JPH10511340A

JPH10511340A - ゲル生成ポリペプチド誘導体

Info

Publication number: JPH10511340A
Application number: JP7521421A
Authority: JP
Inventors: ベグナース，ローランズ; エー．ジャンメイ，ポール
Original assignee: ブリガムアンドウィメンズホスピタル
Priority date: 1995-02-09
Filing date: 1995-02-09
Publication date: 1998-11-04
Also published as: AU1919595A; WO1995021622A1; US5955434A

Abstract

(57)【要約】本発明は、水中及び種々の有機溶媒中でゲルを生成し、その代表的総合的式が（Ｉ）式中、Ｒ¹がCH₃，CH₂−CH(CH₃)₃，CH(CH₃)CH₂CH₃であり、Ｒ²がＨ，CH₃，CH₂OH，(CH₂)_n−COOH，(CH₂)₄−NH−CO−OCH₂C₆H₅であり、Ｒ³がジペプチド残基であり、ｍが０又は１であり、ｎが１又は２であるか；あるいは（II）式中、Ｒ¹がCH₃，CH₂−CH(CH₃)₂又はCH(CH₃)CH₂CH₃であり、Ｒ²がCH₂−CH(CH₃)₂であり、Ｒ³がＨ，CH₃，CH₂OH,（CH₂）_n−COOH又は(CH₂)₄−NH−CO−OCH₂C₆H₅であり、Ｒ⁴がトリペプチド残基であり、ｍが０又は１であり、ｎが１又は２であるＮ末端Fmoc保護化ペプチドの組合せに関する。これらの型のペプチドは水性溶液中でゲルを生成し、生物学的に適合性で、ドラッグデリバリー、抗原デリバリーに有用で、食物腐敗を遅らせるための食品添加剤として有用で、充填剤として作用する。

Description

【発明の詳細な説明】ゲル生成ポリペプチド誘導体産業上の利用分野本発明は、水又は有機溶媒中でゲルを生成する一連の化学合成低分子量ペプチド、並びにそのように生成されるゲルを包含する。これらのゲルの分子構造は、研究、医学、化粧品及び食品の用途に用いるための新規な物質、立体触媒基質及びミセル調製物として利用し得る。本発明の背景生体適合性物質により生成されるゲルは、医学及び産業に多数の用途を有するが、しかしゲルを生成するのに高分子量化合物、高濃度のポリマー又は有機溶媒を必要とするために限定されていた。水性溶液中で低濃度の単純ポリマーを生成するゲルを合成するのが望ましいと考えられた。ゲルは、溶媒分子をトラップする分子集合体の連続的な網状組織で構成される。ゲル相は、凝集を生じるためにこれらの小分子間の立体化学的対応を必要とする。肉眼的ゲルを生成する低分子は、線状集合体、ミセル及びその他の構造を含めた種々の顕微鏡的充填によりそうし得る。ゲルの機械的弾性に関与する成分は弱い非共有結合によってつなぎ合わされて、多数の化粧用又は治療用のペースト又はスプレッドに適した機械的特性を有する物質を生成する。水中でゲルを生成する、ゼチラン及びデンプンのような高分子量網状組織系も十分説明されている。これらのゲルは、高分子を水と混合し、加熱して冷却すると生じる。ゲルを生成するがしかし主に有毒有機溶媒中である低分子量化合物のいくつかの例がある。例えば長脂肪族鎖を有する有機酸、部分的フッ素化ｎ−アルカン、コレステロール誘導体、オキシアントラセン誘導体、及びHanabusa，K.，et al. ，J．Chem．Soc．Chem．Commun．4，390-392（1993）により考察されたようなその他のものを含めたこのような化合物の化学構造は様々である。ゲルを生成する低分子量化合物としては、アミノ酸及びペプチド誘導体がある。油中及びその他の有機溶媒中でゲルを生成する脂肪酸及び高級アルコールを含有するアミノ酸エステル及びアミドの構造は、Saito T.等に対する特許（日本国特許第50022801号（1975）及び米国特許第 3,969,087号(1976)）に既に記載されている。 