JPH10510703A - 炎症アデノイドで発現する新規なケモカイン、その産生と使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、炎症アデノイド組織で発現する新規な発現ケモカイン（ＡＤＥＣ）を同定し、コードするアミノ酸配列及びヌクレオチドを提供する。本発明には、ＡＤＥＣをコードするヌクレオチド配列に対するアンチセンス分子、精製ＡＤＥＣを作るための発現ベクター、ＡＤＥＣに特異的に結合し得る抗体、ＡＤＥＣをコードするヌクレオチド配列の検出のためのハイブリダイゼーションプローブまたはオリゴヌクレオチド、ＡＤＥＣの発現のための生物工学的処理をなされた宿主細胞、ＡＤＥＣに特異的に結合し得る抗体またはＡＤＥＣをコードする核酸分子に基づく、炎症または疾病の診断テスト方法も含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】 炎症アデノイドで発現する新規なケモカイン、その産生と使用関連出願 本出願は、１９９４年２月４日に出願された“新規なヒトアデノイド細胞由来 ポリペプチド群、それらの産生と使用（Novel Human Adenoid Cell-Derived Pol ypeptides，Their Productin and Uses）”なる名称の米国特許出願第０８／１ ９４，３１７号の一部継続出願である。背景技術 単球、マクロファージ、好塩基球、及び好酸球を含む白血球は、Ｔ細胞及び／ またはＢ細胞により開始される病理的機構において重要な役目を果たす。特に、 マクロファージは、強力な酸化剤及び組織の破壊に役立つタンパク質分解酵素を 作り出し、かつ他の炎症性細胞を増やし活性化するサイトカイン類を分泌する。 白血球がその適切な目的地の方に進み、他の細胞と相互作用する過程での重要 な調節プロセスに関する研究は現在進行中である。血液から損傷組織または炎症 組織への白血球の移動を説明するモデルは、現在以下のようなものとされている 。第１ステップは、白血球が血管壁の内皮細胞をローリングし接着する。この動 きは、セレクチンとそのリガンドとの過渡的な相互作用により媒介されている。 第２ステップは、インテグリン及びそのリガンドにより媒介される、より安定的 な白血球−内皮細胞相互作用を促進する細胞の活性化である。このより強力でよ り安定な接着により、白血球の血管外遊出及び組織への移入という最終ステップ が促進される。 インタークリン（intercrine）なる名称でも知られている、ポリペプ チドサイトカインのケモカインファミリーは、異なる炎症状態における白血球動 員を説明するために必要不可欠の細胞特異性を有している。第１に、ケモカイン は内皮細胞上の特定の接着分子の発現を媒介する。第２に、ケモカインは、特定 の細胞タイプを活性化する化学誘因物質因子の勾配を作り出す。更に、ケモカイ ンは特定の細胞タイプの増殖を刺激し、特定のレセプタを保有する細胞の活性化 を調節する。これらの作用の何れもが、標的細胞に対する高い特異性を説明して いる。 このケモカインは小さなポリペプチドで、一般に約７０〜１００アミノ酸（ａ ａ）の長さで、８〜１１ｋＢの分子量を有し、１〜１００ｎＧ／ｍｌの濃度の範 囲で活性である。初めに、このケモカインは炎症組織から単離、精製され、その 対生物作用に関して特徴付けられた。最近では、ケモカインは分子クローニング 技術によって発見され、構造と共に機能分析により特徴づけられている。 各ケモカインは、主として成熟分子における初めの２つのシステイン残基のス ペーシングに基づき、４つのシステインモチーフを通して近縁関係を有している 。現在、各種ケモカインは２つのファミリー、即ちＣ−Ｘ−Ｃケモカイン（α） 及びＣ−Ｃケモカイン（β）の何れか一方に割り当てられている。例外は存在す るが、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインは、好中球及び繊維芽細胞を活性化し、Ｃ−Ｃケモ カインは単球／マクロファージ、好塩基球、好酸球、Ｔ細胞他を含むより多様な 標的細胞のグループに作用する。これらのケモカインの両ファミリーは多種多様 なタイプの細胞により合成され、その概要は“Ｔｈｏｍｓｏｎ Ａ．（１９９４ ）Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， ２ｄ Ｅｄ． Ａｃａｄｅ ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ．”に記載されている。ケモカインのこの２つのグ ループについては後に再び説明する。 原型の、最も広く研究されているＣ−Ｘ−Ｃケモカインは、血小板第 ４因子（ＰＦ４）である。この７０個のアミノ酸からなるタンパク質は、画定性 の４つのシステインを示し、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォー ミング成長因子β（ＰＧＦ−β）及びβトランボグロブリン（β−ＴＧ）と共に 、刺激された血小板の顆粒から放出される。このホモ四量体分子は、インターロ イキン−８（ＩＬ−８）と類似の構造を有しており、繊維芽細胞、好中球、及び 単球の体内移動を誘発し、またヘパリンと結合する。ＰＦ４は血栓症、炎症、及 び創傷治癒の間の関連についての生物学的モデルを提供する。 血小板の粒子に見いだされる他のケモカインには、β−ＴＧ、結合組織活性化 タンパク質ＩＩＩ（ＣＴＡＰ−ＩＩＩ）、及び好中球活性化ペプチド２（ＮＡＰ −２）がある。これらの３つのペプチドは、前駆体分子、血小板塩基性タンパク 質（platelet basic protein）（ＰＢＰ）の異なるプロセシングによって誘導さ れる。β−ＴＧは、８１個のアミノ酸からなる、塩基性の高いタンパク質であり 、繊維芽細胞の体内移動に作用するが、好中球または単球に対しては影響を及ぼ さない。ＣＴＡＰ−ＩＩＩは、８５個の塩基からなるが、アミノ酸４〜８５はβ −ＴＧと同一である。ＣＴＡＰ−ＩＩＩは、顆粒における主なタンパク質であり 、生成タンパク質としてのその役割は明らかにされていないことから、これは、 更にプロセシングされるまで不活性な第２の前駆体である可能性がある。ＮＡＰ −２は、好中球を誘引するが、単球は誘引しないものと考えられている。 非血小板Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインには、ＩＬ−８、γインターフェロン誘発性タ ンパク質（ＩＰ−１０）、メラニン細胞増殖刺激活性化（ＭＧＳＡまたはｇｒｏ ）タンパク質、上皮由来好中球誘因物質−７８（ＥＮＡ−７８）、顆粒球走化性 タンパク質−２（ＧＰＣ−２）、及びストロマ細胞由来１α因子、及び１β因子 （ＳＤＦ−１α及びＳＤＦ−１β） が含まれる。（ＮＡＰ−１とも称する）ＩＬ−８は、炎症誘発性サイトカイン、 ＩＬ−１及び３、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦや、内毒素、ミトゲン、微粒子、細菌及 びウィルスに反応して単球／マクロファージ、好中球、繊維芽細胞、内皮細胞、 ケラチノサイト及びＴ細胞により分泌される。ＩＬ−８は、好中球の接着及びケ ラチノサイトの増殖の双方のアップレギュレーションと、好塩基球によるヒスタ ミンの産生のダウンレギュレーションとを含む急性の炎症を促進する。 ＩＰ−１０は機能が未知である１０ｋＤタンパク質であって、そのｍＲＮＡは 、単球、繊維芽細胞、及び内皮細胞において発見された。単球、ケラチノサイト 、及び活性化Ｔ細胞は、ＩＰ−１０タンパク質を分泌するが、このタンパク質は 遅延型過敏症反応を起こした部位に局在していた。ＭＧＳＡ／ｇｒｏ ａのｃＤ ＮＡは、１５ｋＤのタンパク質を産生し、これは繊維芽細胞内に現われる。その 転写は成長関連的（growth related）であり、オートクリン成長因子として機能 する。異なる非対立遺伝子形態のｇｒｏ βとｇｒｏ ｇは、ｇｒｏ ａとそれ ぞれ９０％及び８６％が一致している。組換えｇｒｏ ａタンパク質は、好中球 を誘引し活性化する。ＥＮＡ−７８は、肺胞細胞の上清から生成された。ｇｒｏ γのように、これもｉｎ ｖｉｔｒｏで好中球を誘引し、活性化する。 ＧＣＰ−２は、６ｋＤのタンパク質であって、骨肉腫細胞の上清から単離され たものである。ＧＣＰ−２には様々なＮ末端切断型が存在し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ で好中球を誘引し、活性化すると共に、ｉｎ ｖｉｖｏで顆粒球の集積を引き起 こす。ＳＤＦ−１α及び−１βは、分泌性分子及びＩ型膜タンパク質をコードす るｃＤＮＡが新たに単離されたものである。 “Ｓｔｒｉｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ， ５７：７５２−７６２”（以 下Ｓｔｒｉｅｔｅｒ Ａ論文）、及び“Ｓｔｒｉｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１ ９９５） Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ ， ２７０：２７３４８−２７３５７”（以下Ｓｔｒｉｅｔｅｒ Ｂ論 文）には、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインファミリーのメンバーの第１システインアミノ 酸残基の前にあるＮＨ₂−末端ＥＬＲ（Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ）モチーフの存 在または不在に応じて、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインファミリーが不同性の血管新生作 用を示すことが論証されている。例えば、ＩＬ−８、ＥＬＲ Ｃ−Ｘ−Ｃケモカ インが、血管新生特性を示しており、一方ＰＦ４、非ＥＬＲが血管新生を抑制し ていたことが論証されている。血管新生は、血管を新たに形成することが特徴で あり、胚発生、創傷治癒、慢性の炎症、及び悪性の固形腫瘍の増殖において必要 不可欠の生物学的事象である。 ＳｔｒｉｅｔｅｒのＢ論文によれば、血管新生因子及び血管抑制因子の産生の 生物学的不均衡が、慢性関節リウマチ、強皮症、乾癬、及び腫瘍形成を含むいく つかの血管新生依存性疾患の病因となっていることが示唆されている。Ｓｔｒｉ ｅｔｅｒのＡ論文によれば、ＩＰ−１０及びＰＦ４のような非ＥＬＲ Ｃ−Ｘ− Ｃケモカインが、腫瘍由来血管新生活性の低下を通して、血管新生にマイナスの 影響を及ぼすことが示唆されている。 炎症を起こした、若しくは患部組織における異常の診断に対する現在の技術は 、主として臨床的な症状の観察、人体組織または体液のホルモン、ポリペプチド 、または様々な代謝物質の血清学的な分析に依存している。疾病または腫瘍形成 の早期には、患者は臨床的な症状を示さないことが多い。更に、血清学的分析で は必ずしも、重複した、または非常に近い範囲にある侵入性疾患と遺伝的症候群 との間の区別をつけること ができない。従って、発現ケモカインのような小さな分子を含む新たな診断技術 の開発は、早期の正確な診断を可能にし、分子病因論に関する理解を深め、効果 的な治療法の開発において使用するために重要である。 このケモカイン分子については、“Ｓｃｈａｌｌ ＴＪ （１９９４） Ｃｈ ｅｍｏｔａｃｔｉｃ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ： Ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ Ｔｅｒ ａｐｅｕｔｉｃ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ Ｂｕｓ ｉｎｅｓｓ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ， ＭＡ， ｐｐ １８０−２７０”及び“Ｐａｕｌ ＷＥ （１９９３） Ｆｕｎ ｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ３ｒｄ Ｅｄ． Ｒａｖｅｎ Ｐ ｒｅｓｓ， ＮＹＣ， ｐｐ ８２２−８２６”なる文献に記載されている。発明の開示 本発明は、炎症を発症しているアデノイドである炎症アデノイドに由来する新 規なヒトタンパク質をコードする独特のヌクレオチド配列を提供する。この新た な遺伝子は、アデノイドで発現されることからアデノイド発現型ケモカイン、ま たは符号でａｄｅｃ（インサイト社クローンＮｏ．２０２９３）と称するもので あり、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインファミリーに属し、符号ＡＤＥＣで表されるポリペ プチドをコードする。