JPH1054828A - 液体クロマトグラフィー用充填剤及びそれを用いた分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ボロン酸誘導体を特異的に保持し得ると共
に、逆相液体クロマトグラフィー用充填剤としても用い
られ得る、液体クロマトグラフィー用充填剤を提供す
る。また、それを用いてボロン酸誘導体を有利に分離す
る方法、或いは逆相液体クロマトグラフィー手法による
分離方法を提供する。 【解決手段】 液体クロマトグラフィー用充填剤を、芳
香環上の少なくとも一組の隣合う炭素原子に水酸基が結
合せしめられている芳香族官能基にて化学修飾された多
孔性担体から、構成する。また、そのような液体クロマ
トグラフィー用充填剤を用いて、液体クロマトグラフィ
ー手法によりボロン酸誘導体を分離したり、或いは逆相
液体クロマトグラフィー手法により所定の化合物を分離
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】本発明は、新規な液体クロマトグラフィー
用充填剤及びそれを用いた分離方法に係り、特に逆相液
体クロマトグラフィー用充填剤による分離特性と、ボロ
ン酸誘導体だけを特異的に保持する分離特性を併せ有
し、更に逆相液体クロマトグラフィーにおいて、従来の
アルキル基結合型充填剤では分離出来ない化合物の分離
をも可能とする液体クロマトグラフィー用充填剤と、そ
のような充填剤を用いた分離方法に関するものである。

【０００２】

【背景技術】従来から、液体クロマトグラフィー手法
は、広範囲の分離条件の適用が可能であり、試料を高温
にさらす必要もなく、室温程度の低い温度条件下でも、
化合物の分離が可能であると共に、高い分離能を発揮し
得るところから、生体関連物質から有機化合物の全般に
至る、種々の化合物の精製、分離等に広く利用されてき
ている。そして、この液体クロマトグラフィー手法によ
る物質の分離特性は、カラムに充填される充填剤の特性
によって大きく影響されるところから、分離対象に合わ
せて充填剤を選択することによって、様々な化合物の分
離を行なうことが可能となるのである。

【０００３】ところで、一般に、そのような液体クロマ
トグラフィー手法に用いられる充填剤としては、アルキ
ル基を有する官能基で化学修飾されたシリカゲルからな
るアルキル基結合型シリカゲル充填剤に代表される、逆
相液体クロマトグラフィー（以下、逆相クロマトグラフ
ィーと言う）用充填剤が、広く用いられているが、この
逆相クロマトグラフィー用充填剤は、目的とする化合物
を、主に疎水性相互作用によって保持して、その相互作
用の違いによって分離するものであり、生体関連物質か
ら炭化水素化合物まで、非常に広範囲に亘る化合物を分
離するために適用されている。

【０００４】しかしながら、かかる逆相クロマトグラフ
ィー用充填剤は、種々の化合物を保持し得る汎用性の高
い充填剤であるが故に、試料中に存在する目的とする化
合物と、それ以外の化合物とを同程度に保持する場合が
あり、該目的化合物のみを保持することが困難となるこ
とが少なくない。従って、従来の逆相クロマトグラフィ
ー用充填剤にあっては、それを用いて、生体関連試料の
如き、非常に多くの夾雑物を含む試料中から、目的とす
る微量の有用成分を短時間で分離しようとする場合に
は、適切な分離が得られ難いという問題を有しているの
である。

【０００５】また、逆相クロマトグラフィー手法におい
て、従来から汎用されているアルキル基結合型充填剤を
用いる場合にあっては、そのような充填剤が主に疎水性
相互作用によって分離特性を発揮するものであるところ
から、疎水性の異なる化合物を効果的に分離し得るもの
の、疎水性の類似している化合物同士を分離することが
困難となるという問題が生じるのである。

【０００６】そこで、上述の如き逆相クロマトグラフィ
ー用充填剤の問題点を改善するために、目的とする化合
物だけを特異的に保持、分離し得る充填剤の開発が試み
られているが、充填剤によって、該目的化合物だけが特
異的に保持、分離されるためには、それら充填剤と目的
化合物とが特異的に相互作用することが必要となる。そ
して、そのように特異的に相互作用するものとしては、
酵素と基質、抗原と抗体、或いはホルモンとレセプター
等の生体関連物質同士の組合わせを例示することが出来
る。

【０００７】より詳細には、例えば、基質と酵素との相
互作用を利用する場合であって、分離したい目的化合物
が酵素であるとすると、先ず、分離したい酵素の基質が
固定相として担体に結合せしめられてなる充填剤を用意
する。次いで、この充填剤を用いて、通常の液体クロマ
トグラフィー手法の手順に従って、分離したい酵素を含
んだ試料溶液を分離する。そうすると、前記固定相たる
基質には、目的とする酵素だけが特異的に相互作用する
ものであるところから、目的とする酵素のみが充填剤に
保持され、その他の化合物は充填剤にて保持されない。
その状態で移動相溶媒を流し続けると、充填剤に保持さ
れた酵素を除く他の化合物は、カラムから除去されるこ
ととなる。そして、他の化合物のカラムからの除去が完
了した後に、適当な手段を用いて、前記酵素と基質との
相互作用を抑制することによって、目的とする酵素を分
離することが出来るのである。

【０００８】ところが、かくの如き目的とする化合物だ
けを特異的に保持し得る充填剤は、該目的化合物の分離
には最適である反面、目的化合物以外の化合物の分離に
は利用することが出来ないところから、充填剤としての
適用範囲が著しく狭くなり、利用価値が殆どなくなると
いう問題を有しているのである。

【０００９】このように、従来から用いられている逆相
クロマトグラフィー用充填剤にあっては、広範囲の化合
物の分離に適用し得る反面、特定の化合物を高い効率で
分離することが困難となるのであり、他方、特定の化合
物だけを特異的に保持し得るような充填剤にあっては、
特定の化合物を高い効率で分離することが可能となる反
面、分離可能な化合物の範囲が著しく狭くなるのであ
る。つまり、それら二種類の充填剤は、互いに相反する
特性を有するものであるところから、それぞれ一長一短
を有しているのである。従って、それら二種類の充填剤
の長所を併せ持つような充填剤は、従来の逆相クロマト
グラフィー用充填剤よりも、特定の化合物を高効率に分
離することが出来、また、特定の化合物だけを特異的に
保持し得る充填剤よりも、多くの化合物の分離に適用す
ることが可能となり、互いの問題点を克服し得る、優れ
た充填剤となることが期待されるのである。

