JPH10511541A

JPH10511541A - Ｔ細胞応答を調節するための方法および組成物

Info

Publication number: JPH10511541A
Application number: JP8508689A
Authority: JP
Inventors: イー．サーカーズ，エリ; クマー，ヴィピン
Original assignee: ザリージェンツオブザユニバーシティーオブカリフォルニア
Priority date: 1994-08-26
Filing date: 1994-08-26
Publication date: 1998-11-10
Also published as: WO1996006630A1

Abstract

(57)【要約】Ｔ細胞調節ペプチド、そのようなペプチドの同定方法、およびそれらの使用方法が本発明において提供される。一つの実施態様においては、インターフェロンγ分泌Ｔｈ１細胞を刺激し、かつ高いＭＨＣ結合親和性を有する、特異的抗原に対するＴ細胞調節ペプチドが同定される：これらの調節ペプチドは、例えば、アレルギー性疾患を調節するために患者に投与することができる。別の実施態様においては、ＩＬ−４分泌Ｔｈ２細胞を刺激し、かつ低いＭＨＣ結合親和性を有する、特異的抗原に対するＴ細胞調節ペプチドが同定される：これらの調節ペプチドは、例えば、自己免疫性疾患を調節するために患者に投与することができる。

Description

【発明の詳細な説明】Ｔ細胞応答を調節するための方法および組成物発明の背景１．発明の分野本発明は一般にＴ細胞応答並びに詳しくは特定抗原に対するTh1 およびTh2 応答を調節するための方法および組成物に関する。２．関連技術の説明免疫応答は或る状況下でしばしば有益として見られるが、抗原に対する免疫応答は実際には免疫応答が起こる動物に有害であり得る。免疫応答は宿主が重度の病的後遺症にかかる症状を生じる例は、エリテマトーデスの如き自己免疫疾患である。エリテマトーデスでは、宿主の甲状腺、赤血球、ＤＮＡ、および血小板中の決定因子と反応する抗体がしばしば存在する。それ故、自己免疫疾患について、免疫応答を抑制することが従来望ましかった。免疫応答の抑制が所望される別の例はアレルギーの治療である。アレルゲンの IgE 抗体は枯草熱を生じ、外因性喘息の如きその他のアレルギー疾患と関係することが証明された。アレルギー疾患におけるIgE 抗体の重要な役割は、アレルゲンに対するIgE 抗体形成の調節および抑制がアレルギー疾患の基礎的な治療の一つであるという可能性を生じた。免疫系は種々の応答を生じる可能性を有し、上記のように、その応答は時として有害である。感染性薬剤に対する正しい免疫応答は、細胞介在性および体液性の両方の免疫エフェクター機能の適当な組の活性化に依存する。二つの平行なＴ細胞サブセット（一つはCD4 受容体(CD4⁺ ）を有し、別のものはCD8 受容体(CD8⁺ )を有する）が同定された。これらのサブセットは異なる抗原提示MHC 分子を認識するように特殊化され、CD4+T 細胞はクラスIIMHC 分子を認識し、またCD8+T 細胞はクラスＩMHC 分子を認識する。 CD4+サブセットはTh1 およびTh2 と称される亜集団に更に細分され、これらはリンホカイン／サイトカインの異なるパターンを分泌し、そしてまた互いのエフェクター機能を相互に変更する。サイトカインはその他の細胞に影響し、かつ異なる亜集団のエフェクター機能の多くの原因となる分子である。Th1 細胞はインターフェロンγ（IFN-γ）、インターロイキン２(IL-2)並びに腫瘍壊死因子(TNF )を分泌し、またTh2 細胞はインターロイキン４(IL-4)、インターロイキン５(IL -5)、インターロイキン６(IL-6)、インターロイキン９(IL-9)、インターロイキン10(IL-10)、およびインターロイキン13(IL-13)を分泌する。両方のサブセットの特徴的なサイトカインの組み合わせを分泌する第三のサブセット表現型(Th0) が報告され、免疫応答中の早期に存在すると考えられた。最近の研究はマウスTh 1 細胞およびTh2 細胞に匹敵するサイトカインパターン機能を有する CD4+T 細胞のヒト均等物(Romagnani，S.，Ann.Rev.Immunol.，12:227，1994)、並びにサイトカインの両方のファミリーを分泌することが明らかである両方の種の細胞のグループ(Th0)を証明した。明らかになった総意は、Th1 サブセットおよびTh2 サブセットが抗原活性化およびサイトカインの存在の結果として共通の前駆細胞からの別の子孫として生じることである(Rocken，M．ら，J.Immunol.，148:1031 -1036，1992; Seder,R.ら，J.Exp.Med.，176:1091-1098，1992)。マウスおよびヒトの間のＴ細胞調節の一般的な特徴における類似性はマウスモデルをリンホカインの相当するヒトin vivo 活性およびin vivo のＴ細胞サブセットのレベルを調節することの結果を理解するのに格別に有益にした。現在、感染性疾患を制御または解明することの失敗は不十分な免疫応答ではなく不適当な免疫応答からしばしば生じるというかなりの証拠がある。例えば、マウスおよびヒトのリーシュマニア症、並びにらい腫らいの非治癒形態は強いが逆生産的(counterproductive)Th2支配応答を示す(Powrie，F．ら，Immunology To- day，14:270-274，1993)。こうして、これらの状況下の介入はIFN-γ産生を増進するようにTh1 応答を増大し、またはそのバランスをシフトすることを目的とすることができた。実際に、IL-12 の存在がTh1 に対する応答を誘導するのに有効であることが示された(Trinchieri，G.，Immunology Today，14:335-338，1993) 。同様に、殆どのアレルギー疾患は環境抗原に対するTh2 様応答により支配されることが明らかである。Th2 細胞はアレルギー疾患の三つの重要な特徴の発生を刺激する。IL-4はIgE 産生を誘発し、IL-5は好酸球増加の原因となり、IL-3、IL -4 およびIL-10 の組み合わせはマスト(mast)細胞生産をもたらす(O'Hehir，R.E .ら，A-nnu.Rev.Immunol.，9:67，1991)(その細胞はアレルゲンによる刺激後にアレルギーの原因の媒介物質のそれらの内容物を放出する)。一方、Th1 細胞は遅延型過敏症および幾つかの自己免疫応答を含む炎症免疫応答の非常に異なる組を媒介する。IFN-γおよび或る程度にTNF はマクロファージを活性化し、これが順に多種の細胞内病原体および細胞外病原体を死滅する能力を有する。それ故、 Th1 応答またはIFN-γ産生のアップレギュレーションおよびIL-4分泌のダウンレギュレーションによる介入は治療戦略の重要な因子であり得た。実際に、IFN-γ と多くの活性を共有する IFN-αはIgE および好酸球増加を減少することが示された。病原微生物に応答するTh1 誘発炎症の利益とは対照的に、自己抗原に対するこれらの応答は通常有害である。自己免疫疾患はヒト自己免疫症状、例えば、実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)の殆どの実験モデルで一般にヒトにおいて多要因性(multifactorial)であるが、多発性硬化症のモデルがミエリン塩基性タンパク質(MBP)特異性Th1 細胞により主として媒介されることが示された(Powell,M.B. ら，Int.Immunol.，2:539，1990; Ruddle,N.H.ら，J.Exp.Med.，172:1193，1990 )。また、ヒトおよび動物モデルでインスリン依存性真性糖尿病(IDDM)のTh1 細胞関与の証拠がある(Tisch,R．ら，Nature，366:72-75，1993)。抗IFN-γは非肥満性糖尿病(NOD)マウスで糖尿病に対し保護することが示された。この状況では、優占種Th2 応答が有益であり得る。実際に、最近、CD45RC^low（ラットの場合）およびCD45RB^low（マウスの場合）CD4+細胞（これらは主としてTh2 様サイトカインを分泌する）の存在は自己免疫の保護であることが示された(Powrie,F.ら，J.Exp.Med.，179:589-600，1994)。この保護はIL-4により媒介されることが明らかに示された。こうして、本発明は免疫系それ自体を解明して優占種Ｔ細胞応答を疾患から離して転じて、その応答をアレルギー反応の場合に危険なTh2 からおそらく保護的な、またはそれ程危険ではないTh1 に転じるだけでなく、自己免疫において有害なTh1 からTh2 に転じるという要件を満足する。最後に、リガンド−受容体アフィニティーを変化した後に見られるサイトカイン産生の逸脱はワクチン投与後に保護免疫応答を得るのに有益である。本発明は、自己免疫またはアレルギー反応を防止しようとするのではなく、その代わりに最も成功した戦略が別の、転換した応答(diversionary response)および／または保護応答を誘発することであることを示す。発明の要約本発明は、Ｔ細胞のサブセット、Th1 とTh2 の比がサブセットの刺激により変化でき、それによりこれらの細胞集団の一つまたはその他の上昇されたレベルにより生じる有害な効果を排除するための手段を与えるという発見に基いている。 Th1 細胞応答は自己免疫疾患としばしば関連し、一方、Th2 応答はアレルギー反応と関連する。一実施態様において、本発明は、抗原から変異体免疫優性ペプチドのアレイを調製し、そのアレイから、高いMHC 結合アフィニティーを有し、がつその抗原に特異性のＴ細胞の増殖を誘発するペプチドを選択することを含んでなる、特定の抗原についてＴ細胞調節(modulatory)ペプチド（そのペプチドはIFN-γ分泌Ｔ細胞集団を刺激する）を同定する方法を提供する。同様に、別の実施態様において、本発明の方法はIL-4分泌Ｔ細胞集団を刺激するペプチドを同定するのに利用され、そのペプチドは低いMHC 結合アフィニティーを有する。別の実施態様において、本発明は抗原について有効な量のＴ細胞調節ペプチド（そのペプチドはIFN-γまたはIL-4分泌Ｔ細胞集団を刺激する）を患者に投与することを含んでなる、Ｔ細胞疾患を有する患者の特定の抗原に対するＴ細胞応答の調節方法を提供する。更に別の実施態様において、本発明はＴ細胞調節ペプチドを提供する。図面の簡単な説明図１はBALB/cマウスおよびB6マウス中のPSP 分子に関する決定因子領域のプロフィールを示す。２μｇのrPSP（ＡおよびＣ）または2.5 μg のHPSP（ＢおよびＤ）で既に免疫された４〜６匹のプールされたBALB/c（ＡおよびＢ）マウスまたはB6（ＣおよびＤ）マウスのリンパ節細胞を155 種のペプチドのそれぞれの28μ M 溶液中で72時間インキュベートし、次に１μCiの［³H］チミジンで更に18時間標識した。ペプチドは３残基だけアドバンスする(advancing)15merであり、全PS P 分子をカバーする。ペプチド番号は15mer のＮ末端残基を表す。データは図１、２および３中で個々の培養物中の［³H］チミジンとり込みとして表される。再現性を確かめるために、実験を２〜４回行った。