Hanabusa K.，et al.，J．Chem．Soc.，Chem．Commun.(18)1371-1373(1992)は、アラニン誘導体Ｎ−ベンジル−オキシカルボニルＬ−アラニン４−ヘキサデカノイル２−ニトロフェニルエステルがメタノール及びシクロヘキサン中で１％以下の濃度で熱可逆性ゲルを生成することを開示している。同様に、Hanabusa K.，et al.，J．Chem．Soc.，Chem．Commun．4，390-392（1993）は、Ｎ−ベンジル−オキシカルボニルＬ−バリル−バリンｎ−オクタデシルアミドがいくつかの有機液体中でゲルを作ることを開示している。式（X− X′−OCH₂CH₂COO）_n（式中、Ｘ及びＸ′はバリン又はイソロイシン誘導体である）を有するデプシペプチドは、De Vries E．J.，et al.，J．Chem．S oc.，Chem．Commun．（3）238-240（1993）で考察されているように塩化メチレン、アセトニトリル、エチルアセテート及びアセトンのような溶媒により熱安定性ゲルを生じる。 Ihara M.，et al.，J．Chem．Soc.，Chem．Commun．（17）1244-1 245（1992）は、両カルボキシル基がＮ−ドデシルアミド基により誘導され、温ベンゼンに溶解するが、冷却するとこれらの混合物がゲルを生成するベンジルオキシカルボニルβ−アラニングルタメート誘導体に関する。注目すべきことには、水中でゲルを生成する低分子量化合物はそれほど一般的でない。これらの例としては合成糖脂質Ｎ−オクチル−Ｄ−グルコンアミドが挙げられるが、これは水溶液中で長時間加熱すると、一部加水分解する。 Jayakumar A.，et al.，J．Chem．Soc.，Chem．Commun．（10）853-855（1993 ）において、ｔ−ブトキシカルボニル−バリル−バリル−イソロイシンメチルエステルがクロロホルム中でミセルを生成することも注目に値する。このペプチドの臨界ミセル濃度は 2.5mMである。 Kalopissis G.，et al.,の仏国特許第 1,397,231号（1965）は、アミノ酸基が脂肪酸によりアシル化され、アミド基がアルキル化されるアスパラギン誘導体を開示する。これらの誘導体は、約３％の濃度で水中でゲルを生成する。 Mandal，A．B．and Jayakumar，J.，J．Chem．Soc.，Chem．Commun．3，237-2 38（1993）は、トリフルオロアセテート／水混合物中に希釈されたテトラペプチド Tyr-Gly-Phe-Ala ベンジルエステルがミセルを生成することを示している。 Weitzherg M.，et al.，PCT 国際特許出願90 15,602（1990）及びBurch R．M.， et al.，Proc Natl．Acad．Sci.，USA，88（2）355-359（1991）は、いくつかの９−フルオレニルメトキシカルボニル−（Fmoc−）アミノ酸誘導体が免疫反応を調節することを示しているが、一方Noronha-Blob L.，et al.，Rur．J．Pharmac ol.，199（3）387-388（1991）もこれらの誘導体が内毒性ショックを低減する能力を有することを示している。水性非毒性溶液中で安定である低濃度の低分子量化合物から迅速且つ安価にゲルを生成する能力が、最近のゲル生成系に欠けていることは注目に値する。このようなゲルは、医学及び産業に多数の用途を有すると考えられる。本発明の要約安価で且つ迅速に生成される生物学的適合性のゲル化物質を提供することが、本発明の目的である。これは、本明細書に示した新規に開発されたＮ末端Fmoc保護化ジペプチド又はトリペプチド化合物シリーズを用いることにより達成し得る。水性溶液中に入れると、個々のジペプチド又はトリペプチド分子は他の溶質を封入し得る棒状ミセルを生成するように集合する。同様に、成形ミセルは大型ペプチド誘導体の溶液中に観察されたが、Mandal．A．B．