【００１０】一方、近年におけるファインケミカル技術
の台頭により、分離精製が必要とされる化合物が増加し
ているが、ボロン酸基が結合せしめられたボロン酸誘導
体も、そのような分離精製の対象とされるようになって
来ている。即ち、このボロン酸誘導体は、ボロン酸基が
シスジオール構造に対して特異的な識別能を有するとこ
ろから、シスジオール構造を有する糖質を認識するため
のインターフェースとして利用されているものであり、
また、癌細胞へボロン酸誘導体を取り込ませて、そこへ
低エネルギー中性子を照射することで、特定の細胞を死
滅させる等の医学的用途にも利用されているものであ
る。そして、ボロン酸誘導体は、そのような先端技術に
利用されるに際して、その特性を充分に発揮し得るため
に、高度に精製されている必要がある。

【００１１】ところで、そのようなボロン酸誘導体を、
液体クロマトグラフィー手法を用いて精製する場合に
は、充填剤として、従来の逆相クロマトグラフィー用充
填剤が採用されることとなるのであるが、今後、ボロン
酸誘導体に関する研究が更に発展すると、逆相クロマト
グラフィー用充填剤では、充分に分離することが出来な
いボロン酸誘導体が出現することが予想されるため、ボ
ロン酸基との特異的な相互作用を利用して、ボロン酸誘
導体だけを高効率に分離する充填剤が必要であると考え
られる。

【００１２】しかしながら、ボロン酸誘導体のように、
生体内に存在しない化合物にあっては、酵素と基質等の
生体関連物質由来の相互作用を利用することが出来ない
ために、ボロン酸誘導体だけを特異的に保持する充填剤
は、現在までのところ、実現されていないというのが現
状である。

【００１３】従って、特異的にボロン酸誘導体を保持し
得て、従来の逆相クロマトグラフィー用充填剤よりも効
率的にボロン酸誘導体を分離することが可能であると共
に、ボロン酸誘導体のみだけでなく、ボロン酸誘導体以
外の化合物の分離にも適用することが可能であり、しか
も、逆相クロマトグラフィーで汎用されているアルキル
基結合型充填剤では分離出来ない化合物をも分離するこ
とが可能となる新規な充填剤の開発が望まれているので
ある。

【００１４】

【解決課題】ここにおいて、本発明は、かかる事情を背
景として為されたものであって、その課題とするところ
は、ボロン酸誘導体を特異的に保持し得ると共に、逆相
クロマトグラフィー用充填剤としても用いられ得る液体
クロマトグラフィー用充填剤を提供することにあり、ま
た、そのような優れた充填剤を用いて、ボロン酸誘導体
を有利に分離し得る分離方法、更には逆相クロマトグラ
フィー手法により、ボロン酸誘導体以外の様々な物質を
有利に分離し得る分離方法を提供することにある。

【００１５】

【解決手段】そして、本発明者等が、このような課題を
解決すべく、種々、官能基の探索と評価とを重ねた結
果、芳香環上の少なくとも一組の隣合う炭素原子に水酸
基が結合せしめられている芳香族官能基で化学修飾した
多孔性担体より構成されている充填剤を用いることによ
り、逆相クロマトグラフィー用充填剤としての分離特性
を有するだけでなく、ボロン酸誘導体を特異的に保持す
る分離特性をも有することを見出したのである。また、
これに加えて、そのような構造の充填剤は、単に疎水性
相互作用だけではなく、電子吸引性基を有する化合物や
水素結合性の化合物との間に強い相互作用を有するとこ
ろから、逆相クロマトグラフィーで汎用されるアルキル
基結合型充填剤で分離できない化合物の分離が可能とな
るということを見出して、新規な逆相クロマトグラフィ
ー用充填剤及びそれを用いた分離方法を構築するに到っ
たのである。

【００１６】すなわち、本発明は、その充填剤に係る発
明として、芳香環上の少なくとも一組の隣合う炭素原子
に水酸基が結合せしめられている芳香族官能基にて化学
修飾された多孔性担体より構成されていることを特徴と
する液体クロマトグラフィー用充填剤を、その要旨とす
るものである。

【００１７】このような本発明に従う液体クロマトグラ
フィー用充填剤にあっては、かかる所定の構造を有して
いることによって、充填剤とボロン酸誘導体との相互作
用が増大せしめられることとなるところから、ボロン酸
誘導体をより強く保持し得るようになるのである。

【００１８】また、かかる充填剤は、疎水性相互作用に
より化合物を保持し得るところから、逆相クロマトグラ
フィー用充填剤として有利に用いることが出来、以て広
範囲の化合物の分離に有利に適用され得るものである。

【００１９】さらに、本発明に従う液体クロマトグラフ
ィー用充填剤には、芳香環上の少なくとも一組の隣合う
炭素原子に水酸基が結合せしめられている芳香族官能基
が所定の担体に導入されていることにより、保持する化
合物との相互作用が、単に疎水性相互作用だけではなく
なるところから、従来の逆相クロマトグラフィー用充填
剤ではうまく分離することの出来なかった疎水性の類似
する化合物に対しても有利に適用され得るのである。

【００２０】なお、本発明に従う液体クロマトグラフィ
ー用充填剤の好ましい態様の一つによれば、前記多孔性
担体は、シリカゲル或いは多孔性ポリマーとされる。

【００２１】また、本発明は、液体クロマトグラフィー
手法によってボロン酸誘導体を分離するに際して、かか
るボロン酸誘導体を特異的に保持する充填剤として、芳
香環上の少なくとも一組の隣合う炭素原子に水酸基が結
合せしめられている芳香族官能基にて化学修飾された多
孔性担体より構成される充填剤を用いることを特徴とす
る分離方法をも、その要旨とするものである。そして、
このように、液体クロマトグラフィー手法によってボロ
ン酸誘導体を分離するに際して、ボロン酸誘導体を特異
的に保持し得る充填剤が用いられているところから、ボ
ロン酸誘導体が有利に分離され得るのである。

【００２２】さらに、本発明は、逆相液体クロマトグラ
フィー手法による分離に際して、充填剤を、芳香環上の
少なくとも一組の隣合う炭素原子に水酸基が結合せしめ
られている芳香族官能基にて化学修飾された多孔性担体
にて構成した分離方法をも、その要旨とする。

【００２３】そして、そのような本発明に従う分離方法
の好ましい態様の一つによれば、前記多孔性担体は、シ
リカゲル或いは多孔性ポリマーとされる。

【００２４】

【発明の実施の形態】ところで、本発明に従う充填剤と
しては、前述したように、芳香環上の少なくとも一組の
隣合う炭素原子に水酸基が結合せしめられている構造の
芳香族官能基（以下、単に芳香族官能基という）にて、
多孔性担体が化学修飾されたものであれば、如何なる形
態のものが用いられても、何等差支えないが、一般に
は、Ａｒ−Ａ−多孔性担体材料（但し、Ａｒ：芳香族官
能基、Ａ：スペーサー基）にて表される構造を有する化
学結合型の充填剤が用いられることとなる。