図２はBALB/cマウスのPSP 決定因子領域の精密な決定因子マッビングを示す。 2.5 μg のHPSPで既に免疫された個々のBALB/cマウスのリンパ節細胞を図１に使用したのと同じ条件下でコア138-147/143-155(A)および369-376(B)を有する決定因子領域内でそれぞれのペプチド（14μM ）とともに培養した。ペプチドは一つの残基だけアドバンスする15mer であり、図１中に表された選択された決定因子領域をカバーする。図３はB6マウスのPSP 決定因子領域の精密な決定因子マッピングを示す。2.5 μg のHPSPで既に免疫された個々のB6のリンパ節細胞を図１に使用したのと同じ条件下でコア138-147/143-155(A)、194-201(B)、または456-464(C)を有する決定因子領域内でそれぞれのペプチド（14μM ）とともに培養した。ペプチドは一つの残基だけアドバンスする15mer であり、図１中に示された選択された決定因子領域をカバーする。図４は図２に特定された決定因子領域に関するコア配列を示す。コアは図２からの増殖結果に従って特定され、その決定因子領域に関する最大増殖の少なくとも50％を誘発するペプチドの共有残基を含む。PSP ペプチド配列が１文字アミノ酸コードにより示される。図５はBALB/cおよびB6中の主要PSP 決定因子領域に関するリンホカインプロフィールを示す。個々のBALB/cマウス（Ａマウス１および２）およびB6マウス（Ｂマウス１および２）からのリンパ節細胞を完全培地１ml中でコア369-376(BALB/c )および456-464(B6)を有する決定因子領域に相当するペプチドとともに培養した。上澄みを48時間後に回収し、遠心分離し、-70 ℃で貯蔵し、ELISA によるIFN- γ およびIL-4に関するアッセイの10分前に解凍し、培養物を図２のようにして樹立し、増殖につて分析した。結果はBALB/cおよびB6の両方について２種の個々の動物からのリンホカインおよび増殖プロフィールを表す。図６はコア369-376 を有する決定因子領域内のペプチドが抗IFN-γの存在下で Th2 細胞を誘発することができることを示す。BALB/cマウスを2.5 μg のHPSP（ＡおよびＢ）で免疫し、１日目および３日目にPBS 中のXMG1.2抗体500 μg でi. p.注射した（Ｂのみ）。９日目に、３匹の動物からの膝窩リンバ節細胞をそれぞれのグループからプールし、20μg/mlの抗体R46A2(抗IFN-γ)(ＡおよびＢ)の存在下または不在下でペプチド364-378(ＡおよびＢ)または368-382(Ａ)とともに48 時間培養した。48時間後に回収した生細胞を表２のようにELISPOT により分析した。図７はELISPOT 技術により測定された変異体ペプチド抗原誘発IFN-γ(Th1)(A) およびIL-5(Th2)(B)産生Ｔ細胞の頻度を示す（10⁶リンパ節細胞中のスポット形成細胞(SFC)として表される）。図８は種々の濃度のペプチド変異体による刺激後の［³H］チミジンとり込みにより測定されたＴ細胞クローンの増殖を示す。図９は9.4Lys（●）、9.4Arg（■）および9.4Met（▲）に応答して9.4Lys特異性Ｔ細胞クローン、3C10による増殖パターン(A)並びにリンホカイン、IL-4(B)およびIFN-γ(C)分泌プロフィールの比較を示す。発明の詳細な説明本発明は特定の抗原についてＴ細胞調節ペプチドを同定する方法を提供し、そのペプチドはIFN-γ分泌Ｔ細胞集団またはIL-4分泌Ｔ細胞集団を刺激する。本発明の方法はMHC について低アフィニティー結合および高アフィニティー結合を有するペプチドの同定およびＴ細胞増殖の誘発を伴う。一旦同定されると、これらのＴ細胞調節ペプチドはTh1またはTh2 関連Ｔ細胞疾患、例えば、アレルギー疾患または自己免疫疾患を有する患者の治療に有益である。第一実施態様において、本発明は抗原から変異体免疫優性ペプチドのアレイを調製し、そのアレイから、高いMHC 結合アフィニティーを有し、かつその抗原に特異性のＴ細胞の増殖を誘発するペプチドを選択することを含んでなる、特定の抗原についてＴ細胞調節ペプチド（そのペプチドはIFN-γ分泌Ｔ細胞集団を刺激する）を同定する方法を提供する。本明細書に使用される“Ｔ細胞調節ペプチド ”という用語は既存のＴ細胞応答の変化を生じるペプチドを表す。例えば、そのペプチドは保護Ｔ細胞応答を刺激することにより優占種Ｔ細胞応答を病的症状から離れて転じるのに使用し得る。Th1 細胞はリンホカイン、例えば、IFN-γ、IL -2、および腫瘍壊死因子(TNF)を好んで分泌する。それ故、Th2 応答が患者に危険な程高い場合、例えば、アレルギー反応の場合、Th1 応答を刺激することが望ましい。それ故、有害な応答を阻止することとは対照的に、本発明の方法は保護応答を誘発することにより作用する。別の実施態様において、本発明は抗原から変異体免疫優性ペプチドのアレイを調製し、そのアレイから、低いMHC 結合アフィニティーを有し、かつその抗原に特異性のＴ細胞の増殖を誘発するペプチドを選択することを含んでなる、特定の抗原についてＴ細胞調節ペプチド（そのペプチドはIL-4分泌Ｔ細胞集団を刺激する）を同定する方法を提供する。Th2 細胞はリンホカイン、例えば、IL-5、IL-6 、IL-9、IL-10およびIL-13を好んで分泌する。それ故、Th1 応答が患者で危険な程高い場合、例えば、自己免疫疾患の場合、Th2 応答を刺激することが望ましい。Ｔ細胞調節ペプチドを同定する上記方法は抗原から変異体免疫優性ペプチドのアレイを調製する工程およびそのアレイから、刺激することを所望するＴ細胞集団に応じて、高いか、または低いMHC 結合アフィニティーを有し、かつその抗原に特異性のＴ細胞の増殖を誘発するペプチドを選択する工程を含んでなる。本明細書に使用される“抗原”は免疫応答を誘発する物質を表す。Ｔ細胞調節ペプチドの起源である本発明の抗原は宿主に対し外因的に誘導されてもよく、または誘導されなくてもよい。例えば、本発明の方法は“自己抗原”であるＴ細胞調節ペプチドを同定するのに使用し得る。自己抗原は自己抗体と反応し、またはＴ細胞を活性化する生体の通常の成分である。また、本発明は“アロ抗原”に対する寛容性を誘発することを含む。アロ抗原は種の幾つかの員、例えば、血液グループ物質のみに見られる抗原を表す。異種抗原は異種の間の相違のために免疫反応を生じる物質である。 “免疫優性”ペプチドは、良くプロセシングされ、Ｔ細胞に提示され、かつ潜在的な決定基の全ての中で競合的に有利にされる、全抗原から誘導されたペプチドである。抗原からの更に不十分にプロセシングされた決定基は抗原提示の下降階級順序で“優性以下(subdominant)”及び“潜在”と称される。本発明の方法において、免疫優性ペプチドは典型的にはマウスの如き動物を局所部位で、例えば、足蹠中で皮内で免疫し、排液リンパ節を動物から除去し、注射の約9-11日後に細胞懸濁液を調製することにより同定される。細胞は96ウェル培養プレートのウェルの如き固体担体に分布され、続いてこれにペプチドのオーバーラッピング組の一つが添加される。オーバーラッピングペプチドは約10-20-mer であることが好ましく、10-14 アミノ酸のオーバーラップを有する15-merであることが最も好ましい。抗原誘発Ｔ細胞増殖は当業者に知られている通常の方法により測定し得る(Coliganら，Current Protocols in Immunology，Wiley Interscience，199 1，Unit 3を参照のこと)。増殖はＤＮＡ合成を示すトリチウム標識チミジン（［³ H］）のとり込みを測定することにより評価される。この方法では、当業者は優性決定基を有するので強い応答を誘発するペプチドおよび優性以下の決定基を有するので弱い応答を誘発するペプチドを特定し得る。応答を誘発する幾つかの近接ペプチドがあり、陽性ペプチドのそれぞれ中に見られるアミノ酸を特定することにより、残基の“コア”が同定し得る。免疫優性ペプチドが一旦同定されると、決定基のコア＋コアの両側の約３残基が試験免疫原として使用されることが好ましい。コア内のそれぞれのアミノ酸残基の変異体のアレイが、それぞれの残基で約３の変異体でもって、生産される。本明細書に使用される“変異体”は免疫優性ペプチドまたはコアペプチドの突然変異誘発形態であるペプチド、または、例えば、組換えもしくはペプチド合成により生産されたペプチドを表す。当業者はアミノ酸残基の置換に通常の方法、例えば、ペプチドをコードするＤＮＡのランダム突然変異誘発または部位誘導突然変異誘発を行うのに知られている方法を知っているであろう。典型的には、MHC 結合アフィニティーおよびＴ細胞増殖応答の誘発についてスクリーニングされる野生型配列のそれぞれの位置の三つの変異体は、(1) 保存的変化、(2) 非保存的変化、および(3) アラニン変異体への変化である。野生型残基がアラニンである場合、残基変化の一つはセリンまたは単一の小さい残基への変化であろう。MHC 結合に影響するアミノ酸変化は直接または間接に評価し得る。例えば、変異体ペプチドの結合が、精製MHC 分子を使用するアッセイにより直接測定し得る。結合は細胞競合アッセイにより間接に測定し得る。ペプチドは液相中のMHC 結合について分析でき、または固相担体に結合し得る。加えて、これらのアッセイにおけるペプチドは種々の方法で検出可能に標識し得る。本発明のペプチドを利用し得るアッセイの型の例は直接フォーマットまたは間接フォーマットの競合アッセイおよび非競合アッセイである。当業者は無用の実験をすることなくその他のアッセイフォーマットを知るであろうし、または容易に認識できる。本発明のペプチドは多くの異なる担体に結合でき、そしてMHC へのペプチドの結合を検出するのに使用し得る。公知の担体の例として、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然セルロースおよび変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよびマグネタイトが挙げられる。担体の性質は本発明の目的のために可溶性または不溶性であってもよい。当業者はペプチドを結合するのに適したその他の担体を知っているであろうし、またはルーチン実験を使用して、このような担体を確かめることができるであろう。当業者に知られている多くの異なる標識および標識方法がある。本発明に使用し得る標識の型の例として、酵素、放射性同位元素、蛍光化合物、コロイド金属、ケミルミネッセント化合物、およびバイオルミネッセント化合物が挙げられる。当業者は本発明のペプチドに結合するのに適したその他の標識を知っているであろうし、またはルーチン実験を使用して、このような標識を確かめることができるであろう。更に、本発明のペプチドへのこれらの標識の結合は、当業者に普通の通常の技術を使用して行い得る。本発明によれば、高アフィニティーペプチド変異体は相当する野生型ペプチドよりも少なくとも1,000 倍、好ましくは少なくとも5,000 倍大きいMHC 結合アフィニティーを有する。また、本発明の低アフィニティーペプチド変異体は相当する野生型ペプチドよりも少なくとも1,000 倍、好ましくは少なくとも5,000 倍小さいMHC 結合アフィニティーを有する。