがって、第一の概念によると、本発明は、疎水性相中に可溶化される親水性物質及び該疎水性相が分散される親水性相の間の直接的な相互作用を抑制する物質の使用を提供するものである。本発明において、「物質(agent)」ということばは、親水性物質が一般的には溶解しない疎水性相自体を親水性中に分散させて、例えば、乳濁液を形成する際に、該疎水性中に可溶化される親水性物質と該親水性相との間の直接的な相互作用を抑制できる物質を意味する。第二の概念によると、本発明は、一般的には溶解しない疎水性溶剤中に可溶化される親水性物質および該親水性物質と単相の疎水性調製物が分散される親水性相との間の直接的な相互作用を抑制する物質からなる単相の疎水性調製物を提供するものである。親水性物質は親水性相の個々の分子と接触できるが、大部分の親水性相とは接触できないので、故に、親水性物質の親水性相中への漏れは抑制されると考えられる。本発明において、「親水性物質(hydrophilic species)」ということばは、通常、水性溶剤には可溶性であるが疎水性溶剤には不溶性である物質を意味するものである。好ましくは、以下の物質が挙げられる：（ｉ）酸性脂質、例えば、コレステロールヘミスクシネート(cholesterol hem isuccinate)（Ｃｈｅｍｓ）またはホスファチジン酸；または（ｉｉ）例えば、カゼイン等の化合物などの疎水性相を通過できない乳化安定剤。第三の概念によると、本発明はまた、一般的には溶解しない疎水性溶剤中に可溶化される親水性物質、及び乳濁液等の、該疎水性相が分散される親水性相の間の直接的な相互作用を抑制するのに使用される物質を提供するものである。好ましくは、明細書中に記載される物質は、ＵＫ特許出願番号９３２３５８８．５号に記載される可溶化プロセスに使用される。したがって、さらなる概念によると、本発明は、以下よりなり：（ｉ）液状媒質中で両親媒性物質と親水性物質との間で化学的な相互作用が生じないように液状媒質中で親水性物質と両親媒性物質とを会合する(associate) ；（ｉｉ）液状媒質を除去し、親水性のヘッドグループ(head group)が親水性物質の方に向いた両親媒性分子のアレイ(array)を残す；および（ｉｉｉ）親水性物質／両親媒性物質のアレイの周りに疎水性溶剤を供給する、親水性物質及び疎水性相が分散される親水性相の間の直接的な相互作用を抑制する物質を一以上の上記段階で添加する、疎水性溶剤における、親水性物質からなる単相の疎水性調製物の調製方法を提供するものである。好ましくは、上記方法において、上記物質は段階（ｉ）において両親媒性物質(amphiphile)と共に添加され、また、例えば、コレステロールヘミスクシネート(cholesterol hemisuccinate)（Ｃｈｅｍｓ）またはホスファチジン酸（ＰＡ）等の化合物などの疎水性相を通過できない乳化安定剤であることが好ましい。本発明の明細書において、「化学的な相互作用」という言葉は、共有結合またはイオン結合または水素結合等の相互作用に関するものであり、ファンデルワールス力またはこのようなオーダーの大きさの他の相互作用を含むことを意図するものではない。他の概念によると、本発明は、親水性物質及び親水性相の間の直接的な相互作用を抑制する物質を親水性相に添加する段階からなる、親水性相における、疎水性溶剤における親水性物質からなる、単相の疎水性調製物の分散方法を提供するものである。上記方法において、上記物質は、例えば、カゼイン等の化合物などの疎水性相を通過できない乳化安定剤であることが好ましい。広範な様々な高分子が本発明の方法を用いて適当に可溶化できる。油溶液中に疎水性高分子を可溶化させることは一般的にほとんど難しくないので、通常、高分子化合物は親水性であるまたは少なくとも親水性領域を有するものである。適当な高分子の例としては、タンパク質及び糖タンパク質、ＤＮＡやＲＮＡ等の、オリゴ−及びポリ核酸(oligo- or polynucleic acid)、多糖及び場合によっては、全細胞または細胞小器官またはウィルス（全部またはその一部）を含むこれらのいずれかの超分子集合体(supermolecular assembly)が挙げられる。高分子、特にシクロデキストリン等の多糖、と共にビタミン等の小分子を一緒に可溶化(c o-solubilise)することも簡便である。ビタミンＢ₁₂等の小分子をまた高分子と化学的に共役させて、本組成物中に含ませてもよい。特に、可溶化される高分子がタンパク質またはポリペプチドである際には、該物質は酸性脂質であることが好ましい。本発明の方法によって好ましく可溶化されるタンパク質の例としては、インスリン、カルシトニン、ヘモグロビン、シトクロムＣ、西洋ワサビのペルオキシダーゼ、アプロチニン、マッシュルームのチロシナーゼ、エリトロポエチン、ソマトトロピン、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、ガラニン(galanin)、ウロキナーゼ、因子ＩＸ、組織プラスミノーゲン活性化因子、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、フェリチン、インターフェロン、因子ＶＩＩＩ、メラニン及びこれらの断片（上記タンパク質はすべて適当な源由来である）が挙げられる。