JPH10511305A - 定在音波を発生させる方法、定在音波を用いた超音波処理の方法、および定在音波ソニケータ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、電気波発生器（１０）、電気波発生器に電気的に接続された振動素子（７０）、および振動素子に対して横切って固定された振動可能部材（１６０）を含むソニケータ（５）を提供する。ソニケータは、テスト試料（６０）を超音波処理するのに使用でき、そのような方法のステップは、（ａ）電気エネルギー波を振動エネルギー波に変換するステップ、（ｂ）定在音波（１５０）を発生させるために振動可能部材を振動エネルギー波に接触させるステップ、および（ｃ）テスト試料を定在音波に接触させ、それによりテスト試料中の微粒子材料または高分子材料を超音波処理するステップを含む。また、振動エネルギーをシャフトに沿って振動可能部材に伝えることによって振動可能部材中に定在音波を発生させ、それにより振動可能部材中に定在音波（１５０、１７０）を発生させる方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 定在音波を発生させる方法、定在音波を用いた超音波処理の 方法、および定在音波ソニケータ 本明細書は、その全体を参照により本明細書の一部とする１９９４年１２月２ ２日出願の米国特許同時係属出願第０８／３６２６４０号の一部継続出願である 。 発明の分野 本発明は、音波に関し、特に、微粒子材料を超音波処理するのに使用できる超 音波を発生させる方法に関する。 発明の背景 超音波エネルギーは、汚水からウイルスや細菌などの微生物まで、微粒子材料 を破壊するか、さもなければ分裂させるのに様々な工業分野および科学分野にお いて使用されている。超音波エネルギーまたは超音波が固体材料を破壊する作用 は、超音波が媒体中を伝搬することにより媒体中に圧力変化がもたらされるもの と説明される。これらの圧力変化は２００００気圧にもなり、圧力変化に耐えら れない媒体中の微粒子は破壊される。 「ソニケータ」は、超音波を使用して微粒子材料を破壊するのに使用される装 置である。ソニケータは、一般に三つの種類 に分類できる。第一に、「液浸」ソニケータは、一般に、超音波を出す振動プロ ーブを液体試料中に浸すものである。米国特許第５０７４４７４号には液浸タイ プのソニケータが記載されている。 第二に、「バス」ソニケータは、一般に振動する容器を含み、容器内の液体は 、振動する容器によって生成された超音波を受ける。一般に、容器は水で充填さ れ、第二の容器内に入れられた試料は水中に配置される。したがって、試料容器 内の固体は超音波エネルギーを受ける。バスタイプのソニケータは米国特許第４ ８９７４１３７号に記載されている。 最後に、「直接」ソニケータは、試料の入った容器に直接超音波エネルギーを 当てる。試料中に粒子材料が存在すれば、超音波エネルギーを受ける。直接ソニ ケータは米国特許第４９８３５２３号に記載されている。 発明の概要 本発明は、電気的波の発生器（以下、電気波発生器と呼ぶ）、電気波発生器に 電気的に接続された振動素子、および振動素子に対して横切って（transversley ）固定された振動可能部材を含むソニケータを提供する。ソニケータは、テスト 試料を超音 波処理するのに使用でき、そのような方法は、（ａ）電気エネルギー波を振動エ ネルギー波に変換するステップ、（ｂ）定在音波を発生させるために振動可能部 材を振動エネルギー波に接触させるステップ、および（ｃ）テスト試料を定在音 波に接触させ、それによりテスト試料中の微粒子材料または高分子材料を超音波 処理するステップを含む。また、振動エネルギーをシャフトに沿って振動可能部 材に伝えることによって振動可能部材中に定在音波を発生させる方法を提供する 。 図面の簡単な説明 第１図は、本発明による定在音波ソニケータの一実施形態を概略的に示す図で ある。 第２図は、本発明による定在音波ソニケータの一実施形態を概略的に示す図で ある。 第３図は、プレートの形をした定在音波ソニケータの振動可能部材の平面図お よび断面ＩＶ−ＩＶを通るプレートの断面図である。 第４図は、定在音波ソニケータの一実施形態を示し、かつそのような一実施形 態中を伝搬する波を示す図である。 第５図は、本発明による振動素子に対して横切って固定でき る振動可能部材として使用できるプレートの平面図である。 本発明の詳細な説明 超音波は、振動エネルギーの供給源に対して横切って固定された振動可能部材 中を伝わることを出願者は観測した。さらに、そのような振動可能部材中に生じ た波は、振動エネルギーの供給源から放出される波の振動数よりも高い振動数を 有する。出願者の発明は、振動可能部材中にそのような波を生成し、定在音波を 使用して微粒子材料または高分子材料を超音波処理する方法を対象とする。 定在音波ソニケータ５を第１図に示す。第１図に示すように、電気波発生器１ ０は振動素子２０に電気的に接続される。シャフト３０は、振動素子２０を貫い て突出し、振動可能部材４０を振動素子２０に対して横切って固定する。そのほ うが好ましいが、振動可能部材４０は直接に振動素子２０に対して横切って固定 できるので、シャフト３０は不要である。振動可能部材４０は、試料管６０を振 動可能部材４０に固定する複数のアパーチャ５０を規定する。 電気波発生器１０、振動素子２０、シャフト３０および振動可能部材４０とと もに使用できる他の構成要素が第１図および 第２図に示されている。