高MHC 結合アフィニティーを有する変異体および低MHC 結合アフィニティーを有する変異体を樹立したので、野生型ペプチドに特異性のＴ細胞はこれらの変異体で刺激され、リンホカイン分泌パターンが測定される。Ｔ細胞増殖応答を刺激するアミノ酸変化は直接または間接に分析し得る。トリチウム標識チミジンとり込みを利用する上記方法が直接アッセイの例である。適当なＴ細胞集団の増殖の誘発は、変異体免疫優性ペプチドによる刺激後にＴ細胞集団からのリンホカイン産生を測定することにより間接的に測定し得る。例えば、Th1 細胞の増殖の刺激の誘発はIFN-γ、IL-2、および／または腫瘍壊死因子(TNF)に関するアッセイにより測定でき、またTh2 細胞の増殖の刺激の誘発はIL-5、IL-6、IL-9、IL-10 およびIL-13 に関するアッセイにより測定し得る。リンホカインは通常のイムノアッセイ技術により測定されることが好ましいが、当業者はこのような検出のためのその他のアッセイを知っているであろう。Ｔ細胞増殖応答の確認のために、以下に記載されるクローン化Ｔ細胞が同系抗原提示細胞(APC)の存在下で次第に増加する濃度のペプチド変異体とともにインキュベートされる。マウス系では、照射された脾臓細胞がAPC として使用されることが好ましい。次に上澄みが、例えば、イムノアッセイまたはバイオアッセイにより分析される。Ｔ細胞調節ペプチドを同定するための本発明の方法はin vitroおよびin vivo のそれらのＴ細胞特異性について変異体を再試験する工程を更に含んでもよい。この目的のために、感作されたリンパ節からのＴ細胞クローンが調製され、これらは野生型免疫優性ペプチドと反応する。これらのクローンは当業者に知られている方法、例えば、KimotoおよびFathman（J.Exp.Med.，152:759，1980）により記載された限界希釈法により調製される。次にこれらのクローンはin vitroで変異体ペプチドのそれぞれで刺激される。マウスの如き動物が野生型ペプチド並びに変異体ペプチドの両方で抗原投与され、約10日後に、リンパ節増殖応答が両ペプチドで再生される。in vitroアッセイおよびin vivo アッセイの両方における増殖応答性の交差反応性は変異体および野生型ペプチドにより誘発された応答で観察し得るＴ細胞特異性の類似性を示す。また、本発明はアミノ酸配列ASQXRPSQR およびYSDGSCTQRASEAHASLLPFN （それぞれ、配列番号１および配列番号２）、並びにこれらの配列のヒト類似体を含む、保存変化を有する合成Ｔ細胞調節ペプチドを提供する。本明細書に使用される “保存変化”という用語は別の生物学上類似する残基によるアミノ酸残基の置換を表す。保存変化の例として、別の残基に代えて一つの疎水性残基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンの置換、または別の残基に代えて一つの極性残基の置換、例えば、リシンに代えてアルギニン、アスパラギン酸に代えてグルタミン酸、もしくはアスパラギンに代えてグルタミンの置換、等が挙げられる。配列番号１はミエリン塩基性タンパク質(MBP)ポリペプチドのアミノ酸１〜９に相当し、Ｘはグルタミン酸、グルタミン、アラニン、バリン、チロシンまたはメチオニンであることが好ましい。配列番号２はリーシュマニアメジャー(Leishmania major)のPSP(gp63)であるプロマシチゴート表面プロテアーゼのアミノ酸361〜382に相当する。配列番号２のコアはアミノ酸RASEAHASである。本明細書に使用される“合成ペプチド”という用語は完全に天然産のタンパク質分子を含まないペプチドを表す。ペプチドは、それが化学合成、組換え遺伝子技術、または全抗原の断片化等の如き技術を使用するヒトの介入により生産し得る点で“合成”である。本発明のペプチドは、上記ペプチドの活性が残っている限り、ペプチドの“機能性断片”を含む。このようなペプチドは、無用の実験に頼らないで本明細書に記載されたルーチンスクリーニング方法を使用して当業者により容易に同定し得る。これらのペプチドは長さが５アミノ酸程度に小さくてもよく、好ましくは10 アミノ酸程度に小さくてもよい。本発明のペプチドの一次アミノ酸配列の小さな修飾は、本明細書に記載された特定のペプチドまたは本発明の方法により同定されたペプチドと較べて実質的に均等の活性を有するペプチドをもたらし得る。このような修飾は部位誘導突然変異誘発によるように計画的であってもよく、または自然であってもよい。これらの修飾により生産されたペプチドの全ては、初期の変異体ペプチドの生物活性が依然として存在する限り、本発明内に含まれる。例えば、配列番号１のペプチドの最初の６アミノ酸は最初の８または９アミノ酸と同じ程度にTh1 細胞を刺激し得る。このような測定はルーチンであり、無用の実験をしないで行い得る。更に、一つ以上のアミノ酸の欠失がまたその生物活性を有意に変化しないで得られる分子の構造の修飾をもたらし得る。これはまた実用性を有する更に小さい活性分子の発生をもたらし得る。例えば、当業者は通常の技術を使用して配列番号１からアミノ末端またはカルボキシ末端アミノ酸を除去でき、または配列番号２からアミノ酸を欠失することができ、但し、それらのアミノ酸が特別なペプチドの生物活性に必要とされないことを条件とする。本発明のペプチドはα−アミノ基のt-BOC またはFMOC保護の如き普通に使用される方法により合成し得る。両方の方法は段階的合成を伴い、それにより単一アミノ酸がペプチドのＣ末端から開始するそれぞれの工程で添加される（Coligan ら，Current Protocols in Immunology，Wiley Interscience，1991，Unit9を参照のこと）。本発明のペプチドはまた0.1-1.0 ミリモルのアミン/gポリマーを含むコポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）を使用して、Merrifield(J.Am.Chem.S oc.，85:2149，1962)、並びにStewart およびYoung（Solid Phase Peptides S-y nthesis，Freeman，San Francisco，1969，27-62頁）により記載された公知の固相ペプチド合成により合成し得る。化学合成の完結時に、ペプチドは０℃で約1/ 4-1 時間の液体HF-10 ％アニソールによる処理により脱保護され、ポリマーから開裂し得る。試薬の蒸発後に、ペプチドがポリマーから１％酢酸溶液で抽出され、次にそれが凍結乾燥されて粗物質を得る。これは通常溶媒として５％酢酸を使用してセファデックスG-15によるゲル濾過の如き技術により精製し得る。カラムの適当なフラクションの凍結乾燥が均一なペプチドまたはペプチド誘導体を生じ、次にそれがアミノ酸分析、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、紫外線吸収分光分析法、分子回転運動、溶解性の如き通常の技術により特性決定でき、また固相エドマン分解により定量し得る。本発明のペプチドは単独で、混合物中で、または凝集物、ポリマーの如き多量体等として使用し得る。こうして、本発明はその中に含まれる本発明の特別なペプチドに関して均一または不均一ポリマーを生じるために本発明の一種以上の同じまたは異なるペプチドを含む合成ペプチドを含む。種々の混合物、凝集物、多量体等を生産するのに適した技術は当業者に知られているであろう。また、本発明は本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書に使用される“ポリヌクレオチド”は、別個の断片の形態または更に大きい構築物の成分としての、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを表す。本発明のペプチドをコードするＤＮＡはｃＤＮＡ断片から、または組換え転写単位で発現され得る合成遺伝子を与えるオリゴヌクレオチドから構築し得る。本発明のポリヌクレオチド配列はＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を含む。ポリヌクレオチド配列は遺伝子コードから演繹し得る。しかしながら、コードの縮重が考慮される必要がある。本発明のポリヌクレオチドは遺伝子コードの結果として縮重している配列を含む。本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは配列番号１または２、並びに相補核酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む。相補配列はアンチセンスヌクレオチドを含んでもよい。配列がＲＮＡである場合、配列番号１または２のデオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、およびＴはそれぞれリボヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、およびＵにより置換される。また、長さが少なくとも15塩基である上記核酸配列の断片が本発明に含まれ、この長さはその断片を生理条件下で本発明のペプチドをコードするＤＮＡに選択的にハイブリッドを形成させるのに充分である。本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は原核生物または真核生物のいずれ中でも発現し得る。宿主として、微生物、酵母、昆虫および哺乳類生物が挙げられる。原核生物中で真核配列またはウイルス配列を有するＤＮＡ配列を発現する方法が当業界で公知である。宿主中で発現し、複製し得る生物学的機能性ウイルスベクターおよびプラスミドベクターが当業界で知られている。このようなベクターは本発明のＤＮＡ配列をとり込むのに使用される。また、本発明は抗原に有効な量のＴ細胞調節ペプチド（そのペプチドはIFN-γ またはIL-4分泌Ｔ細胞集団を刺激する）を患者に投与することを含んでなる、Ｔ細胞疾患を有する患者の特定の抗原に対するＴ細胞応答の調節方法を提供する。患者がTh2 の上昇したレベルと関連するＴ細胞疾患を有する場合、その疾患は典型的にはアレルギー疾患またはぜん虫感染症である。患者がTh1 の上昇したレベルと関連するＴ細胞疾患を有する場合、その疾患は典型的には自己免疫疾患、またはバクテリア、ウイルスもしくは原生動物の病因を有する疾患である。患者はヒトであることが好ましい。本明細書に使用される“有効量”という用語は、投与されるＴ細胞調節ペプチドの量が抗原に対する患者の応答を減少し、例えば、アレルギーの症候を減少するのに充分な量であることを表す。有効と考えられるペプチドの量は、患者の抗原特異性Th1:Th2 比を監視することにより測定し得る。これは末梢血リンパ球サンプルにより分泌されたリンホカインのELISA 測定により測定されることが好ましい。その他の方法が当業者に知られているであろう。本発明のペプチドの投与の投薬量範囲は所望の効果を生じるのに充分に大きい量である。一般に、投薬量は患者の年齢、症状、性別、および上記のバクテリアまたはその他の薬剤による感染の程度により変化し、当業者により決定し得る。投薬量は禁忌の場合に個々の医師により調節し得る。いずれにしても、Th1:Th2 の前投与および後投与の比は患者の回復と相関関係があるべきである。アレルギー疾患の例として、アレルギー性鼻炎、喘息、アトピー性皮膚炎、および食物アレルギーが挙げられる。