JPH10510432A - ヒドロキシプロリンに富んだタンパク質、並びにそれらを含んでいる医薬製剤及び化粧的調製物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、以下の特徴、すなわち、ゲル浸透及び電気泳動により測定された、可変間隔１２，０００ないし３８，０００で平均分子量２０，０００ダルトン、高い水溶性、を有する、Ｔａｘｕｓ ｓｐｐ．、Ｇｉｎｇｋｏ ｂｉｌｏｂａ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕ ｌｅｎｔｕｍ、及びＤａｕｃｕｓ Ｃａｒｏｔａ細胞培養物から酸アルコール抽出により得ることができるヒドロキシプロリンに富んだ糖タンパク質に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒドロキシプロリンに富んだタンパク質、並びにそれらを含んでいる医薬製剤及 び化粧的調製物 本発明は、植物源から得ることのできるヒドロキシプロリンに富んだ糖タンパ ク質、並びにそれらの製薬的及び化粧的使用に関する。 より明確には、本発明は、以下の特徴、 - ゲル浸透及び電気泳動により測定された、可変間隔１２，０００ないし３８， ０００で平均分子量２０，０００ダルトン、 - 酸性水溶液における可溶性、 を有する、Ｔａｘｕｓ ｓｐｐ．、Ｇｉｎｇｋｏ ｂｉｌｏｂａ、Ｌｙｃｏｐｅ ｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ、及びＤａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ細胞培 養物から酸アルコール抽出により得ることができるヒドロキシプロリンに富んだ 糖タンパク質に関する。 コラーゲン及びプロテオグリカンのような動物起源のいくつかの糖タンパク質 は、それだけでまたは適当な調製物に含まれて局所的に用いられると、皮膚に対 して有益な作用を及ぼすことが知られている。 プロリン及びヒドロキシプロリンに富んだ糖タンパク質であるコラーゲンは、 特に、しわ、並びに乏しい皮膚の水和及び弾力性に関連した他の不快な傷の治療 において、それだけでまたは他のポリペプチド塩基と合わせて用いられる。しか しながら、動物起源のコラーゲンは、ウイルス及び毒素からの混入の危険のため に、その使用を制限する。植物起源の化合物はこれらの危険を伴わないけれども 、今までのところ、化粧品におけるこれらの使用は全く限定されており、例えば 、アロエのような植物の粗抽出物またはアボカドのような全体の細かく刻んだ植 物さえ含 む化粧的調製物が知られている。 増殖期における植物細胞から生産され、動物コラーゲンに類似した構造を有す る、エクステンシンと呼ばれる植物糖タンパク質が知られている。ＥＰ−Ａ−第 ０ ５３３ ４０７８号は、１００，０００ダルトン以上の平均分子量を有する エクステンシンの化粧的使用を開示している。しかしながら、食塩水溶液による 様々な起源の植物成分の抽出及びそれに続くトリクロロ酢酸のような強酸での精 製を含む、今までに記述されたエクステンシンの抽出のための方法は、可溶性、 安定性、再現性、及びそれらの化学的物理的特性の一貫性に関する問題のために 、化粧品のために適した生成物を得ることができない。 今回、選択した植物の細胞のインビトロ培養及び適当な培地中に増殖させたこ れらの細胞の酸アルコール溶液での抽出を含んでなる方法により、上記のエクス テンシンに構造的に類似するが、より低い分子量及び酸性水溶液におけるより高 い可溶性を有するヒドロキシプロリンに富んだ糖タンパク質を得ることが可能で あることが見いだされた。 本発明により得ることができる糖タンパク質は、コラーゲンより高い、水和し 、薄い皮膜を形成し、正常な状態に戻し、そして瘢痕化する特性を有する。従っ て、この発明の糖タンパク質は、乾燥肌、乾癬、魚鱗癬、ふけ症、角化症、しわ 、痙瘡、湿疹、炎症性皮膚病、皮膚の老化の治療、及び動物コラーゲンの使用が 提案されている全ての他の応用のための化粧的または皮膚科学的調製物において 用いられることができる。 本発明の糖タンパク質の水溶液は、不溶性生成物の形成を導く糖タンパク質の いかなる重合もなしに安定なままである。