第１図を見ると、電気波発生器１０によって生成された 電気エネルギーを増幅するために増幅器７０が電気波発生器１０に電気的に接続 される。さらに、電気波発生器１０および振動素子２０は、振動素子２０の受け るインピーダンスが最小になるようにするフィードバック位相トラッキングルー プ８０に動作可能に結合される。振動素子２０およびシャフト３０の大部分を囲 むハウジング９０は、それらが囲む構成要素を格納するのに使用される。システ ム全体（図示せず）を囲むハウジングも、ソニケータから出る音（または無線周 波数）をさらに低減するのに使用される。 第２図に、複数の振動素子が使用されることが考慮された本発明の一実施形態 を示す。一般に、二つの振動素子が使用される。第２図は、第一の振動素子２０ および第二の振動素子１００を示す。この実施形態によれば、振動素子１００は 、一方の振動素子が他方の振動素子の上で整合するいわゆる「スタック」構成と して振動素子２０に接触している。第２図はまた、振動可能部材４０を振動素子 ２０および１００に対して横切って固定するための好ましい実施形態を示す。こ の実施形態によれば、振動可能部材４０を振動素子に固定するために位置決め シース１１０および１１５、ならびにシャフト１１６が使用される。位置決めシ ース１１０および１１５は振動素子２０および１００を挟む。位置決めシース１ １５はさらにシャフト１１６に固定され、シャフト１１６は振動可能部材４０に 固定され、それにより振動可能部材４０を振動素子２０および１００に対して横 切って固定する。位置決めシース１１０は、振動素子２０および１００を支持し 、位置決めシース１１５は、シャフト１１６と協働して、振動可能部材４０に振 動エネルギーを伝えるのに使用される。振動可能部材を振動素子に対して横切っ て固定する他の手段としては、これらに限定されないが、溶接、ネジ、ピニオン ロッド、フランジなどがある。本明細書で振動可能部材と振動素子との接続また は配向を示すのに使用する「横切って固定する」という表現は、振動可能部材が 、振動素子の出す振動波が振動可能部材を横断または交差する位置に保持される ことを意味する。 一般に、本明細書で提供されるソニケータを用いてテスト試料を超音波処理す るステップは、電気エネルギーを振動エネルギーに変換するステップ、振動エネ ルギーを直接または間接的に振動可能部材に伝えるステップ、振動可能部材中に 定在音波 を形成するステップ、および試料管を定在音波に接触させるステップによって達 成される。したがって、試料管中のテスト試料は、定在音波のエネルギーを受け 、それにより超音波処理される。本明細書で教示するように超音波処理されるテ スト試料は、これらに限定されないが、全血、血清、血漿、髄液、尿、リンパ液 、腹水、涙、唾液、痰、乳など人間または動物の体液、ならびに細胞培養上澄液 などの生物学的液体を含めて、微粒子材料を含んでいるものなら何でもよい。 電気波発生器１０は、定在音波ソニケータ用のエネルギーの供給源である。電 気波発生器１０は、作動させると、波の形で電気エネルギーを出す。電気波発生 器は、当技術分野において周知であり、様々な波長、振幅、電圧、電流などを有 するように調整することができる電気エネルギー波の供給源である。一般に、電 気波発生器から出力される電気的波は、約５ＫＨｚから約８０ＫＨｚまで、より 一般的には約２０ＫＨｚから約６０ＫＨｚまでの周波数を有する。増幅器を使用 する場合、電気波発生器を増幅器に電気的に接続することによって電気的波を増 幅器に伝えることができる。 増幅器７０は、当業者に周知の方法論を使用して電気波発生 器１０に電気的に接続される。使用した場合、増幅器７０は、電気波発生器１０ から電気エネルギーを波の形で受け取る。増幅器はまた、当技術分野において周 知であり、一般に、電気的波のエネルギーを増大させるのに使用させる。本発明 によれば、電気的波のエネルギーを増大させるステップは、一般に、周波数に影 響を及ぼさないが、波の振幅を増大させる。したがって、増幅された波は、電気 波発生器１０によって生成された波と比較して増大した電圧および電流を有する 。高いエネルギー波を出力できる電気波発生器があるが、一般に、電気波発生器 からの低いエネルギー電波は、振動素子に接触する前に増幅される。 電気波発生器１０によって生成され、適用できる場合、増幅器７０によって増 幅された電波は、一般に接続およびワイヤ、または電気エネルギーを振動素子に 伝え、したがって増幅器を振動素子に電気的に接続する他の手段を介して振動素 子２０に伝えられる。 振動素子は、一般に、電気エネルギーを機械エネルギーまたは振動エネルギー に変え、振動エネルギーを振動可能部材に直接または間接的に伝えるものなら何 でもよい。圧電性物質は、一般に、電気エネルギーを機械エネルギーに変換する 能力のた めに当技術分野において周知である分極結晶材料である。圧電材料は、特定の方 向に振動波を出すことも周知である。ニオブ酸ジルコニウム鉛などセラミック圧 電材料が好ましい。 異なる「固有周波数」を有する異なる圧電材料も周知である。圧電材料固有周 波数は、圧電材料が、電気エネルギーを振動エネルギーに変換する際に最小イン ピーダンス（または抵抗）となる周波数である。抵抗を回避するために、一般に 、圧電振動素子に伝えられる電気エネルギー波の周波数は、圧電材料の固有周波 数と実質上同じであることが好ましい。具体的には、入力されるエネルギーの周 波数は、振動素子の固有周波数の数Ｈｚ以内が好ましい。したがって、振動素子 の固有周波数が４０ＫＨｚの場合、約３９．