JPH10511550A

JPH10511550A - 有機酸とアミノ酸の製造

Info

Publication number: JPH10511550A
Application number: JP8520338A
Authority: JP
Inventors: エムミアーズ，ジェイムズ
Original assignee: ジェネンコアインターナショナルインコーポレーテッド
Priority date: 1994-12-28
Filing date: 1995-12-20
Publication date: 1998-11-10
Also published as: AR000541A1; FI972791A0; WO1996020282A1; US6238895B1; FI972791L; CA2214318A1; EP0819178A1; AU3992295A; MX9704877A; FI122142B

Abstract

(57)【要約】マイクロバクテリウム属の菌株を、所望の有機酸またはアミノ酸へのフマル酸の酵素的変換による有機酸またはアミノ酸の製造のための利用、並びにそのような利用方法およびそのような本発明の利用および方法により生産された変換溶液が開示されている。本発明の利用と方法は、それによって生産された所望の有機酸またはアミノ酸のＬ異性体型を、所望の有機酸またはアミノ酸のＤ異性体型の存在無しで提供する。また開示されているのは、マイクロバクテリウム属の株および有機酸またはアミノ酸の何れかのＬ異性体を含む反応物質溶液である。

Description

【発明の詳細な説明】有機酸とアミノ酸の製造発明の分野本発明は有機酸およびアミノ酸、より詳細にはＬリンゴ酸とＬアスパラギン酸の、微生物、より詳細にはマイクロバクテリウム属の種の微生物を用いた製造に関する。発明の背景有機酸およびアミノ酸は薬品、健康および食品産業において様々な目的で用いられている。特に好ましいのはＬ異性体型の有機酸およびアミノ酸である。Ｌリンゴ酸は、主に薬品用途において、超アンモニア血症の解毒剤として、およびアミノ酸注入剤の成分として用いられている。Ｌリンゴ酸はまた、クエン酸と競合し、例えば菓子製品等のための食品酸味剤としての利益を示す。他の利用には、アルコールを含まない飲料、キャンディ、および果物や野菜の缶詰等の幅広い範囲の食品の調味剤が含まれる。Ｌアスパラギン酸は食品産業において幅広く調味剤として利用されているアミノ酸である。有機酸およびアミノ酸は従来は化学合成によって製造されてきた。しかしながら、アミノ酸および有機酸の化学合成は（例えば、マレイン酸無水物および水からのリンゴ酸の化学合成）、一般に光学不活性な混合物（ＤＬ異性体）としてアミノ酸または有機酸を生成する。そのような混合物は、天然Ｌ異性体をＤＬ異性体から除去するための分離工程を続いて行わなければならない。このようなＤＬ異性体混合物に関連した問題を克服するために、様々な微生物を有機酸およびアミノ酸を合成（生産）するために利用する方策が立てられてきた。このような微生物の利用は、酵素反応の生物特異性および選択性を提供し、基質を、化学合成では入手できない天然のＬ型有機酸またはアミノ酸に変換することを可能としている。この生物特異性および選択性は、全体の生産物の収量、生産物の品質および顕著な廃物処理の減少、それによって作られた天然Ｌ型有機酸および／またはアミノ酸の生産等の利益をもたらすものである。フマル酸を天然Ｌ型リンゴ酸に酵素的に変換するために多様な微生物を利用することが開示されている。このような菌株には、ラクトバチルスブレビ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルスデルブルエッキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）およびＥ．コリ（米国特許番号第２９７２５６６号）およびパラコロバクテリウムアエロジノイド属（Ｐａｒａｃｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｅｒｏｇｅｎｏｉｄｅｓ（米国特許番号第３９８０５２０号）の種が含まれる。さらに、ブレビバクテリウムアンモニアジーン（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウムエクイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｑｕｉ）、キサントバクターフラブス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒｆｌａｖｕｓ）、プロテウスブルガリ（Ｐｒｏｔｅｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ）およびピチアファリノサ（Ｐｉｃｈｉａｆａｒｉｎｏｓａ）（米国特許番号第３９２２１９５号）等の多様なフマラーゼ生産微生物の利用が、フマル酸のリンゴ酸への変換に関して開示されている。