JPH10512753A - Ｃ−Ｃケモカイン受容体３：ＣＫＲ−３またはＥｏｓ−Ｌ２ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、Ｃ−Ｃケモカイン受容体３（ＣＫＲ−３）またはＥｏｓＬ２と称する哺乳類（例えば、ヒト）受容体蛋白質をコードする単離および／または組み換え核酸ならびに本明細書で単離、組み換え哺乳類ＣＫＲ−３受容体と称する蛋白質またはポリペプチドに関する。さらに、本発明は、本発明の受容体蛋白質またはその一部をコードする核酸を含む組み換え核酸構築物、組み換えＣＫＲ−３受容体またはポリペプチドの生産に有用なかかる構築物を含む宿主細胞ならびに研究および診断的応用に有用な、該受容体と反応する抗体に関する。また、リガンド、受容体機能の阻害剤（例えば、アンタゴニスト）もしくは促進剤（アゴニスト）を同定するために、該核酸、蛋白質および宿主細胞の使用方法も提供される。治療を必要とする個体への受容体機能を阻害または促進する化合物の投与は、白血球機能の選択的調節に対する新規なアプローチを提供し、様々な炎症性および自己免疫性疾患または感染治療において有用である。好酸球およびリンパ球等の白血球に存在する主要な白血球ケモカイン受容体として、該受容体は、薬剤のスクリーニングおよび設計に対する手掛かりとなる標的を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｃ−Ｃケモカイン受容体３：ＣＫＲ−３またはＥｏｓ−Ｌ２関連出願 本願は、1995年1月19日に出願された米国出願第08/375,199号の一部継続出願 であり、その教示はすべて参考文献により本明細書に合体させる。政府の補助 本明細書に記述する研究はその全部または一部が米国政府の助成金によって補 助された。米国政府は本発明に関して一定の権利を有する。背景技術 ケモカイン類はインテクリン（intecrine）類とも呼ばれ、化学誘引機能を持 つサイトカインファミリーの可溶性で低分子量の構成要素である。ケモカイン類 は、例えば、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、マスト細胞などの白血 球、T細胞、B細胞などのリンパ球および多形核白血球（好中球）などを含む血液 を構成する（赤血球以外の）要素の走化性を選択的に誘導できる。走化性の刺激 に加えて、ケモカイン類は、細胞形状の変化、細胞内遊離カルシウム濃度（［Ca²⁺ ］ｉ）の一過性上昇、顆粒エキソサイトーシス、インテグリン上方調節、生物 活性脂質（ロイコトリエンなど）の形成および呼吸バーストなどの応答性細胞に 白血球の活性化に伴う他の変化を選択的に誘発することもできる。したがってケ モカイン類は炎症性応答の初期誘因剤であり、感染または炎症部位への炎症媒介 物質の放出、走化性および管外溢出を引き起こす。 現在までに特徴づけられたケモカイン類はその一次構造に関連性を持つ。これ らは、ジスルフィド結合を形成する4つの保存されたシステインを共有する。数 種類のケモカイン類のcDNAクローニングと生化学的特徴づけによって、これらの 蛋白質は20〜25アミノ酸のリーダー配列を持ち、それが分泌時に切断されて約92 〜99アミノ酸の成熟蛋白質が生じることがわかっている。このファミリーは、こ の保存されたシステインモチーフに基づいて、C-Cケモカイン類（β-ケモカイ ン類）およびC-X-Cケモカイン類（α-ケモカイン類）と呼ばれる２つの種類に分 けられ、保存されたシステインの最初の２つが前者の場合は隣接しており、後者 の場合は介在残基によって分離されている。Baggiolini，M.およびC.A．Dahinde n，Immunology Today，15:127-133（1994））。 C-X-Cケモカイン類には、インターロイキン8（IL-8）、PF4および好中球活性 化ペプチド2（NAP-2）など、好中球の強力な化学誘引物質であり活性化因子であ るいくつかの化学誘引物質が含まれる。C-Cケモカイン類には、単球またはリン パ球の化学誘引物質であり活性化因子であると特徴づけられているが、好中球に とっては化学誘引物質でないと思われるヒト単球走化性蛋白質1〜3（MCP-1、MCP -2およびMCP-3）、RANTES（Regulated on Activation，Normal T Expressed and Secreted）およびマクロファージ炎症性蛋白質1αおよび1β（MIP-1αおよびMI P-1β）などの分子が含まれる。例えば、組換えRANTESは試験管内で単球とメモ リーT細胞の化学誘引物質である（Schall，T.J.ら，Nature，347:669-671（1990 ））。さらに最近になって、分子内に単一のシステイン対を有し、リンパ球を誘 引するリンフォタクチン（lymphotactin）と呼ばれるケモカインが同定されてい る（Kelner，G.S.ら，Science，266:1395-1359（1994））。 C-Cケモカイン類は、アレルギー性炎症におけるその潜在的役割ゆえに大変興 味深い。例えば、MCP-1はヒト好塩基球のエキソサイトーシスを誘発し、ヒスタ ミンおよびロイコトリエンC₄などの炎症媒介物質の高レベルな放出をもたらす。 同様に、ケモカイン結合に応答して起こるこれらの細胞事象を誘発するC-Cケモ カイン類の受容体も極めて興味深い。最近、C-Cケモカイン類のある受容体がク ローニングされたが、これはMIP-1αおよびRANTESを結合すると報告されている 。したがって、このMIP-1α/RANTES受容体はC-Cケモカイン受容体1と命名された （CKR-1；Neote，K．ら，Cell，72: 415-425（1993）；Horuk，R．ら，国際公開 第94/11504号パンフレット,1994年5月26日公開；Gao，J.-I.ら，J．Exp．Med.， 177: 1421-1427（1993））。MCP-１受容体もクローニングされている（ Charo，I.F．ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，91: 2752（1994））。CKR-2と 命名されたこの受容体はMCP-1を高い親和性で結合し、MCP-3にはそれより低い親 和性で結合すると報告されている（Charo，I.F．ら，Proc．Natl．Acad．Sci.US A，91: 2752-2756（1994））。CKR-2は、異なる細胞質テイルを産生するイソタ イプA中の択一的スプライス部位の使用によって生じる２つのイソタイプとして 存在することが示されている。この領域でスプライシングされないイソタイプB は、結合分析とシグナル伝達分析で、MCP-1およびMCP-3の機能的受容体であるこ とが示されている（Charo，I.F．ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，91:2752-27 56（1994）；Myers，S．J.ら，J．Biol．Chem.，270: 5786-5792（1995））。さ らに最近になって、CKR-4と呼ばれる新しい受容体が記述されている。この受容 体に由来するcRNAは、X．laevis卵母細胞に注射すると、MCP-1、MIP-1αおよびR ANTESに応答して、Ca²⁺活性化塩素流を生じると報告された（Power,C.A．ら，J ．Biol．Chem.，270: 19495-19500（1995））。 MCP-1受容体（CKR-2）およびC-Cケモカイン受容体1は７回膜貫通型Ｇ蛋白質共 役受容体のスーパーファミリーに属すると予想される（Gerard，C.およびGerard ，N.P.，Annu．Rev．Immunol.，12: 775-808（1994）；Gerard，C.およびGerard ，N.P.，Curr．Opin．Immunol.，6: 140-145（1994））。このG蛋白質共役（ヘ ビ状）受容体ファミリーは、７つの膜貫通領域を含有する内在性膜蛋白質の大き いグループからなる。これらの受容体のリガンドには、エピネフリンおよびノル エピネフリンなどの生物起源の小さいアミン分子、サブスタンスPおよびニュー ロキニンなどのペプチド、ケモカインなどのより大きな蛋白質など、多様な分子 群が含まれる。これらの受容体はG蛋白質に結合している。G蛋白質はGTP結合能 を持ち、例えば細胞内媒介因子の生産によって、結合した受容体からのシグナル 伝達を媒介できるヘテロ三量体調節蛋白質である。 ２種類のIL-8受容体cDNAのクローニングと配列決定によれば、これらのC-X-C 受容体蛋白質も７回膜貫通型Ｇ蛋白質共役受容体蛋白質と配列類似性を共有する ことが明らかである（Murphy，P.M.およびH.L．Tiffany，Science，253: 1280-1 283（1991）；Murphyら，国際公開第WO93/06299号パンフレット；Holmes，W.E. ら，Science，253: 1278-1280（1991））。アナフィラトキシンC5aや細菌ホルミ ル化トリペプチドfMLPなどの走化性蛋白質に対する他の受容体もクローニングに よって特徴づけられており、やはりこれらの７回膜貫通型蛋白質に対して配列類 似性を持つ受容体蛋白質をコードすることがわかっている（Gerard，N.P.および C．Gerard，Nature，349: 614-617（1991）；Boulay，F.ら，Biochemistry，29: 11123-11133（1990））。既知のケモカイン受容体に対して有意な配列類似性を 持ち、組織および白血球亜集団分布も似ている蛋白質が他にもいくつか同定され クローニングされているが、これらの受容体のリガンドは不確定のままである。 したがって、これらの蛋白質はオーファン受容体と呼ばれている。 ケモカイン類とそれらの標的細胞との相互作用およびこの相互作用によって刺 激される白血球の走化性と細胞活性化などの事象を理解するには、さらなる遺伝 子およびコードされる受容体の単離と特徴づけならびに対応するリガンドの特徴 づけが必須である。発明の要約 本発明は、C-Cケモカイン受容体3（CKR-3）と呼ばれる哺乳類（例えばヒト） 受容体蛋白質をコードする単離および/または組換え核酸に関する。さらに本発 明は、本発明の受容体蛋白質または該受容体の一部をコードする核酸を含有する 、プラスミドまたはレトロウイルスベクターなどの組換え核酸構築物に関する。 本発明の核酸と構築物を用いることによって組換え受容体蛋白質を生産できる。 もう１つの態様として、本願核酸は、本発明の受容体をコードする第2の核酸と ハイブリダイズ可能で、細胞に導入すると、受容体の発現を阻害できるアンチセ ンス核酸をコードする。 本発明のもう1つの側面は、本明細書で「単離組換え哺乳類CKR-3受容体」と呼 ぶ蛋白質またはポリペプチドに関する。組換えCKR-3受容体またはポリペプチ ドは、本明細書に記述するように、宿主細胞中で生産できる。１つの態様におい て、受容体蛋白質は、エオタキシン、RANTESおよび/またはMPC-3などの1以上の ケモカイン類の高アフィニティー結合および/または（1以上の）細胞応答（例え ば走化性、エキソサイトーシス、１以上の炎症媒介物質の放出など）を刺激する 能力によって特徴づけられる。 受容体と反応する抗体は、例えば、受容体またはその一部を免役原として用い るか、受容体蛋白質またはポリペプチドを発現する細胞を用いることによって生 産できる。かかる抗体やその断片は、受容体蛋白質の精製および研究、表面受容 体を発現する細胞の同定ならびに細胞の選別または計数を含む治療的応用、診断 的応用および研究的応用に有用である。 また本発明は、受容体のリガンドならびに受容体機能の阻害剤（例えばアンタ ゴニスト）や促進剤（例えばアゴニスト）を同定する方法をも包含する。１つの 態様において、該細胞に導入された核酸によってコードされる受容体蛋白質また はポリペプチドを発現するように操作されている適当な宿主細胞をアッセイに用 いて、受容体機能のリガンド、阻害剤または促進剤を同定し、その効力を評価す る。かかる細胞は発現された受容体蛋白質またはポリペプチドの機能を評価する 際にも有用である。 本発明によれば、受容体機能のリガンド、阻害剤および促進剤を同定し、さら に治療的効果について評価することができる。リガンドおよび促進剤は必要に応 じて正常な受容体機能の刺激するために使用でき、一方、受容体機能の阻害剤は 受容体活性を軽減または阻害するために使用できる。したがって本発明は、種々 の炎症性疾患と自己免疫疾患に有用な抗炎症療法であって、個体（例えば哺乳類 ）に受容体機能の阻害剤を投与することからなる新規な方法を提供する。対照的 に、個体に対するリガンドまたは促進剤の投与による受容体機能の刺激は、例え ば寄生虫感染症の治療に有用な白血球機能の選択的刺激に対する新規な方法を提 供する。図面の簡単な説明 図1A-1CはヒトCKR-3蛋白質（Eos L2受容体とも呼ぶ）をコードするゲノムクロ ーンから決定したヌクレオチド配列（配列番号：１）およびそのオープンリーデ ィングフレームによってコードされている蛋白質の予想アミノ酸配列（配列番号 ：２）を示す。 図2A-2BはヒトCKR-3受容体をコードするcDNAから決定したヌクレオチド配列（ 配列番号：３）およびそのオープンリーディングフレームによってコードされて いる蛋白質の予想アミノ酸配列（配列番号：４）を示す。 図3は、経内皮走化性アッセイの一種の図解である。24ウェルプレートのウェ ルなどの容器に培養インサートを設置することによって、そのウェル内に第1室 と第2室を作る。ECV304内皮細胞をそのインサートの内側のポリカーボネート膜 上に単層に生育させる。物質（例えばケモカイン）に対する応答について評価し ようとする細胞を上室に入れ、その物質を下室に入れる。内皮層を通過して下室 に移動する細胞を検出する（インサートを除去し、適当な方法で細胞を検出また は計数する）ことによって、走化性を評価できる。例えば、下室の細胞を集め、 それをフローサイトメトリー（例えばFACS分析、光散乱）で評価することができ る。 図4は種々のケモカインに応答して起こるヒト好酸球の走化性を表すヒストグ ラムである。標準的な手法でヒト好酸球を精製し、24ウェル経内皮走化性アッセ イで種々のケモカイン類に対する応答を顕微鏡で評価した（細胞／ハイパワーフ ィールド（HPF））。 図5A-5Bは種々のケモカイン類に対するHL-60細胞（図5A）および酪酸分化HL-6 0細胞（図5B）の応答を表すヒストグラムである。内皮被覆インサートを用いて 走化性アッセイを行い、それを1.5時間続けた。結果は10回行なった異なる実験 の代表例である。 図6はEos L2でトランスフェクトしたL1-2前B細胞の種々のクローンのFACS分 析の図である。200を超えるクローンから得た細胞を、M2抗FLAG ＭＡｂとそれ に続く抗マウスIg-FITCで染色した（Y-軸は細胞数；X-軸は蛍光）。陰性対照（P AUL001）では、トランスフェクトした細胞を無関係な抗体で染色した。 図7はヒト好酸球に対するRANTESおよびMIP-1αの結合を表すヒストグラムであ る。精製した正常ヒト好酸球を、250nMの種々の非放射性ケモカイン類（MIP-1α 、RANTES、IL-8、MCP-1、MCP-3）の存在下または不在下で、0.1nM ¹²⁵I-標識MIP -1αまたはRANTES（放射性）と共に培養した。 図8は種々の非放射性ケモカイン類（RANTES、MIP-1α、MCP-1およびMCP-3）に よるヒト好酸球に対する¹²⁵I-標識RANTES結合の阻害を表すグラフである。ヒト 好酸球を0.1nM放射線標識RANTESおよび指定した濃度の非放射性ケモカイン類と 共にインキュベートした。プロットしたデータは各試料につき2連の平均と標準 偏差である。 図9は非放射性ケモカイン類（250nM）の存在下または非存在下における酪酸分 化HL-60細胞に対する0.1nM放射線標識MIP-1αまたはRANTES（「放射性」）の結 合を表すヒストグラムである。 図10はEos L2感染SF9細胞に対する0.1nM ¹²⁵I-標識（「放射性」）RANTESまた は0.1nM ¹²⁵I-標識（「放射性」）MCP-3の結合を表すヒストグラムである（cpm ，１分あたりのカウント数）。(左から右に向かって、放射性RANTESのみ；放射 性RANTES＋非放射性RANTES；放射性MCP-3のみ；放射性MCP-3＋非放射性MCP-3)。 図11A-11Bは酪酸分化HL-60細胞に対するMCP-3の結合を表すグラフである。図1 1Aでは、0.1nM放射線標識MCP-3の結合を種々の濃度の非放射性MCP-3の存在下で 評価した。図11Bは図11Aのデータから計算したスキャッチャード（Scatchard） プロットである。 図12A-12Bは、モノクローナル抗体（MAb）LS26-5H12を一次抗体とし、FITC-抗 マウスIgを二次抗体として用いた、Eos L2の発現に関するヒト好酸球（図12 A）とリンパ球（図12B）のFACS分析の結果の図である。「neg」は、一次抗体と して非特異的抗体を用いた陰性対照を示す。 図13A-13Dは白血球におけるCKR-3発現をＭＡｂ LS26-5H12およびフローサイト メトリーを用いて決定したグラフである。白血球の亜群を抗CKR-3 ＭＡｂ LS26- 5H12（実線）またはIgG₁イソタイプ適合対照抗体（MOPC-21）（影付き図）で染 色した。図13A，好酸球；図13B，T細胞；図13C，単球；図13D，好中球。ヨウ化 プロピジウム染色に基づいて死亡細胞を排除した。 図14A-14Cは、CKR-3受容体で一過性にトランスフェクトしたL1.2細胞（図14A ）、mockトランスフェクトしたL1.2対照細胞（図14B）またはE5細胞株（安定なL 1.2 CKR-3トランスフェクタント）（図14C）の抗CKR-3モノクローナル抗体（LS2 6-5H12，実線）による細胞表面染色を表すグラフである。対照モノクローナル抗 体MOPC-21によるバックグラウンド染色も示す（影付き図）。 図15A-15Dは、E5細胞株（CKR-3受容体でトランスフェクトされた安定なL1-2細 胞株；図15A）またはヒト好酸球（図15B）に対する放射線標識ヒトエオタキシン の競合的リガンド結合の結果を表すグラフである。細胞を0.6nM ¹²⁵I-標識エオ タキシンおよび種々の濃度の非標識エオタキシン（○）、RANTES（△）またはMC P-3（□）と共にインキュベートした。室温で60分の後、細胞ペレットを洗浄し 、計数した。非標識エオタキシン競合のスキャッチャードプロットをデータから 計算した（図15C，E5細胞株；図15D，好酸球）。 図16は種々のケモカイン類によるE5細胞株に対するヒトエオタキシン結合の阻 害を表すヒストグラムである。E5細胞（安定なL1-2/CKR-3トランスフェクタント ）を、0.6nM放射線標識エオタキシンおよび250nMの指定の非標識ケモカイン類と 共に、または競合剤なしでインキュベートした。 図17A-17CはL1.2細胞およびL1.2受容体トランスフェクタントの走化性を表す ヒストグラムである。１×10⁶細胞のE5細胞株（安定なL1-2/CKR-3トランスフェ クタント）（図17A）、L1.2親細胞株（図17B）またはIL-8 RB L1.2受容体トラ ンスフェクタント株LSLW-2（図17C）を上室に入れ、ケモカイン類を指定した濃 度で下室に入れた。4時間移動させ、下室に移動する細胞を計数した。すべての アッセイを2連で行い、結果は少なくも3回行なった別個の実験の代表例である。 ケモカイン類をx-軸に沿って記載し、移動した細胞数をy-軸に沿って記載し、ケ モカインの濃度をz-軸に沿って記載する。 図18A-18Bは2つの異なる個体から得た好酸球の走化性応答を表すグラフである 。その応答はCKR-3 L1.2トランスフェクタントの応答に似ている。エオタキシン 、RANTES、MCP-3およびMIP-1αに対する好酸球の走化性応答にはドナー間の相違 が観測された。好酸球を血液から精製し、種々の濃度のケモカイン類に対するそ の走化性応答について評価した。値は、同じ2人のドナーを用いて少なくとも4回 行なった実験の代表例から得たものである。 図19は、293細胞をA31 cDNAクローンでトランスフェクトすることによって得 た安定な細胞株（A31-293-20）の膜に対する¹²⁵I-標識RANTESの結合（中心に点 を打った四角）を非トランスフェクト293細胞の膜に対する結合（黒丸）と比較 したグラフである。 図20は、293細胞をA31 cDNAクローンでトランスフェクトすることによって得 た安定な細胞株（A31-293-20）の膜に対する¹²⁵I-標識MCP-3の結合を非トランス フェクト293細胞の膜に対する結合と比較したヒストグラムである。トランスフ ェクトされた細胞（A31-20）またはトランスフェクトされていない細胞（UT293 ）の膜に対する標識MCP-3の結合を、非放射性MCP-3の非存在下（0nM）または非 放射性MCP-3の存在下（100nM）で決定した。 図21は、非放射性MCP-3によってトランスフェクタント（A31-20）または非ト ランスフェクタント（UT293）の膜から外される結合性¹²⁵I-標識MCP-3の量を決 定することによって評価した、結合の特異性を表すヒストグラムである。発明の詳細な説明 本明細書に記述するように、Eos L2またはC-Cケモカイン受容体3（CKR-3） と呼ばれる新規ヒト受容体をコードする核酸を単離した。ヒトのゲノムクローン およびcDNAクローンの両方を特徴づけた。cDNAクローンは、過好酸球増加症候群 の患者から得た好酸球から構築された好酸球cDNAライブラリーから単離した。そ れらのクローンを配列分析したところ、G蛋白質共役受容体であって類似の7回膜 貫通領域構造を持つと考えられる他のC-Cケモカイン受容体とアミノ酸配列類似 性を共有する355アミノ酸の予想蛋白質をコードする1065ヌクレオチドのオープ ンリーディングフレームを含有する遺伝子が明らかになった（図1A-1Cおよび2A- 2B；配列番号：２および4）。 CKR-3ゲノムクローンおよびCKR-3 cDNAクローンがコードする予想蛋白質は、 各24位、106位、183位および273位の細胞外ドメインに1個ずつ、4つのシステイ ン残基を含有する（配列番号：２および4）。これらの位置のシステインは、CKR -1、CKR-2、CKR-4、IL8-RAおよびIL8-RBを含むすべてのケモカイン受容体に保存 されている。さらに、この受容体はDRYLAIVHA（残基130-138）というアミノ酸モ チーフを含有する（配列番号：２および4）。このモチーフもC-X-CおよびC-Cケ モカイン受容体間で高度に保存されており、細胞内にあると予想される。プロテ インキナーゼCリン酸化の共通部位（Kishimoto，A..ら，J．Biol．Chem.，260: 12492-12499（1985）；Woodgett，J.R.，Eur．J．Biochem.，161: 177-184（198 6））が2つあり、１つは第3細胞内ループのアミノ酸位置231に、もう1つは細胞 質テイルのアミノ酸位置333に存在する。さらに、細胞質テイルには8つのセリン /スレオニン残基が存在し、これらは、例えば好中球から単離されたもの（Harib au，B．およびR．Synderman，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90: 9398（1993） ）などのG蛋白質共役受容体キナーゼや他の関連するファミリー構成員（Benovic ，J.L．およびGomez，J.，J．Biol．Chem.，268: 19521-19527（1993）；Kunapu li．P.およびBenovic，J.L.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90: 5588-5594（19 93））のリン酸化部位として機能しうる。セリン/スレオニンが豊富な細胞質テ イルもサイトカイン受容体に共通する特徴である。CKR-1 、CKR-2、CKR-4、IL-8RAおよびIL-8RB受容体とは異なり、CKR-3はどの細胞外ド メインにもN-結合型グリコシル化部位を含有しない。CKR-3受容体蛋白質は、MIP -1α/RANTES受容体とも呼ばれるC-Cケモカイン受容体1とは異なる。 ゲノムライブラリーおよびcDNAライブラリーから得た核酸配列は次の例外を含 めて同一線形順序で並んでいた。２つの配列は、開始コドンの上流が異なる（図 2Aの78位）。ゲノムクローンは、プロモーターおよび5'非翻訳領域のほとんどを コード領域から隔離するイントロンを持つようである。このゲノム配置は、IL-8 RAおよびRB（Ahuja，S.K．ら，J．Biol．Chem.，269: 26381-89（1994）；Spre nger，H.ら，J．Biol．Chem.，269: 11065-11072（1994）；Sprenger，H.ら，J ．Immunol.，153: 2524-2532（1994））およびCKR-1（Gao，J.L．ら，J．Exp．M ed.，177: 1421-1427（1993））を含む他の７回膜貫通型化学誘引物質受容体に 認められるものと類似する（Gerard，N.P.ら，Biochemistry，32: 1243-1250（1 993）；Murphy，P.M.ら，Gene，133: 285-290（1993））。さらに相違点の周辺 のゲノム配列を調べると、規範的なスプライス受容配列が認められる。 当初の配列情報によって、cDNA配列が、1塩基の挿入とそれに続く1塩基の欠失 または1塩基の欠失とそれに続く1塩基の挿入から生じたイン・フレームでシフト していると思われる2つの領域が明らかになった。これらの変異は予想される蛋 白質の263〜266と276〜279のそれぞれに、4つの連続するアミノ酸相違をもたら した。他の相違は予想される蛋白質の182位、196位、197位および315位にアミノ 酸相違をもたらした。配列番号：５に記載のヌクレオチド配列は両クローンで配 列決定された領域を含む共通配列であり、当初の核酸配列の単純な整列（塩基対 塩基）によって構築したものである。cDNAクローンおよびゲノムクローンの間の 当初のアミノ酸相違をXaaで示す配列番号：６は、配列番号：５の予想蛋白質を 表す。しかし、さらに配列分析を行なったところ、オープンリーディングフレー ムのヌクレオチド配列は図2Bのヌクレオチド918〜919に対応する位置でのみ異な ると思われることが明らかになった。ゲノムクローンはこの位置 にCGを持ち、一方、cDNAクローンはこの位置にGCを持つ。したがってゲノムクロ ーンは276位にスレオニン（ACG）をコードし、cDNAクローンは276位にセリン（A GC）をコードする。この相違は配列決定のあいまいさによるものか、逆転写中に cDNAに導入された間違いかもしれない。あるいは、この保存的置換（セリン/ス レオニン）は個体間の多形性によるのかもれない。さらにまた、この相違はcDNA ライブラリー構築用のRNAを採取した患者の好酸球中の受容体遺伝子の突然変異 によるのかもしれない。 ヒト由来のC-Cケモカイン受容体3に特異的なモノクローナル抗体とポリクロー ナル抗体を、この受容体のN-末端合成ペプチドを用いて作製した。そのモノクロ ーナル抗体の1つを用いるFACS（蛍光活性化細胞選別）分析によって、この受容 体がヒト好酸球にはかなり発現するが、単球、好中球、リンパ球、T細胞、T細胞 芽細胞（CD3 ＭＡｂによる活性化で生成したもの）を含む白血球には発現しない ことが明らかになった（図13A-13D）。この発現パターンは高度に精製した白血 球亜群のRNAを用いるノーザン分析によって確認された。しかし、いくつかの実 験ではCKR-3 mRNAまたはCKR-3受容体がTリンパ球中に検出されたので、CKR-3がT リンパ球の亜群で発現される可能性はある（実施例5）。 また、ゲノムクローンおよびcDNAクローンを種々の系で発現させた。トランス フェクトされた哺乳類細胞およびバキュロウイルス感染昆虫細胞におけるゲノム クローン由来の受容体の発現を、抗体を用いて検出した。CKR-3を発現する哺乳 類細胞の安定なトランスフェクタントを構築したところ、コードされている受容 体が、好酸球で観測された結合親和性に匹敵する高い親和性で、特異的に放射線 標識エオタキシンを結合することがわかった。トランスフェクト れた哺乳類細 胞を用いる研究によって、この受容体がRANTESおよびMCP-3をも高い親和性で特 異的に結合するが、試験した他のCCまたはCXCケモカイン類とは結合しないこと が示された。この結合データと一致して、本明細書に示すように、ネズミB細胞 リンパ腫株に生成した受容体トランスフェクタントは、走化性アッセイでエオタ キシン、RANTESおよびMCP-3に応答して移動したが、試験した他のケモカイン類 には応答しなかった。いくつかの異種系で発現させると、このヒト受容体は使用 した条件下でMIP-1αに有意な結合をしなかった。さらに、好酸球および好酸球 様細胞株を用いる走化性ならびにリガンド結合アッセイは、RANTESおよびMCP-3 が、MIP-1α/RANTES受容体であるC-Cケモカイン受容体1とは異なる受容体を介し て好酸球に結合することを示す。 好酸球化学誘引物質としてのMIP-1αの役割には議論がある。ある研究者らは 走化性応答を検出するし（Rot，A．ら，J．Exp．Med.，176: 1489-1495（1995） ）、その一方で他の研究者らはそれを検出しない（図４、実施例1；Ebisawa，M ．ら，J．Immunol.，153: 2153-2160（1994）；Ponath，P.D.ら，J．Clin．Inve st.，（1996）（印刷中））。興味深いことに、MIP-1αはマウスにおける好酸球 化学誘引物質であり、これは、ネズミエオタキシンとも結合してシグナルを発信 するネズミCKR-3ホモログによって媒介されるようである（Post，T.W.ら，J．Im munol.