他の使用できる高分子としては、ＦＩＴＣ−標識デキストラン(FITC-labelled dextran)及びトルラ属の酵母(Torulla yeast)からのＲＮＡ抽出物がある。高分子に加えて、本発明の方法はより小さい有機分子を可溶化するのにも使用できる。小さな有機分子の例としては、グルコース、アスコルビン酸、カルボキシフルオレシン(carboxyfluorescin)及び抗癌剤等の数多くの薬剤が挙げられるが、本方法は他の小さな有機分子、例えば、他のビタミン類または製薬上若しくは生物学的に活性を有する物質、にも同様にして使用できることはいうまでもない。さらに、塩化カルシウムやリン酸ナトリウム等の分子もまた本発明の方法を用いて可溶化できる。本発明は、非水溶液の使用によって分子が体内に入り変化する、例えば、生物学的利用能を向上するようなルートが可能になるので、製薬上及び生物学的に活性を有する物質に対して特に好ましい。本発明の疎水性組成物に含まれる他の型の物質は、小さな無機分子等の無機材料またはコロイド金属等のコロイド物質である。本発明の方法は、コロイド金、パラジウム、白金若しくはロジウム等のコロイド金属の性質を、粒子が一般的な環境下では凝集してしまう疎水性溶剤中でさえ保持することが可能である。このことは有機溶剤中で行われる反応の触媒として特に有用である。本発明において使用される両親媒性物質は数多く存在し、リン脂質等の双性イオンの両親媒性物質は特に好ましいことが知られているものに含まれる。ホスファチジルコリンのヘッドグループを有するリン脂質は特に好ましく用いられ、このようなリン脂質の例としては、ホスファチジルコリン（ＰＣ）それ自身、リゾ −ホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）、スフィンゴミエリン、ヘキサデシルホスホコリン等のこれらの誘導体またはホスホリルコリンを含む両親媒性ポリマー及びフッ素化(fluoronated)リン脂質等のハロゲン化両親媒性物質が挙げられる。本願において、「ホスファチジルコリン（ＰＣ）」及び「レシチン」という言葉は交互に使用される。適当な天然のレシチンは、例えば、卵、及び特に大豆等の既知の源由来であってもよい。ほとんどの場合、使用される疎水性溶剤と化学的に類似の両親媒性物質を選ぶことが好ましく、この件に関しては以下により詳細に説明する。本発明者らがリン脂質等の双性イオンの両親媒性物質が本方法において特に好ましく使用されることを発見したという事実は、本発明とオカハタ(Okahata)らの方法の有意な差をさらに示すものである。さらに、従来の文献の著者等は、陰イオンの及び双性イオンの脂質は著者等の方法に使用するには全く適当でないと結論付けており、これらの脂質を用いると複合体の収率はゼロであったと述べていた。使用される疎水性溶剤は、組成物が使用される目的、可溶化される物質の型及び両親媒性物質によって異なる。適当な溶剤としては、鉱油、スクアラン及びスクアレン等の非極性油、長鎖の脂肪酸（オレイン酸やリノレン酸等の不飽和脂肪酸が好ましい）、アルコール類、特にオクタノール等の中鎖のアルコール類やフィトール等の枝分れ長鎖アルコール類、ネロールやゲラニオール等のイソプレノイド類、テルピネオール、グリセロールモノオレエート（ＧＭＯ）等のモノグリセリド、酢酸エチル、酢酸アミルや酢酸ボルニル等の他のエステル類、ジグリセリド及びトリグリセリド、特に中鎖のトリグリセリド及びこれらの混合物、長鎖フルオロカーボン等のハロゲン化油またはリピディオール(lipidiol)等のヨウ素化トリグリセリドなどの上記いずれかのハロゲン化類似体が挙げられる。最適な結果は、通常、疎水性溶剤及び両親媒性物質を適当に使用する際に得られる。例えば、オレイン酸等の溶剤には、ｌｙｓｏ−ＰＣがＰＣよりも好ましく選ばれた両親媒性物質であり、疎水性溶剤がトリグリセリドである際には逆が好ましい。さらに、場合によっては、親水性物質／両親媒性物質のアレイに接触する前に大量の両親媒性物質を疎水性溶剤に添加することが好ましいことが分かった。このことは、疎水性溶剤に対する両親媒性物質の高い親和性により、両親媒性分子が親水性物質周辺の位置から除かれないことを示すものである。本発明の調製物は、肉眼では透明で、さらに、可視波長での濁度を測定することにより、及び場合によってはある一定の期間沈降を調べることにより検出できることが非常に好ましい。親水性のヘッドグループが親水性物質部分に面するアレイ中への両親媒性分子の向きは多様に得られ、特に適当な方法の例は以下により詳細に記載する。カービー(Kirby)ら（バイオテクノロジー(Biotechnology)、１９８４年１１月、頁９７９〜９８４及びリポソームテクノロジー(Liposome Technology)、Ｉ巻、頁１９〜２７、グレゴリアディス著、シーアールシープレス，インコーポレイテッド、ボカレイトン、フロリダ、ユーエスエー(Gregoriadis，Ed.