多様な微生物を、フマル酸（アンモニア塩）のＬアスパラギン酸への変換のために利用することもまた報告されている。Ｅ．コリ、ブレビバクテリウムメタルコリジーン（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｔａｌｃｏｌｉｇｅｎｅｓ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）およびシュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ）の菌株が、すべてこの目的のために開示されている。さらに、ブレビバクテリウムアンモニアジーンのフマル酸アンモニウムのＬアスパラギン酸への変換のための利用が、米国特許第４１３８２９２号において開示されている。不幸なことに、開示された微生物を用いた生物特異性および選択性は、天然のＬ型のリンゴ酸、アスパラギン酸および／または他の有機酸および／またはアミノ酸の生産に関してある利点を提供するものであるが、にもかかわらす、これらの工程の効率を改善し以前には考慮されていない微生物の菌株をそのために同定し利用する必要が残っている。マイクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の微生物は良く知られており、記述されている（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｕａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ２、Ｓｅｃｔｉｏｎ１５、１３２０−１３２２ページ（１９８６）を参照）。マイクロバクテリウムはフマラーゼ生産菌であるが、マイクロバクテリウム属の微生物をＬリンゴ酸および／またはＬアスパラギン酸の生産のための利用は知られていない。従って、他の微生物であって効率良くそして効果的に、Ｌリンゴ酸および／またはＬアスパラギン酸等の有機酸および／またはアミノ酸を工業的に生産する能力を有するものを同定し利用する必要が残されていると見ることができる。発明の概要有機酸および／またはアミノ酸、特にＬリンゴ酸および／またはＬアスパラギン酸の製造のために、フマル酸またはその塩を効率良くそして効果的に変換する能力を有する微生物を同定し提供することが本発明の主要な目的である。有機酸および／またはアミノ酸、特にＬリンゴ酸および／またはＬアスパラギン酸を効率良くそして効果的に製造するための方法を提供することが本発明のさらに主要な目的である。微生物の利用により酵素的に合成（生産）された有機酸および／またはアミノ酸、特にＬリンゴ酸および／またはＬアスパラギン酸を提供することが本発明の更なる主要な目的である。本発明の教示にしたがって、ここに記載されるように同定、利用されるのは、フマル酸またはその塩を酵素的変換による有機酸および／またはアミノ酸の製造のために有用なマイクロバクテリウム属の微生物菌株である。本発明の教示にさらに従って、ここに開示されているのは有機酸および／またはアミノ酸の製造方法である。この方法は、マイクロバクテリウム属の菌株を培養し、それによってそこにおいてフマラーゼが（細胞内に）生産されることを含む。必要であれば、培養された菌株は続いて培地から回収してもよい。培養に続いて、フマル酸またはその塩を培養されたマイクロバクテリウム属の菌株と反応させ、それによりフマル酸またはその塩が酵素的にＬ有機酸またはＬアミノ酸の何れかに酵素的に変換される。この方法は、さらに前述のＬ有機酸またはＬアミノ酸を回収することを含む。好ましくは、本発明の方法はさらに微生物を、フマル酸またはその塩が存在している変換溶液に配置する前に微生物を固定化することを含む。しかしながら、本発明の方法は、変換溶液内で「自由」な型にある微生物についてもまた実施されてもよいことに注意されたい。更に好ましくは、固定化された微生物は、フマル酸またはその塩の酵素的変換のためのその使用の前に前処理されている。この見地から、本発明の方法は更に固定化された微生物を、生産されるＬ有機酸またはＬアミノ酸をおよび緩衝を含む前処理溶液中において保温することを更に含む。このような前処理はゆるやかな振とうの下で行われるのがより好ましい。