and Jayakumar，J.，J． Chem．Soc.，Chem．Commun．3．237-238（1993）及びHanabusa K.，et al.，J． Chem．Soc.，Chem．Commun．4，390-392（1993）に考察されているように、有機溶媒中だけであった。本発明の別の目的は、小型疎水性又は両親媒性治療分子のための新規の供給システムを提供することである。これらの薬剤は分子量が約 100Da〜約5000Daの範囲である。本発明は局所的又は循環性治療薬と相溶性である。多数の薬剤が、リポソームベースのベクターを用いて目下供給されていて、これは生成に経費がかかり、作製するのが難しい。本発明のさらに別の目的は、慣用的架橋及びアジュバントの非存在下でそれらの免疫刺激能力を増強する注射抗原用のビヒクルを提供することである。本明細書に記載のジペプチド又はトリペプチド化合物を用いた安定な水性ゲルは、例えば水分喪失を遅くすることにより食物腐敗を遅らせるための食品添加剤として、食品濃化剤として、イオン交換クロマトグラフィーによるタンパク質の精製において、血清からの抗体のアフィニティー精製において、並びに化粧品用の属性のあるクリームベースとして用い得る。図面の要約図１は、ねじり振り子を用いた流動学的測定から得られた部分的保護化ジペプチドFmoc-L-Leu-L-Asp（表２の化合物５）の溶液の特徴的振動運動を示す。この曲線から、剪断弾性率Ｇ′を算出する。図２は、ペプチド濃度に及ぼすＧ′の依存関係を示す。図４は、化合物５ゲルに関する温度に及ぼす光散乱強度の依存関係を示す。実験パラメーター： 633nm光、散乱角90°、化合物５濃度、10mM Tris 緩衝液、pH 7.4中に37mg／ml。図５は、水の蒸発に及ぼす化合物５及びゼラチンの作用を示す。図６Ａは、20℃（丸）及び60℃（三角）で測定した10mM Tris pH 7.0中の種々の濃度のFmoc-Leu-Aspの光散乱強度を示す。図６Ｂは、60℃で10mM Tris pH 7.0中の２mg／mlのFmoc-Leu-Aspの貯蔵（黒三角）及び損失剪断弾性率（白三角）を示す。図６Ｃは、60℃（三角）及び20℃（丸）での振動（frequency）の範囲の１％最大ひずみでの剪断貯蔵弾性率Ｇ′（中黒）及び剪断損失弾性率Ｇ″（中白）の測定値を示す。図６Ｄは、１ラジアン／秒の振動で種々の最大剪断ひずみでのＧ′及びＧ″の測定値を示す。その他の実験条件及び記号は図６Ｃと同様である。図７は、0.02重量分画ローダミン-Leu-Aspを含有する10mM Tris pH 7.0中の４ mg／ml Fmoc-Leu-Asp の同焦点走査顕微鏡写真である。図８Ａ及びＢは、Fmoc-Leu-Aspを用いた塩酸５−メチル１−アダマンタンアミン−３−カルボン酸に対する抗体の発現を示す。本発明の詳細な説明本発明は、水及び種々の有機溶媒中でゲルを生成し、そのジペプチドの具体例の代表的全体式が：（式中、Ｒ１はCH₃，CH₂−CH(CH₃)₂又はCH(CH₃)CH₂CH₃であり；Ｒ２はＨ，CH₃，CH₂OH，(CH₂)_n−COOH又は(CH₂)₄−NH-CO−OCH₂C₆H₅であり；Ｒ３はジペプチド残基であり；ｍは０又は１であり；そしてｎは１又は２である）であるＮ末端Fmoc−保護化ペプチド組合せに関する。この種のペプチドは１重量％未満の濃度で水中でゲルを生成し、少なくとも10 ℃〜60℃で安定である。ゲルはペプチド濃度２〜４mg／mlで 100Paのオーダーの弾性率を有し、糸状タンパク質により形成される弾性網状組織を特徴とする。Fm oc-Leu-Aspゲルが生じる濃度は、Janmey P．A．et al.，Biochemistry 27，8218 -8227(1988)に示されているように公知の最も有効なゲル化剤の範囲内であって、高度延長構造が生じなければならないことを意味する。図７に示したように、微量のローダミン-Leu-AspをFmoc-Leu-Aspゲル中に混入することにより、10ミクロンの長さの細い棒状フィラメントが見えるようになる。