免疫系が宿主自体の組織を攻撃する自己免疫疾患の例として、型１インスリン依存性真性糖尿病、成人呼吸困難症候群、炎症性腸疾患、皮膚炎、脳膜炎、血栓性血小板減少性紫斑病、シェーグレン症候群、脳炎、ブドウ膜炎、白血球付着不全、慢性関節リウマチ、リウマチ熱、ライター症候群、乾癬性関節炎、進行性全身性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、天疱瘡、類天疱瘡、壊死性脈管炎、筋無力症、多発性硬化症、エリテマトーデス、多発性筋炎、サルコイドーシス、肉芽腫症、脈管炎、悪性貧血、CNS 炎症疾患、抗原−抗体複合体介在性疾患、自己免疫溶血性貧血、ハシモト甲状腺炎、グレーブス病、習慣性自然流産、レイナルド症候群、腎炎、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、セリアック病、エイズの自己免疫合併症、萎縮性胃炎、強直性脊髄炎およびアジソン病が挙げられるが、これらに限定されない。所望の場合、Ｔ細胞は当業界で知られている技術によりその他のPBL から分離し得る。細胞の分離操作として、抗体被覆磁性ビーズを使用する磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、モノクローナル抗体に結合され、またはモノクローナル抗体と一緒に使用される細胞毒性薬剤、例えば、補体および細胞毒素、および固体マトリックス、例えば、プレートに付着された抗体による“パンニング”、またはその他の好都合な技術が挙げられる。正確な分離を与える技術として、蛍光活性化細胞ソーターが挙げられ、これらは種々の程度の洗練化、例えば、多数のカラーチャンネル、低角度および鈍角の光散乱検出チャンネル、インピーダンスチャンネル等を有し得る。Ｔ細胞調節ペプチドは、非経口投与、皮下投与、肺内投与、経口投与、および鼻内投与を含む、好適な手段により投与される。非経口注入として、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、または腹腔内投与が挙けられる。投薬は、投与が短期であるか、または延長されるかに一部依存して、注射、最も好ましくは静脈内注射または皮下注射により与えられることが好ましい。本発明のペプチドは生理的に許される溶液中で投与される。非経口投与用のペプチドの製剤として、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液、およびエマルションが挙げられる。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、およびポリエチレングリコールである。水性担体として、食塩および緩衝媒体を含む、水、アルコール性／水性溶液、エマルションまたは懸濁液が挙げられる。非経口ビヒクルとして、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸処理したリンゲル、または固定オイルが挙げられる。静脈内ビヒクルとして、液体補給剤および栄養補給剤、電解質補給剤、例えば、リンゲルデキストロースをベースとする補給剤等が挙げられる。防腐剤およびその他の添加剤、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、および不活性ガス等が存在してもよい。本発明のペプチドは中和された医薬上許される塩形態として治療組成物に製剤化し得る。これらとして、酸付加塩（ポリペプチドまたは抗体分子の遊離アミノ基で生成される）が挙げられる、これらは無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸、または有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸等で生成される。また、塩として、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄、および有機塩基、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等から生成された塩が挙げられる。以下の実施例は本発明を説明することを目的とするものであり、本発明を限定するものではない。それらは使用し得る典型的なものであるが、当業者に知られているその他の操作がまた使用し得る。実施例１材料および方法１．マウス雌のBALB/cJ、C57BL/6、BALB.B、CBA/Jおよび510.D2マウス（8-12週齢）を、J ackson Laboratories（Bar Harbor，ME）から購入したか、我々自身の施設で繁殖させた。２．培地 2×10-⁵Mの2-メルカプトエタノール、20mMのグルタミン、および25μg/mlのゲンタマイシンを加えた血清不含のHL-1培地（Ventrex,Portland，ME）を、ペプスキャン実験に使用した（図1AとBおよび2AとB）。他の実験には、特に記載された場合を除いて、5%の熱不活性化FCS(GeminiBioproducts，Calabasas，CA)、2×10 -⁵Mメルカプトエタノール、20mMのグルタミン、および25μg/mlのゲンタマイシンを加えたRPMI 1640(Sigma,St.Louis，MO)を使用した。３．抗原組換えgp63(rPSP)はDr．Robert McMaster(University of British Columbia) 、親水性(HPSP)と両親媒性(APSP)の両方の型の天然gp63(PSP)はDr．Robert Etge s(Universite de Lausanne)の厚意により譲り受けた。可溶性Ｌメジャー(LV39) 抗原は、凍結と解凍を３回繰り返した後、10,000gで10分間遠心分離をおこなうことにより調製した。４．抗体およびリンホカイン XMG 1.2(抗マウスIFN-γ)をプロテインG-セファロース(Zymed，San Francisco ，CA)カラムで精製し、Bayer，E.A.，et al.，Methods Biochem.Anal.，26:1，1 980に記載された方法でビオチン化した。R46A2(ATCC)(抗マウスIFN-γ)をプロテインＧカラムで上記のように精製した。BVD4-11 およびBVD6-2A62(抗マウスIL-4 )、TRFK-4および-5(抗マウスIL−5)、並びにJES5-sA5およびSXC-1(抗マウスIL-1 0)は、Pharmingen(San Diego，CA)より購入した。GK 1.5(抗マウスCD4⁺)、34-5- 3S(抗 1-A^c)、および2.43(抗マウスCD8⁺)細胞をATCCより購入し、抗体をこの研究所で精製した。抗マウスThy-1⁺腹水およびウサギLow-tox補体は、Accurate Ch emical and Scientific(Westbury，NY)より購入した。rHuIL-2は、Dr. Ray Apple(Roche Molecular Systems，Alameda，CA)より譲り受けた。r-マウス IL-4は、Dr.William Paul(NIH)の厚意により譲り受け、r-マウス IL-5およびIL- 10は、Pharmingenより購入した。r-マウス IFN-γは、Genzyme(Cambridge，MA) より購入した。５．合成ペプチド LメジャーPSP(Miller，R.A.，et al.，39:267，1990)の配列全体にわたり重なり合う完全な一連のペプチドを、Chiron Mimotopes(Clayton，Victoria，Austra lia)により、‘マルチピン’ペプチド合成技術を用いて合成した。この方法を、他にも詳細に記載されているように修正して、ペプチドがビンから開裂するようにした(Maeji，N.J.，et al.，J．Immunol．Methods，134:23，1990)。どちらの場合も、加えた最初のアミノ酸残基はプロリンで、次にα-Boc-ε-Fmoc-リジンを加えた。次いで、Fmoc保護基をはずし、もう一つのFmocで保護されたアミノ酸をリジンのε-アミノ基につけ加えて、Fmoc脱保護とアミノ酸カップリングの反復サイクルをおこなった。それぞれのペプチドの末端のアミノ基はアセチル化された。すべての保護基をはずした後、C-末端のリジン-プロリン残基がジケトピペラジン誘導体を形成するような条件下で、中性のpHの水で処理することによりピンからの開裂をおこなった。ペプチドの収率を、上記のMaeji，N.J.らの文献に記載された方法で計算した。６．免疫化および培養条件 2μgのrPSP、または2.5μgのHPSP若しくはAPSP、または40μgの合成ペプチドを用いて、マウスの足の裏皮下に(SC)免疫した。すべての免疫原は、50%完全フロイントアジュバント(Difco，Detroit，MI)中に乳化した。9-10日後にマウスを殺し、膝後面のリンパ節をプールするか、個々のマウスから取り出すかして、単細胞懸濁液と同じように処理した。細胞（5×10⁵/ウェル）を、様々な濃度のペプチドまたはタンパク質とともに96穴プレート(Costar,Cambridge，MA)にまき、３日間インキュベートし、次いで、18時間にわたり1μCiの[³H]チミジン(ICN，C osta Mesa，CA)でパルスラベルした。スカトロン細胞収集器（Scatron，Sterlin e，VA)を用いて培養物を回収し、LKB-Wallacl205ベータプレートリーダー(LKB， Turku，FinLand)により[³H]チミジンの取り込みを測定した。リンホカイン産生の研究のために、リンパ節細胞を、1mlの培養液中に2-5×10⁶細胞/mlで 24穴プレート(Costar)に入れ、抗原とともに37℃でインキュベートした。48、72 または96時間培養後上清を回収し、遠心分離して-70℃で貯蔵した。テストの方法としては、Ｔ細胞系を、1mlの培養液中、1×10⁵細胞/mlで、2×10⁶のマイトマイシンＣで処理した脾臓細胞および抗原とともに24穴プレート中でインキュベートした。上清を24-48時間後に回収し、上記のように処理した。ELISPOTアッセイのために、細胞を10⁷細胞/mlで48時間インキュベートし、フィコール上(d=1.083 )に浮かべて回収した生存可能な細胞を洗浄し、様々な濃度でELISPOTプレートにまいた。別の方法として、リンパ節細胞懸濁液を抗原とともに直接ELISPOTプレートにまいて下記のように処理した。７．リンホカインの測定 IFN-γ、IL-4、およびIL-10をELISAにより、記載された方法(18-20)で測定した。簡単に述べると、96穴ELISAプレート(Nunc Maxisorp，Kamnstrup,Denmark) を、の0.05Mトリス(pH8.5)中、2μg/mlの捕獲抗原でコートして、4℃で一晩インキュベートした。次いでプレートを２回洗浄し、25mMトリス緩衝生理食塩水-100 %FCS（ブロッキング緩衝液）で２時間ブロックし、４回洗浄し、ブロッキング緩衝液中で順次希釈したサンプルとともに室温で90分間インキュベートした。４回洗浄後、２次抗体をブロッキング緩衝液中に2μg/mlで加え、次いでプレートを室温で１時間インキュベートし、６回洗浄し、1:4000に希釈したアビジンD-ペルオキシダーゼ(Vector，Burlingame，CA)とともに室温で30分間インキュベートした。