また本発明は、ａｄｅｃＤＮＡ、またはそのフラグメント 、またはオリゴマーによる、試料またはその抽出物のテスト過程を有する炎症状 態の診断テスト方法を含む。更に、本発明には、ＡＤＥＣをコードするヌクレオ チド配列に対するアンチセンス分子、ＡＤＥＣをコードする核酸を含むクローニ ングベクターまたは発現ベクター、ＡＤＥＣをコードする核酸を含む発現ベクタ ーで形質転換された宿主細胞または生物、精製ＡＤＥＣ、及び宿主細胞からの精 製ＡＤＥＣの産生及び回収方法も含まれる。図面の簡単な説明 第１図は、アデノイド発現型ケモカインのヌクレオチド配列（ａｄｅｃ；配列 番号：１）及び予測アミノ酸配列（ＡＤＥＣ；配列番号：２）を示した図である 。 第２図は、Ｃ−Ｘ−Ｃファミリーの他のヒトケモカインとＡＤＥＣとのアミノ 酸アラインメントを示した図である。ここに示したアラインメントは、ＤＮＡｓ ｔａｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ社（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）の多重配列アラインメン トプログラム（multisequence alignment program）を用いて作製されたもので ある。 第３図は、ヒトＣ−Ｘ−Ｃケモカインの近縁関係樹形図である。系統樹は、Ｐ ＡＭ２５０残基表とともにＣｌｕｓｔａｌ法を用いるＤＮＡＳＴＡＲ ｓｏｆｔ ｗａｒｅ系統樹プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｉｎｃ． Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）により作製された。 第４図は、予測アミノ酸配列及び組成に基づくＡＤＥＣの免疫学的特性及び疎 水性の分析結果を示した図である。発明の実施の形態 用語の定義 本明細書において、“アデノイド発現型ケモカイン”またはＡＤＥＣなる用語 は、配列番号：１の核酸から転写されたｍＲＮＡによりコードされる配列番号： ２に示すポリペプチド、若しくはそのフラグメントを意味する。ＡＤＥＣは、自 然発生したものか、化学的に合成されたものであるかの何れかである。本明細書 において、“ａｄｅｃ”は、核酸配列を表し、“ＡＤＥＣ”は、タンパク質、ペ プチドまたはアミノ酸配列を表す。 本明細書において、“活性”なる用語は、自然発生ＡＤＥＣの生物学的及び／ または免疫学的活性を保持しているＡＤＥＣの形態を意味する。 本明細書において、“自然発生ＡＤＥＣ”なる用語は、生物工学的処 理を受けていないヒト細胞により生成されたＡＤＥＣを意味し、より具体的には 、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（lipidation ）及びアシル化を含む翻訳語修飾されたポリペプチドから生成される様々なＡＤ ＥＣの形態を表現する用語である。 本明細書において、“誘導体”なる用語は、ユビキチン化、ラベリング（例え ば放射性核種や、様々な酵素修飾による標識付け）、ペジレーション（ポリエチ レングリコールによる誘導体化）のような化学的修飾、若しくは例えばオルニチ ンのような通常はヒトタンパク質において自然発生しないアミノ酸の化学合成に よる挿入、置換によって得られた自然発生ＡＤＥＣに由来するポリペプチドを意 味する。 本明細書において、“変異体”または“突然変異体”または“組換え変異体” なる用語は、組換えＤＮＡ技術を用いて生成されるアミノ酸の挿入、除去、及び ／または置換により自然発生ＡＤＥＣとは異なるものとなった任意のポリペプチ ドを意味する。興味の対象となる活性、細胞接着性、走化性を損なわずに置換、 付加、あるいは除去され得るアミノ酸残基を決定するためには、特定のＡＤＥＣ の配列と相同体のサイトカインの配列とを比較し、相同性の高い領域でのアミノ 酸配列の変化の数を最小にすればよい。 アミノ酸の置換では、例えばロイシンからイソロイシンまたはバリンへの置換 、アスピレートからグルタメートへの置換、スレオニンからセリンへの置換、即 ち保存的アミノ酸置換のような１個のアミノ酸が構造的及び／または化学的特性 がそれに類似した他の１個のアミノ酸で置換されるのが好ましい。アミノ酸の挿 入または除去は、通常１〜５個のアミノ酸の範囲で行われる。組換えＤＮＡ技術 を用いてＡＤＥＣのアミノ酸の挿入、除去、または置換を体系的に行い、得られ た組換え変異体の活性を検定することにより、許容される変異体が実験的に決定 され得る。 必要ならば、ＡＤＥＣまたはＡＤＥＣ変異体に生物工学的処理を施して、“シ グナル配列またはリーダー配列”を含むようにすることができる。これにより、 細胞膜を通してポリペプチドを移動させることが可能となる。このような配列は 、本発明のポリペプチド上に自然に存在するか、あるいは組換えＤＮＡ技術によ り異種タンパク質源から得られる。 本明細書において、ＡＤＥＣ“フラグメント（断片）”、“部分”、または“ セグメント”なる用語は、生物学的及び／または免疫学的活性を示すに十分な長 さを有するアミノ酸の伸展（ストレッチ）を意味する。好適実施例では、このＡ ＤＥＣ断片は少なくとも約５個のアミノ酸、少なくとも約７個のアミノ酸、また は少なくとも約８〜１３個のアミノ酸を含み、別の実施例では約１７個またはそ れ以上のアミノ酸を含む。 本明細書において、“オリゴヌクレオチド”またはポリヌクレオチド“フラグ メント”、“部分”、または“セグメント”なる用語は、同一の、若しくは近縁 関係にある核酸を同定、若しくは増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ ）法や、当業者には周知の様々なハイブリッド形成法におけるプライマーとして 使用するのに十分な長さを有するＡＤＥＣをコードする核酸の任意のストレッチ を意味する。 本発明には、ＡＤＥＣをコードする組換え核酸分子で形質転換された宿主細胞 、ベクター、及び天然または組換えポリペプチド源から得られた精製ＡＤＥＣポ リペプチドが含まれる。ＡＤＥＣポリペプチドを単離するための様々な方法は、 当業者の周知となっている。例えばこのようなポリペプチドの精製のために、本 発明の提供する抗体を用いたイムノアフィニティクロマトグラフィーを利用する ことができる。タンパク質精製のための他の周知の方法は、例えば、“Ｄｅｕｔ ｓｃｈｅｒ Ｍ （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ １８２， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ” 及び“Ｓｃｏｐｅｓ Ｒ （１９８２） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔ ｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ． Ｓｐｒｉｎｇ ｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， ＮＹＣ”に記載されており、これらの文献を本明細書と 共に参照されたい。 本明細書において、“組換え”なる用語は、組換えＤＮＡ技術を用いて調製さ れるＡＤＥＣをコードするポリヌクレオチドを意味する。ＡＤＥＣをコードする ＤＮＡも対立形質の変異体または組換え変異体、及びその突然変異体を含み得る 。 本明細書において、“プローブ”または“核酸プローブ”または“オリゴヌク レオチドプローブ”なる用語は、所望の標的配列とハイブリッド形成し得るＡＤ ＥＣの部分、フラグメント、またはセグメントを意味する。分子生物学における 従来の技術を用いることにより、ＡＤＥＣをコードするｃＤＮＡまたは内生核酸 を検出し、増幅し、または定量するのにこのプローブが使用され得る。プローブ の長さは様々であり、好ましくは、約１０から最大約数１００ヌクレオチドの長 さを有するものである。当業者には理解されようが、ハイブリッド形成条件及び プローブの設計は、使用目的に応じて変化する。例えば、ＰＣＲでの使用を目的 としたプローブは、長さが１５〜３０ヌクレオチドであり、変性プローブのプー ルの一部分であり得る。即ちＰＣＲ用プローブは、ヌクレオチドのミスマッチに 対する許容性を有するが、未知の配列に対する結合に適用するオリゴヌクレオチ ドである得るのに対して、サザンハイブリダイゼーションまたはノーザンハイブ リダイゼーション用のプローブは、長さが数１００ヌクレオチドの、１つの特定 のヌクレオチド配列である得る。従って、ＡＤＥＣに対する特異的検出用のプロ ーブで好適なものは、配列番号：１の配列の非保存ヌクレオチド領域から得られ るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドフラグメントであり得る。本明細 書において、“非保存的ヌクレオチド領域”なる用語は、配列番号：１に独特に 存在し、かつＣ−Ｘ−Ｃケモカインのファミリーにおける保存される領域を含ま ないヌクレオチド領域を意味する。プローブは一本鎖または二本鎖で、ｉｎ ｓ ｉｔｕハイブリッド形成及びＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫検定法）のような技術を 含む膜ベースのハイブリダイゼーション、溶液、細胞、組織またはにおいて特異 性を有し得る。本発明の範囲には、ここに開示するポリペプチドのオリゴヌクレ オチド、フラグメント、または部分、若しくはその相補的な鎖であって、プロー ブとして用いられるものが含まれる。 “オリゴヌクレオチド”または“オリゴヌクレオチドプローブ”は、ＡＤＥＣ をコードするここに開示するヌクレオチド配列に基づいて調製される。オリゴヌ クレオチドは、ここに開示するヌクレオチド配列の部分を含み、少なくとも約１ ５個のヌクレオチドからなるが、通常は約２０ヌクレオチド、最大約６０個のヌ クレオチドからなる。核酸プローブは、約６ｋｂより少ない塩基対数の、通常は 約１ｋｂ未満の配列の部分からなり得る。本発明のオリゴヌクレオチド及び核酸 プローブは、細胞または組織内にＡＤＥＣをコードする核酸が存在するか否かを 判定するため、または“Ｗａｌｓｈ ＰＳ ｅｔ ａｌ（１９９２）ＰＣＲ Ｍ ｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ． １：２４１−２５０”に記載のように染色体ＤＮＡ から類似した核酸配列を分離するのに使用され得る。 本発明の核酸プローブは、自然発生核酸、組換え一本鎖または二本鎖核酸から 誘導されるか、若しくは化学的に合成され得る。プローブの標識化は、ニックト ランスレーション法、クレノウフィルイン反応法、ＰＣＲ法、または当分野にお いて周知の他の方法を用いて行われ得る。本発明のプローブを調製し、標識する 方法は、“Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｄ Ｅｄ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ”または“Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ （１９８９） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ ２， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ”に 詳しく述べられており、これらの文献を本明細書と共に参照されたい。 別の形態として、本発明のポリペプチド、またはそれと近縁関係にあるポリペ プチドをコードする組換え変異体は、当業者に周知の技術を用いて、遺伝暗号の “冗長性”を利用することにより合成、または同定され得る。様々な切断部位を 作り出すサイレント変化のような、様々なコドン置換を導入することで、プラス ミドやウィルスベクターへのクローニング、または特定の原核細胞形または真核 細胞形における発現を最適化することができる。また、突然変異を導入すること によって、ポリペプチドの特性を変更し、リガンド結合親和力、鎖間親和力、ま たはポリペプチド変性またはターンオーバー速度を変えることもできる。発明の詳細な説明 本発明は、新規なＣ−Ｘ−ＣケモカインファミリーＡＤＥＣを同定する独特な ヌクレオチド配列を提供する。ＡＤＥＣをコードするヌクレオチド配列は、炎症 性アデノイド組織から作られたｃＤＮＡライブラリ、胎児の脾臓組織から作られ たｃＤＮＡライブラリ、及び股関節のリウマチ様滑膜から作られたｃＤＮＡライ ブラリにおいて同定された。ＡＤＥＣをコードするヌクレオチド配列は、３時間 培養された接着性単球培地、及びＴ細胞培地においても同定された。ＡＤＥＣを コードするヌクレオチド配列は、７２時間培養された接着性単球培地または酢酸 ミリスチル酸ホルボール（ＰＭＡ）で処理されたＴ細胞においても見いだされた 。 