８ＫＨｚ〜約４０．２ＫＨｚ、最も 好ましくは約３９．９４〜約４０．０１ＫＨｚの周波数を有する電気エネルギー 波を発生させることが好ましい。 上述のように、本発明によれば、複数の振動素子が使用できる。複数の圧電振 動素子を使用する場合、それらが出す振動波が互いを圧縮したり、またある波ま たは他の波が出す波の効果を低減したりしないように整合しなければならない。 振動素子がスタック化されている（すなわち、互いに接触している）場 合、正極が互いに接触しかつ負極がスタックの反対側の端部のところにあるよう に振動素子の極が整合しなければならないことを当業者なら理解できよう。他方 、複数の振動素子がスタック化されておらず、互いに離間している場合、例えば 振動素子が出す波のエネルギーが最小であるシャフト上の位置において、振動素 子が互いに離間していることが好ましい。これらの位置は主として、振動素子に よって生成された波の波長に基づく。 具体的には、波の発生源と発生源から一波長の距離との間で、波は、最小エネ ルギーの三つの点を有する。図的に言えば、最小エネルギーは、波がその伝搬方 向を規定する軸を横切る点のところに現れる。波が波の方向に対して直角な軸か ら始まると仮定すると、最小エネルギー領域は、波の発生源、発生源から２分の １波長、および発生源から全波長のところに現れる。したがって、複数の振動素 子を使用する場合、振動素子は、振動素子によって生成される波の発生源のとこ ろに配置することが好ましい。これは、上述のスタック構成である。あるいは、 複数の振動素子は、同相の同じ結晶であることが好ましい。例えば、振動素子が 互いに離間している場合、それらの間隔は、ｎを任意の整数として、式ｎ＋１／ ２波長によって表される。し たがって、ある振動素子は、例えば、０．５波長、１波長、１．５波長、および ２波長などの距離において他の振動素子から離間する。あるいは、例えば、三つ の振動素子を使用する場合、一つの振動素子をシャフトに固定し、第二の振動素 子を第一の振動素子から１／２波長のところに固定し、第三の振動素子を第一の 振動素子から１波長のところに固定する。 上述のように、振動波のエネルギーはｎ＋１／２波長のところで最小になる。 しかしながら、最大エネルギー領域は、振動波がその伝搬方向を規定する軸から 最も離れた点のところに現れる。図的に言えば、波が波の方向に対して直角な軸 から始まると仮定すると、最大エネルギー領域は、波の発生源から１／４波長の ところ、および波の発生源から３／４波長のところに現れる。したがって、最大 エネルギー領域は、ｎを任意の整数として、発生源からｎ＋１／４波長のところ 、および発生源からｎ＋３／４波長のところに現れる。振動可能部材を最大量の エネルギーに当て、それによりそのようなエレメントに沿って最大量の微粒子破 壊を達成するために、振動素子からｎ＋１／４波長またはｎ＋３／４波長離れた 距離に振動可能部材を配置することが好ましい。したがって、振動可能部材は、 例えば、 振動素子から０．２５波長、０．７５波長、１．２５波長、および１．７５波長 のところに配置することが好ましい。 第１図および第２図に示される実施形態など、振動可能部材が振動素子から離 間している場合、そのような間隔を達成する手段、例えば上述のシャフトや位置 決めシースなどは、一般に、振動エネルギー波を振動可能部材に伝えるのに適し た任意の細長い部材である。一般に、この役目を果たすことができるどんな材料 でも、本発明による使用に適する。そのような材料としては、これらに限定され ないが、アルミニウム、鋼、鉄、チタン、その合金など金属がある。一般に、振 動可能部材を振動素子から離間するのに、容易に入手できるので円柱形部材が使 用される。 定在音波を生成する手段は、場合によっては振動可能部材および振動素子を含 む。なぜならば、振動可能部材に接触した際に、振動素子からの振動エネルギー により、振動可能部材中に放射される定在音波が形成されるためである。振動波 は、振動可能部材に接触したときに、振動可能部材の周縁に向かって放射され、 そのような波は電力がシステムに供給される限り放射され続ける。したがって、 振動可能部材中に複数の振動波が生 成される。これらの波は、振動可能部材の端部に到達すると反射される。したが って、振動可能部材の端部に向かって伝導される波の他に、複数の波が反対の方 向に反射される。したがって、電源を作動させた際に、複数の振動波が振動可能 部材中を前後に進行する。結局、これらの波は、集合して、振動可能部材中に平 衡波を確立する。この平衡波は「定在音波」と呼ばれる。 実際には、定在音波は、電気波発生器が作動された際に瞬時に生成される。複 数の振動波が集合して定在音波を形成する結果として、定在音波は、電気波発生 器の電波出力または振動素子によって生成された振動波と比較して高い周波数を 有する。したがって、テスト試料に接触する音波の周波数は、振動素子から発生 し、振動可能部材に接触する波の周波数よりも大きくなる。振動可能部材は、振 動素子によって放出される振動波の周波数を二倍以上にすることが分かっている 。 定在音波は、波の発生源からｎ＋１／４波長またはｎ＋３／４波長の距離のと ころで最大エネルギー領域を有する。定在音波のエネルギーを効率的に使用して 、テスト試料中に存在する微粒子材料を分裂させるために、ｎを任意の整数とし て、定在 音波の発生源からｎ＋１／４波長またはｎ＋３／４波長の距離のところで試料管 を振動可能部材に固定することが好ましい。