【００２５】そして、かかる芳香族官能基が所定のスペ
ーサー基（Ａ）を介して結合せしめられて、目的とする
充填剤を与える多孔性担体材料としては、前記した芳香
族官能基が化学的に結合せしめられて保持され得るもの
であれば、公知の如何なる多孔性担体材料も用いられ
得、通常、シリカゲル、多孔性ガラス、ガラスビーズ、
アルミナ、チタニア、ジルコニア等の無機担体や、ポリ
スチレンゲル、デキストランゲル、ポリアクリルアミド
ゲル、アガロースゲル、ポリ酢酸ビニルゲル、ポリメチ
ルメタクリレートゲル等の多孔性ポリマーが用いられる
こととなるが、中でも、シリカゲルや多孔性ポリマーが
好んで用いられる。何故なら、シリカゲルは、シラノー
ル基の反応性が高いところから、容易に化学修飾され得
ることに加えて、大きな機械的強度を有しており、容易
に入手され得るものであるからであり、また、多孔性ポ
リマーは、酸やアルカリに対して安定であるからであ
る。

【００２６】また、前記多孔性担体材料を化学修飾する
芳香族官能基としては、その芳香環上の少なくとも一組
の隣合う炭素原子に水酸基が結合せしめられている限り
において、如何なるものも採用され得るものである。そ
して、そのような芳香族官能基を構成する芳香環は、単
環であっても、多環であっても、何等差支えなく、本発
明の効果が得られる範囲内で、芳香環上において置換基
を有していても構わない。そして、そのような芳香環の
例としては、ベンゼン、ペンタレン、インデン、ナフタ
レン、アズレン、ヘプタレン、ビフェニレン、アセナフ
チレン、フルオレン、フェナレン、フェナントレン、ア
ントラセン、フルオラセン、アセフェナントリレン、ア
セアントリレン、トリフェニレン、ピレン、ナフタセ
ン、プレイアデン、ピセン、ペリレン、ペンタフェン、
ペンタセン、テトラフェニレン、ベンゾフルオランチ
ン、ヘキサフェン、ヘキサセン、ルビセン、コロネン、
トリナフチレン、ヘプタフェン、ヘプタセン、ピランス
レン、デカシクレン、オバレン等を挙げることが出来
る。

【００２７】さらに、前記Ａにて表される、芳香族官能
基と多孔性担体材料との間に結合せしめられるスペーサ
ー基としては、充填剤による化合物に対する保持力、特
にボロン酸に対する保持力の大部分が、芳香族官能基を
構成する芳香環上の少なくとも一組の隣合う炭素原子に
結合せしめられている水酸基にて発現されるものであ
り、スペーサー基の違いによる影響を殆ど受けないとこ
ろから、公知の各種の原子団が用いられ得る。そして、
そのようなスペーサー基としては、例えば、メチレン
基、エチレン基、プロピレン基等の直鎖状炭化水素基が
挙げられるが、それらに、エーテル結合、アミド結合、
エステル結合、カルボニル基等の他、硫黄原子、窒素原
子を含む官能基等が導入された原子団が用いられても、
何等差し支えない。また、ここでは、スペーサー基を有
する構造のものを例示したが、これだけに限定されるも
のではなく、前記芳香族官能基が、スペーサー基を介さ
ずに、直接多孔性担体材料に結合せしめられていても、
何等差し支えない。

【００２８】ところで、本発明に従う充填剤中の固定相
（芳香族官能基）の量は、溶質の保持時間に影響を与え
るものであるが、一般に、その量が増加すると、溶質と
固定相との相互作用が大きくなり、その結果として、溶
質の保持力が増大する。従って、そのような固定相が多
く結合せしめられてなる充填剤の使用により、目的とす
る化合物、例えばボロン酸誘導体に対する強い保持力が
発揮され、その結果、それら化合物の分離が効果的に為
され得ることとなる。つまり、目的とする化合物に対す
る、より大きな保持力を有する充填剤を得るためには、
出来るだけ多くの芳香族官能基が多孔性担体に結合せし
められることが望ましいのである。一方、本発明に従う
充填剤中の固定相の量の下限は、条件によって異なり、
一義的に決定されるものではないが、一般に、目的とす
る化合物に対する保持力が有効に発揮されるのに充分な
量であればよい。

【００２９】また、芳香族官能基に結合せしめられる水
酸基の結合数は、多くなる程、固定相と化合物との疎水
性相互作用が弱くなるが、その反面、水酸基が導入され
ることによって、電子吸引性基を有する化合物との相互
作用が強くなる等の、疎水性相互作用以外の作用が発現
されることにより、充填剤の保持力が低下しないところ
から、水酸基の結合数は、特に制限されるものではな
い。

【００３０】ここにおいて、上述の如き本発明に従う液
体クロマトグラフィー用充填剤は、公知の各種の反応を
利用して、多孔性担体に対して芳香族官能基が結合せし
められることにより、製造され得るものであり、例え
ば、シリカゲルを多孔性担体として用いる場合には、一
般に、１）芳香族官能基を有するシリル化剤をシリカゲ
ル担体に反応せしめる方法、２）芳香族官能基を有する
有機金属化合物をシリカゲル担体と反応せしめる方法、
３）反応性を有する官能基をシリカゲル担体に導入した
後、その官能基に芳香族官能基を結合せしめる方法等の
反応を利用して製造されることとなる。

【００３１】より詳細には、前記１）のシリル化剤を用
いる方法では、先ず、目的とする芳香族官能基を有する
化合物と二重結合を有する化合物とを反応させ、次い
で、二重結合を有するアルケンの炭素−炭素二重結合部
分に、白金触媒を用いてヒドロシラン（Ｈ−Ｓｉ）を付
加させることによって、シリル化剤を得る。この反応に
おいては、反マルコフニコフ型の付加が主として進行
し、アルケン分子の末端に珪素原子が結合するように反
応する。この方法は、シリル化剤への転化率が大きく、
副反応も少ないために、目的とする構造のシリル化剤が
得られ易いという利点があるが、二重結合を有する化合
物は重合する場合があり、特に高分子合成等に用いられ
るような重合性の高いモノマ−類似の二重結合を持つ化
合物では、付加反応よりも重合反応が進行する場合もあ
る。また、シリル化剤の合成に際しては、ヒドロシラン
の付加反応を用いないシリル化剤の合成方法である、２
つ以上の反応性の官能基（主として塩素）を持つ有機塩
素化ケイ素化合物とグリニャール試薬等の有機金属試薬
を反応させる方法も、利用することが出来る。