好ましくは、本発明の方法がマイクロバクテリウム属の以下の菌株の１つを培養することを含む：マイクロバクテリウムインペラル（ｉｍｐｅｒａｌｅ）、マイクロバクテリウムラクチカム（ｌａｃｔｉｃｕｍ）、マイクロバクテリウムアンモニアフィラム（ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）、マイクロバクテリウムアルボレセンス（ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ）、およびマイクロバクテリウムラエバニフォルマンス（ｌａｅｖａｎｉｆｏｒｍａｎｓ）。最も好ましくは、本発明の方法が以下の菌株の１つを培養することを含む：マイクロバクテリウムインペラルＡＴＣＣ８３６５、マイクロバクテリウムラクチカムＡＴＣＣ８１８０、マイクロバクテリウムアンモニアフィラムＡＴＣＣ１５３５４、マイクロバクテリウムアルボレセンスＡＴＣＣ４３５８、およびマイクロバクテリウムラエバニフォルマンスＡＴＣＣ１５９５３。さらに好ましくは、本発明の方法において用いられる（酵素的に変換される）フマル酸は、その（フマル酸）塩の状態にある。フマル酸ナトリウムまたはフマル酸アンモニウムの利用が好ましい。この見地から、本発明の方法は、フマル酸ナトリウムのマイクロバクテリウム属の菌株によるＬリンゴ酸の生産のための酵素的変換、およびフマル酸アンモニウムのマイクロバクテリウム属の菌株によるＬアスパラギン酸の生産のための酵素的変換を含むことを考慮されたい。本発明の方法によって生産された有機酸またはアミノ酸は、それらの天然Ｌ型にある。最も好ましくは、Ｌリンゴ酸およびＬアスパラギン酸の生産のための本発明の方法の利用である。別の関連した本発明の面においては、ここに開示されているのは、Ｌ有機酸およびＬアミノ酸の製造方法であって、マイクロバクテリウム属の菌株によって天然に生産されたフマラーゼをフマル酸またはその塩と反応させ、それによりフマル酸またはその塩が酵素的にＬ有機酸またはＬアミノ酸へ変換されることを含むものである。この方法は、マイクロバクテリウム属の菌株を培養し、それによってフマラーゼが生産され、フマラーゼを回収する工程を含む。必要であれば、フマラーゼは精製されたかまたは濃縮された状態で、生産生物（マイクロバクテリウムまたは遺伝的に操作された宿主）またはその部分を含む他の培地成分の存在下もしくは非存在下で回収されてもよい。回収したフマラーゼを続いてフマル酸またはその塩と反応させ、それによりフマル酸またはその塩は酵素的にＬ有機酸またはＬアミノ酸の何れかに変換される。本発明の方法はさらに、そのように生産された前述のＬ有機酸またはＬアミノ酸を回収することを含む。なおもさらなる本発明の教示に従っては、開示されているのは、反応物質溶液であって、高度に精製されたＬ有機酸またはＬアミノ酸およびマイクロバクテリウム属の菌株でありフマル酸またはその塩を所望のＬ有機酸またはＬアミノ酸で他の型（すなわちＤＬ型）の有機酸および／またはアミノ酸が存在しないものへ変換するために用いられたものを含むものである。本発明の反応物質溶液中のマイクロバクテリウムの菌株は、好ましくは、マイクロバクテリウムインペラル、マイクロバクテリウムラクチカム、マイクロバクテリウムアンモニアフィラム、マイクロバクテリウムアルボレセンスおよびマイクロバクテリウムラエバニフォルマンスである。最も好ましくは、本発明の反応物質溶液中のマイクロバクテリウムの菌株は、マイクロバクテリウムインペラルＡＴＣＣ８３６５、マイクロバクテリウムラクチカムＡＴＣＣ８１８０、マイクロバクテリウムアンモニアフィラムＡＴＣＣ１５３５４、マイクロバクテリウムアルボレセンスＡＴＣＣ４３５８およびマイクロバクテリウムラエバニフォルマンスＡＴＣＣ１５９５３である。好ましくは、本発明の反応物質溶液のＬ有機酸またはＬアミノ酸はＬリンゴ酸またはＬアスパラギン酸である。これらの、および更なる本発明の目的および利点は以下の記述をその実施例と関連づけて読むことにより容易に明らかとなるであろう。好ましい実施態様の記述本発明は、有機酸および／またはアミノ酸、特にＬリンゴ酸および／またはＬアスパラギン酸の製造のために、フマル酸またはその塩を効率良くそして効果的に変換する能力を有する微生物を同定し利用することに関する。本発明の教示にしたがって、有機酸および／またはアミノ酸、特にＬリンゴ酸および／またはＬアスパラギン酸の製造のために、フマル酸またはその塩を効率良くそして効果的に変換すると同定され用いられた微生物は、マイクロバクテリウム属に属するものである。