JPH10513563A - ケミカルライブラリの分類への向流クロマトグラフィの適用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ケミカルライブラリをサブライブラリに分離する方法であって、ライブラリに向流クロマトグラフィ（ＣＣＣ）を適用し、サブライブラリフラクションを集めることから成る方法。

Description

【発明の詳細な説明】 ケミカルライブラリの分類への向流クロマトグラフィの適用 本発明は化学的化合物の混合物を分離する方法に関する。特に向流クロマトグ ラフィ（ＣＣＣ）を用いたケミカルライブラリの分類（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉ ｏｎ）に関する。 ケミカルライブラリの分類に利用できる方法は反復再合成、アフィニティ選別 、ポジショナル・スキャニング（ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）、 自己解読（ｓｅｌｆ−ｄｃｃｉｐｈｅｒｍｅｎｔ）又は直交（ｏｒｔｈｏｇｏｎ ａｌｉｔｙ）、ビーズ選別の後のシーケンシング、及び／又は符号化されたタグ の解読及び逆相高性能液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を含む固−液吸 着クロマトグラフィ法などを含む。これらの方法は広く検討されている（Ｇａｌ ｌｏｐ，Ｍ．Ａら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，３７：１２３３−５１ ；Ｇｏｒｄｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，３７，１３ ８５−４０１；Ｍａｄｄｅｎ，Ｄ．ら、Ｐｅｒｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｄｒｕ ｇ Ｄｅｓｉｇｎ，１９９５，２：２６９−８５；Ｃｈａｂａｌａ，Ｊ．Ｃ．ら 、Ｐｅｒｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，１９９５，２：３ ０５−１５；Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｋ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．１９９５ ，５１：８１３５−７３；Ｌｏｗｅ，Ｇ．、Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，１９ ９５，３０９−１７）。しかし更に改良されたライブラリ分類の方法に対する要 求が存在する。 我々は有益なサブライブラリフラクション及び個々のライブラリメンバーを同 定するためにＣＣＣを用いてケミカルライブラリの区分が可能であることを見い だした。これは特に喜ばしいことであり、なぜならこれまではＣＣＣは天然物の 混合物及び抽出物、抗生物質及びペプチドからの化合物の分離及び／又は精製に 適用されるのみだったからである［Ｉｔｏ，Ｙ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ａｎａｌ ．Ｃｈｅｍ．，１９８６，１７，６５−１４３：Ｃｏｎｗａｙ．Ｗ．Ｄ．，１９ ９ ０，’Ｃｏｕｎｔｅｒｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ａｐｐ ａｒａｔｕｓ，Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｒｉｌｌ，Ｇ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｌｉ ｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．，１９８５，８：２２５９−８０；Ｍａｒｔｉｎ，Ｄ ．Ｇ．ら、Ａｍ．Ｌａｂ．（Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，Ｃｏｎｎ．），１９８６，１ ８ｔｈ Ｏｃｔｏｂｅｒ，２１−２６；Ｆａｒｔｈｉｎｇ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｌ ｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．，１９９０，１３：９４１−５０；Ｌｅｅ，Ｓ．Ｓ ．；Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．，１９９４，Ａ，６６７：３２２−６；Ｈｅｒｍ ａｎｓｌｏｋｋｅら、Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．，１９９４，Ａ，６６４：４５ −５３］．これらの化合物は関連性のない種の背景と対照に各々に存在している 。 そのため、本発明の第１の態様において、我々はケミカルライブラリをサブラ イブラリフラクションに分ける方法であって、該ライブラリに向流クロマトグラ フィ（ＣＣＣ）を適用し、サブライブラリフラクションを集めることからなる方 法を提供する。 ＣＣＣは 固相を必要とせず、本質的に、用いられる試料の全ては、全ての物 質について１００％の回収率で処理される。ＣＣＣの後記の面はライブラリ分類 において特に重要である。 更に我々はＣＣＣはＨＰＬＣのような他の形態のクロマトグラフィとは異なっ た様式で化合物を分離することを見いだした。ゆえにケミカルライブラリは更に 特徴づけられ、精製される。 本発明の方法によれば、当業者はケミカルライブラリを様々な有用なサブライ ブラリフラクションに分けることができる。ライブラリは薬剤探索及びデザイン における有用なパラメータに従って実施例に制限されることない方法で区分され る。ＣＣＣは本来、液−液分配クロマトグラフィの一形態であり、物質は特定の 固定相と移動相における分配係数に従って分けられる。よって、分配係数はＣＣ Ｃによって測定できる（Ｃｏｎｗａｙ，”Ｃｏｕｎｔｅｒｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｈ ｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ａｐ ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｖａｌｌａｔら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．，１９９０，５０４：４１１−９） 。 更に、補正された分配係数パラメータＣｌｏｇＰは、疎水性／親水性及び、しば しば生物学的活性に関連する有用な指標であり、薬剤分子の構造−活性の量的相 関（ｑｕａｎｔａｔｉｖｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａ ｓｉｏｎｓｈｉｐ：ＱＳＡＲ）において重要である。更にＣｌｏｇＰは特に薬剤 の活性部位への送達において、薬剤のイオン性（ｐＫａ）を補正してｌｏｇＤを 与える場合に顕著な役割を果たす。更にＣｌｏｇＰは正又は負の値をとりうるが 、薬剤探索及びデザインにおいて興味深い化合物は０より大であるＣｌｏｇＰの 値を有する傾向にあり、特に１から４の間のＣｌｏｇＰの値を有する。ｌｏｇＤ については好ましい範囲は０から２である。よって、ＣｌｏｇＰ及びｌｏｇＤは 薬剤デザインのプロセスにおいて考慮する基礎的なパラメータである。従って本 発明は薬剤探索及びデザインのプロセスに主要な関連を有する。 その結果、更なる態様において、本発明の方法を用いて得られるサブライブラ リフラクションを提供する。フラクションは、いかなる都合のよい数の、及び都 合のよいサイズのサブライブラリフラクションを供給するためにも、ＣＣＣフラ クション分離中にいかなる相から得てもよい。 このようなフラクションは好ましくは０より大のＣｌｏｇＰの値を有し、更に 好ましくは約１から４の間である。そのｌｏｇＤは好ましくは約０から２の間で ある。 液滴型、遠心型、遊星型（ｐｌａｎｅｔａｒｙ）ＣＣＣ等の、いかなる都合の よい形のＣＣＣを使用してもよい。遊星型又は遠心型コイルＣＣＣが好適である 。 ケミカルライブラリは、都合の良い数（例えば数十、数百、数千、数百万など ）の適当な化合物｛例えばペプチド、ペプトイド、及び他のオリゴマー化合物（ 環状又は鎖状）、及び鋳型ベースの比較的低分子の化合物、例えばベンゾジアゼ ピン、ヒダントイン、ビアリール、多環化合物（例えばナフタレン、フェノチア ジン、アクリジン、ステロイドなど）、炭化水素及びアミノ酸誘導体、、ジヒド ロピリジン、ベンズヒドリル及び複素環（例えばトリアジン、インドールなど） ｝の各々のメンバーからなっても良い。引用される数及び化合物の種類が例示と して列記されているが、制限するものではない。分析を簡単にするためにケミカ ルライブラリはいかなる都合の良い数のサブライブラリの混合物として提供され て も良い。これらは、例えば約１００まで、あるいは約５０までのように、典型的 には約１０−１０００のライブラリ化合物を含んでも良い。 