最後に、プレートを８回洗浄し、基質、2,2'-アジノ-ビス-3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸(ABTS:Sigma)を100μg/mlの濃度で、H₂O₂（30%溶液の1 :2000）とともに加えた。タイターテックマルチスキャン ELISA リーダー(Flow Laboratories,Huntsville，AL)を用いて405nmの光学濃度を測定した。組換えタンパク質を基準として用いて、値をU/mlに変換した。リンパ節におけるTh1およびTh2細胞の見かけ上の頻度を求めるために、ELISPO T技術を用いた(Taguchi，T.，et al.，J．Immunol．Methods，128:65,1990; Fuj ihasi，K.，et al.，J．Immunol.，Methods，160:181，1993)。簡単に述べると、Millititer HAプレート(Millipore,Bedford，MA)を、2μg/mlの抗IL -4、およびIFN-γ、または抗IL-5により、4℃で一晩コートした。次いでウェルを完全培地とともに室温で２時間インキュベートすることによりブロックした。細胞を、100μlの培地中、10⁴から2.5×10⁵細胞/ウェルの範囲の濃度で２つ組でウェルに加えて37℃で20-60時間インキュベートした（詳細は図の説明を参照）。インキュベーションに続いて、プレートを、まず、0.01MEDTAを含む氷冷PBSでよく洗浄して付着した細胞を取り除き、次いでPBS-0.05% Tween 20で洗浄した。次いでビオチンを結合した抗IL-4(2μg/ml)、抗IFN-γ(1μg/ml)、または抗IL-5 (2μg/ml)とともにウェルを室温で90分間インキュベートし、PBS-Tweenで６回洗浄し、1:2000希釈のアビジンD-ペルオキシダーゼとともに室温で45分間再インキュベーションした。次いでプレートを８回洗浄し、室温で１時間、の0.05M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)中の400μg/mlの3-アミノ-9-エチルカルバゾール(AEC ，Sigma)基質およびH₂O₂(30%溶液の1:1500)を加えることにより、スポットを生成させた。スポットの数を実体顕微鏡を用いて測定した。８．Ｔ細胞系の樹立リンパ節細胞を上記の方法で調製し、5-10×10⁶細胞/mlの濃度で、1mlの完全培地中で抗原とともに24穴プレート中でインキュベートした。６日後に細胞を回収し、マイトマイシンＣで処理した新鮮な同系の脾臓細胞[抗原提示細胞（APC） ]および抗原とともに再インキュベートした。７日後、生存可能な細胞をフィコール(Sigma)上に浮かべて回収し、50U/mlのrIL-2中でインキュベートした。この時点から、細胞を抗体/APCまたはIL-2で一週間おきに刺激した。実施例２ h-2d^dよびh-2^bマウス中のPSPに対するＴ細胞の増殖性の反応の決定基の概要クローン化された遺伝子のDNA配列(Miller,R.A.，et al.，Mol．Biochem．Par asitol．39:267，1990)に由来するものとして、12アミノ酸のオーバーラップを有しながら分子に沿って進行し、かつ天然のL.メジャーPSPの全配列をカバーする一連の15量体のペプチドを用いて、HPSPまたはrPSPに対するT細胞の増殖性の反応の一般的な概要を測定した。図１にBALB/cおよびB6マウスのPSP分子上の決定基領域の概要を示す。あらかじめ2μgのrPSP(AおよびC)または2.5μgのHPSP (BおよびD)で免疫されたBALB/c(AおよびB)またはB6(CおよびD)マウス４〜６匹分のリンパ節細胞を、155のペプチドの，各28μMの溶液中で72時間培養した後、さらに18時間、1μCiの[³H]チミジンでパルスラベルした。ペプチドは、３残基ずつ進行する15量体で、PSP分子全体をカバーするものであった。ペプチド番号は1 5量体のN-末端の残基を示す。データは、図１、２および３に、それぞれの培養における[³H]チミジンの取り込みによって表した。再現性を保証するために、実験は２回から４回おこなった。いくつかのＴ細胞決定基領域は、HPSP免疫後のBALB/cマウスにおいて、簡単にはっきりとわかる(図1A)。最も優勢な決定基領域は、ペプチドp361(‘p361’は残基361から始まる15量体である)からp367により再現することのできるもので、続いて、次に優勢な決定基のグループは、（重要な順に）ペプチドp403からp409 、p136からp151、p106からp121、p172からp181、およびp286からp292によりそれぞれ再現されるものであり、他にいくつかの重要性の低い領域があった。決定基は、ピークの反応を示すペプチド15量体のアミノ末端を表す一つの数字により示されている。組換え体(図1B)と天然のPSPとの免疫間における唯一の差異は、組換え体には残基331周辺の領域の決定基が存在しないことであった。B6マウスにおいては(図 1CおよびD)、BALB/cマウスに比べて決定基領域の総数は少なかったが、優勢な、および次に優勢な決定基の数は同じであった。最も優勢な決定基はペプチドp451 からp460により再現されるのに対し、他の決定基は、p187からp193、p136からp1 48、およびp106からp112の範囲のペプチドにより再現される。興味深いことに、これらの決定基の約50%はBALB/cマウスにも存在しているが、他のものは明らかに異なっている。実施例３ PSPに対する反応におけるコア決定基第二の実験系において、先の実験において検出された主要な決定基領域に対応し、一つのアミノ酸以外は重なり合っている合成ペプチドを用いて反応を再現した。図２に、BALB/cマウスのPSP決定基領域の精密な決定基地図を示す。あらかじめ2.5μgのHPSPにより免疫された個々のBALB/cマウスのリンパ節細胞を、図１の場合と同じ条件で、138-147/143-155(A)および369-376(B)をコアとする決定基の中のそれぞれのペプチド（14μMの濃度）とともに培養した。ペプチドは一残基ずつ進行する15量体で、図１に表される選択された決定基領域をカバーする。図３に、B6マウスにおけるPSP決定基領域の精密な決定基地図を示す。あらかじめ2.5μgのHPSPにより免疫された個々のB6マウスのリンパ節細胞を、図１の場合と同じ条件で、138-147/143-155(A)、194-201(B)、または456-464(C)をコアとする決定基の中のそれぞれのペプチド（14μMの濃度）とともに培養した。ペプチドは一残基ずつ進行する15量体で、図１に表される選択された決定基領域をカバーする。図４に、図２で範囲を示した決定基領域のコア配列を示す。コアは図２の増殖の結果に従って決定され、その決定基領域に対して、最大増殖の少なくとも50% を誘導するペプチド残基を共有している。PSPペプチド配列は１文字のアミノ酸コードで示す。 HPSP免疫後に、一連の重なり合うペプチドの15量体（ペプスキャン）によりコア領域を再現することができ、それは、マップされるべき各決定基の、決定基領域に対して最大の増殖の50%以上を与えるすべてのペプチドに含まれる残基としてここで任意に定義される。図２(AおよびB)に、BALB/cマウスの、p136からp151 およびp361からp367のそれぞれのペプチドの周辺の領域に対するペプスキャンを示し、図３(a-c)に、B6マウスの、p136からp148、p187からp193、およびp451からp460それぞれのペプチドを含む領域を示す。それぞれの決定基のコア領域は図４に表す。決定基領域136-151および361-367が、BALB/cマウスとB6マウスで明らかに類似したコアをもつことは注目に値する。BALB/cマウスおよびB6マウスの両方で、決定基領域136-151は明らかに二つの重なり合う決定基を含んでいる。BAL B/cにおいては、コアは138-148および144-155であり、B6においては、138-147および143-155である。決定基領域p361-p367は、BALB/cおよびB6系統について完全に同一のコア、369-376をもつ。BALB.B(H-2^b)およびB10.D2(H-2^d)を用いた実験によっても、それぞれB6およびBALB/cと類似した反応が得られた。例えばコア 369-376をもつBALB/cのいくつかの決定基が、九つの隣接した位置で始まるペプチドに対して非常に活性な増殖を示すことは、多重に重なり合ったコアの存在を示唆しており、興味深い。B6マウスにおいても、きわめて大きい決定基領域が、たとえばコア456-464および194-201を有する領域に存在する。実施例４優勢な決定基により誘導されたリンホカインの概要いくつかの研究(Sadick，M.D.，et al.，J．Exp．Med.，171:115，1990;Sadic k，M.D.，et al.，J．Immunol.，136:655，1986; Belosevic，M.，et al.，J.Im munol.，143:266，1989)により、マウスのリーシュマニア症の消散におけるIL-4 の有害な役割と同時に、INF-γの重要性が示されている。リーシュマニア系においてワクチンとなり得るペプチドは、高いIFN-γの産生と低いIL-4レベルとを一貫して誘導しなくてはならない。BALB/cおよびB6における主要な決定基領域の中でペプチドを再現したリンホカインの測定結果を図５に示す。図５は、BALB/cおよびB6の主要なPSP決定基領域に対するリンホカインの概要を示す。個々のBALB/ c(A.マウス１および２)およびB6マウス（Bマウス１および２）から採取したリンパ節細胞(5×10⁶)を、1mlの完全培地中で、コア369-376(BALB/c)および456-464( B6)を有する決定基領域に対応するペプチドとともに培養した。48時間後に上清を集めて遠心分離し、-70℃で貯蔵して、ELISAによるIFN-γおよびIL-4のアッセイの10分前に解凍した。培養は図２に示した方法でおこなわれ、増殖についてアッセイした。その結果は、BALB/cおよびB6の両方について２匹の個々の動物から得られたリンホカインおよび増殖の概要を表している。それぞれの系統のこれらの決定基領域における増殖とIFN-γ産生との間には、各系統間で、ほとんど正確に一致した緊密な相関関係がある。ELISAで測定したときには、これらの優勢な決定基にはIL-4は検出されなかった。これらの優勢な領域から樹立したＴ細胞系も、強いIFN-γ産生を示した。それにもかかわらず、コア456-464を有するB6の決定基領域に関連したいくつかのペプチドは、Ｔ細胞系とともにIL-4の分泌を誘導することもできた。実施例５リーシュマニア再現を開始するペプチド増殖とIFN-γ産生の結果を組み合わせて、BALB/cマウスにおける優勢なペプチド364-378、およびB6マウスにおけるペプチド452-464を、ペプチド開始後、特異的Ｔ細胞活性が、冷凍及び解凍したリーシュマニア抽出物により再現されるかどうかの決定に利用した。免疫したBALB/cおよびB6マウスのどちらからのリンパ節細胞も、L.メジャー抽出物に反応して増殖をおこし、IFN-γを産生することができるが、IL-4は測定されなかった（表１）。