もちろん、試料管が固定されるプレ ート上の領域は、本発明の範囲を制限するものではなく、ｎ＋１／４またはｎ＋ ３／４のガイドラインは、最適な超音波処理が行われることが分かっていること を示すものにすぎないことが理解できよう。 振動可能部材上の最大エネルギーの部位は、有限要素分析を実施することがで きるコンピュータプログラムを使用して、プレート材料の音響インピーダンス（ 材料中の音速および材料の密度の尺度）、プレートの寸法、およびプレートに接 触する波の波長を含む変数を入力し、プレート中の最小および最大エネルギー領 域を計算することによって決定することができる。そのようなプログラムは、米 国ペンシルバニア州ピッツバーグのＡｌｇｏｒ社から市販されている。 あるいは、プレート中の最小および最大エネルギーの部位は、実験によって容 易に決定することができる。具体的には、システムに電力を投入する前に、砂、 滑石、シリコンカーバイド、炭化ケイ素、またはガラスビーズなど小さい微粒子 材料を振動可能部材上に配置する。システムにエネルギーを供給すると、 微粒子材料は、最小エネルギー領域に移動する。これらの部位は、ｎを任意の整 数とし、波が振動可能部材と振動素子からの振動波との交点から始まると仮定す ると、波の発生源からｎ＋１／２波長を有する領域を表す。したがって、これら の部位間の領域は、波の発生源からｎ＋１／４波長、すなわち上述のように最大 エネルギー領域を表す。したがって、これらの領域は、試料管を固定するのに好 ましい部位である。この最大エネルギー領域を決定する方法が好ましいのは、実 際に、最大および最小エネルギー領域の正確な決定が容易に行えるためである。 第３図に、試料管をプレートの形をした振動可能部材に固定する好ましい方法 を示す。第３図は、側面図上に転移された定在音波１３０のイメージとともに振 動可能部材／プレート４０の側面図および平面図を示す。試料管をプレートに固 定するアパーチャ５０は、定在音波が最大エネルギーになる領域のところに示さ れている。アパーチャが好ましいのは、振動可能部材と試料管の接触を保証する ために、ねじ切り、テーパ化、またはその両方が行えるためである。試料管をプ レートに固定するにはアパーチャが好ましいが、弾性バンド、フック、フランジ 、クリップ、留め金、スナップなど他の手段も適する。 本発明により使用される振動可能部材の寸法は、当業者が選択するものである 。しかしながら、定在音波を形成するために、振動可能部材は、振動素子（また は振動可能部材を振動素子に取り付ける手段）よりも大きいか、または少なくと も一つの寸法がその上に張り出していなければならない。振動可能部材は、上述 のように、振動素子または取付け手段の上に、少なくとも振動素子によって生成 された波の１／２波長の距離張り出すことが好ましい。円形プレートは、好まし い振動可能部材である。なぜならば定在音波が最大エネルギーになるプレート上 の領域に、実際に試料を配置することができるからである。しかしながら、正方 形、長方形、円柱形および同様の形状も、本発明による振動可能部材として使用 するのに適する。 振動可能部材を形成するのに適した材料も、主として、定在音波を形成する材 料の能力に基づいて当業者が選択するものである。弾性材料も剛性材料も定在音 波を形成することができるが、剛性材料を使用して振動可能部材を形成した場合 、システムに入力されるエネルギーは、弾性材料を使用して振動可能部材を形成 した場合よりも大きくなる。金属、金属合金および高分子材料ならびにコポリマ ー、混合物および積層物、および高 分子材料上に金属を付着させたものがプレート材料として使用される。例えば、 そのような振動可能部材材料としては、これらに限定されないが、アルミニウム 、チタン、ステンレス鋼、ポリプロピレンやポリエチレンなどポリオレフィン、 ポリエチレンテレフタレートなどポリエステル、ポリエチレン、スチレンアクリ ロニトリル、およびアクリロニトリルブタジエンスチレンなどポリマーを含むス チレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレートやポリアクリロニトリル などアクリルポリマー、ポリ塩化ビニルやポリ塩化ビニリデンなど塩素を含むポ リマー、アセタールホモポリマーおよびコポリマー、ポリフッ化ビニリデンやポ リテトラフルオロエチレンなどフッ素を含むポリマー、ポリアミド、ポリエーテ ルエーテルケトン、ポリ硫化フェニレンやポリエーテルスルホンなどイオウを含 むポリマー、ポリウレタン、およびポリジメチルシロキサンなどケイ素を含むポ リマーがある。 本発明の好ましい実施形態によれば、フィードバック位相トラッキングループ （以後「トラッキングループ」）を使用して、定在音波ソニケータの最適な性能 を保証する。上述のように、振動可能部材は、一般に、材料の組成に応じて様々 な固有周波 数を有する圧電材料を含む。圧電材料は、この固有周波数でない周波数を有する エネルギーに接触すると、電気エネルギーの振動エネルギーへの変換に対してイ ンピーダンスまたは抵抗を示す。この変換の際に抵抗をもたらす他の要因は、プ レートに固定された試料管および試料の重量である。振動可能部材に供給される エネルギーの増大は、抵抗をもたらす要因を相殺するのを助ける。トラッキング ループは、振動素子の受ける抵抗の量を測定し、インピーダンスの増大を相殺す るように電気波発生器の周波数入力を調整するために、ワイヤや接続などによっ て、振動素子および交番電気波発生器または増幅器に動作可能に結合される。 