JPH1052300A - 細胞内テロメラーゼ活性の測定法 - Google Patents
細胞内テロメラーゼ活性の測定法Info
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- JPH1052300A JPH1052300A JP13695997A JP13695997A JPH1052300A JP H1052300 A JPH1052300 A JP H1052300A JP 13695997 A JP13695997 A JP 13695997A JP 13695997 A JP13695997 A JP 13695997A JP H1052300 A JPH1052300 A JP H1052300A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/91—Transferases (2.)
- G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
- G01N2333/91245—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 癌の早期発見に役立ち、細胞診断でも適用可
能な簡便なテロメラーゼの測定方法を提供する。 【解決手段】 スライドグラス上に試料を固着し、その
状態で、試料中のテロメラーゼによるテロメラーゼ基質
の延長反応を行い、試料をスライドグラス上に固着した
状態で、得られた延長反応生成物を塩基結合連鎖反応に
付す工程からなるテロメラーゼ活性の測定方法。
能な簡便なテロメラーゼの測定方法を提供する。 【解決手段】 スライドグラス上に試料を固着し、その
状態で、試料中のテロメラーゼによるテロメラーゼ基質
の延長反応を行い、試料をスライドグラス上に固着した
状態で、得られた延長反応生成物を塩基結合連鎖反応に
付す工程からなるテロメラーゼ活性の測定方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、癌細胞の分裂・増
殖に重要な役割を果たし、臨床検査の測定対象因子とし
て重要なテロメラーゼ活性の測定方法、病理検査方法お
よび該酵素活性測定試薬に関する。本発明は例えば癌診
断のための臨床検査技術、病理判定技術として重要であ
る。
殖に重要な役割を果たし、臨床検査の測定対象因子とし
て重要なテロメラーゼ活性の測定方法、病理検査方法お
よび該酵素活性測定試薬に関する。本発明は例えば癌診
断のための臨床検査技術、病理判定技術として重要であ
る。
【０００２】
【従来の技術】テロメラーゼ活性の測定方法として、プ
ライマーにラジオアイソトープをラベルした後、テロメ
ラーゼ反応を行い、生じたテロメラーゼ反応生成物をポ
リメラーゼ連鎖（ＰＣＲ）反応により増幅した後、該Ｐ
ＣＲ反応生成物を電気泳動に付した後オートラジオグラ
フィーにより活性を測定する方法が知られている（キム
ら、サイエンス、２６６巻、２０１１頁、１９９４年：
ＷＯ９５／１３３８１号公報）。
ライマーにラジオアイソトープをラベルした後、テロメ
ラーゼ反応を行い、生じたテロメラーゼ反応生成物をポ
リメラーゼ連鎖（ＰＣＲ）反応により増幅した後、該Ｐ
ＣＲ反応生成物を電気泳動に付した後オートラジオグラ
フィーにより活性を測定する方法が知られている（キム
ら、サイエンス、２６６巻、２０１１頁、１９９４年：
ＷＯ９５／１３３８１号公報）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従来の方法は、試料に
細胞抽出液等を用いるため、個々の細胞におけるテロメ
ラーゼ活性の検出ができず、癌の診断に繁用されている
細胞診断には適用できない。このため、癌の早期発見に
役立つよう、細胞診断でも適用可能な簡便なテロメラー
ゼの測定方法が望まれている。
細胞抽出液等を用いるため、個々の細胞におけるテロメ
ラーゼ活性の検出ができず、癌の診断に繁用されている
細胞診断には適用できない。このため、癌の早期発見に
役立つよう、細胞診断でも適用可能な簡便なテロメラー
ゼの測定方法が望まれている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、細胞診断に用いるスライドグラス上で、蛍光ラベル
した基質を用いてテロメラーゼ反応を行った後、蛍光ラ
ベルしたプライマーを用いて塩基結合連鎖反応を行い、
細胞内テロメラーゼ反応により生じた蛍光を、蛍光顕微
鏡で肉眼的に確認するという画期的な細胞内のテロメラ
ーゼ活性の測定方法が提供される。
に、細胞診断に用いるスライドグラス上で、蛍光ラベル
した基質を用いてテロメラーゼ反応を行った後、蛍光ラ
ベルしたプライマーを用いて塩基結合連鎖反応を行い、
細胞内テロメラーゼ反応により生じた蛍光を、蛍光顕微
鏡で肉眼的に確認するという画期的な細胞内のテロメラ
ーゼ活性の測定方法が提供される。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明は、（１）スライドグラス
上に試料を固着する工程、（２）試料をスライドグラス
