JPH10511558A - 神経薬スクリーニング - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 神経疾患又は神経傷害の診断又は治療に有用な薬剤のための先導的化合物を同定するための組成物は、単離されたネトリンと、結腸直腸癌に欠落しているもの（ＤＣＣ）及びネオゲニンのような単離された天然のネトリンレセプターを含んでいる。この方法は、単離された哺乳動物ネトリン、単離された天然の哺乳動物ネトリンレセプター及び候補薬剤の混合物をインキュベートし、薬剤の存在がネトリンのレセプターへの結合を調節するかどうかを決定する工程を含んでいる。

Description

【発明の詳細な説明】 神経薬スクリーニング この出願においてなされた研究は、国立衛生研究所の補助金によって一部支援 されたものである。合衆国政府はこの出願についての特許に対して権利を有する ものである。 緒言 分野 本発明の技術分野は、哺乳動物のネトリン(netrin)と哺乳動物ネトリンレセプ ターを用いた神経薬スクリーニングである。 背景 ネトリンは、発育する軸索の成長の大きな調節物質であり、或る軸索の誘因物 質として、また他の軸索の忌避物質として作用する、一群の蛋白質である。それ 自体、これらの効果の調節は、成人神経系の軸索の再生（例えば、傷害や外傷に 続くもの）を援助する重要な治療経路を与える。 ネトリン活性の調節物質の高処理医薬スクリーンを構築する能力は、同定でき る哺乳動物ネトリンがないために制限されていた。ネトリンに対する神経応答を 媒介する軸索上のレセプターを同定することは、神経系の治療に関与する先導的 な医薬を同定するための重要な標的を提供することになる。 関連文献 イシイら(1992)Neuron 9，873-881，は、哺乳動物のネトリン遺伝子に類似の 配列を有するネマトーダ遺伝子、unc-6 を記載している。Leung-Hagensteinら(1 992)Cell 71，289-299，Hedgecockら(1990)Neuron 2，61-85及びHamelin ら(199 3)Nature 364，327-330は、脊椎動物遺伝子、「結腸直腸癌に欠落しているもの （ＤＣＣ）」”Deleted in Colorectal Carcinoma”(DCC)及びネオゲニン(neoge nin)に類似した配列を有する、unc-6 と同じ遺伝子経路にある２つの他の 遺伝子、unc-5 及びunc-40を記載している(Fearonら(1990)Science 247，49-56, Hendrickら(1994)及びVielmetterら(1994)JCB 127，2009-2020)。Cho ら(1995)C urrent Opinion in Genetics and Development 5，72-78は、ＤＣＣ機能の最新 のレビューを記載している。さらに下記の文献も参照されたい。Colamarino &Te ssie-Lavigne(1995)Cell 81，621-629; Kennedyら(1994)Cell 78，425-435;及び Serafiniら(1994)Cell 71，289-299。 発明の概要 本発明は、神経疾患又は神経傷害の診断又は治療に有用な薬剤の先導的化合物 を同定するための方法及び組成物を提供するものである。特に、本発明は、単離 されたネトリンと、このネトリンに特異的に結合し得る、単離された天然ネトリ ンレセプターを含む混合物を提供するものである。ネトリンレセプターの例とし ては、ＤＣＣ及びネオゲニンがある。この一般的な方法は、単離されたネトリン 、単離された天然ネトリンレセプター、及び候補となる薬剤を含む混合物をイン キュベートし、該薬剤の存在が、レセプターに対するネトリンの結合を調節する かどうかを決定する工程を含む。特定の薬剤は、神経疾患又は神経傷害の診断又 は治療に有用な薬剤のための先導的化合物を与える。 詳細な説明 本発明は、哺乳動物、特にヒトの、神経疾患又は神経傷害の診断又は治療に有 用な生理活性物質又は薬剤を同定するための方法及び組成物を提供するものであ る。この方法は、哺乳動物、特にヒトの、ネトリンと、対応するネトリンレセプ ターの相互作用を、候補薬剤の存在下及び非存在下でモニターするというもので ある。レセプター活性化アッセイ、結合アッセイをはじめとする、広範な種類の アッセイが利用できる。結合アッセイは、細胞上に発現した全長レセプターの細 胞外領域に対するネトリンの結合、又はＣ末端を切り詰めたレセプターに対する ネトリンのインビトロ蛋白質−蛋白質結合をモニターすることができる。一般的 には、このようなインビトロスクリーニングは、固体基質への結合パートナーの 一方の固定化を含んでいる。 