ソニケータの動作について、第４図とともに論じる。テスト試料１４０を試料 管６０内に配置し、アパーチャ５０を使用して試料管６０を振動可能部材４０に 固定する。電気波発生器１０は、作動させると、選択された周波数および振幅を 有する波の形で電気エネルギーを発生する。次いで、この波の振幅は、増幅器７ ０を通過した後で増大する。したがって、電気的波のエネルギーが増大する。し かしながら、電気的波の周波数は変わらない。増幅された電気的波１５０は、例 えば、増幅器７０ および振動素子２０に接続されたワイヤ１６０を介して振動素子２０に伝えられ る。振動素子２０は、電気エネルギーを振動エネルギーに変換し、振動波１７０ を出す。振動波１７０は、シャフト３０に沿って振動可能部材４０に向かって伝 搬し、振動可能部材４０とシャフト３０が結合される点において振動可能部材４ ０に接触する。振動波１７０は、プレート４０を横断する定在音波１３０に変換 され、試料管６０に接触し、それによりテスト試料１４０を超音波処理する。超 音波処理が終了してから、一般に約２分後、より一般的には約１０分後に、電気 波発生器１０をオフにし、それによりシステム中を伝搬する波を消散させる。 上述のように、振動素子によって伝えられた波は、振動可能部材に接触し、定 在音波に変換される。したがって、試料管は、振動素子から直接出ない波と接触 する。というよりは、試料管には、振動可能部材によって生成され、かつ振動素 子によって生成された波と異なる波である定在音波が接触する。そのような波は 、振動可能部材によって放出される周波数よりも大きい周波数を有する。 本明細書に記載のソニケータは、例えば、テスト試料中に存 在するウイルスや細菌など細胞を超音波処理し、それにより溶解するのに使用で きる。細胞は、溶解されると、（核酸を含む）細胞内成分を周囲のテスト試料中 に放出する。周囲のテスト試料中に放出された核酸は、放出された核酸またはそ の断片を増幅し、もしあれば、増幅された生成物を検出することによって検出で きる。核酸配列を増幅し、検出する方法は、当技術 Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用すれば、本発 明に従って放出された核酸配列を増幅し、検出することができる。核酸配列を増 幅するのに使用できる例示の増幅反応には、これらに限定されないが、ヨーロッ パ特許ＥＰ−Ａ−３２０３０８号およびＥＰ−Ａ−４３９１８２号に記載のリガ ーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、および米国特許第４６８３１９５号および第４６８３ ２０２号に記載のポリメラーザ連鎖反応（ＰＣＲ）がある。 実施例 実施例で使用したソニケータは、第２図に示されるものと実質上同じである。 関数発生器（Ｐｈｉｌｉｐｓ ｍｏｄｅｌ ＰＭ１５１３２、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ 社、オランダ、エイントホ ーフェン）を使用して、正弦波を発生させ米国ペンシルバニア州ソダートンのＡ ｍｐｌｉｆｉｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製のｍｏｄｅｌ７００Ａ１増幅器によっ て増幅した。増幅器は、（米国インディアナ州レバノンのＥｔａｌｏｎ社から市 販されている）一対のドーナツ形ニオブ酸ジルコニウム鉛圧電振動素子にワイヤ および接続（Ｅｔａｌｏｎ社）を用いて接続した。振動素子は、固有周波数２９ ＫＨｚを有し、スタック化し、円形プレートに最も近い振動素子がプレートから ５５ｍｍ（λ／４波長）になるようにアルミニウムディスクでサンドイッチした 。プレートは、直径８８．９ｍｍ、厚さ３．１ｍｍを有するアルミニウムの円形 部片であった。直径６．３５ｍｍの十個の円形ねじ切り穴を、それぞれ試料プレ ートの中心から３１．７５ｍｍのところを中心として形成し、プレートの外縁の まわりに穴のリングを形成した。最初の十個の穴から同心円に、八個のねじ切り 穴の他の円を、試料プレートの中心から１９．０５ｍｍのところを中心として形 成した。プレートとシャフトが互いにネジ止めされるようにシャフトの一端およ びプレートの中心をねじ切りすることによってプレートをシャフトに固定した。 同様にしてシャフトをアルミニウムディスクに固 定した。 実施例１ 定在音波の周波数決定 細かい砂をソニケータのプレート上に散布し、電気波発生器を作動させた。増 幅器によって生成され、したがって振動素子に伝えられた波が３９ＫＨｚの周波 数および５０ワットを有するように、ソニケータの電気波発生器を設定した。電 気波発生器を作動させると、砂は、移動して、プレートの表面上に三つの同心円 を形成した。一つの砂の円は、プレートの縁と試料管ホルダの最も外側のリング との間にでき、他の砂の円は、試料管ホルダのリングの間にでき、第三の砂の円 は、プレートの中心と試料管ホルダの最も内側のリングとの間にできた。砂が移 動した領域は、定在音波が最小エネルギーを有する領域を示した。したがって、 砂の円の間のスパンは、プレート上に生成された定在音波の１／２波長を表した 。 同心円間の距離は１３ｍｍであった。したがって、全定在音波長は０．０２６ ｍであった。アルミニウム中の横方向における音速は３０４０メートル／秒であ り、アルミニウム中の縦方向における音速は６４２０メートル／秒である。波の 周波数は、 次式：周波数＝速度／波長に基づいて計算することができる。