上に固着した状態で、試料中のテロメラーゼによるテロ
メラーゼ基質の延長反応を行う工程、および（３）試料
をスライドグラス上に固着した状態で得られた延長反応
生成物を塩基結合連鎖反応に付す工程からなるテロメラ
ーゼ活性の測定方法に関する。
上に試料を固着する工程、（２）試料をスライドグラス
上に固着した状態で、試料中のテロメラーゼによるテロ
メラーゼ基質の延長反応を行う工程、および（３）試料
をスライドグラス上に固着した状態で得られた延長反応
生成物を塩基結合連鎖反応に付す工程からなるテロメラ
ーゼ活性の測定方法に関する。
【０００６】スライドグラス上に試料を固着する工程と
しては、スライドグラス上に試料を添加した後、乾燥さ
せてから固着する工程または、スライドグラス上に凍結
乾燥切片標本を置き固着する工程が挙げられる。スライ
ドグラスとしては、一般に検鏡用に用いるスライドグラ
スが用いられる。なお、スライドグラスとしては無蛍光
のものが好ましいが、シラン処理を施したものがとりわ
け好ましく、無蛍光でシラン処理のものが最も好まし
い。
しては、スライドグラス上に試料を添加した後、乾燥さ
せてから固着する工程または、スライドグラス上に凍結
乾燥切片標本を置き固着する工程が挙げられる。スライ
ドグラスとしては、一般に検鏡用に用いるスライドグラ
スが用いられる。なお、スライドグラスとしては無蛍光
のものが好ましいが、シラン処理を施したものがとりわ
け好ましく、無蛍光でシラン処理のものが最も好まし
い。
【０００７】試料としては、血液、リンパ液、尿、分泌
液、組織切片等生体由来の臨床検査材料であればどのよ
うなものでもよいが、血液あるいは穿刺液等から分離し
た細胞を用いることが好ましい。試料のスライドグラス
への添加方法は、常法によりピペットで分注するか、ま
たはサイトスピン等の自動細胞収集装置を用いてもよい
［井上和秋ら：細胞診の手引き（井上勝一、中村仁志夫
編）５６頁、北海道大学図書刊行会、１９９５年刊］。
試料に組織切片等を用いるときは、その凍結乾燥片を常
法により作成し、スライドグラス上に設置する［勝山好
ら：臨床検査法提要（金井正光編）１２１３頁、金原出
版、１９９５年刊］。
液、組織切片等生体由来の臨床検査材料であればどのよ
うなものでもよいが、血液あるいは穿刺液等から分離し
た細胞を用いることが好ましい。試料のスライドグラス
への添加方法は、常法によりピペットで分注するか、ま
たはサイトスピン等の自動細胞収集装置を用いてもよい
［井上和秋ら：細胞診の手引き（井上勝一、中村仁志夫
編）５６頁、北海道大学図書刊行会、１９９５年刊］。
試料に組織切片等を用いるときは、その凍結乾燥片を常
法により作成し、スライドグラス上に設置する［勝山好
ら：臨床検査法提要（金井正光編）１２１３頁、金原出
版、１９９５年刊］。
【０００８】試料のスライドグラスへの固着方法は、試
料を設置後、直ちに冷風にて固着乾燥するのが好ましい
が、必要によりポリエチレングリコール等を含有した細
胞固定剤を用いて固着化してもよい。市販の細胞固定剤
としては、サイトキープ（商品名：日本商事製）が挙げ
られる。試料をスライドグラス上に固着した状態で、試
料中のテロメラーゼによるテロメラーゼ基質の延長反応
を行うとは、（１）の工程で得たスライドグラス上の試
料にテロメラーゼ基質の蛍光標識化体およびデオキシヌ
クレオシドトリフェスフェーツを添加することによりテ
ロメラーゼ基質延長反応を行うことをいう。
料を設置後、直ちに冷風にて固着乾燥するのが好ましい
が、必要によりポリエチレングリコール等を含有した細
胞固定剤を用いて固着化してもよい。市販の細胞固定剤
としては、サイトキープ（商品名：日本商事製）が挙げ
られる。試料をスライドグラス上に固着した状態で、試
料中のテロメラーゼによるテロメラーゼ基質の延長反応
を行うとは、（１）の工程で得たスライドグラス上の試
料にテロメラーゼ基質の蛍光標識化体およびデオキシヌ
クレオシドトリフェスフェーツを添加することによりテ
ロメラーゼ基質延長反応を行うことをいう。
【０００９】本発明においてテロメラーゼ（EC2.7.7.3
1）とは、自己複製能を持つ線状染色体に必要な末端構
造であるテロメアの繰り返し配列（テロメア反復配列）
の合成に関与する酵素を意味する。テロメアとは、直鎖
状染色体の末端部分を意味し、テロメア反復配列とは、
テロメアに局在化している特定塩基配列の反復配列を表
す。
1）とは、自己複製能を持つ線状染色体に必要な末端構
造であるテロメアの繰り返し配列（テロメア反復配列）
の合成に関与する酵素を意味する。テロメアとは、直鎖
状染色体の末端部分を意味し、テロメア反復配列とは、
テロメアに局在化している特定塩基配列の反復配列を表
す。
【００１０】テロメラーゼ基質は、テロメリック配列を
含まないオリゴヌクレオチドを用いることが好ましく、
5'-GTTAGGGTTAGGGTTAGG-3'、5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGG-3'
等も用いることができるが、とりわけ好ましくはＴＳプ