熱変性したHPSP(HPSP)によっては増殖性の応答は再現されなかったが、IFN-γ応答は陽性であった。しかしながら、 HPSPに対するいくつかのＴ細胞系は、BALB/cおよびB6の両方から樹立された。また、rPSPによっても簡単に再現することができた。 BALB/cまたはB6マウスを、40μgのペプチド364-378または452-466でそれぞれ免疫した。９日後、膝後面のリンパ節細胞を３匹のマウスからプールし、冷凍および解凍したL.メジャーの抽出物(1×10⁵/ml)に対する反応について、増殖およびリンホカイン産生をアッセイした。増殖は実施例２に記載された方法で、リンホカイン産生は実施例５の方法で測定された。（培地単独のc.p.m.値は4-6×10^-3 であった。実施例６決定基エンベロープ内の異なるペプチドによるリンホカインの誘導ペプチド346-378により免疫されたBALB/c、B6およびCBAマウスから採取したリンパ節中のIFN/IL-5産生Ｔ細胞の見かけ上の頻度を決定するために、ELISPOT アッセイをおこなった（表２）。IFN-γ産生細胞の頻度はIL-5産生細胞の約50-1 00倍であったが、IL-5を産生する細胞は明らかに測定可能であった。最も興味深いのは、全rPSPで免疫したマウスから採取したリンパ節細胞を用いておこなわれたELISPOTアッセイの結果であった（表３）。決定基エンベロープ内の異なった配列は、異なったパターンのリンホカイン産生をおこなうＴ細胞の上昇をもたらした。たとえば、364-378のような中心部分のペプチドは、ほとんど排他的に典型的なTh1表現型を有する細胞集団を刺激したが、ペプチド368-382は比-4産生細胞の頻度を誘導して、IFN-γ産生細胞の３倍近くにした。類似のパターンが他の境界ペプチド、361-375によっても誘導された。 BALB/c、B6またはCBAマウスをp364-378で免疫し、３匹の動物からの膝後面のリンパ節細胞をプールして、リンホカインを分泌する能力をアッセイした。細胞を10⁷細胞/mlの濃度で10μg/mlのp364-378または3μg/mlのrPSPとともに48時間培養し、次いで分散させ、洗浄し、ELISPOTプレートに10⁴から2.5×10⁵細胞/ウェルの濃度で２つ組でまいた。プレートをさらに20時間培養し、次いで記載された方法でスポット生成の処理をした。この決定基領域に対する一般的な特異性が同一であるが、細部の特異性の要件に相違があるような異なるＴ細胞が存在し、これらのペプチドによって異なった刺激を受けると考えられる。Th1およびTh2細胞の樹立は相互に阻害し合うこと(H sieh，C.S.，et al.，Science．260:547，1993)、およびTh1/Th2リンホカインの初期濃度が決定的となることが示唆されているので、測定されたほとんどの決定基領域における、IFN-γの総合的な優位性は、これらのペプチドが、十分な数の Th2細胞を開始できなかったこと、または最初のＴ細胞による、Th2細胞を樹立するのに十分なIL-4の分泌を誘導できなかったことの結果である可能性がある。この可能性をテストするために、BALB/cマウスをrPSPで免疫し、抗IFN-γ抗体をペプチド364-378または368-376とともに培養物に加えた場合のリンパ節細胞が IL-5を産生する能力をテストした。図６に示されるように、コア369-376を有する決定基領域内のペプチドは、抗IFN-γの存在下でTh2細胞を誘導することが可能である。BALB/cマウスを2.5μgのHPSP(AおよびB)で免疫し、１日目と３日目に、PBS中の500μgのXMG 1.2抗体（Bのみ）を腹腔内(ip)注射した。９日目にそれぞれのグループについて３匹のマウスからの膝後面リンバ節細胞をプールして、20μg/mlの抗体R46A2(抗IFN-γ)(AおよびB)の存在下または非存在下で、ペプチド364-378(AおよびB)または368-382(A)とともに48時間培養した。48時間後に生存している細胞を回収し、表２に示すようにELISPOTによりアッセイした。図6(A)に示されるELISPOTの結果は、IL-5産生細胞を大きく増加させることにより、ペプチド364-378に対する応答におけるIFN-γ産生細胞の見かけ上の優位性を著しく変化させることができることを示している。このことは、ペプチド36 4-378が誘導するのは前の集団からのIFN-γのみではないことを示している。マウスに抗IFN-γを注射した場合に、Th2における同様の増加がin vivoで観察された(図6B)。図6(A)に見られるように、再現にペプチド368-382を用いた場合、IL- 5分泌Ｔ細胞の数と比較してIFN-γ分泌Ｔ細胞の数が明白に減少した。その効果は表３に示したものほど大きくないが、これは、免疫原(rPSP対HPSP)の違いおよび単一のＴ細胞の測定法の違いを含む二つの実験の間の違いの数に起因すると考えられる。実施例７様々なペプチドMHC結合 in vivo(ポリクローナル)、およびin vitro(モノクローナル)系を用いて、同一のMHC分子(I-A^u、共刺激性の分子およびサイトカインを発現するAPCのような、同一の刺激条件で異なるMHC-結合リガンドにより刺激した場合に、同じＴ細胞が異なるリンホカイン分泌パターンを示すかどうかを決定した。４位において一つのアミノ酸を置換すると、変化していないＴ細胞の特異性と結びついて非常に広い範囲のMHC-結合親和性を有する変異体が発生するので(Wraith，D.C.，et al .，Cell，59:247-255，1989; Hood，L.E.，et al.，Cold Spring Harbor Symp． Quant.Biol.,54:859-874，1989)、ミエリン塩基性タンパク質のN-末端ペプチドフラグメントの1-9がアセチル化されたもの（ここでは9.4Lysと省略する）を、所望のリガンドとして用いた。こうして、(i)テストされたすべての４位変異体に対して増殖させたB10.PLマウスから誘導された9.4Lys特異的Ｔ細胞クローン；(ii)B10.PLマウスを9.4Lysまたはその同一性を維持している変異体で追加免疫した後の変異体によるポリクローンの再現のパターン(Kumar，el: al.,準備中 )、(iii)B10.PLマウスをそれぞれのペプチドで追加免疫した後誘導された、ペプチド変異体(9.4Ala、9.4Metおよび9.4Val)に特異的なクローン化したＴ細胞は、それぞれの変異体を、9.41.ysにより免疫した後に誘導された9.4Lys特異的Ｔ細胞の変異体と同じようにして認識した。最も高い、および最も低い親和性を有するリガンドを選択するために、精製したI-Au分子およびペプチドで標識したプロトタイプを用いて、変異体の相対的な MHC結合親和性を決定した。これらは表４に示されるように、競合するペプチドの50%μM用量で表される。MHC結合親和性は、精製したクラスIIの分子を用いた直接MHC結合アッセイによって決定した。精製したI-Au^umMに対して10nM）を5nM の放射線標識された非天然ペプチドYAHAAHAAHAAHAAHAA（配列番号３）とともに、プロテアーゼ阻害剤混合物（1mM PMSF、1.3mM 1.10フェナンスロリン、73μM ペプスタチンA、8mM EDTA、6mM N-エチルマレイミド、および200μＭ N-p-トシル-L-リシンクロロメチルケトン）の存在下、5%DMSOを含むPBS中で48時間、標準的なプロトコール(Buus．S.，et al.，Science，235:1353-1358，1987)に従ってインキュベートした。インキュベーション混合物における最終的な界面活性剤濃度は、2.6％ジギトニンであった。10-20％の結合に必要なMHCの量はおよそ20-10 0nMであった。この後のアッセイはすべてこのクラスIIの濃度を用いておこなった。阻害アッセイにおいては、ペプチド競合剤は、典型的には1.2mg/mlから0.12 ng/mlの範囲の濃度でテストされた。次いでデータをプロットし、50%の阻害を得られる用量を計算した。それぞれのペプチドについて2-4回の完全に独立した実験をおこなった。ペプチドは、Dr．S．Horvath(Caltech，Pasadena，CA)またはDr．C．Miles(Ma cromolecular Resources，Fort Collins，CO)により、ペプチドシンセサイザー( Applied Biosystems Inc.，Foster City，CA)を用いて、固相法により合成され、HPLCにより逆相カラムを用いて精製された(Clark-Lewis，I.，etal.，Science ，231:134，1986)。I-A^u 分子は、BALB/cのＢ細胞リンパ腫系A20.2 JA(I-A^d,I-E^d ）のPL/Jマウス(I-A^u、I-E^u )の脾臓細胞に融合することにより作られたI-A^u発現ハイブリッド細胞系JK91.7より精製された。細胞を、PBS/1%NP40および1mMPMSF中に、10⁸細胞/mlの濃度で溶解した。15,000gの遠心分離により溶解産物から核と砕片を除去し、I-A^u分子を、前記の方法(Wall，M.，et al.，Intl．I mmunol.，4:773-777，1992)でアフィニティにより精製した。A^dおよびイソタイプ分子の混合物の混入を防ぐために、I-A^uを認識するがI-A^dまたはイソタイプの混合物を認識しないMab Y3JPを用いた。以前から言われているように（Wraith，D.C.，et al.，上記；Hood，L.E.，et al.，上記）、Ｔ細胞刺激能力の高い変異体のペプチドは9.4Lysよりも効果的に結合する。ペプチド変異体9.4Argはすべての変異体の中で最も結合力が弱く、一方、ペプチド9.4Metおよび9.4Tyrは、9.4Lysよりも約10,000倍も強く結合し、最も強い結合力を有する。特に、野生型のペプチド9.4Lysは、9.4Argよりもわずかに強いだけである。ペプチド変異体9.4Alaは先の観察結果（Wraith，D.C.，et a l.，上記：Hood，L.E.，et al.,上記）のように、9.4Lysよりも400倍高い結合親和性を示した。興味深いことに、MBPの長いN-末端ペプチドであるAc-120は、9.4 Alaとほとんど同じくらい効果的にI-Auに結合する。これらの知見は、9.4Lysの４位の残基がMHC結合に関与していることを明白に示している。高い、あるいは低いMHC結合能力を有するリガンドについて、Th1またはTh2の一方に偏って反応をおこさせることができるかどうかをテストした。9.4Argおよび9.4Lysを最も弱い、9.4Metを最も強いMHC結合力を有するペプチドとして我々の刺激アッセイをおこなった。B10.PLマウスを9.4Arg、9.4Lysまたは9.4Metで免疫し、10日後に、サイトカイン特異的単細胞酵素連鎖イムノスポット（ELISASPO T）アッセイ(Taguchi，T.，et al.，J．Immunol．Methods,128:65-73，1990; Fu jihasi，K.，et al.，J．Immunol．Methods，160:181-189，1993)を用いて、取り出したリンパ節中のTh1またはTh2細胞の頻度をアッセイし（図７）、10⁶リンパ節細胞中のスポット形成細胞(SFC)として表した。