このアッセイは、単離されたネトリンと、このネトリンに特異的に結合するこ とができる単離された天然ネトリンレセプターを含む混合物を使用する。このア ッセイに使用するネトリンレセプターの例としては、ＤＣＣ及びネオゲニンがあ る。本発明者は、これらの哺乳動物遺伝子産物が天然の哺乳動物、特にヒトの、 ネトリンレセプターとして機能することを見いだした。この一般的な方法は、単 離されたネトリン、単離された天然ネトリンレセプター、及び候補薬剤を含む混 合物を形成し；この混合物を所定の条件下でインキュベートして、それにより、 前記候補薬剤が存在しないならば、前記ネトリンが前記ネトリンレセプターに第 １結合親和力で特異的に結合し；前記ネトリンレセプターに対する前記ネトリン の第２結合親和力を検出する工程を含み、前記第１と第２の結合親和力の差が大 きいということは、前記候補薬剤が神経疾患又は神経傷害の診断又は治療に有用 な薬剤のための先導的化合物及び／又は生理活性物質であることを示す。 以下の例示的なアッセイは、例示の目的で示すものであり、限定的なものでは ない。トランスフェクトしたＣＯＳ細胞のリガンドスクリーニング。 Ｉ リガンドの調製 発現構築物：標的ネトリンをコードするｃＤＮＡをヒトＩｇＧのＦｃ部分で標 識し、２９３発現ベクターにサブクローニングする(ｐＣＥＰ４：In Vitrogen) 。 トランスフェクション：２９３ＥＢＮＡ細胞を、ネトリン発現構築物でトラン スフェクトする（CaPO₄法）。24時間後、回収し、トランスフェクト細胞を、Ｇ ４１８（ゲネティシン，２５０μg/ml，ギブコ）及びハイグロマイシン(200μg/ ml)で選択する。選択処理が完了したら細胞をダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ ＭＥ）／１０％ＦＣＳ中に、選択条件下に保持する。 調整培地の調製：血清含有培地を、グルタマックス−１（ギブコ）と３００ng /ml ヘパリン（シグマ）を含むオプチメン(Optimem)に置き換え、細胞を３日間 調整する。この培地を集め、3,000 ｘｇで10分間遠心する。上清を濾過し(0.45 μm)、0.1 ％アジドを加え、４℃で２週間以内、保存する。 II 繰り詰めたレセプターの調製（ポジティブコントロール） 発現構築物：細胞外領域を含む対応するネトリンレセプター欠落変異体をコー ドするｃＤＮＡ（経膜領域のＮ末端で切り詰めた）を２９３発現ベクターにサブ クローニングする(ｐＣＥＰ４：In Vitrogen)。 トランスフェクション：２９３ＥＢＮＡ細胞を、レセプター変異体発現構築物 でトランスフェクトする（CaPO₄法）。24時間後、回収し、トランスフェクト細 胞を、Ｇ４１８（ゲネティシン，２５０μg/ml，ギブコ）及びハイグロマイシン (200μg/ml)で選択する。選択処理が完了したら細胞をダルベッコ改変イーグル 培地（ＤＭＥ）／１０％ＦＣＳ中に、選択条件下に保持する。 調整培地の調製：血清含有培地を、グルタマックス−１（ギブコ）と３００ng /ml ヘパリン（シグマ）を含むオプチメン(Optimem)に置き換え、細胞を３日間 調整する。この培地を集め、3,000 ｘｇで10分間遠心する。上清を濾過し(0.45 μm)、0.1 ％アジドを加え、４℃で２週間以内、保存する。 II トランスフェクトＣＯＳ細胞 ＣＯＳ細胞（250,000）を３５mm皿の２mlＤＭＥ／１０％ＦＣＳに播く。 18〜24時間後、１μg のネトリンレセプターをコードするＤＮＡ（ｐＭＴ２１ 発現ベクターにクローニングしたｃＤＮＡ）を血清を含まない培地２００μl に 希釈し、６μl のリポフェクタミン（ギブコ）を加える。この溶液を室温で15〜 45分間インキュベートする。 この細胞をＰＢＳで２回洗浄する。脂質−ＤＮＡ複合体を含む試験管に血清を 含まない培地８００μl を加える。この溶液を洗浄した細胞の上にのせる。 ６時間インキュベートする。１mlＤＭＡ／２０％ＦＣＳを加えて反応を停止す る。細胞をリフィードする。12時間後アッセイを行う。 III リガンド結合アッセイ トランスフェクトＣＯＳ細胞のプレートを冷ＰＢＳ(プラスCa/Mg)/1% ヤギ血 清で１回洗浄する。１mlの調整培地（ニート）を加え、室温で90分間インキュベ ートする。 プレートをＰＢＳ(プラスCa/Mg)で３回洗浄する。４回目の洗浄の際、１mlＰ ＢＳに対して１mlの50％メタノールを加える。次いで、１mlのメタノールを加え る。空気を抜いてから１mlメタノールを加える。 ＰＢＳで１回洗浄する。ＰＢＳ／１％ヤギ血清で１回洗浄する。 ＰＢＳ／１％ヤギ血清中の第２抗体（アルカリ性ホスファターゼに結合した１ 対2,000 抗ヒトＦｃ(Jackson Lab)）を加える。