【００３２】なお、上記で得られるシリル化剤におい
て、珪素原子に結合している４つの置換基の内、少なく
とも一つは、塩素、臭素、メトキシ基、エトキシ基、ア
ルキルアミノ基等の、シリカゲル担体の表面に存在する
シラノール基と反応する官能基でなければならない。ま
た、２つ或いは３つの反応性の官能基を持つシリル化剤
も存在し、何れも、芳香族官能基によるシリカゲル担体
の化学修飾に適用することが出来る。

【００３３】そして、上記で得られた芳香族官能基を有
するシリル化剤を、シリカゲル担体の表面に存在するシ
ラノール基と反応せしめることにより、目的とする、芳
香族官能基にて化学修飾されてなる多孔性担体（シリカ
ゲル）を、容易に得ることが出来るのである。

【００３４】また、前記２）の有機金属化合物を用いる
方法は、Locke 等が報告している方法〔D.C. Locke, J.
J. Schermud and B. Banner, "Anal.Chem.", 44, 90 (1
972)〕であり、この方法では、先ず、シリカゲル担体の
シラノール基に対して、塩化チオニル等の、水酸基を塩
素置換することの出来る試薬を作用させて、かかるシラ
ノール基を塩素で置換する。次いで、この塩素置換され
たシリカゲル担体に対して、目的とする芳香族官能基を
有するグリニャール試薬とされた有機金属化合物を作用
させることにより、該芳香族官能基をシリカゲル担体に
結合させて導入せしめることが出来、以てシラノール基
における水酸基を芳香族官能基で置換することが出来る
のである。

【００３５】さらに、前記３）の、反応性を有する官能
基を担体に導入した後に、その官能基に芳香族官能基を
結合せしめる方法は、上記２）で示した、有機金属化合
物を担体と反応させる方法と類似するが、この方法で
は、先ず、予めアミノ基のような反応性官能基を有する
化合物をシリカゲル担体のシラノール基と反応、結合せ
しめ、次いで、このアミノ基と反応し得る官能基、例え
ば、カルボキシル基を有する芳香族官能基と、前記反応
性官能基の導入されたシリカゲル担体とを、Ｎ，Ｎ’−
ジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合剤にて縮合せ
しめることにより、目的とする充填剤を得ることが出来
るのである。なお、この例では、最終的にアミド結合が
形成されることとなるが、その他エステル結合やエーテ
ル結合等が形成される官能基の組合せの反応について
も、同様に行なわれ得るのである。

【００３６】このように、芳香族官能基にてシリカゲル
担体が化学修飾されてなる充填剤は、各種の合成方法に
よって製造され得るものであるが、反応性官能基が導入
されているシリカゲル担体（充填剤）が市販されている
場合には、合成工程を簡略化出来るところから、前記
３）の方法により製造することが望ましい。

【００３７】また、多孔性ポリマーを多孔性担体として
用いる場合には、前記シリカゲル担体を芳香族官能基に
て化学修飾する方法における３）の方法と同様の方法に
より、目的とする充填剤を製造することが出来る。より
詳細には、先ず、予めアミノ基のような反応性官能基を
有する化合物を多孔性ポリマーと反応、結合せしめて、
多孔性ポリマーに反応性官能基を導入する。次いで、こ
のアミノ基と反応し得る官能基、例えば、カルボキシル
基を有すると共に、芳香族官能基を有する化合物を用意
し、それに前記反応性官能基の導入された多孔性ポリマ
ーを、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドや
Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド等の縮合剤を
用いて縮合せしめることにより、目的とする充填剤を得
ることが出来るのである。

【００３８】そして、本発明では、かくの如き本発明に
従う液体クロマトグラフィー用充填剤を用いて、ボロン
酸誘導体を分離することも、その特徴とするものであ
り、これにより、効果的にボロン酸誘導体を分離するこ
とが出来るようになったのであるが、そのようなボロン
酸誘導体の液体クロマトグラフィー手法による分離操作
には、従来と同様な操作乃至は条件が採用されることと
なる。

【００３９】すなわち、そのような分離操作にあって
は、本発明に従う充填剤を充填せしめたカラムに対し
て、ボロン酸誘導体は、所定の溶媒に溶解させた溶液と
して供給せしめられることとなる。ところで、ここで用
いられる所定の溶媒としては、通常、メタノール、酢酸
エチル、テトラヒドロフラン、クロロホルム、水等が用
いられる。

【００４０】また、この分離カラム内に溶液形態におい
て供給されたボロン酸誘導体は、充填剤にて保持され、
続いて、分離カラム内に流通せしめられる移動相溶媒に
て、ボロン酸誘導体が順次溶出せしめられて、分離され
ることとなる。なお、ここで用いられる移動相溶媒とし
ては、通常の逆相液体クロマトグラフィー手法において
用いられる溶媒、即ち極性溶媒が用いられ、そのような
極性溶媒の具体例としては、水、メタノール、アセトニ
トリル、ホルムアミド、或いはそれらを混合した溶媒等
を挙げることが出来る。

【００４１】さらに、本発明は、逆相クロマトグラフィ
ー手法による分離に際して、前述の如き充填剤を用いる
ことも、その特徴とするものであり、それによって、各
種の化合物を逆相クロマトグラフィー手法によって効果
的に分離することができるようになったのであるが、そ
のような逆相クロマトグラフィー手法による分離操作に
も、また従来と同様な操作乃至は条件が採用されること
となるのである。

【００４２】

【実施例】以下に、本発明を更に具体的に明らかにする
ために、本発明の幾つかの実施例を示すこととするが、
本発明が、そのような実施例の記載によって、何等の制
約をも受けるものでないことは、言うまでもないところ
である。また、本発明には、以下の実施例の他にも、更
には上記の具体的記述以外にも、本発明の趣旨を逸脱し
ない限りにおいて、当業者の知識に基づいて種々なる変
更、修正、改良等を加え得るものであることが、理解さ
れるべきである。

【００４３】実施例 １ ───各種液体クロマトグラフィー用充填剤の合成──
─ 前述したように、本発明に従う液体クロマトグラフィー
用充填剤は、従来から公知の様々な手法を用いて合成さ
れ得るものであるが、本実施例では、市販のアミノ基結
合型シリカゲル充填剤を多孔性担体として利用すること
が出来て、充填剤の合成工程の簡略化を図り得るところ
から、アミノ基結合型多孔性担体と、かかるアミノ基と
反応可能な官能基を有する芳香族官能基とを結合させる
ことにより、目的とする充填剤を合成する方法を採用す
ることとする。また、アミノ基と芳香族官能基との結合
形態には、アミド結合、尿素結合、ウレタン結合等の種
々の結合形態を選択し得るが、カルボキシル基を酸無水
物とした後に、アミノ基と反応させてアミド結合を形成
する方法が簡便であるため、アミド結合の形態を適用す
ることとする。