，CRC Press，Inc.，Boca Raton，Florida，USA )）によって記載された方法と同様の出発点を有する、第一の方法では、親水性物質を親水性溶剤における両親媒性物質の分散液と混合することにより、両親媒性分子は親水性のヘッドグループが親水性物質を含む親水性相に向かって外側に面する集合体を形成する。次に、親水性溶剤を除去して、両親媒性分子の親水性のヘッドグループが親水性物質に向かう乾燥組成物を残す。オカハタ(Okahata)らによる方法においても、タンパク質溶液は水における両親媒性物質の分散液と混合した。しかしながら、上記文献の著者等は、さらに疎水性溶剤に可溶性となる沈殿物を得ることが必要であると信じていた。本発明の多くの好ましい両親媒性物質はこのような沈殿物を形成しないので、オカハタ(O kahata)らはこれらは使用できないと結論付けた。本発明の方法によると、沈殿物は必要とせず、むしろ、目的とする生成物の収率が減少するので沈殿物を形成させることは望ましくないと一般的に考えられている。第一の方法によると、他の極性溶剤を使用してもよいが、親水性溶剤は水であることが好ましい。両親媒性物質の集合体によって取られる形態は、ミセル、単ラメラ小胞、好ましくは約２５ｎｍの直径を有すると通常考えられる小さい単ラメラ小胞、多重ラメラ小胞または管状構造物、例えば渦巻形のシリンダー、六角形相(hexagonal p hase)、立方形相(cubic phase)またはミエリン型構造物(myelin type structure )がある。使用される形態は使用する両親媒性物質によって異なり、例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）等の両親媒性物質は小さい単ラメラ小胞を形成する傾向にあるが、リゾ−ホスファチジルコリンはミセルを形成する。しかしながら、これらのすべての構造物において、両親媒性分子の疎水性のテールは構造物の中心に向かって内側に面しているが、親水性のヘッドグループは親水性物質が分散する溶剤に向かって外側に面している。両親媒性物質：親水性物質の重量比は、通常、１：１〜１００：１、好ましくは２：１〜２０：１の範囲内であり、最も好ましくは、ＰＣで約８：１であり、ｌｙｓｏ−ＰＣでは４：１である。これらの割合は好ましい割合であるのみであり、特に、上限は最小限の可能な量の両親媒性物質を用いることが好ましいという経済的な考慮によって設定されていることを指摘するべきである。より低い限度はより臨界的であり、２：１またはそれより低い割合のみが親水性物質がかなり疎水性部分を有するまたは非常に大きい場合に用いられると考えられる。溶剤を速やかに除去すると良好に実施でき、既知の溶剤除去方法は凍結乾燥法でありが、他の方法を用いてもよい。場合によっては、特に、親水性物質が大きなタンパク質等の高分子化合物である際には、親水性溶液中に塩を含ませることが有用である。しかしながら、大量の無機塩の存在によって結晶が形成して、曇った溶液になりやすくなるため、塩化ナトリウム等の無機塩ではなく有機塩が使用されるのが好ましい。酢酸アンモニウムが、凍結乾燥によって容易に除去できるというさらなる長所を有するため、このように目的には特に好ましい。ヘッドグループが親水性物質部分方向に向いている両親媒性物質のアレイを含む組成物の第二の調製方法は、共有の溶剤に親水性物質及び両親媒性物質を一緒に可溶化し(co-solubilise)た後溶剤を除去することである。本発明の方法の生成物は新規である。したがって、本発明のさらなる概念によると、本発明の方法によって得られる疎水性溶剤における親水性物質からなる単相の疎水性調製物を提供するものである。親水性物質に加えて単相の疎水性調製物中に他の成分を含ませることも望ましい。このことは、親水性物質が高分子である際に、しばしば特に好ましく、この場合には、調製物は、例えば、胆汁酸塩、ビタミン類または高分子に結合する若しくは高分子と会合する他の小分子を含んでいてもよい。高分子／両親媒性物質のアレイによっては上記したカービー(Kirby)らによって開示されているが、開示されているアレイはすべてリポソームの形成における中間体であり、上述したように、このような型のものからなる非リポソームのまたは疎水性の組成物には従来は何等興味がなかった。したがって、両親媒性物質が小さい単ラメラ小胞を形成しないためリポソームを形成するとは考えられないものである本発明のアレイは新規である。本発明の調製物の一つの長所としては、本質的に無水であるため加水分解に対してより安定であることが挙げられる。また、タンパク質の場合では、本調製物はタンパク質が開いて(unfold)変性するには水が存在しなければならないと考えられるため、凍結融解に安定であり、高温でより大きな安定性を有する。このことは、親水性物質の水性の調製物に比べると非常により長い寿命を有すると考えられることを意味する。本発明の溶液は非常に多能であり多くの用途がある。これらはまた、単独で使用してよいが、水相と組み合わせて使用して乳濁液または同様の２相組成物を形成することが好ましく、このことは本発明のさらなる概念を形成するものである。