ライマー（5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'）を用いる。
含まないオリゴヌクレオチドを用いることが好ましく、
5'-GTTAGGGTTAGGGTTAGG-3'、5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGG-3'
等も用いることができるが、とりわけ好ましくはＴＳプ
ライマー（5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'）を用いる。
【００１１】テロメラーゼ基質の蛍光標識化体とは、蛍
光標識を結合したテロメラーゼ基質を含むテロメラーゼ
基質を意味する。蛍光標識を結合したテロメラーゼ基質
はテロメラーゼ基質に、蛍光ホスフォアミダイト（クロ
ーンテック社製）等の蛍光試薬を結合させることにより
得ることができる（牧野ら、ＰＣＲ方法と応用、１９９
２年、コールドスプリングハーバーラボラトリー社
刊）。
光標識を結合したテロメラーゼ基質を含むテロメラーゼ
基質を意味する。蛍光標識を結合したテロメラーゼ基質
はテロメラーゼ基質に、蛍光ホスフォアミダイト（クロ
ーンテック社製）等の蛍光試薬を結合させることにより
得ることができる（牧野ら、ＰＣＲ方法と応用、１９９
２年、コールドスプリングハーバーラボラトリー社
刊）。
【００１２】デオキシヌクレオシドトリフォスフェーツ
とは、デオキシヌクレオシドトリフォスフェートの混合
物を意味し、デオキシアデノシントリフォスフェート、
デオキシグアノシントリフォスフェート、デオキシシチ
ジントリフォスフェートおよびデオキシチミジントリフ
ォスフェートからなる。
とは、デオキシヌクレオシドトリフォスフェートの混合
物を意味し、デオキシアデノシントリフォスフェート、
デオキシグアノシントリフォスフェート、デオキシシチ
ジントリフォスフェートおよびデオキシチミジントリフ
ォスフェートからなる。
【００１３】テロメラーゼ基質延長反応とは、試料中の
テロメラーゼによりテロメラーゼ基質の蛍光体を基点と
するテロメア反復配列を合成する反応をいう。より詳細
には、細胞中のテロメラーゼによりテロメラーゼ基質の
蛍光体にデオキシアデノシントリフォスフェート等の各
デオキシヌクレオシドトリフォスフェートがテロメア反
復配列に従って結合される結果、テロメラーゼ基質の延
長体が合成されることをいう。
テロメラーゼによりテロメラーゼ基質の蛍光体を基点と
するテロメア反復配列を合成する反応をいう。より詳細
には、細胞中のテロメラーゼによりテロメラーゼ基質の
蛍光体にデオキシアデノシントリフォスフェート等の各
デオキシヌクレオシドトリフォスフェートがテロメア反
復配列に従って結合される結果、テロメラーゼ基質の延
長体が合成されることをいう。
【００１４】テロメラーゼ基質延長反応は、ライトの方
法（ライトら、ヌクレオシド アシド リサーチ２３
巻、３７９４頁、１９９５年）等に記載されているが、
本発明はスライドグラス上の試料で該反応を行うことを
留意して以下の手法で行えばよい。スライドグラス上の
試料にテロメラーゼ基質の蛍光標識化体およびデオキシ
ヌクレオシドトリフォスフェーツを含んだ緩衝液を添加
した後、試料に蓋をし、インキュベートする。この際、
緩衝液中に塩基結合酵素連鎖反応に用いる耐熱性（Ｔａ
ｑ）塩基結合酵素またはプライマーのどちらか一方を加
えておくことが好ましい。また、インキュベーションは
暗箱中で行うことが好ましい。
法（ライトら、ヌクレオシド アシド リサーチ２３
巻、３７９４頁、１９９５年）等に記載されているが、
本発明はスライドグラス上の試料で該反応を行うことを
留意して以下の手法で行えばよい。スライドグラス上の
試料にテロメラーゼ基質の蛍光標識化体およびデオキシ
ヌクレオシドトリフォスフェーツを含んだ緩衝液を添加
した後、試料に蓋をし、インキュベートする。この際、
緩衝液中に塩基結合酵素連鎖反応に用いる耐熱性（Ｔａ
ｑ）塩基結合酵素またはプライマーのどちらか一方を加
えておくことが好ましい。また、インキュベーションは
暗箱中で行うことが好ましい。
【００１５】緩衝液とは、濃度１〜１００ｍＭで、ｐＨ
６〜９、好ましくはｐＨ７．５〜８．５の緩衝液であれ
ばどのようなものでもよいが、リン酸緩衝液、トリス塩
酸緩衝液等を用いることが好ましい。該緩衝液には塩化
カリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化マグ
ネシウム等の金属塩、ポリオキシエチレン ソルビタン
モノラウレート（以下、ツイン２０という）等の界面活
性剤、エチレングリコール ビス（２−アミノエチルエ
チル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラアセテックアシド
（以下、ＥＧＴＡという）等のキレート剤、Ｔ４ジーン
３２プロテイン、牛血清アルブミン等の蛋白質を添加し
てもよい。試料に蓋をするとは、スライドグラス上の試
料をカバーグラスまたはパラフィルム等で覆うことをい
う。
６〜９、好ましくはｐＨ７．５〜８．５の緩衝液であれ
ばどのようなものでもよいが、リン酸緩衝液、トリス塩