したがって、プレ ート上の定在音波の周波数は、横方向周波数について３０４０（メートル／秒） ／０．０２６（メートル）であった。したがって、横方向周波数（すなわち、定 在音波の周波数）は１１７ＫＨｚであった。したがって、試料を超音波処理する のに使用した波である定在音波の周波数は、振動素子に入力された波の周波数の 少なくとも二倍以上である。 実施例２ テスト試料の電力密度入力／体積 この実施例では、本発明のソニケータを用いた超音波処理の結果として試料が 受けるパワー／ユニット体積を計算した。この決定を行うために、水およびガラ スビーズの一定体積を超音波処理し、水およびガラスビーズの温度変化を使用し て、ミリリットル当たり供給されるパワーを決定した。 ０．５ミリリットルの水、０．１ミリリットルのガラスビーズ（直径１５０〜 ２１２マイクロメートル、製品番号１１４５、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社 、米国ミズーリ州セントルイス）をマイクロフュージタイプの１．５ミリリット ル試料管（米国ノースキャロライナ州ニュートンのＳａｒｓｔｅｄｔ社から 市販）に加えた。試料管をソニケータのプレートに固定し、その後１２０秒間超 音波処理した。超音波処理の前の水およびガラスビーズの温度は２３℃であり、 超音波処理の後の水およびガラスビーズの温度は７０℃であった。式：熱（カロ リー）＝（質量）×（Δ温度）×（熱容量Ｃｐ）に基づいて、熱のカロリーを計 算し、ジュールに変換した（１ジュール＝０．２３８８カロリー）。したがって 、水の場合、吸収されたカロリーは、合計（０．５ミリリットル）（１グラム／ ミリリットル）（４７℃）（１カロリー／℃）すなわち２３．５カロリーすなわ ち９８．２ジュールである。同様に、ガラスビーズの受けたジュールを計算する と、１１．８ジュールであった。したがって、ビーズおよび水の受けた全ジュー ルは、１１０ジュールであった。電力をシステムに送達していた時間（１２０秒 ）で割ると、水およびビーズに送達された全ワットは、０．９１７ワットであっ た。最後に、ワットを試料の量（０．５ミリリットル）で割ると、試料の受けた 電力密度は１．８３ワット／ミリリットルであることが分かった。 実施例３ 様々な電力設定および様々な周期での結核菌の超音波処理 この実施例では、本発明のソニケータを使用して、結核菌株Ｈ３７Ｒａ（Ｍｔ ｂ）から核酸を放出させた。Ｍｔｂのテスト試料を超音波処理した後、ソニケー タによって生じた細胞破壊の程度を決定するために、ＬＣＲをテスト試料のアリ コート上に走らせた。 ４×１０⁷コロニー形成ユニット（ｃｆｕ）／ミリリットルのＭｔｂの培養液 を蒸留水で４０ｃｆｕ／ミリリットルの濃度まで希釈した。次いで、２５０マイ クロリットルの希釈した培養液および１００マイクロリットルの１０ミリモルト リス（ヒ エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ８緩衝液（ＴＥ緩衝液）を１．５ミ リリットル試料管（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）内に入れた。次いで、これらの管をプレ ート中のねじ切り穴から管をねじ込むことによって試料管ホルダ内に挿入した。 試料管は、互いに対向して配置し、奇数個の管を超音波処理すべき場合、ＴＥ緩 衝液の入ったブランク管を奇数個の試料管に対向して配置した。電気波発生器お よび増幅器を周波数２９ＫＨｚにおいて動作するように設定した。さらに、デュ ーティ定格を５０％に設定した。プレートに供給されるパワー、ならびに超音波 処 理の時間を変化させた。実際のパワーおよび時間をこの実験のデータとともに表 １に示す。パワーは、トランスデューサからの反射パワーをできるだけ小さくし て０に近づけた後で、増幅器のパネルからの順方向パワーとして読みとった。様 々な試料を超音波処理した後、放出されたＤＮＡを増幅するために、３５マイク ロリットルの超音波処理した混合物を反応管に加えた。 放出されたＤＮＡは、実質上米国特許第５４２７９３０号および１９９４年５ 月１３日出願の米国特許出願第０８／２４２４０３号に記載されているギャップ 充填ＬＣＲを使用して増幅した。ターゲット配列は、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１と して本明細書に記載され、ターゲット配列を増幅するのに使用したプローブは、 ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２からＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．５．として本明細書に記載さ れている。隣接するプローブの他端には、増幅された配列の検出を容易にするた めにカルバゾールおよびアダマンタンハプテンで標識付けした。 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国イリノイ州アボットパーク）を用いて、耐カル バゾールコーティングを施した微粒子および アルカリホスファターゼに結合した耐アダマンタン抗体を使用 で測定したレート塩基信号を用いて配列の存在を示した。 下の表１にこの実験の結果を示す。表１に示すように、ソニケータは、テスト した様々なパワーおよび時間においてＭｔｂを破壊した。 実施例４ ガラスビーズを用いた超音波処理 この実施例では、実施例３で使用したのと同じ試料、手順お よびソニケータを使用した。