本発明の方法は、全てあるいは都合の良い部分のケミカルライブラリをサブラ イブラリフラクションに分けることに用いても良いということは評価されるであ ろう。例えば与えられたライブラリの化合物を多数の個々のライブラリ混合物に 分ける。１又はそれ以上のライブラリ混合物はライブラリの生物学的スクリーニ ングに先だって、あるいは後に本発明の方法中で用いられる。 好ましい化合物は低分子量の化学的な化合物であり、潜在的に治療剤となりう るものである。例えば８００、６００あるいは４００ダルトン以下などの１００ ０ダルトン以下の化合物である。 本発明の更なる態様では、我々はケミカルライブラリの分類であって、向流ク ロマトグラフィ（ＣＣＣ）をライブラリに適用し、サブライブラリフラクション を集め、１又はそれ以上のサブライブラリフラクションの分析を行い、１又はそ れ以上の個々のライブラリメンバーの同定を行うことからなる方法を提供する。 便宜的にサブライブラリフラクション及び個々の化合物の同定は従来の分析技 術、例えば質量分析（ＭＳ）又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）等の技術を用いて測定さ れる。 非限定的な例を挙げると、２０００化合物からなるライブラリが２０フラクシ ョン又はサンプル間に均等に分配される。これらの２０のサンプル（ＡからＴ） は、薬剤探索に関連する生物学的スクリーンにおいて試験され、サンプルＱは活 性であると同定されるとする。サンプルＱの一部は次にＣＣＣにかけられ当業者 によって選択される溶媒システムを用いて適当な数のフラクションに分画される 。ケミカルライブラリサンプルが分画されるフラクションの数は制限されないが 好ましくは１０から３０の範囲である。こうして、選択された溶媒システムが水 性固定相からなる場合は、ＣＣＣ装置からの初期のフラクションはサンプルＱ中 に存在するものの中で最も高いＣｌｏｇＰの値を有するライブラリメンバーを含 むであろう。更にＣＣＣ分配中に相モードを固定水相から固定有機相にいつでも 代えることが可能である。このことによって同じ実験中に低ＣｌｏｇＰのライブ ラリメンバーを分画することが可能となり、サンプルＱ中に含まれる全てのライ ブ ラリメンバーがＣｌｏｇＰの範囲にわたって分布する１組のフラクションを生じ る。同様に、選択された溶媒システムが有機固定相であればＣＣＣ装置からの初 期のフラクションはサンプルＱ中に存在するものの中で最低のＣｌｏｇＰの値を 有するライブラリメンバーを含むであろう。再びＣＣＣ分画中はいつでも相モー ドを固定有機相から固定水相に代えることが可能であり、同じ実験中に高Ｃｌｏ ｇＰのライブラリメンバーを分画することが可能であり、そしてまたサンプルＱ 中に含まれる全てのライブラリメンバーがＣｌｏｇＰの範囲にわたって分布する １組のフラクションを生じる。更に、サンプルＱはＣＣＣを用いて２回又はそれ 以上分画されてもよいが、異なる溶媒システムと固定水相及び固定有機相両方の 異なる相モードを用いてサンプルＱ中に存在するライブラリメンバーを含む何組 かのフラクションを与え、しかしそれらのライブラリメンバーはＣ’ｌｏｇＰに 従って異なった形態で分布している。ここで、Ｃ’ｌｏｇＰは特定の溶媒システ ムに対する補正された分配係数であり、ＣｌｏｇＰとは異なる。 本発明の方法において用いる適当な液相の選択は、熟練した科学者にとっては 明確である。特別な溶媒システムはイソヘキサン：酢酸エチル：メタノール：水 からなる。都合の良い割合の例は例えば１：１：１：１又は１：２：１：２又は ２：１：２：１である。溶媒システムは所望によりトリエチルアミンのようなｐ Ｈ調整剤を含んでも良い。 サブライブラリフラクションは例えば１から２０の間の化合物など、いかなる 都合のよい数の化合物を含んでも良いが、１から１０の間の化合物が好ましい。 ＣＣＣから得られたサブライブラリフラクションは、薬剤探索に関連した生物 学的スクリーンにおいて再検査されても良い。活性であると同定されたフラクシ ョンはさらなる分画と再検査のために再度ＣＣＣにかけることができ、あるいは 従来の分離システム、例えばＨＰＬＣなどにかけてもよく、もし質量分析につな がっているのであれば、例えばＬＣ−ＭＳ、又は核磁気共鳴につながっているの であれば、例えばＬＣ−ＮＭＲによって、ライブラリメンバーあるいは該サブラ イブラリフラクションに含まれるメンバーの同定をしても良い。もし従来の分離 技術によって活性フラクション中にたった一種の化合物の存在のみ示されれば、 推論により、その化合物が活性を担うライブラリメンバーであるだろう。