室温で30〜40分間インキュベー トする。 ＰＢＳで３回洗浄する。アルカリ性ホスファターゼバッファー（100 mM Tris- Cl，pH9.5，100mM NaCl，5mM MgCl₂）で１回洗浄する。アルカリ性ホスファター ゼ試薬を調製する：アルカリ性ホスファターゼバッフー中に、4.5μl/ml NBTと3 .5 μl/ml BCIP （ギブコ）を含む。 10〜30分間インキュベートし、20 mM EDTAのＰＢＳ溶液で冷却する。 ネトリンに結合した細胞は、暗紫色の反応生成物の存在によって眼で見える。 平行してインキュベーションを行い、希釈系列の変異体レセプター調整培地と 結合したネトリンを滴定することにより、ポジティブコントロールを与える。 IV 結果：ネトリンレセプターに対するネトリンの結合 哺乳動物ネトリンを発現する細胞はネトリンレセプターに結合することが示さ れた。第２抗体存在下で、ネトリン−Ｆｃ融合の不存在下では、対照ＣＯＳ細胞 又はレセプター発現ＣＯＳ細胞との反応性は観察されなかった。ネトリンが直接 にアルカリ性ホスファターゼに融合し、第２抗体を必要としない構築物を使用し たレセプター発現細胞に対する結合は観察された。レセプター欠落変位体は、阻 害アッセイのためのポジティブコントロールとして作用する、ネトリン−レセプ ター結合を滴定する。 この明細書に引用したすべての刊行物及び特許出願の内容は、各刊行物又は特 許出願が具体的にかつ個別に参照されることにより、この明細書に含まれるもの とする。本発明の理解を容易ならしめるために、本発明を例示により詳細に説明 したが、本発明の開示に照らし、特許請求の範囲の精神及び範囲を逸脱すること なく変更、改変を行うことができることは当業者に明らかなところである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 マス カスコ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94143 サンフランシスコ（番地なし）ユ ーシーエスエフ デパートメント アナト ミー (72)発明者 マス マサユキ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94143 サンフランシスコ（番地なし）ユ ーシーエスエフ デパートメント アナト ミー (72)発明者 レナード ディヴィッド アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94143 サンフランシスコ（番地なし）ユ ーシーエスエフ デパートメント アナト ミー (72)発明者 テッシエール ラヴィーニュ マルク アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94143 サンフランシスコ（番地なし）ユ ーシーエスエフ デパートメント アナト ミー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．単離された哺乳動物のネトリンと、該ネトリンに特異的に結合し得る単離さ れた天然の哺乳動物ネトリンレセプターを含む混合物。 ２．ネトリンがヒトネトリンである請求項１記載の混合物。 ３．レセプターが結腸直腸癌に欠落している（ＤＣＣ）ものである請求項１記載 の混合物。 ４．レセプターがネオゲニンである請求項１記載の混合物。 ５．単離された哺乳動物のネトリンと、該ネトリンに特異的に結合し得る単離さ れた天然の哺乳動物ネトリンレセプターを含み、該レセプターが、結腸直腸癌に 欠落しているもの（ＤＣＣ）及びネオゲニンからなる群から選ばれたものである 混合物。 ６．神経疾患又は神経傷害の診断又は治療に有用な薬剤のための先導的化合物又 は生理活性物質を同定する方法において、 単離された哺乳動物ネトリン、単離された天然の哺乳動物ネトリンレセプター 、及び候補薬剤とを含む混合物を形成し； 該混合物を、所定の条件下でインキュベートして、該候補薬剤が存在する場合 を除き、該ネトリンが第１抗体親和力で該ネトリンレセプターに特異的に結合し ；該ネトリンレセプターに対する該ネトリンの第２抗体親和力を検出し； 該第１結合親和力と該第２結合親和力の差が、神経疾患又は神経傷害の診断又 は治療に有用な薬剤のための先導的化合物又は生理活性物質であることを示すも のである、上記方法。 ７．ネトリンがヒトネトリンである請求項６記載の方法。 ８．レセプターが、結腸直腸癌に欠落しているもの（ＤＣＣ）である請求項６記 載の方法。 ９．レセプターが、ネオゲニンである請求項６記載の方法。 10．レセプターが、結腸直腸癌に欠落しているもの（ＤＣＣ）及びネオゲニンか らなる群から選ばれたものである請求項６記載の方法。