ＡＤＥＣが同定された組織において、その発現の検出のための診断テ ストを行うことは有用である。タンパク質分解酵素及び組織の損傷または破壊を もたらし得る他の分子の産生に応じて好中球及び繊維芽細胞は活性化する。従っ て、ＡＤＥＣの過剰な発現に対する診断テストを行うことにより、診断が速やか になり、過剰な組織の損傷や破壊が起こる前に炎症の適切な治療を行うことがで きる。 最近の研究成果は、走化性サイトカインのＣ−Ｘ−Ｃケモカインファミリーは 炎症性の活性を有していると共に、血管新生の媒介における不同性の効果を、そ の機能として示すか、またはＥＬＲドメインの存在または不存在（上述のＳｔｒ ｉｅｔｅｒ Ａ論文及びＢ論文参照）を示すことを示唆している。非ＥＬＲ Ｃ −Ｘ−Ｃケモカインは血管新生の抑制効果を示してきた。従って、ＡＤＥＣまた はそのフラグメントを用いて、血管新生依存性疾患、例えば腫瘍形成、慢性関節 リウマチ、強皮症、及び乾癬を予防しまたは治療することが可能である。 ＡＤＥＣまたはその相補配列をコードするヌクレオチド配列は、分子生物学の 分野における当業者には周知の技術において数多くの用途を有する。これらの技 術には、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用、ＰＣＲ用オリゴマーと しての使用、染色体及び遺伝子マッピングにおける使用、ＡＤＥＣの組換え体産 生における使用、及びアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡの、またはこれらの化学 的類似体等の産生における使用が含まれる。ここに開示するＡＤＥＣをコードす るヌクレオチドの使用方法は、周知の技術の一例であり、当業者に周知の何らか の技術にその使用を限定しようとするものではない。更に、未だ開発されていな い分子生物学的技術であっても、それが例えばトリプレット遺伝暗号及び特異的 な塩基対相互作用のような既知のポリヌクレオチド配列の特性に基づく技術であ る限り、ここに開示するヌクレオチド配列を使用することができる。 遺伝暗号の同義性（degeneracy）の結果、そのヌクレオチド配列がＡＤＥＣを コードするもので限り、既知のヌクレオチド配列及び自然発生遺伝子のヌクレオ チド配列に対する相同性を有する最小限のヌクレオチド配列を有するヌクレオチ ド配列を含む、様々なＡＤＥＣをコードするヌクレオチド配列が産生され得る、 ということは当業者には理解されよう。本発明は、より具体的には可能なコドン 選択に基づいて組合せを選択することにより作られ得る全ての可能なヌクレオチ ド配列をその範囲に含んでいる。これらの組合せは、自然発生ＡＤＥＣのヌクレ オチド配列に対して適用されるような標準的なトリプレット遺伝暗号に基づいて 作られる。また、このような全ての変異体は、具体的にここで開示されたものと 考えられたい。 ＡＤＥＣ及び／またはＡＤＥＣ変異体をコードするヌクレオチド配列は、厳格 な条件の下で自然発生ＡＤＥＣ遺伝子のヌクレオチド配列とハイブリッド形成可 能なものであるのが好ましいが、実質的に異なるコドン使用頻度をプロセシング するＡＤＥＣまたはＡＤＥＣ誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り出すこ とは有益であり得る。コドンの選択は、特定の原核細胞または真核細胞の発現宿 主におけるペプチドの発現速度を高めるように選択することができ、このときこ の発現速度は、その宿主における特定のコドンの使用頻度に基づいて決まる。本 発明のＡＤＥＣ及び／またはＡＤＥＣ誘導体をコードするヌクレオチド配列を、 このコードされたアミノ酸配列を変えることなく実質的に変化させる他の理由は 、より望ましい特性、例えば自然発生ヌクレオチド配列から産生されたものより 長い半減期を有するＲＮＡ転写物を産生するためである。 ＡＤＥＣをコードするヌクレオチド配列は、完全に確立された組換えＤＮＡ技 術（“Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ ａｌ， ２ｄ Ｅｄ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ”参照 ）により様々な他のヌクレオチド配列と結合してもよい。 ａｄｅｃに結合するのに有用なヌクレオチド配列には、例えば従来より周知の プラスミド、コスミド、λファージ誘導体、ファージミド等のクローニングベク ターの組合せが含まれる。興味の対象であるベクターには、発現ベクター、複製 ベクター、プローブ産生ベクターシータエンシングベクター等が含まれる。一般 に、興味の対象となるベクターは、少なくとも１つの生物において複製起点機能 を発揮する便利な制限エンドヌクレアーゼ検知サイト、及び宿主細胞用として選 択可能なマーカーを含み得る。 本発明の別の実施例では、ＡＤＥＣをコードする自然発生ヌクレオチド配列と ハイブリッド形成可能なａｄｅｃ特異的核酸ハイブリダイゼーションプローブが 提供される。ＡＤＥＣをコードする配列の検知のためのこのようなプローブは、 配列番号：１の非保存領域から得られるヌクレオチドフラグメントを含むのが好 ましい。近縁関係にあるケモカインをコードする配列の検出のためのこのような プローブは、Ｃ−Ｘ−ＣまたはＣ−Ｃをコードする配列のヌクレオチドの少なく とも５０％を含むのが好ましい。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、 配列番号：１のヌクレオチド配列、または自然発生ａｄｅｃのプロモータ、エン ハンサー要素、及びイントロンを含むゲノムの配列に由来するものであり得る。 ハイブリダイゼーションプローブは、様々なリポーターグループにより標識され 得るが、このリポーターグループには、³²Ｐまたは³⁵Ｓのような放射性核種、若 しくはアルカリホスファターゼのような酵素標識が含まれ、これらはアビジン／ ビオチン結合系を介してプローブに 結合する。この他当業者に周知の技術を用いてプローブを標識することができる 。 米国特許第４，９６５，１８８号、第４，６８３，１９５号、及び第４，８０ ０，１９５号明細書に記載されているようなＰＣＲ法の実施において、ＡＤＥＣ をコードするヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチドの別の使用方法があ る。このようなＰＣＲにおいて使用されるプローブは、組換えにより得られたも のであるか、化学的に合成されたものであるか、若しくは両者の混合であり得、 また、診断的な使用に供される分散したヌクレオチドまたは近縁関係にあるゲノ ム配列の同定に用いられる可能な変性配列のプールを含み得る。 ａｄｅｃ特異的ハイブリダイゼーションプローブを産生するための他の方法に は、ｍＲＮＡプローブの産生のためのベクターへの、ＡＤＥＣ及びＡＤＥＣ誘導 体をコードする核酸配列のクローニングが含まれる。このようなベクターは従来 より周知であり、または市販されており、例えばＴ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリ メラーゼのような適当なＲＮＡポリメラーゼ及び適当な放射性の標識をなされた ヌクレオチドを添加することによりｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成す るのに使用することができる。 現在完全に化学合成によりＡＤＥＣ及びＡＤＥＣ誘導体をコードするＤＮＡ配 列、またはその部分を産生することが可能であり、その後、従来より周知の試薬 、ベクター、及び細胞を用いて様々な市販のＤＮＡベクターに挿入することがで きる。化学合成を用いて、ａｄｅｃポリヌクレオチド配列若しくはその部分に突 然変異を起こさせることも可能である。 ＤＮＡ配列決定の方法は、従来より周知である。従来の酵素を用いる方法では 、ＤＮＡポリメラーゼクレノウフラグメント、ＳＥＱＵＥＮＡ ＳＥ（登録商標） （ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ． Ｃｌｅｖｅ ｌａｎｄ， ＯＨ）またはＴａｑポリメラーセを用いて、興味の対象のＤＮＡ鋳 型にアニーリングされたオリゴヌクレオチドプライマーからＤＮＡ鎖を延長する 。この方法は、一本鎖及び二本鎖の双方の鋳型を用いるのに開発されたものであ る。チェーンターミネーション反応の生成物は、通常ユリアアクリルアミドゲル 上で電気泳動処理され、オートラジオグラフィ（放射性核種で標識された前駆体 の検出）、または蛍光体（蛍光体で標識化された前駆体の検出）の何れかにより 検出される。機械を用いた反応調製、蛍光体検出を利用した分析及び配列決定の 技術の近年の進歩により、１日当たりに決定され得る配列数は増加した（ここで は、例えばＣａｔａｌｙｓｔ ８００及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ３７３ＤＮＡシーケンサのような機械を用いる）。 このヌクレオチド配列を用いて、ＡＤＥＣの発現レベルの異常に関連する炎症 及び疾病の検出のためのアッセイを構築することができる。このヌクレオチド配 列は、従来より周知の方法で標識した上で、ハイブリッド形成条件の下で患者の 体液または組織の試料に添加することができる。インキュベーション時間の経過 後、ヌクレオチドが酵素で標識されていた場合には、所望に応じて染料（または 他の展開剤を必要とする標識）を含有する適合性の液体で試料が洗浄される。こ の適合性の液体を洗い流した後、染料を定量し、標準値と比較する。染料の量が 著しく多い場合には、このヌクレオチド配列は試料とハイブリッド形成したこと になる。ａｄｅｃが異常なレベルで存在している場合には、このアッセイにより 炎症及び／または疾病の存在が確認されたことになる。 ａｄｅｃのヌクレオチド配列を用いて、その遺伝子のマッピングのためのハイ ブリダイゼーションプローブを構築することができる。ここに開示するヌクレオ チド配列の染色体及び染色体の特定の領域へのマッピ ングを、周知の遺伝子及び／または染色体マッピング技術を用いて行うこともで きる。このような技術には、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、既知の染 色体マーカーに対するリンケージ分析、既知の染色体に対して特異的なライブラ リまたはフローソートされた染色体調合物を用いたハイブリダイゼーションスク リーニング等が含まれる。染色体延展（chromosome spread）の蛍光ｉｎ ｓｉ ｔｕハイブリダイゼーション技術については、他の文献、即ち“Ｖｅｒｍａ ｅ ｔ ａｌ （１９８８） Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ： Ａ Ｍａｎ ｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒ ｅｓｓ， ＮＹＣ”に記載されている。 染色体調合物の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び他の物理的染 色体マッピング技術は、追加的な遺伝子地図データと関連付けられ得る。遺伝子 地図データの例としては、“Ｏ’Ｂｒｉｅｎ （１９９０） Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｐｓ： Ｌｏｃｕｓ Ｍａｐｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ， Ｂｏｏｋ ５； Ｈｕｍａｎ Ｍａｐｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＮＹ”がある。物理的染色体地図上でのａｄ ｅｃをコードする遺伝子の位置と特定の疾病（若しくは特定の疾病に対する素因 ）との間の相関関係は、この遺伝病に関連するＤＮＡの領域の範囲を特定するた めの助けとなる。本発明のヌクレオチド配列を用いて、健常者の遺伝子配列と、 キャリアまたは遺伝病の保因者の遺伝子配列との相違を検出することができる。 ＡＤＥＣをコードするヌクレオチド配列を用いて、周知の組換えＤＮＡ技術を 利用して精製ＡＤＥＣを作り出すことができる。遺伝子を単離した後、その遺伝 子を発現させる方法を記載した文献は数多くあるが、その例としては、“Ｇｏｅ ｄｄｅｌ （１９９０） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐ ｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙ ｍｏｌｏｇｙ． Ｖｏｌ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ”がある。ＡＤＥＣは、原核細胞または真核細胞の何れかの様々な 宿主細胞内において発現され得る。宿主細胞は、ａｄｅｃヌクレオチド配列が内 生である種と同一の種、あるいは異なる種の何れからでも得ることができる。