【００４４】しかし、そのようなアミド結合を形成する
方法において、フェノール性水酸基を有するカルボン酸
誘導体をアミノ基に結合させる場合には、アミド結合を
形成する下記化１の（ａ）に示される主反応（アミド化
反応）の他に、フェノール性水酸基と酸無水物とが反応
して、エステル結合を形成する、下記化１の（ｂ）に示
される副反応の進行が予想される。そこで、アミド結合
を形成する際に惹起される副反応を抑制するための条件
について、検討することとする。なお、下記化１におい
て、Ａｒは、芳香環を表わしている。

【００４５】［化１］ （ａ）ＨＯ−Ａｒ−ＣＯＯＨ ＋ Ｈ₂ Ｎ−（担体）→
ＨＯ−Ａｒ−ＣＯＮＨ−（担体） （ｂ）ＨＯ−Ａｒ−ＣＯＯＨ ＋ ＨＯ−Ａｒ−ＣＯＯ
Ｈ→ ＨＯ−Ａｒ−ＣＯＯ−Ａｒ−ＣＯＯＨ

【００４６】より詳細には、先ず、フェノール性水酸基
を有する化合物としてフェノールを用い、またカルボキ
シル基を有する化合物として安息香酸を用い、更にアミ
ノ基結合型多孔性担体の代わりにアミノ基を有するヘキ
シルアミンを用意して、それらを反応させた。より具体
的には、フェノール：０．４７ｇ、安息香酸：０．６１
ｇ及びヘキシルアミン：０．５１ｇを、Ｎ，Ｎ’−ジメ
チルホルムアミド：２０ｍＬに溶解した後、縮合剤とし
て、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド：０．６
３ｇを添加して、均一溶液条件下において、縮合反応
（アミド化反応）を進行せしめた（反応溶液Ａ）。ま
た、縮合反応時に、更に１−ヒドロキシベンゾトリアゾ
ール：０．６８ｇを添加したものについても、反応を進
行せしめた（反応溶液Ｂ）。なお、この１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾールは、アミド化反応を促進することが
一般的に知られている。

【００４７】次に、上記のそれぞれで得られた反応生成
液を、高速液体クロマトグラフィーにより分析して、生
成したエステル化体のピーク面積値及びアミド化体のピ
ーク面積値を測定した。なお、高速液体クロマトグラフ
ィーによる分析は、カラムとしてＣｏｓｍｏｓｉｌ ５
Ｃ１８−ＭＳ（内径：４．６ｍｍφ、長さ：１５０ｍ
ｍ）を用い、移動相溶媒としてメタノール：０．１％ト
リフルオロ酢酸水溶液＝６０：４０（容量比）の混合溶
媒を用いて行なった。

【００４８】そして、上記で測定されたアミド化体のピ
ーク面積値及びエステル化体のピーク面積値を用い、以
下の数式に従って、アミド化体の生成比率及びエステル
化体の生成比率を算出し、その結果を、下記表１に示
す。 アミド化体の生成比率 ＝アミド化体のピーク面積値÷
（アミド化体のピーク面積値＋エステル化体のピーク面
積値）×１００（％） エステル化体の生成比率＝１００−アミド化体の生成比
率（％）

【００４９】

【表１】

【００５０】かかる表１に示される結果から明らかなよ
うに、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを添加せず
に、縮合反応を進行せしめた場合には、副反応の生成物
であるエステル化体が６．７％生成した。一方、１−ヒ
ドロキシベンゾトリアゾールを添加して、縮合反応を進
行させた場合には、副反応の生成物であるエステル化体
が殆ど生成せず、略定量的に主反応の生成物であるアミ
ド化体が９９．８％生成した。このように、アミノ基と
フェノール性水酸基を有するカルボン酸とを反応せしめ
て、アミド化合物を合成する場合には、１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾールを添加することによって、アミド化
体の生成が促進され、その結果、望ましくない副反応
（エステル化反応）が、効果的に抑制され得ることが確
認されたのである。

【００５１】従って、本実施例においては、液体クロマ
トグラフィー用充填剤を合成するために、アミノ基結合
型多孔性担体に対して、カルボン酸誘導体を反応させる
際には、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを添加する
反応条件を採用することとした。

【００５２】次いで、上記の実験結果を踏まえて、アミ
ノプロピル基がシリカゲルに導入された市販の担体（充
填剤）であるCosmosil ５ＮＨ₂ （ナカライテスク株式
会社製）に、対応するカルボン酸誘導体を反応せしめる
ことにより、下記表２に示される固定相の構造を有する
各充填剤（２，３−ＯＨ型充填剤、３，４−ＯＨ型充填
剤、３，４，５−ＯＨ型充填剤、３，４−ＯＨ−１型充
填剤、ＣＨ₃ 型充填剤、３，５−ＯＨ型充填剤）を合成
した。具体的には、３，４−ＯＨ型充填剤を合成する場
合を例に挙げて、充填剤の合成方法の詳細について、以
下に説明する。なお、下記表２において、２，３−ＯＨ
型充填剤、３，４−ＯＨ型充填剤、３，４，５−ＯＨ型
充填剤、３，４−ＯＨ−１型充填剤、ＣＨ₃ 型充填剤、
３，５−ＯＨ型充填剤の担体側の「Ｓｉ・」にて表わさ
れる構造は、正確には、「Ｓｉ≡」、「Ｓｉ（ＯＣ₂ Ｈ
₅ ）＝」、「Ｓｉ（ＯＨ）＝」、「Ｓｉ（ＯＣ₂ Ｈ₅ ）
₂−」、「Ｓｉ（ＯＨ）（ＯＣ₂ Ｈ₅ ）−」、「Ｓｉ
（ＯＨ）₂ −」の何れかである。

【００５３】

【表２】

【００５４】先ず、３，４−ジヒドロキシ安息香酸：
０．８６ｇ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール：０．
７６ｇを、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド：２０ｍＬ
に溶解せしめた。この溶液に、Cosmosil ５ＮＨ₂ ：
２．０ｇを加え、分散させた後、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロ
ピルカルボジイミド：０．７１ｇを加え、室温で撹拌し
た。そして、そのような反応液から、一晩経過後に得ら
れるゲルを、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド、メタノ
ール及びクロロホルムで吸引濾過洗浄した後、５０℃で
乾燥することにより、ベンゼン環上の互いに隣合う３位
と４位の炭素原子に二つの水酸基が結合せしめられた官
能基で化学修飾されている３，４−ＯＨ型充填剤を得
た。なお、Cosmosil ５ＮＨ₂ は、粒子径：５μｍ、細
孔径：１２ｎｍの多孔性球状のシリカゲルがアミノプロ
ピルトリエトキシシランで化学修飾された後、更にヘキ
サメチルジシラザンで化学修飾された充填剤である。