加えて、これらの溶液の粘性は特に高 くそして濃度によらず、０．１％の濃度のものは、意 外にも、１％コラーゲンまたは５％植物アルブミン溶液と同じ薄い皮膜形成及び 水和力を有する。 抽出される植物成分は、Ｔａｘｕｓ ｓｐｐ．、Ｇｉｎｇｋｏ ｂｉｌｏｂａ 、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ、及びＤａｕｃｕｓ ｃａ ｒｏｔａ 細胞のファーメンター培養物から得られる。種Ｔａｘｕｓ ｓｐｐ．、Ｇｉｎｇｋｏ ｂｉｌｏｂａ、及びＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎ ｔｕｍ からの細胞の使用は、特に好ましい。Ｄｏｂｂｓ及びＲｏｂｅｒｔｓ、Ｅ ｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ、第 ２版、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏ ｒｋ、１９８５年により記述されたように、細胞培養技術は、通例であり、そし て葉、樹皮、根、幹、または種子のような植物の様々な部分からのカルス培養物 から開始する懸濁培養を含む。 典型的には、上記のＤｏｂｂｓ及びＲｏｂｅｒｔｓによるマニュアルにおいて 記述されたように、滅菌及び場合によっては抗菌物質（ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉ ａｌｓ）の添加後、カルスの植物組織は、適当な液体培養培地の接種材料に用い られる。本発明のために特に適した培地は、ムラシゲ・スクーグ培地である。プ ロリン、還元剤、エチレン、またはエセフォンもしくはＬ−アミノシクロプロパ ンカルボン酸のようなエチレンを遊離できる化合物のような特別な添加物の添加 は、所望する糖タンパク質の生産性を増加するために適当であり得る。 オーキシンのようなナフチル酢酸、サイトカイニンのような６−（γ，γ−ジ メチルアミノ）−プリン、ビタミン、及び炭素源として３％サッカロースの使用 は好ましい。選択される成分により、ビタミンＣの添加 は、最終生成物を褐変から防ぐために適当であり得る。 発酵期間は、３から１２日まで変わることができ、好ましくは５及び６日の間 である。いったん発酵が完了されると、培養培地は遠心分離され、そして細胞集 団は、希釈した鉱酸、好ましくは塩酸または硫酸の存在下で、アルコール、好ま しくはエタノールにより抽出される。この方法は、本発明の糖タンパク質の安定 性を危うくし得るいくつかの酵素、特に、糖タンパク質の重合を促進し、結果と して不溶性生成物の形成を生じるポリフェノールオキシダーゼ及びチロシンオキ シダーゼを不活性化する。 鉱酸の存在下でのアルコール抽出は、塩基性糖タンパク質の完全な抽出を可能 にし、そしてこの目的のために極めて選択的であることが判明した。エタノール の他に、メタノールまたはイソプロパノールのような水に混合可能な他のアルコ ールが用いられることができる。得られた水アルコール（ｈｙｄｒｏａｌｃｏｈ ｏｌｉｃ）抽出物は中和され、次に濃縮され、そして変性したタンパク質が完全 に沈殿するまで７０ないし１００℃の温度、好ましくは約８０℃に加熱される。 次に、この懸濁液は濃縮により透明な液体にされ、そしてこの液体は、高及び低 分子量の物質を除くために分画限外濾過に供される。限外濾過は、繊維が中空で あるまたは代わりに螺旋状に巻かれていてもよい、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（商標） またはＲｏｍｉｃｏｎ（商標）のような、１０，０００ダルトンないし４０，０ ００ダルトンの分画を有するポリスルホン膜により行われる。得られた濾過生成 物は、塩及び低分子量の糖のような所望されない物質を除くために、電気透析さ れる。濾過及び透析後、得られた溶液は、それだけで化粧的または医薬調製物に 用いられることができ、あ るいはより少ない容量に濃縮され、次に凍結乾燥または霧化されることができる 。 