組 換えＤＮＡ技術によってＡＤＥＣを産生することの利点には、精製用として高濃 度に濃縮されたタンパク質源が得られること、及び精製のための簡単な手順が利 用できるようになることがある。 ＡＤＥＣは、タンパク質精製を容易にするべく添加された１または２以上の追 加のポリペプチドを有するキメラタンパク質として発現され得る。このような精 製促進ドメイン（分子内領域）には、固定化金属上での精製を可能にするヒスチ ジン−トリプトファンモジュールのような金属キレート化ペプチド固定化免疫グ ロブリン上での精製を可能にするタンパク質Ａドメイン、及びＦＬＡＧＳ伸展／ アフィニティ精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ， Ｓｅａｔｔｌｅ， ＷＡ）において利用されるドメイン等があるが、これらに限定されるものではな い。切断可能なリンカー配列（例えばＸＡ因子またはエンテロキナーゼ）が精製 ドメインと、ＡＤＥＣをコードする配列との間に含まれていると、ＡＤＥＣの精 製を促進するのに役立つことがある。 ＡＤＥＣをコードするＤＮＡによって形質転換された細胞は、ＡＤＥＣの発現 及び細胞培地からのタンパク質の回収に適切な条件の下で培養され得る。組換え 細胞により産生されたＡＤＥＣは、使用される特定の遺伝子構造に応じて、分泌 されるか、あるいは細胞内に保持され得る。一般に、組換えタンパク質は、分泌 される形態で準備しておくのがより便利である。精製のステップは、使用される 産生プロセスの性質及び産 生される特定のＡＤＥＣの性質に基づいて決まる。 本発明のＡＤＥＣ ｃＤＮＡのタンパク質への翻訳は、ｃＤＮＡを適当な発現 ベクターにサブクローニングし、このベクターを適切な発現宿主に感染させるこ とによりなされ得る。実施例７に記載されているように、ＡＤＥＣの発現及び精 製のための好適な発現ベクターは、ＡＤＥＣを含む融合タンパク質の発現用とし て使用でき、かつ６個のヒスチジン残基、次いでチオレドキシン及びエンテロキ ナーゼ切断サイトをコードする核酸を含むものである。ヒスチジン残基は、ＩＭ ＩＡＣ（固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー“Ｐｏｒａｔｈ ｅ ｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ３：２６３：２８１”に記載）上での精製を促進し 、一方エンテロキナーゼ切断サイトは、融合タンパク質からのケモカインの精製 のための手段となる。 ここに開示するｃＤＮＡライブラリの産生に用いられる発現ベクターは、クロ ーニングサイトの上流にあるβ−ガラクシトシダーゼに対するプロモータ、それ に続くアミノ末端Ｍｅｔで、それに続くβ−ガラタシトシダーゼの７つの残基、 それに続く人工的プライミング及び転写のために有用なバクテリオファージプロ モータ及び多数の独特の制限サイト（Ｅｃｏ ＲＩを含む）を含むヌクレオチド 配列を有し、またこの発現ベクターは本発明のケモカインの発現のためにも用い ることができる。ＩＰＴＧを有する単離された菌株を、標準的な方法で導入する ことにより、β−ガラクシトシダーゼの７つの残基に始まり、リンカーの約１５ 個の残基、及びｃＤＮＡ内部でコードされたＡＤＥＣに対応する融合タンパク質 が産生される。ｃＤＮＡクローン挿入断片は、必ずランダムプロセスにより産生 されることから、含まれたｃＤＮＡが適切な翻訳のための正しい読み枠に存在す る可能性は３つに１つである。ｃＤＮＡが適 切な読み枠に存在しない場合には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異を含む周知の方法 による適切な数の塩基の除去または挿入や、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたは大 豆ヌクレアーゼを用いた消化、若しくはオリゴヌクレオチドリンカーの混入によ り、正しい読み枠に存在するものを得ることができる。上述のように、ＡＤＥＣ は細菌系において発現される。 ＡＤＥＣをコードする本発明のヌクレオチド配列は、特定の宿主におけるタン パク質源の発現のために有用であることが知られているベクターに移入され得る 。クローニングサイトと共に、目標ｃＤＮＡ（２５塩基）の両端における伸展部 分とハイブリッドを形成するのに十分なＤＮＡのセグメントを含むオリゴヌクレ オチドアンプリマーは、標準的な方法で化学的に合成され得る。次いで、これら のプライマーを用いて、ＰＣＲ法により所望の遺伝子セグメントを増幅すること ができる。得られた新たな遺伝子セグンメントは、標準的な条件の下で適当な制 限酵素で切断し、ゲル電気泳動法により単離することができる。別の形態として 、適当な制限酵素を用いてヌクレオチド配列を切断し、欠失した遺伝子セグメン トに化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを埋め込むことにより、類似の遺伝 子セグメントを産生することができる。更に、複数の遺伝子から得られた配列を コードするセグメントを相互に結合し、適当なベクターにクローニングして、組 換え配列の発現を最適化することができる。 このようなキメラ分子用の適切な発現宿主には、チャイニーズハムスターの卵 巣及びヒト２９３細胞のような哺乳類の細胞、Ｓｆ９細胞のような昆虫の細胞、 サッカロミセスセルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のような酵母菌細胞、 及びＥ．ｃｏｌｉのような細菌が含まれるが、これらに限定されるものではない 。このような細胞系のそれぞれに対して有用な各発現ベクターも、細菌内での増 殖を可能にする複製起点、及 びβ−ラクタマーゼ抗抗生物質遺伝子のような細菌内での選択を可能にする選択 可能なマーカーを含み得る。更に、このベクターは、感染された真核宿主細胞群 における選択を可能にする、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のよ うな第２の選択可能なマーカーを有し得る。真核細胞の発現宿主において使用す るためのベクターは、３′ポリアデニル化配列のようなＲＮＡプロセシング要素 を、それが興味の対象であるｃＤＮＡに含まれていない場合には必要とすること がある。 更に、このベクターは遺伝子発現を増加させるプロモータまたはエンハンサー を含み得る。このようなプロモータは宿主特異的であって、ＭＭＴＶ、ＳＶ４０ 、またはＣＨＯ細胞用のメタロチオネインプロモータや、細菌宿主用のｔｒｐ、 ｌａｃ、ｔａｃ、またはＴ７プロモータや、酵母菌用のα因子、アルコール酸化 酵素、またはＰＧＨプロモータが含まれる。ＲＳＶエンハンサーのような転写エ ンハンサーは、哺乳類の宿主細胞において使用され得る。ひとたび標準的な培養 法により均一な組換え細胞の培養物が得られると、組換えにより産生されたＡＤ ＥＣが大量に条件培地から得られ、当技術分野において周知のクロマトグラフィ ー法により分析できることになる。 組換え体の産生に加えて、固相技術を用いた直接のペプチド合成によりＡＤＥ Ｃフラグメントを産生することもできる。（“Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ （ １９６９） Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ． Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ； Ｍｅｒｒｉ ｆｉｅｌｄ Ｒ （１９６３） Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ８５：２１４９ −２１５４”参照）。ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成は、手作業、あるいは機 械により自動的に行うことができる。自動的な合成は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ （Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を製造業者の指示に従っ て用いることにより行うことができる。ＡＤＥＣの様々なフラグメントを個別に 化学合成し、化学的な方法により結合することによってＡＤＥＣの全体を産生す ることもできる。 抗体の誘発において使用するためのＡＤＥＣは、免疫活性を有していなければ ならない。ＡＤＥＣ特異的抗体の誘発において使用するためのペプチドは、その ペプチドが、自然発生ＡＤＥＣの一部分の三次元的構造を保持しているような少 なくとも５個、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を 含み、自然発生ＡＤＥＣの全アミノ酸配列を含んでいてもよい。ＡＤＥＣのアミ ノ酸配列の短いストレッチは、ヒザラガイヘモシアニン（ＫＬＨ）や抗体産生に 使用されるキメラ分子のような他のタンパク質のストレッチと融合され得る。 本発明のＡＤＥＣに対するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を調製 するための方法は、様々なものが当業者の知るところであろう。その方法の１つ は、逆相ＨＰＬＣ分離から変性ＡＤＥＣを得て、これを用いて当業者に周知の技 術でマウスまたはウサギを免疫化する方法である。マウスの免疫化には変性ＡＤ ＥＣ約１００μｇで十分であり、ウサギの免疫化には最大１ｍｇを用いることが できる。マウスハイブリドーマを同定するために、変性タンパク質を放射性要素 で標識し、これを用いて潜在性ネズミＢ細胞ハイブリドーマをスクリーニングし て、抗体を産生するものを分離することができる。この方法では、必要なタンパ ク質の量はわずかであり、数１０００のクローンを標識しスクリーニングするた めには２０ｍｇで十分である。 別の方法では、ＡＤＥＣのアミノ酸配列はｃＤＮＡ配列から推論されるように 、その分析により免疫抗原性の高い領域が決定される。これらの領域を含むポリ ペプチドを合成し、適切な免疫化プロトコルで使用し て抗体を産生する。適切なエピトープを選択するための分析方法は、“Ａｕｓｕ ｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ （１９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ ２． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）”に記載されている。免疫化のための最適なアミノ 酸配列は、通常、そのタンパク質が自然のコンフォーメーションをなしていると きに外部環境にさらされやすいポリペプチドのＣ末端、Ｎ末端、及びその間に介 在する親水性領域に存在する。 典型的には、約１５残基の長さを有する選択されたポリペプチドは、ｆｍｏｃ 化学を用いるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎ ｔｈｅｓｉｚｅｒ ｍｏｄｅｌ ４３１Ａを用いて合成され、Ｍ−マレイミドベ ンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ；上述のＡｕｓｕｂ ｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ参照）と反応させることによりヒザラガイヘモシアニン またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ；Ｓｉｇｍａ）と結合される 。必要ならば、ＫＬＨに結合できるようにペプチドのＮ末端にシステインを挿入 してもよく、動物は、フロイント完全アジュバントによりペプチド−ＫＬＨ複合 体で免疫化される。得られた抗血清は、ペプチドをプラスチックに結合し、１％ のＢＳＡでブロックし、抗血清と反応させ、その後洗浄し、（放射性または蛍光 性の）標識をなされたアフィニティ精製された特異的ヒツジ抗ウサギＩｇＧと反 応させることにより、抗ペプチド活性をテストすることができる。 ハイブリドーマも標準的な技術を用いて調製される。興味の対象となるハイブ リドーマは、標識化ＡＤＥＣでスクリーニングし、所望の特異性を有するモノク ローナル抗体を産生するそれらの融合体を同定することにより検出される。例え ば、典型的なプロトコルでは、プレート（Ｆ ＡＳＴ， Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ ）の穴が、アフィニティ精製された特異的ウサギ抗マウス（または適当な抗種Ｉ ｇ）抗体約１０ｍｇ／ｍｌでコーティングされる。コーティングされた穴は１％ のＢＳＡでブロックされ、洗浄されて、ハイブリドーマの上清液にさらされる。 