特に、マイクロバクテリウムの菌株の、マイクロバクテリウムインペラル、マイクロバクテリウムラクチカム、マイクロバクテリウムアンモニアフィラム、マイクロバクテリウムアルボレセンスおよびマイクロバクテリウムラエバニフォルマンス種のものが、すべてこの課題のために効率的で効果的であると、ここにおいて同定され、利用された。最も詳細には、マイクロバクテリウムインペラルＡＴＣＣ８３６５、マイクロバクテリウムラクチカムＡＴＣＣ８１８０、マイクロバクテリウムアンモニアフィラムＡＴＣＣ１５３５４、マイクロバクテリウムアルボレセンスＡＴＣＣ４３５８およびマイクロバクテリウムラエバニフォルマンスＡＴＣＣ１５９５３の菌株がここにおいて開示されている。本発明の方法は、有機酸および／またはアミノ酸および、特にそれらのＬ異性体の生産のための、フマル酸およびその塩の酵素的変換に関するものである。本発明の方法（および変換溶液）の主要な利点は、それによって生産される有機酸および／またはアミノ酸がＬ異性体型であってＤ異性体型ではないということである。この見地から、本発明の方法の利用により、所望の有機酸および／またはアミノ酸の、Ｄ異性体の不在でのＬ異性体（を含む溶液）が生産され、それ故に、ＤＬ異性体混合物ではない実質的に異性体として純粋なＬ有機酸および／またはＬアミノ酸が生産されることが発見された。本発明の方法は、実行を望まれている酵素的変換のために用いられることが望まれているマイクロバクテリウム属の菌株の好適な菌株を選択することを含む。この菌株を続いて培養液体培地で培養する（その間、微生物の培養によりフマラーゼが生産される）。培養が終わると、菌株は液体培地から除去される。培養した菌株を、酵素的に所望の有機酸またはアミノ酸へ変換されるフマル酸またはその塩（フマレート型）を含む変換溶液中に位置させる（保温する）。変換溶液中にはマイクロバクテリウムの菌株によって生産されたフマラーゼがフマル酸またはその塩と反応し、それによって、その生産が望まれているところの（Ｌ異性体型の）有機酸および／またはアミノ酸に酵素的に変換され、反応物質溶液が生成される。このように生産された有機酸および／またはアミノ酸は、続いて反応物質溶液から、所望のようにおよび／または必要であるように、続いての使用のために（分離により）除去される。本発明の方法は、マイクロバクテリウムインペラル、マイクロバクテリウムラクチカム、マイクロバクテリウムアンモニアフィラム、マイクロバクテリウムアルボレセンスおよびマイクロバクテリウムラエバニフォルマンス種の菌株を利用する。最も詳細には、菌株群マイクロバクテリウムインペラルＡＴＣＣ８３６５、マイクロバクテリウムラクチカムＡＴＣＣ８１８０、マイクロバクテリウムアンモニアフィラムＡＴＣＣ１５３５４、マイクロバクテリウムアルボレセンスＡＴＣＣ４３５８およびマイクロバクテリウムラエバニフォルマンスＡＴＣＣ１５９５３が本発明の方法において用いられた。微生物はそれらの（フマラーゼの生成と共存する）増殖を可能とする何れの方法によっても培養されてよく、当業者には容易に理解される。この見地において、そのような培養は、好気的条件下で、炭素源（グルコース、スターチ、グリセロールおよび糖蜜等）、窒素源（ペプトン、カゼインまたは大豆の加水分解派生体、硝酸アンモニウムまたはナトリウム、硫酸またはリン酸アンモニウム、トウモロコシ浸酒、モルトエキストラクト等）および、必要であれば金属塩等もまた含む培地中で行われるであろうことは考慮されるべきである。そのような培養の温度は約２０℃から約４０℃までであり、好ましくは３０−３２℃で、約１８時間から約４８時間まで、培養されている菌株に応じた期間行われてもよい。好ましくは、そのような培養は、２３時間（Ｍ．インペラルの場合）、４７時間（Ｍ．ラエバニフォルマンスの場合）または３６時間（残りのここで用いられたマイクロバクテリウムの菌株の場合）行われる。培養培地のｐＨは、約ｐＨ５．５から約ｐＨ８までであり、約６−７が好ましい。続いて細胞は、発酵（培養）の終りに回収されてもよい。このような回収は、当業者に良く知られている何れの適切な手段によって成されてもよい。ここに開示されたように、そのような回収は培養液体培地の細胞の沈殿を生じさせるための遠心分離、続いての上清のデカントまたはその他の細胞回収によって成され得る。必要であれば、回収された細胞はそれに続く変換（反応）にそれだけで（フリーの細菌細胞の型で）用いられてもよい。そのような場合は、細胞は当業者に公知の方法に従って破壊され、粗抽出物またはその部分精製抽出物が変換反応において用いられる。微生物は、細菌細胞のフリーの状態で用いられてもよいが、細菌細胞（または細菌細胞中のフマラーゼ）を固定化するのが有利である。そのような場合は、細菌細胞は全体の発酵培地中に（除去される前に）ある間に（そしてそれをフマル酸またはその塩の存在する変換溶液中に配置する前に）固定化されてもよい。