【００５５】また、かかる３，４−ＯＨ型充填剤を合成
した場合と同様にして、２，３−ＯＨ型充填剤、３，
４，５−ＯＨ型充填剤、３，４−ＯＨ−１型充填剤、Ｃ
Ｈ₃ 型充填剤、及び３，５−ＯＨ型充填剤についても、
３，４−ジヒドロキシ安息香酸の代わりに、それぞれ対
応した構造の水酸基置換カルボン酸誘導体を用いて、合
成した。

【００５６】ところで、同じく表２に示される３，４−
ＯＨ−Ｐ型充填剤は、Cosmosil ５ＮＨ₂ ：２．０ｇの
代わりに、アミノ基が導入された多孔性のポリマー担体
を用いる以外は、３，４−ＯＨ型充填剤を合成する場合
と同様にして得られた充填剤である。なお、そこで用い
られるアミノ基が導入された多孔性ポリマー担体は、グ
リシジルメタクリレートと架橋剤としてのエチレングリ
コールジメタクリレートとを、希釈剤としてのトルエ
ン、重合開始剤としてのα、α’−アゾビスイソブチロ
ニトリル及び懸濁安定剤としてのポリビニルアルコール
を溶解させた水溶液の存在下において、共重合せしめ
て、多孔性球状ポリマーを得、更にそれをアンモニア中
で加熱還流することにより、得られたものである。

【００５７】また、Ｃ₁₈型充填剤（オクタデシル基結合
型充填剤；Cosmosil ５Ｃ１８−ＭＳ：ナカライテスク
株式会社製）及びDiol型充填剤（ジオール型充填剤；Co
smosil ５Diol：ナカライテスク株式会社製）は、従来
から用いられている充填剤であり、比較のために、表２
に併せ示した。

【００５８】なお、この表２において示される充填剤略
号において、「−ＯＨ」の前に記載されている数字は、
芳香環のカルボニル基が結合している位置を１位とした
ときの水酸基の結合位置を示している。また、「−Ｏ
Ｈ」以降に示される数字は、スペーサーであるメチレン
基の数を示している。更に、「−ＯＨ」以降に示される
Ｐは、ポリマー担体を用いた充填剤であることを示して
いる。更にまた、「ＣＨ ₃ 」は、水酸基置換ベンゼン環
の代わりにＣＨ₃ 基が用いられた充填剤であることを示
している。

【００５９】そして、下記表３には、上記で合成した各
種充填剤（３，４−ＯＨ−Ｐ型充填剤を除く）の炭素含
有率と、充填剤に結合した芳香族官能基の結合量を示
す。なお、比較のために、Cosmosil ５ＮＨ₂ 型充填剤
の炭素含有率及び充填剤の表面に結合しているアミノ基
量も、併せ示した。

【００６０】

【表３】

【００６１】この表３に示されるように、本発明例の
２，３−ＯＨ型充填剤、３，４−ＯＨ型充填剤、３，
４，５−ＯＨ型充填剤や比較例のＣＨ₃ 型充填剤、３，
５−ＯＨ型充填剤の如きCosmosil ５ＮＨ₂ 型充填剤か
ら合成した充填剤は、Cosmosil５ＮＨ₂ 型充填剤に導入
されているアミノ基に対して、１５〜７０％の割合で芳
香族官能基が結合せしめられているが、その結合量は、
結合せしめられた芳香族官能基により差が認められた。
例えば、ベンゼン環の２位に水酸基が結合している２，
３−ＯＨ型充填剤や、ベンゼン環上に３個の水酸基が結
合している３，４，５−ＯＨ型充填剤では、芳香族官能
基の結合量の減少が認められた。これは、芳香族官能基
の立体的な大きさに基づく立体障害により担体への結合
量が減少したためであると考えられる。

【００６２】実施例 ２ ───ベンゼンボロン酸に対する保持特性─── 本実施例では、前記実施例１で合成した各液体クロマト
グラフィー用充填剤を、それぞれ、内径：４．６ｍｍ
φ、長さ：１５０ｍｍのクロマト管に充填して、それを
用いて、アセトニトリル：０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ４）＝５０：５０（容量比）の混合溶媒を移動相とし
て、液体クロマトグラフィー手法により、ベンゼンとベ
ンゼンボロン酸誘導体とを実際に分離した。

【００６３】より詳細には、液体クロマトグラフィー装
置は、送液ポンプ（ＬＣ−６Ａ型：株式会社島津製作所
製）と、前記各充填剤が詰められたカラムと、試料注入
器（７１２５型：レオダイン社製）と、紫外吸収検出器
（ＳＰＤ−６Ａ型ＵＶ検出器：株式会社島津製作所製）
とから構成されており、移動相溶媒の送液速度を、全て
１．０ｍＬ／分の流速とした。また、紫外吸収検出器の
検出感度を、０．１６ＡＵＦＳに設定し、更に検出波長
を、２５４ｎｍに設定して、測定を行なった。なお、カ
ラム温度を恒温水槽により調節して、３０℃となるよう
にした。更に、溶出時間の計測には、データ処理装置
（ＣＲ−５Ａ型：株式会社島津製作所製）を用いた。

【００６４】そして、各充填剤のベンゼン及びベンゼン
ボロン酸に対する保持特性を、ｋ’値を指標として、下
記表４に示した。

【００６５】なお、一般に、カラム（充填剤）の保持特
性を示す場合、試料をカラムに注入してから、カラムか
ら溶出されたピークの頂上までの時間（保持時間）が用
いられるが、この保持時間は、送液する移動相溶媒の流
速が同一で、しかも用いられるカラムが同一である場合
においてのみ、その相対的な評価が可能となるものであ
るために、充填剤が異なる複数のカラムの比較やカラム
の大きさが違う場合、あるいは移動相溶媒の送液速度が
異なる場合などにおいては、前記保持時間を比較して
も、相対的な比較を行なうことが不可能となる。そのた
めに、異なる条件のクロマトグラフィー分離の結果の比
較においては、通常、次式のｋ’で表される値、即ち保
持されない溶質の溶出時間に対する保持される溶質のカ
ラム内に滞留する時間の割合で、各溶質の保持特性（保
持力）が評価されることとなる。 ｋ’＝（ｔ_r −ｔ₀ ）／ｔ₀

【００６６】但し、ｔ_r ：保持される溶質の保持時間、
ｔ₀ ：保持されない溶質の溶出時間である。そして、か
かるｋ’値を用いることにより、カラムの長さや太さ或
いは流速の違い等による影響を無視することが出来るの
であり、以て純粋に充填剤の特性評価を行なうことが可
能となるのである。