，155: 5299-5305（1995）；この文献の全教示は参考文献により本明細書 に合体される）。 本発明の蛋白質および抗体を用いると、CKR-3受容体を発現するさらなる細胞 タイプ（例えば好塩基球などの白血球）とさらなるリガンドを同定できる。本発 明によれば、他のケモカイン類の哺乳類CKR-3受容体結合能を評価できる。 新規受容体をコードするクローンのクローニングおよび特徴づけならびにエオ タキシン、RANTESおよびMCP-3のようなケモカイン類を結合し、それに応答して 起こる走化性を媒介することが示される新規CKR-3受容体の単離と特徴づけは、 この受容体が、ケモカイン類に応答して起こる選択的な白血球の走化性および活 性化に関与する７回膜貫通型Ｇ蛋白質共役受容体ファミリーの一員であることを 示唆している。CKR-3受容体およびその哺乳類ホモログはMIP-1α/RANTES受容体 およびMCP-1受容体とは異なる（つまりCKR-3受容体はC-Cケモカイン受容体1（CK R-1）およびMCP-1受容体（CKR-2）ならびにそれらのホモログ以外の受 容体である）。 化学誘引物質に応答して起こる白血球走化性と白血球活性化の選択的誘導にお けるケモカイン受容体の役割ゆえに、ケモカイン受容体は白血球移動、とりわけ 炎症に伴う移動に重要な役割を果たす。炎症および感染の部位で生産されたケモ カイン類は、循環から組織内の炎症部位に、選択された白血球亜型を特異的に補 充する。白血球ケモカイン受容体に対するケモカイン結合に引き続いてインテグ リンの活性化が起こり、白血球インテグリンおよび内皮細胞接着分子を介して白 血球が内皮細胞壁に強固に接着する。白血球は平坦な形になり、内皮を通過して 組織内の炎症部位に向かって移動する。白血球の組織または炎症部位に対する特 異性は多くの場合、インテグリンと細胞接着分子の間の接着相互作用のレベルで はなく、ケモカイン-受容体相互作用のレベルで決定される。 RANTESおよびMCP-3は好酸球と好塩基球にとって最も強力な走化性サイトカイ ン類に属する。さらに、RANTESは、Tリンパ球の亜集団であるメモリーT細胞にと っても化学誘引物質であると報告されている。本明細書に示すように、RANTESお よびMCP-3は好酸球と好酸球様細胞の走化性を誘発できる。本明細書に記述するC KR-3受容体蛋白質も、RANTESおよびMCP-3を高い親和性で結合する。 さらに本明細書で明らかにするように、CKR-3はエオタキシンを（好酸球で観 察される結合親和性と比較して）高い親和性で特異的に結合し、CKR-3受容体は その発現が高度に制限されている。例えばRANTESおよびMCP-3（Baggiolini，M. およびDahinden，C.A.，Immunol．Today，15: 127-33（1994）；Dahinden，C.A. ら，J．Exp．Med.，179: 751-756（1994）；Kameyoshi，Y．ら，J．Exp．Med.,1 76; 587-592（1992）；Rot，A．ら，J．Exp．Med.，176: 1489-1495（1995）） ならびにPAF、C5aおよびIL-16（Wardlaw，A.J．ら，J．Clin．Invest.，78: 170 1-1706（1986）；Gerard，N.P.ら，J.Biol．Chem.，264: 1760-1765（1989）；R and，T.H.ら，J．Exp．Med.，173: 1521-1528（1991））など、好酸球に対する 化学誘引物質がいくつか同定されているが、これらの化学誘引物質は他の白 血球細胞型の移動をも誘発する。対照的に、最初はモルモットで同定され、続い てマウスとヒトで同定された強力な好酸球化学誘引物質であるケモカイン、すな わち、エオタキシンは、選択的に好酸球の走化性を誘導する（Jose，P.J.ら，Bi ochem．Biophys．Res．Commun.，205: 788-794（1994）；Jose，P.J.ら，J．Exp ．Med.，179: 881-887（1994）；Rothenburg，M.E.ら，Proc．Natl．Acad.．Sci ．U.S.A.，92: 8960-8964（1995）；Ponath，P.D.ら，J．Clin．Invest.，（199 6）（印刷中））。さらに、CKR-3だけでなくCKR-1とCKR-2をも結合するMCP-3（B en-Baruch，A.ら，J．Biol．Chem.，270: 22123-22128（1995））またはCKR-1と CKR-4を結合するMIP-1α（Neote，K．ら，Cell，72: 415-425（1993）；Power， C.A．ら，J．Biol．Chem.，270: 19495-19500（1995））のようなケモカイン類 とは対照的に、エオタキシンは高い忠実度でCKR-3に結合し、CKR-3を介してシグ ナルを発信する。好酸球に制限されたCKR-3の発現とCKR-3に対するエオタキシン 結合の忠実さは、組織における好酸球の選択的な補充と移動の考えうる機構とな る。これに関して、組織内におけるエオタキシンの生産は選択的な好酸球補充を 誘発することができ、アカゲザルの皮膚内にエオタキシンを注射すると選択的な 好酸球移動が起こる。さらにエオタキシンは、CKR-3トランスフェクタントの試 験管内走化性と同様に、生体内でもRANTESより10倍低い投与量で好酸球を補充す ることが示されている（Ponath，P.D.ら，J．Clin．Invest.，（1996）（印刷中 ））。 結合、シグナル発信または細胞応答の刺激などの受容体機能の阻害または促進 による本発明の哺乳類CKR-3受容体機能の調節は、白血球が媒介する炎症性作用 、とりわけ好酸球および/またはT細胞の作用の効果的かつ選択的な阻害または促 進法を提供する。例えば、本明細書に記述するように同定されるCKR-3受容体機 能のリガンド、阻害剤および促進剤を用いて、治療目的で白血球機能を調節する ことができる。 好酸球はMIP-1α受容体を発現せず、有意な量のMCP-1受容体を発現しない。 さらに、上述のように、エオタキシンおよびRANTESは好酸球にとって最も強力な 化学誘引物質に属し、エオタキシンおよびRANTESはCKR-3受容体に高い親和性で 特異的に結合する。CKR-3受容体は、主要な好酸球およびリンパ球ケモカイン受 容体として、好酸球および/またはTリンパ球機能の干渉または促進にとって重要 な標的である。CKR-3受容体機能を阻害または促進する化合物、例えば本願方法 によって同定されるリガンド、阻害剤および促進剤などは、治療目的で好酸球お よび/またはT細胞機能を調節する際にとりわけ有用である。核酸、構築物およびベクター 本発明は、Eos L2またはC-Cケモカイン受容体3（CKR-3）と命名された哺乳類 （例えばヒト）受容体蛋白質ならびに該受容体の一部をコードする配列を持つ単 離および/または組換え（例えば実質上純粋なものを含む）核酸に関する。１つ の態様において、上記核酸またはその一部は、哺乳類C-Cケモカイン受容体（例 えば哺乳類CKR-3受容体）に特徴的な機能、例えば結合活性（リガンド、阻害剤 および/または促進剤結合など）、シグナル発信活性（哺乳類Ｇ蛋白質の活性化 、細胞質遊離カルシウム濃度［Ca²⁺］ｉの迅速かつ一時的な増加の誘導など）お よび/または細胞応答の刺激（走化性、エキソサイトーシスまたは白血球による 炎症媒介物質の放出の刺激、インテグリン活性化など）などを少なくとも1つは 持つ蛋白質またはポリペプチドをコードする。より具体的には、本発明は哺乳類 CKR-3受容体またはその一部をコードする配列からなる単離および/または組換え 核酸またはその一部に関する。 さらに本発明は、（1）（a）配列番号：１、配列番号：３または配列番号：５ の配列を持つ核酸、（b）配列番号：１、３または5のいずれかの相補鎖、（ｃ） コード領域（配列番号：１のヌクレオチド181-1245、配列番号：３のヌクレオチ ド92-1156または配列番号：５のヌクレオチド15-1079）からなる前述の配列の一 部または前述の配列のいずれかのRNA体（TがUで置換されているもの）とハイブ リダイズできること、または（2）配列番号：２、配列番号：４もしく は配列番号：６のアミノ酸配列を持つポリペプチドまたはその機能的同等物（す なわち上記受容体の天然の（または生理学的な）リガンドの1以上に対するリガ ンド結合活性および/またはリガンド結合に応答する刺激機能を持つため、細胞 応答（走化性、エキソサイトーシスまたは白血球による炎症媒介物質の放出など ）を刺激できるポリペプチド）をコードできること、または（3）その両特徴に よって特徴づけられる、単離および/または組換え核酸に関する。 １つの態様において、配列番号：２、４または6およびそれらの機能的同等物 との間のアミノ酸配列同一率が少なくとも約70%（≧70%）である。好ましい態様 では、配列番号：２、４または6の機能的同等物がそれぞれ配列番号：２、４ま たは6と少なくとも約80%の配列同一性を共有する。より好ましくは、配列番号： ２、４または6およびそれらの機能的同等物との間のアミノ酸配列同一率が少な くとも約90%であり、さらに好ましくは、少なくとも約95%である。これらの基準 に合致する単離および/または組換え核酸には、天然に存在する哺乳類CKR-3受容 体の配列およびその一部と同一の配列を持つ核酸、または天然に存在する配列の 変異型が含まれる。かかる変異型には、１以上の残基の付加、欠失または置換に よって相違する突然変異体、１以上の残基が修飾されている修飾核酸（DNAまた はRNA類縁体など）および1以上の修飾残基を含む突然変異体が含まれる。 かかる核酸は、例えば高ストリンジェンシー条件または中程度のストリンジェ ンシー条件下でのハイブリダイゼーションによって検出および単離できる。核酸 ハイブリダイゼーションに関する「高ストリンジェンシー条件」と「中程度のス トリンジェンシー条件」はCurrent Protocols in Molecular Biology（Ausubel, F.M．ら編，第1巻，増補26,1991；その教示は参考文献として本明細書に合体さ れる）の2.10.1-2.10.16頁（特に2.10.8-11を参照のこと）と6.3.1-6頁に説明さ れている（実施例2も参照のこと）。プローブ長、塩基組成、ハイブリダイズす る配列間のミスマッチ率、温度およびイオン強度などの因子が核酸ハイブリ ッドの安定性に影響を与える。したがって高ストリンジェンシー条件または中程 度のストリンジェンシー条件は、一部には、未知の核酸との相同性を比較しよう とする既知のDNAの特徴に応じて、実験的に決定できる。 配列番号：1、3もしくは5または配列番号：1、3もしくは5のいずれかの相補鎖 に（例えば高または中程度のストリンジェンシー条件下で）ハイブリダイズでき ることを特徴とする単離および/または組換え核酸は、さらに、哺乳類C-Cケモカ イン受容体（例えば哺乳類CKR-3受容体）に特有の機能、例えば結合活性（リガ ンド、阻害剤および/または促進剤結合など）、シグナル発信活性（哺乳類G蛋白 質の活性化、細胞質遊離カルシウム濃度［Ca²⁺］ｉの迅速かつ一時的な増加の誘 発など）および/または細胞応答の刺激（白血球による炎症媒介物質の放出、エ キソサイトーシスまたは走化性の刺激、インテグリン活性化など）などの少なく とも1つを持つ蛋白質またはポリペプチドをコードしてもよい。 ハイブリダイズする核酸によってコードされる蛋白質またはポリペプチドのシ グナル発信機能は、受容体結合に応答するG蛋白質活性の酵素的アッセイ（例え ば膜画分を用いて、G蛋白質αサブユニットにおけるGTPのGDPへの変化など）に よって検出できる。G蛋白質共役は、例えば細胞または適当な細胞画分（膜など ）を百日咳菌毒素などのG蛋白質の特異的阻害剤で処理または予備処理してG蛋白 質による刺激を遮断するアッセイを用いて、さらに評価できる（Bischoff，S.C. ら，Eur．J．Immunol．23: 761-767（1993）；Sozzani，S．ら，J．Immunol．14 7: 2215-2221（1991））。 ハイブリダイズする核酸がコードする蛋白質またはポリペプチドの刺激機能は 、その蛋白質またはポリペプチドを発現する細胞を用いて、走化性または媒介物 質放出に関する標準的アッセイ（例えばリガンド（エオタキシン、RANTESまたは MCP-3などのケモカイン）または促進剤に応答して起こる走化性、エキソサイト ーシス（例えば好酸球ペルオキシダーゼ、β-グルクロニダーゼなどの酵素）ま たは媒介物質の放出を測定するアッセイなど）で検出できる。 ハイブリダイズする核酸がコードする蛋白質またはポリペプチドの結合機能は 、例えば受容体を含有する膜画分または受容体を発現する細胞を用いる結合アッ セイまたは結合阻害アッセイで検出できる（実施例9；Van Riperら，J．Exp．Me d.，177: 851-856（1993）；Sledziewskiら，米国特許第5,284,746号（1994年2 月8日）を参照のこと）。したがって、コードされている蛋白質またはポリペプ チドのエオタキシン、RANTESもしくはMCP-3などのリガンド、阻害剤および/また は促進剤結合能を評価できる。哺乳類CKR-3受容体に特有の機能は他の適当な方 法でも評価できる（下記参照）。 これらの方法は単独で、もしくは他の適当な方法と組み合わせて、配列番号： ２、４、６またはそれらの機能的同等物のアミノ酸配列を持ち、かつ、そのアッ セイで検出される活性を持つポリペプチドをコードする核酸の同定および/また は単離操作にも使用できる。特定の機能を持つ配列番号：２、４または6のポリ ペプチド部分をコードする単離核酸の一部もこの方法で同定および単離できる。 本発明の核酸は蛋白質またはポリペプチドの生産に使用できる。例えば、哺乳 類CKR-3受容体のコード配列の全部または一部を含有する核酸、または配列番号 ：１、３もしくは5の配列または配列番号：１、３もしくは5のいずれかの相補鎖 にハイブリダイズするDNAを、さらなる配列操作またはコードされたポリペプチ ドの適当な宿主細胞における生産のために作製される種々の構築物およびベクタ ーに組込むことができる。 本明細書でいう「単離された」核酸とは、その供給源のゲノムDNAまたは細胞R NA（例えば細胞中やライブラリーのような核酸の混合物中に存在する場合など） の核酸から分離された核酸であり、さらなるプロセシングを受けているものであ ってもよい。「単離された」核酸には、実質上純粋な核酸、化学合成によって生 産された核酸、生物学的方法と化学的方法の組み合わせによって生産された核酸 および単離された組換え核酸を含む、本明細書に記載の方法、類似の方法また は他の適当な方法で得られる核酸が含まれる。本明細書でいう「組換え」核酸と は、組換えDNA法によって生産された核酸であり、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR） および/または制限酵素を用いたベクターへのクローニングなどの人工的組換え 法による操作で作製される核酸を含む。また「組換え」核酸は、細胞の天然の機 構を介して起こる組換え事象によってもたらされる核酸であるが、所望の組換え 事象を許容し、それを起こりやすくするように設計された核酸の細胞への導入後 に選択される核酸でもある。アンチセンス構築物 もう１つの態様において、核酸が、センス鎖からなる標的分子に全部または一 部が相補的で、その標的分子とハイブリダイズできるアンチセンス核酸である。 標的はDNAであってもよいし、そのRNA体（すなわちDNAのT残基がRNA体ではU残基 である）であってもよい。当該技術分野で公知の方法または他の適当な方法で細 胞に導入すると、アンチセンス核酸はそのセンス鎖がコードする遺伝子の発現を 阻害できる。アンチセンス核酸は標準的な技術で生産できる。 １つの態様において、アンチセンス核酸がある標的核酸に対して完全にまたは 部分的に相補的で、標的核酸とハイブリダイズでき、その標的核酸は配列番号： １、３または5の相補鎖の配列を持つ核酸にハイブリダイズできる。例えばアン チセンス核酸は、配列番号：５またはハイブリダイゼーションが可能なその一部 の配列を持つ標的核酸に相補的であってもよい。別の態様において、アンチセン ス核酸が哺乳類CKR-3受容体（例えばヒトEos L2受容体）をコードする標的核酸 に対して完全にまたは部分的に相補的で、該標的核酸とハイブリダイズできる。 アンチセンス核酸は、研究的応用や治療的応用を含む種々の目的に有用である 。例えば、アンチセンス核酸を含む構築物を適当な細胞に導入することによって 、受容体発現を阻害できる。かかる細胞は、例えばその親細胞や他の関連細胞型 を用いて受容体リガンド相互作用の特異性を評価する際に貴重な対照細胞となる 。もう１つの側面として、かかる構築物を哺乳類の細胞の一部または全部に導入 する。アンチセンス核酸は受容体発現を阻害し、その構築物を含有する細胞にお いてCKR-3受容体が媒介する炎症過程を阻害できる。したがって、本発明のアン チセンス核酸を用いて、炎症性の疾患や状態を治療できる。アンチセンス構築物 を含有する適当な実験動物は、白血球機能欠損症、特に好酸球欠損症の有用なモ デルにもなり、CKR-3受容体機能に関してさらなる情報を与える。かかる動物は 、宿主防御における好酸球および/またはTリンパ球などの白血球の役割を解明す るのに有用な、感染性疾患の貴重なモデルにもなりうる。哺乳類核酸 ヒトの炎症性疾患と自己免疫疾患および寄生虫感染症の理解と治療における進 歩は極めて有益だろうから、ヒトCKR-3は本明細書に記載のほとんどの実験に選 択した種であった。しかし、ヒトCKR-3（Eos L2）のゲノムDNAおよびcDNAの単離 および操作、ベクターと宿主株の構築ならびに受容体もしくはその断片の作製お よび使用に関して記述する方法は、霊長類（サル（カニクイザルなど）などのヒ ト以外の霊長類など）、ウシ属（乳牛など）、ヒツジ（緬羊など）、ウマ科（馬 など）、イヌ科（犬など）、ネコ科（イエネコなど）および齧歯類（モルモット 、ラットやマウスなどのネズミ種など）を含むが、ただしこれらに限定されるわ けではない他の哺乳類にも適用できる。本明細書に記載するヒトCKR-3 cDNAクロ ーン、ヒトCKR-3ゲノムクローンまたはそれらの十分な一部は、それが単離体お よび/または組換え体または合成物であるかどうかにかかわらず、またPCRによっ て作製されたコード配列内の断片を含めて、相同なCKR-3遺伝子（ホモログ）ま たは他の関連受容体遺伝子（例えば新規C-Cケモカイン受容体遺伝子）を他の哺 乳類種から（例えばハイブリダイゼーション、PCRまたは他の適当な技術によっ て）検出および/または回収するためのプローブとして使用できる。これは本明 細書に記述する方法や他の適当な方法で達成できる。蛋白質とペプチド 本発明は、本発明の核酸がコードする蛋自質またはポリペプチドにも関する。 本発明の蛋白質およびポリペプチドは、単離体および/または組換え体である。 本明細書でいう「単離された」蛋白質またはポリペプチドとは、哺乳類細胞中に 存在していた状態よりも精製された蛋白質またはポリペプチドである。「単離さ れた」蛋白質またはポリペプチドには、実質上純粋な蛋白質またはポリペプチド 、化学合成や生物学的方法と化学的方法の組み合わせによって作製された蛋白質 またはポリペプチド、単離された組換え蛋白質またはポリペプチドなど、本明細 書に記載の方法、類似の方法または他の適当な方法で得られる蛋白質またはポリ ペプチドが含まれる。本明細書でいう「組換え」蛋白質またはポリペプチドとは 、組換え核酸の発現によって生産される蛋白質またはポリペプチドである。 好ましい態様において、蛋白質またはポリペプチドが哺乳類CKR-3受容体に特 有の機能、例えば結合活性（リガンド、阻害剤および/または促進剤結合など） 、シグナル発信活性（哺乳類G蛋白質の活性化、細胞質遊離カルシウム濃度［Ca^{2 +} ］ｉの迅速かつ一時的な増大の誘導など）および/または細胞応答の刺激（走化 性、エキソサイトーシスまたは白血球による炎症媒介物質の放出の刺激、インテ グリン活性化など）などの少なくとも1つを持つ。そこで、これらの蛋白質を哺 乳類由来のCKR-3蛋白質または哺乳類ケモカイン受容体3蛋白質と呼ぶ。これらの 蛋白質には、例えば天然に存在する哺乳類CKR-3受容体、それら蛋白質の変異型 および/またはそれらの一部が含まれる。かかる変異型には、１以上のアミノ酸 残基の付加、欠失または置換によって異なる多形変異型および天然または人工の 突然変異体、あるいは1以上の残基が修飾されている修飾ポリペプチドおよび1以 上の修飾残基を含む突然変異体が含まれる。一例はエオタキシンを結合する哺乳 類CKR-3受容体蛋白質である。 特に好ましい態様において、本発明の哺乳類CKR-3受容体は、天然に存在する 哺乳類CKR-3受容体蛋白質またはポリペプチドのように、１以上の天然リガンド または生理学的リガンドに対するリガンド結合機能および/またはリガンド結合 に応答する刺激機能をもつので、細胞応答（走化性、エキソサイトーシスまたは 白血球による炎症媒介物質の放出の刺激など）を刺激できる。例えばヒトケモカ イン受容体3蛋白質の場合、単離ヒトCKR-3蛋白質は1以上の天然リガンドまたは 生理学的リガンドを結合する。本明細書に示すように、単離ヒトCKR-3蛋白質は エオタキシンおよびRANTESを高い親和性で特異的にならびにMCP-3を特異的に結 合する。１つの態様において、ヒトCKR-3受容体蛋白質またはポリペプチドが、 リガンド結合に応答して起こる走化性、エキソサイトーシスまたは白血球による 炎症媒介物質の放出のきっかけともなる。 さらに本発明は、上述のような哺乳類CKR-3受容体蛋白質またはポリペプチド を第1部分とし、天然に認められる哺乳類CKR-3受容体には存在しない第2部分に 連結されたその第1部分を含む融合蛋白質にも関係する。したがって、第2部分は アミノ酸またはポリペプチドでありうる。第1部分は融合蛋白質のN-末端に局在 してもよいし、C-末端または内部に存在してもよい。１つの態様において、融合 蛋白質が第1部分であるヒトCKR-3受容体ならびにリンカー配列およびアフィニテ ィーリガンド（酵素、抗原、エピトープ標識など）を含む第2部分とを含む。 融合蛋白質は種々の方法で生産できる。例えば、いくつかの態様は、CKR-3遺 （Pharmacia）およびpET-15b（Novagen）などの適当な発現ベクターに挿入する ことによって作製できる。次に、得られた構築物を適当な発現用宿主細胞に導入 する。発現後、融合蛋白質を適当なアフィニティー基盤を用いて細胞溶解液から 単離または精製できる（例えばCurrent Protocols in Molecular Biology（Ausu bel，F.M．ら編，第2巻，増補26,16.4.1-16.7.8頁（1991）を参照のこと）。さ らにアフィニティー標識は、融合蛋白質中に存在するCKR-3受容体蛋白質または ポリペプチドの検出手段を提供する。例えば、抗原またはエピトープアフィニテ ィー標識からなる融合蛋白質の細胞表面発現や特定の細胞画分における該融合 蛋白質の存在は、適当な抗体を用いて検出できる（例えば実施例3を参照のこと ）。 また本発明は、例えばヒトCKR-3受容体の断片などの哺乳類由来のCKR-3受容体 の単離および/または組換え部分にも関する。後に詳述するように、哺乳類CKR-3 受容体の一部（例えば合成ペプチド）を作製し、それを抗体の生産に使用するこ とができる。１つの態様において、選択された哺乳類CKR-3受容体の単離および/ または組換え部分（例えばペプチド）が少なくとも1つの免疫学的特性を持つ。 本明細書で受容体の一部に関して用いる免疫学的特性には、免疫反応性（本発明 の哺乳類CKR-3受容体蛋白質（その一部を含む）に対して生じた抗体によって結 合される）、免疫原性（適当な免疫感作法で使用すると、それ自身に対する抗体 応答を誘導する）および/または交差反応性（選択された哺乳類受容体と反応す る抗体を誘導する）が含まれる。さらに、哺乳類CKR-3受容体に特有な機能、例 えば結合活性、シグナル発信活性または刺激機能（細胞応答の刺激）などの少な くとも１つを持つCKR-3受容体の一部も作製できる。哺乳類G蛋白質共役受容体の 構造と機能に関する詳細な研究は、哺乳類CKR-3受容体を機能ドメインに分割す ることを可能にするための基礎を提供する（例えばLefkowitzら，J．Biol．Chem .，263: 4993-4996（2988）；PanayotouおよびWaterfield，Curr．Opinion Cell Biol.，1: 167-176（1989）を参照のこと）。さらに、完全な機能または部分的 な機能を所有する受容体の一部、または第2の受容体の別の部分と結合した時に 、哺乳類CKR-3受容体に特有な機能（例えばリガンド、阻害剤もしくは促進剤結 合機能）の少なくとも1つを持つ機能的蛋白質を構成する受容体の一部を作製す ることもできる。（試験試料中のリガンドの存在を検出する際に有用なハイブリ ッドG蛋白質共役受容体の構築と使用については、例えばSledziewskiら，米国特 許第5,284,746号を参照のこと）。組換え哺乳類CKR-3受容体の製造方法 本発明のもう1つの側面は、哺乳類CKR-3受容体またはその一部を製造する方 法に関する。哺乳類CKR-3受容体またはその一部の発現に適した構築物も提供す る。この構築物は適当な宿主細胞に導入できる。組換え哺乳類CKR-3受容体また はその一部を発現する細胞を単離し、培養中に維持することもできる。かかる細 胞は、特徴づけ、単離および/または精製用の蛋白質の生産や、リガンド、また はリガンド結合の阻害剤もしくは促進剤を検出するための結合アッセイでの使用 など、種々の目的に有用である。適当な宿主細胞は、例えば大腸菌、枯草菌およ び他の適当な細菌等の細菌細胞を含む原核細胞であってもよいし、例えばカビ細 胞、酵母細胞（例えばピチア・パストリス（Pichia pastoris）、アスペルギル ス種、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ（pombe）、 ニューロスポラ・クラッサ）などの真核細胞、または他の下等真核細胞および昆 虫由来の細胞（例えばSf9昆虫細胞）または哺乳類由来の細胞（例えば293細胞、 チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO））などの高等真核細胞であってもよい 。（例えばAusubel，F.M．ら編，Current Protocols in Molecular Biology，Gr eene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc.，（1993）を参照の こと。） 組換え哺乳類CKR-3受容体蛋白質、その一部または融合蛋白質を生産する宿主 細胞は次のように作製できる。哺乳類CKR-3受容体または融合蛋白質のコード配 列の全部または一部をコードする核酸を、例えばプラスミド、ウイルスまたは他 の適当な発現用レプリコンなどのDNAベクターなどの核酸ベクターに挿入できる 。シングルコピーまたはマルチコピーとして維持されるベクターまたは宿主細胞 染色体に組込まれるベクターなど、種々のベクターを利用できる。 選択したCKR-3受容体の転写および/または翻訳シグナルを直接発現に使用する ことができる。別法として、適当な発現ベクターも使用できる。哺乳類CKR-3受 容体または融合蛋白質のコード配列の全部または一部をコードする核酸の発現に 適したベクターは、いくつかの追加成分を含有してもよく、かかる追加成分には 次の1以上が含まれるがこれらに限定されない：複製起点、選択可能マーカー 遺伝子、１以上の発現制御要素、例えば転写制御要素（プロモーター、エンハン サー、ターミネーターなど）および/または1以上の翻訳シグナル、（ベクターま たは受容体によってコードされる膜標的用の）シグナル配列またはリーダー配列 。 プロモーターは適当な宿主細胞での発現用に提供される。プロモーターは構成 的であってもよいし、誘導性であってもよい。ベクターでは、プロモータが受容 体蛋白質、その一部または融合蛋白質をコードする核酸に有効に連結しており、 コードされたポリペプチドの発現を管理することができる。原核細胞宿主に適し た種々のプロモーター（例えば大腸菌用のlac、tac、T3、T7プロモーター）およ び真核細胞宿主に適した種々のプロモーター（例えば酵母アルコールデヒドロゲ ナーゼ（ADH1）、SV40、CMV）が利用できる。 さらに、発現ベクターは、具体的には、そのベクターを保持する宿主細胞を選 択するための選択可能マーカーおよび複製可能発現ベクターの場合複製起点をも 含む。抗生物質または薬物耐性を付与する産物をコードする遺伝子は、一般的な 選択可能マーカーであり、原核細胞（例えばβ-ラクタマーゼ遺伝子（アンピシ リン耐性）、テトラサイクリン耐性に対するTet遺伝子）および真核細胞（例え ばネオマイシン（G418またはジェネティシン）、gpt（ミコフェノール酸）、ア ンピシリンまたはハイグロマイシン耐性遺伝子）に使用できる。ジヒドロ葉酸レ ダクターゼマーカー遺伝子は、種々の宿主におけるメトトレキセートによる選択 を可能にする。宿主の栄養要求性マーカー（例えばLEU2、URA3、HIS3）の遺伝子 産物をコードする遺伝子は、酵母における選択可能マーカーとしてしばしば使用 される。ウイルス（例えばバキュロウイルス）ベクターまたはファージベクター およびレトロウイルスベクターなどの宿主細胞のゲノムに組み込むことができる ベクターの使用も予想される。また本発明は、これらの発現ベクターを保持する 細胞にも関係する。 受容体蛋白質またはポリペプチドをコードする核酸をベクターに挿入して、こ れらの成分の1以上に有効に連結し、発現に適した条件下に維持された宿主細胞 に、得られた構築物を導入すると、受容体蛋白質またはポリペプチドが生産され る。