そのような固定化の後は、発酵培地は容易に、当業者によく知られている何れかの方法、例えば単なるデカントなどにより容易に除去されうる。細菌細胞の固定化は、本発明の方法に従ったフマル酸（またはその塩）の酵素的変換において使用されうる、好適な当業者に知られている何れの方法によって成されてもよい。そのような方法には、ポリアクリルアミドまたはカラゲナンゲルまたは高度ポリマーフィルムに固定されることが含まれる。その他の固定化の方法（およびここにおいて好ましく用いられたもの）は米国レター特許第４７６００２４号に記載されている方法である。本発明の方法において用いられる（酵素的に変換される）フマル酸およびその塩は、所望の有機酸に変換されるために好適な如何なる型（フマル酸塩等）の如何なるフマル酸であっても良い。この見地から、酵素的変換をされるべきフマル酸の型としてフマル酸ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、およびバリウムがすべて用いられ得る。好ましい塩はフマル酸ナトリウムおよびフマル酸アンモニウムである。ここにおいて、フマル酸ナトリウム（およびそのマイクロバクテリウム属の菌株による酵素的変換）がＬリンゴ酸の生産に利用され、フマル酸アンモニウム（およびそのマイクロバクテリウム属の菌株による酵素的変換）がＬアスパラギン酸の生産に利用されることが考慮された。本発明の方法によれば、フマル酸またはその塩を、溶液（変換溶液）中の細胞によって生産されたフマラーゼと反応させる。フマル酸およびその塩は約４から１０のｐＨを有するが、フマル酸ナトリウムの変換によりＬリンゴ酸が生産される場合にはｐＨ７．５が好ましく、フマル酸アンモニウムの変換によりＬアスパラギン酸が生産される場合にはｐＨ８．８が好ましい。反応は約１５℃から約６０℃（好ましくは約４０℃）の温度で、約０．５−４８時間、好ましくは約１時間の期間行われる。溶液（変換溶液）は変換されることが望まれているフマル酸またはその塩の液体型を含む。好ましくは、フマル酸またはその塩は１．０Ｍの濃度で存在している。必要であれば、（変換）溶液は、水、溶媒の水性溶液、リン酸またはトリスヒドロキシ塩酸等の緩衝液をまた含んでいてもよい。水酸化ナトリウム、カリウム、またはアンモニウム等のアルカリ、塩酸または硫酸等の無機酸を、約４から約１０（好ましくは約７．５から約８．８）のｐＨを有するように添加してもよい。（変換）溶液中に存在するフマル酸もしくはその塩の濃度について特に制限はないが、変換反応を行うために、約０．５％（ｗ／ｖ）から約３０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１１．６％（ｗ／ｖ）を用いるのが通常は適当である。（変換）溶液中に含まれる培養されたまたは処理された生産物（微生物等）の濃度について特に制限はないが、変換反応を行うために、約０．５％（ｗ／ｖ）から約１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは４．０％（ｗ／ｖ）を用いるのが通常は適当である。何れの公知の方法、例えばイオン交換または活性炭素を用いた吸収または放出等が、Ｌ有機酸またはＬアミノ酸を反応生成物からの分離およびそれに続く使用のための精製に用いられる。本発明の変換溶液はマイクロバクテリウム属の微生物（上記で詳細に特定および議論されたもの）およびＬ有機酸またはＬアミノ酸の何れかをそれらのＤ異性体および／またはＤＬ異性体型の不在下で含む。この見地から、変換溶液は、有機酸またはアミノ酸の何れのＤ異性体および／またはＤＬ異性体の存在を有しない。必要であれば、本発明の原理は、Ｌ有機酸およびＬアミノ酸の、マイクロバクテリウム属の菌株によって天然に生産されたフマラーゼをフマル酸またはその塩と反応させ、それによりフマル酸をＬ有機酸またはＬアミノ酸の何れかに酵素的に変換することによる生産を可能とする。フマラーゼに対し「天然に生産された」という用語を用いた場合は、その意味はその微生物（ここにおいて同定されたもの）によって天然に生産されたフマラーゼのみならず、そのようなフマラーゼ遺伝子をコードしている遺伝子を、その遺伝子にコードされているフマラーゼが遺伝子操作された宿主による発現が可能となるようなその形質転換（遺伝子操作の良く知られた原理と技術を用いて）による、他の微生物によって生産された同じフマラーゼをも意味する。このように記述してきたが、本発明の利用、方法および変換媒体、以下の実施例は、説明のためのみに意図されたものであり、制限しているものを意味するものでもなく、そのように読まれるべきものでもない。