図７は、Zeise 倒立顕微鏡に取り付けたBioRad MRC 600同焦点画像形成システムにより得られた0.02重量分画ローダミン-Leu-Aspを含有する10mM Tris pH 7 .0中の４mg／ml Fmoc-Leu-Asp の同焦点走査顕微鏡写真である。これに対比して、ゼラチン溶液はこのような低濃度ではゾルのままで、匹敵する剪断弾性率を有する最低濃度の他の合成ポリマーゲルは少なくともそれより高い大きさのオーダーである。この種のペプチドの個々の例としては、ジエチルエーテル、炭化水素及びそれらの混合物のような有機溶媒中でゲルを生成するものが挙げられる。本発明で特に興味深いものは、Fmoc-Leu-Aspにより生成されるゲルである。図６Ａに示したように、１mg／ml〜 1.5mg／mlの濃度で、Fmoc-Leu-Aspの溶液は20 ℃及び60℃の両方で光散乱の突然の増大を蒙る。この場合、直径１cmの円筒形セル中の１ml溶液を633nm 10mWレーザーを用いたBrookhaven Instruments BI30ATN 装置で測定した。２mg／mlジペプチドの溶液を100℃から60℃に冷却すると、低ひずみ振動測定によりゲルの粘弾性パラメーター特性が得られる。物質の弾性強度の測定値である貯蔵剪断貯蔵弾性率Ｇ′は、数分以内に80paの安定レベルに達する（図６Ｂ）。これらの測定は、Rheometrics RFSII 機器を用いて実施した。最大剪断ひずみは、１ラジアン／秒の振動での振動変角に関しては１％であった。この値は、Ferry，J．D.，Ann．NY Acad．Sci．408，1-10（1983）に示されているようなフィブリン、又はJanmey P．A．et al.，Biochemistry 27，8218-822 7（1988）に示されているようなＦ−アクチンといった最強生体高分子ゲルの値に匹敵する。これに対比して、ゼラチン溶液はこの濃度ではゾルのままで、匹敵する剪断弾性率を有する最低濃度の他の合成ポリマーゲルは少なくともそれより高い大きさのオーダーである。剪断貯蔵弾性率Ｇ′は 0.1〜100 ラジアン／秒の振動にわずかに依っており、剪断損失弾性率Ｇ″よりはるかに大きい（図６Ｃ）。さらにそれは温度に対して非感受性で、これはジペプチドゲル中で形成された構造が生理学的有意味な範囲で熱安定性であることを示唆する。しかしながら、図６Ｄに示すように、剪断弾性率は剪断変角の大きさに強く依っている。ゲルは最小測定可能ひずみ（0.3％）で歪み弱化しているが、しかしＧ′は＞Ｇ″のままであり、試料が10％に歪まされると両弾性率は100のうちの一因子により低下する。この意味で、Fmoc-Leu- Aspゲルは、ともに10％でひずみ硬化とその後の破壊、及びそれより大きなひずみでの弱化を示すBale，M．D．& Perry，J．D.，Thromb Res.，52,565-72（1988 ）に示されているフィブリンと、又はJanmey P．A．etal.，Biochemistry 27，8 218-8227（1988）に示されているようなＦ−アクチンとは異なる。ゲル生成ペプチドの構造特異性を表１に要約する。対応するFmoc−アミノ酸−Ｏ−スクシニミジルエステルとアミノ酸のナトリウム塩又はそれらの誘導体とを反応させて、表１に記載した部分的保護化ジペプチドFmoc-Leu-Asp及びその類似体を60〜80％の収率で合成した。反応は水性DMF 中で実施し、アセトニトリル／水勾配中でのHPLCによりペプチドを精製した。ペプチド化学業界で十分公知のいくつかの方法のいずれかにより、本発明のさらに別のペプチド変異体を合成し得る。下記の表２の化合物１のために用いられるこれらの方法の１つを以下に示す；ジメチルホルムアミド（DMF）中でのカルボジイミド法によりＮ−保護化アミノ酸及びＮ−ヒドロキシスクシンアミドから、Ｎ−保護化アミノ酸Ｎ−ヒドロキシスクシンアミドエステルを生成する。エステルを水性KOH 溶液中で別のアミノ酸と結合させる。