構築物は、選択した宿主細胞に適した方法（例えば形質転換、トランスフェ クション、エレクトロポレーション、感染など）で細胞に導入できる。受容体を 生産するには、上記構築物を含む宿主細胞を発現に適した条件下、例えば、適当 な塩類、成長因子、抗生物質、栄養補給物などを補足した適当な培地、誘導物質 （n-酪酸など）の存在下に維持する。抗体 さらに本発明は、CKR-3受容体またはその一部と反応する抗体にも関する。１ つの態様において、単離および/または組換えのその一部（例えばペプチド）を 含む哺乳類CKR-3蛋白質に対して抗体を生じさせる。好ましい態様では、これら の抗体が単数または複数のCKR-3受容体またはその一部に特異的に結合する。 本発明の抗体はポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体で あってもよく（例えば実施例5を参照のこと）、抗体という用語はポリクローナ ル抗体とモノクローナル抗体の両方を包含するものとする。本発明の抗体は、本 発明の蛋白質またはポリペプチド、例えば単離および/または組換え哺乳類CKR- ３受容体蛋白質またはその一部または合成ペプチドなどの合成分子を含む適当な 免役原に対して生じさせることができる。さらに、受容体を発現する細胞（トラ ンスフェクションされた細胞など）を免役原として使用したり、受容体を結合す る抗体のスクリーニングに使用することもできる。例えばChuntharapaiら，J．I mmunol．152: 1783-1789（1994）を参照のこと。 免疫感作抗原の調製ならびにポリクローナルおよびモノクローナル抗体の生産 は、任意の適当な技術で行なえる。様々な方法が記述されている（例えばKohler ら，Nature，256: 495-497（1975）およびEur．J．Immunol．6: 511-519（1976 ）；Milsteinら，Nature 266: 550-552（1977）；Koprowskiら，米国特許第4,17 2,124号；Harlow，E.およびD．Lane，1988，Antibodies: A Laboratory Manu al，（Cold Spring Harbor Laboratory:ニューヨーク州コールドスプリングハー バー）；Current Protocols In Molecular Biology，第2巻（増補27,94年夏）,A usubel，F.M.ら編（John Wiley & Sons:ニューヨーク州ニューヨーク），第11章 （1991）を参照のこと）。一般的には、適当な不死化細胞株（例えばSP2/0のよ うな骨髄腫細胞株）を抗体産生細胞と融合することによってハイブリドーマを作 製する。抗体産生細胞、好ましくは脾臓またはリンパ節のものは、注目する抗原 で免疫感作した動物から得る。選択培養条件を用いて融合細胞（ハイブリドーマ ）を単離し、限界希釈法でクローニングする。所望の特異性を持つ抗体を産生す る細胞を適当なアッセイ（例えばELISA）で選択する。 単鎖抗体および異なる種に由来する部分を含有するキメラ擬人化または擬霊長 類化（CDR移植）抗体ならびにキメラまたはCDR移植単鎖抗体も本発明に包含され 、「抗体」という用語に含まれる。これらの抗体の様々な部分を、通常の技術で 化学的に結合するか、遺伝子工学的技術を用いて連続的蛋白質として調製するこ とができる。例えば、キメラまたは擬人化鎖をコードする核酸を発現させること によって、連続的蛋白質を製造することができる。例えばCabillyら，米国特許 第4,816,567号、Cabillyら，欧州特許第0,125,023 B1号、Bossら，米国特許第4, 816,397号、Bossら，欧州特許第0,120,694 B1号、Neuberger，M.S．ら，国際公 開第86/01533号パンフレット、Neuberger，M.S．ら，欧州特許第0,194,276B1号 、Winter，米国特許第5,225,539号およびWinter，欧州特許第0,239,400 B1号を 参照のこと。また、擬霊長類化抗体についてはNewman，R.ら，BioTechnology，1 0: 1455-1460（1992）を、単鎖抗体についてはLadnerら，米国特許第4,946,778 号およびBird，R.E.ら，Science，242: 423-426（1988）をも参照のこと。 さらに、キメラ擬人化、擬霊長類化または単鎖抗体の断片を含む抗体の機能的 断片も製造できる。上述の抗体の機能的断片は、それらが由来する完全長抗体の 結合機能および/または調節機能の少なくとも1つを保持する。例えば、哺乳類 CKR-3受容体またはその一部に結合できる抗体断片は、Fv、Fab、Fab'およびF（a b’）₂断片（ただしこれらに限られるわけではない）を含めて、本発明に包含さ れる。かかる断片は酵素的切断や組換え技術によって生産できる。例えばパパイ ンまたはペプシン切断によって、それぞれFabまたはF（ab’）₂断片を生成する ことができる。別法として、天然の停止部位の上流に1以上の停止コドンが導入 されている抗体遺伝子を用いて、様々な先端欠失型の抗体を生産することもでき る。例えば、F（ab’）₂重鎖部分をコードするキメラ遺伝子を、重鎖のヒンジ領 域およびCH₁ドメインをコードするDNA配列を含むように設計できる。 本発明の抗体は、研究的応用、診断的応用および治療的応用を含む種々の応用 に有用である。例えば、これらを使用して、受容体またはその一部を単離および /または精製したり、受容体の構造（例えばコンフォメーション）および機能を 研究することができる。 本発明の抗体は、研究的応用および治療的応用において受容体機能を調節する ためにも使用できる。例えば、抗体は、（a）受容体に対する結合（例えばリガ ンド、第2の阻害剤または促進剤の結合）、（b）受容体シグナル発信および/ま たは（c）刺激機能を阻害する阻害剤として作用できる。受容体機能の阻害剤と して作用する抗体は、リガンドまたは促進剤の結合を直接または間接に（例えば コンフォメーション変化を引き起こすことによって）遮断できる。例えば抗体は 、リガンドの結合を阻害することによって、または（リガンドの結合の阻害を伴 う、または伴わない）脱感作によって、受容体機能を阻害できる。 また、受容体を結合する抗体は受容体機能のアゴニストとしても作用し、受容 体に結合すると、受容体のシグナル発信および/または刺激機能（例えば走化性 、エキソサイトーシスまたは前炎症媒介物質の放出）などといった受容体機能を 誘発または刺激する。 さらに、本発明の種々の抗体を用いて、例えば好酸球、好塩基球およびリンパ 球のような白血球または受容体遺伝子でトランスフェクションされた細胞におけ る受容体の発現を検出または測定することもできる。したがってこれらの抗体は 、診断または研究目的の細胞選別（例えばフローサイトメトリー、蛍光活性化細 胞選別）などの応用にも有用である。 抗イディオタイプ抗体も提供する。抗イディオタイプ抗体は別の抗体の抗原結 合部位に関連する抗原決定基を認識する。第2の抗体に対する抗イディオタイプ 抗体は、その第2抗体を生産するのに使用した動物と同じ種の好ましくは同じ株 の動物を免疫感作することによって調製できる。例えば米国特許第4,699,880号 を参照のこと。 １つの態様において、抗体を受容体またはその一部に対して生じさせ、今度は それらの抗体を使用して抗イディオタイプ抗体を生産する。そのようにして生産 した抗Idは、例えばリガンド、受容体機能の阻害剤または促進剤などの受容体を 結合する化合物を結合でき、かかる化合物を検出、同定または定量するための免 疫アッセイに使用できる。かかる抗イディオタイプ抗体は受容体自体には結合し ないが、受容体機能の阻害剤でもありうる。 抗イディオタイプ（すなわち抗Id）抗体自体を使用して抗イディオタイプ抗体 （すなわち抗-抗Id）を生じさせることができる。かかる抗体は最初の免疫感作 抗体と特異性が似ているか同一でありうる。１つの態様において、受容体への結 合を遮断する抗体アンタゴニストを用いて抗Idを生じさせ、その抗Idを用いて、 その抗体アンタゴニストと類似するか同一の特異性を持つ抗-抗Idを生じさせる ことができる。これらの抗-抗Id抗体を受容体機能に対する阻害効果について評 価することによって、それらがアンタゴニストであるかどうかを決定できる。 単鎖抗イディオタイプ抗体およびキメラ擬人化または擬霊長類化（CDR移植） 抗イディオタイプ抗体ならびにキメラまたはCDR移植単鎖抗イディオタイプ抗体 を調製することもでき、これらは抗イディオタイプ抗体という用語に包含される 。かかる抗体の抗体断片も調製できる。リガンド、受容体機能の阻害剤または促進剤の同定 本明細書でいうリガンドとは、受容体蛋白質に結合する物質である。選択した 哺乳類CKR-3受容体のリガンドは、選択したその哺乳類受容体に結合する物質で ある。１つの態様において、リガンドはCKR-3を含む2以上の哺乳類ケモカイン受 容体に選択的に結合できる。好ましい態様では、哺乳類CKR-3受容体のリガンド 結合が高い親和性で起こる。リガンドという用語は、単離物および/または精製 物の天然のリガンド、合成体および/または組換え体天然リガンドのホモログ（ 例えば別の哺乳類由来のもの）、抗体、かかる分子の一部および受容体を結合す る他の物質などの物質（ただしこれらに限られるわけではない）を意味する。選 択した哺乳類受容体の天然リガンドは生理学的条件下でその受容体に結合でき、 その哺乳類CKR-3受容体と同じ哺乳類に由来する。リガンドという用語は、受容 体活性の阻害剤または促進剤である物質ならびに結合はするが阻害剤活性や促進 剤活性を欠く物質を包含する。 本明細書でいう阻害剤とは、哺乳類C-Cケモカイン受容体（例えば哺乳類CKR- ３受容体）に特有の機能、例えば結合活性（リガンド、阻害剤および/または促 進剤結合など）、シグナル発信活性（哺乳類G蛋白質の活性化、細胞質遊離カル シウム濃度［Ca²⁺］ｉの迅速かつ一時的な増加の誘導など）および/または細胞 応答の刺激などの少なくとも1つを阻害する物質である。阻害剤という用語は、 受容体を結合するアンタゴニスト（例えば抗体、天然リガンドの突然変異体、そ の他のリガンド結合の競合的阻害剤）および受容体に結合することなく受容体機 能を阻害する物質（例えば抗イディオタイプ抗体）とを意味する。 本明細書でいう促進剤とは、哺乳類C-Cケモカイン受容体（哺乳類CKR-3受容体 など）に特有の機能、例えば結合活性（リガンド、阻害剤および/または促進剤 結合など）、シグナル発信活性（哺乳類G蛋白質の活性化、細胞質遊離カルシウ ム濃度［Ca²⁺］ｉの迅速かつ一時的な増加の誘導など）および/または細胞応答 の刺激などの少なくとも1つを促進（誘導または増大）する物質である。促進剤 という用語は、受容体を結合するアゴニスト（例えば抗体、別の種に由来する 天然リガンドのホモログ）および受容体に結合することなく受容体機能を（例え ば関連する蛋白質を活性化することによって）促進する物質とを意味する。 哺乳類CKR-3受容体蛋白質またはポリペプチドのリガンド、阻害剤または促進 剤を同定するには、本発明の核酸および蛋白質による後述のアッセイを単独で、 または互いに組み合わせて、または他の適当な方法と組み合わせて使用すること ができる。ヒトCKR-3は、通常、高処理量スクリーニングに適するレベルで細胞 内に存在しない。したがって、CKR-3受容体蛋白質のリガンド、阻害剤および促 進剤を同定するには、本発明の核酸を含有し、それを発現する細胞がとりわけ重 要である。 哺乳類からCKR-3受容体遺伝子を単離したら、受容体蛋白質またはポリペプチ ドを生産するため、上述のように、その遺伝子を発現系に組込むことができる。 例えば本発明の核酸を含む構築物で安定に、もしくは一過性にトランスフェクト した細胞中で発現した受容体または受容体を含有する細胞画分（例えばトランス フェクとした細胞の膜画分）中の受容体などの単離および/または組換え受容体 蛋白質またはポリペプチドを、受容体機能に関する試験で使用することができる 。所望であれば、その受容体をさらに精製することもできる。受容体機能の試験 は試験管内でも生体内でも行なえる。 本明細書に記載の方法や他の適当な技術を用いて受容体機能を監視することに よってある化合物の効果を評価する本発明の方法に、例えば図1A-1C（配列番号2 をも参照のこと）、図2A-2B（配列番号4をも参照のこと）または配列番号6に記 載のヒトCKR-3受容体などの単離組換え哺乳類CKR-3受容体蛋白質を使用すること ができる。例えば安定なまたは一過性のトランスフェクタント（A31/293/#20安 定トランスフェクタント（例えば実施例9を参照）、マウスL1-2前B細胞の安定な トランスフェクタント（例えば実施例3を参照）、バキュロウイルス感染Sf9細胞 （例えば実施例4を参照）など）は、結合アッセイに用いることができる。マウ スL1-2前B細胞または走化性を持つ他の適当な細胞の安定なトランス フェクタントは、例えば走化性検定に用いることができる（例えば実施例3を参 照のこと）。 本発明の方法によれば、化合物を個別にスクリーニングすることもできるし、 １以上の化合物を本明細書記載の方法に従って同時に試験することもできる。化 合物の混合物を試験する場合は、記述する工程で選択された化合物を、適当な方 法（例えばPCR、配列決定、クロマトグラフィー）で適宜分離し、同定すること ができる。１試験試料中の1以上の化合物（リガンド、阻害剤、促進剤など）の 存在も、これらの方法によって決定できる。 複合化学合成や他の方法で作製された大きな複合化合物ライブラリー（例えば 有機化合物、組換えまたは合成ペプチド、「ペプトイド」、核酸）を試験するこ とができる（例えばZuckeman，R.N.ら，J．Med．Chem.，37: 2678-2685（1994） とそこに引用されている文献を参照のこと。また、Ohlmeyer，M.H.J.ら，Proc． Natl．Acad．Sci．USA 90: 10922-10926（1993）とDeWitt，S.H.ら，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 90: 6909-6913（1993）（標識した化合物について）、Rutter ，W.J.ら，米国特許第5,010,175号、Huebner，V.D．ら，米国特許第5,182,366号 、Geysen，H.M.，米国特許第4,833,092号をも参照のこと）。本発明方法によっ て複合ライブラリーから選択される化合物が独特の標識を持つ場合は、クロマト グラフィー法による個々の化合物の同定が可能である。 １つの態様において、ファージ提示法を使用する。例えば、受容体結合（例え ば適当な結合緩衝液において）に適した条件下でポリペプチドを提示するファー ジ（例えばファージまたはライブラリーのようなファージの収集物）と受容体を 接触させる。受容体に結合したファージを、標準的な技術または他の適当な方法 で選択する。ファージは適当な溶出緩衝液を用いて受容体から分離できる。例え ば、イオン強度やpHの変化はファージの放出をもたらしうる。別法として、溶出 緩衝液が、化合物の結合を破壊するように設計された1または複数の放出成分、 例えば提示されたペプチドの受容体に対する結合を破壊できる1以上の化合物（ 結合を競合的に阻害するリガンド、阻害剤および/または促進剤など）を含んで もよい。任意に、この選択工程を繰り返すか、別の選択工程を用いることによっ て、受容体に結合するファージをさらに濃縮することもできる。提示されたポリ ペプチドを（例えばファージDNAの配列決定などによって）特徴づける。同定さ れたポリペプチドを生産し、さらにリガンド結合機能、阻害剤機能および/また は促進剤機能について試験することができる。増大した安定性や他の望ましい特 性を持つかかるペプチドの類縁体を製造できる。 １つの態様において、任意の配列の核酸がコードするN-末端ペプチドを伴った 外殻蛋白質を含む融合蛋白質を発現し、それを提示するファージを生産できる。 本発明の受容体蛋白質またはポリペプチドを発現させる適当な宿主細胞をこのフ ァージと接触させ、結合したファージを選択し、回収し、特徴づける。（例えば 、G蛋白質共役受容体を用いるファージ提示法について議論しているDoorbar，J ．およびG．Winter，J．Mol．Biol.，244: 361（1994）を参照のこと。） 哺乳類CKR-3受容体の潜在的リガンド、阻害剤および/または促進剤の他の供給 源としては、他の化学誘引物質（アナフィラトキシンC5a、細菌ホルミル化トリ ペプチド（fMLP）など）、その受容体と同じ哺乳類由来の哺乳類ケモカインや別 の哺乳類由来の哺乳類ケモカイン（例えばヒト受容体については、ヒト以外の供 給源から得られるヒトケモカインのホモログ）などといった他のケモカイン類（ エオタキシンなど）、天然に存在する変種や合成または組換え変種のような他の 化学誘引物質またはケモカイン類の変異型、他の哺乳類CKR-3受容体リガンド、 阻害剤および/または促進剤（抗体、アンタゴニスト、アゴニストなど）とその 変異型、他のG蛋白質共役受容体リガンド、阻害剤および/または促進剤（アンタ ゴニストやアゴニストなど）、適当な受容体ペプチドや受容体機能を阻害できる 類縁体などといった哺乳類CKR-3受容体の可溶性部分が挙げられるが、これらに 限られるわけではない（例えばMurphy,R.B.,国際公開第94/05695号パンフレット を参照のこと）。 本発明の試験管内法は、高処理量スクリーニングに使用できる。これらのアッ セイは多数の試料を加工できるように適合させることができる（例えば96ウェル 形式）。好酸球の単離は難しいので、かかるスクリーニングには、単離された好 酸球の代わりに、受容体を発現する宿主細胞を使用することが好ましい。 結合アッセイには、適当な宿主細胞における受容体の高レベル発現が好ましい 。受容体の発現は種々の方法で監視することができる。例えば、受容体またはそ の一部を結合する本発明の抗体を用いて発現を監視することができる。また、市 販の抗体を用いて、受容体蛋白質またはポリペプチドを含む抗原標識-またはエ ピトープ標識-融合蛋白質（例えばFLAG標識受容体；実施例３参照）の発現を検 出することもできる。結合アッセイ 本発明の単離および/または組換え受容体蛋白質、その一部または適当な融合 蛋白質は、１またはそれ以上のヒトCKR-3受容体などの哺乳類CKR-3受容体蛋白質 に結合する化合物、およびリガンドあるいは受容体活性の潜在的阻害剤または促 進剤である化合物を選択および同定する方法に使用できる。この方法によって選 択される化合物（リガンド、阻害剤または促進剤を含む）を、受容体機能に対す る刺激または阻害効果および/または治療的用途についてさらに評価できる。 １つの態様において、活性な単離および/または組換え哺乳類CKR-3受容体蛋白 質またはポリペプチドに結合する化合物をこの方法で同定する。この態様では、 使用する受容体蛋白質またはポリペプチドが、CKR-3受容体に特有の機能、例え ばシグナル発信活性（哺乳類G蛋白質の活性化など）、刺激機能（走化性や炎症 媒介物質放出の刺激など）および/または結合機能（リガンド、阻害剤および/ま たは促進剤結合など）などの少なくとも1つを持つ。特に好ましい態様において 、単離および/または組換え哺乳類CKR-3受容体蛋白質またはポリペプチドがリガ ンド結合機能を持ち、その受容体の天然のリガンドを結合する。 例えば、ある単離および/または組換え哺乳類CKR-3受容体蛋白質またはポリペ プチドを結合に適した条件下に維持し、その受容体を被験化合物と接触させ、結 合を検出または測定することができる。１つの態様において、本発明の受容体を コードする核酸配列を含む構築物で安定にまたは一過性にトランスフェクトした 細胞内で、受容体蛋白質を発現させることができる。その細胞を受容体の発現に 適した条件下に維持する。その細胞を結合に適した条件下に（例えば適当な結合 緩衝液中で）化合物と接触させ、標準的な技術で結合を検出する。結合を測定す るには、結合の程度を適当な対照と比較して（例えば化合物の不在下で決定した バックグラウンドと比較して、第2の化合物（すなわち標品）の結合と比較して 、トランスフェクトしていない細胞に対する化合物の結合と比較して）決定でき る。任意に、受容体を含有する細胞画分（膜画分など）を全細胞の代わりに使用 してもよい（例えば実施例9を参照のこと）。 １つの態様において、化合物を適当な標識（例えば蛍光標識、同位体標識）で 標識し、その標識の検出によって結合を決定する。結合の特異性は、例えば非標 識化合物または第2のリガンドを競合剤として用いる競合または置換によって評 価できる。 哺乳類受容体のリガンドは、同じ哺乳類種由来の天然リガンドまたは別の種由 来の天然リガンドを含めて、この方法で同定できる。受容体を結合する促進剤ま たは阻害剤の結合活性も、かかるリガンド結合アッセイで評価できる。 結合阻害アッセイを用いて、リガンドと、受容体に結合し他の化合物（リガン ドなど）の結合を阻害する阻害剤および促進剤を同定することもできる。例えば 、第2の化合物の存在下で起こる第1の化合物の結合に比べて、（第2の化合物の 不在下で起こる）第1の化合物の結合の減少を検出または測定する結合検定を行 なうことができる。受容体を第1および第2の化合物と同時に接触させてもよいし 、逐次（順番は問わない）接触させてもよい。第2化合物の存在下で起こる第1化 合物の結合の程度は、第2化合物による結合の阻害の指標となる。例えば 、第1化合物の結合が減少したり、完全に破壊されたりすることもある。 １つの態様において、ヒトCKR-3受容体に対する第1化合物（例えばRANTESなど のケモカイン）の結合の第2の試験化合物による直接阻害を測定する。例えば、 ヒトCKR-3に対する¹²⁵I-標識RANTESまたは¹²⁵I-標識MCP-3の結合を阻害するある 化合物の能力を監視することができる。かかるアッセイは、全細胞（例えば酪酸 分化HL-60細胞またはヒトCKR-3受容体をコードする核酸を含有する適当な細胞株 ）を用いて行なうこともできるし、例えば該細胞の膜画分を用いて行なうことも できる。 受容体を結合する化合物の存在を同定するには、他の方法も利用でき、例えば 、受容体結合によって誘発される事象（シグナル発信機能および/または細胞応 答の刺激など）を監視する方法である（下記参照）。 本発明の抗体の阻害効果を結合阻害アッセイで評価できることは理解されるだ ろう。受容体結合に関する抗体間の競合も、このアッセイにおける第1化合物を 別の抗体とし、抗体結合に適した条件下でその検定を行なうことによって評価で きる。 この方法で同定されるリガンドならびに受容体結合阻害剤（アンタゴニストな ど）および促進剤（アゴニストなど）をさらに評価することによって、結合に引 き続いて、それらがCKR-3受容体の他の機能を阻害または活性化するように作用 するかどうかを決定し、および／または、それらの治療的有用性を評価すること ができる。シグナル発信アッセイ リガンドまたは促進剤（アゴニストなど）の結合は、G蛋白質共役受容体によ るシグナル発信をもたらすことができ、G蛋白質の活性化を刺激する。ある化合 物による誘導シグナル発信機能の誘導は任意の適当な方法で監視できる。例えば 、受容体結合が誘発するG蛋白質活性（GTPからGDPへの加水分解など）や、その 後に起こるシグナル発信事象（細胞内（細胞質）遊離カルシウム濃度［Ca²⁺］ iの迅速かつ一過性の増加の誘導など）を、当該分野公知の方法または他の適当 な方法で評価できる（例えばNeote，K．ら，Cell，72: 415-425（1993）；VanRi perら，J．Exp．Med.，177: 851-856（1993）；Dahinden，C.A.ら，J．Exp.Med. ，179: 751-756（1994）を参照のこと）。 リガンドまたは促進剤の受容体結合能とG蛋白質活性化能の測定には、ハイブ リッドG蛋白質共役受容体を用いるSledziewskiらの機能アッセイも使用できる（ Sledziewskiら，米国特許第5,284,746号；この特許の教示は参考文献により本明 細書に合体される）。 （ハイブリッド受容体への結合が誘発する）宿主細胞の生物学的応答を監視す る。この場合、応答の検出が試験試料中のリガンドの存在の指標となる。Sledzi ewskiらは試験試料中のリガンドの存在を検出する方法を記述している。この場 合、リガンドは受容体のリガンド結合ドメインに結合されうる化合物である。こ の方法の１つの態様において、生物学的に活性なハイブリッドG蛋白質共役受容 体（すなわち融合蛋白質）の発現を指示できるDNA構築物で酵母宿主細胞を形質 転換する。このハイブリッド受容体は、リガンド結合ドメイン以外のドメインの 少なくとも1つが酵母G蛋白質共役受容体（STE2遺伝子産物など）の対応するドメ インで置換された哺乳類G蛋白質共役受容体を含む。この構築物を含有する酵母 宿主細胞を上記ハイブリッド受容体が発現される条件下に維持し、その細胞を、 ハイブリッド受容体に対するリガンドの結合が可能な条件下で、試験試料と接触 させる。アッセイを記述されているように行い、（ハイブリッド受容体への結合 が誘発する）宿主細胞の生物学的応答をアッセイする。応答の検出はシグナル発 信機能の指標となる。 例えば、STE2遺伝子産物から誘導したハイブリッド受容体への結合がBAR1プロ モーターの誘導をもたらすようなアッセイが提供される。このプロモーターの誘 導は、BAR1プロモーターに連結され第2の構築物に乗せて宿主細胞に導入される レポーター遺伝子（β-gal）を利用して測定される。このリポーター遺伝子の発 現は、例えば細胞溶解液に対する試験管内酵素検定によって、あるいは培地に指 示薬（X-gal）を含む平板での青色コロニーの存在によって検出できる。 もう１つの態様において、このアッセイを用いて受容体機能の潜在的阻害剤を 同定する。ある化合物の阻害活性は、このアッセイでリガンドまたは促進剤を用 い、リガンドまたは促進剤によって誘導される活性を阻害するその化合物の能力 を評価することによって決定できる。 既知リガンドの変異型を、共役G蛋白質の活性を刺激する能力の減少（能力の 減少または消滅）についてスクリーニングすることもできる。この態様では、化 合物は（先立って（または後に）行なう別の方法で決定すると）リガンド結合活 性を持つが、受容体の連動が共役G蛋白質の活性を誘発しないか、わずかにしか 誘発しない。かかる化合物は潜在的アンタゴニストであり、適当なアッセイでさ らに評価することができる。例えば同じアッセイをリガンドまたは促進剤の存在 下に行なって、リガンドまたは促進剤の活性を阻害するその化合物の能力を評価 できる。走化性および細胞刺激アッセイ 受容体機能を評価するには走化性アッセイも使用できる。これらのアッセイは ある化合物によって誘発される試験管内または生体内の細胞の機能的移動に基づ いており、これらのアッセイを用いてリガンド、阻害剤または促進剤の結合およ び/または化学誘引効果を評価できる。試験管内経内皮走化性アッセイの使用を 実施例1に記述する。Springerらは経内皮リンパ球走化性アッセイについて記述 している（Springerら，国際公開第94/20142号パンフレット,1994年9月15日公開 ；この公報の教示は参考文献により本明細書に合体される；Bermanら，Immunol Invest．17: 625-677（1988）も参照のこと）。内皮を横切るコラーゲンゲルへ の移動も記述されている（Kavanaughら，J．Immunol，146: 4149-4156（1991） ）。 マウスL1-2前B細胞または走化性を持つ他の適当な宿主細胞の安定なトランス フェクタントは、例えば走化性アッセイに使用できる（例えば実施例3を参照の こと）。本明細書にさらに記述するように、好酸球様細胞株（例えばCKR-3受容 体を同化する酪酸分化HL60株）も走化性アッセイに組込むことができる。 一般に走化性アッセイでは、障壁（内皮、フィルターなど）の第1表面から反 対側の第2表面の方向に増大する化合物レベルに向かって障壁内へ、または障壁 を通過して移動する、適当な細胞（例えば白血球（リンパ球、好酸球、好塩基球 など））の指向的な運動または移動を監視する。膜やフィルターは、フィルター の第1表面からフィルターの反対側の第2表面の方向に増大する化合物レベルに向 かってフィルター内に、またはフィルターを通過して移動する、適当な細胞の指 向的運動または移動を監視するのに便利な障壁となる。いくつかのアッセイでは 、ICAM-1、フィブロネクチンまたはコラーゲンなどの接着を容易にする物質で膜 をコーティングする。 例えば、適当な容器（含有手段）内で、第1室から細孔膜中への、もしくは細 孔膜を通過して、試験対象の化合物を含有し、膜によって第1室から隔離された 第2室への細胞の移動を検出または測定できる。化合物に応答して起こる特異的 な移動の監視に適した細孔サイズを持つ適当な膜、例えばニトロセルロース、ポ リカーボネートなどを選択する。例えば約3〜8ミクロン、好ましくは約5〜8ミク ロンの細孔サイズを使用できる。フィルター上の細孔サイズは均一であってもよ いし、適当な細孔サイズの範囲に分布していてもよい。 移動を評価するため、フィルターへの移動距離、フィルターを横切ってフィル ターの第2表面に接着している細胞数および/または第2室中に蓄積する細胞数を 標準的な技術（例えば顕微鏡）で決定できる。１つの態様において、細胞を検出 可能な標識（例えば放射性同位体、蛍光標識、抗原またはエピトープ標識）で標 識し、膜に接着したその標識および/または第2室中に存在するその標識の存在を 適当な方法で（例えば放射活性や蛍光を検出するか、免疫アッセイで）決定する ことによって、移動を評価できる。ある化合物によって誘発される移動の程 度を、適当な対照に対して（例えばその化合物の不在下に決定したバックグラウ ンド移動と比較して、第2の化合物（すなわち標準）によって誘発される移動の 程度と比較して、その化合物によって誘発される非トランスフェクタントの移動 と比較して）決定することができる。 