実施例１２ｇの加水分解された動物コラーゲン、３ｇのラクトースおよび１．５ｇのバクト酵母エキス（ＤＩＦＣＯ）／１００ｍｌの蒸留水（ｐＨ６．０）の発酵培地を調製した。この培地を１２０℃で３０分間（液体サイクル）１５ＰＳＩで滅菌し、冷却した。滅菌発酵培地のそれぞれの試料に、続いて表１に列挙した、すべてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、１２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ２０８５２、Ｕ．Ｓ．Ａに、以下の表１に列挙された預託番号の下に預託してある多様なマイクロバクテリウムの菌株の活性培養を接種した（３％ｖ／ｖ）。表１に概略を示したそれぞれの試料の接種の後、発酵を、３０−３２℃で２３時間（Ｍ．インペラルのための試料１および２の場合）、４７時間（Ｍ．ラエバニフォルマンスのための試料９および１０の場合）または３６時間（試料３−８）、温度調節されたベンチトップ保温旋回シェーカーＧ２４（３／４”（１９ｍｍ）の直径の円軌道、水平方向に旋回）、３５０ＲＰＭに保持、において行った。実施例２Ｌアスパラギン酸の生産は以下のように行った。実施例１の試料１、３、５、７および９の発酵培養液体培地全体の中の細菌細胞を、米国レター特許出願番号第４７６００２４号の実施例２０（および表２）に記載のとおりに、しかし６ＮＮａＯＨをｐＨ調整に用いて固定化した。前処理溶液で、（水１００ｍｌあたり）１０％（ｗ／ｖ）Ｌアスパラギン酸（ＳＩＧＭＡ）、０．１％（ｗ／ｖ）塩化カルシウム２水和物、０．１％（ｗ／ｖ）ＴＷＥＥＮ８０（ＳＩＧＭＡ）および水酸化アンモニウム（５６．６％（ｗ／ｗ）、ｐＨ７．５に調整用）から成るものを調製した。１０％（ｗ／ｖ）の固定化された細胞を前処理溶液に添加した。これらの試料を続いて６時間、４０℃で穏やかに振とうしながら保温した。前処理溶液をデカンテーションにより固定化細胞から除去し、固定化細胞を５０ｍｌ部の１．０Ｍフマル酸アンモニウム、ｐＨ８．８（それにより変換溶液を形成）中に４０℃で１時間再懸濁した。１時間後、細胞を反応生成物（および変換溶液）から１５０００ＲＰＭ（ＳＳ −３４ローター）で４５分間の遠心分離により分離し、反応生成物を高圧力液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で、ＨＰＸ−８７Ｃカラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いてカラム温度８０℃で、０．０１Ｍ酢酸カルシウム（ｐＨ５．５）を移動相として用いて分析した。ＲＩ検出を、０．９ｍｌの流速とともに用いた。Ｌアスパラギン酸生産および濃度を、続いてＨＰＬＣ分析から決定された標準曲線から得られた標準と比較することにより決定した。この方法およびマイクロバクテリウム属の多様な菌株の利用の結果を以下の表２にまとめる。上記の反応生産物のＨＰＬＣ分析は、前処理された固定化細胞とフマル酸アンモニウムのｐＨ８．８での保温はＬアスパラギン酸を生産したことを示していた。実施例３Ｌリンゴ酸の生産は以下のように成された。実施例１の試料２、４、６、８、および１０の発酵培養液体培地全体の中の細菌細胞を培養培地から、試料の１５０００ＲＰＭ（ＳＳ−３４ローター）で４５分間の遠心分離により分離した。そのように回収された、各々の試料の２ｇの湿細菌細胞を、５０ｍｌ部の１．０Ｍフマル酸ナトリウム、ｐＨ７．５（それにより変換溶液を形成）中に４０℃で１時間再懸濁した。１時間後、細胞を反応生成物（および変換溶液）から１５０００ＲＰＭ（ＳＳ −３４ローター）で４５分間の遠心分離により分離し、反応生成物を高圧力液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で、ＨＰＸ−８７Ｈカラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いてカラム温度６０℃で、０．０１Ｎ硫酸を移動相として用いて分析した。０．７ｍｌの流速であった。ＲＩ検出を用いた。Ｌリンゴ酸生産および濃度を、続いてＨＰＬＣ分析から決定された標準曲線から得られた標準と比較することにより決定した。この方法およびマイクロバクテリウム属の多様な菌株の利用の結果を以下の表３にまとめる。上記の反応生産物のＨＰＬＣ分析は、前処理された固定化細胞とフマル酸ナトリウムのｐＨ７．５での保温はＬアスパラギン酸を生産したことを示していた。実施例４Ｍ．アルボレセンスＡＴＣＣ４３５８を、１０ｌの発酵液体培地を生産するために用いられた成分を１００倍に増加させたことを除いては上記実施例１に記載のとおりに得、培養した。