酸緩衝液等を用いることが好ましい。該緩衝液には塩化
カリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化マグ
ネシウム等の金属塩、ポリオキシエチレン ソルビタン
モノラウレート（以下、ツイン２０という）等の界面活
性剤、エチレングリコール ビス（２−アミノエチルエ
チル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラアセテックアシド
（以下、ＥＧＴＡという）等のキレート剤、Ｔ４ジーン
３２プロテイン、牛血清アルブミン等の蛋白質を添加し
てもよい。試料に蓋をするとは、スライドグラス上の試
料をカバーグラスまたはパラフィルム等で覆うことをい
う。
【００１６】プライマーとしては、塩基結合酵素連鎖反
応にＰＣＲ反応を用いる場合は、不完全なテロメリック
反復配列（5'-CCCTTA-3'）と完全なテロメリック反復配
列（5'-CCCTAA-3'）から構成されるものが用いられ、３
個の不完全なテロメリック反復配列と１個の完全なテロ
メリック反復配列から構成される蛍光標識化ＣＸリバー
スプライマー（5'-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3'）を用
いることが好ましい。また、塩基結合酵素連鎖反応にリ
ガーゼ連鎖（ＬＣＲ）反応を用いる場合は、Ｃリッチテ
ロメリック配列（5'-CTAACC-3'）から構成されるものが
用いられ、蛍光標識化ＡＣＴプライマー（5'-GCGCGGCTA
ACCCTAACCCTAACC-3'）を用いることが好ましい。
応にＰＣＲ反応を用いる場合は、不完全なテロメリック
反復配列（5'-CCCTTA-3'）と完全なテロメリック反復配
列（5'-CCCTAA-3'）から構成されるものが用いられ、３
個の不完全なテロメリック反復配列と１個の完全なテロ
メリック反復配列から構成される蛍光標識化ＣＸリバー
スプライマー（5'-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3'）を用
いることが好ましい。また、塩基結合酵素連鎖反応にリ
ガーゼ連鎖（ＬＣＲ）反応を用いる場合は、Ｃリッチテ
ロメリック配列（5'-CTAACC-3'）から構成されるものが
用いられ、蛍光標識化ＡＣＴプライマー（5'-GCGCGGCTA
ACCCTAACCCTAACC-3'）を用いることが好ましい。
【００１７】該プライマーまたは本明細書に記載された
以下のオリゴヌクレオチド・プライマー等は、ＤＮＡ自
動合成機等を用いる常法により得ることができる。蛍光
標識化ＣＸリバースプライマーまたは蛍光標識化ＡＣＴ
プライマーとは、蛍光標識を結合したＣＸリバースプラ
イマーまたはＡＣＴプライマーを意味する。蛍光標識を
結合したＣＸリバースプライマーまたはＡＣＴプライマ
ーはＣＸリバースプライマーまたはＡＣＴプライマー
に、蛍光ホスフォアミダイト（クローンテック社製）等
の蛍光試薬を結合させることにより得ることができる
（牧野ら、ＰＣＲ方法と応用、１９９２年、コールドス
プリングハーバーラボラトリー刊）。
以下のオリゴヌクレオチド・プライマー等は、ＤＮＡ自
動合成機等を用いる常法により得ることができる。蛍光
標識化ＣＸリバースプライマーまたは蛍光標識化ＡＣＴ
プライマーとは、蛍光標識を結合したＣＸリバースプラ
イマーまたはＡＣＴプライマーを意味する。蛍光標識を
結合したＣＸリバースプライマーまたはＡＣＴプライマ
ーはＣＸリバースプライマーまたはＡＣＴプライマー
に、蛍光ホスフォアミダイト（クローンテック社製）等
の蛍光試薬を結合させることにより得ることができる
（牧野ら、ＰＣＲ方法と応用、１９９２年、コールドス
プリングハーバーラボラトリー刊）。
【００１８】耐熱性（Ｔａｑ）塩基結合酵素は、塩基結
合酵素連鎖反応にＰＣＲ反応を用いる場合はＴａｑ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（E.C.2.7.7.7）を表し、ＬＣＲ反応
を用いる場合はＴａｑ ＤＮＡリガーゼ（E.C.6.5.1.
1）を表す。試料をスライドグラス上に固着した状態
で、得られた延長反応生成物を塩基結合酵素連鎖反応に
付すとは、上記（２）の工程で既に耐熱性塩基酵素を添
加している場合はプライマーを、既にプライマーを添加
している場合は耐熱性塩基酵素を、（２）の工程を終え
たスライドグラス上の試料に添加することにより、塩基
結合酵素、（２）の工程で得られたテロメラーゼ基質延
長反応の反応生成物、およびプライマーが混合され、塩
基結合酵素連鎖反応が行われることをいう。塩基結合酵
素連鎖反応としては、ＰＣＲ反応またはＬＣＲ反応が挙
げられ、該反応のいずれかひとつを選択することによ
り、耐熱性塩基結合酵素およびプライマーが上記のよう
に決定される。
合酵素連鎖反応にＰＣＲ反応を用いる場合はＴａｑ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（E.C.2.7.7.7）を表し、ＬＣＲ反応
を用いる場合はＴａｑ ＤＮＡリガーゼ（E.C.6.5.1.