インキュベーションの後、この穴は約１ｍｇ／ｍｌの濃度の標識化ＡＤＥＣにさ らされる。抗体を産生するクローンは、上述のような条件の下で検出可能な量の 標識化ＡＤＥＣと結合する。このようなクローンは、増殖された上で、限界希釈 （１細胞／３穴）で２サイクルのクローニングをなされる。クローニングされた ハイブリドーマは、プリスタン処置を受けたマウスに注射され、マウスの復水が 作り出される。モノクローナル抗体は、タンパク質Ａを用いるアフィニティクロ マトグラフィーにより、マウスの復水から精製される。少なくとも１０⁸Ｍ^-1、 好ましくは１０⁹〜１０¹⁰以上の親和力を有するモノタローナル抗体は、典型的 には、“Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ ｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＮＹ”または“Ｇｏｄｉｎｇ （１９ ８６） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ２ｄ Ｅｄ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ ｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ”に記載の標準的な手順により作られる。これ らの文献を本明細書と共に参照されたい。 特定のＡＤＥＣ配列に対して特異的な抗体は、適当な動物にＡＤＥＣ配列を接 種することにより産生され得る。抗体が、配列番号：２に開示されたＡＤＥＣポ リペプチドの全体または一部分に対して産生され、そのタンパク質の全体または 一部分に結合するならば、その抗体はＡＤＥＣに対して特異的であると言える。 抗体の誘発は、動物への注射により 生ずる免疫反応の刺激作用によるもののみならず、合成抗体、または組換え免疫 グロブリンライブラリ（“Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ （１９８９） ＰＮＡ Ｓ ８６：３８３３−３８３７またはＨｕｓｅ ｅｔ ａｌ （１９８９） Ｓ ｃｉｅｎｃｅ ２５６：１２７５−１２８１”参照）またはリンパ球集団のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激作用によっても起こる。現在の技術（“Ｗｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９” ）では、抗体形成の原理に基づき、高度に特異的に結合する多数の試薬を提供す ることができる。このような技術は、ＡＤＥＣに特異的に結合し得る分子の産生 に容易く適用することができる。 ＡＤＥＣをコードするポリペプチドは、例えば腫瘍形成、慢性関節リウマチ、 強皮症、及び乾癬のような血管新生に関連する様々な異常な状態を治療するのに 有用なものとなり得る。ＡＤＥＣ遺伝子配列を細胞に導入することにより遺伝子 治療を用いて、血管新生関連の病気の状態に関連するＡＤＥＣの過剰発現または 発現不足によって特徴付けられる状態を治療することができる。例えば、ＡＤＥ Ｃをコードするポリヌクレオチドは、機能不全内生遺伝子を置換したり、または それに代わって効果を発揮することができる。これとは別に、ＡＤＥＣ若しくは そのフラグメントを用いて、血管新生関連の病気または状態の治療を行うことが できる。 レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、 またはウシ乳頭腫ウイルスのようなウイルス由来の発現ベクターを用いて、ＡＤ ＥＣをコードするヌクレオチド配列を、標的細胞集団に分配することができる。 当業者には周知の方法を用いて、ＡＤＥＣポリヌクレオチド配列を含む組換えウ イルスベクターを構成することができる。このような技術の例は“Ｍａｎｉａｔ ｉｓ ｅｔ ａｌ．， １ ９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ，Ｎ．Ｙ．”及び“Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９８９ Ｃｕｒｒｅ ｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇ ｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅ ｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ．Ｙ．”に記載されており、これらを参照 されたい。別の形態として、組換えＡＤＥＣ分子を、リボソーム内に再構成して 、標的細胞に分配することができる。従って、本発明は、効果的な量のＡＤＥＣ をコードするポリヌクレオチド配列及び薬化学的に適格の担体を含む血管新生関 連の病気状態を治療する薬化学的組成物を提供する。本発明は更に、効果的な量 のＡＤＥＣをコードするポリヌタレオチドの患者への投与を含む、血管新生関連 の疾病を患っている患者の治療方法を提供する。これとは別に、炎症に関連する 状態のような、ＡＤＥＣの過剰発現によって特徴付けられる異常状態の治療を、 ＡＤＥＣｍＲＮＡの翻訳を抑制するアンチセンス核酸を遺伝子治療技術を用いて 導入することにより、行うことができる。 ＡＤＥＣの抗体、阻害剤、アンチセンス分子、レセプタ、若しくは類似体（過 剰なＡＤＥＣ産生に対する処理剤、以下略して“ＴＥＣ”と称する）は、治療的 に投与されたときそれぞれ異なる効果を与え得る。このＴＥＣは、無毒性で、不 活性で薬化学的に適格な水性担体媒質でありそのｐＨは約５〜８、より好適には ６〜８のである。但し、このｐＨ値は、照合される抗体、阻害剤、レセプタ、ま たは類似体の特性や治療される病状に応じて変わってくる。ＴＥＣの特性には、 分子の可溶性、半減期、及び抗原性／免疫抗原性が含まれ、効果的な担体を決定 するのに役立ち得る。自然発生ヒトタンパク質はＴＥＣとして好適であるが、薬 物スクリーニングによって得られた有機分子も特定の状態の下では同様に効果的 であり得る。 ＴＥＣは、局所塗布用クリームまたはゲル、粘膜透過性スプレーまたはエーロ ゾル、皮膚透過性パッチまたは包帯、注射可能な静脈内または洗浄調合物及び経 口投与液若しくは錠剤を含む周知の投与経路によって与えられ得るが、投与の仕 方は以上挙げたものに限定されない。特定の配合、正確な投与量、及び投与経路 は、病院所属医師により決定され、それぞれの状況に応じて変わってくる。 このような決定は、治療を受ける条件、投与されるＴＥＣ、及び特定のＴＥＣ の薬動力学的プロフィールのような様々な変量を考慮してなされる。考慮され得 る他の因子には、病状、患者の年齢、体重、性別、食事、投与の回数、薬物の組 合せ、反応感受性及び治療に対する耐性／反応が含まれる。長時間作用するＴＥ Ｃ調剤の投与の頻度は、特定のＴＥＣの半減期及び消失速度に応じて、３日から ４日に１回、１週間に１回、または２週間に１回であり得る。 通常の投与量は、投与経路に応じて０．１〜１００，０００μｇ、最大１ｇの 間で変化し得る。ＴＥＣの特定の投与量に関しての説明は以下の文献、即ち米国 特許第４，６５７，７６０号、第５，２０６，３４４号、または第５，２２５， ２１２号明細書に記載されている。ＴＥＣの種類に応じて効果的な配合も変わり 、また肝臓を標的にする投与と、下垂体を標的にする場合では、投与方法も異な ってくることが予測される。 炎症性アデノイドに関連する状態、または白血球、特定の単球及びマクロファ ージを活性化する疾病及び永久損傷は、ＴＥＣで治療され得ると考えられる。こ れらの状態若しくは病気は、後に説明する診断テストにより詳しく診断され得る 。このような診断テストは、例えばエプスタイン・バーウイルス、ホジキン病、 様々な新生物または非特異的咽頭炎 にかかっている疑いのある患者に対して行われるべきである。 以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明を限定するもの ではない。 実施例 １．ｍＲＮＡの単離及びｃＤＮＡライブラリの構築 ａｄｅｃのｃＤＮＡ配列は、初めに炎症性アデノイドライブラリを含むポリヌ クレオチド配列の中から同定された。このライブラリは、アデノイド、及び扁桃 摘出においてヒトの子供から外科的に取り出された扁桃腺リンパ球系組織の混合 物から構築された。アデノイド組織は、カリフォルニア大学ロスアンジェルス校 から冷凍状態のものが得られた。冷凍組織は、乳鉢と乳棒ですりつぶされ、すぐ にグアニジウムイソチオシアナーテ（“Ｃｈｉｒｇｗｉｎ ＪＭ ｅｔ ａｌ （１９７９） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：５２９４”参照）を含有する 緩衝液に溶解された。溶解に続けて、セノール−クロロホルム抽出及びエタノー ル沈殿が数回行われた。ポリ（Ａ＋）ｍＲＮＡは、常磁性粒子に結合されたスト レプトアビジンとビオチン化オリゴｄ（Ｔ）を用いて単離された（“Ｐｏｌｙ（ Ａ） Ｔｒａｃｔ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ； Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ”）。 炎症性アデノイド組織から得られたポリ（Ａ）ｍＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ ｅ Ｉｎｃ． ；１１０１１ Ｎ． Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｄ．， Ｌ ａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ ９２０３７）を用いて、ｃＤＮＡライブラリを構築し た。ｃＤＮＡの合成は、オリゴｄ（Ｔ）及び／またはランダム六量体をプライマ ーとして用いて行われた。合成アダプタオリゴヌクレオチドはＵＮＩ−ＺＡＰ（ 商標） ｖｅｃｔｏｒ ｓ ｙｓｔｅｍ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）に挿入することができるよう にｃＤＮＡの末端に結合された。これにより高い効率で一方向性（センス方向） のλライブラリ構築が可能となり、ｃＤＮＡ挿入体を有するクローンを検出する ための青−白の色による選択ができるプラスミド系の利点を利用できるようにな る。 各ｃＤＮＡライブラリの品質は、ＤＮＡプローブと抗体プローブの何れかを用 いてスクリーニングされ、次いでｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標登録）ファージ ミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）が生細胞の中で手早く切り取られた。 このファージミドにより、簡単に挿入断片の特徴付け、配列決定、部位指定突然 変異誘発、一方向性の形質の形成及び融合タンパク質発現のために、プラスミド 系を使用することが可能となる。各ライブラリからのファージ粒子は、Ｅ．ｃｏ ｌｉ宿主細胞株ＸＬ１−ＢＬＵＥ（商標登録）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ ．）に感染させられた。ＸＬＩ−ＢＬＵＥの形質転換効率が高いために、少ない 比率で表現されたクローンをｃＤＮＡライブラリから得られる可能性が高められ る。 ２．ｃＤＮＡクローンの単離 ファージミド形態の個々のｃＤＮＡクローンは、ｉｎ ｖｉｖｏ切除プロセス により得られた。このプロセスでは、ＸＬＩ−ＢＬＵＥが、ｆ１ヘルパーファー ジと同時に感染された。λファージ及びｆ１ヘルパーファージの双方に由来する タンパク質は、λ標的ＤＮＡ上の定められた配列から新たなＤＮＡ合成を開始し 、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド及びｃＤＮＡ挿入断片の全てのＤＮＡ配列 を含む小さな一本鎖環状ファージミドＤＮＡ分子を形成した。このファージミド ＤＮＡは、細胞から放出され、精製されて、更に新鮮な細菌性宿主細胞（ＳＯＬ Ｒ， Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）に再感染するのに使用されて、ここで 二本鎖のファージミドＤＮＡが産生された。ファージミドがβ−ラクタマーゼに 対する遺伝子を保有していることから、新たに形質転換された細菌が、アンピシ リンを含有する培地上で選択された。 ファージミドＤＮＡは、ＱＩＡＧＥＮ（商標登録） ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃ ａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．