これらの細菌細胞を、上記の実施例２記載の手順および変数に従って（米国レター特許出願番号第４７６００２４号の実施例２０および表２を参照）増加された量のために必要なように調整して固定化した。１０ｌの発酵液体培地を続いて脱塩水で、その測定された導電率が６０００オーム以下となるまで希釈した。希釈した培地を続いて１００ｇのＦＷ−２（イーグル−ピッチャー；Ｅａｇｌｅ−Ｐｉｃｈｅｒ）と混合し、均質な溶液が得られるまで混合した（約１５−３０分）。６３０ｍｌの５％（ｗ／ｖ）ポリエチレンイミン水性溶液を添加し、混合物をｐＨ８．０で均質な混合物が得られるまで（約１５分間）撹拌した。次に、２７００ｍｌの５％（ｗ／ｖ）キトサンを添加し、混合物をｐＨ８．０で均質な混合物が得られるまで（約１５分間）撹拌した。８００ｍｌの５％（ｗ／ｖ）グルタールアルデヒドを添加し、ｐＨを６Ｎの水酸化ナトリウムを用いて９．０に調整した。混合物を濾過（Ｃ．ＧＯＯＤＭＡＮＣｏ．クロスフィルター、カタログ番号７４１８−０ポリプロピレンフェルト、１８オンスフェルト二重取り付け）前に１時間穏やかに撹拌し、押出し（ダイサイズ：１ｍｍ）および４５℃でＧｌａｔｔＤｒｙｅｒ（ＧＬＡＴＴＡＩＲＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ｉｎｃ．）中で乾燥した。乾燥固定化細胞小片をフマル酸またはその塩をＬリンゴ酸に変換するために以下のように用いた。乾燥固定化細胞小片調製物を、続いて被膜カラム（２．５ｃｍｘ５０ｃｍ）中に充填した。フマル酸ナトリウム溶液（変換溶液）ｐＨ７．５（１Ｍ）を、続いて継続的にカラムの中を４０℃で、１時間あたり、１．５カラムベッド体積の流速で通過させた。溶出物中のＬリンゴ酸成分をＨＰＬＣによって決定した。フマル酸のＬリンゴ酸への変換は８０％以上であった。実施例５Ｍ．アルボレセンスＡＴＣＣ４３５８を、１０ｌの発酵液体培地を生産するために用いられた成分を１００倍に増加させたことを除いては上記実施例１に記載のとおりに得、培養した。これらの細菌細胞を、上記実施例２記載の手順および変数に従って（米国レター特許出願番号第４７６００２４号の実施例２０および表２を参照）増加された量のために必要なように調整して固定化した。１０ｌの発酵液体培地を続いて脱塩水で、その測定された導電率が６０００オーム以下となるまで希釈した。希釈した培地を続いて１００ｇのＦＷ−２（イーグル−ピッチャー；Ｅａｇｌｅ−Ｐｉｃｈｅｒ）と混合し、均質な溶液が得られるまで混合した（約１５−３０分）。６３０ｍｌの５％（ｗ／ｖ）ポリエチレンイミン水性溶液を添加し、混合物をｐＨ８．０で均質な混合物が得られるまで（約１５分間）撹拌した。次に、２７００ｍｌの５％（ｗ／ｖ）キトサンを添加し、混合物をｐＨ８．０で均質な混合物が得られるまで（約１５分間）撹拌した。８００ｍｌの５％（ｗ／ｖ）グルタールアルデヒドを添加し、ｐＨを６Ｎの水酸化ナトリウムを用いて９．０に調整した。混合物を濾過（Ｃ．ＧＯＯＤＭＡＮＣｏ．クロスフィルター、カタログ番号７４１８−０ポリプロピレンフェルト、１８オンスフェルト二重取り付け）前に１時間穏やかに撹拌し、押出し（ダイサイズ：１ｍｍ）および４５℃でＧｌａｔｔＤｒｙｅｒ（ＧＬＡＴＴＡＩＲＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ｉｎｃ．）中で乾燥した。乾燥固定化細胞小片をフマル酸またはその塩をＬアスパラギン酸に変換するために以下のように用いた。乾燥固定化細胞調製物を、１０％（ｗ／ｖ）Ｌアスパラギン酸、０．１％（ｗ／ｖ）塩化カルシウム２水和物、０．１％（ｗ／ｖ）ＴＷＥＥＮ８０（ＳＩＧＭＡ）およびｐＨを８．８に調節するための濃縮（５６．６ｗ／ｗ）水酸化アンモニウムの混合物と共に４５℃で５から８時間緩やかに撹拌しながら混合した。溶液を続いてデカンテーションし、前処理した固定化調製物をカラムにつめた。フマル酸アンモニウム（１Ｍ）ｐＨ８．８の水性溶液（変換溶液）を、１時間あたり１／３カラムベッド体積に等しい流速で３７℃でカラムに通した。Ｌアスパラギン酸を、続いて、溶出物のｐＨを、濃硫酸によって２．０−３．０に調整して沈殿させた。溶出物中のＬリンゴ酸成分をＨＰＬＣによって決定した。結果を表４に示す。従って、本発明の方法の利用はフマル酸からＬアスパラギン酸への効率的で効果的な酵素的変換という結果となることがみられるであろう。本発明の基本精神から離れることなく、多くの変更が成され得る。