ゆえに ライブラリは分類される。 本発明の更なる態様は、例えばＬＣ−ＭＳ又はＬＣ−ＮＭＲによる活性サブラ イブラリフラクションの分析により、各活性フラクションにたとえ１以上の化合 物が存在しても、活性フラクションの全てに存在するライブラリメンバーはただ 一つであるということが判明することである。このメンバーは推論から再び活性 化合物となるだろう。ゆえにライブラリは再度分類される。 本発明の更なる態様は、検査前に、薬剤探索にとって分配係数が受け入れられ ない値であるライブラリメンバーを除去するためにケミカルライブラリを前もっ て分画することへのＣＣＣの使用である。ゆえに、例えば、上記の２０のライブ ラリフラクションは、ＣＣＣを用いる当業者によって、生物学的検査に先立ち、 各フラクションはサブフラクションに分画される。こうして水性固定相が用いら れても、有機移動相を用いたごく初期の溶出フラクションが最大のＣｌｏｇＰの 値を有するライブラリメンバーを含むだろう。これらは、所望であれば、検査の 前に処分しても良い。同様に、有機固定相を用いた場合、水性移動相を用いたご く初期の溶出フラクションは最小のＣｌｏｇＰの値を有するライブラリメンバー を含むだろう。 これらは、所望であれば、検査の前に処分しても良い。こうして、この方法に よってケミカルライブラリは薬剤探索にとって好ましい範囲内にある分配係数を 有するメンバーのみ有するものが作られる。この好ましい範囲とはＣｌｏｇＰの 値が約１から４の間であり、又はｌｏｇＤの値が約０から２の間である。 我々は理論的考察に限定されることを望まないが、上記で概説したとおり、本 発明の方法は、個々の化合物を同定できるまでライブラリのサブ混合物を分ける ことに用いてもよい。代わりに、サブライブラリフラクションはＨＰＬＣなどの 慣用の技術によってさらに分けてもよい。 ここで本発明を例示を挙げて説明するが、本例示によって以下に示す実施例に 制限するものではない：実施例１ トリスアミノトリアジンライブラリの向流クロマトグラフィ分離： ライブラリは’ミックス アンド デバイド’（ｍｉｘ ａｎｄ ｄｉｖｉｄ ｅ）法（Ｆｕｒｋａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．，１９９１ ，３７，４８７−４９３）を用いて、ｓｙｍ−トリアジン核を基礎に調製し、２ 位に３つのアミン、４位に３つのアミン及び６位に更に３つのアミンを用いて、 各々が９つ成分を含んでいる３混合物の３^*３^*３ライブラリを提供した。 予期した化合物の存在を確認するために混合物はＨＰＬＣ−質量分析で検査さ れ、混合物のうちの一つを遊星型コイル向流クロマトグラフィを用いたＣＣＣ分 離にかけられた。 混合物の２０ｍｇを６０ｍｌコイルで精製した。溶媒システムはイソヘキサン ：酢酸エチル：メタノール：水：トリエチルアミンを２：１：２：１：０．０６ の割合に混合したものであった。コイルは最初上層を有機相、下層を水相で満た し、平衡に達するまで、ｍｌ／分でヘッド トウー テイル方向（ｈｅａｄ ｔ ｏ ｔａｉｌ）にポンプを作動した（コイルの回転速度９００ｒｐｍ）。下層に 溶解したサンプルが注入されて、２０分間ポンピングを続け、２０個の１ｍｌフ ラクションが最初に集められた。コイルの回転方向を反転し、テイル トウー ヘッド方向に更に１０分間ポンピングを続けた。５個の２分間のフラクションを 集めた。コイルを空にして計２６フラクションを得た。 ＨＰＬＣによるフラクションの検査は、フラクション３及び４中に３つの成分 の混合物、フラクション５及び６中に１つの成分、フラクション７中に２つの成 分の混合物、フラクション８及び９中に１つの成分、フラクション１０中に２つ の成分の混合物、フラクション１１−１４中に１つの成分、フラクション１９− ２５に４つの成分の混合物、及びフラクション２６中に主として２つの成分を含 む混合物を示した。こうして溶媒のエバポレートの後、クロマトグラフィによっ て９つのうち３つの純粋成分、３つの２成分の混合物、１つの３及び４成分の混 合物を得た。実施例２ システイン誘導体ライブラリの向流クロマトグラフィ分離 ライブラリは鋳型システインを基礎に調製された。このライブラリの一部は１ ．５グラムの１−［Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−システイニル ）モルホリン］（５ｍｍｏｌ）を過剰の無水炭酸カリウム（１．３８グラム、１ ０ｍｍｏｌ）と共にアセトン（８０ｍｌ）に取り、０．１等量の９種のアルキル 化試剤（０．