【００６７】そして、ベンゼン環にボロン酸基が一つ結
合した構造のベンゼンボロン酸に対する、各充填剤によ
る保持の特異性は、充填剤によるベンゼンの保持特性
（ｋ’ _A ）に対する充填剤によるベンゼンボロン酸の保
持特性（ｋ’_B ）の比：分離係数（α＝ｋ’_B ／
ｋ’_A ）によって評価した。具体的には、ベンゼンは、
ボロン酸基を有さず、主として疎水性相互作用によって
保持される化合物であるところから、分離係数が大きな
値を示すほど、ベンゼンボロン酸に対して特異的に保持
する力を有する充填剤であることを示している。

【００６８】

【表４】

【００６９】かかる表４の結果から明らかなように、ア
ミノ基結合型シリカゲル充填剤を多孔性担体として用い
て合成した、本発明例の２，３−ＯＨ型充填剤、３，４
−ＯＨ型充填剤、３，４，５−ＯＨ型充填剤、及び３，
４−ＯＨ−１型充填剤は、分離係数が２０以上であり、
ベンゼンボロン酸に対して特異的に強い保持力を有する
ことが示された。また、多孔性ポリマー担体を用いて合
成した、本発明例の３，４−ＯＨ−Ｐ型充填剤にあって
も、１０．８８という大きな分離係数を示し、ベンゼン
ボロン酸に対して特異的に強い保持力を有することが示
された。一方、芳香環や水酸基を有していないＣＨ₃ 型
充填剤や二つの水酸基を芳香環上に有するものの、互い
に隣合わない炭素原子に結合している芳香族官能基にて
担体が化学修飾されてなる３，５−ＯＨ型充填剤は、分
離係数が１以下であり、ベンゼンボロン酸に対して微弱
な保持力しか持たないことが示された。また、従来から
用いられる、広範囲の化合物の分離に適用され得る充填
剤であるＣ₁₈型充填剤や、互いに隣合う炭素原子に水酸
基が結合しているものの、芳香環上に水酸基が結合して
いない有機官能基にて担体が化学修飾されてなるDiol型
充填剤にあっても、２以下の分離係数を示し、弱い保持
力しか示さなかった。一般に、ボロン酸基は、ジオール
性官能基を有する化合物に対して特異的な相互作用を示
すことが知られているが、Diol型充填剤における分離係
数は小さかったことから、ベンゼンボロン酸に対する特
異的な保持力は、芳香環以外の互いに隣合う炭素原子に
結合した水酸基を有する充填剤では、得られないと考え
られる。

【００７０】また、２，３−ＯＨ型充填剤の分離係数と
３，４−ＯＨ型充填剤の分離係数との比較から、芳香環
内の互いに隣合う炭素原子に結合している二つの水酸基
の結合位置の違いによる分離係数の格差は約３倍であ
り、３，４−ＯＨ型充填剤の分離係数と３，４，５−Ｏ
Ｈ型充填剤の分離係数との比較から、芳香環内の炭素原
子に結合している水酸基の数の違いによる分離係数の格
差は約１．７倍であり、更に、３，４−ＯＨ型充填剤の
分離係数と３，４−ＯＨ−１型充填剤の分離係数との比
較から、水酸基を持つ芳香環官能基とシリカゲル充填剤
とを結合するスペーサーの長さの違いによる分離係数の
格差は約１．１倍であることが示された。更に、３，４
−ＯＨ型充填剤の分離係数と３，４−ＯＨ−Ｐ型充填剤
の分離係数との比較から、芳香族官能基で化学修飾され
る、多孔性担体の違いによる分離係数の格差は約２．６
倍であることが示された。

【００７１】これらのことから、芳香環上の少なくとも
一組の隣合う炭素原子に結合している水酸基の結合位
置、水酸基の結合数、水酸基を持つ芳香環官能基と多孔
性担体とを結合するスペーサーの長さ、或いは官能基で
化学修飾された担体の違いにより、ベンゼンボロン酸に
対する特異性は、３倍未満程度の格差を生ずると考えら
れる。しかし、複数の水酸基が芳香環内の互いに隣合う
炭素原子に結合している官能基で化学修飾された本発明
例の充填剤の分離係数（１０．８８〜８０．４２）と、
比較例の充填剤の分離係数（０．１２〜１．６４）との
比較において、本発明例の充填剤の分離係数は、比較例
の充填剤の分離係数の６〜６７０倍の値を与えるところ
から、ベンゼンボロン酸に対する特異的な保持特性は、
主として、芳香環上の少なくとも一組の隣合う炭素原子
に水酸基が結合している構造により発現されているもの
と考えられ、その他の要因の寄与は、相対的に小さいも
のであると考えられる。

【００７２】従って、以上の結果から、本実施例で用い
られた充填剤以外の充填剤であっても、芳香環上の少な
くとも一組の隣合う炭素原子に水酸基が結合している芳
香族官能基で担体が化学修飾されてなる充填剤であれ
ば、ベンゼンボロン酸に対する高い特異性が得られると
考えられるのである。

【００７３】実施例 ３ ───ベンゼンボロン酸の保持に対するｐＨの影響──
─ 芳香環上の少なくとも一組の隣合う炭素原子に水酸基が
結合している芳香族官能基で化学修飾されてなる充填剤
の、ベンゼンボロン酸に対する特異的に強い保持力は、
ボロン酸基が解離して生じるボロン酸陰イオンと、充填
剤の芳香環上の少なくとも一組の隣合う炭素原子に結合
せしめられている水酸基との相互作用に基づくと考えら
れる。このため、ボロン酸基及び芳香環上の水酸基の解
離に影響を与えると予想される移動相のｐＨ値と、充填
剤によるベンゼンボロン酸誘導体に対する分離係数との
関係について調べた。

【００７４】詳細には、下記表５に示されるような各ｐ
Ｈ値を与えるリン酸緩衝溶液とアセトニトリルとの５
０：５０（容量比）混合溶媒を移動相として、３，４−
ＯＨ型充填剤を用いて、ベンゼン及びベンゼンボロン酸
を分離して、それらの保持特性（ｋ’値）を測定し、そ
の結果を、下記表５に示した。また、それら保持特性か
ら、ベンゼンに対するベンゼンボロン酸の分離係数を算
出して、その結果を、下記表５に併せ示した。なお、表
５中のｐＨ値の後の括弧内の数字は、リン酸緩衝溶液と
アセトニトリルとを混合した後に測定した、実際の移動
相のｐＨ値を示している。