本発明の上記概念によると、親水性相および疎水性相からなる２相組成物であって、該疎水性相が上記方法によって得られる親油性溶剤における親水性物質の調製物からなるものである２相組成物を提供するものである。一般的には、このようなタイプの組成物では、疎水性相は親水性相中に分散している。２相組成物は、必要とされる目的によっては、一時的であるまたは安定である乳濁液であってもよい。乳濁液粒子の平均的な大きさは疎水性相および水相両方の性質によって異なる。しかしながら、２μｍ程度の範囲内である。水相における疎水性調製物の分散液は、混合によって、例えば、約１０〜６０秒、一般的には約１５秒間等の短期間激しくボルテックスする(vortexing)、または例えばオービタルシェーカー(orbital shaker)を用いて数時間緩やかに混合することによって、得られる。他の概念によると、本発明は、可溶化される際の親水性物質及び親水性物質を可溶化する疎水性相が分散される親水性相の間の直接的な相互作用を抑制する物質をあらかじめ添加した親水性相に疎水性相を分散させることからなる、疎水性相の、乳濁液等の、分散液の調製方法を提供するものである。本発明を以下の実施例を参照しながらさらに説明するが、下記実施例は本発明を制限するものではないことはいうまでもない。実施例１０．００１５Ｍホウ酸緩衝液を、１００ｍｌの蒸留水に６０ｍｇのテトラホウ酸ナトリウムを溶解し、ｐＨ８．００に調整することにより調製した。５ｍｇのＢＡＰＮＡをＢ９ガラス製ネジキャップ付きバイアル瓶中に秤量し、３ｍｌのメタノールに溶解した。１０ｍｇのトリプシンを１５ｍｌプラスチック製の遠心管 (centrifuge)中に秤量し、そして１０ｍｌのホウ酸緩衝液をボルテックス(vorte xing)しながら添加した。懸濁液を、ローラーミキサーで混合した後、未溶解物を沈降させ(spin down)、上清をデカンテーションした。アプロチニンの希釈溶液（５０μｌ／ウェル）を０〜３０μｇ／ｍｌの濃度でミマイクロプレートの列に沿って分取した。上記ＢＡＰＮＡ溶液を、１ｍｌ〜２０ｍｌの緩衝液を添加することによって２０倍に希釈した後、１００μｌのＢＡＰＮＡ希釈標準溶液を各ウェルに導入し、完全に混合した。このプレートを４０分間３７℃で振盪しながらインキューベートした後、４０５ｎｍでのプレートリーダーで読みとった。ウェル中のアプロチニン濃度に対する基質変換による光学濃度をプロットした後、アプロチニンがトリプシン活性を中和するにちょうど十分である濃度での変曲点を観察する。この変曲点の位置は、テストサンプルのウェル中にさらに導入されたアプロチニンの量にしたがって移動し、この濃度は標準品と比較することによって推測することができる。これにより、油から放出されて水相に移りやすいアプロチニンの割合が示される。アプロチニンを、実施例４のプロトコルと同様にして超音波処理された大豆のホスファチジルコリン分散液（１００ｍｇ／ｍｌ蒸留水）１００μｌ、及びアプロチニン溶液（２０ｍｇ／ｍｌ蒸留水）２５μｌの混合物を凍結乾燥し、次いで１００μｌのミグリオール８１８(Miglyol 818)を添加することによって、ミグリオール８１８(Miglyol 818)中に可溶化した。アプロチニンの濃度は、油中で５ｍｇ／ｍｌであった。コントロール溶液は、アプロチニンを使用しなかった以外は、上記と同様にして調製した。これらの油の水性分散液を、１０μｌの各油を１ｍｌのホウ酸緩衝液と共に１０秒間ボルテックスすることによって調製した。これらの第二の分散液におけるアプロチニンの最終濃度は０および５０μｇ／ｍｌであった。これらの分散液を２倍に希釈し、上記方法に記載されたのと同様にしてマイクロプレートのウェルに添加し、この際、０、５、１０、１５及び２５μｇ／ｍｌの希釈溶液を用いた。基準化された光学濃度を下記表、および添付するグラフに示す。１２．５μｇ／ｍｌのコントロールの標準物質との比較により、少なくとも５０％のアプロチニンが水相中に油から放出されることが示される。実施例２アプロチニンを、リン脂質分散液にホスファチジルコリンに加えて１０重量％のホスファチジン酸を含ませた用いた以外は、上記実施例に記載したのと同様にしてミグリオール８１８(Miglyol 818)中に可溶化した。分散液を適切に試験し、２５μｇ／ｍｌ及び１２．５μｇ／ｍｌのコントロールの標準物質と比較した。これらの標準との比較によって、わずかに２５％のアプロチニンが水相中に放出されることが示される。実施例３アプロチニンを、リン脂質分散液にホスファチジルコリンに加えて１０重量％のコレステロールヘミスクシネート（Ｃｈｅｍｓ）を含ませた以外は、上記実施例に記載したのと同様にしてミグリオール８１８中に可溶化した。該分散液を適切に試験し、そして、２５、１２．５および６．２５μｇ／ｍｌのコントロールの標準物質と比較した。これらの標準物質との比較により、わずかに１２．５％のアプロチニンが水相中へ放出されることが示される。実施例４１００ｍｇ／ｇの懸濁液を含む、大豆のホスファチジルコリン（ｓｏｙＰＣ）の水性分散液を調製し、窒素で完全にフラッシュし(flush)、８ミクロンのピーク間の幅で超音波処理した。