５ｍｍｏｌ、以下のリストを参照のこと）を１０分おきに加えるこ とにより調製した。数時間の攪拌後、適当な保護試薬を過剰に加え、（この場合 はエチルブロマイド（２７２ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ））、さらに数時間攪拌した 。無機塩類を除くために濾過して、エバポレートで溶媒及び過剰の保護試薬を除 き、ライブラリ混合物を得た。ＨＰＬＣ分析で１０化合物の存在が確認され、混 合物は遊星型コイル向流クロマトグラフを用いたＣＣＣによる分離にかけた。 混合物の６０ｍｇを６０ｍｌコイルで精製した。溶媒システムはイソヘキサン ：酢酸エチル：メタノール：水を１：１：１：１の割合で混合したものを用いて 、平衡に至らせた。コイルは初め水性の下層で満たし、上層を平衡に至るまで４ ｍｌ／分でテイル ト_ウー ヘッド方向にポンプを作動した（コイルの回転速度 ９００ｒｐｍ）。サンプルは上層に溶解し、溶媒ラインに導入され、フラクショ ンの回収（１×１２ｍｌ、２×４ｍｌ、６×８ｍｌ、１×１２ｍｌ、２×２０ｍ ｌ）と共に３０分間引き続きポンブを作動した。コイルを空にして総計１３フラ クションを得た。 ＨＰＬＣによるフラクションの検査により、以下の結果となった： フラクション１；なし、フラクション２；成分Ａ、フラクション３；成分Ａ及び Ｂ、及びいくらかのＣ及びＤ、フラクション４；成分ＣおよびＤ、及びいくらか のＢ及びＥ、フラクション５；成分Ｄ、Ｅ及びＦ、フラクション６；成分Ｅ及び Ｆ、フラクション７；成分Ｆ、フラクション８；なし、フラクション９；いくら かの成分Ｇ、フラクション１０；成分Ｇ及びＨ、フラクション１１；成分Ｇ及び いくらかのＨ、フラクション１２；成分Ｊ、フラクション１３；成分Ｉ及びいく らかのＪ。こうしてクロマトグラフィによって、４つの１種の成分のみ含むフラ クション及び７つの４成分主でを含むフラクションを得た。アルキル化試剤 Ａ ３，４−ジクロロベンジルブロマイド Ｂ ３，３−ジメチルアリルブロマイド Ｃ ベンジルブロモアセテート Ｄ メチル３−（ブロモメチル）ベンゾエート Ｅ ブロモアセトフェノン Ｆ ２−（ブロモメチル）ベンゾニトリル Ｇ ブロモアセトニトリル Ｈ ２−メトキシエチルブロマイド Ｉ ブロモアセトアミド Ｊ エチルブロマイド

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｒ 33/32 Ｇ０１Ｎ 24/02 ５３０Ｇ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ケミカルライブラリをサブライブラリフラクションに分離する方法であって 該ライブラリに向流クロマトグラフィ（ＣＣＣ）を適用し、サブライブラリフラ クションを集めることからなる方法。 ２．０より大であるＣｌｏｇＰの値を有するフラクションを供給するためにＣＣ Ｃを用いる請求項１に記載の方法。 ３．１から４の範囲であるＣｌｏｇＰの値を有するフラクションを供給するため にＣＣＣを用いる請求項１又は２に記載の方法。 ４．０より大であるｌｏｇＤの値を有するフラクションを供給するためにＣＣＣ を用いる請求項１又は２に記載の方法。 ５．０から２の範囲であるｌｏｇＤの値を有するフラクションを供給するために ＣＣＣを用いる請求項１又は２に記載の方法。 ６．分離するケミカルライブラリをサブライブラリの混合物として供給する方法 であって、１又はそれ以上の混合物にＣＣＣを適用し、サブライブラリフラクシ ョンを集める前記請求項のいずれかに記載の方法。 ７．サブライブラリフラクションを分離して更にサブライブラリの混合物を供給 する方法であって、１又はそれ以上のサブライブラリフラクションにＣＣＣを適 用し、サブライブラリフラクションを集め、該方法が所望により少なくとも１度 繰り返される請求項６に記載の方法。 ８．ケミカルライブラリが分子量１０００ダルトンより小である化合物からなる 前記請求項のいずれかに記載の方法。 ９．前記請求項のいずれかに記載の方法で得られたサブライブラリフラクション 。 １０．請求項９に記載のサブライブラリフラクションの生物学的アッセイ、試験 システム又はスクリーニングにおける使用。 １１．請求項１から８のいずれかに記載の方法により得られる、サブライブラリ フラクション中のライブラリメンバーが、質量分析スペクトロスコピー又は核磁 気共鳴スペクトロスコピーを用いて同定されることによる、ケミカルライブラリ の分類方法。 １２．液体クロマトグラフィが質量分析スペクトロスコピー又は核磁気共鳴スペ クトロスコピーに接続されている請求項１１に記載の方法。