ただし、８０マイクロリットルのガラスビーズ（直 径１５０〜２１２マイクロメートル、製品番号１１４５、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ社、米国ミズーリ州セントルイス）を超音波処理の前に試料管に加えた 。この実験のパワー出力、超音波処理時間および結果を下の表２に示す。表２に 示すように、ガラスビーズが存在する場合、ソニケータは、テストした様々なパ ワーおよび時間において細胞を破壊した。 実施例５ 定在音波ソニケータ、バスソニケータ およびビードビータの比較 この実施例では、定在音波ソニケータ、バスソニケータおよびビードビータの 、Ｍｔｂから核酸を放出させる能力を比較した。 １００マイクロリットルの３×１０⁸ｃｆｕ／ミリリットルのＭｔｂの培養液 、８０マイクロリットルのガラスビーズ（直径１５０〜２１２マイクロメートル 、製品番号１１４５、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、米国ミズーリ州セント ルイス）、および１７０マイクロリットルのＴＥ緩衝液を試料管に入れ、実施例 ３の場合と同様に定在音波ソニケータを用いて超音波処理を行った。ただし、超 音波処理は、５０ワットで５分、１０分および３０分間行った。 バス超音波処理は、Ｂｒａｎｓｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｍｏｄｅｌ Ｎ ｏ．２２００（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ社、米国コネチカット 州ダンベリ）を用いて実施した。上述の定在音波ソニケータと場合と同様に試料 を調製した。ただし、１００マイクロリットルのガラスビーズを試料管に加 えた。バスソニケータには、約１、５リットルの水を入れ、摂氏６５°（Ｃ）ま で予熱し、３０分間事前超音波処理を行った。試料管をバス中に浸し、２０分間 超音波処理を行った。 １００マイクロリットルの３×１０⁸ｃｆｕ／ミリリットルのＭｔｂの培養液 と、３００マイクロリットルのガラスビーズとを試料管中で混合することによっ てバスビータの実験を実施した。管を試料ホルダ中に装填し、ビードビータ（Ｎ ｏｕｖａｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国カリ フォルニア州オレンジ）中に挿入した。ビードビーティングを５分間行った。 超音波処理およびビードビーティングの後、溶解したＤＮＡサイズを決定する ために、様々な試料管からの溶解物に対してゲル電気泳動を実施した。アガロー スゲル（０．７％重量／体積）を走らせ、臭化エチジウムを使用してＤＮＡ染色 を行った。ゲルは、定在超音波処理がＭｔｂから核酸を放出させたことを示した 。 実施例６ 電子位相トラッキングループを使用した超音波処理 この実施例では、上述のものよりも大きい円形プレートを有 する定在音波ソニケータ、およびトラッキングループを使用して、Ｍｔｂ試料を 超音波処理した。試料プレートは、直径１２７ｍｍ、厚さ２．３８ｍｍであり、 プレートの中心から５３．７ｍｍのところに互いに実質上等距離に穿孔された二 十個のねねじ切り穴を有する。 この定在音波ソニケータのＭｔｂを超音波処理する能力を、バス超音波処理（ 実施例５の場合と同様）、ビードビーティング（実施例５の場合と同様）および 煮沸を含めて他の細胞溶解方法と比較した。すべての方法について、等しいＭｔ ｂの初期濃度（約１ｃｆｕ／ミリリットル）を用いてテストした。定在音波ソニ ケータによる超音波処理の前にＭｔｂ細胞を遠心分離器にかけ、得られたペレッ トをＴＥ緩衝液内で再懸濁した。 バス超音波処理およびビードビーティングを実施例５で説明したように実施し た。定在超音波処理は、周波数３４ＫＨｚ、パワー１００ワットにおいて５分間 行った。デューティサイクルを５０％に設定した。煮沸細胞溶解方法に従って試 料を沸騰した水の中に１５分間入れた。 溶解の後、放出された核酸を増幅し、実施例３で説明した方法で検出した。各 種の方法によって得られた結果を下の表４に 示す。表４は、定在超音波処理によって得られた結果を示し、表５は、ビードビ ーティングによって得られた結果を示し、そして表６は、バス超音波処理によっ て得られた結果を示す。煮 １２１の場合に２９２であった。 各種の表によって示されるように、定在超音波処理では、他 実施例７ 正方形プレートを用いた定在超音波処理 この実施例では、１２７ｍｍ×１２７ｍｍ×３．１８ｍｍ正方形プレートを具 備する定在音波ソニケータを使用して、Ｍｔｂを超音波処理した。プレート４０ 中にねじ切り穴５０を第５図に示されるパターンの形に穿孔した。第５図には、 プレートおよびシャフト接続１８０の部位も示されている。実施例３に記載した 試料調製、超音波処理および核酸検出の手順をこの実施例でも使用した。表７に 、このようにして超音波処理した四十個の試料について得られた結果を示す。表 ７に示すように、 正方形プレートを具備する定在音波ソニケータは、Ｍｔｂ細胞を効果的に破壊し た。 実施例８ 臨床試料の定在超音波処理 この実施例では、無発病性のＨ３７ＲａＭｔｂ菌株ではなく、Ｍｔｂに冒され ている疑いのある患者からの臨床試料を使用した。米国カリフォルニア州オレン ジのＯｒａｎｇｅ Ｃｏｕｎｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒの８３人の患 者から痰試料を得た。