小室は、プラスチック、ガラス、ポリプロピレン、ポリスチレンなど、種々の 固体で形成することができる。小室から取り外せる膜、例えばBiocoat（Collabo rative Biomedical Products）やTranswell（Costar，マサチューセッツ州ケン ブリッジ）培養インサートなどは、接着細胞の計数を容易にする。 容器には、第1室内の細胞を含む液体と第2室内の液体に接触するようにフィル ターを設置する。試験化合物またはこの検定のために存在する追加のリガンド、 阻害剤もしくは促進剤以外は、膜の両側の液体が同じであるか、実質的に類似し ていることが好ましい。小室内の液体は、細胞の安定性を増大させ、細胞の非特 異的結合を阻害するように作用する蛋白質溶液（例えばウシ血清アルブミン、ウ シ胎児血清、ヒト血清アルブミン）および/または培養培地を含みうる。 好ましい態様では、特に好酸球、好酸球様細胞、リンパ球、CKR-3受容体を発 現する細胞について、経内皮移動を監視する。経内皮移動アッセイが好ましい。 かかるアッセイは、白血球が血管から血管壁を裏打ちする内皮細胞層を横切って 炎症部位の組織内に存在する化学誘引物質に向かって移動する生体内条件をより 正確に再現するので、生理学的モデルとして優れている。さらに、経内皮アッセ イはバックグラウンド（信号対雑音比）が比較的低い。 この態様では、内皮細胞層を通過する移動を評価する。細胞層を調製するため 、内皮細胞の接着を促進するために任意にコラーゲン、フィブロネクチンまたは 他の細胞外マトリックス蛋白質でコーティングしておいてもよい細孔フィルター または膜上で内皮細胞を培養できる。好ましくは、コンフルエントな単層が生成 するまで内皮細胞を培養する。単層形成には、例えば静脈、動脈または微小血管 内皮（ヒト臍静脈内皮細胞（Clonetics Corp，カリフォルニア州サンディエゴ） など）や適当な細胞株（実施例1で使用するECV304細胞株など）など、種々の哺 乳類内皮細胞を利用できる。特定の哺乳類受容体に応答して起こる走化性を検定 するには、同じ哺乳類の内皮細胞が好ましいが、異なる哺乳類種または属由来の 内皮細胞も使用できる。 一般的には、フィルターの第1表面からフィルターの反対側の第2表面に向かっ て、化合物レベルが増大する方向に、膜またはフィルター内へ、または膜または フィルターを通過して移動する細胞の指向的移動を検出することによって、この アッセイを行ない、そのフィルターは第1表面に内皮細胞層を含む。指向的移動 は第1表面に接する領域から膜内へ、または膜を通過して、フィルターの反対側 に置かれた化合物に向かって起こる。第2表面に接する領域に存在する化合物の 濃度は、第1表面に接する領域に存在する化合物の濃度より大きい。 １つの態様において、ある化合物のリガンドまたは促進剤活性の試験に走化性 を用いる。移動能を持ち哺乳類CKR-3受容体を発現できる細胞を含む組成物を第 １室に入れ、好ましくは第1室内の細胞の走化性を誘導できる（化学誘引機能を 持つ）他のリガンドや促進剤の不在下に、試験対象の化合物を含む組成物を第2 室に入れる。しかし、化学誘引機能を持つ1以上のリガンドまたは促進剤が存在 してもよい。このアッセイで受容体を結合し、哺乳類CKR-3受容体を発現する細 胞の走化性を誘導できる化合物は、受容体機能のリガンドまたは促進剤である。 阻害剤の試験に使用する１つの態様において、移動能を持ち、哺乳類CKR-3受 容体を発現できる細胞を含む組成物を第1室に入れる。第1室内の細胞の走化性を 誘導できる（化学誘引機能を持つ）１以上のリガンドまたは促進剤を含む組成物 を第2室に入れる。細胞を第1室に入れる直前か、細胞と同時に、試験対象の化合 物を含む組成物を、好ましくは第1室に入れる。このアッセイで哺乳類CKR-3受容 体を発現する細胞の受容体を結合し、リガンドまたは促進剤による走化性の誘導 を阻害できる化合物は、受容体機能の阻害剤（すなわち刺激機能の阻害剤 ）である。リガンドまたは促進剤によって誘導される移動の程度が試験化合物の 存在下で減少すれば、それが阻害活性の指標となる（例えば実施例5を参照）。 別個に結合試験（上記参照）を行なって、阻害が受容体に対する試験化合物の結 合の結果であるのか、それとも異なる機構によって起こるのかを決定することも できる。 組織に対する化合物の注射に応答して起こる組織の白血球浸潤を監視する生体 内アッセイを後述する（「炎症のモデル」を参照のこと）。これらのモデルでは 、細胞が炎症部位への移動および走化性によってリガンドまたは促進剤に応答す る能力を測定する。 記述する方法に加えて、受容体を含有する適当な宿主細胞を用いて、活性な受 容体が誘発する細胞応答を監視することによって、受容体の刺激機能に対するリ ガンド、阻害剤または促進剤の効果を評価することもできる。同様に、これらの アッセイを用いて受容体の機能を決定することもできる。例えば、エキソサイト ーシス（例えば好酸球カチオン性蛋白質および/または1以上の酵素または他の顆 粒成分の放出をもたらす好酸球の脱顆粒、好塩基球からのヒスタミンの放出）、 炎症媒介物質放出（例えばロイコトリエン類（ロイコトリエンC₄など）のような 生物活性脂質の放出）、呼吸バースト（Rot，A．ら，J．Exp．Med.，176: 1489- 1495（1992））を、当該分野公知の方法や他の適当な方法で監視することができ る。例えばBischoff，S.C.ら，Eur．J．Immunol.，23: 761-767（1993）やBaggl iolini，M．およびC.A．Dahinden，Immunology Today，15: 127-133（1994）と それらに引用されている文献を参照のこと。 １つの態様において、脱顆粒またはエキソサイトーシス機能を持つ細胞による 脱顆粒またはエキソサイトーシス時の酵素放出を監視することによって、リガン ド、阻害剤および/または促進剤を同定する。エキソサイトーシスまたは脱顆粒 を刺激することのできる活性な受容体蛋白質をコードする本発明の核酸を含有す る細胞を、適当な条件下に適当な培地中で維持し、それによって受容体を発現さ せ、脱顆粒を誘発する。受容体を被験化合物と接触させ、酵素放出を評価する。 培地への酵素の放出は、免疫学的アッセイまたは酵素活性に関する生化学的アッ セイなど、適当な方法で検出または測定できる。 アッセイ成分（基質、補因子、抗体など）を培地に（例えば細胞と化合物を混 合する前、後もしくは同時に）添加することによって、培地を直接的に検定でき る。別法として、アッセイに先立って細胞から分離し、さらに分画した培地に対 して検定を行なうこともできる。 例えば、β-グルクロニダーゼや好酸球ペルオキシダーゼのような酵素に関す る便利なアッセイを利用できる（White，S.R．ら，「好酸球および好酸球調整培 地中の好酸球ペルオキシダーゼの速度検定法」，J．Immunol．Methods，144（2 ）：257-63（1991））。 ある化合物による脱顆粒の刺激は、その化合物が哺乳類CKR-3受容体のリガン ドまたは促進剤であることの指標となりうる。もう１つの態様では、脱顆粒の阻 害が阻害剤の指標となる。この態様では、受容体を発現する細胞をリガンドまた は促進剤と混合し、その前、後または同時に被験化合物を加える。炎症のモデル 生体内でリガンド、阻害剤または促進剤の治療薬としての効果を評価するため に使用できる様々な炎症の生体内モデルがある。 例えば、肺への好酸球浸潤を持つ霊長類モデルを生体内試験に利用できる（例 えばWenger，C.D.ら，Science，247: 456（1990）を参照のこと）。１つの態様 において、ヒトCKR-3と反応し、霊長類CKR-3と交差反応する抗体（例えばモノク ローナル抗体）をその動物に投与する。気管支肺胞洗浄液中の好酸球数、呼吸コ ンプライアンス、呼吸数など（ただしこれらに限られるわけではない）、いくつ かのパラメーターを測定することによって、生体内効果を評価できる。気道過敏 症の症状の減少が治療効果の指標となる。 さらに、喘息の羊モデル、受動皮膚アナフィラキシーのモルモットモデル、そ の他の適当なモデルを、生体内での化合物の評価に使用できる（例えばWeg，V.B ．ら，J．Exp．Med.，177: 561（1993）、Abraham，W.M．ら，J．Clin．Invest. ，93: 776（1994）を参照のこと）。 また、ウサギ、ラット、モルモットなどの適当な動物に化合物を皮膚内注射し た時の白血球浸潤も監視できる（例えばVan Damme J.ら，J．Exp．Med.，176: 5 9-65（1992）、Zachariae，C.O.C．ら，J．Exp．Med．171: 2177-2182（1990） 、Jose，P.J.ら，J．Exp．Med．179: 881-887（1994）を参照のこと）。１つの 態様において、皮膚生検を白血球（好酸球、顆粒球など）の浸潤について組織学 的に評価する。もう１つの態様として、走化性を持ち管外溢出能を持つ標識細胞 （例えば、CKR-3受容体を発現し、¹¹¹Inなどで標識された安定なトランスフェク タント）を動物に投与する。試験試料（例えば適当な緩衝液または生理学的担体 中の被験化合物）の注射に応答して起こる細胞の浸潤が、その試料中のリガンド または促進剤（アゴニストなど）の存在の指標となる。これらのアッセイを改良 して、走化性と白血球管外溢出の阻害剤を同定することもできる。例えば、リガ ンドまたはアゴニストを試験動物に投与する前、後もしくは同時に、阻害剤を投 与できる。阻害剤の不在下での浸潤の程度に比べて、阻害剤の存在下で浸潤の程 度が減少したら、それが阻害の指標となる。診断的応用 本発明は様々な診断的用途を持つ。これらの用途には本明細書に記載の用途が 含まれるが、必ずしもそれらに限られるわけではない。 哺乳類CKR-3受容体蛋白質をコードする遺伝子中の突然変異は、コードされて いる受容体の機能の少なくとも1つに欠損をもたらして、受容体機能を増減する 可能性がある。例えば、受容体の変種を生成したり、発現レベルを変えたりする 突然変異は、受容体機能を増減して、受容体が媒介する炎症過程を増減する可能 性がある。 例えば、受容体機能の検出または測定法を用いて、ある個体の細胞（白血球な ど）中の受容体の活性やかかる細胞から単離した受容体の活性を特徴づけること ができる。これらのアッセイでは、減少または増進した受容体機能を評価できる 。 本発明の核酸は、活性が減少または増大している受容体をコードする欠損哺乳 類CKR-3受容体遺伝子のスクリーニング、特徴づけおよび/または単離に使用でき る試薬（プローブ、PCRプライマーなど）を提供する。例えば、標準的な欠損遺 伝子スクリーニング法を使用できる。欠損遺伝子とそこにコードされている受容 体の活性を単離し、それらを適当な宿主細胞中で発現させて、哺乳類CKR-3受容 体について本明細書に記述するような評価をさらに行なうことができる。いくつ かのヒト疾患はG蛋白質共役受容体機能の欠損に関係している（Clapham，D.E.， Cell，75: 1237-1239（1993）、Lefkowitz,R.J.，Nature，365: 603-04（1993） ）。 本発明の抗体は、細胞表面上に受容体を検出する操作で使用できる。受容体は 、それを発現する白血球細胞タイプ、特に好酸球のマーカーになる。例えば、受 容体蛋白質またはペプチドに対して生じた抗体を用いて、受容体を発現する細胞 を数えることができる。細胞数は、白血球細胞タイプの減少または増大が観察さ れる種々の疾患または状態（例えば過好酸球増加症候群における過好酸球増加症 、好酸球減少症など）の診断に使用できる。ある個体から得た試料中に増大した レベルの好酸球が存在すれば、それは炎症性の疾患または状態（例えば喘息や、 寄生虫感染などの感染症）による好酸球浸潤の指標となりうる。別法としてまた は前記に加えて）、受容体を発現する細胞を細胞の混合物の中から選別するため に抗体を使用することもできる。この目的には、細胞の計数および/または選別 に適した方法（例えばフローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別法）を使用で きる。 さらに、白血球の炎症過程が変化する（例えば適当な対照に比べて、正常な個 体における発現レベルなどが増大または減少する）種々の疾患または状態におけ る受容体発現の増大または減少を、抗体を用いて検出または測定することもでき る。例えば、白血球（好酸球、T細胞などのリンパ球、単球、好塩基球など）を 個体から得て、適当な免疫学的アッセイ（ELISA、FACS分析法など）を用いて、 その発現レベルを評価することができる。哺乳類CKR-3受容体の発現レベルは、 哺乳類CKR-3受容体の発現レベルが増大または減少する疾患や状態の診断に使用 できる。トランスジェニック動物 組換えDNA技術を用いて宿主動物のゲノムが改変されたトランスジェニック動 物を構築することができる。１つの態様において、その改変が遺伝性でない（例 えば骨髄中の先祖細胞などの体細胞を改変する）。別の態様において、その改変 が遺伝性である（生殖細胞系を改変する）。トランスジェニック動物は標準的な 技術または他の適当な方法で構築できる（例えばCooke，M.P．ら，Cell，65: 28 1-291（1991）（Tリンパ球の改変について）、Hanahan，D.，Science，246: 126 5-1275（1989））。 一側面として、適当な動物宿主中の内因性哺乳類CKR-3受容体遺伝子を完全に 、もしくは部分的に（例えば遺伝子破壊技術によって）不活性化または無力化す ることによって、トランスジェニック動物を作出することができる。本発明の核 酸を用いて、不活化または無力化されたCKR-3遺伝子を含有する宿主の構築の成 功を（例えばサザンハイブリッド形成法によって）評価することができる。さら に、不活化または無力化されたCKR-3遺伝子を含有する宿主の構築の成功は、コ ードされている受容体の機能を監視する適当なアッセイによっても評価できる。 別の態様において、哺乳類CKR-3受容体蛋白質またはポリペプチドをコードす る核酸を適当な宿主に導入することによって、トランスジェニック動物を作出す ることもできる。好ましい態様では、そのトランスジェニック動物中に存在する 内因性CKR-3受容体遺伝子を、（例えば、該内因性遺伝子を破壊し置換する相同 組換えによる該核酸の導入と同時に）不活化する。例えば、白血球（例えば好酸 球、リンパ球（Tリンパ球など））中で異なる哺乳類種（例えばヒト）の哺乳類C KR-3受容体をコードする核酸を発現できるトランスジェニック動物（マウス、モ ルモット、羊など）を作出することができる。これらのトランスジェニック動物 は、導入された受容体の機能を評価するための便利な動物モデルを提供する。さ らに、トランスジェニック動物にある化合物を投与し、受容体によって媒介され る炎症過程に対するその化合物の効果を適当なアッセイで監視することもできる （例えばWeg，V.B．ら，J．Exp．Med.，177: 561（1993）、Abraham，W.M．ら， J．Clin．Invest.，93: 776（1994）を参照のこと）。この方法で、受容体機能 を阻害または促進する化合物を同定したり、その生体内効果を同定または評価す ることができる。治療法 哺乳類CKR-3受容体に特有の機能の少なくとも1つを阻害または促進することに よる本発明の哺乳類CKR-3受容体機能調節法は、白血球が媒介する炎症作用の選 択的で効果的な阻害または促進法になる。CKR-3受容体機能の1以上のリガンド、 阻害剤および/または促進剤（本明細書に記述するように同定されるものなど） を用いて、白血球機能を治療目的で調節することができる。 哺乳類CKR-3受容体は、主要な好酸球およびリンパ球ケモカイン受容体として 、哺乳類（ヒトなど）の好酸球および/またはリンパ球機能を妨害または促進す るための標的になる。ある種の炎症性浸潤ではT細胞と好酸球の同時局在化が一 貫して観察される。したがって、本願方法に従って同定されるリガンド、阻害剤 および促進剤などのCKR-3受容体機能を促進または阻害する化合物は、治療目的 で好酸球および/またはリンパ球機能を調節する際にとりわけ有用である。 したがって本発明は、かかる治療を必要とする個体の炎症性応答を阻害または 促進する方法であって、哺乳類CKR-3受容体機能を阻害または促進する化合物を そのような治療を必要とする個体に投与することを含む方法を提供する。 １つの態様において、哺乳類CKR-3受容体（例えばヒトCKR-3受容体）の1以上 の機能を阻害する化合物を投与することによって、炎症を阻害（すなわち軽減ま たは防止）する。その結果、白血球移動、走化性、（酵素、ヒスタミンなどの） エキソサイトーシスまたは炎症媒介物質の放出などの1以上の炎症過程が阻害さ れる。例えば、本発明の方法で、（喘息などにおける）炎症部位への好酸球浸潤 を阻害できる。 別の態様において、哺乳類CKR-3受容体（例えばヒトCKR-3受容体）の1以上の 機能を促進する化合物を投与することによって、白血球移動、走化性、（酵素、 ヒスタミンなどの）エキソサイトーシスまたは炎症媒介物質の放出などの炎症過 程を刺激（誘発または増進）して、炎症過程の有益な刺激をもたらす。例えば好 酸球を補充することによって寄生虫感染に対抗することができる。 ヒトのような霊長類に加えて、様々な他の哺乳類を本発明の方法に従って治療 できる。例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット や、その他のウシ属、ヒツジ類、ウマ科、イヌ科、ネコ科、齧歯類またはネズミ 科種などの哺乳類を治療できるが、これらに限られるわけではない。さらには、 鳥類（例えばニワトリ）などの他の種にもこの方法を実施できる。 炎症と感染に関係する疾患と状態をこの方法で治療することができる。好まし い態様におけるその疾患または状態とは、炎症応答を調節するために好酸球およ び/またはリンパ球の作用を阻害または促進すべき疾患または状態である。 CKR-3受容体機能の阻害剤で治療できるヒトまたは他の種の疾患または状態の 例を次に挙げるが、これらに限られるわけではない。 ・ 炎症性またはアレルギー性疾患および状態、例えばアレルギー性鼻炎、過敏 性肺疾患、過敏性肺炎、好酸球増加性肺炎（レフレル症候群、慢性好酸球増加性 肺炎など）、間質性肺疾患（ILD）（特発性肺繊維症、関節リウマチに関連するI LD、全身性エリテトーデス、強直性脊椎炎、全身性硬化症、シェーグレン症候群 、多発性筋炎、皮膚筋炎など）、喘息などの呼吸アレルギー疾患；全身性アナ フィラキシーまたは過敏性応答、（ペニシリン、セファロスポリンなどに対する ）薬物アレルギー、虫さされアレルギー；クローン病や潰瘍性大腸炎などの炎症 性腸疾患；脊椎関節症；硬皮症；皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー 性接触皮膚炎、蕁麻疹などの炎症性皮膚病および乾癬；血管炎（壊死性、皮膚お よび過敏性血管炎など）など； ・ 好酸球増加性筋炎、好酸球増加性筋膜炎； ・ 自己免疫疾患、例えば慢性関節リウマチ、乾癬関節炎、多発性硬化症、全身 性エリテマトーデス、重症筋無力症、若年型糖尿病、糸球体腎炎、自己免疫甲状 腺炎、ベーチェット病など； ・ （移植などにおける）移植片拒絶、例えば同種移植片拒絶または対宿主性移 植片病など； ・ 皮膚または器官の白血球浸潤を伴う癌； ・ 望ましくない炎症応答を治療すべきその他の疾患または状態、例えば再灌流 損傷、アテローム性動脈硬化症、ある種の血液学的悪性腫瘍、サイトカインが誘 発する毒性（敗血症ショック、内毒素ショックなど）、多発性筋炎、皮膚筋炎な ど（ただしこれらに限られるわけではない）も治療できる。 CKR-3受容体機能の促進剤で治療できるヒトまたは他の種の疾患または状態の 例を次に挙げるが、これらに限られるわけではない。 ・ 免疫抑制、例えばAIDSなどの免疫不全症候群にかかっている患者や、放射線 療法、化学療法、自己免疫疾患の治療あるいは免疫抑制を引き起こすその他の薬 物療法（コルチコステロイド療法など）を受けている患者に認められるもの；受 容体機能の先天的欠乏症または他の原因による免疫抑制など； ・ 寄生虫病などの感染性疾患、例えば線虫（回虫）などの蠕虫感染症（鞭虫症 、蟯虫症、回虫症、鉤虫症、棹虫症、旋毛虫症、糸状虫症）；吸虫（フラックス ）（住血吸虫症、肝吸虫症）、条虫（サナダムシ）（包虫症、無鉤条虫症、嚢虫 症）；内臓虫、内臓幼虫移住（トキソカラ属など）、好酸球増加性胃腸炎（アニ サキ（Anisaki）種、フォカネマ（Phocanema）種など）、皮膚幼虫移住（ブラジ ル鉤虫、イヌ鉤虫）など（ただしこれらに限られるわけではない）。ある種の炎症反応、特に喘息における標的細胞としての好酸球 好酸球は骨髄で生産され、組織（主に肺、胃腸管および尿生殖管などの粘膜組 織）に循環する。好酸球は典型的には血中の白血球の1〜3%を構成する。しかし 、アレルギー性疾患や蠕虫寄生虫感染症にかかっている人々では、増大した好酸 球蓄積が組織または血液で起こる。好酸球蓄積は宿主にとって有益でもあり、有 害でもある。 例えば、好酸球はカチオン性蛋白質を含有する多数の顆粒を持っている。例え ばIgG、IgAまたはIgE受容体の連動や、血小板活性化因子（PAF）、ロイコトリエ ンまたはケモカインなどの炎症媒介物質による刺激などによって誘発される好酸 球の脱顆粒は、その顆粒中の成分の放出をもたらす。好酸球からの産物は宿主細 胞に対する損傷をも引き起こす。最も有害な産物はカチオン性蛋白質で、喘息の 患者では検出されるその濃度が増大している。好酸球は、ロイコトリエンC4と血 小板活性化因子（PAF）を含むいくつかの炎症媒介物質をも生成する。これらの 媒介物質は気道平滑筋を収縮し、粘液の分泌を促進し、血管透過性を変化させ、 さらなる好酸球および好中球浸潤を引き起こす。 好酸球はアレルギー/喘息体質の開始と維持に関与する。したがって好ましい 態様として、本願方法を、喘息や過敏（アレルギー）状態（特に粘膜組織が関与 するものや他の好酸球関連疾患における過敏状態）の治療に使用できる。特に好 ましい態様として、哺乳類CKR-3受容体（例えばヒトCKR-3受容体）の1以上の機 能を阻害する化合物を喘息患者に投与する。 好酸球は、多細胞蠕虫寄生虫のように巨大で食菌不能な生物に対抗し、これを 破壊する宿主の防御には、明らかに重要である。また好酸球は、高レベルのIgE 抗体を誘導する他の病原体に対する免疫反応において重要なエフェクター細胞で もある。したがって、寄生虫病のような感染病の治療に本願方法を使用すること によって、炎症性防御を刺激または促進したり、あるいは宿主に危害を加える免 疫応答を抑制することができる。好酸球と喘息病因 喘息は気道または気管支の閉塞を特徴とし、広範囲にわたる薬学的媒介物質に 応答して迅速な狭窄と気管支過剰反応を起こす。気管支粘膜内層の慢性炎症は喘 息の発生に重要な役割を果たしていると広く考えられている。 好酸球、マクロファージおよびリンパ球による気管支粘膜の著しい浸潤が喘息 と他の過敏症で観察される。炎症を起こした気道に対する好酸球の選択的移動が しばしば認められるが、これは内皮に対する好酸球の選択的結合と血液からの抽 出の結果であると思われる。好酸球は、特に気管支粘膜損傷の原因物質であると 考えられている。喘息患者の研究は、血中好酸球数が気管支過剰反応の程度と相 関することを示唆している。さらに、喘息患者から得た気管支生検と気管支肺胞 洗浄液は、好酸球の程度と臨床的重篤度の間に明確な関係を示す。したがって、 とりわけ喘息の場合には、好酸球の存在と有害な免疫反応の間に強固な関連があ る。 化学誘引物質に応答して起こる選択的な白血球の走化性、管外溢出および活性 化において機能する好酸球とリンパ球上の主なケモカイン受容体は、好酸球補充 を妨害するための優れた標的となる。例えば、哺乳類（例えばヒト）CKR-3受容 体の少なくとも1つの機能の阻害剤を投与することは、その受容体に対するケモ カインの結合を阻害することなどによって、効果的で選択的な喘息の治療法とな りうる。炎症を起こした肺および気道組織への白血球、特に好酸球の補充（管外 溢出、浸潤）を軽減または防止し、および／または、これらの組織における白血 球機能を軽減することによって、喘息の有害な炎症過程を阻害でき、その症状を 緩和できる。 肺に対する好酸球補充の遮断によって喘息の症状を緩和できるという証拠があ る。α4インテグリンと反応するモノクローナル抗体の投与は、ヒツジにおいて 肺および気道への好酸球の蓄積を阻害し、抗原投与に対する気道の過剰反応を遮 断したと報告されている。喘息の霊長類モデルでは、ICAM-1に対するモノクロー ナル抗体が気道好酸球増加症と過剰反応を減衰させると報告されている。さらに 、受動皮膚アナフィラキシーのモルモットモデルでは、抗α4モノクローナルに よる好酸球の試験管内予備処理が、好酸球蓄積を抑制したとも報告されている（ これらのモデルについてはWegner，C.D.ら，Science，247: 456（1990）、Weg， V.B．ら，J．Exp．Med.，177: 561（1993）およびAbraham，W.M．ら，J．Clin.I nvest.，93: 776（1994）を参照のこと）。投与法 本発明によれば、１以上の化合物を単独で、あるいは別の薬物と組み合わせて 、適当な経路で宿主に投与できる。化合物（例えばリガンド結合を阻害する受容 体ペプチド、抗体または抗体断片）の有効量を投与する。有効量とは、その投与 条件下で所望の治療効果を達成するに足る量（例えばCKR-3受容体機能の阻害ま たは促進と、それによるそれぞれ、炎症応答の阻害または促進に十分な量）であ る。 種々の投与経路が可能で、例えば治療しようとする状態または疾患に応じて、 経口投与法、食餌法、局所投与法、腸管外投与法（静脈内注射、動脈内注射、筋 肉内注射、皮下注射など）、吸入投与法（気管支内吸入、鼻孔内吸入または経口 吸入、鼻孔内滴剤など）が挙げられるが、必ずしもこれらに限られるわけではな い。喘息などの呼吸アレルギー性疾患には、吸入法が好ましい投与法である。 投与すべき化合物の製剤は、選択した投与経路に応じて変化するだろう（例え ば液剤、乳剤、カプセル剤など）。投与すべき化合物を含む適当な組成物を、生 理学的に許容される担体または賦形剤中に調製することができる。例えば液剤や 乳剤の場合は、適当な担体として、食塩水や緩衝培地などの水溶液、アルコール /水溶液、乳液、懸濁液などが挙げられる。腸管外用の賦形剤には、塩化ナトリ ウム、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化 リンゲルまたは脂肪油などを含めることができる。静脈内用の賦形剤には、種々 の添加物、保存剤、液体、栄養または電解物質補充剤などを含めることができる （一般的にはRemington's Pharmaceutical Science，第16版,Mack編，1980を参 照のこと）。吸入法の場合は、化合物を可溶化し、適当な投与用ディスペンサー （アトマイザー、ネブライザーまたは加圧エアロゾールディスペンサーなど）に 入れることができる。実施例 次に以下の実施例によって本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例によ り限定されるものではない。 実施例１ ヒト好酸球と好酸球様細胞株の走化性特性 ヒト好酸球の走化性 １または複数の好酸球ケモカイン受容体のアンタゴニストを同定するには、好 酸球走化性に重要なケモカイン類を同定し、それらのケモカイン類が結合する１ または複数の受容体を決定する必要がある。走化性ウェルのポリカーボネート膜 上に生育した内皮細胞株を使用する高感度な改良走化性アッセイで走化性実験を 行なった。好酸球の単離 ヘパリン処理した血液100mlをPBSで1:1に希釈した。その20mlを65%、75%Perco ll段階勾配に重層した。その勾配を室温、1500rpmで25分間遠心分離した。好酸 球/好中球層を新しいチューブに移し、20mlの0.2%NaClを添加して1分後、30mlの 1.8%NaClを加えることにより、赤血球を溶解した。PBS、0.5%BSA、0.5mM EDTAを 含む緩衝液で細胞を2回洗浄した。細胞を冷緩衝液（PBS、0.5%BSA、0.5mM EDTA ）に5×10⁷細胞/50μlの密度で再懸濁し、50μlのCD16マイクロビーズをその細 胞に加えた。その混合物を4℃で25分間インキュベートした後、900μlの冷緩衝 液を加えた。miniMACS^TM分離ユニット（Miltenyi Biotec，I nc.，95603カリフォルニア州オーバン）を用いて、CD16陽性細胞（好中球）を枯 渇させた。カラムには細胞を200μlずつのせた。通過細胞を集め、組織学的に評 価した。この好酸球調製物は＞99%純度であった。走化性アッセイ ケモカイン類はPeprotech，Inc．（ニュージャージー州ロッキーヒル）から入 手した。3.0ミクロンBiocoat細胞培養インサート（Collaborative Biomedical P roducts）を用い、24ウェルプレート中で走化性実験を行なった。走化性実験に 先立って、内皮細胞を上記インサート上でコンフルエントになるまで2日間培養 した。使用した内皮細胞は、フォン・ウィレブラント因子ならびにICAM-1および VCAM-1などの内皮細胞マーカーを発現するECV304（European Collection of Ani mal Cell Cultures,英国ソールズベリー・ポートンダウン）と呼ばれる細胞株で あった。これらのアッセイはこの内皮細胞系によって極めて容易になる。という のは、ヒト臍静脈内皮細胞は天然では変異性で、数世代しか使用できず、成長が ECV304よりはるかに遅いからである。アッセイは37℃で1.5時間行ない、移動し た細胞を倒立顕微鏡で数えた。結果 図4に示す結果は、少なくとも5回の実験の代表例である。