， ９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅ．， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ ９１３１１）のＱＩＡＷＥＬＬ −８ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて精製 された。この技術は、細菌細胞を溶解し、高度に精製されたファージミドＤＮＡ を単離するための、高速で信頼性が高く高スループットの方法である。精製樹脂 から溶離されたこのＤＮＡは、ＤＮＡ配列決定及び他の分析的操作に適したもの であった。 ３．ｃＤＮＡクローンの配列決定 炎症アデノイドライブラリのランダム分離により得られたｃＤＮＡ挿入断片は 、部分的に配列決定された。このｃＤＮＡは、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏ Ｌａｂ ２２００ （Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ ＮＶ）と、４台のＰｅｌ ｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒｓ （ＰＴＣ２００ ｆｒｏｍ ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ ｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７７ ｏｒ ３７３ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓ ｙｓｔｅｍｓ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を組み合わせて用いて、Ｓａｎｇ ｅｒＦ． Ａｎｄ ＡＲ Ｃｏｕｌｓｏｎ （１９７５； Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂ ｉｏｌ， ９４：４４１ｆ）記載の方法により配列決定され、ＤＮＡの読み枠が 決定された。 ４．ｃＤＮＡクローン及び演鐸されたタンパク質の相同性検索 各ｃＤＮＡの配列は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製の検索アル ゴリズムを、ＩＮＨＥＲＩＴ（商標） ６７０ Ｓｅｑｕｅｎ ｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍに組み込んで用いて、ＧｅｎＢａｎｋの 配列と比較された。このアルゴリズムでは、Ｐａｔｔｅｒｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｔｉｏｎ Ｌａｎｇｕａｇｅ （ＴＲＷ Ｉｎｃ．， Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅ ｓ ＣＡ）を用いて、相同性領域を決定した。配列比較をどのように行うかを定 める３つのパラメータは、ウィンドウサイズ、ウィンドウオフセット、及び誤差 許容度であった。これら３つのパラメータの組合せを用いて、興味の対象である 配列に対して相同性を有する領域を含む配列を、ＤＮＡデータベースから検索し 、適当な配列に対して初期値と共にスコアが付けられた。続いて、これらの相同 領域を、ドットマトリクス相同性プロット法を用いて検定し、偶然の一致と真の 相同領域とを区別した。相同性検索の結果を表示するためにＳｍｉｔｈ−Ｗａｔ ｅｒｍａｎアラインメント用いた。 ペプチド及びタンパク質配列の相同性は、ＩＮＨＥＲＩＴ（商標）６７０ Ｓ ｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａ１ｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、ＤＮＡ配列の相同 性の検査に類似した方法で確認された。Ｐａｔｔｅｒｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔ ｉｏｎ Ｌａｎｇｕａｇｅ及びパラメータウィンドウを用いて、相同性領域を含 むタンパク質配列のデータベースを検索し、相同性領域は初期値と共にスコアを 付けられて表示された。ドットマトリクス相同性プロット法により検定を行い、 有意な相同性領域を偶然の一致と区別した。 ＢＬＡＳＴ（ベーシック局部的一致検索ツール）（“Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ （１９９３） Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０−３００， Ａｌｔｓｃｈ ｕｌ， ＳＦ ｅｔ ａｌ （１９９０） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４ ０３−１０）”参照）を用いて、局部的な配列の一致を検索した。ＢＬＡＳＴは 、ヌクレオチド及びアミノ酸 配列双方のアライメントを検出して、これにより配列の類似性が決定される。ア ライメントが局部的であるために、ＢＬＡＳＴは、ギャップを含まないアライメ ントを求めるのに有用なものである。ＢＬＡＳＴアルゴリズム出力の基本単位は 、Ｈｉｇｈ−ｓｃｏｒｉｎｇ Ｓｅｇｍｅｎｔ Ｐａｉｒ（ＨＳＰ）である。 ＨＳＰは、アライメントが局部的に最大となる部分の長さが等しく、アライメ ントスコアがユーザがセットしたカットオフスコアまたは閾値スコア以上である ような２つの配列フラグメントからなる。ＢＬＡＳＴを用いる方法により、興味 の対象となる配列と、データベース配列とのＨＳＰを捜し、発見された一致の統 計的優位性を評価し、ユーザが選択した優位性の閾値を超える一致のみを知るこ とができる。パラメータＥは、データベース配列との一致で報告されるものを選 択するための、統計的優位性の閾値を設定する。Ｅは、データベース検索全体の 文脈の中で、ＨＳＰ（若しくはＨＳＰの組）の偶然の一致の予定頻度の上限と解 釈される。Ｅを満たすデータベース配列は、プログラムの出力において報告され る。 アデノイド発現型ケモカイン（ＡＤＥＣ）に対するヌクレオチド配列及びアミ ノ酸配列は、それぞれ配列番号：１及び配列番号：２に示されている。 ５．遺伝子の同定及び全長さにわたる配列決定 炎症性アデノイドライブラリのクローンの中からランダムにピックアップし配 列決定すると、既知のＣ−Ｘ−Ｃケモカイン分子との相同性を有するが、明らか に異なっているａｄｅｃ配列が見つけられた。このａｄｅｃに対するヌクレオチ ド配列はサイトカイン社クローンＮＯ．２０２９３内において発見された。予測 される全ての可能な３つのこの配列の翻訳物について、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ及び ＰＩＲのようなタンパク質 データベースを検索したが、ａｄｅｃの可能な翻訳物と完全に一致するものは見 つけられなかった。第２図に示すのは、ＡＤＥＣと他のケモカイン分子との比較 であって、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフを含む実質的な相同領域が共有されているところ が示されている。しかし、系統分析により、ＡＤＥＣは、他のよく特徴付けられ たヒトＣ−Ｘ−Ｃケモカインとは近縁関係にないことが分かった（第３図参照） もこれらの分予の最も近縁なものは、図面の右側に集まっている。この結果が表 しているのは、ＡＤＥＣが、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインの新たなサブファミリーまた は変異体であることだと考えられる。 ６．アンチセンス分析 ＡＤＥＣの正しい完全なｃＤＮＡ配列を知ることにより、遺伝子機能の調査で のアンチセンス技術に、これを適用することが可能になる。ＡＤＥＣをコードす るポリヌクレオチド配列のアンチセンス鎖を含むゲノムのまたはｃＤＮＡのフラ グメントをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで用いて、特定のタンパク質 の発現を阻害することができる。このような技術は周知であり、ヌクレオチド配 列の様々な部位に付くプローブをデザインすることができる。細胞または実験動 物の全体をこのようなアンチセンス配列で処理することより、興味の対象である 遺伝子の機能を効果的に遮断することができる。多くの場合、細胞レベル、組織 レベル、若しくは生物体全体のレベルでの挙動（例えば死亡率、分化した機能の 消失、形態の変化等）を観察することにより、その遺伝子の機能を確認すること ができる。 開放された読み枠の転写を妨害するように構築された配列を用いることに加え て、イントロン領域、プロモータ／エンハンサー要素、またはトランス作用調節 遺伝子に対するアンチセンス配列をデザインすることにより、遺伝子発現を修飾 することかできる。同様に、“三重らせん体 （トリプルヘリックス）”塩基対として知られるＨｏｇｅｂｏｏｍ塩基対を用い て阻害を達成することができる。 ７．ＡＤＥＣの発現 ＡＤＥＣをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターにクローニングした。 この発現ベクターは、Ｔ７プロモータに始まり、それに続く開始メチオニンコド ン（ＡＴＧ）、それに続くＥ．ｃｏｌｉのＴｒｘＡ遺伝子（チオレドキシンをコ ードするもの）、それに続くエンテロキナーゼ切断可能部位をコードする配列、 及びＡＤＥＣをコードするヌクレオチド配列を含むものである。ＡＤＥＣに対し ては、発現されたタンパク質のＮ末端残基は配列番号：２の配列の第２４残基の Ｌｅｕ（ロイシン）である。 ６個のヒスチジンコドンを含む上述の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転 換させ、宿主細胞培地をＩＰＴＧで誘発して発現されたタンパク質に、変性ＳＤ Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動法を施した。発現ベクターから得られた核酸 は、上述のＳａｍｂｒｏｏｋのミニプレッププロシージャを用いて部分的に精製 され、これによりスーパーコイルしたＤＮＡが産生された。約１００ｎｇのＤＮ Ａを用いて、宿主細菌細胞Ｗ３１１０／ＤＥ３を形質転換させた。Ｗ３１１０／ ＤＥ３は、ＡＴＣＣのＷ３１１０及びＮｏｖａｇｅｎ社製のｌａｍｂｄａ ＤＥ ３ ｌｙｓｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＤＥ３溶原化キット）を用いて構 築された。ＤＥ３溶源は、その親Ｗ３１１０より形質転換受容性が低いことが多 く、効率的な形質転換のためのスーパーコイルしたＤＮＡの使用に適用される。 各ケモカイン形質転換から１つの形質転換体が選択され、それを用いてアンピ シリン含有Ｌ−ブロスの５ｍｌの培地に接種した。各５ｍｌの培地は、振とうし た上で３７℃で一晩（１２〜１５時間）増殖させた。 一晩おいた後、その培地の１ｍｌを、５００ｍｌのフラスコ内で、アンピシリン 含有Ｌ−ブロスの１００ｍｌの培地に接種し、振とうした上で３７℃で増殖させ 、培地のＯＤ６００が０．４〜０．６に達するで放置した。接種された細胞がＯ Ｄ６００の値で０．６を越えるまで増殖した場合には定常期に入り、誘発レベル は低減する。 接種の時に、５ｍｌの試料を取り出し、氷上に設置して、前誘発（preinducti on）試料（または０時間試料）として用いた。この細胞培地がＯＤ６００の値で ０．６に達したとき、１００ｍＭ ＩＰＴＧ原液の４００μｌを添加して、最終 的な濃度は０．４ｍＭになるようにした。この培地は、振とうした上、３７℃で ３時間増殖させた。１時間から最大６時間の間隔で、培地の５ｍｌの分割量を取 り、変性ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で発現誘発の分析を行った。 融合タンパク質は、細胞の不溶性分画に蓄積していることが観察された。 ＡＤＥＣの誘発が最大となるのは２時間経過したときであった。４時間以上増 殖させると、培地で溶解が生じ、このタンパク質分解により所望のタンパク質の 全体としての収量は低減した。０時間、１時間、及び２時間経過したときに細胞 培地の５ｍｌの分割量を取り４℃で５分間３０００ＲＰＭで遠心分離した。その 上清を吸引し、細胞の溶解を促進すべくピペットに凍結融解処理を施した。この ピペットは４℃でＴＥ［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ ｐＨ ８．０， １ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ ８．