非常に感度の高いELISA単細胞スポットアッセイを使用して、対象となるリンホカインを実際に分泌する細胞の頻度を測定し、ELISAにおいてリンホカインの吸収または低下に伴う問題や、m RNA検出における翻訳または分泌された産物の定量化の困難さを除くようにした。（リンパ節細胞のポリクローンのレベルでは、IL-4産生は、低レベルおよびIFN-γによる交叉調節の両方の原因のため、ELISAでは検出されなかった。） B10.PLマウスの群（各群に４匹ずつ）に対して、完全フロイントアジュバントに乳化させた7nmoleのペプチドを皮下に注入した。９日後に膝後面および鼠径部のリンパ節細胞(1×10⁷)を取り出して、1mlの完全培地(DMEM)中、最適濃度のペプチド(9.4Lys、14μM; 9.4Arg、50pM; 9.4Met、7μM)を用いて生体外(ex-vivo) で活性化した。この濃度ではリンパ節増殖再生反応は同程度であった。48時間培養後、生存している細胞をフィコールハイパック(d=1.083)を通して回収し、洗浄して、連続的に希釈して（10⁴から5×10⁵細胞/ウェル）、mAb R4-6A2(抗IFN- κ)およびTRFK-5(抗IL-5)(Pharmingen，San Diego，CA)でプレコートした96穴マイクロタイタープレート(Millipore)に移した。24時間後、細胞を取り除き、ビオチン化したXMG1.2およびTRFK-4、並びに3-アミノ-9-エチルカルバゾール(SIGM A)基質(SIGMA)と結合したアビジンD-ペルオキシダーゼを用いて、IFN-γおよびI L-5スポットを可視化した。スポットを実体顕微鏡で計数し、抗原が存在した場合と存在しなかった場合に見られたスポットの数の違いから、抗原特異的細胞の頻度を決定した。他の２つの独立した実験から、9.4Metで追加免疫したマウスにおけるIFN-γ産生細胞の頻度は、9.4Lys/9.4Argで免疫化したマウスよりも4.1または５倍高かった。これに対して、IL-5産生細胞の頻度はそれぞれのマウスの群で変化がなかった。明らかに、IFN-γ産生細胞は、高親和性ペプチド、9.4Metで感作したマウス(1 0⁶細胞あたり1170細胞)において、低親和性ペプチド、9.4Argまたは9.4Lysで免疫化したマウス(10⁶細胞あたり250 細胞)と比較して、約５倍高かった(図7A)。これに対して、IL-5産生細胞の頻度はマウスの３つの群のすべてで同じくらいであり（10⁶細胞あたり70-80細胞）、最も高い親和性を有するリカンドへの反応に比例して増加しなかった(図7B)。同様に、IL-4分泌細胞の頻度もそれぞれの群で変化がなかった。IFN-γ/IL-5産生Ｔ細胞の頻度の比は、9.4Metで免疫したマウスで15であったのに対し、9.4Argまたは9.4Lysで追加免疫したマウスでは２または３であった。このように、高親和性リガンドはリンホカイン分泌パターンをTh 1型の方に移動させるように見える。9.4Argの低い結合能力を埋め合わせる試みとして、マウスを50-100倍高い濃度の9.4Argで追加免疫した。この結果、 IL-5分泌細胞の数は10倍増加し、これに比例したIFN-γ産生Ｔ細胞の頻度の増加を伴わなかった（IFN-γ/IL-5の比は１以下）。実施例８ペプチド変異体によるＴ細胞の刺激同じＴ細胞が、変化したリガンドによる異なる刺激によってIFN-γまたはIL-4 を産生することができるかどうかを決定するために、9.4Lysに特異的なクローン化したＴ細胞を、濃度を変化させた(0.001nMから1mM)それぞれのペプチドで処理した後、増殖およびリンホカイン分泌パターンを測定した。まず、9.4Lys特異的Ｔ細胞のクローン（Bhardwaj，V.，et al.，J．Immunol., 151:5000-5011，1993; Urban，J.，et al.，Cell，54:577-592，1988）を用いて、これらが、高いMHC結合親和性を有する変異体と同様に低いMHC結合親和性を有する変異体を認識することができるかどうかを決定する研究をおこなった。インターロイキン４(IL-4)を分泌するが、インターフェロンγを分泌しない、9.4Lys に特異的なCD4⁺T 細胞クローン(3C10)の典型的な増殖の概要を図８に示す。簡単に述べると、Ｔ細胞(ウェルあたり5×10⁴ -1×10⁵ 細胞)(Ｔ細胞クローン、3C10 は、ウェルあたり0.3細胞で二つの連続的な限界希釈により、MBPにより免疫されたB10.PLマウスから作られた長期Ｔ細胞系から誘導された)を、放射線照射された同系の脾臓細胞(APC)(ウェルあたり1×10⁵ −5×10⁵細胞)とともに、異なる濃度(1nMから14μM)のペプチドを加えて、または加えずにインキュベートした。Ｔ細胞クローンの増殖は、３日間の培養の最後の18時間の[³H]-チミジンの取り込みによって測定された。２日後、1μCiの³H-チミジンをそれぞれのウェルに加えた。18時間後にプレートを収集し、前と同様にシンチレーション計数により増殖を定量した(Kumar，V．et al.，J．Exp．Med.,178:909-916，1993)。ペプチドのアミノ酸配列を表１に示す。Acl-9(・)、9.4Glu(○)、9.4Gln(△)、9.4Ala(▽) 、9.4Arg(■)、9.4Met(▲)、および9.4Val(□)。これらのデータは二つの別の実験により得られた。４位にリジンより小さい疎水性側鎖または負荷を持つ残基(Glu)を有するペプチド変異体は顕著な刺激作用を示さなかったのに対して、中性または電荷を持たない極性の側鎖(Gln)によるアミノ酸の置換はＴ細胞の活性化に対してより効果的であった。無極性または疎水性の側鎖(Ala、Val、Met)を有する9.4Lysの４位変異体が、強い、不規則な増殖反応を示し、10³から10⁵倍低い抗原濃度において、効率的にＴ細胞を刺激することができたことは注目される(図８)。これらの変異体の増殖における階層はこのＴ細胞クローンに特有なものではなく、他の9.4L ys特異的クローン化Ｔ細胞(2C6、5C4およびPL2.2)も同様の刺激の概要を示した( Bhardwaj，V.，et al.，J．Immunol.，151:5000-5011，1993)。実施例９ペプチド変異体に応答した、増殖およびリンホカイン分泌増殖およびＩＬ−４分泌を誘導する変異体の相対的能力を比較した（図９）。 9.4 Lys（●）、9.4 Arg（■）および 9.4 Met（▲）に応答しての、9.4 Lys特異的Ｔ細胞クローン３Ｃ１０による増殖パターン（Ａ）、並びにリンホカインＩＬ−４（Ｂ）及びＩＦＮ−γ（Ｃ）分泌プロフィールの比較を行った。５ｘ１０⁴クローン化Ｔ細胞／ウエルを、５ｘ１０⁵合成遺伝子型ＡＰＣ（3000 Rを照射したB10.PLマウス由来の脾細胞）と共に種々の濃度(0.001 nMから 1.0 m M)のペプチド9.4 Lys、9.4 Arg および 9.4 Metの存在下で９６ウエルマイクロタイタープレート中でインキュベートした。実験は３回くり返した。実施例８中の記載のように、増殖を(³H)-チミジン取り込みにより測定した。ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の測定については、プレートを37℃でインキュベートし、培養48時間後および72時間後に上清を回収し、遠心し、-70℃で保存した。ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４を、文献に記述されたように(Curry，R.C.ら，J．Immunol．Method s，104:137-145，1987; Mosmann，T.ら，J．Immunol．145:2938-2945，1990)ELI SAによって測定した。すなわち、96ウエルELISA プレート(NUNC Maxisorp，Kamn strup,デンマーク)を、0.05 M Tris(pH 8.5)中に溶解した2 μg/mlの捕獲抗体でコートし、一晩４℃でインキュベートした。次にプレートを２回洗浄し、25 mM Tris緩衝化生理食塩水-10% FCS（ブロック用緩衝液）を用いて２時間ブロックし、４回洗浄し、ブロック用緩衝液中に溶解したサンプルの連続希釈物と共に室温で90分間インキュベートした。４回洗浄した後、第２抗体をブロック用緩衝液に２μg／ｍｌの濃度で添加した。プレートを１時間室温でインキュベートし、６回洗浄し、次にアビジンD-ペルオキシダーゼ(Vector，Burlingame，CA)の1:4000 希釈物と共に30分間室温で再びインキュベートした。最後にプレートを８回洗浄し、基質2,2'-アジノ-ビス-3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸（ＡＢＴＳ）(SIGMA，St．Louis，MO)を100 μg/mlの濃度で、H₂O₂（30%溶液の1:2000希釈物）と共に添加した。Titertek Multiskan ELISAリーダー(Flow Laboratories， Huntsville，AL)を用いて405 nmでＯ．Ｄ．を測定した。標準として組換えタンパク質を用いて、測定値を単位/mlに変換した。検出下限はＩＦＮ−γおよびＩＬ−４につき、それぞれ0.8 および0.5 単位/mlであった。マウスＩＦＮ− γ特異性モノクローナル抗体Ｒ４−６Ａ２並びにＸＭＧ１．２、および抗マウスＩＬ−４モノクローナル抗体ＢＶＤ４−１Ｄ１１およびＢＶＤ６−２Ａ６２は Pharmingen，San Diego，CAより購入した。組換えマウスＩＬ−４はWilliam Pau l博士(NIH)より寛大な贈与を受けた。ｒ−ＩＦＮ−γはGenzyme Co.，Cambridge ，MAより購入した。これらのデータは３個の独立した実験の結果を表すものである。明らかに、３つのペプチド9.4 Lys、9.4 Arg および 9.4 Metはすべて、確立されたＴｈ２クローンについて予測されたように、増殖およびＩＬ−４産生を誘導することができた(図9Aおよび9B)。興味深いことに、9.4 Metで刺激した後の5 0%最大ＩＬ−４産生に必要とされる濃度(0.3μM)は、9.4 Arg/9.4 Lys について必要とされる濃度(４又は７μＭ)より約10倍も低かった。一方、「増殖効率」の同様な比較においては、9.4 Met は9.4 Lys よりも約 1〜5x10⁵倍良好であった。対照的に、50%最大ＩＬ−４産生に必要とされる濃度は9.4 Lys のそれと類似しているように思われるが、9.4 Arg は増殖誘導において10倍劣っていた。これらのデータにより、より高いMHC結合親和性を有する変異体は相対的にＩＬ−４産生よりも増殖誘導に良好であり、また逆にMHC結合親和性に乏しい変異体はＩＬ−４分泌をより効果的に誘導することが示唆される。重要なことに、比較的高いペプチド濃度においてではあるが、9.4 Met は2/4 Ｔ細胞クローンにおいて有意なレベルのＩＦＮ−γ分泌を誘導した（図９Ｃ）。Ｔ細胞クローン３Ｃ１０によって産生されたＩＦＮ−γの最大量は、9.4 Metの濃度100 μMのもとで47.1 u/mlであった。同様に、9.4 Lys より1000倍以上高い MHC結合を示した他の変異体、例えば9.4 Val、もまたＩＦＮ−γを誘導した。