各アリコートに、氷スラリー浴中で３０秒間冷却することによって３０秒のパルスを挿入して、全４分間の超音波処理を施した。次に、得られた小さい単ラメラ小胞(small unilamellar vesicle)（ＳＵＶ）の乳白色の分散液を１５分間遠心してチタン粒子を除去した。コロイド金ゾルを以下のようにして調製した。１５μｌの２５ｍＭ炭酸カリウム、１５μｌの１％タンニン酸及び５０ｍｇのクエン酸三ナトリウムを蒸留水で総重量２２．５ｇに調製し、１０ｍｌを２５ｍｌの共せんガラス製コニカルフラスコ（Ａ）に移し、ウォーターバス中で６０℃に加熱した。２５ｍｇの塩化金三水和物を蒸留水で２５０ｍｇに調製し、得られた溶液５０μｌを５０ｍｌの共せんガラス製コニカルフラスコ（Ｂ）中の４０ｍｌの蒸留水に添加し、同様のウォーターバス中で６０℃に加熱した。フラスコＡの内容物をフラスコＢのものと混合し、７５分間加熱し続けると、濃い赤色のコロイド金ゾルが形成された。室温まで冷却した後、１０ｍｌの一部を２ｍｇのウシ血清アルブミンと混合することにより安定化させた。１ｍｌの安定化金ゾルを０．６ｍｌのＳＵＶと混合し、一晩凍結乾燥し、得られた凍結乾燥物を３００ｍｇのミグリオール８１８と共にボルテックスする(vor texing)ことにより分散させた。１時間以内に、透明な赤色のミグリオールにおけるコロイド金の分散液が形成された。この分散液の３個の５０ｍｇのアリコートをガラス製の小バイアル瓶に加えた後、５００ｍｇの水、リン酸緩衝グルコース溶液（１ｍＭリン酸ナトリウムを含む３００ｍＭグルコース、ｐＨ７．４）及びＳＵＶを別のバイアル瓶に添加した。この混合物を１０秒間ボルテックスすることにより乳化させた後、観察した。１時間以内に、乳濁液のクリーミングが生じ始め、一晩放置後、これは実質的な範囲にまで起こった。すべての場合で、下方の水相がピンク色に着色されたのが観察されたことから、一部のコロイド金が油相から放出されたことが示された。しかしながら、ＳＵＶの存在下で乳化された調製物では、上方の油乳濁液相では保色性の度合いが有意により高く、下方の水相での保色性の度合いはそれに比例してより低かった。これより、リン脂質のＳＵＶ分散液の存在は、油相からのコロイド金の損失を抑制する役割を果たすと考えられた。実施例５１ｍｌのインスリンの１％溶液（溶解を促進するために２％酢酸を含む）を１ μＣｉのＩ¹²⁵−標識インスリンと混合した後、さらに、実施例３と同様にして調製されたコレステロールヘミスクシネート含有ＳＵＶ３ｇと混合した。この混合物を凍結乾燥し、得られた凍結乾燥物を、オービタルシェーカー(orbital s haker)で４時間混合して、ミグリオール８１８３ｇで分散させることにより、油における放射線標識されたインスリンの透明な分散液を得た。２００ｍｇの分散液の２個のアリコートを、それぞれ、８００ｍｇのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と混合し、それぞれ、１０秒及び３０秒間ボルテックスすることにより乳化した。各々の得られたｏ／ｗ乳濁液をさらに９ｍｌのＰＢＳで希釈した後、８０，０００ｇで４０分間遠心して、その成分画分に分類した。油相の表面層を注意深く残存したＩ¹²⁵−標識インスリンによるガンマ放射能の計測用のバイアル瓶に移した。放出されたＩ¹²⁵−標識インスリンを含む上清を別のバイアル瓶に移し、既に形成されたペレットを残した。ペレット、典型的な割合の上清及び残った油画分すべてについて、油画分の上清による混入に関して適当な修正を行いながら、放射能を計測した。２種の乳濁液のうち、一方を３０秒間ボルテックスしたところ、４５．４％の放射線標識が油相内に保持され、３．０％は遠心によるペレット（本質的にリポソームであると考えられる）に関連するものであることが示され、さらに、１０秒間ボルテックスされた乳濁液に関する相当する数字は、それぞれ、４３．３．及び１．３％であった。これに対して、油分散液を調製するのに使用したＳＵＶがｓｏｙＰＣ／Ｃｈｅｍｓではなく純粋なｓｏｙＰＣから構成される別の２実験では、標識物の油における保持率は３１％及び２８％であり、各場合におけるペレットでは１％であった。これより、油におけるタンパク質の分散液を調製するのに使用される両親媒システムにＣｈｅｍｓを含ませることにより、後者が乳化されて第二のｗ／ｏ分散液を形成する際には油内のタンパク質の保持率が向上すると考えられる。実施例６下記に列挙される組成物を使用する以外は実施例３に記載されたのと同様にして、Ｉ¹²⁵−標識インスリンを調製し、油相中に導入した。調製物１の１個の１００ｍｇのアリコート及び調製物２の同様のアリコートを１０ｍｌの遠心管に秤量した。各アリコートに、１ｍｌのＰＢＳを添加した。すべてを１０秒間完全にボルテックスした後、後者を１０ｍｌのＰＢＳで希釈した。次に、実施例２に記載されたのと同様にして、乳濁液を遠心し、各成分相に分画した。得られたペレットは、高い割合のリン脂質を含む油から構成されると考えられる。