２〜３時間後、実施例１に記載されているように、活性化エステルを反応させ、反応生成物を分離する。その他の種類の活性化エステルを用いてもよいし、アミノ酸カルボキシル基の他の遮断剤を用い得るし、並びにその他の溶媒を用い得る。ここに略記し、実施例で詳細に説明しているいくつかの方法により、合成化合物の水性ゲルを製造し得る。１．微粉砕ジペプチド又はトリペプチド化合物を沸騰水中に懸濁し、混合物を短時間、激しく混合又は振盪して、放置し、冷却する。50〜60℃でゲル化が起きる。この手順を反復して、さらに均質な混合物及び強力なゲルを生成し得る。２．ジペプチド又はトリペプチド化合物を水と混和性の最小容量の有機溶媒中に溶解し、室温で小容量の溶液を大容量の水に加えて、迅速に混合すると、その後ゲルが生成する。３．方法１及び２を組合せてもよい。ゲル生成に必要なFmoc−保護化ジペプチド又はトリペプチドの量は、0.1〜５重量％であ。ゲルに混入する化合物の量は、通常は１％を超えないし、製造方法及び混合物中の他の添加剤に依る。特定の生物学的作用を有するゲルを生成するために、薬剤又は抗原のような他の溶質を含有する個々の水性懸濁液、溶液及び乳濁液中でゲルを生成する。下記の実施例４は、ホウ酸含有ゲルを記載する。同様に、サリチル酸、硫黄化合物、治療物質の懸濁液をゲルに混入し得る。特に興味深いもののうち、表２の化合物５が70％グリセロールの溶液中でゲルを生成することは注目に値する。ゼラチンペプチドも水性溶液の氷点に影響を及ぼす。種々の製剤及びその他の化合物の活性を増強するために、これらを物理的及び化学的にゲル中に混入し得る。免疫学的に活性な物質をゲル化ペプチドと共有結合させると、それらはより活発な抗原となり、大型ポリ陰イオンの免疫刺激能力が活用されて固有の抗原性をほとんど又は全く有さない低分子量分子に対する抗体を産生する。抗ウイルス薬アダマントアミンに対するウサギにおける抗体産生は、BSA と共有結合されて慣用的方法によりアジュバントとともに注射された場合と、付加的アジュバントなしでFmoc-Leu-Aspゲル中でトラップされた場合に少なくとも同様に有効に進行する。さらに、非常に水に溶けやすい化合物を結合すると、それらは低溶解性及び多価となり、それによりそれらの薬物動態が変えられる。調製された水性ゲルは匹敵量のゼラチン及びデンプンよりゆっくりと乾燥する（下記実施例５）ので、したがって化粧品、医薬及び食品クリーム組成物に新規の用途を有する。化合物５ゲルの粘弾性特性の試験を、図１，２，４及び６に要約する。ねじり振り子を用いた自由振動により、剪断弾性率を測定した。本方法の理論及び説明は、Plazek D.，Vrancke.，Berge J.，T rans．Soc．Rheol．2．39-47(1958)：Ferry J．Viscoelastic Properties of Po lymers，Wiley New York（1980）及びJanmey P.，et al.，J．Rheol．27，135-1 53（1993）に記載されている。Tris緩衝液 pH7.4を用いて方法１により、ゲルを生成する。図１のペプチド濃度は、2.5mg／ml （0.25％）である。これらのデータから得られた剪断弾性率は 3.1Paである。これは、このゲルの中等度に高い弾性強度を表す。弾性率は、ペプチド濃度に依る（図２）。2.5mg／mlから５mg／mlに濃度を漸増すると、弾性率が強力に増大する。５mg／mlはほぼ飽和濃度である。ペプチド濃度及び温度との化合物５溶液の光散乱強度の依存関係を図４及び６Ａに示す。本発明の別の具体例は、上記と類似したＮ末端Fmoc−保護化ペプチドの組合せに関する。しかしながら、この別の具体例は３つのペプチドからなり、一般式：（式中、Ｒ１はCH₃，CH₂−CH(CH₃)₂又はCH(CH₃)CH₂CH₃であり；Ｒ２はCH₂-CH(CH₃)₂であり；Ｒ３はＨ，CH₃，CH₂OH，（CH₂）_n−COOH又は（CH₂）₄−NH−CO−OCH₂C₆H₅であり；Ｒ４はトリペプチド残基であり；ｍは０又は１であり；そしてｎは１又は２である）で表される。