1）を表す。試料をスライドグラス上に固着した状態
で、得られた延長反応生成物を塩基結合酵素連鎖反応に
付すとは、上記（２）の工程で既に耐熱性塩基酵素を添
加している場合はプライマーを、既にプライマーを添加
している場合は耐熱性塩基酵素を、（２）の工程を終え
たスライドグラス上の試料に添加することにより、塩基
結合酵素、（２）の工程で得られたテロメラーゼ基質延
長反応の反応生成物、およびプライマーが混合され、塩
基結合酵素連鎖反応が行われることをいう。塩基結合酵
素連鎖反応としては、ＰＣＲ反応またはＬＣＲ反応が挙
げられ、該反応のいずれかひとつを選択することによ
り、耐熱性塩基結合酵素およびプライマーが上記のよう
に決定される。
【００１９】より具体的には、テロメラーゼ基質延長反
応生成物とプライマーとを、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
を用いて増幅させるＰＣＲ反応に付する場合（サイキ
ら、サイエンス、２３９巻、４８７頁、１９８８年；キ
ムら、サイエンス、２６６巻、２０１１頁、１９９４
年）、またはテロメラーゼ基質延長反応生成物とプライ
マーとを、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼを用いて増幅させる
ＬＣＲ反応に付する場合（バラニーら、プロシーデング
オブ ナショナルアカデミー オブ サイエンス ８
７巻、１８７４頁、１９８７）が挙げられる。前記のよ
うに耐熱性塩基結合酵素およびプライマーが適当に組み
合わされることにより塩基連結酵素連鎖反応が開始され
るが、スライドグラス上で該反応を行うには、市販の自
動ＰＣＲシステム（商品名オムニスライド、ハイバイド
社製）等を用いることが好ましい。
応生成物とプライマーとを、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
を用いて増幅させるＰＣＲ反応に付する場合（サイキ
ら、サイエンス、２３９巻、４８７頁、１９８８年；キ
ムら、サイエンス、２６６巻、２０１１頁、１９９４
年）、またはテロメラーゼ基質延長反応生成物とプライ
マーとを、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼを用いて増幅させる
ＬＣＲ反応に付する場合（バラニーら、プロシーデング
オブ ナショナルアカデミー オブ サイエンス ８
７巻、１８７４頁、１９８７）が挙げられる。前記のよ
うに耐熱性塩基結合酵素およびプライマーが適当に組み
合わされることにより塩基連結酵素連鎖反応が開始され
るが、スライドグラス上で該反応を行うには、市販の自
動ＰＣＲシステム（商品名オムニスライド、ハイバイド
社製）等を用いることが好ましい。
【００２０】塩基連結酵素連鎖反応終了後、スライドグ
ラスを洗浄液で洗浄した後、蛍光顕微鏡を用いて、試料
中のテロメラーゼ活性を確認することができる。洗浄液
としては、生理食塩水、精製水等どのようなものでもよ
い。また、マクバイン緩衝液とグリセリンを混合したも
ので試料を封入することが好ましい。蛍光顕微鏡は市販
のものでよい。
ラスを洗浄液で洗浄した後、蛍光顕微鏡を用いて、試料
中のテロメラーゼ活性を確認することができる。洗浄液
としては、生理食塩水、精製水等どのようなものでもよ
い。また、マクバイン緩衝液とグリセリンを混合したも
ので試料を封入することが好ましい。蛍光顕微鏡は市販
のものでよい。
【００２１】以下に、本発明方法の詳細な説明を行う。
血液等生体から採取した検体から常法により遠心分離法
等を用いて細胞を採取する。得られた細胞を細胞培養液
等で洗浄した後、サイトスピン等の細胞分注器を用いて
無蛍光スライドグラスに静置する［井上和秋ら：細胞診
の手引き（井上勝一、中村仁志夫編）５６頁、北海道大
学図書刊行会、１９９５年刊］。試料を風乾させ試料を
固定化する。
血液等生体から採取した検体から常法により遠心分離法
等を用いて細胞を採取する。得られた細胞を細胞培養液
等で洗浄した後、サイトスピン等の細胞分注器を用いて
無蛍光スライドグラスに静置する［井上和秋ら：細胞診
の手引き（井上勝一、中村仁志夫編）５６頁、北海道大
学図書刊行会、１９９５年刊］。試料を風乾させ試料を
固定化する。
【００２２】１〜１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
＝６〜９）に１〜１０００ｐｍｏｌの蛍光標識化ＴＳプ
ライマー（5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'）、１〜３００ｍ
Ｍのデオキシヌクレオシドトリフォスフェーツおよび
０．１〜２０ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含
有させスライドグラス上の試料に添加する。スライドグ
ラスをパラフィルムで覆い、１０〜５０℃、好ましくは
２０〜４０℃、とりわけ好ましくは２５℃で、７分〜１
時間３０分、好ましくは１０分〜１時間、とりわけ好ま
しくは３０分〜１時間、最も好ましくは１時間暗箱中で
インキュベートする。
＝６〜９）に１〜１０００ｐｍｏｌの蛍光標識化ＴＳプ
ライマー（5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'）、１〜３００ｍ
Ｍのデオキシヌクレオシドトリフォスフェーツおよび
０．１〜２０ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含
有させスライドグラス上の試料に添加する。スライドグ
ラスをパラフィルムで覆い、１０〜５０℃、好ましくは
２０〜４０℃、とりわけ好ましくは２５℃で、７分〜１
時間３０分、好ましくは１０分〜１時間、とりわけ好ま
しくは３０分〜１時間、最も好ましくは１時間暗箱中で
インキュベートする。
【００２３】ＴＳプライマー延長反応が終了した後、１
〜３００ｐｍｏｌ、好ましくは５０〜２００ｐｍｏｌ、
とりわけ好ましくは１００ｐｍｏｌの蛍光標識化ＣＸリ
バースプライマー（5'-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3'）
を添加する。これによりＰＣＲ反応が開始されるが、Ｐ
ＣＲ反応の熱反応サイクルは、例えば９０〜１００℃の
温度で１〜１２０秒間、４０〜６０℃の温度で１〜１２