ECV304内皮細胞をポ リカーボネート膜上で生育させることによって、バックグラウンド移動がほとん ど完全に減少した。経内皮走化性アッセイに適用した好酸球は、いくつかのケモ カイン類、具体的にはRANTES、MCP-3およびそれより弱くMCP-1に対する移動を示 した。MIP-1β、IL-8、MCP-2およびIP-10は好酸球走化性に対してほとんど効果 を持たなかった。MIP-1αは好酸球の走化性をいくつかの実験で誘導したが、一 般的には不活性であった。異なるケモカイン類に対する白血球の応答性には変動 性があり、ケモカイン調製物の質にも不確定性があるので、これらの実験ではあ る範囲のケモカイン濃度を使用した。RANTESとMCP-3に対する高レベルな好酸球 走化性が一貫して認められた。酪酸分化HL-60細胞におけるRANTES走化性の誘導 多くの研究、特に高処理量スクリーニングに使用できるほどの好酸球をヒト血 液から単離することは難しい。好酸球様細胞株は好酸球の代わりになりうる。HL -60細胞が好酸球経路に分化できることは、いくつかの実験室で発見されている （Tagari，P.ら，Int．Arch．Allergy Immunol.，101: 227-233（1993）、VanRi per，G．ら，J．Immunol.，152: 4055-4061（1994））。かかる細胞が好酸球の 走化性機能をまねることができるかどうかを決定するため、HL-60細胞を試験し た。 HL-60細胞をRPMI（HEPESなし）＋20%ウシ胎児血清（FCS）に0.5×10⁶細胞/ml の密度で再懸濁した。n-酪酸（Sigma Chemical Co.，ミズーリ州セントルイス； #B5887）を1M n-酪酸のストック溶液から0.4mMの最終濃度で加えた。HL-60細胞 を37℃、5%CO₂で4日間インキュベートした。これらのHL-60細胞の好酸球様特性 は、走化性検定におけるRANTESおよびMCP-3応答性の誘導によって示される（図5 A〜5B）。さらに、ケモカイン受容体発現のノーザンブロット分析とリガンド結 合研究（下記参照）によって、これらの分化したHL-60細胞に好酸球と同様のケ モカイン受容体が誘導されたことが確認された。 実施例２ 主要な好酸球ケモカイン受容体の同定 プライマーの選択と設計 5つのケモカイン受容体遺伝子を整列させ、比較することによって、好酸球か ら新規のケモカイン受容体をPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニングする際 に使用する一組の縮重オリゴヌクレオチドを作成した。これら5つの受容体遺伝 子の選択は、それらが結合するケモカインリガンドのタイプ（I1-8受容体A（IL8 RA）、I1-8受容体B（IL8RB）、MIP-1α受容体（MIP1αＲ））または発現がリン パ様細胞または組織に限られると報告されているこれら受容体に有意な配列類似 性を持つオーファン受容体（エプスタイン-バー誘導性受容体-1（EBI1R） とバーキットリンパ腫受容体-1（BLR1））のいずれかに基づいた。刊行されたい くつかのアラインメントに基づいて、受容体配列を手で整列させた（IL-8RA、Ho lmesら，Science，253: 1278-1280（1991）；IL-8RB、Murphy，P.A.ら，Science ，253: 1280-1283（1991）；MIP1α/RANTES、Neote，K．ら，Cell，72: 415-425 （1991）；EBI1R、Birkenbach，M．ら，J．Virol.，67: 2209-2220（1993）；お よびBLR1（Dobner，T.ら，Eur．J．Immunol.，22: 2795-2799（1992））。 高度な配列相似性に基づいて、膜貫通（TM）領域2、6および7内ならびにTM3の すぐC-末端側の領域内の配列を、縮重オリゴヌクレオチド設計の標的として選択 した。この縮重オリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列を次の表に記 載する。 好酸球の単離および精製 ヘパリン処理した血液100mlをPBSで1:1に希釈した。その20mlを65%、75%Perco ll段階勾配に重層した。その勾配を室温、1500rpmで25分間遠心分離した。好酸 球/好中球層を新しいチューブに移し、20mlの0.2%NaClを添加して1分後、30mlの 1.8%NaClを加えることにより、赤血球を溶解した。リン酸緩衝生理食塩水（PBS ）、0.5%ウシ血清アルブミン（BSA）、0.5mMエチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA ）の溶液で細胞を2回洗浄した。細胞を冷緩衝液（PBS、BSA、EDTA溶液）に5×10⁷ 細胞/50μlの密度で再懸濁し、50μlのCD16マイクロビーズをその細胞に加えた 。その混合物を4℃で25分間インキュベートした後、900μlの冷緩衝液を加えた 。miniMACS^TM分離ユニット（Miltenyi Biotec，Inc.，95603カリフォルニア州オ ーバン）を用いて、CD16陽性細胞（好中球）を枯渇させた。カラムには細胞を20 0μlずつのせた。通過細胞を集め、組織学的に評価した。この基準によると、こ の好酸球調製物は＞99%純度であった。ｍＲＮＡ単離及びＰＣＲ ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写−ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）に用いるｍ ＲＮＡを、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から購入したＭｉｃｒｏ −ＦａｓｔＴｒａｃｋ^TM ｍＲＮＡ単離キットを用いて、精製した細胞から直接 抽出した。７ＴＭＳ縮重プライマーを用いる前に、ｍＲＮＡの質をβ−アクチン 及び／又はＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）ｍ ＲＮＡのＰＣＲ増幅により評価した。 ２０〜５０ｎｇのｍＲＮＡを、製造業者により明記されているように、Ｇｅｎ ｅＡｍｐ^R ＲＮＡ ＰＣＲ キット（パーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ ｌｍｅｒ）製）を用いて、オリゴｄＴ及び／又はランダム・ヘキサマーをプライ マーとして、最終容量２０μｌで逆転写した。２〜５μｌのこのｃＤＮＡ（逆転 写好酸球伝達暗号）を、５０μｌの容量中で２００μＭのｄＮＴＰおよび５０〜 １００ｐｍｏｌの縮重プライマーと混合した。マグネシウム濃度およびｐＨを各 プライマー対に対して最適化した。マグネシウム濃度は１．０から３．０ｍＭま での範囲にし、ｐＨは８．５から１０．０までの範囲にした。様々なサイクル・ パラメーターの数値も求めたにもかかわらず、一般的に用いた条件は以下に類似 していた。９４℃３０秒；３７℃３０秒を３サイクル、ランプ２分で７２℃に１ 分、続いて、９４℃４５秒；４８℃１分；７２℃１分を３０サイクル。（ランプ ＝徐々に増加）。 単離した２０１ｂｐの断片（以下参照）に関して、プライマー対２ａ−１およ び７−１またはプライマー対２ａ−１および３Ｒを６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ，ｐＨ ９．５及び１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂中でのＰＣＲ反応（前述）に用いた 。各反応の１μｌの産物を、「ネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）」プライマー２ａ −２および３Ｒを用いた別の（２回目の）回のＰＣＲに用いた。（「ネスティッ ド」プライマーは、プライマーの外側の配列にハイブリダイズするプライマーで ある。）ネスティッドＰＣＲの反応条件は１回目のＰＣＲで述べたとおりであっ た。 ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で評価、分離し、適当な大きさの断片を 精製し、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ^TM ＳＫ＋ クローニングキット（ストラタジェ ン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）製）を用いてサブクローニングした。（適当な断 片の大きさは以下のようである：領域２ａと７（上記表参照）からのプライマー 対でのＰＣＲでは約７００ｂｐ；領域２ａからのプライマーとプライマー３Ｒで のＰＣＲでは約２００ｂｐ；プライマー３Ｆと領域６ｂからのプライマーでのＰ ＣＲでは約４００ｂｐ、そして、プライマー３Ｆと領域７のプライマーでのＰＣ Ｒでは約５５０ｂｐ。）期待される断片の大きさは、関連する受容体蛋白質が同 じ構造類似性を共有するであろうという仮説に基づいて予想した。迅速スクリーニングアッセイ ７ＴＭＳの新規なメンバーに対する多数のクローンを迅速にスクリーニングす るために、上記のようにして得た細菌コロニー（すなわち、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐ ｔ ＳＫ＋にサブクローングした適当な大きさの断片を含むプラスミドの形質転 換体）のインサートを、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ^TMのポリリンカーの側に位置する 配列に相補的なＴ３およびＫＳプライマーを用いたＰＣＲによりスクリーニング した。すなわち、オーバーナイト形質転換由来の一部の細菌のコロニーを、２０ ０μＭ ｄＮＴＰ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．５、５０ｍＭ ＫＣｌ、２． ５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５０ｐｍｏｌ 各プライマーおよび０．２５ユニット Ｔ ａｑ ポリメラーゼを含む４０μｌのＰＣＲ混合物と直接混合した。サイクル条 件は、９４℃２０秒；５５℃２０秒；７２℃３０秒を２５サイクルにした。正し い大きさのインサートを、２０μｌのＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルで評 価して同定した。反応の残りの２０μｌをＡｌｕＩ、ＨｈａＩＲｓａＩで消化し （三重消化）、そして１２％ポリアクリルアミドゲル上で分離して異なる消化パ ターンをスクリーニングした。それから、異なるパターンのクローンをシーケン ス分析のために選択した。結果 縮重オリゴから生じた、ＰＣＲ断片のシーケンス分析により、ｐＣＲ−Ｓｃｒ ｉｐｔ中の２０１ｂｐの部分ｃＤＮＡクローンを同定した。（縮重オリゴは２ａ −１、２ａ−２、３Ｆ、３Ｒ及び７−１であった）。この部分クローンは、Ｅｏ ｓ Ｌ２と名付けられ（Ｌ２及びＥＬ２とも呼ぶ）、ＭＩＰ１α／ＲＡＮＴＥＳ 受容体に対して７８．３％のアミノ酸の類似性（８１．１％の核酸の類似性）お よびＭＣＰ−１受容体に対して６０．８％のアミノ酸の類似性（６１．６％の核 酸の類似性）を有することが分かった。最も最近の配列データベースの調査によ り、この部分クローンはユニークであることが示された。サザン及びノーザン分析 ＰＣＲ断片を標識し、サザン及びノーザンブロットの両方のプローブに用いた 。ＰＣＲプローブを調製するために、２０１ｂｐの断片を制限酵素ＥｃｏＲＩお よびＮｏｔＩでｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔベクターから解離させた。この消化の結果 、２０１ｂｐの断片と３９塩基対のベクター由来のポリリンカーから成る２４０ ｂｐの断片が得られた。この断片をアガロースゲルによる電気泳動によりベクタ ーから分離し、製造業者により推奨されているとおりに（Ｍａｇｉｃ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ，プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）、マディソン（Ｍａｄ ｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州（ＷＩ））により精製した。約２００ｎｇの原料 を、ベーリンガー・マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ） から購入したランダム プライムド ＤＮＡ ラベリング キット（Ｒａｎｄｏ ｍ Ｐｒｉｍｅｄ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ）で、製造業者の推奨す る標識プロトコールに従って標識した。 サザンブロットに対しては、ゲノムＤＮＡ（クローンテック・ラボラトリーズ 社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．），パロアルト（ Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ），カリフォルニア（ＣＡ）から購入）を制限酵素で一晩消 化し、０．７％アガロースゲル電気泳動で分離し、続いてＨｙｂｏｎｄ−Ｎナイ ロンメンブレン（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）製）にキャピラリートランス ファーした。ハイブリダイゼーションは、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（１×Ｄｅ ｎｈａｒｄｔ溶液は０．０２％ ウシ血清アルブミン、０．０２％ フィコール 、０．０２％ ポリビニルピロリドンである）、１０％ Ｗ／Ｖ デキストラン 硫酸塩、２％ ＳＤＳと剪断サケ精子ＤＮＡ（１００μｇ／ｍｌ）を含む６×Ｓ ＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ クエン酸ナト リウムである）中で一晩６５℃で行なった。メンブレンを２×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ中６５℃で２度リンスし、続いて０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中６５ ℃で２度洗浄（各１５分）した。 サザンハイブリダイゼーションにより、用いた各酵素で、単一の強くハイブリ ダイズする断片と単一の弱くハイブリダイズする断片が示された。弱くハイブリ ダイズする断片はＭＩＰ１α１／ＲＡＮＴＥＳ受容体のようである。 Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔをクローンテ ック・ラボラトリーズ社，パロアルト，カリフォルニア）から購入した。Ｅｘｐ ｒｅｓｓＨｙｂ^TM Ｓｏｌｕｔｉｏｎもクローンテック・ラボラトリーズ社から 購入した。Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔを製 造業者により推奨されたように行なった。プローブは前記サザンブロットについ て記述したものであった。ノーザンハイブリダイゼーションの結果により、脾臓 、末梢血白血球および胸腺に高レベルの約１．６ｋｂの伝達暗号があることが示 された。更なるノーザン分析を実施例５に示す。ゲノムライブラリースクリーニング クローンテック・ラボラトリーズ社（パロアルト，カリフォルニア）から購入 した、ＥＭＢＬ３ ＳＰ６／Ｔ７ベクターに構築したヒトゲノムファージライブ ラリーを２０１ｂｐのＰＣＲ断片でスクリーニングし、全長のクローンを得た。 約２５，０００のプラーク形成ユニットを、ライブラリーとともに提供された大 腸菌株Ｋ８０２の６００μｌのオーバーナイト細菌培養物とＮＺＣＹＭトップア ガロース中で混合し、ＮＺＣＹＭアガー（ＮＺＹＣＭブロス、アガーおよびアガ ロースはＧｉｂｃｏ／ＢＲＬから購入した））を含む１５０ｍｍのペトリ皿上に プレーティングした。３７℃７時間のインキュベーション後、プレートをＢＡ− ８５ニトロセルロースメンブレン（シュライヒャー・アンド・シューエル（Ｓｃ ｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）製，キーン（Ｋｅｅｎｅ），ニュ ーハンプシャー州（ＮＨ））で５分間かぶせてファージをメンブレンにトランス ファーさせた。それから、メンブレンを５分間Ｄｅｎｔｕｒｉｎｇ Ｓｏｌｕｔ ｉｏｎ（１．５Ｍ 塩化ナトリウム、０．５Ｎ 水酸化ナトリウム）に浸し、続 いて１．５Ｍ 塩化ナトリウム、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０で中和した。 フィルターを１５分間風乾し、それから２時間、８０℃、減圧下で固定した。そ れから、フィルターをサザンブロットについて前述したようにハイブリダイズさ せた。２０１ｂｐのＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチドプライマー２ａ−２（Ｔ Ｍ２）と３Ｒ（ＴＭ３）の間のヌクレオチドを含んでいた。 Ｅｏｓ Ｌ２．８と名付けた１つのゲノムファージクローンは、サザンブロッ トで見られた１．８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片を含むインサートを含んでいた（ 完全なインサートの大きさは決定されていないが、約１７ｋｂである）。 ファージクローンＥｏｓ Ｌ２．８をＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化し、アガ ロースゲルで電気泳動した。約１．８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片を切り出し、ア ガロースから電気溶出し、フェノール／クロロホルム抽出し、そしてエタノール で沈殿させた。１．８ｋｂの断片を水に再懸濁し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｉ Ｉ ＫＳ＋ベクター（ストラタジェン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）製）のＨｉｎ ｄＩＩＩサイトにライゲーションし、続いてＧｉｂｃｏ／ＢＲＬから購入したＤ Ｈ５αコンピテントセルを形質転換した。 このＨｉｎｄＩＩＩ断片の両ストランドを配列決定し、そして該断片がＥｏｓ Ｌ２受容体（ヒトＣＫＲ−３受容体）の全アミノ酸をコードする領域を含んで いることが分かった。この配列と以下に述べるｃＤＮＡクローンとの比較により 、該クローンが全長のクローンであることが示されている。１０６５ヌクレオリ ドのオープンリーディングフレームは、推定分子量４１Ｋｄ、３５５アミノ酸の 蛋白質（配列番号：２）をコードしている。 全長のＥｏｓ Ｌ２受容体の配列と、ＭＩＰ１α／ＲＡＮＴＥＳ受容体及びＭ ＣＰ−１受容体との比較により、各々７３．４％と６０．５％のアミノ酸の類似 性が示された。この比較のために、配列を手で並べて、類似アミノ酸の数をアミ ノ酸の合計数で割り、１００をかけた。） 配列をＭｅｇＡｌｉｇｎ^TM（ドナスター社（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．）製） を用いたＣｌｕｓｔａｌ法によっても並べた。他のケモカイン受容体配列との比 較により、ＣＫＲ−１、ＣＫＲ−２Ｂ、及びＣＫＲ−４に対して、各々６２％、 ４７％、及び４１％のアミノ酸配列の類似性が示された。対照的に、ＩＬ−８受 容体Ａ及びＢに対するアミノ酸配列の類似性は、両受容体に対してたった２７％ であった。この受容体のＭＩＰ１α／ＲＡＮＴＥＳ受容体及びＭＣＰ−１受容体 、両Ｃ−Ｃケモカイン受容体に対する配列の類似性は、本明細書に報告した、Ｅ ｏｓ Ｌ２がＣ−Ｃケモカイン受容体であることを示す結果と一致している。 実施例３ トランスフェクション細胞株でのＥｏｓ Ｌ２の発現 ＦＬＡＧ−付加Ｅｏｓ Ｌ２（ＣＫＲ−３）受容体構築 Ｅｏｓ Ｌ２受容体融合蛋白質を以下のようにして構築した。 １． ｐＣＤＭ８中のＦＬＡＧ−ＰＡＦ受容体構築物（カンズ（Ｋｕｎｚ，Ｄ ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：９１０１−９１０６（１９９２）） をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで二重消化し、ＦＬＡＧペプチドをコードす るヌクレオチドを含む４８ｂｐの断片を解離させた。ヌクレオチド配列は、ＡＡ ＧＣＴＴＣＣＡ ＧＣＡ ＧＣＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＴＡＣ ＡＡＧ ＧＡＣＧ ＡＣ ＧＡＴ ＧＡＣ ＡＡＡ ＧＡＡＴＴＣ（配列番号：１５）である。アミ ノ酸配列は、ＭＤＹＫＤＤＤＤＫＥＦ（配列番号：１６）である。ＦＬＡＧヌク レオチドを含む４８ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片をｐｃＤＮＡ３ベク ター（インビトロジェン製，サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ），カリフォル ニア州（ＣＡ））のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングし、 ｐｃＤＮＡ３／ＦＬＡＧを生じさせた。 ２． １．８ｋｂのＥｏｓ Ｌ２のＨｉｎｄＩＩＩ断片を含むｐＢｌｕｅｓｃ ｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋ベクターを、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化して１． ２６１ｋｂの断片を解離させた。このＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片は、Ｅｏｓ Ｌ ２アミノ酸の９１から停止コドンまでをコードするヌクレオチドと、同じ３’非 翻訳領域と、２１ｂｐのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋ベクターを含ん でいる。 ３． Ｅｏｓ Ｌ２遺伝子の５’末端を増幅するが最初のＭｅｔを除き、工程 １で前述したＥｃｏＲＩサイトと適合できるＥｃｏＲＩサイトを工作するために ２つのＰＣＲプライマーを作製した。５’プライマー（配列番号：１７）は： ＥｃｏＲＩ ５’−ＴＴＡＡ ＧＡＡＴＴＣ ＡＣＡ ＡＣＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＧＡＴ Ａ Ｃであった。 このプライマーはＥｃｏＲＩサイトと、Ｍｅｔコドンを除くＥｏｓＬ２遺伝子の 最初の１７ヌクレオチドを含む。 ３’プライマー（配列番号：１８）は： ＢａｍＨＩ ５’−ＣＡＴＡＧＴ ＧＧＡＴＣＣ ＡＧＡＡＴＧであった。 このプライマーはＥｏｓ Ｌ２遺伝子のちょうどＢａｍＨＩサイトの３’でプラ イムする。１．８ｋｂのＥｏｓ Ｌ２断片を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋ベクターを鋳型として用いたこれら２つのプライマーでの増幅により、 Ｅｏｓ Ｌ２の５’末端を含む２８０ｂｐの断片が増幅され、この２８０ｂｐの 断片をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化して、以下に述べるライゲーション用 断片を得ることができる。 増幅の条件は： １００ｎｇの１．８ｋｂのＥｏｓＬ２断片を含むｐＢｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋を、５０μｌの反応量で２００μＭ ｄＮＴＰ及び ５０ｐｍｏｌのプライマーと組み合わせた。最終マグネシウム濃度は２．５μＭ で、ｐＨは８．０であった。９４℃３０秒；５５℃３０秒；７２℃３０秒を２５ サイクルで、断片を増幅した。前述のように、増幅産物をアガロースゲルで分離 し、電気溶出で精製した。該断片をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、再び アガロースゲルで精製した。 ４． Ｆｌａｇ−付加ＥｏｓＬ２遺伝子の構築のため、ＦＬＡＧ断片を含むｐ ｃＤＮＡ３ベクター（工程１で述べた）をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化した 。ベクター断片（ＦＬＡＧコード配列を含むＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片）を電気 泳動によりポリリンカー断片から分離し、そしてベクター断片を他の電気溶出し た断片について述べたように精製した。ベクター断片を工程３でＰＣＲにより生 じたＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片と組み合わせた。これら２つの断片を工程２の １．２６１ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片と組み合わせた。３つの断片全てを いっしょに３重ライゲーションしてｐｃＤＮＡ３中にＦＬＡＧ−付加ＥｏｓＬ２ 受容体を得た。ライゲーションしたＤＮＡでＤＨ５αを形質転換した。一過性トランスフェクタント ２９３細胞（ＡＴＣＣ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＲＬ１５７３）をＧｉ ｂｃｏ／ＢＲＬから得て、１０％ 牛胎児血清、グルタミン、及びペニシリン／ ストレプトマイシン（全てＧｉｂｃｏ／ＢＲＬ製）を補ったＭｉｎｉｍａｌ Ｅ ｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）Ａｌｐｈａ Ｍｅｄｉｕｍ中で成長 させた。各一過性のトランスフェクションに対し、２×１０⁶個の２９３細胞を トランスフェクションの１日前に３５−ｍｍの組織培養皿にプレーティングした 。トランスフェクションの日に細胞（成長して皿に接着している）をＰｈｏｓｐ ｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ製） で１度洗い、そしてＤＮＡとｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ^TM Ｒｅａｇｅｎｔ（ Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ製）の混合物を細胞にアプライした。 最終量１００μｌのＯｐｔｉＭＥＭ^TM（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ製）中の２μｇの Ｆｌａｇ付加Ｅｏｓ Ｌ２受容体発現ベクターを、１００μｌ量にした１２μｌ のＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ^TM試薬と４５分間室温でインキュベートして、Ｄ ＮＡ／ｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ^TM試薬混合物を作製した。最終混合物量は２ ００μｌである。４５分のインキュベーション後、８００μｌのＯＰｔｉＭＥＭ^TM を２００μｌのＤＮＡ／ｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ^TM試薬に加えて、１ｍｌ の溶液を前記のように細胞に重層する。それから、細胞を３７℃で５時間インキ ュベーションし、その時に前記のように補った１ｍｌのＭＥＭ Ａｌｐｈａ Ｍ ｅｄｉｕｍを加える。細胞をさらに１２時間インキュベートし、その時に全培地 を取り除き、細胞をＰＢＳで２度洗浄し、２ｍｌの前記のように補ったＭＥＭ Ａｌｐｈａ ｍｅｄｉｕｍを加える。それから、トランスフェクトした細 胞をさらに７２時間インキュベートする。細胞を、ＰＢＳ １０ｍＭ ＥＤＴＡ 中でインキュベーション後、それらを穏やかにピペッティングして集める。 ＦＬＡＧ付加Ｅｏｓ Ｌ２受容体の細胞表面発現を一過性にトランスフェクト した２９３細胞で行った。免疫蛍光染色及びＦＡＣＳ分析により決定すると、約 ２．６％の細胞が該受容体を表面に発現していた。いくつかの細胞での発現のレ ベルはバックグランドより２桁多いことが分かった。このことは高レベルの発現 がこの細胞株で達成できることを示している。Ｅｏｓ Ｌ２遺伝子はネオマイシ ン耐性遺伝子を有するｐｃＤＮＡ３発現ベクター（インビトロジェン社製、サン ディエゴ、カリフォルニア）により保持されているので、安定２９３トランスフ ェクタントはジェネティシン（Ｇ４１８）選択を用いて選択することができる。安定細胞株 ＦＬＡＧ付加受容体を有する５００以上のマウスＬ１−２ 前Ｂ細胞の安定株 が作製された。Ｌ１−２ 前Ｂ細胞は（ユージン ブッチャー博士（Ｄｒ．Ｅｕ ｇｅｎｅ Ｂｕｔｃｈｅｒ），スタンフォード大学，スタンフォード，カリフォ ルニア）から得て、１０％ ウシ血清アルブミン、及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、ピ ルビン酸ナトリウムおよびβ−メルカプトエタノールを補ったＲＰＭＩ−１６４ ０（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ製）で維持した。２００以上のクローン由来の細胞をＭ ２抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（インターナショナル バイオテクノロジー社 （Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．） 