特に興味深いのは、Fmoc-Leu-Leu-Asp化合物である。この化合物は、約１％の酸の水性溶液中でゲル化する。このペプチドとのゲル生成のための好ましい酸溶液は、約１％の酢酸水溶液である。酸の不存在下では、ペプチドは集合体及び極弱性ゲルを生成するが、しかし酸を付加すると弾性は強力に増大される。この特徴は、酸性環境中で液体が固化するのに望ましい用途に利用し得る。例えば、このペプチドと胃に供給されるべき物質との水性混合物を液体形態で経口摂取し、胃の酸性環境中に到着すると混合物はゲルに固化する。酸性環境要件以外では、この種のペプチドは上記の方法にしたがってゲルを製造するために用い得る。以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の一般的特徴及び用途はそれらに限定されない。実施例実施例１．Ｎ保護化ペプチドの合成使用したアミノ酸は、グリシン及びｂ−アラニン以外は、Ｌ−配置であった。Ｎ保護化アミノ酸（５mmol）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（５mmol）を、室温で又は45℃以下で静かに加熱しながら、最小量のDMF(８ml）中に溶解した。０℃でDMF に溶解したＮ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジミド（5.5mmol）４mlを加えた。混合物を、定期的にかき混ぜながら室温で１時間保持した。濾過して沈澱物を取り出し、Ｃ末端アミノ酸又はペプチド（10mmol）を２Ｎ KOH の溶液から加えた。反応混合物を室温で２時間激しく攪拌した。大量(100〜200ml)の水を漸次加えて、６Ｎ HCL で溶液をpH 2.0〜3.0 に酸性化した。特定の調製により、沈澱物、ゲル又は油を生じた。収率50〜80％の生成物を、下記の方法の一つにより単離した。沈澱物を軽度の真空中でガラスフィルターにより濾過し、水ですすいで、真空下で脱水し、必要な場合には、エチルアセテート／石油エーテルから再沈澱させた。ゲルを同様に処理したが、但し、適切なサイズ（30cm）のガラスフィルターを用いた。油をエチルアセテートに取った。エチルアセテート相を水で数回洗浄し、Na₂S O₂で乾燥させ、真空蒸発させた。残余物を結晶化又は再沈澱させた。実施例２．水性ゲルの調製水10mlを沸騰させて、その中に表２の 0.8％の微粉砕化合物５を懸濁した。懸濁液を激しく振盪又は攪拌後、10〜15分放置した。冷却すると、溶液は50〜60℃ で濁ってきて、室温でゲルが生じた。ゲルを再加熱し、攪拌して、再冷却した。数回繰り返すと、しっかりしたゲルが生じた。化合物５は 0.8％以下で可溶性であった。0.4％以下の濃度では、ほとんど又は全くゲルは生成しなかった。このような溶液を蒸発させて容積を50％にし、加熱して冷却すると、ゲルが生成した。実施例３．エチルエーテル中でのゲルの調製 10mlの沸騰ジエチルエーテル中に表２の微粉砕化合物５を 150〜200mg 懸濁した。懸濁液を振盪し、濾過して、−５℃で30〜60分間放置した。冷却するとゲルが生成した。ゲルを計算し、溶媒を一定重量に真空蒸発させて、ペプチド濃度を測定した。この方法では、溶質濃度は１〜 1.2％であることが判明した。実施例４．化合物５及びホウ酸のゲル 0.8％化合物５を沸騰水中の 3.5％ホウ酸に加え、振盪した。冷却すると、ゲルが生じた。ゲルをガラス板上に１〜２mmの厚さに塗り付けた。水を蒸発させると、ホウ酸を含有する均一な薄膜が生じた。実施例５．ゲル脱水 0.5〜0.6 ％又は 0.8％の化合物５、ゼラチン又はデンプンを含有するゲルを90℃で水に溶解し、短時間冷却した。溶液(0.8ml)をプラスチック製浅皿（内径17mm）に注ぎ入れた。室温に冷えたら、皿を計量し、真空にせずに乾燥剤とともに放置して、脱水した。化合物５のみが、冷却時にゲルを生成した。