Ｗａｔｅｒｓポンプ装置からなり、Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ Ｌｉｎｅａ ｒ Ｗａｔｅｒｓ（商標）カラム金属製品（ｂａｔｔｅｒｙ）３０ｃｍ ｘ ０． ５ｃｍ及びＷａｔｅｒｓ ＵＶ吸収検出器、モデル４８４を備えた高速液体クロ マトグラフィーを用いて、ゲル浸透により本発明の生成物の分析的特性化を行っ た。０．０６７Ｍリン酸一カリウム、０．１Ｍ ＮａＣｌ、及び６ ｘ １０^-4Ｍ ＮａＮ₃を含んでいる水溶液を溶離剤として用いた。分析する糖タンパク質サン プルを、同じ溶離剤溶液（３ｍｇ／１０ｍｌ）及び段階的な量の物質並びにチト クロムＣ（１２，４００ダルトン）及びデキストランブルー（２，０００，００ ０ダルトン）の間の分子量として選択された基準物質に溶解し、選択的にまたは 同時に、生成物またはそれらの中間体を１２．５％ポリアクリルアミドゲル及び ４％スタッキングゲル上の電気泳動により測定することができる。分析するサン プルを、１００ｍｇ及び３００ｍｇの間の量を投入しながら、ＳＤＳ及び０．１ ％メルカプトエタノールを含んでいるバッファーに溶解する。２０ｍＡの定電流 で４時間、泳動を行う。標準曲線を５個の標準重量（７ｋＤ、１４ｋＤ、２４ｋ Ｄ、５４ｋＤ、及び６６ｋＤ）で描く。２つの主要バンドに対して、この標準曲 線から２２．５ｋＤ及び２５ｋＤの重量を計算し、より弱いバンドに対して、３ １ｋＤ及び３４ｋＤの重量を計算する。ここに記述する方法は、比較できる分子 量及び比較できるアミノ酸組成を有する生成物の混合物を、異なる植物から開始 する様々な細胞外植体から得ることを可能にする。Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ 細胞から抽出された糖タンパク質のアミノ酸分析の 結果を例として以下に示す。 アミノ酸 ピーク面積％ Ａｓｐ ４．３９９ Ｇｌｕ ４．３２８ Ｈｙｐ １７．５０５ Ｓｅｒ ７．０６５ Ｇｌｙ ６．０５６ Ｈｙｓ １．７８２ Ａｒｇ ２．４７１ Ｔｈｒ ４．７３９ Ｐｒｏ １０．０３６ Ａｌａ ８．２ Ｔｙｒ ２．３８８ Ｖａｌ ６．１６２ Ｍｅｔ １．１５４ Ｉｌｅ ２．４７９ Ｌｅｕ ５．５２５ Ｐｈｅ １．８６２ Ｌｙｓ １４．２５４ 上のデータは、糖タンパク質混合物中に存在するアミノ酸の全量の割合をいう 。混合物中の糖は、アラビノース及びガラクトースである。糖に対するアミノ酸 の割合は、様々な生成物に対して平均して２：１である。 上記のように、本発明の生成物は、製薬学的及び化粧的分野の両方に おいて用いられることができる。製剤分野に対しては、生成物は、ゲルまたは軟 膏剤中に含まれることができ、あるいは熱傷または損傷の特別な治療のための薬 を含ませたガーゼに塗られることができる。この場合、生成物は、通常、滅菌ま たは滅菌濾過に供せられ、そして凍結乾燥される。 本発明の化粧的及び皮膚科学的調製物は、慣例的な方法により調製されること ができる。投与形態の例は、水性スプレー、ローション剤、溶剤、乳剤、ゲル、 軟膏剤、及びクリームを含む。 本発明の化粧的及び皮膚科学的調製物は、約０．０１％ないし約５０％、好ま しくは０．０５％から５％までの重量百分率のヒドロキシプロリンに富んだ糖タ ンパク質、並びに通例の添加物を含むことができる。本発明の糖タンパク質の高 い安定性を考えれば、５０％以上の可溶性のヒドロキシプロリンに富んだ糖タン パク質を含んでいる医薬製剤及び化粧的調製物が得られることができる。 本発明の糖タンパク質は、それだけでまたは長期間の水和作用を提供するため にマイクロカプセルの中に包まれて、製薬学的及び化粧的調製物に加えられるこ とができる。マイクロカプセルは、親水性または親油性のいずれかであることが できる。本発明の調製物は、所望する目的のための補足的なまたは有用な活性を 有する他の活性素を含むことができる。 本発明は、以下の実施例によりさらに例示される。 実施例１ 糖タンパク質の生産のためのＧｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａのカルス及び液体培養 の調製 Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａの若葉の外植体を、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ８０ （商標）溶液中でこれらの葉を洗浄することにより調製する。