０秒間、６０〜８０℃の温度で１〜２４０秒間のサイク
ルを１〜５０回行えばよい。スライドグラス上でＰＣＲ
反応を行うため、上記のオムニスライド等を用いること
が好ましい。
〜３００ｐｍｏｌ、好ましくは５０〜２００ｐｍｏｌ、
とりわけ好ましくは１００ｐｍｏｌの蛍光標識化ＣＸリ
バースプライマー（5'-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3'）
を添加する。これによりＰＣＲ反応が開始されるが、Ｐ
ＣＲ反応の熱反応サイクルは、例えば９０〜１００℃の
温度で１〜１２０秒間、４０〜６０℃の温度で１〜１２
０秒間、６０〜８０℃の温度で１〜２４０秒間のサイク
ルを１〜５０回行えばよい。スライドグラス上でＰＣＲ
反応を行うため、上記のオムニスライド等を用いること
が好ましい。
【００２４】ＰＣＲ反応終了後、スライドグラスを洗浄
液で洗浄した後、蛍光顕微鏡を用いて、試料中のテロメ
ラーゼ活性を確認することができる。また、本発明のテ
ロメラーゼ活性測定試薬は、蛍光標識化ＣＸリバースプ
ライマー、デオキシヌクレオシドトリフォスフェート、
蛍光標識化ＴＳプライマーおよびＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼの他に、スライドグラス、試料の固定具、Ｔ４ジー
ン３２プロテイン等を含んでいてもよい。さらに、前記
の緩衝液、洗浄液またはそれに含まれる前記の各種添加
剤を含んでいてもよい。
液で洗浄した後、蛍光顕微鏡を用いて、試料中のテロメ
ラーゼ活性を確認することができる。また、本発明のテ
ロメラーゼ活性測定試薬は、蛍光標識化ＣＸリバースプ
ライマー、デオキシヌクレオシドトリフォスフェート、
蛍光標識化ＴＳプライマーおよびＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼの他に、スライドグラス、試料の固定具、Ｔ４ジー
ン３２プロテイン等を含んでいてもよい。さらに、前記
の緩衝液、洗浄液またはそれに含まれる前記の各種添加
剤を含んでいてもよい。
【００２５】
実施例１ ＨＥＬ細胞を採取する。得られた細胞をリン酸緩衝液
（ｐＨ６.４）で洗浄した後、サイトスピン（５００ｒ
ｐｍ、３分）を用いて無蛍光スライドグラス上へ添加し
た。試料をすぐに風乾させ、試料を固定化した。
（ｐＨ６.４）で洗浄した後、サイトスピン（５００ｒ
ｐｍ、３分）を用いて無蛍光スライドグラス上へ添加し
た。試料をすぐに風乾させ、試料を固定化した。
【００２６】２５μｌの２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ６〜９）［塩化マグネシウム１．５ｍＭ、塩化カ
リウム６３ｍＭ、ツイン２０（商品名）０.０５％、Ｅ
ＧＴＡ１μＭ、Ｔ４ジーン３２プロテイン１μｇ／ｍｌ
（ベーリンガーマンハイム社製）、牛血清アルブミン
（０.１ｍｇ／ｍｌ）含有］に、１００ｐｍｏｌの蛍光
標識化ＴＳプライマー（5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'）
［ファルマバイオテック社製〕、５０ｍＭのデオキシヌ
クレオシドトリフォスフェーツおよび２ユニットのＴａ
ｑ ＤＮＡポリメラーゼを含有させ、スライドグラス上
の試料に添加した。スライドグラスをパラフィルムでお
おい、２５℃で、３０分間暗箱中でインキュベートし
た。
（ｐＨ６〜９）［塩化マグネシウム１．５ｍＭ、塩化カ
リウム６３ｍＭ、ツイン２０（商品名）０.０５％、Ｅ
ＧＴＡ１μＭ、Ｔ４ジーン３２プロテイン１μｇ／ｍｌ
（ベーリンガーマンハイム社製）、牛血清アルブミン
（０.１ｍｇ／ｍｌ）含有］に、１００ｐｍｏｌの蛍光
標識化ＴＳプライマー（5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'）
［ファルマバイオテック社製〕、５０ｍＭのデオキシヌ
クレオシドトリフォスフェーツおよび２ユニットのＴａ
ｑ ＤＮＡポリメラーゼを含有させ、スライドグラス上
の試料に添加した。スライドグラスをパラフィルムでお
おい、２５℃で、３０分間暗箱中でインキュベートし
た。
【００２７】ＴＳプライマー延長反応が終了した後、２
５μｌの１００ｐｍｏｌの蛍光標識化ＣＸリバースプラ
イマー（5'-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3')をスライド
グラス上の試料に添加した。これによりＰＣＲ反応が開
始されるが、ＰＣＲは上記のオムニスライド中で行っ
た。熱サイクルは９４℃の温度で３０秒間、５０℃の温
度で３０秒間、７２℃の温度で９０秒間のサイクルを３
０回行った。ＰＣＲ反応終了後、スライドグラスを流水
にて洗浄した後、マクバイン緩衝液／グリセリン溶液
（１：１＝ｖ／ｖ）で封入した。標識化した細胞を蛍光
顕微鏡にＧフィルターを用いて、試料中のテロメラーゼ
活性を確認した。
５μｌの１００ｐｍｏｌの蛍光標識化ＣＸリバースプラ
イマー（5'-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3')をスライド
グラス上の試料に添加した。これによりＰＣＲ反応が開
始されるが、ＰＣＲは上記のオムニスライド中で行っ
た。熱サイクルは９４℃の温度で３０秒間、５０℃の温
度で３０秒間、７２℃の温度で９０秒間のサイクルを３
０回行った。ＰＣＲ反応終了後、スライドグラスを流水
にて洗浄した後、マクバイン緩衝液／グリセリン溶液
（１：１＝ｖ／ｖ）で封入した。標識化した細胞を蛍光
顕微鏡にＧフィルターを用いて、試料中のテロメラーゼ
活性を確認した。
【００２８】顕微鏡で確認したＨＥＬ細胞由来の蛍光シ
グナルがテロメラーゼ活性に依存するものであるか否か
を確認するため、。検鏡後細胞膜を破壊し、溶出体をゲ
ル電気泳動に付した後、６Ｍの尿素を含んだ６％アクリ
ルアミドゲル（商品名 ロングレンジャー；ＡＴバイオ
ケム社製）に封入し、電気泳動を行った。ゲル中の蛍光
泳動像はフラグメント マネージャープログラム（ファ
ルマシア バイオテク社製）で自動的に解析した（ＷＯ
９５／１３３８１）。
グナルがテロメラーゼ活性に依存するものであるか否か
を確認するため、。検鏡後細胞膜を破壊し、溶出体をゲ
ル電気泳動に付した後、６Ｍの尿素を含んだ６％アクリ
ルアミドゲル（商品名 ロングレンジャー；ＡＴバイオ