15時間後、化合物５ゲルはその水分の57％を失ったが、ゼラチン及びデンプン溶液はそれぞれそれらの水分の70％及び87％を失った。化合物５及びゼラチンの作用を図５に示す。ゼラチンは水の蒸発を遅らせた場合、化合物５より効果が低かった。実施例６．抗原性剤のゲル中への取込み及び免疫反応の刺激本実施例の考察に際して、以下の略語を用いた： Ada2Me：塩酸３，５−ジメチル−１−アダマンタンアミン、 AdaMeC：塩酸５−メチル−１−アダマンタンアミン３−カルボン酸、 AdaMeC-BSA：ウシ血清アルブミンの抱合体及びカルボジイミド法により調製したAdaMeC、 AdaMeC-Bal-BSA：ウシ血清アルブミンの抱合体及び遊離アミノ基を有するAdaMeC−（βアラニン）。低分子量薬剤塩酸３，５−ジメチル−１−アダマンタンアミン（Ada2Me）及び５−メチル− １−アダマンタンアミン３−カルボン酸（AdaMeC）も、それぞれ１mM及び33mMの濃度でFmoc-Leu-Aspゲル（10mg／ml＝21mM）中に混入し得る。さらに高い総濃度 (＞５mM Ada2Me 又は＞33mM AdaMeC)で、これらの薬剤はゲル化を阻害した。リン酸塩緩衝食塩水に溶解したAdaMeCを含有するFmoc-Leu-Aspゲルをアジュバントを加えずにウサギに注射すると、この薬剤に対する抗体を産生して、等容量の完全フロイントアジュバントに溶解したAdaMeC-BSA抱合体で免疫化した動物の場合と同じか又はそれより高い力価を有する抗血清を生じた（図８）。抗体測定の３方法、即ちアガロースゲル中での二重拡散法、逆放射拡散法及び受身血球凝集法から匹敵する結果を得た。単独で注射した場合、Ada2Me（５mM）もAdaMeC（33mM ）も特異的抗体を産生しなかった。Fmoc-Leu-Asp単独は、１：４以下の力価を有する抗体を産生した。雌無作為交配ウサギを１週間間隔で３回免疫化して、24日目に交配させた。最初の２回の免疫化には完全用量を用い、３回目の免疫化には完全用量の半量を用いた。完全用量のBSA 抱合体は総タンパク質 100μｇであった。注射前に、AdaM eC-BSA及びAdaMeC-Bal-BSA溶液を等容量の完全フロイントアジュバントで希釈したが、AdaMeC＋ジペプチドゲルは等容量の0.01Ｍリン酸塩緩衝液 pH7.4で希釈した。Oudin．J．Meth．Enzymol.，70，166-98（1980）に記載されているように、２つの免疫沈降検定法、即ちアガロースゲル中での二重拡散法及び逆放射免疫拡散法により、免疫血清を分析した。図８Ａに示したように、アガロース中での二重拡散法を用いて、完全フロイントアジュバント中のBSA とβアラニン(Bal)スペーサーを伴って又は伴わずに結合した又はしないAdaMeCで、あるいはアジュバントを用いずにFmoc-Leu-Aspと混合したAdaMeCで免疫化されたウサギの血清中の AdaMeC含有抱合体を認識する抗体の力価を測定した。３つの免疫原の各々に対して抗血清を試験し、AdaMeC又はFmoc-Leu-Asp単独を注射したウサギの血清と比較した。図８Ｂに示すように、Adler．F．L．& Adler．L．T.，Meth Enzymol.，70 ，455-66（1980）に記載されているような受身血球凝集試験を用いて、３つのAd aMeC抱合体、AdaMeC単独又はAda2Meで試験後に３つのAdaMeC抱合体の各々で免疫化したウサギの抗血清を分析した。最初の２つの検定では、固相は、0.8％塩化ナトリウムを含有する１％アガロースであった。試料容量は25μｌであった。プローブを37℃で72時間インキュベートした。アガロースゲル中での二重拡散法では、等平衝濃度を含む20μｇ／ml〜1000μｇ／mlの濃度で、抗原を中央ウエルに入れ、抗血清を周囲ウエルに入れた。逆放射免疫拡散法では、Ada2 Me又はAdaMeCを20μｇ／ml〜200μｇ／mlの濃度でアガロースと混合し、抗血清を種々の濃度でウエル中に入れた。