非常に低いMHC結合を有する9.4 Lys および9.4 Arg ペプチドは、非常に高いペプチド濃度(1 mM まで)においてもＩＦＮ−γを誘導することができなかった。ELI SA アッセイにおいて9.4 Met の存在下で、ＩＦＮ−γはＴ細胞によって分泌されるが他の細胞型（例えばＡＰＣ）によっては産生されないことを確実にするため、精製Ｔ細胞（３Ｃ１０）を用いてELISAスポット技法によりＩＦＮ−γ産生を測定した。9.4 Met(28μM)で刺激後のＩＦＮ−γ及びＩＬ−４産生細胞の頻度は、それぞれ1/800および1/80Ｔ細胞であった。実施例１０低親和性ペプチド処理後のＴ細胞におけるＩＬ−４産生異なる変異体を類似したレベルで用いた場合の、抗原提示細胞の表面におけるクローン３Ｃ１０によるサイトカイン産生を測定した。表面抗原／ＭＨＣを表示する直接的手段が何ら存在しない場合は、9.4 Lys 反応性Ｔ細胞ハイブリドーマ (HY.33)を用いてこれを間接的に評価した。変異体のペプチド濃度は、変異体が類似した数のＴＣＲ（インジケーターＴ細胞系の増殖によって測定される）を誘発した(triggered)と思われる濃度について測定した（表５）。9.4 Lys 特異的Ｔ細胞ハイブリドーマ(Hy.33)細胞（1x10⁵細胞／ウエル）を、同遺伝子型の照射された脾細胞(5x10⁵)および種々の濃度のペプチドの存在下で刺激した。24時間後に、100 μlの24時間培養物上清の存在下におけるＩＬ−２依存性細胞系ＨＴ −２による³H-チミジンの取り込みを測定することにより、ＩＬ−２分泌を先に記述されたように測定した(Bhardwaj,V.ら，J．Immunol.，151:5000-5001，1993 )。対照（ＡＰＣおよびＴ細胞、抗原なし）ＣＰＭは1488+ 138 であった。ここに示すデータは、３個のウエルの算術平均である。Ｔ細胞クローン３Ｃ１０によるサイトカイン産生を実施例９に記載のようにELISA によって測定した。各ペプチドについて直線範囲における増殖及びリンホカイン産生が比較される。予想されたように、同一レベルのＴＣＲシグナリング(signalling)に必要とされる濃度は、変異体が異なると異なっていた。例えば、9.4 Arg、9.4 Lysおよび 9.4 Metにつき、それぞれ14 μM、0.7 μM および0.0007 μMであった。これらのペプチド濃度では、Ｔ細胞クローン３Ｃ１０は検出可能レベルのＩＦＮ−γを産生しなかった（表５）。興味深いことに、9.4 Argまたは9.4 Lys の存在下で有意な量のＩＬ−４が産生された。これは、低親和性変異体が優先的にＩＬ−４産生を誘発することを更に確認するものである。これらのデータは、ＭＨＣ結合親和性における変化が変更されたＴ細胞シグナリングを生じ、示差的リンホカイン分泌パターンをもたらすことを示唆している。これは、アゴニスト／アンタゴニストペプチドの認識の結果、Ｔ細胞におけるシグナリングが変更されるという最近の実証と一致している(Evavold，B.D.ら， Science，252:1308-1310，1991; de Magistrisら，Cell，68:625-634,1992)。高親和性ペプチドは、ＭＨＣ分子と安定した複合体を形成する能力により、または内因的に補充された(filled)ＭＨＣ由来の低親和性ペプチドを置換することにより(Reay，P.A.ら，The EMBO Journal，11:2829-2839，1992; Fairchild ら，int l．Immunol.，5:151-1158，1993)、密度の高いリガンドの一群を形成することができる(Murray，J.S.ら，J．Immunol.，22:559-565，1992; Soloway，P.ら，J.E xp．Med.，174:847-858，1991)ことが示唆された。安定したMHC-ペプチド複合体の形成は、ＴＣＲとの高親和性相互作用をもたらすことも可能であった。低親和性変異体9.4 Lys または9.4 Arg の認識が抗ＣＤ４ｍＡｂによって完全に阻害されるのに対し、高親和性変異体9.4 Metの認識が上記ｍＡｂによってブロックされないことは注目に値する。したがって、コレセプター(co-receptor)(例:CD4 )、補刺激(costimulatory)分子(例:CD28)および接着分子を含む種々の相互作用によってもたらされる全刺激の性質は、サイトカイン分泌の独特のパターンを有する異なるＴ細胞エフェクターを引き出すことができた。したがって、ＭＨＣ結合に影響を及ぼすリガンドにおける構造変化は、抗原特異的Ｔ細胞応答を健康なＴｈ１またはＴｈ２パターンに向け直さなければならない、自己免疫性疾患、アレルギー、およびＡＩＤＳに関与するＴ細胞のエフェクター機能の免疫操作のための可能な標的を表す。本発明を現在好ましい実施態様に即して記述したが、本発明の精神から逸脱することなく種々の改変がなされうることが理解されるであろう。したがって、本発明は以下の請求の範囲によってのみ限定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 ＡＢＦＣ０７Ｋ 14/555 ＡＢＧＡ６１Ｋ 37/02 ＡＢＦＡＣＪＡＢＢＡＣＳＡＢＧＡＤＹＡＣＳＡＤＺＡＣＪＣ０７Ｋ 14/52 ＡＢＥＧ０１Ｎ 33/15 ＡＢＡ 33/53 ＡＡＢ // Ｃ０７Ｋ 14/54 ＡＤＹ 14/555 ＡＤＺ (72)発明者クマー，ヴィピンアメリカ合衆国 90034 カリフォルニア州ロサンゼルス，エヌオー．217，バグリーアヴェニュー 3700番地

Claims

【特許請求の範囲】１．特定抗原に対するＴ細胞調節ペプチドを同定する方法であって、ここで該ペプチドはＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞集団を刺激するものであり、以下の工程：ａ．該抗原由来の変異型主要抗原ペプチドの一群を調製し；そしてｂ．高いＭＨＣ結合親和性を有し、かつ該抗原に特異的なＴ細胞の増殖を誘導するペプチドを上記群より選択する、を含んでなる、該方法。２．Ｔ細胞集団が、ＩＬ−２および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）からなる群より選択されたリンホカインをさらに分泌する、請求項１に記載の方法。３．主要抗原ペプチドがコアペプチドである、請求項１に記載の方法。４．Ｔ細胞増殖の誘導が直接的に測定される、請求項１に記載の方法。５．Ｔ細胞増殖の誘導が間接的に測定される、請求項１に記載の方法。６．ＭＨＣ結合が直接的に測定される、請求項１に記載の方法。７．ＭＨＣ結合が間接的に測定される、請求項１に記載の方法。８．工程ｂがin vitro工程である、請求項１に記載の方法。９．工程ｂがin vivo工程である、請求項１に記載の方法。 10．ＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞がさらに遅延型過敏症（ＤＴＨ）を媒介する、請求項１に記載の方法。 11．ＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞がさらにマクロファージを活性化する、請求項１に記載の方法。 12．特定抗原に対するＴ細胞調節ペプチドを同定する方法であって、ここで該ペプチドはＩＬ−４分泌Ｔ細胞集団を刺激するものであり、以下の工程：ａ．該抗原由来の変異型主要抗原ペプチドの一群を調製し；そしてｂ．低いＭＨＣ結合親和性を有し、かつ該抗原に特異的なＴ細胞の増殖を誘導するペプチドを上記群より選択する、を含んでなる、該方法。 13．Ｔ細胞集団が、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群より選択されたリンホカインをさらに分泌する、請求項２に記載の方法。 14．主要抗原ペプチドがコアペプチドである、請求項２に記載の方法。 15．ＭＨＣ結合が直接的に測定される、請求項２に記載の方法。 16．ＭＨＣ結合が間接的に測定される、請求項２に記載の方法。 17．Ｔ細胞増殖の誘導が直接的に測定される、請求項２に記載の方法。 18．Ｔ細胞増殖の誘導が間接的に測定される、請求項２に記載の方法。 19．工程ｂがin vitro工程である、請求項２に記載の方法。 20．工程ｂがin vivo工程である、請求項２に記載の方法。 21．ＩＬ−４分泌Ｔ細胞がさらにＩｇＥ応答を媒介する、請求項２に記載の方法。 22．ＩＬ−４分泌Ｔ細胞がさらにＢ細胞の分化を誘導する、請求項２に記載の方法。 23．Ｔ細胞疾患を有する患者において特異的抗原に対するＴ細胞応答を調節する方法であって、有効量の、該抗原に対するＴ細胞調節ペプチドを患者に投与することを含んでなり、ここで該ペプチドはＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞集団を刺激するものである、該方法。 24．Ｔ細胞疾患がアレルギー性疾患である、請求項23に記載の方法。 25．アレルギー性疾患がアレルギー性鼻炎、喘息、アトピー性皮膚炎および食物アレルギーである、請求項24に記載の方法。 26．Ｔ細胞疾患が蠕虫による感染に関連している、請求項23に記載の方法。 27．Ｔ細胞疾患を有する患者において特異的抗原に対するＴ細胞応答を調節する方法であって、有効量の、該抗原に対するＴ細胞調節ペプチドを患者に投与することを含んでなり、ここで該ペプチドはＩＬ−４分泌Ｔ細胞集団を刺激するものである、該方法。 28．Ｔ細胞疾患が自己免疫性疾患である、請求項27に記載の方法。 29．自己免疫性疾患が、Ｉ型インスリン依存性糖尿病、成人呼吸困難症候群、炎症性腸疾患、皮膚炎、髄膜炎、血栓性血小板減少性紫斑病、シェーグレン症候群、脳炎、ブドウ膜炎、白血球癒着欠損症、慢性関節リウマチ、リウマチ熱、ライター症候群、乾癬性関節炎、進行性全身性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、天疱瘡、類天疱瘡、壊死性血管炎、重症筋無力症、多発性硬化症、エリテマトーデス、多発筋炎、サルコイドーシス、肉芽腫症、脈管炎、悪性貧血、ＣＮＳ炎症性疾患、抗原抗体複合体媒介疾患、自己免疫性溶血性貧血、橋本甲状腺炎、グレーヴズ病、習慣性自然流産、レーノー症候群、糸球体腎炎、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、腹腔疾患、ＡＩＤＳの自己免疫性合併症、萎縮性胃炎、強直性脊椎炎、およびアディソン病よりなる群から選択される、請求項28に記載の方法。 30．Ｔ細胞疾患が細菌、ウイルスおよび原生動物からなる群より選択される生物による感染に関連している、請求項27に記載の方法。 31．ＡＳＱＸＲＰＳＱＲからなるアミノ酸配列を有し、ここでＸはグルタミン酸、グルタミン、アラニン、バリン、チロシンおよびメチオニンからなる群より選択される、Ｔ細胞調節合成ペプチド。 32．請求項31に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列。 33．ＹＳＤＧＳＣＴＱＲＡＳＥＡＨＡＳＬＬＰＦＮからなるアミノ酸配列を有するＴ細胞調節合成ペプチド。 34．請求項33に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列。