ケム社製）に封入し、電気泳動を行った。ゲル中の蛍光
泳動像はフラグメント マネージャープログラム（ファ
ルマシア バイオテク社製）で自動的に解析した（ＷＯ
９５／１３３８１）。
【００２９】テロメラーゼ活性に由来する６塩基対の断
続的なピークが観察された。すなわち、前記の細胞内テ
ロメラーゼ活性の測定方法において観察された細胞の蛍
光ピークが細胞内のテロメラーゼにより合成されたＰＣ
Ｒ産物に由来することが確認された。また、ＰＣＲ処理
のみを施さなかったサンプル、およびＴＳプライマー延
長反応のみを施さなかったサンプルにおいては蛍光の減
弱を認めたことから、蛍光ピークが細胞内のテロメラー
ゼにより合成されたＰＣＲ産物に由来することが裏付け
られた。以上、本発明の細胞内テロメラーゼ測定方法に
より、細胞、組織切片等のテロメラーゼ活性が簡単に測
定できることが確認された。
続的なピークが観察された。すなわち、前記の細胞内テ
ロメラーゼ活性の測定方法において観察された細胞の蛍
光ピークが細胞内のテロメラーゼにより合成されたＰＣ
Ｒ産物に由来することが確認された。また、ＰＣＲ処理
のみを施さなかったサンプル、およびＴＳプライマー延
長反応のみを施さなかったサンプルにおいては蛍光の減
弱を認めたことから、蛍光ピークが細胞内のテロメラー
ゼにより合成されたＰＣＲ産物に由来することが裏付け
られた。以上、本発明の細胞内テロメラーゼ測定方法に
より、細胞、組織切片等のテロメラーゼ活性が簡単に測
定できることが確認された。
【００３０】実施例２ 表１に示した各種癌細胞中のテロメラーゼ活性を測定す
るため、各細胞５００ｃｅｌｌｓを試料として用い、実
施例１に示した方法に準じて、細胞内テロメラーゼ活性
の測定を行った。測定は検鏡により、細胞の蛍光強度
を、強陽性、陽性、陰性の３種に分類し、視野内の細胞
でこれらに該当する蛍光強度を持つ個数を測定し、視野
中の細胞総数に対する割合を陽性率とした。その結果を
表１に示す。
るため、各細胞５００ｃｅｌｌｓを試料として用い、実
施例１に示した方法に準じて、細胞内テロメラーゼ活性
の測定を行った。測定は検鏡により、細胞の蛍光強度
を、強陽性、陽性、陰性の３種に分類し、視野内の細胞
でこれらに該当する蛍光強度を持つ個数を測定し、視野
中の細胞総数に対する割合を陽性率とした。その結果を
表１に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】実施例３ ＨＥＬ細胞の代わりにＫ５６２細胞を用い、暗箱中での
インキュベーション時間を１５分、３０分、１時間とす
る以外は、実施例１および実施例２と同様の方法によ
り、視野中の細胞のテロメラーゼ活性陽性率および蛍光
強度を測定した。結果を表２に示す。
インキュベーション時間を１５分、３０分、１時間とす
る以外は、実施例１および実施例２と同様の方法によ
り、視野中の細胞のテロメラーゼ活性陽性率および蛍光
強度を測定した。結果を表２に示す。
【００３３】
【表２】
【００３４】
【発明の効果】本発明により、臨床診断上重要なテロメ
ラーゼ活性の測定に有用な測定方法および試薬が提供さ
れる。本発明は臨床医学上多用される癌の細胞診断に適
用可能な簡便な方法であるため、診療検査、病理検査等
に活用される。
ラーゼ活性の測定に有用な測定方法および試薬が提供さ
れる。本発明は臨床医学上多用される癌の細胞診断に適
用可能な簡便な方法であるため、診療検査、病理検査等
に活用される。
【００３５】
【００３６】配列番号：１ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列：ＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡ ＧＧＧＴＴＡＧＧ
【００３７】配列番号：２ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列：ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ ＧＧＴＴＡＧＧＧ
【００３８】配列番号：３ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列：ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡ ＧＣＡＧＡＧＴＴ
【００３９】配列番号：４ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列：ＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴ ＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣ ＣＴＡＡ
【００４０】配列番号：５ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列：ＧＣＧＣＧＧＣＴＡＡ ＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴ ＡＡＣＣ
Claims (5)
- 【請求項１】 （１）スライドグラス上に試料を固着す
る工程、（２）試料をスライドグラス上に固着した状態
で、試料中のテロメラーゼによるテロメラーゼ基質の延
長反応を行う工程、および（３）試料をスライドグラス
上に固着した状態で、得られた延長反応生成物を塩基結
合連鎖反応に付す工程からなるテロメラーゼ活性の測定
方法。 - 【請求項２】 スライドグラス上に試料を固着する工程
が、試料をスライドグラスに設置後、直ちに冷風にて固
着乾燥する工程からなる請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 試料をスライドグラス上に固着した状態
で、試料中のテロメラーゼによるテロメラーゼ基質の延
長反応を行う工程が、スライドグラス上の試料にテロメ
ラーゼ基質の蛍光標識化体およびデオキシトリフォスフ
ェーツを含んだ緩衝液を添加した後、暗箱中でインキュ
ベーションを行う工程からなる請求項１または２記載の
方法。 - 【請求項４】 試料をスライドグラス上に固着した状態
で、得られた反応生成物を塩基結合酵素連鎖反応に付す
工程が、スライドグラス上の試料に耐熱性塩基酵素およ
びプライマーを添加することにより、塩基結合酵素、テ
ロメラーゼ基質延長反応生成物およびプライマーが混合