対照実験では、非免疫化動物の血清を用いた。受身血球凝集反応では、ヒツジ赤血球の 0.5％懸濁液を７つの調製物：即ち２つのBSA 抱合体(AdaMeC-BSA，AdaMeC-Bal-BSA)，BSA単独、Ada2Me＋ジペプチドゲル、ジペプチドゲル単独、及びAda2Me又はAdaMeC単独で処理した。BSA 調製物中のタンパク質濃度は１mg／mlであった。ジペプチドゲル調製物の場合、0.5ml のゲルを 4.5mlのヒツジ赤血球SRBC懸濁液と混合した。Ada2Meは 200mg／mlの濃度で用いた。混合物を20℃で１時間インキュベートし、未吸着抗原を遠心分離で除去し、SRBCを洗浄した。50μｌの試料をトレイのウエル中に入れた。抗血清及び精製抗体を、１：100 から出発して、１／２の工程で、0.01Ｍリン酸塩緩衝食塩水 pH7.4で希釈した。未処理SRBC、血清及び非免疫化動物からの抗体を対照実験に用いた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ // Ａ２３Ｌ 3/3526 ５０１Ａ２３Ｌ 3/3526 ５０１ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ【要約の続き】Ｎ末端Fmoc保護化ペプチドの組合せに関する。これらの型のペプチドは水性溶液中でゲルを生成し、生物学的に適合性で、ドラッグデリバリー、抗原デリバリーに有用で、食物腐敗を遅らせるための食品添加剤として有用で、充填剤として作用する。

Claims

【特許請求の範囲】１．一般式：（式中、Ｒ１はCH₃，CH₂−CH(CH₃)₂又はCH(CH₃)CH₂CH₃から成る群から選択され；Ｒ２はＨ，CH₃，CH₂OH，(CH₂)_n−COOH又は(CH₂)₄−NH−CO−OCH₂C₆H₅から成る群から選択され；Ｒ３はジペプチド残基であり；ｍは０又は１であり；そしてｎは１又は２である）のF-moc 誘導体化陰イオン性ジペプチド。２．Ｒ２が CH₂−COOHである請求項１記載のジペプチド。３．Ｒ１が CH₂−CH(CH₃)₂である請求項１記載のジペプチド。４．ＲがCH₃である請求項２記載のジペプチド。５．Ｒ２がCH(CH₃)CH₂CH₃である請求項２記載のジペプチド。６．水及び請求項１記載の 0.1重量％〜 5.0重量％のジペプチドを含んで成る水性ゲル。７．水及び請求項１記載の 0.1重量％〜 1.0重量％のジペプチドを含んで成る水性ゲル。８．水及び請求項３記載の 0.1重量％〜 1.0重量％のジペプチドを含んで成る水性ゲル。９．水及び請求項４記載の 0.1重量％〜 1.0重量％のジペプチドを含んで成る水性ゲル。 10．水及び請求項５記載の 0.1重量％〜 1.0重量％のジペプチドを含んで成る水性ゲル。 11．さらに抗原を含んで成る請求項８記載の水性ゲル。 12．さらに低分子量薬剤を含んで成る請求項８記載の水性ゲル。 13．低分子量薬剤が塩酸３，５−ジメチル−１−アダマンタンアミン又は５− メチル−１−アダマンタンアミン３−カルボン酸から成る群から選択される請求項12記載の水性ゲル。 14．一般式：（式中、Ｒ１はCH₃，CH₂−CH(CH₃)₂又はCH(CH₃)CH₂CH₃から成る群から選択され；Ｒ２はCH₂CH(CH₃)₂であり；Ｒ３はＨ，CH₃，CH₂OH，（CH₂）_n−COOH又は(CH₂)₄−NH−CO−OCH₂C₆H₅から成る群から選択され；Ｒ４はトリペプチド残基であり；ｍは０又は１であり；そしてｎは１又は２である）のF-moc 誘導体化陰イオン性トリペプチド。 15．Ｒ３が CH₂−COOHである請求項１記載のトリペプチド。 16．Ｒ１が CH₂CH(CH₃)₂である請求項２記載のトリペプチド。 17．水、 0.1％〜 2.0％の酢酸及び請求項16記載の 0.1重量％〜 5.0重量％のトリペプチドを含んで成る水性ゲル。 18．水、 0.1％〜 2.0％の酢酸及び請求項16記載の 0.1重量％〜 1.0重量％のトリペプチドを含んで成る水性ゲル。