ホスファチジン酸を含む調製物では、ホスファチジルコリン単独を含む調製物に比べて、かなりより少量の放射線標識されたインスリンが水性上清に放出される。実施例７下記に列挙される組成物を使用する以外は実施例２に記載されたのと同様にして、Ｉ¹²⁵−標識インスリンを調製し、油相中に導入した。調製物１の１個の１００ｍｇのアリコートを１０ｍｌの遠心管に秤量し、０．５％カゼイン溶液１ｍｌを添加し、１０秒間完全にボルテックスした。次に、試験管の内容物を１０ｍｌの０．５％カゼイン溶液で希釈した。さらに、実施例２に記載されたのと同様にして、乳濁液を遠心し、各成分相に分画した。表に示されるように、かなりの割合の放射線標識されたインスリンが油相内に保持される。実施例８０．８ｍｌの２５ｍＭ塩化カルシウムを、実施例１と同様にして調製された０．８ｍｌのｓｏｙＰＣＳＵＶと混合し、一晩凍結乾燥し、得られた凍結乾燥物を０．５ｇのミグリオール８１８と混合した。一晩放置した後、完全に透明な分散液が形成された。一部の分散液は、１５０ｍｇを約０．１７ｍｇのスダン４色素と混合し、透明な濃い赤色の溶液を形成することによって着色させた。２ｍｌの１％アルギン酸ナトリウムをガラス製の試験に移し、短時間ボルテックスすると同時に、パスツールピペットから上記着色した油分散液を添加した。得られた不透明な乳濁液を５００ｇで５分間遠心し、上方のピンク色の油分を多量に含む相を下方にある透明な水相からデカンテーションし、光学顕微鏡で観察した。すべての油は、凝結物の兆候を示さない数多くの小さな離散した液滴として存在していることが分かった。一部の油の液滴は、油の液滴から放出されるカルシウムイオンによるアルギン酸塩の界面複合体形成(interfacial complexation)によるものであると推測される外壁に囲まれていると考えられた。１２日間放置しても、顕微鏡によってもあるいは肉眼によっても、乳濁液の破壊(breakdown)の兆候は依然としてなかった。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年１月１７日【補正内容】請求の範囲１．疎水性相が親水性のヘッドグループが疎水性溶剤中に分散される親水性物質の方を向いた両親媒性分子のアレイからなる、疎水性相中に可溶化される親水性物質及び該疎水性相が分散される親水性相の間の直接的な相互作用を抑制する物質の使用。２．該物質が疎水性相を通過できない乳化安定剤または酸性脂質である、請求の範囲第１項に記載の使用。３．該物質がコレステロールヘミスクシネート（Ｃｈｅｍｓ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）またはカゼインである、請求の範囲第２項に記載の使用。４．親水性のヘッドグループが疎水性溶剤中に分散される親水性物質の方を向いた両親媒性分子のアレイからなる単相の疎水性調製物において、該調製物が親水性物質および疎水性調製物が分散される親水性相との間の直接的な相互作用を抑制する物質からなることを特徴とする単相の疎水性調製物。５．以下ＡまたはＢよりなる：Ａ．ｉ）親水性物質を溶剤における両親媒性物質の溶液または分散液と混合する；ｉｉ）溶剤を除去して両親媒性分子の親水性のヘッドグループが親水性物質の方を向いた乾燥組成物を残す；及びｉｉｉ）親水性物質／両親媒性物質のアレイの周りに疎水性溶剤を供給する；またはＢ．ｉ）疎水性溶剤における両親媒性物質の溶液を親水性溶剤における親水性物質の溶液で乳化して乳濁液を得る；及びｉｉ）該疎水性溶剤を除去する疎水性溶剤における親水性物質からなる単相の疎水性調製物の調製方法において、親水性物質及び疎水性調製物が分散される親水性相の間の直接的な相互作用を抑制する物質を一またはすべての上記段階で添加することを特徴とする調製方法。６．該物質が酸性脂質である、請求の範囲第５項に記載の方法。７．該物質がコレステロールヘミスクシネート（Ｃｈｅｍｓ）またはホスファチジン酸（ＰＡ）である、請求の範囲第６項に記載の方法。８．親水性相における、親水性のヘッドグループが疎水性溶剤中に分散される親水性物質の方を向いた両親媒性分子のアレイからなる単相の疎水性調製物の分散方法において、該方法がさらに親水性物質及び親水性相の間の直接的な相互作用を抑制する物質を親水性相に添加する段階からなることを特徴とする分散方法。９．該物質が疎水性相を通過できない乳化安定剤である、請求の範囲第８項に記載の方法。１０．該物質がカゼインである、請求の範囲第９項に記載の方法。１１．該親水性物質がタンパク質、糖タンパク質、オリゴ−及びポリ核酸、多糖およびこれらの超分子集合体からなる群から選ばれるものである、請求の範囲第１項から第３項のいずれかに記載の使用、請求の範囲第４項に記載の調製物、または請求の範囲第５項から第１０項のいずれかに記載の方法。１２．