製、ニューヘーヴン（Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ）、コネティカット州（ＣＴ））、続 いて抗マウスＩｇ−ＦＩＴＣ（ジャクソン イミュノリサーチ ラボラトリーズ 社（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ ｓ，Ｉｎｃ．）製）で染色することにより表面での発現をスクリーニングし、そ して蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）で分析した。免疫蛍光染色及びＦ ＡＣＳ分析は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ ｇｙ，１巻，コリジャン（Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．）ら，編，（ジョン・ウィリー ＆ソンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）；ニューヨーク ，ニューヨーク州（ＮＹ））に記載されているように行った。いくつかの細胞株 に対するＦＡＣＳ分析の結果により、高レベルのＥｏｓ Ｌ２でＦＬＡＧ付加受 容体を発現する多数のクローンが示された（図６）。非トランスフェクション細 胞（示されていない）は染色に対して陰性であった。高レベルの発現をする安定 細胞株をＥｏｓ Ｌ２受容体に反応する抗体の生産の免疫原として用いることが できる。さらに、これらの細胞株は走化性やリガンド結合を研究するのに役立つ 。バキュロウィルス発現 バキュロウィルス発現ベクターの構築のために、ｐｃＤＮＡ ３中のＦｌａｇ 付加Ｅｏｓ Ｌ２受容体をＨｉｎｄＩＩＩで消化してＦｌａｇ付加遺伝子を除い た。該遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ断片をクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ） フラグメ ントとｄＮＴＰで突出を埋めて平滑末端にした。該平滑末端断片をｐＶＬ１３９ ３（インビトロジェン製）のＳｍａＩサイトにサブクローニングした。２．０μ ｇのＥｏｓ Ｌ２遺伝子を含むｐＶＬ１３９３ベクターを０．５μｇのＡｃＭＮ ＰＶ ウイルスＤＮＡ（インビトロジェン製）と混合し、製造業者の使用説明書 に従ってＩｎｓｅｃｔｉｎ^TM（インビトロジェン製）でＳｆ９昆虫細胞（インビ トロジェン製）にコトランスフェクションした。ＳＦ−９００培地（無血清）を ５ｍｌのＳＦ−９培養基（１０％ ウシ胎児血清含有Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｓｕｐｐ ｌｅｍｅｎｔｅｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉａ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ製））で翌 日置き換えて、細胞を５日間成長させた。組み換えウイルスを、オーレイリー， ミラー，とルコー（Ｄ．Ｒ．Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｌ．Ｋ．Ｍｉｌｌｅｒ，ａｎｄ Ｖ．Ａ．Ｌｕｃｋｏｗ） （１９９４） Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒ ｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１４９−１５８頁に記載さ れているようにプラーク精製した。 前記のプラーク精製組み換えウイルスでＳｆ９細胞を感染させることにより、 Ｅｏｓ Ｌ２受容体の発現をＳｆ９細胞上に得た。Ｓｆ９細胞（２×１０⁶細胞 ／ｍｌ）を１０：１の感染多重度で感染させた。感染を７２時間続けて、その時 に細胞をＭ２抗ＦＬＡＧ抗体で染色した。 この受容体の発現の成功は、Ｓｆ９細胞でのバキュロウイルス発現システムで も達成された。良好なレベルの発現は抗ＦＬＡＧ抗体での染色に基づいて達成さ れている（実施例５参照）。ＦＡＣＳにより受容体を発現していることが示され ている同じ細胞Ｓｆ９トランスフェクタントで、リガンド結合も達成された。決 定的な細胞表面発現はヨウ化プロピジウム排除により示されたが、陰性コントロ ール（すなわち、Ｅｏｓ Ｌ２遺伝子インサートを欠く発現ベクターでトランス フェクトしたＳｆ９細胞）と比較すると、これらの細胞での発現は低いように見 えた。高細胞表面発現のために、感染の長さを減らすことができ、またＭＯＩを さらに最適化することができる。 実施例４ リガンド結合研究 リガンド結合手順 Ｅｏｓ Ｌ２受容体でトランスフェクトした細胞又は精製正常ヒト好酸球（上 記参照）をＨａｎｋｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ ＨＢＳＳ）で洗浄し、それから結合緩衝液（： ５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ₂、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．５％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、 ｐＨ ７．３）に再懸濁した。微量遠心管中で、５×１０⁵個の細胞を０．１ｎ Ｍの放射線標識ケモカイン（ニューイングランド ニュークリアー（ＮｅｗＥｎ ｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）、マサチューセッツから購入）と２００μｌのア リコート中で室温で６０分間インキュベートした。該細胞を放射線標識ケモカイ ンのみと、又は、指示された濃度で用いた、競合剤としての非標識ケモカイ ン（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ製）と共に、のいずれかでインキュベートした。インキ ュベーションの終わりに、細胞を結合緩衝液で３度洗浄した。各洗浄は、微量遠 心機で７，０００×ｇで２分間の遠心分離からなる。洗浄後、ペレットをＬＰ３ チューブに移し、そして、結合量を表す細胞の放射線活性をガンマカウンターで 測定した。全試料を二連にし、そして全ての実験を少なくとも３度繰り返した。 スキャッチャードプロットを結合データから、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈコンピュータ ー上でＭｉｃｒｏＳｏｆｔ ＥｘｃｅｌｌおよびＣｒｉｃｋｅｔＧｒａｐｈによ り計算した。ヒト好酸球への結合 走化性アッセイ（実施例１参照）からの発見に基づいて、リガンド結合研究の 焦点をＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α及びＭＣＰ−３にあわせた。リガンド結合研 究を放射線標識ケモカインと様々な「非放射性」ケモカインを競合剤として用い て行った。精製正常ヒト好酸球を、０．１ｎＭ¹²⁵Ｉ−標識ＭＩＰ−１α又はＲ ＡＮＴＥＳのいずれかと、様々な非放射性ケモカイン（２５０ｎＭ ＭＩＰ−１ α、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、又はＭＣＰ−３）の存在下又は非存 在下でインキュベートした。細胞をよく洗浄した後、結合をガンマカウンターに より測定した。 図７は、ヒト好酸球のＲＡＮＴＥＳ及びＭＩＰ−１αへの結合を示したヒスト グラムである。これらの結果は、好酸球はＭＩＰ−１αへ弱く結合するだけで、 そして、この結合をＭＩＰ−１α自身や他のβ−ファミリーのケモカイン、例え ば、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３及びＲＡＮＴＥＳにより阻害することができること を示している（図７）。対照的に、好酸球はＲＡＮＴＥＳにより豊富に結合した （図７）。ＲＡＮＴＥＳによる結合は、過剰量の「非放射性」ＭＩＰ−１αによ り十分に阻害できなった（図８）。このことは、好酸球に、ＭＩＰ−１αおよび ＲＡＮＴＥＳに対して識別された受容体がある可能性を示している。 スキャッチャードプロット分析により、親和性が９１ｐＭのＭＩＰ−１α結合 サイトが１．８×１０³あることが示された。該分析により、低親和性（８８３ ｐＭ）でより多くの結合サイト（３．６×１０⁴／細胞）を有するＲＡＮＴＥＳ に対する受容体も示された。用いた条件下では、有意なＭＣＰ−１の好酸球への 結合はなく（示されていない）、そして、ＭＣＰ−１は非常に高濃度の場合を除 きＲＡＮＴＥＳの結合を阻害しなかった（２５００倍過剰、図８）。酪酸−分化ＨＬ−６０細胞への結合 酪酸分化ＨＬ−６０細胞をリガンド結合アッセイに用いて、これらの細胞が好 酸球と同じようにふるまうかどうかを決定した。０．１ｎＭ¹²⁵Ｉ−標識ＭＩＰ −１α又はＲＡＮＴＥＳと、２５０ｎＭの非放射性ケモカイン（ＭＩＰ−１α、 ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−３、Ｉ１−８、ＭＣＰ−１）の非存在下又は存在下でイ ンキュベートした０．５×１０⁶ＨＬ−６０細胞を用いて、アッセイを前記のよ うに行った。これらの細胞では、ＭＩＰ−１αおよびRＡＮＴＥＳの両方が等し く良好に結合し、両者が互いに交差阻害できた（図９）。この観察は、両ケモカ インが好酸球の経内皮移動を誘導する走化性アッセイ（実施例１参照）と一致す る（図８）。誘導過程で、ＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳの結合は未分化ＨＬ −６０細胞では有意ではないため、両受容体は制御されなかったように見える（ データは示されていない）。Ｅｏｓ Ｌ２受容体トランスフェクタント Ｅｏｓ Ｌ２受容体のクローニングと発現に続き、トランスフェクション細胞 を多数のケモカインへの結合を試験するために用いた。他の研究者らにより観察 された現象である、非放射性ケモカイン添加が結合を阻害したので、２９３トラ ンスフェクタントを用いた最初の試みは失敗した。対照的に、バキュロウイルス を感染させたＳＦ９細胞を用いると、良好なＲＡＮＴＥＳ結合が検出された（図 １０）。ＳＦ９細胞に対するアッセイ条件は哺乳類細胞とは異なっていた。０． １ｎＭ¹²⁵Ｉ−標識RＡＮＴＥＳの結合は、０．５％ ＢＳＡを補った、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂及び１ｍＭ ＣａＣｌ₂中で 起きた。室温で６０分後、細胞を０．５Ｍ ＮａＣｌを含む結合緩衝液で３度洗 浄し、そして、細胞ペレットの放射線活性をガンマカウンターを用いてカウント した。 これらのリガンド結合アッセイでは、ＭＩＰ−１α又はＲＡＮＴＥＳの最も有 効な異種構造競合剤はＭＣＰ−３であった。事実、ＭＣＰ−３はＭＣＰ−１の活 性化Ｔ細胞への結合も効果的に阻害した。したがって、ＭＣＰ−３はＣＫＲ−１ 、ＣＫＲ−２及びＣＫＲ−３に結合するように見える（ＣＫＲ−１，ガオ（Ｇａ ｏ，Ｊ．Ｌ．），ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７７：１４２１−１４２７（１ ９９３）とネオテ（Ｎｅｏｔｅ，Ｋ．）ら，Ｃｅｌｌ，７２：４１５−４２５（ １９９３）； ＣＫＲ−２，シャロ（Ｃｈａｒｏ，Ｉ．Ｆ．），ら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：２７５２−２７５６（１９９４） とマイヤー（Ｍｙｅｒｓ，Ｓ．Ｊ．），ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０ ：５７８６−５７９２（１９９５））。 放射線標識ＭＣＰ−３（ペプロテック社（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）製 、ロッキーヒル（Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ）、ニュージャージー州（Ｎ．Ｊ．）） も結合研究に用いた。図１１Ａ〜１１ＢはＭＣＲ−３の分化ＨＬ−６０細胞への 結合を示したグラフである。ＭＣＰ−３の結合を以下の修飾をして前記のように 行った。細胞を０．１ｎＭ¹²⁵Ｉ−標識ＭＣＰ−３とインキュベートした。用い た結合緩衝液は０．５％ＢＳＡ及び０．１％アジ化ナトリウムを含むＨＢＳＳで あった。結合は３７℃で３０分行った。結合していない同位元素を、８００μｌ の２０％ショ糖により、１２，０００×ｇで２分間細胞を回転することにより分 離した。それから、チューブをドライアイスで急冷凍し、チップをペンチで切り 取ってカウントした。 実施例５ 好酸球ケモカイン受容体の発現 Ｅｏｓ Ｌ２受容体が好酸球の機能的受容体であることを確認するために、受 容体の発現を、（ａ）ノーザンブロット分析、及び（ｂ）受容体反応性抗ペプチ ド抗体モノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーにより評価した。ヒト好酸球、好中球、及びＰＢＭＣの精製 密度勾配遠心分離と抗ＣＤ１６磁気ビーズを用いた陰性選択（ハンセル（Ｈａ ｎｓｅｌ，Ｔ．Ｔ．）ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１２２：９７（１ ９８９））を組み合わせて、高レベルの循環血液好酸球（５〜１７％）を有する 個体のヘパリン化血液から好酸球を単離した。簡単に言えば、Ｐｅｒｃｏｌｌ遠 心分離の顆粒球画分を、ＣＤ１６マイクロビーズ（ミルテニー バイオテック社 （Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．）製、サニーベール（Ｓｕｎｎｙ ｖａｌｅ）、カリフォルニア（ＣＡ））と３０分間インキュベートした。それか ら、細胞をＭＡＣＳカラム（ミルテニー バイオテック社製）にかけて、そして 、好酸球を通過画分に集めた。光学顕微鏡によるＤｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ−染色細 胞遠心分離調製物の分析により決定すると、好酸球は組織学上９９％以上の純度 であることが示された。 ヒト好中球を室温でのＰｅｒｃｏｌｌ密度勾配遠心分離（δ＝１．０８８）に よりヘパリン化静脈血液から単離した（コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら，編，１ ９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， （ジョン・ウィリー＆ソンズ：ニューヨーク，ニューヨーク州）。ＲＢＣを低張 溶解により除いた。 ＰＢＭＣを既述のように単離した（コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら，編，１９ ９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（ ジョン・ウィリー＆ソンズ：ニューヨーク，ニューヨーク州））。単球を磁気ビ ーズを用いたＣＤ１４陽性選択により精製し、そして、リンパ球をナイロンウー ルに通過させて、Ｔ細胞を精製した。ＣＤ３芽球を生産するために、１０％ Ｆ ＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０中の２×１０⁶ＰＢＭＣ／ｍｌを、最初に抗ＣＤ ３抗体ＴＲ７７で被覆した組織培養プレートに加えた。４〜６日後芽球を新鮮な 培地に移して、５０ユニット／ｍｌのＩＬ−２（ジェンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ ）製）を補った。ノーザン分析： ＣＫＲ−３は好酸球に選択的に発現する。 エオタキシンは好酸球に対する選択的化学誘引物質であるにもかかわらず、Ｃ ＫＲ−３受容体は、単球とＴ細胞を誘引することが知られているＲＡＮＴＥＳと ＭＣＰ−３にも結合する。受容体の伝達暗号の発現は、様々な白血球集団で試験 されている。 最初のノーザンハイブリダイゼーションの結果（実施例２参照）により、ＨＬ −６０細胞株においてのみならず、脾臓、末梢血液白血球および胸腺ならびに好 酸球およびＴ細胞等の多数の白血球亜集団においても約１．６ｋｂの伝達暗号が 発現することが示された。伝達暗号レベルは、ＨＬ−６０細胞株において酪酸誘 導により好酸球経路に沿って劇的に増加した。 サザンブロットでクロスハイブリダイズするＭＩＰ１α／ＲＡＮＴＥＳ受容体 に対する伝達暗号は弱く、そして約３．０ｋｂであると報告されているので、こ の伝達暗号はＥｏｓ Ｌ２のものでありそうである。最初の２０１ｂｐのＰＣＲ 断片をサザンブロットのプローブとして用いた場合、１．８ｋｂのＨｉｎｄＩＩ Ｉ断片に強くハイブリダイズするのが見られる。これは、本明細書でクローニン グして議論した断片である。この断片に加えて、約１０ｋｂの断片に非常に弱く ハイブリダイズするのが観察される。この１０ｋｂの断片は、報告されたＭＩＰ １α／ＲＡＮＴＥＳ受容体のＨｉｎｄＩＩＩ断片の大きさに一致する。このＭＩ Ｐ１α／ＲＡＮＴＥＳ受容体はノーザン上では観察されない約３ｋｂの伝達暗号 を生産する。それゆえ、ノーザン上で見られる約１．６ｋｂ伝達暗号はおそらく Ｅｏｓ Ｌ２遺伝子由来であろう。断然豊富なＥｏｓ Ｌ２の発現は、過好酸球 症候群の患者から精製した好酸球の調製物において観察された（実施例８参照） 。 ＣＫＲ−３の他のＣＣケモカイン受容体に対する高配列類似性およびサザンブ ロットにおいて全長のクローンが複数の配列にハイブリダイズするという事実の ため、さらなるノーザン分析に、サザンブロットにおいて他の配列とクロスハイ ブリダイズしない、ゲノムクローンの３’非翻訳領域由来の２５０ｂｐの断片を 用いた。ハイブリダイゼーションのため、ヌクレオチド１２０３〜１４５３を含 むＣＫＲ−３に特異的な３’非翻訳領域プローブを用いた（図１Ｃ）。 単球、好中球、リンパ球、Ｔ細胞、ＣＤ３ ＭＡｂでの活性化により生産した Ｔ細胞芽球、及び好酸球を含む異なる白血球集団由来のＲＮＡを用いて、ノーザ ンブロットのパネルを調製した。ＴｒｉＺＯＬ^TM 試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ製 ）を用いて製造業者の推奨するプロトコルに従って、ＲＮＡを単離した。高度に 精製された各白血球集団から単離した全ＲＮＡの１５μｇを１．２％ホルムアル デヒドアガロースゲル上で分離し、Ｎｙｔｒａｎ−Ｐｌｕｓ^TMナイロンメンブレ ン（シュライヒャー・アンド・シューエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓ ｃｈｕｅｌｌ）製）にトランスファーしてＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ^Rを用いて クロスリンクさせた。放射線標識３’非翻訳領域プローブを用いたハイブリダイ ゼーションを、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ^TM Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（クローンテック（ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）製）で製造業者の提示するプロトコルを用いて行なった。ノ ーザンブロットを増感スクリーンを用いて３〜５日間Ｘ−ＯＭＡＴ ＡＲフイル ムに露光させた。ＣＫＲ−３特異的プローブを０．５％ ＳＤＳ中で沸騰させて 除去し、負荷する時の変動をコントロールするために該ブロットをβ−アクチン で再びプローブした。 検出可能なシグナルを与える細胞集団は好酸球だけで、そこでは、１．８ｋｂ の大きさの伝達暗号が見つけられた。これらの結果は、図１３Ａ〜１３Ｄの免疫 学的に検出した表面発現のパターンと一致している。この実験において伝達暗号 は休止又は活性化Ｔ細胞では検出されなかったにもかかわらず、ある亜群のＴ細 胞が受容体を発現することは可能である。好酸球ケモカイン受容体反応性モノクローナル抗体（ＭＡｂ） Ｅｏｓ Ｌ２受容体に反応性のあるＭＡｂを、マウスをＮ末端の３５アミノ酸 に対応する合成ペプチドで免疫することにより生産した。ヌクレオチド配列から 導き出したＥｏｓ Ｌ２のＮ末端の３５アミノ酸（図１Ａ〜１Ｃ参照；また、配 列番号：２参照）を合成して、担体蛋白質ＰＰＤ（ミコバクテリウム ツベルキ ュロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来の精 製蛋白質；セバン バイオテック社（Ｓｅｖｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｄ． ）製，ケンブリッジ，イギリス）に結合させた。 雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスを２週間間隔で４回、５０μｇのＰＢＳ中のペプチドペ プチド担体コンジュゲートで免役した。Ｆｒｅｕｎｄ完全（最初の注射）及び不 完全アジュバント（以降の注射）を用いて、マウスにペプチドコンジュゲートを 腹腔内注射した。最後の免疫をアジュバントなしに静脈内注射した。ポリクロー ナル抗血清を合成ペプチドで免役したマウスからも集めた。 １５，０００以上のハイブリドーマを生産する２つの好結果の融合を行なった 。最終注射の４日後、脾臓を除去し、単一細胞懸濁物を無血清ＤＭＥＭ培地で調 製した。ガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．）ら（ガルフレら，Ｎａｔｕｒｅ，２６ ６：５５０−５５２（１９７７））に従って、これらの細胞をハイブリドーマ融 合パートナーＳＰ２／０と融合させた。２０ｍｌの脾臓細胞と２０ｍｌのＳＰ２ ／０を組み合わせて８００ｇで５分間回転して、培地を除いた。あらかじめ３７ ℃に温めておいた５０％ポリエチレングリコール１５００（ベーリンガー マン ハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）製、インディアナポリス、 インディアナ州（ＩＮ））溶液を細胞ペレットに２分間かけて加えて、続いて１ ０ｍｌのＤＭＥＭ培地を３分間かけて加えた。細胞懸濁物を４００ｇで３分間回 転し、上清を除いた。２０％ ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ ユニット／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン硫酸塩、 及びＨＡＴ選択培地（ベーリンガー マンハイム製、インディアナポリス、イン ディアナ州）を含むＤＭＥＭ培地に穏やかに再懸濁した。細胞を９６ウェル平底 マイクロタイタープレートに２００μｌ／ウェルでプレーティングした。 １０〜１４日後、酵素標識抗マウス抗体（セイヨウワサビペルオキシダーゼ標 識抗マウスＩｇＧ（ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）製））を用いてＥＬＩＳＡア ッセイで、ウェル由来の上清を該ペプチドに対する反応性についてスクリーニン グした。合成ペプチドに対して強い反応性を示す約２００のｍＡｂを選択した。 関心のあるハイブリドーマを限定希釈を用いてサブクローニングした。 どの抗体が天然型表面発現分子を認識できるかを決定するために、ヒトＥｏｓ Ｌ２ゲノムＤＮＡを有するＡｃＭＮＰＶウイルスで感染させたＳｆ９昆虫細胞 に対してＭＡｂをスクリーニングした。約１０％の細胞の強い抗ＦＬＡＧ染色か ら判断すると、これらの昆虫細胞はＥｏｓ Ｌ２（ＣＫＲ−３）受容体を細胞表 面に発現していた。染色はＭ２抗ＦＬＡＧ抗体、続いて抗マウスＩｇ−ＦＩＴＣ （ジャクソン イミュノリサーチ ラボラトリーズ社（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍ ｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）製）で行ない 、そしてＦＡＣＳｃａｎ分析を用いる蛍光活性化セルソーティングにより分析し 、発現を定量した。（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ ｏｌｏｇｙ，１巻，コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．）ら，編，（ジョン・ウィ リー＆ソンズ社；ニューヨーク，ニューヨーク州）。 約３３％の抗ペプチドハイブリドーマはＥｏｓ Ｌ２トランスフェクション昆 虫細胞と反応し、２次抗体として抗マウスＩｇ−ＦＩＴＣ（ジャクソン イミュ ノリサーチ ラボラトリーズ社製）を用いてＦＡＣＳ分析により決定したところ 、染色パターンはＦＬＡＧ抗体と同じであった。抗ＦＬＡＧで染色した非トラン スフェクション昆虫細胞は完全に陰性であった。抗ペプチド抗体も非トランスフ ェクション細胞に対して試験したが、染色に対し陰性であった。 トランスフェクション昆虫細胞を染色することが分かったＭＡｂを、ＦＡＣＳ 分析を用いてヒト好酸球、末梢血液リンパ球、単球、好中球、及び活性化Ｔ細胞 （活性化Ｔ細胞；リンパ球を抗ＣＤ３抗体で処理してＴ細胞を活性化した）との 反応性について試験した。細胞をｍＡｂ ＬＳ２６−５Ｈ１２とそれからＦＩＴ Ｃ−抗マウスＩｇ（ジャクソン イミュノリサーチ ラボラトリーズ社製）で染 色した。過剰の正常ヒト血清を用いてＦｃ受容体結合をコントロールした。 全好酸球を、選択した抗Ｅｏｓ Ｌ２ ｍＡｂ、ＬＳ２６−５Ｈ１２で染色し た（図１２Ａ）。単球は免疫蛍光に対し弱陽性であった。少量のリンパ球が染色 に対し陽性で（図１２Ｂ）、そして実質上全ての活性化T細胞が抗体ＬＳ２６− ５Ｈ１２で弱く染色された（示されていない）。このことは、Ｔ細胞がＴ細胞活 性化の際に正の制御をうける受容体を発現することを示している。好中球はアッ セイ条件下でＬＳ２６−５Ｈ１２抗体により有意には染色されなかった。Ｅｏｓ Ｌ２受容体の期待された分布、及びそれがＲＡＮＴＥＳ結合において機能する ことに基づくと、ＭＡｂ ＬＳ２６−５Ｈ１２はこの受容体の天然発現型を認識 するように見える。ＬＳ２６−５Ｈ１２ ＭＡｂに加え、約５個のさらなるＭａ ｂが同じようにふるまった。 ＬＳ２６−５Ｈ１２ハイブリドーマを限定希釈によりさらに精製した。もう１ つの実験において、高度に精製した白血球の亜群（実施例５に記載したように精 製した）をＭＡｂ ＬＳ２６−５Ｈ１２で染色し、フローサイトメトリーにより 分析した（図１３Ａ〜１３Ｄ）。染色プロファイルは少なくとも４つの実験で表 された。Ｔ細胞をＣＤ３染色に基づき同定した。単球及び好中球を前方及び側面 スキャッターにより同定した。 高度に精製された好酸球はＬＳ２６−５Ｈ１２で強く染色され（図１３Ａ）、 このことは、好酸球の表面上での受容体の豊富な発現を示し、そして、リガンド 結合とスキャッチャード分析により決定された高い受容体数と一致していた。好 中球、血液Ｔ細胞及び単球はこのＭＡｂによりほんのわずかしか又は全く染色を 示さなかった（図１３Ｂ〜１３Ｄ）。これら後者の結果により、再クローニング したハイブリドーマ由来の抗体を用いて、ＣＫＲ−３が選択的に好酸球に発現し 、そして試験した他の白血球型では識別できるほどには発現しないことが示され ている。しかしながら、ある亜群のＴ細胞が受容体を発現する可能性はある。走化性の抗体阻害 前記の酪酸−分化ＨＬ−６０細胞と培養インサートを用いて、ポリクローナル 抗血清（ＬＳ２６−５Ｈ１２ ＭＡｂを作ったのと同じマウスから集めた）を走 化性アッセイに用いた。（該インサートは、マイクロタイターディッシュのウェ ル内に置いたときに、上室を形成する）。１００ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＴＥＳ（下 室中）に応答する酪酸−分化ＨＬ−６０細胞の走化性をモニターした。ＲＡＮＴ ＥＳに応答する走化性は無血清対照に対して、１μｌの正常マウス血清の存在下 （細胞と共に上室に置いた）と同程度生じた。対照的に、１．０μｌの抗血清の 存在下では（細胞と共に上室に置いた）、ＲＡＮＴＥＳ−誘導走化性を４０％ま で阻害した。異なる試験では、ポリクローナル抗ペプチドラッビト血清を用いて 同様には走化性を阻害しなかった。 実施例６ 安定Ｌ１．２細胞トランスフェクタントの選択 ２％〜５％の一過性トランスフェクトＣＯＳ、ＨＥＫ−２９３及びＣＨＯ細胞 はＦＬＡＧ−付加受容体に対する抗体を用いて評価すると表面陽性であったが、 しかるに実質的な細胞内蛋白質が検出でき、このことにより、効率の悪い蛋白質 の輸送が示唆される。リガンド結合特異性及びＣＫＲ−３によるシグナル伝達を さらに評価するために、Ｌ１．２マウス前Ｂ細胞株を用いて、さらに高レベルの 表面発現を有する株を選択した（図６参照）。この細胞株は他の化学誘引物質受 容体の研究にうまく用いられていて（ホンダ（Ｈｏｎｄａ，Ｓ．），ら，Ｊ．Ｉ ｍｍｕｎｏｌ．，１５２：４０２６−４０３５（１９９４））、そして、トラン スフェクトヒトケモカイン受容体の発現は様々なリガンドに対する特異的走化性 能を与える（下記参照）。 ＣＫＲ−３の表面発現をモニターするために、ＣＫＲ−３のＮ末端３５アミノ 酸に対応する配列を有する合成ペプチドでマウスを免疫することにより、受容体 のＮ末端領域に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を生産した。抗ペプチドＭ ＡｂをＥＬＩＳＡにより検出し、そして、天然型受容体を認識するＭＡｂをヒト 好酸球との反応性、並びに、一過性のトランスフェクタントの染色により同定し た。