等しい体積の試料、および１％Ｎアセチルシステイン、２ ％水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）および１．４５％クエン酸ナトリウムを含む無 塩溶液を混合し、２０分間放置した。次いで、約４０ミリリットルのリン酸ナト リウム緩衝液（６７ミリモル）を希釈した試料に加え、その後それらを３０００ ｇにおいて１５分間遠心分離器にかけた。得られたペレットを、０．２％ウシ属 血清アルブミンを含むリン酸ナトリウム緩衝液（６７ミリモル）中に再懸濁し、 再懸濁したペレットを塩酸（ＨＣｌ）を用いて中和した。各試料の一部をＭｔｂ の細胞培養に使用し、第二の部分を抗酸性染色（ＡＦＳ）に使用し、そして第三 の部分（３７５マイクロリットル）をＬＣＲ増幅に使用した。ＬＣＲ増幅に使用 した部分を１ミリリットルのＴＥ緩衝液中で希釈し、３０００ｘｇにおいて２０ 分間遠心分離器にかけ た。得られたペレットを２５０マイクロリットルのＴＥ緩衝液中で再懸濁し、３ ０マイクロリットルのガラスビード（直径１５０〜２１２マイクロメートル、製 品番号１１４５、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、米国ミズーリ州セントルイ ス）を試料管に加え、その後それらを実施例１で使用した定在音波ソニケータの 試料ホルダ中に装填した。超音波処理したすべての試料を、パワー５０ワット、 周波数３４ＫＨｚ、デューティ定格５０％において１０分間超音波処理した。２ ５マイクロリットルの超音波処理した試料を、実施例３の場合と同様にＬＣＲを 使用して増幅し、実施例３の場合と同様に検出した。表８に、細胞培養、ＡＦＳ およびＭｔｂの検出に基づくＬＣＲを使用して、八個の試料から得られた結果を 示す。残りの試料は、すべての方法によってもＭｔｂに対して陽性であった。 ＡＦＳ指数は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｓｏｃｉｅｔｙのコン ベンション「Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｌａｓｓ ｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ」Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅ ｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．、１９９０；１４２：７２５−７３５に基づく。この指数に よれば、値「１＋」は、Ｍｔｂの存在を示し、値「２＋」は、値１＋よりも大き いＭｔｂロードを示す。このＭｔｂ検出方法によれば、四個の試料が陽性であっ た。 培養コロニーのカウントは、集密的から陰性まで及んだ。培養内の個々のコロ ニーをカウントすることができたが、それらのカウントを表８に示される範囲内 で示し、配置した。この Ｍｔｂ検出方法によれば、五個の試料が陽性であった。この方法によって陽性と 判定されたすべての試料は、Ｍｔｂによって汚染されていると判定された。マイ クロバクテリア種をＡｃｃ 社、米国カリフォルニア州サンディエゴ）によって判定した。 Ｍｔｂターゲット配列の定在音波ソニケータおよびＬＣＲ増幅は、八個の試料 がＭｔｂに対して陽性であることを示した。さらに、この方法は、培養またはＡ ＦＳによって陽性であったすべての試料中でＭｔｂを検出した。その試料がこの Ｍｔｂ検出方法によって陽性であった患者をＭｔｂ感染に対して治療し、それ以 外の患者は治療しなかった。したがって、定在音波ソニケータは、Ｍｔｂから核 酸を放出させるのに有効であった。 本発明について、特定の実施形態に関して詳細に説明したが、本発明の精神お よび範囲から逸脱することなく様々な変更および修正をそのような実施形態に加 えることができることが当業者なら理解できよう。さらに、上述のすべての特許 および文献は、参照により本明細書の一部となる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）電気波発生器と、 （ｂ）前記電気波発生器に電気的に接続された振動素子と、 （ｃ）前記振動素子に対して横切って固定された振動可能部材とを含む試料を 超音波処理する装置。 ２．前記電気波発生器および前記振動素子に電気的に接続された増幅器をさらに 含む請求の範囲第１項に記載の装置。 ３．前記電気波発生器に電気的に接続された増幅器、および前記増幅器および振 動素子に動作可能に結合されたフィードバック位相トラッキングループをさらに 含む請求の範囲第２項に記載の装置。 ４．前記振動素子上にスタック化された第二の振動素子をさらに含む請求の範囲 第１項に記載の装置。 ５．（ａ）電気エネルギー波を振動エネルギー波に変換するステップと、（ｂ） 振動可能部材中に定在音波を発生させるために前記振動可能部材を振動エネルギ ー波に接触させるステップと、（ｃ）テスト試料を前記定在音波に接触させるス テップとを含む超音波処理の方法。 ６．前記振動可能部材が円形プレートである請求の範囲第５項に記載の方法。 ７．前記定在音波が約１００ＫＨｚよりも大きい周波数を有する請求の範囲第５ 項に記載の方法。 ８．振動エネルギーをシャフトを介して振動可能部材に伝搬させ、それにより前 記振動可能部材中に定在音波を発生させるステップを含む定在音波を生成する方 法。 ９．微粒子材料を前記定在音波に当てるステップをさらに含む請求の範囲第８項 に記載の方法。