該親水性物質がインスリン、カルシトニン、ヘモグロビン、シトクロムＣ、西洋ワサビのペルオキシダーゼ、アプロチニン、マッシュルームのチロシナーゼ、エリトロポエチン、ソマトトロピン、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、ガラニン、ウロキナーゼ、因子ＩＸ、組織プラスミノーゲン活性化因子、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、フェリチン、インターフェロン、因子ＶＩＩＩ、メラニン、これらの断片、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＦＩＴＣ−標識デキストランまたはビタミンＢ₁₂である、請求の範囲第１項から第３項のいずれかに記載の使用、請求の範囲第４項に記載の調製物、または請求の範囲第５項から第１０項のいずれかに記載の方法。１３．該両親媒性物質がリン脂質である、請求の範囲第１項から第１２項のいずれかに記載の使用、調製物または方法。１４．該リン脂質がホスファチジルコリンのヘッドグループを有する、請求の範囲第１３項に記載の使用、調製物または方法。１５．該リン脂質がホスファチジルコリン（ＰＣ）、リゾ−ホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）、スフィンゴミエリン、ヘキサデシルホスホコリン等の上記いずれかの誘導体またはホスホリルコリンを含む両親媒性ポリマーである、請求の範囲第１４項に記載の使用、調製物または方法。１６．該疎水性溶剤が長鎖の脂肪酸、中鎖のアルコール、枝分れ長鎖アルコール、モノグリセリド、ジグリセリド、中鎖のトリグリセリドまたは長鎖のトリグリセリドからなる、請求の範囲第４項から第１５項のいずれかに記載の調製物または方法。１７．該リン脂質がＰＣからなりかつ該疎水性溶剤がトリグリセリドであるまたは該リン脂質がｌｙｓｏ−ＰＣからなり該疎水性溶剤がオレイン酸である、請求の範囲第１６項に記載の調製物または方法。１８．方法Ａを使用し、かつ段階（ｉ）において、親水性物質を水における両親媒製物質の分散液と混合する、請求の範囲第５項に記載の方法。１９．両親媒性物質の集合体がミセル、単ラメラ小胞、多重ラメラ小胞または渦巻形のシリンダー等の管状構造物、六角形相、立方形相またはミエリン型構造物からなる、請求の範囲第１８項に記載の方法。２０．水は凍結乾燥によって除去される、請求の範囲第１８項または第１９項に記載の方法。２１．方法Ｂを使用し、かつ親水性物質に対する両親媒性物質の重量比が約１：１〜５０：１である、請求の範囲第５項に記載の方法。２２．該乳濁液が油中水型乳濁液である、請求の範囲第２１項に記載の方法。２３．該疎水性溶剤が低沸点の有機エーテルである、請求の範囲第２１項または第２２項に記載の方法。２４．請求の範囲第５項、第７項または第１１項から第２３項のいずれかに記載の方法によって得られる疎水性溶剤における親水性物質の単相の疎水性調製物。２５．疎水性相が請求の範囲第４項または第２４項に記載の調製物からなる、親水性相及び疎水性相らなる２相組成物。２６．該疎水性相が連続した親水性相中に分散される、請求の範囲第２５項に記載の組成物。２７．乳濁液である、請求の範囲第２５項または第２６項に記載の組成物。２８．親水性物質の経口投与における請求の範囲第４項若しくは第１１項から第１７項のいずれかに記載の調製物、請求の範囲第２４項に記載の調製物または請求の範囲第２５項から第２８項のいずれかに記載の組成物の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者カービー，クリストファー，ジョンイギリス国，バークシャイアーアールジー11 ２ワイエル，ウァーキングハム，オックスフォードロード 95

Claims

【特許請求の範囲】１．疎水性相中に可溶化される親水性物質及び該疎水性相が分散される親水性相の間の直接的な相互作用を抑制する物質の使用。２．該物質が酸性脂質または疎水性相を通過できない乳化安定剤である、請求の範囲第１項に記載の使用。３．該物質がコレステロールヘミスクシネート（Ｃｈｅｍｓ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）またはカゼインである、請求の範囲第２項に記載の使用。４．一般的には溶解しない疎水性溶剤中に可溶化される親水性物質および該親水性物質と単相の疎水性調製物が分散される親水性相との間の直接的な相互作用を抑制する物質からなる単相の疎水性調製物。５．以下よりなり：（ｉ）液状媒質中で両親媒性物質と親水性物質との間で化学的な相互作用が生じないように液状媒質中で親水性物質と両親媒性物質とを会合する；（ｉｉ）液状媒質を除去し、親水性のヘッドグループが親水性物質の方に向いた両親媒性分子のアレイを残す；および（ｉｉｉ）親水性物質／両親媒性物質のアレイの周りに疎水性溶剤を供給する、親水性物質及び該疎水性調製物が分散される親水性相の間の直接的な相互作用を抑制する物質を一またはすべての上記段階で添加する、疎水性溶剤における、親水性物質からなる単相の疎水性調製物の調製方法。６．該物質が酸性脂質である、請求の範囲第５項に記載の方法。７．該物質がコレステロールヘミスクシネート（Ｃｈｅｍｓ）またはホスファチジン酸（ＰＡ）である、請求の範囲第６項に記載の方法。８．