従って、添付のクレームの範囲内で、発明がここに特に記載されている以外にも実施されうることは当業者に理解されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｒ 1:32） (Ｃ１２Ｐ 13/20 Ｃ１２Ｒ 1:32） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．フマル酸またはその塩をマイクロバクテリウム属の菌株と反応させ、それによりフマル酸またはその塩をＬ有機酸またはＬアミノ酸の何れかに酵素的に変換し、当該Ｌ有機酸またはＬアミノ酸を回収することから成るＬ有機酸またはＬアミノ酸を製造するための方法。２．前記菌株がマイクロバクテリウムインペラル種であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。３．菌株がＭ．インペラルＡＴＣＣ８３６５であることを特徴とする請求の範囲第２項記載の方法。４．前記菌株がマイクロバクテリウムラクチカム種であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。５．前記菌株がＭ．ラクチカムＡＴＣＣ８１８０であることを特徴とする請求の範囲第４項記載の方法。６．前記菌株がマイクロバクテリウムアンモニアフィラム種であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。７．前記菌株がＭ．アンモニアフィラムＡＴＣＣ１５３５４であることを特徴とする請求の範囲第６項記載の方法。８．前記菌株がマイクロバクテリウムアルボレセンス種であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。９．前記菌株がＭ．アルボレセンスＡＴＣＣ４３５８であることを特徴とする請求の範囲第８項記載の方法。 10．前記菌株がマイクロバクテリウムラエバニフォルマンス種であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。 11．前記菌株がＭ．ラエバニフォルマンスＡＴＣＣ１５９５３であることを特徴とする請求の範囲第１０項記載の方法。 12．前記フマル酸またはその塩がフマル酸ナトリウムであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。 13．前記フマル酸またはその塩がフマル酸ナトリウムであり、それによって製造されるＬ有機酸がＬリンゴ酸であることを特徴とする請求の範囲第１２項記載の方法。 14．前記フマル酸またはその塩がフマル酸アンモニウムであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。 15．前記フマル酸またはその塩がフマル酸アンモニウムであり、それによって製造されるＬアミノ酸がＬアスパラギン酸であることを特徴とする請求の範囲第１４項記載の方法。 16．前記Ｌ有機酸またはＬアミノ酸がＬリンゴ酸であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。 17．前記Ｌ有機酸またはＬアミノ酸がＬアスパラギン酸であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。 18．マイクロバクテリウム属の菌株、および、有機酸またはアミノ酸であってそのＤ異性体またはＤＬ異性体を含まないＬ有機酸またはＬアミノ酸、を含む反応物質溶液。 19．前記有機酸またはアミノ酸がＬリンゴ酸であることを特徴とする請求の範囲第１８項記載の反応物質溶液。 20．前記有機酸またはアミノ酸がＬアスパラギン酸であることを特徴とする請求の範囲第１８項記載の反応物質溶液。 21．前記菌株がマイクロバクテリウムインペラル種の菌株であることを特徴とする請求の範囲第１８項記載の反応物質溶液。 22．前記菌株がマイクロバクテリウムラクチカム種の菌株であることを特徴とする請求の範囲第１８項記載の反応物質溶液。 23．前記菌株がマイクロバクテリウムアンモニアフィラム種の菌株であることを特徴とする請求の範囲第１８項記載の反応物質溶液。 24．前記菌株がマイクロバクテリウムアルボレセンス種の菌株であることを特徴とする請求の範囲第１８項記載の反応物質溶液。 25．前記菌株がマイクロバクテリウムラエバニフォルマンス種の菌株であることを特徴とする請求の範囲第１８項記載の反応物質溶液。 26．フマル酸またはその塩をマイクロバクテリウム属の菌株によって天然に生産されたフマラーゼと反応させ、それによりフマル酸またはその塩をＬ有機酸またはＬアミノ酸の何れかに酵素的に変換し、当該Ｌ有機酸またはＬアミノ酸を回収することから成るＬ有機酸またはＬアミノ酸を製造するための方法。