され、塩基結合酵素連鎖反応が行われる工程からなる請
求項１〜３いずれか１項記載の方法。 - 【請求項５】 テロメラーゼ活性の測定法が蛍光顕微鏡
を用いた目視法である請求項１〜４いずれか１項記載の
方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13695997A JPH1052300A (ja) | 1996-06-03 | 1997-05-27 | 細胞内テロメラーゼ活性の測定法 |
| CA 2206694 CA2206694A1 (en) | 1996-06-03 | 1997-06-02 | A method of determining intracellular telomerase activity |
| EP97108778A EP0811693A3 (en) | 1996-06-03 | 1997-06-02 | A method of determining intracellular telomerase activity |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8-140534 | 1996-06-03 | ||
| JP14053496 | 1996-06-03 | ||
| JP13695997A JPH1052300A (ja) | 1996-06-03 | 1997-05-27 | 細胞内テロメラーゼ活性の測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1052300A true JPH1052300A (ja) | 1998-02-24 |
Family
ID=26470401
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13695997A Pending JPH1052300A (ja) | 1996-06-03 | 1997-05-27 | 細胞内テロメラーゼ活性の測定法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0811693A3 (ja) |
| JP (1) | JPH1052300A (ja) |
| CA (1) | CA2206694A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006001174A1 (ja) * | 2004-06-24 | 2006-01-05 | Riken | 生体組織切片を用いるテロメラーゼ活性の測定方法 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9717458D0 (en) * | 1997-08-18 | 1997-10-22 | Queen Mary & Westfield College | Telomerase assay |
| US6306589B1 (en) | 1998-05-27 | 2001-10-23 | Vysis, Inc. | Biological assays for analyte detection |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5629154A (en) * | 1993-11-12 | 1997-05-13 | Geron Corporation | Telomerase activity assays |
| WO1994000598A1 (en) * | 1992-06-19 | 1994-01-06 | Northwestern University | Method of detecting amplified nucleic acid sequences in cells by flow cytometry |
| US5364790A (en) * | 1993-02-16 | 1994-11-15 | The Perkin-Elmer Corporation | In situ PCR amplification system |
| HUT78054A (hu) * | 1994-07-07 | 1999-07-28 | Geron Corporation | Emlőseredetű telomeráz RNS-összetevője |
| JPH11507839A (ja) * | 1995-06-07 | 1999-07-13 | ジェロン コーポレイション | テロメラーゼ活性検定 |
-
1997
- 1997-05-27 JP JP13695997A patent/JPH1052300A/ja active Pending
- 1997-06-02 EP EP97108778A patent/EP0811693A3/en not_active Withdrawn
- 1997-06-02 CA CA 2206694 patent/CA2206694A1/en not_active Abandoned
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006001174A1 (ja) * | 2004-06-24 | 2006-01-05 | Riken | 生体組織切片を用いるテロメラーゼ活性の測定方法 |
| JP2006006169A (ja) * | 2004-06-24 | 2006-01-12 | Institute Of Physical & Chemical Research | 生体組織切片を用いるテロメラーゼ活性の測定方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2206694A1 (en) | 1997-12-03 |
| EP0811693A3 (en) | 2001-03-21 |
| EP0811693A2 (en) | 1997-12-10 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
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|
| A02 | Decision of refusal |
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