葉身を約０．５ｃ ｍの断片に切断し、７５％エタノールで１分間前滅菌する。次に、滅菌を、２％ 次亜塩素酸ナトリウム溶液及び滅菌水中での外植体の３回の洗浄で完了する。得 られた外植体を、リンスマイヤー・スクーグビタミン並びに２，４−ジクロロフ ェノキシ酢酸及びナフチル酢酸のようなホルモンを加えた、３％サッカロースを 含んでいるムラシゲ・スクーグ培地中、ペトリ皿に移す。生成物を暗所で２３℃ で２０日間インキュベートする。この期間の終わりに、容易に生育し、同じ条件 における継代培養により連続して移される砕けやすいカルスを得、液体培養にお ける増殖のためにこれらを用いることができる。これらのカルスを、ナフチル酢 酸及び６−（γ，γ−ジメチルアミノ）−プリン、リンスマイヤー・スクーグビ タミン、及び炭素源として３％サッカロースを加えた２００ｍｌのムラシゲ・ス クーグ培地を含んでいるエルレンマイヤーフラスコに接種するために用いる。こ れらのフラスコを撹拌しながら連続光中４日間インキュベートし、その後、細胞 生物体量を糖タンパク質の抽出のために得る。 実施例２ Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ細胞からの糖タンパク質の調製 実施例１により得られた５リットルの培養物を低速遠心分離し、得られた細胞 （１．５ｋｇの新鮮重量）を１％硫酸を含んでいる１．５ｌの７０％エタノール で抽出する。この抽出を２回繰り返し、それにより量的に塩基性糖タンパク質を 回収する。中和後、いかなる濁りも除去するために抽出物を濾過し、そしてエタ ノールを完全に除くまで真空下で５ ０℃で濃縮する。水性の濃縮物を８５℃で３０分間加熱し、沈殿物を除くために 再び遠心分離し、その沈殿物を捨てる。より高分子量のものを除くために、得ら れた透明な溶液を、４０，０００ダルトンの分画限界を有するＣｅｎｔｒｉｃｏ ｎ（商標）膜により限外濾過する。 次に、非糖タンパク質の低分子量の物質を除くために、１０，０００ダルトン の分画を有する中空繊維の膜を用いて、濾過した生成物を限外濾過する。次に、 濾過液を透析に供し、そして１％の固形残留物に濃縮する。１．５リットルのわ ずかに粘性のある生成物を得、これをそれだけで化粧的調整物に用いることがで きる。電気泳動分析で、生成物は６個のバンドを含み、これらのうち４個は、１ ６，０００、２２，０００、３３，０００、及び３６，０００ダルトンの分子量 を有した。 実施例３ Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍからの糖タンパク質の調製 実施例１の方法に従って、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ の滅菌した芽からの細胞集団を、ナフチル酢酸及び６−（γ，γ−ジメチルアミ ノ）−プリン、リンスマイヤー・スクーグビタミン、及び炭素源として３％サッ カロースを加えた１０リットルのムラシゲ・スクーグ培地を含んでいる１４リッ トルのファーメンター中に調製する。０．０５％濃度のイーストエキストラクト の存在下で約７０％濃度の溶存酸素と共に１５０ｒｐｍで撹拌しながら、発酵を ２３℃で５日間続ける。発酵の終わりに培地を集め、そして細胞を濃縮するため に０．２μｍのセラミック膜を通してミクロ（ｍｉｃｒｏ−）濾過する。このよ うにして得られた細胞ペーストに０．５％塩酸を含んでいるいくらかのイ ソプロパノールを加え、そしてこの抽出物に実施例２において記述した方法を用 いる。０．５％の乾燥残留物を有する、３．５リットルの溶液を得る。凍結乾燥 した溶液の分析は、１０％プロリン及び３１％ヒドロキシプロリンの量をそれぞ れ与えた。 実施例４ 化粧的調製物 １００ｇのＯ／Ｗ乳剤は、 実施例２または３の溶液 １０．０ｇ アセチル化ラノリンアルコールＰＥＧ−１０ ２．０ｇ セチル−ステアリルアルコール １．５ｇ パルミチン酸セチル ２．０ｇ ステアリン酸 ７．０ｇ オクタン酸オクチル ７．５ｇ リン酸セチルカリウム ０．