ＣＫＲ−３／ｐｃＤＮＡ３の構築 ＰＣＲを用いて、開始コドンのすぐ５’側にＨｉｎｄＩＩＩ制限サイト及び任 意のＫｏｚａｋ配列を挿入して、１．８ｋｂのゲノム断片に含まれるＣＫＲ−３ 遺伝子を修飾した。コード領域及び４４８ｂｐの３’−非翻訳領域をｐｃＤＮＡ ３（インビトロジェン製）のＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入し、該遺伝子をベクタ ーのヒトＣＭＶ即時型遺伝子プロモーターの支配化に置いた。このＦＬＡＧ−付 加Ｅｏｓ Ｌ２（ＣＫＲ−３）受容体構築物（本明細書においてＣＫＲ−３／ｐ ｃＤＮＡ３とも呼ぶ）の構築の詳細は実施例３に提示されている。トランスフェクション及び安定細胞株選択 ネズミ前Ｂリンパ腫細胞株Ｌ１．２をユージン・ブッチャー博士（スタンフォ ード大学）から得て、１０％ウシ血清を補ったＲＰＭＩ−１６４０中で維持した 。２０μｇの直鎖状ＣＫＲ−３／ｐｃＤＮＡ３を用いて以下のようにして細胞株 をトランスフェクションした。Ｌ１．２細胞をＨＢＳＳで２度洗浄し、０．８ｍ ｌの同液に再懸濁した。プラスミドＤＮＡを細胞と混合して室温で１０分間イン キュベートし、それから０．４ｃｍのエレクトロポレーションキュベットに移し 、そして２５０Ｖ、９６０μＦで単一パルスを与えた。エレクトロポレーション に続いて、室温で１０分間インキュベートした。Ｇ４１８をトランスフェクショ ンの４８時間後最終濃度０．８ｍｇ／ｍｌになるように加え、細胞を９６ウェル プレートに２５，０００細胞／ウェルとなるようプレーティングした。薬剤選択 下２〜３週間後、Ｇ４１８耐性細胞を５Ｈ１２抗受容体ｍＡｂで染色し（下記参 照）、ＦＡＣＳｃａｎ^Rで分析した。 検出可能な表面染色を有する株を限定希釈により数回展開してクローニングし た。最も明るく表面染色されたクローンを、トランスフェクトされた受容体の存 在を確認するめのノーザンハイブリダイゼーション、並びにｐｃＤＮＡ３ベクタ ーに相補的なＴ７プライマーを５’プライマーとして、ＣＫＲ−３特異的プライ マーを３’プライマーとして用いたＲＴ−ＰＣＲによりさらに分析した（示され ていない）。逆転写酵素の付加なしでは増幅は見られなかった。 一過性トランスフェクションのために、安定細胞株生産で述べたとおりに、２ ０μｇのスーパーコイルＤＮＡをエレクトロポレーションに用いた。細胞表面染 色を４８〜７２時間後に評価した。 ＣＫＲ−３／ｐｃＤＮＡ３でトランスフェクトしたＬ１．２細胞を組織培養培 地で１×１０⁶細胞／ｍｌに希釈した。ｎ−酪酸（ナトリウム塩、シグマ ケミ カル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．）製、カタログ番号Ｂ５８ ８７）を最終濃度５ｍＭとなるように加えた（組織培養培地で作製した１Ｍスト ック溶液から希釈した）。使用前に、細胞を３７℃、５％ ＣＯ₂で一晩（１８ 〜２４時間）生育させた。低濃度で用いると成功している（例えば２．５ｍＭ及 び１ｍＭ ｎ−酪酸）。ｎ−酪酸塩処理により、非誘導対照に比べ約１０倍まで 蛋白質のレベルを誘導することが報告されている（例えば、パレルモ（Ｐａｌｅ ｒｍｏ，Ｄ．Ｐ．），ら，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９：３５−４８（１９９１ ）及びそれに引用された参考文献を参照）。ヒトＣＭＶ即時型遺伝子プロモータ ーにより駆動されるＣＫＲ−３ ｍＲＮＡレベルはｎ−酪酸処理により劇的に高 められた。モノクローナル抗体生産及びフローサイトメトリー 合成ペプチドと反応するＭＡｂを前記実施例５で述べたように生産した。ＭＡ ｂを以下のようにＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。炭酸塩緩衝液中２μｇ ／ｍｌの濃度でペプチド５０μｌを用いてＮＵＮＣ ９６−ウェルＭａｘｉｓｏ ｒｐプレートを少なくとも４時間４℃で被覆した。３００μｌ／ウェルのブロッ キング緩衝液（ＰＢＳ ＋ １％ ＢＳＡ）を加えて少なくとも２時間置いた。 プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２０で４回洗浄し、そして、５０μｌのＭＡｂ 上清を各ウェルに加え３７度で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／ Ｔｗｅｅｎ ２０で４回洗浄し、ＰＢＳで１：５００に希釈したアルカリフォス ファターゼ結合２次抗体（ジャクソン イミュノリサーチ ラボラトリーズ製、 ウェストグローブ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ）、ペンシルヴェニア州（ＰＡ））を 各ウェルに加えた。３７℃で３０分間のインキュベーション後、プレートをＰＢ Ｓ／Ｔｗｅｅｎ ２０で４回洗浄した。発色反応に用いた基質はジエタノールア ミン緩衝液（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）製）に溶解したｐ−ニトロフェニ ルフォスフェートであった。プレートをＥＬＩＳＡリーダーで４１０ｎｍで読ん だ。 どの抗ペプチドＭＡｂが天然型表面発現ＣＫＲ−３を認識するかを決定するた めに、抗ペプチドＭＡｂを一過性にトランスフェクトした細胞及び好酸球に対し スクリーニングした。ＭＡｂ染色のため、細胞をＰＢＳで１度洗浄し、２％ Ｆ ＣＳ、０．１％ アジ化ナトリウム（ＦＡＣＳ緩衝液）、５μｇ／ｍｌ 精製抗 体、５μｇ／ｍｌ ＭＯＰＣ−２１ ＩｇＧ₁イソタイプ適合対照ＭＡｂ（シグ マ製）を含む１００μｌのＰＢＳ、又は１００μｌのハイブリドーマ培養液上清 に再懸濁した。４℃で３０分後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２度洗浄し、１００μ ｌのＦＩＴＣ−結合アフィニティー精製Ｆ（ａｂ’）₂ヤギ抗マウスＩｇＧ（ジ ャクソン製）に再懸濁した。３０分間４℃のインキュベーション後、細胞をＦＡ ＣＳ緩衝液で２度洗浄し、ＦＡＣＳｃａｎにより分析して表面発現のレベルを決 定した。ヨウ化プロピジウムを用いて死細胞を排除した。Ｌ１．２細胞株の安定トランスフェクタントでの受容体表面発現 図１４Ａは、抗受容体ＭＡｂ、ＬＳ２６−５Ｈ１２を用いた、Ｌ１．２細胞の 亜集団での一過性トランスフェクション受容体の検出可能な表面染色を示してい る。非トランスフェクションＬ１．２細胞は陰性であった（図１４Ｂ）。前記の ようにトランスフェクタントの限定希釈クローニング及びより高い表面染色選択 により安定細胞株を構築した。この過程で、はるかに高レベルの受容体発現をす る株が得られた（図１４Ｃ）。ノーザンブロット分析により、Ｅ５と名付けた１ つのサブクローンにトランスフェクションしたＣＫＲ−３ ｍＲＮＡが存在し、 非トランスフェクションＬ１．２細胞では存在しないことを確かめた（示されて いない）。 実施例７ 安定Ｌ１．２トランスフェクタントのリガンド結合特異性 ケモカイン類 既述（クラーク−ルイス（Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ，Ｉ．）ら，Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ，３０：３１２８−３１３５（１９９１））のようにして最適化さ れ完全自動化ペプチド合成機（モデル４３０Ａ；アプライド バイオシステムズ 社製、フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）、カリフォルニア（ＣＡ） ）に適合された固相法を用いて合成したヒトエオタキシンを除き、組み換えヒト ケモカイン類をペプロテック社（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）（ロッキーヒ ル（Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ）、ニュージャージー州（ＮＪ））から得た。ヒトエ オタキシンもペプロテックから市販されている。 ¹²⁵ Ｉ−標識 既述（コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．），ら，編，１９９２，Ｃｕｒｒ ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ニューヨーク：ジ ョン・ウィリー＆ソンズ））のようにして、¹²⁵Ｉ−標識エオタキシンをＢｏｌ ｔｏｎ Ｈｕｎｔｅｒ 試薬（ＮＥＮ製）を用いて生産した。放射線標識エオタ キシンの比活性を計算すると１８０Ｃｉ／ｍＭであった。リガンド結合 標的細胞へのケモカイン結合を、既に報告された方法を修飾して行なった（ヴ ァン リッパー（Ｖａｎ Ｒｉｐｅｒ，Ｇ．），ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７ ７：８５１−８５６（１９９３））。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、結合緩衝液（ ５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５、１ｍＭ ＣａＣｌ₂、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、 ０．５％ ＢＳＡ及び０．０５％ アジ化物）に濃度が１×１０⁷／ｍｌとなる ように再懸濁した。５０μｌのアリコート（５×１０⁵細胞）をマイクロフュー ジュチューブに分配し、続いて非放射性競合剤と放射線標識ケモカインを加えた 。最終反応体積は２００μｌであった。細胞を２５０〜５００ｎＭの非標識ケモ カインの存在下で放射線標識ケモカインと共にインキュベートすることにより、 非特異的結合を決定した。室温で６０分のインキュベーション後、細胞を１ｍｌ の０．５Ｍ ＮａＣｌを含む結合緩衝液で３回洗浄した。細胞ペレットをそれか らカウントした。 競合は１００（Ｓ−Ｂ）／（Ｔ−Ｂ）で計算した特異的結合のパーセンテージ で表される。ここで、Ｓは試料の放射線活性、Ｂはバックグランド結合、Ｔは競 合剤無しの全結合である。バックグランド結合は、細胞を放射線標識ケモカイン 及び少なくとも４００倍過剰の非標識ケモカインと共にインキュベートすること により得られる。エオタキシンのＥ５細胞への全結合は１１６１１±１１９ｃｐ ｍで、バックグランド結合は２２４８±７４５ｃｐｍであった。エオタキシンの 好酸球への全結合は７８６６±３５３ｃｐｍで、バックグランド結合は１１４８ ±５１８ｃｐｍであった。実験を通じて二連を用い、標準偏差は常に平均の１０ ％未満であった。全実験を少なくとも３回繰り返した。ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐ ｈ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてカーブフィットを計算した。 実施例６で述べたＥ５細胞株を、放射線標識エオタキシンへ結合する能力につ いて試験した。細胞を０．６ｎＭ¹²⁵Ｉ−標識エオタキシン及び様々な濃度の非 放射性競合剤と共にインキュベートした。図１５Ａは、トランスフェクション細 胞が特異的かつ高親和性で¹²⁵Ｉ−標識エオタキシンに結合したことを示す。結 合データのスキャッチャード分析により解離定数（Ｋｄ）が１．５ｎＭであるこ とが示され（図１５Ｃ）、精製ヒト好酸球を用いて得た値０．５ｎＭ（図１５Ｄ ）に似ていた。さらに、ＲＡＮＴＥＳとＭＣＰ−３の両者が結合に対して特異的 に競合できた。ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β又はＩＬ−８を含む他の試験したケ モカインはどれも放射線標識したリガンドに対して特異的に競合できなかった（ 図１６）。走化性アッセイ ヒト好酸球の走化性を経内皮アッセイ（カー（Ｃａｒｒ，Ｍ．Ｗ．）ら，Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ，Ｓｃｉ，ＵＳＡ，９１：３６５２−３６５６（１９ ９４））を修正して用いて評価した。このアッセイに用いた内皮細胞は、ヨーロ ピアン コレクション オブ アニマル セル カルチャーズ（Ｅｕｒｏｐｅａ ｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ）（ポートンダウン（Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ）、イギリス）から得た、内皮細 胞株ＥＣＶ ３０４であった。内皮細胞を３．０μＭの孔径を有する６．５ｍｍ 径のＢｉｏｃｏａｔ^R Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ組織培養インサート（コスター社（ Ｃｏｓｔａｒ Ｃｏｒｐ．）、ケンブリッジ、マサチューセッツ州（ＭＡ））上 で培養した。ＥＣＶ ３０４細胞用培地は、１０％ ウシ胎児血清、Ｌ−グルタ ミン、及び抗生物質を含むＭ１９９から成っていた。 アッセイ培地は０．５％ ＢＳＡを含む、等量のＲＰＭＩ １６４０及びＭ１ ９９から成っていた。アッセイの２４時間前に、２×１０⁵個のＥＣＶ ３０４ 細胞を２４ウェル走化性プレートの各インサートにプレーティングし、３７℃で インキュベートした。走化性因子（アッセイ培地で希釈）を最終量６００μｌと なるように２４ウェル組織培養プレートに加えた。内皮被覆組織培養インサート を各ウェルに挿入し、１０⁶個の細胞を最終量１００μｌとなるように上室に加 えた。プレートを３７℃で５％ ＣＯ₂／９５％ 空気中で４時間インキュベー トした。 下室に移動した細胞をフローサイトメトリーを用いてカウントした。下室由来 の５００μｌの細胞懸濁物をチューブに入れ、細胞の相対数を、３０秒を１期間 として事象をとらえることにより得た。この測定方法は再現性があることが分か り、白血球についての入場や破片又は他の細胞の除去を可能にした。この方法で 得た数は、顕微鏡で計測して得たものと非常にマッチしていた。 内皮細胞をＢｉｏｃｏａｔ^R Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ組織培養インサートを被覆 するのに用いなかった場合を除き、同じアッセイを用いてＬ１．２細胞又はＬ１ ．２受容体トランスフェクタント細胞株を評価した。Ｌ１．２細胞でのＣＫＲ−３発現はエオタキン、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＣＰ−３に 対する走化性応答を与える Ｌ１．２受容体トランスフェクタントを、濃度範囲の広がりを持つケモカイン のパネルに応答して移動する能力について試験した。ＣＫＲ−３発現細胞株Ｅ５ はエオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ、及びＭＣＲ−３に対して走化性応答を示し、１ ００ｎｇ／ｍｌのエオタキシンに対して応答が頂点に達したが、特異的移動が１ ０ｎｇ／ｍｌの低さでも検出できた（図１７Ａ）。ＲＡＮＴＥＳへの応答は１０ ｎｇ／ｍｌと１００ｎｇ／ｍｌの両方で明白であったが、応答の程度はエオタキ シンほど大きくなかった。ＭＣＲ−３は、好酸球に対するよりも、Ｅ５細胞株に 対しては弱い化学誘引物質に見え、１００ｎｇ／ｍｌ以下では移動は全く検出さ れなかった。試験した他のケモカインに対する有意な応答はこの細胞株では見ら れなかった。他の対照実験においては、ケモカインを単独で上のウェルに加えた 時、細胞は下室に移動しなかった。このことは、細胞移動が化学速度論的よりも むしろ走化性であることを確証している（示されていない）。 非トランスフェクションＬ１．２細胞株は試験したいかなるケモカインにも応 答して移動しなかった（図１７Ｂ）。事実、Ｌ１．２細胞株の顕著な面は、非特 異的リガンドに対する走化性のバックグランドが非常に低いことであった。特異 性の対照として、ＩＬ−８ ＲＢでトランスフェクトしたＬ１．２細胞は、ＩＬ −８、及びＧＲＯα（図１７Ｃ）、並びにＮＡＰ−２及びＥＮＡ−７８（示され ていない）に応答して特異的に移動したが、他のＣＸＣ又はＣＣケモカインには 応答しなかった。トランスフェクションによりＬ１．２細胞に導入した他のケモ カイン受容体も特異的リガンドに対する走化性能を与え、これらは、ＣＫＲ−２ トランスフェクタント（ＭＣＰ−１及びＭＣＰ−３に応答した）、ＣＫＲ−１ト ランスフェクタント（ＭＩＰ−１αに応答した）、及びＩＬ−８ ＲＡトランス フェクタント（ＩＬ−８に応答した）を含む（示されていない）。百日咳毒素は 、好酸球及びＣＫＲ−３トランスフェクタント両方のエオタキシンへの走化性応 答を完全に排除し、このことは、正常及びトランスフェクション細胞の両方にお いて受容体がＧαサブクラス（シモン（Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．），ら，Ｓｃｉｅ ｎｃｅ，２５２：８０２−８０８（１９９１））を通じてシグナル伝達している ことを示していた（示されていない）。好酸球の走化性プロファイルはＣＫＲ−３トランスフェクタントに似ている 正常好酸球の機能がＣＫＲ−３ Ｌ１．２トランスフェクタントに似ているか どうかを評価するために、高レベルの好酸球（ＷＢＣの約６〜８％）（実施例５ 記載のように精製した）を有する、多数の正常個体（ヒト）由来の好酸球を用い て走化性実験を行なった。図１８Ａ〜１８Ｂは、２つの異なる個体で観察された ２つの特徴的な好酸球の走化性のパターンを示している。１つのパターンは、エ オタキシンに対する強い移動と、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＣＰ−３に対するより弱い 応答を特徴としていた（図１８Ａ）。他方のパターンは、エオタキシン、ＲＡＮ ＴＥＳ及びＭＣＰ−３に応答して本質的に同等な走化性を示した（図１８Ｂ）。 各個体において、長期間にわたって高度に再現性があるので、これらのパターン はアッセイの変動によるものではなかった。ＭＩＰ−１αは、２番目のクラスの 個体の好酸球に対しては弱い走化性活性しか示さなかった。 実施例８ Ｅｏｓ Ｌ２をコードするｃＤＮＡのクローニング 好酸球ｃＤＮＡライブラリーの構築 好酸球を特発性過好酸球症候群（コスタ（Ｃｏｓｔａ，Ｊ．Ｊ．）ら，Ｊ．Ｃ ｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９１：２６７３（１９９３））と診断された患者（Ｍ ．Ｖ．）から得た。標準的なグアニジニウム イソチオシアネート／塩化セシウ ム法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ ｏｌｏｇｙ，１巻，オウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら，編，（ジョン ・ウィリー＆サンズ：ニューヨーク，ニューヨーク州）４．２．２−４．２．３ 頁（１９９１）：中）を用いて、ＲＮＡを単離した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ^R（ダ イナル社（Ｄｙｎａｌ，Ｉｎｃ．）製）を用いてｍＲＮＡを得て、λｇｔ２２Ａ のＮｏｔＩ−ＳａｌＩアームにクローニングするような、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰ Ｔ^TM Ｌａｍｂｄａ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ及 びλ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ製、ライフ テクノロジーズ（Ｌｉ ｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）製）を用いてバクテリオファージライブラリ ーを構築した。ライブラリースクリーニング 生じたヒト好酸球ｃＤＮＡライブラリーの約７５０，０００個のバクテリオフ ァージプラークを二連でスクリーニグした。用いたプローブはＭＩＰ−１α／Ｒ ＡＮＴＥＳ受容体（ＣＫＲ−１）（ガオ（Ｇａｏ）ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．， １７７：１４２１（１９９３））をコードする全長の放射線標識ｃＤＮＡプロー ブ（ｐ４ ｃＤＮＡ）であった。ｐ４ ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡＩ（インビトロジ ェン製）のＢａｍＨＩ（５’）及びＸｈｏＩ（３’）サイトにクローニングした 。このクローンのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片（すなわち、ｐｃＤＮＡＩのｐ４ｃ ＤＮＡ）を制限消化により得て、Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ（Ｂｉｏ１０１製）を用 いて単離した。ランダムプライマー標識キット（ベーリンガー マンハイム バ イオケミカルズ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｃａｌｓ）製）を用いて該断片を³²Ｐで標識した。 ５０％ ホルムアミド、５×ＳＳＣ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、１０％ 硫 酸デキストラン、２０ｍＭ ＴＲＩＳ、ｐＨ７．５、０．１％ ＳＤＳ（ドデシ ル硫酸ナトリウム）の溶液中でフィルターを４２℃２時間のインキュベーション によりプレハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションを同じ溶液中で４２℃ で一晩行なった。それから、好酸球ｃＤＮＡライブラリーフィルターを２×ＳＳ Ｃ／０．１％ ＳＤＳで室温で２回、２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳで４２℃で ２回洗浄した。各洗浄は３０分間であった。フィルターを一晩露光し、陽性プラ ークをつついて二連にした。低ストリンジェンシーで洗浄後の二連で陽性の場合 、クローンをさらに評価した。ｃＤＮＡクローンの特徴づけ プラークはプラーク精製し、ＤＮＡを少規模ファージ溶解プロトコルにより単 離した（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ ｉｏｌｏｇｙ，１巻，補足１０，オウスベルら，編，（ジョン・ウィリー＆サン ズ：ニューヨーク，ニューヨーク州）１．１３．７頁（１９９１）：中）。バク テリオファージＤＮＡをＥｃｏＲＩ（ベクターのアーム中のサイト）及びＮｏｔ Ｉで消化した。消化により解離されたインサートをゲルで見て、約１．６ｋｂの 長さであることが分かった。Ｍｉｐ−１６又はＭ−１６と名付けたプラークに存 在する約１．６ｋｂのインサートをＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ（Ｂｉｏ１０１製）を 用いて単離し、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩの両方で消化し非対称末端にしたＢｌｕ ｅｓｃｒｉｐｔ^R ｖｅｃｔｏｒ ＫＳ（ストラタジェン製）のＥｃｏＲＩ及び ＮｏｔＩサイトにクローニングした。ライゲートしたプラスミドを、ハナハン（ Ｈａｎａｈａｎ）により述べられたようにして（ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ ．），（１９８５），：ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，１巻，グローバー（Ｄ．Ｍ． Ｇｌｏｖｅｒ），編（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ：ワシントンＤ．Ｃ．），１０９−１ ３５頁）コンピテントにしたＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌細胞（ストラタジェン製） に導入した。 Ｍ−１６／Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ構築物のジデオキシシーケンシングを、ＵＳ Ｂ（ユナイテッド ステート バイオケミカル（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）、クリーブランド（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ）、オハイオ 州（ＯＨ））から得たジデオキシヌクレオチドシーケンシングキットを用いて行 なった。このクローンのヌクレオチド配列を決定して、ＭＩＰ−１α／ＲＡＮＴ ＥＳ受容体と高い相同性を有する新規の蛋白質をコードしていることが分かった 。；しかしながら、配列データからは、該クローンは全長であるようには見えな かった。 全長のクローンを同定するために、さらに１５〜２０個のプラークを単離、精 製し、そしてファージに存在するインサートを制限酵素分析及び／又はシーケン シングにより特徴づけした。単離し、Ｍ３１と名付けたもう１つのλクローンが 約１．８ｋｂのインサートを含むことが分かった。前記のように、該インサート をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ^R ｖｅｃｔｏｒ ＫＳ（ストラタジェン製）のＥｃｏ ＲＩ及びＮｏｔＩサイトにクローニングし、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌細胞（スト ラタジェン製）に導入した。このクローン（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中のＭ３１イ ンサート、Ｍ３１／Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ構築物と呼ぶ）のＤＮＡシーケンシン グを前記のようにして行ない、それが全長の受容体をコードしていることを示し た。 Ｍ３１インサートをＭ３１／Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ構築物からＥｃｏＲＩ及び ＮｏｔＩでの消化により解離した。生じた断片をＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ（Ｂｉｏ １０１製）を用いて単離し、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩの両方で消化し非対称末端 にしたベクターＡｐ^rＭ９のＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩサイトに挿入した。ベクタ ーＡｐ^rＭ９（デフォウゲロル（ｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ，Ａ．Ｒ．）ら ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７７：１１８７−１１９２（１９９３））は、ｐＢ ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のβ−ラクタマーゼ及びｐＳＲ６４由来のポリリンカー を含むＣＤＭ８（インビトロジェン製）の派生品である。Ａ３１と名付けた生じ た構築物をコンピテントＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞に導入した。 全長ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びコードされた蛋白質の推定アミノ酸配列 を、図２Ａ〜２Ｂに示す（配列番号：３及び配列番号：４も参照）。図２Ａ〜２ Ｂに示されたｃＤＮＡ配列はクローンＡ３１（塩基１５〜３６５（図２Ａ〜２Ｂ の番号））、及びＭ−１６／Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ構築物（塩基３６６〜１１５ ２（図２Ａ〜２Ｂの番号））から決定した。新規の受容体のアミノ酸配列と他の 蛋白質の比較により、新規の受容体とＭＩＰ−１α／ＲＡＮＴＥＳ受容体が６２ ％の配列の同一性を有し、そして新規の受容体とＭＣＰ−１受容体が５０．５７ ％の配列の同一性を有していることが示された。配列の同一性は、Ｗｉｓｃｏｎ ｓｉｎ ＵＷ ＧＣＧ ｐａｃｋａｇｅ（プログラム ギャップ）を用いて、Ｎ ｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（ニードルマン（Ｎｅｅ ｄｌｅｍａｎ）とワンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４ ４３−４５３（１９７０））で決定した。ノーザン分析 ノーザン分析用のＲＮＡを過好酸球症の患者から得た。好酸球を既述（コスタ （Ｃｏｓｔａ，Ｊ．Ｊ．）ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９１：２６７３ （１９９３））のようにして単離した。全好酸球ＲＮＡを標準的な手法（Ｃｕｒ ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １巻，オウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら，編，（ジョン・ウィリー＆ サンズ：ニューヨーク，ニューヨーク州）４．２．２−４．２．３頁（１９９１ ）：中）を用いて単離した。全ＲＮＡを１％ アガロースゲルで分画し、それか ら、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎフィルター（ニューイングランドニュークリアー（Ｎ ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）製）上にブロットした。