親水性物質及び親水性相の間の直接的な相互作用を抑制する物質を親水性相に添加する段階からなる、親水性相における、疎水性溶剤における親水性物質からなる、単相の疎水性調製物の分散方法。９．該物質が疎水性相を通過できない乳化安定剤である、請求の範囲第８項に記載の方法。１０．該物質がカゼインである、請求の範囲第９項に記載の方法。１１．該親水性物質がタンパク質、糖タンパク質、オリゴ−及びポリ核酸、多糖およびこれらの超分子集合体からなる群から選ばれるものである、請求の範囲第１項から第３項のいずれかに記載の使用、請求の範囲第４項に記載の調製物、または請求の範囲第５項から第１０項のいずれかに記載の方法。１２．該親水性物質がインスリン、カルシトニン、ヘモグロビン、シトクロムＣ、西洋ワサビのペルオキシダーゼ、アプロチニン、マッシュルームのチロシナーゼ、エリトロポエチン、ソマトトロピン、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、ガラニン、ウロキナーゼ、因子ＩＸ、組織プラスミノーゲン活性化因子、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、フェリチン、インターフェロン、因子ＶＩＩＩ、メラニン、これらの断片、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＦＩＴＣ−標識デキストランまたはビタミンＢ₁₂である、請求の範囲第１項から第３項のいずれかに記載の使用、請求の範囲第４項に記載の調製物、または請求の範囲第５項から第１０項のいずれかに記載の方法。１３．該両親媒性物質がリン脂質である、請求の範囲第５項から第７項のいずれかに記載の方法。１４．該リン脂質がホスファチジルコリンのヘッドグループを有する、請求の範囲第１３項に記載の方法。１５．該リン脂質がホスファチジルコリン（ＰＣ）、リゾ−ホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）、スフィンゴミエリン、ヘキサデシルホスホコリン等の上記いずれかの誘導体またはホスホリルコリンを含む両親媒性ポリマーである、請求の範囲第１４項に記載の方法。１６．該疎水性溶剤が長鎖の脂肪酸、中鎖のアルコール、枝分れ長鎖アルコール、モノグリセリド、ジグリセリド、中鎖のトリグリセリドまたは長鎖のトリグリセリドからなる、請求の範囲第５項から第７項のいずれかにまたは請求の範囲第１３項から第１５項のいずれかに記載の方法。１７．該両親媒性物質がＰＣからなりかつ該疎水性溶剤がトリグリセリドであるまたは該両親媒性物質がｌｙｓｏ−ＰＣからなり該疎水性溶剤がオレイン酸である、請求の範囲第５項から第７項のいずれかにまたは請求の範囲第１３項から第１６項のいずれかに記載の方法。１８．親水性物質／両親媒性物質のアレイが、親水性物質を親水性溶剤における両親媒性物質の分散液と混合し、親水性溶剤を除去することによって形成される、請求の範囲第５項から第７項のいずれかにまたは請求の範囲第１３項から第１６項のいずれかに記載の方法。１９．親水性溶剤が水である、請求の範囲第１８項に記載の方法。２０．両親媒性物質の集合体がミセル、単ラメラ小胞、例えば単ラメラ小胞、多重ラメラ小胞または渦巻形のシリンダー等の管状構造物、六角形相、立方形相またはミエリン型構造物からなる、請求の範囲第１８項または第１９項に記載の方法。２１．該親水性溶剤は凍結乾燥によって除去される、請求の範囲第１８項から第２０項のいずれかに記載の方法。２２．親水性物質／両親媒性物質のアレイが、共通の溶剤に親水性物質を一緒に可溶化し、さらに該共通の溶剤を除去することによって形成される、請求の範囲第５項から第７項のいずれかにまたは請求の範囲第１３項から第１７項のいずれかに記載の方法。２３．親水性物質／両親媒性物質のアレイが、疎水性溶剤における両親媒性物質の溶液を親水性溶剤における親水性物質の溶液で乳化して乳濁液を得、さらに該疎水性溶剤を除去することによって形成される、請求の範囲第５項から第７項のいずれかにまたは請求の範囲第１３項から第１７項のいずれかに記載の方法。２４．親水性物質に対する両親媒性物質の重量比が約１：１〜５０：１である、請求の範囲第２２項または第２３項に記載の方法。２５．該乳濁液が油中水型乳濁液である、請求の範囲第２３項に記載の方法。２６．該疎水性溶剤がジエチルエーテル等の低沸点の有機溶剤である、請求の範囲第２３項または第２４項に記載の方法。２７．請求の範囲第５項から第７項のいずれかにまたは請求の範囲第１３項から第２５項のいずれかに記載の方法によって得られる、疎水性溶剤における親水性物質の単相の疎水性調製物。２８．疎水性相が請求の範囲第４項または第２６項に記載の調製物からなる、親水性相及び疎水性相らなる２相組成物。２９．該疎水性相が連続した親水性相中に分散される、請求の範囲第２７項に記載の組成物。３０．乳濁液である、請求の範囲第２７項または第２８項に記載の組成物。３１．親水性物質の経口投与における請求の範囲第４項若しくは第１２項に記載の調製物、請求の範囲第２７項に記載の調製物、または請求の範囲第２８項から第３０項のいずれかに記載の組成物の使用。