５ｇ 防腐剤 適当量 香料 適当量 精製水 １００ｇまで適当量 を含む。 実施例５ 化粧的調製物 １００ｇのＯ／Ｗ乳剤は、 実施例２または３の溶液 １０．０ｇ セチルステアリルグルコシド ５．０ｇ ホホバ油 １０．０ｇ ミリスチン酸イソプロピル ８．０ｇ ジメチコーン ０．５ｇ 酸化防止剤 適当量 防腐剤 適当量 香料 適当量 精製水 １００ｇまで適当量 を含む。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９６年１２月１８日 【補正内容】 請求の範囲 １． ａ）Ｇｉｎｇｋｏ ｂｉｌｏｂａ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕ ｌｅｎｔｕｍ 細胞の３から１２日までの期間の液体培地中での培養、 ｂ）希釈した鉱酸の存在下での水に混合できるアルコールでの細胞集団の抽出、 ｃ）抽出物の中和、濃縮、並びに７０℃及び１００℃の間の温度での加熱、 ｄ）沈殿物を除く遠心分離、上清の分画限外濾過及び透析、 を含んでなる工程に従って、Ｇｉｎｇｋｏ ｂｉｌｏｂａ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉ ｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ、またはこれらの細胞培養物から酸−アルコール 抽出により得ることができ、ゲル浸透及び電気泳動により測定した場合、可変間 隔１２，０００ないし３８，０００ダルトンで平均分子量２０，０００ダルトン を有するヒドロキシプロリンに富んだ糖タンパク質（ＨＰＲＧｓ）。 ２． 水和し、薄い皮膜を形成し、正常な状態に戻し、そして瘢痕化する特性を 有する、請求の範囲１の糖タンパク質を有効成分として含んでいる化粧的及び製 薬学的調製物。 ３． 水性スプレー、ローション剤、溶剤、乳剤、ゲル、軟膏剤、クリーム、及 び薬を含ませたガーゼの形態における請求の範囲２に記載の調製物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＡ Ｃ０７Ｋ 14/415 Ｃ０７Ｋ 14/415 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，Ｂ Ｙ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 以下の特徴、 - ゲル浸透及び電気泳動により測定した場合、可変間隔１２，０００ないし３８ ，０００で平均分子量２０，０００ダルトン、 - 高い水溶性、 を有する、Ｔａｘｕｓ ｓｐｐ．、Ｇｉｎｇｋｏ ｂｉｌｏｂａ、Ｌｙｃｏｐｅ ｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ、及びＤａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ細胞培 養物から酸−アルコール抽出により得ることができるヒドロキシプロリンに富ん だ糖タンパク質。 ２． 工程が、 ａ）Ｔａｘｕｓ ｓｐｐ．、Ｇｉｎｇｋｏ ｂｉｌｏｂａ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉ ｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ、及びＤａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ細胞の３から １２日までの期間の液体培地中での培養、 ｂ）希釈した鉱酸の存在下での水に混合できるアルコールでの細胞集団の抽出、 ｃ）抽出物の中和、濃縮、並びに７０℃及び１００℃の間の温度での加熱、 ｄ）遠心分離、分画限外濾過、及び透析、 を含んでなる、請求の範囲１の糖タンパク質の調製方法。 ３． 水和し、薄い皮膜を形成し、正常な状態に戻し、そして瘢痕化する特性を 有する、請求の範囲１の糖タンパク質を有効成分として含んでいる化粧的及び製 薬学的調製物。 ４． 水性スプレー、ローション剤、溶剤、乳剤、ゲル、軟膏剤、クリーム、及 び薬物を含ませたガーゼの形態にある請求の範囲３に記載の調 製物。