０］に再懸濁した。その量はＴＥ（μｌ）＝（ＯＤ６０ ０）（２５０）で計算される量であった。各試料には同量の２×ＳＤＳ Ｓａｍ ｐｌｅ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｏｖｅｘ）が添加された。この試料 を５分間煮沸し、各レーンにつき１０μｌの各試料を負荷したゲル電気泳動法の 結果、ＡＤＥＣ融合タンパク質は、変性ＳＤＳゲル上で２４ＫＤ分子量（予定分 子量２４０９３ダルトン）の位置に移動した。 ８．組換えＡＤＥＣの単離 ＡＤＥＣはキメラタンパク質として発現された。このキメラタンパク質は、６ 個のヒスチジン、それに続くＥ．ｃｏｌｉのチオレドキシン（ＴｒｘＡ）遺伝子 を有し、ＴｒｘＡタンパク質とＡＤＥＣとの間にエンテロキナーゼ切断部位を有 していた。ヒスチジンは、タンパク質の精製を促進するために添加されたもので ある。ヒスチジンが存在することにより、ＩＭＩＡＣクロマトグラフィー（Ｐｏ ｒａｔｈ：上述）上での精製が可能となる。 ９．ＡＤＥＣ特異的抗体の産生 ＰＧＥＣに対するポリクローナル抗体を、上述のセクション７に記載したよう に、電気泳動で精製されたＰＧＥＣ融合タンパク質を約１００μｇウサギに注射 することにより調製した。一次抗体の注射から約８週間の後、ポリクローナル血 清を回収した。配列番号：２のＡＤＥＣのうちの残基２５〜４２からなるＡＤＥ Ｃのペプチドに対するポリクローナル抗体が、通常の方法により調製された。 １０．ＡＤＥＣ特異的抗体を用いた診断テスト 特定のＡＤＥＣ抗体を、前病状態の診断、及びＡＤＥＣの量または分布の差に よって特徴付けられる慢性または急性の疾病に対する診断に用いることができる 。ＡＤＥＣは、それが同定される特定の組織の異常または病状に対して特異的で あることが多い。 ＡＤＥＣに対する診断テストには、ヒトの体液、組織またはこのような組織の 抽出物においてＡＤＥＣを検出するために抗体及び標識を用いる方法が含まれる 。本発明のポリペプチド及び抗体は、修飾した上で使用されることもあれば、修 飾せずに使用されることもある。多くの場合ポリペプチド及び抗体は、検出可能 なシグナルを提供する物質と共有結合または非共有結合で結合させることにより 標識される。標識及び接着 技術には様々なものが知られており、化学的な文献あるいは特許明細書の双方に おいて広く記載されている。適当な標識としては、放射線核種、酵素、気質、補 因子、阻害剤、蛍光剤、化学ルミネセンス剤、磁性粒子等が有る。このような標 識の使用について記載されている特許明細書には、例えば米国特許第３，８１７ ，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６ ，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号、第４，３６６ ，２４１号の明細書がある。また組換え免疫グロブリンの産生方法は、米国特許 第４，８１６，５７６号明細書に記載されている方法を用いることができ、本明 細書と共に参照されたい。 可溶性または膜結合型ＡＤＥＣを測定するための、ＡＤＥＣに対して特異的な ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる様々なプロトコ ルが周知となっている。その例を挙げると、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ） 、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）、及び蛍光活性化細胞分析分類法（ＦＡＣＳ）等 が有る。好適なのは、ＡＤＥＣ上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクロ ーナル抗体を利用した２つの部位のモノクローナルベースの免疫検定法であるが 、競合的結合検定法を用いてもよい。これらの検定法は、“Ｍａｄｄｏｘ， Ｄ Ｅ ｅｔ ａｌ （１９８３， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １５８：１２１１）”他 の文献に記載されている。 １１．特異的抗体を用いる末変性ＡＤＥＣの精製 未変性または組換えＡＤＥＣは、ＡＤＥＣ特異的抗体を用いたイムノアフィニ ティクロマトグラフィーにより精製された。一般に、イムノアフィニティカラム は、抗ＡＤＥＣ抗体と活性化クロマトグラフィー樹脂が共有結合で結びつくこと によって構成される。 ポリクローナル免疫グロブリンは、実施例４に記載したように調製さ れ、モノクローナル抗体は硫安沈殿または固定化タンパタ質Ａ上でのクロマトグ ラフィーによりマウスの復水から調製される。部分的に精製された免疫グロブリ ンは、ＣｎＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のようなクロマトグラフィー樹脂に共有結合によって 付着する。抗体は樹脂に結合し、製造者の指示に従いこの樹脂をブロックした後 、誘導体樹脂を洗浄する。 このようなイムノアフィニティカラムは、可溶型のＡＤＥＣを含む細胞から分 核を調製することによってＡＤＥＣの精製において用いられる。可溶化ＡＤＥＣ は、界面活性剤の添加または従来より周知の他の方法により遠心分離法を用いて 得られた細胞成分分画、若しくは細胞全体を可溶化することによって誘導される 。別の形態として、シグナル配列を含む可溶化ＡＤＥＣは、細胞が増殖する培地 に有用な量だけ分泌され得る。 可溶化ＡＤＥＣ含有調合物は、イムノアフィニティカラムを通されて、このカ ラムはＡＤＥＣの好適な吸収が可能となる条件の下で（即ち、界面活性剤の存在 の下、高イオン強度の緩衝液の中で）ＡＤＥＣはカラムから溶離され、次いでＡ ＤＥＣが回収された。 １２．ＥＣ誘発走化性または細胞活性化の判定 ＡＤＥＣの走化性の活性は、４８穴マイクロケモタキシスチャンバ（“Ｆａｌ ｋ ＷＲ ｅｔ ａｌ （１９８０） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３３：２３９”参照）で測定される。各穴はフィルタによって２つの区画に分割 されており、細胞が化学的勾配に応じてこのフィルタを通過できるようになって いる。ＡＤＥＣを含むＲＭＰＩＩ６４０のような細胞培養地は、通常はポリカー ボネート製のフィルタの一方の側に配置され、同じ媒地内で懸濁された細胞がフ ィルタの他方の区画に配置される。十分なインキュベーション時間が経過すると 、フィルタ前後の濃度勾配に応じて細胞がフィルタを通過する。その後、フィ ルタは各穴から取り出され、フィルタのＡＤＥＣ側に付着した細胞が分類され定 量される。 特異的な細胞集団に対してケモタキシスアッセイを実施することにより、化学 誘因物質の特異性が判定される。初めに、静脈穿刺で得られた血液細胞が密度勾 配遠心分離法により分画され、好中球、末梢血単球細胞、単球及びリンパ球の濃 縮された集団に対して、特定のＡＤＥＣの走化性（ケモタキシス）の活性がテス トされる。所望に応じて、このような濃縮細胞集団は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋濃 縮Ｔ細胞集団のネガティブ選択のために、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋特異的抗体を用 いてそれぞれ更に分画される。 別の実験（アッセイ）により、活性化Ｔ細胞に対するＡＤＥＣの走化性効果が 解明される。この実験では、未分画のＴ細胞または分画されたＴ細胞サブセット が、ＣＤ−３抗体でコーティングされた組織培養容器内で６〜８時間培養される 。このＣＤ３活性化の後、ＡＤＥＣの走化性の活性が上述のようにテストされる 。また、濃縮細胞集団を得るための方法は、他にも様々なものが従来より周知で ある。 ケモカインの中には、好中球及び単球の非走化性細胞活性化作用を示すものも ある。これは、アクチン重合、呼吸バースト作用の増加、アズール親和性顆粒の 脱顆粒、及びシグナル伝達経路の一部としてのＣａ²⁺動員のような好中球活性化 作用の標準的な測定基準を媒介にして検定される。Ｃａ²⁺の動員の検定法には、 Ｃａ²⁺の結合によって放射特性が変化する蛍光プローブを好中球に前負荷する処 理過程が含まれる。細胞が活性化刺激にさらされたとき、蛍光光度計により細胞 を観測することにより、Ｃａ²⁺の流れを知ることができる。Ｃａ²⁺動員の測定に ついては、“Ｇｒｙｎｋｉｅｖｉｃｚ Ｇ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６０：３４４０， ａｎｄ ＭｃＣｏｌｌ Ｓ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５０：４５５０−４５５ ５”に記載されており、これを本明細書と共に参照されたい。 脱顆粒及び呼吸バースト反応は、単球においても測定される（“Ｚａｃｈａｒ ｉａｅ ＣＯＣ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７１： ２１７７−８２”参照）。更に、単球活性化作用の測定基準には、接着分子発現 及びサイトカインの産生の調節を利用することができる（“Ｊｉａｎｇ Ｙ ｅ ｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：２４２３−８”参照 ）。接着分子の発現は、リンパ球の活性にも応じて変化する（“Ｔａｕｂ Ｄ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０： ３５５−３５８”参 照）。 １３．薬物スクリーニング ＡＤＥＣ若しくはそのフラグメントは、様々な薬物スクリーニング技術で化合 物をスクリーニングする際に有用である。このようなテストにおいて用いられる ＡＤＥＣポリペプチドまたはフラグメントは、溶液の中に遊離している形態のも のか、固体の支持体に付着している形態のものか、細胞の表面に支持されている 形態のものか、あるいは細胞内に存在する形態のものの何れかである。薬物スク リーニングの一方法では、宿主細胞として、ＡＤＥＣポリペプチドまたはそのフ ラグメントを発現する組換え核酸で安定的に形質転換される真核細胞または原核 細胞を利用する。薬物は、競合的結合実験において形質転換された細胞からスク リーニングされる。このような細胞は、生存型であれ固定型であれ標準的な結合 実験に使用することができる。これを用いて、例えばＡＤＥＣまたはそのフラグ メントと試験される薬剤との複合体形成を測定したり、あるいは試験される薬剤 によって生じた、ＡＤＥＣまたはそのフラグメントと好中球または繊維芽細胞と の複合体の減少を検査することができる。 従って、本発明は、炎症及び疾病に作用する薬剤または薬物のスクリーニング 方法を提供するものである。これらの方法は、本発明のＡＤＥＣポリペプチド、 若しくはそのフラグメントをこのような薬剤に接触させる過程と、 （ｉ）ＡＤ ＥＣポリペプチド若しくはそのフラグメントとその薬剤との複合体の存在、若し くは（ｉｉ）ＡＤＥＣポリペプチドまたはそのフラグメントと細胞との複合体の 存在を、周知の方法により検定（アッセイ）する過程とを含む。このような競合 的結合検定法においては、ＡＤＥＣポリペプチドまたはそのフラグメントは通常 標識される。適当なインキュベーションの後、遊離したＡＤＥＣポリペプチドま たはそのフラグメントが、結合した形態で存在するそれから分離され、遊離した 、複合体を形成していない標識の量が、特定の薬剤がＡＤＥＣに結合する能力、 またはＡＤＥＣ／細胞複合体に干渉する能力の尺度となる。 薬物スクリーニングのための他の技術では、本発明のＡＤＥＣポリペプチドに 対する適切な結合親和性を有する複合体を高スループットでスクリーニングする ことができ、その技術の詳細は１９８４年９月１３日公開の欧州特許出願第８４ ／０３５６４号明細書に記載されており、本明細書と共にこれを参照されたい。 この方法を簡単に述べると、たくさんの異なる小さなペプチドのテスト化合物が 、例えばプラスチックピンまたは他の物質でできた固体基板の表面上で合成され る。ペプチドテスト化合物は、ＡＤＥＣポリペプチドと反応させられたた上で、 洗浄される。次いで、結合ＡＤＥＣポリペプチドが、周知の方法により検出され る。上述の薬物スクリーニング技術において使用するために、精製ＡＤＥＣをプ レート上に直接コーティングすることもできる。更に、非中和性抗体を用いて、 固体支持体上にペプチドを捕捉若しくは固定化することができる。 ＡＤＥＣポリペプチド若しくはそのフラグメントに結合するテスト化 合物と、ＡＤＥＣに結合できる中和性抗体とが特異的に競合する競合的薬物スク リーニングアッセイの利用も本発明の企図するところである。このようにして、 この抗体を用いて、１または２以上の抗原決定基がＡＤＥＣと共通な任意のペプ チドの存在を検出することができる。 １４．合理的薬物デザイン 合理的薬物デザインの目標は、興味の対象の生物学的に活性のポリペプチド、 若しくは、例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、または阻害剤のような、その ポリペプチドが相互作用する小分子の構造的な類似体を作り出すことである。こ こに例として挙げたものは何れも、より活性の高いまたは安定な形態のポリペプ チドである薬剤、またはｉｎ ｖｉｖｏでポリペプチドの機能を強化、または阻 害する薬剤を作り出すのに用いることができる（“Ｈｏｄｇｓｏｎ Ｊ （１９ ９１） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１９−２１”を本明細書とともに 参照されたい）。 １つの方法では、ＡＤＥＣまたはＡＤＥＣ−阻害剤複合体の三次元構造の決定 を、Ｘ線結晶解析、コンピュータによるモデル化、若しくは最も典型的にはこの ２つの手段を組合せて行う。構造を解明し、分子の活性部位を決定するために、 ポリペプチドの形状及び電荷を確認しなければならない。ポリペプチドの構造に 関する有用な情報が、相同タンパク質の構造に基づいたモデリングにより得られ ることもある。何れの場合においても、対象物の構造の情報を用いて、類似体ケ モカイン状分子をデザインしたり、あるいは効果的な阻害剤を同定している。合 理的薬物デザインの有用なものの例としては、Ｂｒａｘｔｏｎ Ｓ ａｎｄ Ｗ ｅｌｌｓ ＪＡ（１９９２ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：７７９６−７８ ０１）により提示されたような、活性または安定性が改善された分子、若しくは 、Ａｔｈａｕｄａ ＳＢ等（１９９３ Ｊ Ｂｉｏｃ ｈｅｍ １１３：７４２−７４６）によって提示された自然発生ＡＤＥＣの阻害 剤、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用する分子があり、ここでは上述 の両文献を参照されたい。 上述のように、機能検定により選択された標的特異的抗体を単離し、次いでそ の結晶構造を解明することも可能である。通常この方法により、続けて行われる 薬物デザインにおける基礎となり得るファーマコア（pharmacore）が得られる。 機能的な、薬理学的に活性の抗体に対する抗イデオタイプの抗体（抗ｉｄ）を産 生することにより、タンパク質の結晶解析をバイパスすることが可能である。鏡 像の鏡像と同様の意味で、抗ｉｄの結合部位は、もとのレセプタの類似体である ことが期待される。次いで、抗ｉｄを用いて、化学的または生物学的に作られた ペプチドのバンク（bank）から、ペプチドを同定し単離することができる。単離 されたペプチドは、ファーマコアとして役立つ。 本発明により、Ｘ線結晶解析のような分析的研究を行うのに使用できる十分な 量のポリペプチドを作ることができる。更に、ここに開示したＡＤＥＣアミノ酸 配列の知識を、Ｘ線結晶解析の代わり、またはそれと共に用いられるコンピュー タによるモデル化技術に応用することができる。 １５．ＡＤＥＣレセプタの同定 精製ＡＤＥＣを、特異的細胞表面レセプタ及び他の結合分子を特徴付け、精製 に利用することができる。走化性若しくは他の特異的反応によりＡＤＥＣに反応 する細胞は、ＡＤＥＣに対するレセプタを発現しやすい。ＡＤＥＣに放射性標識 を組み込むためには、様々な周知の方法を用いることができる。好適実施例では 、ＡＤＥＣの主たるアミノ基を、¹²⁵Ｉボルトンハンター試薬（“Ｂｏｌｔｏｎ ， ＡＥ ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ， ＷＭ （１９７３） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ １３３：５２９” 参照）で標識する。この試薬は、他のケモカインについても、その生物学的活性 を損なうことなく標識するために用いられてきた（“Ｈｅｂｅｒｔ ＣＡ ｅｔ ａｌ （１９９１） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６： １８９８９； Ｍ ｃＣｏｌｌ Ｓ ｅｔ ａｌ （１９９３） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５０：４ ５５０−４５５５”参照）。レセプタ保有細胞は、標識化ＡＤＥＣと共にインキ ュベートされる。次いで、この細胞は洗浄されて非結合ＡＤＥＣが除去され、次 いでレセプタ結合ＡＤＥＣが定量される。異なる濃度のＡＤＥＣを用いて得られ たデータから、レセプタの数及び親和性を表す数値を計算することができる。 標識化ＡＤＥＣは、その特異的レセプタの精製のための試薬として有用である 。ＡＤＥＣはクロマトグラフィカラムに共有結合で結合される。レセプタ保有細 胞が抽出され、その抽出物がカラムに通される。レセプタは、そのリガンドとの 生物学的親和性のためにカラムに結合する。レセプタはカラムから回収され、Ｎ 末端タンパク質シークエンシングを受ける。得られたアミノ酸配列は、そのレセ プタ遺伝子のクローニングのための変性オリゴヌクレオチドプローブのデザイン に使用される。 別の実施例においては、発現クローニングｍＲＮＡがレセプタ保有細胞から得 られ、それからｃＤＮＡ発現ライブラリが形成される。このライブラリは、細胞 集団へのトランスフェクションがなされ、レセプタを発現する細胞集団は蛍光標 識化ＡＤＥＣを用いて選択される。このレセプタは、高度に標識された細胞から 組換えＤＮＡを回収し配列決定することにより同定される。 別の方法では、レセプタ保有細胞の表面に対する抗体、好ましくはモノクロー ナル抗体が産生され、更にスクリーニングによりこのうち標識化ＡＤＥＣの結合 を阻害するものが同定される。このモノクローナル抗体は、アフィニティ精製ま たはレセプタの発現クローニングのために用 いられる。 可溶性レセプタ、若しくは他の可溶性結合分子の同定も類似した方法で行われ る。標識化ＡＤＥＣを、抽出物、または炎症性アデノイド由来の他の適切な材料 と共にインキュベートする。インキュベーションの後、精製ＡＤＥＣより大きい サイズのＡＤＥＣ複合体を、例えば、サイズ排除クロマトグラフィまたは密度勾 配遠心分離法のような分子の大きさによって分離するサイジング技術を用いて同 定し、従来より周知の方法で精製する。可溶性レセプタまたは結合タンパク質は Ｎ末端シークエンシングを受けて、その可溶性タンパク質が既知である場合には データベースによる同定のため、その可溶性タンパク質が未知である場合にはク ローニングのための十分な情報が獲得される。 上述の明細書の記載の中で引用された全ての文献及び特許明細書は、本明細書 と一体に組み込まれる。上述の本明細書の内容は、当業者が本発明を実行するの に十分なものであると考えられる。実際、当業者は、以下の請求の範囲に記載の 本発明の範囲内で、上述の実施例に様々に変更を加えて実施することができるで あろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/24 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＮ // Ｃ１２Ｐ 21/08 ＡＥＤ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，Ｂ Ｙ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ (72)発明者 ワイルド、グレイグ・ジー アメリカ合衆国カリフォルニア州94087・ サニーベイル・マンダリンドライブ 1239 (72)発明者 シールヘイマー、ジェフリー・ジェイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94022・ ロスアルトスヒルズ・ラクレスタドライブ 12555 (72)発明者 ネオート、クルディープ・シン アメリカ合衆国コネチカット州06333・イ ーストライム・ローズレイン 15

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号：２の配列のポリペプチド、またはその相補的ポリペプチドをコー ドするポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とする精製ポリヌクレオチド。 ２．前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号：１の配列からなることを特徴とす る請求項１に記載のポリヌクレオチド。 ３．厳密な条件の下で、請求項２に記載の前記ポリヌクレオチドとハイブリッド 形成可能なことを特徴とする精製ポリヌクレオチド。 ４．請求項２に記載の前記精製ポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベ クター。 ５．請求項４に記載の前記発現ベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。 ６．請求項２に記載の前記ポリヌクレオチドの非保存フラグメントを含むことを 特徴とするポリヌクレオチドプローブ。 ７．請求項２に記載の前記ポリヌクレオチドの少なくとも一部分に対して相補的 なポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とするアンチセンス分子。 ８．配列番号：２の配列のポリペプチドを産生する方法であって、 ａ）前記ポリペプチドの発現に適切な条件の下で、請求項５に記載の前記宿主 細胞を培養する過程と、 ｂ）前記細胞培養物から前記ポリペプチドを回収する過程とを有することを特 徴とするポリペプチドの産生方法。 ９．生物学的試料においてアデノイド発現型ケモカインをコードするヌクレオチ ド配列を検出するための診断テスト方法であって、 ａ）前記生物学的試料と、配列番号：１のヌクレオチド配列を含む第１ヌクレ オチド配列、若しくはそのフラグメントとを、核酸ハイブリダ イゼーション複合体の形成に適切な条件の下で結合する過程と、 ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記複合体 の存在が、前記生物学的試料におけるアデノイド発現型ケモカインをコードする 第２ヌクレオチド配列の存在と相関している、該過程と、 ｃ）前記試料における前記第２ヌクレオチド配列の量と標準値とを比較し、前 記第２ヌクレオチド配列の量が前記標準値と異なっているか否かを判定する過程 であって、前記第２ヌクレオチド配列の異常レベルの存在が、炎症に関連する状 態と正の相関を有する、該過程とを有することを特徴とする診断テスト方法。 １０．前記第１ヌクレオチド配列がリポーター分子で標識され、前記ハイブリダ イゼーション複合体が前記リポーター分子を測定することにより検出されること を特徴とする請求項９に記載の診断テスト方法。 １１．生物学的試料においてアデノイド発現型ケモカインをコードするヌクレオ チド配列を検出するための診断テスト方法であって、 ａ）核酸増幅に適した条件の下で、前記生物学的試料とＰＤＲプライマーとを 結合する過程であって、前記プライマーが配列番号：１のヌクレオチド配列のフ ラグメントを含む、該過程と、 ｂ）増幅されたヌクレオチド配列を検出する過程と、 ｃ）前記生物学的試料における前記増幅されたヌクレオチド配列の量を、標準 値と比較し、前記ヌクレオチド配列の量が前記標準値と異なっているか否かを判 定する過程であって、前記ヌクレオチド配列の異常レベルの存在が、炎症に関連 する状態と正の相関を有する、該過程とを有することを特徴とする診断テスト方 法。 １２．前記ポリペプチド配列が、配列番号：２の配列を含むことを特徴とする精 製ポリペプチド。 １３．請求項１２に記載の前記精製ポリペプチドに対して特異的であることを特 徴とする抗体。 １４．配列番号：２の配列の第２４残基のロイシンをＮ末端アミノ酸残基として 有することを特徴とする精製アデノイド発現型ケモカイン。 １５．配列番号：２の配列の第２５残基のグルタミン酸をＮ末端アミノ酸残基と して有することを特徴とする精製アデノイド発現型ケモカイン。 １６．配列番号：２の配列の第２５残基乃至第４２残基のアミノ酸残基からなる ことを特徴とする精製アデノイド発現型ケモカイン。 １７．血管新生に関連する疾病を治療するための薬化学的組成物であって、 効果的な量の、請求項１に記載のポリペプチド配列と、 薬化学的に適格な担体とを有することを特徴とする血管新生に関連する疾病を 治療するための薬化学的組成物。 １８．血管新生に関連する疾病を患う患者を治療する方法であって、 前記患者に、請求項１７に記載の前記薬化学的組成物を効果的な量投与する過 程を含むことを特徴とする血管新生に関連する疾病を患う患者を治療する方法。