Ｇｅｎｅ Ｓ ｃｒｅｅｎブロット（ニューイングランドニュークリアー製）の高ストリンジェ ンシー洗浄についての製造業者のプロトコルに従って、フィルターを高ストリン ジェンシーでプローブした。 いくつかのノーザンを調製した。１つはＭ１６／Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ構築物 のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片でプローブすることを伴い、他のものはクローンＡ ３１由来のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片でプローブした。両ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ 断片は３’非翻訳領域を含んでいる。ランダムプライマー標識キット（ベーリン ガー マンハイム バイオケミカルズ製）を用いてプローブを³²Ｐで標識した。 各ノーザンブロットは、全ヒト好酸球ＲＮＡにおいて約１．８ｋｂの非常に強 いシグナルを示した。この結果は、Ａ３１ ＲＮＡがこの患者由来の好酸球で非 常に高いレベルで発現していることを示している。 実施例９ Ｅｏｓ Ｌ２受容体をコードするｃＤＮＡの発現及びリガンド結合研究 構築 ベクターＡ３１（前記）及びＡ３１−ｐｃＤＮＡ３を発現及び結合分析に用い た。Ａ３１−ｐｃＤＮＡ３を構築するために、ベクターＡ３１をＥｃｏＲＩ及び ＮｏｔＩで消化し、約１．８ｋｂのインサートをＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ（Ｂｉｏ １０１製）を用いて単離し、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩの両方で消化したベクター ｐｃＤＮＡ−３（インビトロジェン製）のＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩに挿入した。 Ａ３１−ｐｃＤＮＡ３と名付けたライゲーション構築物をコンピテントＸＬ１− Ｂｌｕｅ細胞に導入した。一過性トランスフェクション 最初のＡ３１を用いた腎細胞株２９３への一過性トランスフェクションは、Ａ ３１の放射線活性ＲＡＮＴＥＳとの高いアフィニティー結合を示していた。これ ら最初の結合研究は再現するのが難しかった。結果的に、安全にＲＢＬ（ラット 好塩基性白血病）及び２９３細胞の両方に安定に組み込まれたＡ３１／ｐｃＤＮ Ａ３により、その後安定な細胞株が生産されている。ＲＢＬ細胞（アクセション 番号 ＡＴＣＣ ＣＲＬ １３７８）を２０８５２、メリーランド州（ＭＤ）、 ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、パークロン ドライブ（Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ） １２３０１、アメリカン タイプ カルチャー コレクション （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ａ ＴＣＣ）、から得て、そして２９３細胞（アクセション番号 ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）はシャロ（Ｉ．Ｃｈａｒｏ）、グラドストーン カルディオバスキ ュラー インスティチュート（Ｇｌａｄｓｔｏｎｅ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌ ａｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から供与された。安定細胞株 安定細胞株を以下のように構築した。Ａ３１−ｐｃＤＮＡ３をＮｏｔＩで消化 して直鎖状にした。直鎖状にしたプラスミドをエレクトロポレーションによりＲ ＢＬ及び２９３細胞に導入した。１００×２０ｍｍプレートで成長したコンフル エント２９３及びＲＢＬ細胞をトリプシン処理し、１ｃｃのリン酸緩衝生理食塩 水（ＰＢＳ）に再懸濁して、０．４ｃｍキュベット（バイオラッド（ＢｉｏＲａ ｄ）製）中で９６０マイクロファラド、２５０ボルトの設定でエレクトロポレー ションした。安定トランスフェクタントをジェネティシン含有培地での陽性選択 により単離した。具体的には、細胞を先ずＤＭＥＭ（ＢＲＬ製）、１０％ウシ胎 児血清で数日間培養し、それから０．９ｍｇ／ｃｃジェネティシン（ＢＲＬ製） 含有ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清に移した。（ＤＭＥＭ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）。３週間後、生存コロ ニーをクローニングシリンダーで無菌的に単離し、個々のクローンを個々のウェ ル中で０．９ｍｇ／ｃｃジェネティシン（ＢＲＬ製）含有ＤＭＥＭ、１０％ウシ 胎児血清で成長させた。 Ａ３１ ＲＮＡを高レベルで発現する生存クローンをノーザン分析により検出 した。１２０個のＲＢＬ株の安定トランスフェクタント、及び３８個の２９３細 胞株の安定トランスフェクタントをスクリーニングした。具体的には、個々のク ローン由来のＲＮＡを酸フェノール法（チョムジンスキー（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓ ｋｉ，Ｐ．）及びサッチー（Ｎ．Ｓａｃｃｈｉ），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ，１６２：１５６−１５９（１９８７））を用いて単離した。ＲＮＡを電気泳動 により分画し、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ（ニュー イングランド ニュークリアー 製）にブロッティングし、そしてノーザンブロットを高ストリンジェンシー洗浄 用の製造業者の指示に従いプローブした。プラスミドＡ３１由来のＥｃｏＲＩ− ＮｏｔＩインサートを単離し、ランダムプライマー標識キット（ベーリンガーマ ンハイム バイオケミカルズ製）を用いて³²Ｐで標識し、プローブとして用いた 。非トランスフェクション２９３又はＲＢＬを対応するトランスフェクタントの 陰性対照として用いた。 その後、Ａ３１−２９３−＃８、Ａ３１−２９３−＃９、Ａ３１−２９３−＃ １７、及びＡ３１−２９３−＃２０と名付けた安定細胞株が他の株に比べＡ３１ ＲＮＡを高レベルで発現することが分かった。ノーザン分析によりＡ３１伝達 暗号を高発現するクローンＡ３１−２９３−＃２０を、さらなる研究のために選 択した。 １つのＲＢＬ株が低媒介（ｌｏｗ−ｍｅｄｉｕｍ）量のＲＮＡを発現すること が分かったが、用いた条件下ではＲＡＮＴＥＳに結合するように見えなかった（ データは示されていない）。リガンド結合 安定クローンＡ３１−２９３−＃２０を結合アッセイに十分な量で成長させた 。詳しくは、細胞を１００ｍｍプレート中でＤＭＥＭ、１０％ ウシ胎児血清、 ０．９ｍｇ／ｃｃ ジェネティシンで成長させた。プレートをコンフルエントに なるまで成長させ、膜を以下のように調製した。培地を除き、細胞をリン酸緩衝 生理食塩水で洗浄した。細胞をＴＥＮ（４０ｍＭ ＴＲＩＳ，ｐＨ７．５、１ｍ Ｍ ＥＤＴＡ、及び１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄して集めた。細胞を液体窒素 で凍結し、室温で解凍し、円錐形のチューブ中で１０分間１８，０００ｒｐｍで 遠心分離することにより膜分画を集めた。コンフルエントになるまで成長させた 単一の１００ｍｍのプレートから集めた膜の半分を用いて、各結合ポイントを決 定した。 ¹²⁵Ｉ標識ＲＡＮＴＥＳをニュー イングランド ニュークリアーから購入し 、そして非放射性ＲＡＮＴＥＳをペプロテック（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）（プリン ストン（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ）、ニュージャージー州（Ｎ．Ｊ．））から購入し た。¹²⁵Ｉ標識ＭＣＰ−３はニュー イングランド ニュークリアーから供与さ れ、そして非放射性ＭＣＰ−３はヴァン デーム（Ｊ．Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ）、 ベルギー、ルーヴェン（Ｌｅｕｖｅｎ） Ｂ−３０００、ルーヴェン大学、リー ガ インスティチュート フォー メディカル リサーチ（Ｒｅｇａ Ｉｎｓｔ ｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）から供与された（オ プデナッカー（Ｏｐｄｅｎａｋｋｅｒ，Ｇ．）ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ ｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９１（２）：５３５−５４２（１９９３）、 も参照）。以下のように変更して、結合アッセイをヴァン リッパー（Ｖａｎ Ｒｉｐｅｒ，Ｇ．）ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７７：８５１（１９９３）に 述べられているように行なった。すなわち、０．１２５ナノモーラーの¹²⁵Ｉ− ＲＡＮＴＥＳのメンブレンへの結合を、変化させた濃度の非標識リガンドの存在 下で行なった。結合緩衝液は５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭ ＣａＣｌ₂、５ｍ Ｍ ＭｇＣｌ₂、０．５％ ＢＳＡ、ｐＨ７．２であった。放射線標識及び非放 射性リガンドを同時にメンブレンに加え（前記参照）、そして１．５時間室温で インキュベートした。結合反応物を２ｃｃの洗浄緩衝液（０．５Ｍ ＮａＣｌ、 ５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭ ＣａＣｌ₂、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．５％ Ｂ ＳＡ、ｐＨ７．２）に加え、ボルテックスして混合し、それからポリエチレンイ ミン処理Ｗｈａｔｍａｎ ＧＦＣ フィルターに置いた。フィルターをさらに２ ｃｃの洗浄緩衝液で洗浄した。洗浄後のフィルターに残っている活性をシンチレ ーションカウンターにより決定した。フィルターをを５ｃｃのシンチレーション 液中に置き、それからミニアクシ−ベータ液体シンチレーションカウンター（ｍ ｉｎｉａｘｉ−ｂｅｔａ ｌｉｑｕｉｄ ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｃｏｕ ｎｔｅｒ）（ユナイテッド テクノロジーズ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇｉｅｓ）製、パッカード（Ｐａｃｋａｒｄ）、ドナーズグローブ（Ｄｏｗｎ ｅｒｓ Ｇｒｏｖｅ）、イリノイ州（ＩＬ））でカウントした。２連で決定した ２ｎＭのポイントを除き、全ポイントを３連で決定した。 アッセイの結果は、Ａ３１クローンによりコードされる受容体へのＲＡＮＴＥ Ｓの高いアフィニティー結合を示していた（図１９）。データのスキャッチャー ド分析はＲＡＮＴＥＳに対するＫ_dが約２．５ｎＭであることを示していたが、 これは正常細胞で期待される値である。 クローンＡ３１−２９３−＃２０由来の膜へのＭＣＰ−３の結合も、前記Ａ３ １−２９３−＃２０膜へのＲＡＮＴＥＳの結合で述べたリガンド結合アッセイを 用いて評価した（図２０）。結合反応には０．１２５ナノモルの¹²⁵Ｉ標識ＭＣ Ｐ−３を含んでいた。 さらに、非放射性ＭＣＰ−３により置き換えられることができる標識ＭＣＰ− ３（非放射性ＭＣＰ−３の非存在下で結合）の範囲を決定することにより、結合 の特異性を評価した（図２１）。全ポイントを２連で行なった。 非トランスフェクション細胞由来の膜に結合したＭＣＰ−３は¹²⁵Ｉ標識ＭＣ Ｐ−３により置き換えられなかった。このことは、非特異的結合を示している。 対照的に、Ａ３１−２９３−＃２０細胞由来の膜に結合したＭＣＰ−３は放射性 ＭＣＰ−３により置き換えられた。このことは、特異的結合を示している。 これらのアッセイの結果は、Ａ３１ ｃＤＮＡによりコードされる受容体がヒ トＭＣＰ−３に特異的に結合することを示している。均等物 当業者であれば、単なる日常的実験手法により、本明細書に記載された発明の 具体的態様に対する多くの均等物を認識でき、あるいは確認することができるで あろう。そのような均等物は下記クレームの範疇に含まれるものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年１月２０日 【補正内容】 請求の範囲 １．下記群から選ばれた核酸に中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダ イズする単離された核酸： ａ）配列番号：１記載の配列、またはその一部であってコード配列からなる核酸 ； ｂ）配列番号：３記載の配列、またはその一部であってコード配列からなる核酸 ； ｃ）配列番号：５記載の配列、またはその一部であってコード配列からなる核酸 ； ｄ）（ａ）ないし（ｃ）のいずれかの核酸の相補鎖；および ｅ）（ａ）ないし（ｄ）のいずれかの核酸のＲＮＡ体であって、ＴがＵに置換さ れたＲＮＡ体。 ２．単離された核酸が本質的に純粋である、請求項１記載の単離された核酸。 ３．単離された核酸が、高ストリンジェンシー条件下でａ）ないしｅ）記載のい ずれかの核酸にハイブリダイズする請求項１記載の単離された核酸。 ４．単離された核酸が、哺乳類ケモカイン受容体３の少なくとも機能的な部分を コードする請求項１、２または３いずれか記載の単離された核酸。 ５．哺乳類がヒトである、請求項４記載の単離された核酸。 １４．ポリペプチドが、ＲＡＮＴＥＳと結合する請求項１０記載の核酸。 １５．下記群から選ばれた核酸に中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリ ダイズする組み換え核酸からなる組み換え構築物： ａ）配列番号：１記載の配列、またはその一部であってコード配列からなる核酸 ； ｂ）配列番号：３記載の配列、またはその一部であってコード配列からなる核酸 ； ｃ）配列番号：５記載の配列、またはその一部であってコード配列からなる核酸 ； ｄ）（ａ）ないし（ｃ）のいずれかの核酸の相補鎖；および ｅ）（ａ）ないし（ｄ）のいずれかの核酸のＲＮＡ体であって、ＴがＵに置換さ れたＲＮＡ体。 １６．組み換え核酸が、有効に発現制御配列に連結されている請求項１５記載の 組み換え構築物。 １７．組み換え核酸が、哺乳類ケモカイン受容体３の少なくとも機能的な部分を コードする請求項１５記載の組み換え構築物。 １８．哺乳類がヒトである、請求項１７記載の組み換え構築物。 １９．哺乳類ケモカイン受容体３をコードする核酸からなる組み換え構築物。 ２０．哺乳類が霊長類である、請求項１９記載の組み換え構築物。 ２１．霊長類がヒトである、請求項２０記載の組み換え構築物。 ２２．下記群から選ばれたポリペプチドをコードする核酸からなる組み換え構築 物： ａ）配列番号：２記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド； ｂ）配列番号：４記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド； ｃ）配列番号：６記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド； ｄ）（ａ）ないし（ｃ）のいずれかのポリペプチドの機能的部分、該部分は哺乳 類Ｃ−Ｃケモカイン受容体の少なくとも１つの機能的特徴を有する；および ｅ）（ａ）ないし（ｃ）のいずれかのポリペプチドの機能的同等物。 ２３．核酸が有効に発現制御配列に連結されている、請求項２２記載の組み換え 構築物。 ２４．単離された組み換え哺乳類ケモカイン受容体３、または哺乳類ケモカイン 受容体の少なくとも１つの機能的特徴または免疫学的特性を有するその一部。 ２５．哺乳類がヒトである、請求項２４記載の単離された組み換え受容体。 ２６．本質的に純粋な哺乳類ケモカイン受容体３、または哺乳類ケモカイン受容 体の少なくとも１つの機能的特徴、例えば、エオタキシン結合を有するその一部 。 ４３．下記工程からなる哺乳類ケモカイン受容体３蛋白質またはその一部の阻害 剤の同定方法： ａ）リガンドの存在下、受容体へのリガンドの結合に適した条件下で、試験対象 の化合物を、活性な組み換え哺乳類ケモカイン受容体３蛋白質を発現する宿主細 胞と結合させる工程；および ｂ）該リガンドおよび活性な単離蛋白質間の複合体形成を検出または測定する工 程。 ４４．哺乳類ケモカイン受容体３蛋白質の少なくとも１つの機能的特徴に対する 阻害剤。 ４５．抗体またはその一部である、請求項４４記載の阻害剤。 ４６．下記からなる群より選ばれた配列を有する核酸に中程度のストリンジェン シー条件下でハイブリダイズする配列を有する核酸からなるアンチセンス核酸： ａ）配列番号：１； ｂ）配列番号：３； ｃ）配列番号：５； ｂ）ａ）ないしｃ）のいずれかの配列のＲＮＡ体。 ４７．哺乳類ケモカイン受容体３蛋白質の少なくとも１つの機能を調節する方法 であって、該蛋白質を、該蛋白質の少なくとも１つの機能の阻害剤または促進剤 と接触させる工程からなる方法。 ４８．哺乳類ケモカイン受容体３蛋白質阻害剤の治療上有効量を、哺乳類に投与 し、そうすることによって炎症が低減することからなる、炎症性疾患または炎症 状態の治療方法。 ４９．治療に使用するための哺乳類ケモカイン受容体３蛋白質の少なくとも１つ の機能の阻害剤または促進剤。 ５０．炎症性疾患または炎症状態の治療に対する医薬の製造のための哺乳類ケモ カイン受容体３蛋白質の阻害剤の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｑ 1/02 33/68 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＥ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ， ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ (71)出願人 チルドレンズ メディカル センター コ ーポレーション アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02115 ボストン，ロングウッド アベニ ュー 300 (72)発明者 ジェラード，クレイグ ジェイ. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02030 ドーヴァー，ウォールポール ス トリート 117 (72)発明者 ジェラード，ノーマ ピー. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02030 ドーヴァー，ウォールポール ス トリート 117 (72)発明者 マッケイ，チャールズ アール. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02161 ニュートン ハイランズ，デダム ストリート 150 (72)発明者 ポナス，ポール ディー. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02118 ボストン，ナンバー．３，アップ トン 45 (72)発明者 ポスト，シアドール ダブリュー. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02159 ニュートン，マンダレー ロード 14 (72)発明者 クイン，シクシン アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02173 レキシントン，タフト アベニュ ー 14

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記群から選ばれた核酸にハイブリダイズする単離された核酸： ａ）配列番号：１記載の配列、またはその一部であってコード配列からなる核酸 ； ｂ）配列番号：３記載の配列、またはその一部であってコード配列からなる核酸 ； ｃ）配列番号：５記載の配列、またはその一部であってコード配列からなる核酸 ； ｄ）（ａ）ないし（ｃ）のいずれかの核酸の相補鎖；および ｅ）（ａ）ないし（ｄ）のいずれかの核酸のＲＮＡ体であって、ＴがＵに置換さ れたＲＮＡ体。 ２．単離された核酸が本質的に純粋である、請求項１記載の単離された核酸。 ３．単離された核酸が、ストリンジェントな条件下でａ）ないしｅ）記載のいず れかの核酸にハイブリダイズする請求項１記載の単離された核酸。 ４．単離された核酸が、哺乳類ケモカイン受容体３の少なくとも機能的な部分を コードする請求項１記載の単離された核酸。 ５．哺乳類がヒトである、請求項４記載の単離された核酸。 ６．単離された核酸が組み換え体である、請求項４記載の単離された核酸。 ７．哺乳類ケモカイン受容体３をコードする単離された組み換え核酸。 ８．哺乳類が霊長類である、請求項７記載の単離された組み換え核酸。 ９．霊長類がヒトである、請求項８記載の単離された組み換え核酸。 １０．下記群から選ばれたポリペプチドをコードする単離された核酸： ａ）配列番号：２記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド； ｂ）配列番号：４記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド； ｃ）配列番号：６記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；および ｄ）（ａ）ないし（ｃ）のいずれかのポリペプチドの機能的部分、該部分は哺乳 類Ｃ−Ｃケモカイン受容体の少なくとも１つの機能的特徴を有する。 １１．該核酸が本質的に純粋である、請求項１０記載の単離された核酸。 １２．組み換え核酸である請求項１０記載の単離された核酸。 １３．ポリペプチドが、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−３およびエオタキシンの１以上 と結合する請求項１０記載の核酸。 １４．ポリペプチドが、ＲＡＮＴＥＳと結合する請求項１０記載の核酸。 １５．下記群から選ばれた核酸にハイブリダイズする組み換え核酸からなる組み 換え構築物： ａ）配列番号：１記載の配列、またはその一部であってコード配列からなる核酸 ； ｂ）配列番号：３記載の配列、またはその一部であってコード配列からなる核酸 ； ｃ）配列番号：５記載の配列、またはその一部であってコード配列からなる核酸 ； ｄ）（ａ）ないし（ｃ）のいずれかの核酸の相補鎖；および ｅ）（ａ）ないし（ｄ）のいずれかの核酸のＲＮＡ体であって、ＴがＵに置換さ れたＲＮＡ体。 １６．組み換え核酸が、有効に発現制御配列に連結されている請求項１５記載の 組み換え構築物。 １７．組み換え核酸が、哺乳類ケモカイン受容体３の少なくとも機能的な部分を コードする請求項１５記載の組み換え構築物。 １８．哺乳類がヒトである、請求項１７記載の組み換え構築物。 １９．哺乳類ケモカイン受容体３をコードする核酸からなる組み換え構築物。 ２０．哺乳類が霊長類である、請求項１９記載の組み換え構築物。 ２１．霊長類がヒトである、請求項２０記載の組み換え構築物。 ２２．下記群から選ばれたポリペプチドをコードする核酸からなる組み換え構築 物： ａ）配列番号：２記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド； ｂ）配列番号：４記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド； ｃ）配列番号：６記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド； ｄ）（ａ）ないし（ｃ）のいずれかのポリペプチドの機能的部分、該部分は哺乳 類Ｃ−Ｃケモカイン受容体の少なくとも１つの機能的特徴を有する；および ｅ）（ａ）ないし（ｃ）のいずれかのポリペプチドの機能的同等物。 ２３．核酸が有効に発現制御配列に連結されている、請求項２２記載の組み換え 構築物。 ２４．単離された組み換え哺乳類ケモカイン受容体３、または哺乳類ケモカイン 受容体の少なくとも１つの機能的特徴もしくは免疫学的特性を有するその一部。 ２５．哺乳類がヒトである、請求項２４記載の単離された組み換え受容体。 ２６．本質的に純粋な哺乳類ケモカイン受容体３、または哺乳類ケモカイン受容 体の少なくとも１つの機能的特徴、例えば、エキソタキシン(exotaxin)結合を有 するその一部。 ２７．哺乳類ＣＫＲ−３受容体蛋白質またはその機能的部分をコードする、単離 された組み換え核酸を含む宿主細胞。 ２８．核酸が有効に発現制御配列に連結され、そうすることによって、宿主細胞 を発現に適した条件下で維持するときに、コード化受容体蛋白質またはその機能 的部分が発現される、請求項２７記載の宿主細胞。 ２９．発現蛋白質が、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−３およびエオタキシンの１以上と 結合する請求項２８記載の宿主細胞。 ３０．哺乳類ケモカイン受容体３蛋白質またはその一部を含む融合蛋白質であっ て、該一部は、哺乳類ケモカイン受容体の少なくとも１つの機能的特徴または免 疫学的特性を有するものである融合蛋白質。 ３１．哺乳類ケモカイン受容体蛋白質またはその一部が、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ −３およびエオタキシンの１以上と結合する請求項３０記載の融合蛋白質。 ３２．ポリペプチドがＲＡＮＴＥＳと結合する、請求項３０記載の融合蛋白質。 ３３．哺乳類がヒトである、請求項３０記載の融合蛋白質。 ３４．核酸構築物であって、該構築物は、請求項３０記載の融合蛋白質をコード する核酸からなる発現ベクターであり、該核酸は、哺乳類ケモカイン受容体３蛋 白質に対するコード配列の全部または一部からなり、該コード配列は、発現制御 配列の制御下にある核酸構築物。 ３５．哺乳類ケモカイン受容体３蛋白質またはその機能的部分の生産方法であっ て、該受容体またはその機能的部分をコードする組み換え核酸を含む宿主細胞を 、該核酸の発現に適した条件下で維持し、そうすることによって、コードされる 蛋白質が発現し、該受容体またはその一部が産生されることからなる生産方法。 ３６．下記工程からなる哺乳類ケモカイン受容体３蛋白質またはその機能的部分 の生産方法： ａ）哺乳類ケモカイン受容体３蛋白質に対するコード配列の全部または一部をコ ードする核酸からなり、該コード配列は少なくとも１つの発現制御配列と有効に 連結している組み換え核酸構築物を提供する工程； ｂ）該構築物を、適当な宿主細胞に導入する工程；および ｃ）核酸が発現する条件下で、該宿主細胞を適当な培地中で維持する工程。 ３７．該細胞またはその生育培地から、哺乳類ケモカイン受容体３蛋白質または その機能的部分を単離する工程をさらに含んでなる請求項３６記載の方法。 ３８．哺乳類ケモカイン受容体３蛋白質もしくは該受容体蛋白質の一部に結合す る抗体またはその機能的部分。 ３９．哺乳類ケモカイン受容体３蛋白質が、ヒト哺乳類ケモカイン受容体３蛋白 質である請求項３８記載の抗体。 ４０．哺乳類ケモカイン受容体３蛋白質またはその一部のリガンドの検出方法で あって、受容体へのリガンド結合に適した条件下で、試験対象の化合物を、活性 な単離された哺乳類ケモカイン受容体３蛋白質と結合させる工程ならびに該化合 物および活性な単離蛋白質間の複合体形成を検出または測定する工程からなる方 法。 ４１．下記工程からなる哺乳類ケモカイン受容体３蛋白質またはその一部のリガ ンドの同定方法： ａ）受容体へのリガンド結合に適した条件下で、試験対象の化合物を、活性な組 み換え哺乳類ケモカイン受容体３蛋白質を発現する宿主細胞と結合させる工程； および ｂ）該化合物および活性な単離蛋白質間の複合体形成を検出または測定する工程 。 ４２．複合体形成が、受容体へのリガンドの結合に応答して該活性な受容体によ るシグナル発信活性もしくは細胞応答を検出または測定することにより監視され る請求項４１記載の方法。 ４３．下記工程からなる哺乳類ケモカイン受容体３蛋白質またはその一部の阻害 剤の同定方法： ａ）リガンドの存在下、受容体へのリガンドの結合に適した条件下で、試験対象 の化合物を、活性な組み換え哺乳類ケモカイン受容体３蛋白質を発現する宿主細 胞と結合させる工程；および ｂ）該リガンドおよび活性な単離蛋白質間の複合体形成を検出または測定する工 程。 ４４．哺乳類ケモカイン受容体３蛋白質の少なくとも１つの機能的特徴に対する 阻害剤。 ４５．抗体またはその一部である、請求項４４記載の阻害剤。 ４６．下記からなる群より選ばれた配列を有する核酸にハイブリダイズする配列 を有する核酸からなるアンチセンス核酸： ａ）配列番号：１； ｂ）配列番号：３； ｃ）配列番号：５； ｂ）ａ）ないしｃ）のいずれかの配列のＲＮＡ体。 ４７．哺乳類ケモカイン受容体３蛋白質の少なくとも１つの機能を調節する方法 であって、該蛋白質を、該蛋白質の少なくとも１つの機能の阻害剤または促進剤 と接触させる工程からなる方法。 ４８．哺乳類ケモカイン受容体３蛋白質阻害剤の治療上有効量を、哺乳類に投与 し、そうすることによって炎症が低減することからなる、炎症性疾患または炎症 状態の治療方法。