【００７５】

【表５】

【００７６】この表５に示される結果から明らかなよう
に、ベンゼンに対するベンゼンボロン酸の分離係数は、
ｐＨの変化によって、大きく変化することが示されたの
である。より詳細には、移動相のｐＨの違いによってベ
ンゼンの保持特性（ｋ’値）は変化しないが、ベンゼン
ボロン酸の保持特性（ｋ’値）はｐＨ９〜１０で大きな
値を示し、それに伴い分離係数もｐＨ９〜１０で最大値
を示した。その理由としては、ボロン酸基は、アルカリ
性になる程、解離し易くなることが知られており、酸性
移動相中では、ボロン酸の解離が少なくなり、芳香環上
の水酸基との相互作用が形成され難いためであると考え
られる。また、ｐＨ１１以上で分離係数の減少が観察さ
れたが、それは、芳香環上の炭素原子に結合せしめられ
ている水酸基が解離して、ボロン酸陰イオンとの結合が
形成され難くなったためと考えられる。

【００７７】また、ｐＨ１０における分離係数は、ｐＨ
３における分離係数の１５０倍以上に達し、ボロン酸誘
導体を分離する際に、用いる移動相のｐＨ値を変化させ
ることにより、充填剤によりベンゼンボロン酸を特異的
に保持させることと、保持しているベンゼンボロン酸を
溶出させることが容易に制御し得ることが理解されるの
である。

【００７８】実施例 ４ ───各種ボロン酸誘導体に対する保持特性─── ３，４−ＯＨ型充填剤を用いて、アセトニトリル：０．
０２Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ３）＝５０：５０（容量
比）或いはアセトニトリル：０．０２Ｍリン酸緩衝溶液
（ｐＨ４）＝５０：５０（容量比）を移動相として、下
記表６に示される各種ボロン酸誘導体を分離し、それぞ
れの保持特性を測定し、それを、下記表６に併せ示し
た。

【００７９】

【表６】

【００８０】この表６の結果から、ボロン酸誘導体の保
持特性は、前記実施例３の場合と同様に、移動相のｐＨ
の上昇に伴って増加する傾向を示し、従って本発明に従
う充填剤は、ベンゼンボロン酸以外のボロン酸誘導体を
も、特異的に保持するものであると考えられる。

【００８１】また、保持特性に対するボロン酸誘導体の
置換基の影響について見ると、ニトロ基のような電子吸
引性基で置換されたボロン酸誘導体は、ベンゼンボロン
酸より大きな保持特性を示したのに対して、メチル基の
ような電子供与性基で置換された誘導体は、ベンゼンボ
ロン酸よりも小さな保持特性を示した。これは、同じ移
動相条件であっても、電子吸引性の官能基で置換された
ボロン酸誘導体は、ボロン酸陰イオンがより安定化され
て、充填剤と相互作用し易くなるために、充填剤による
保持力が増大するのに対して、電子供与性の官能基で置
換されたボロン酸誘導体は、充填剤と相互作用し難くな
るために、充填剤による保持力が減少するためであると
考えられる。従って、表６に示される各ボロン酸誘導体
に対する保持特性の違いは、主として保持される化合物
の化学的性質の違いにより生じていると考えられ、本発
明に従う充填剤によれば、ボロン酸誘導体同士を効果的
に分離することが可能であることが示唆されるのであ
る。

【００８２】実施例 ５ ───ベンゼンボロン酸の保持に対する酸或いは塩基の
影響─── リン酸緩衝液を用いずに、下記表７に示される酸や塩基
を用いて調製された溶媒を移動相として、３，４−ＯＨ
−Ｐ型充填剤を用いて、ベンゼンとベンゼンボロン酸を
分離した際の保持特性を測定し、また、その保持特性か
らベンゼンに対するベンゼンボロン酸誘導体の分離係数
を求め、その結果を、下記表７に併せ示した。

【００８３】

【表７】

【００８４】かかる表７に示される結果から明らかなよ
うに、トリフルオロ酢酸、酢酸、Ｎ−メチルモルホリ
ン、トリエチルアミンの如き有機酸や有機塩基を用いて
調製した溶媒からなる移動相であっても、前記実施例３
で示した、リン酸緩衝液を用いた場合と同様に、ｐＨ値
の変化に拘らず、ベンゼンの保持特性（ｋ’値）は略同
じであるが、ベンゼンボロン酸の保持特性（ｋ’値）
は、ボロン酸陰イオンと芳香環上の少なくとも一組の隣
合う炭素原子に結合している水酸基との相互作用が形成
され易いｐＨ値を与える移動相を用いて分離した時程、
より長くベンゼンボロン酸が保持されるのであり、ｐＨ
値の変化によるボロン酸誘導体の保持特性の変化は、リ
ン酸緩衝液を用いずにｐＨ値を調製した場合でも惹起さ
れることが確認された。更に、ベンゼンボロン酸は、水
を用いずに調製した有機溶媒を移動相として用いて分離
した場合では、トリフルオロ酢酸を添加した有機溶媒を
移動相として用いた場合には、保持特性が比較的小さく
なるのに対して、Ｎ−メチルモルホリンを添加した有機
溶媒を移動相として用いた場合には、保持特性が比較的
大きくなるのである。従って、芳香環上の少なくとも一
組の隣合う炭素原子に水酸基が結合している芳香族官能
基で化学修飾された本発明に従う充填剤は、非水系の移
動相を用いた場合でも、ボロン酸誘導体を効果的に分離
し得ることが理解されるのである。

【００８５】このように、前記実施例２、３、４及び５
の結果から、芳香環上の少なくとも一組の隣合う炭素原
子に水酸基が結合している芳香族官能基で化学修飾され
た本発明に従う充填剤は、移動相のｐＨ値を調整するこ
とにより、ボロン酸誘導体に対する保持特性を制御する
ことが可能であり、従って、移動相のｐＨ値を調整し
て、充填剤によりボロン酸誘導体をより特異的に保持す
るようにしたり、逆に充填剤に保持されているボロン酸
誘導体を溶出し易くしたり出来る特性を有する充填剤で
あることが示されたのである。

【００８６】実施例 ６ ───一置換ベンゼンの保持特性の評価─── ここでは、芳香環上の少なくとも一組の隣合う炭素原子
に水酸基が結合している芳香族官能基で化学修飾された
本発明に従う充填剤を、逆相クロマトグラフィー用充填
剤として用いた場合の分離特性について調べることとす
る。

【００８７】より詳細には、３，４−ＯＨ型充填剤、或
いは従来から逆相クロマトグラフィー手法に用いられる
Ｃ₁₈型充填剤を用いて、各種一置換ベンゼンを分離し、
その保持特性を求めた。そして、その対数値を求めて、
下記表８に示した。また、各種一置換ベンゼンのＬｏｇ
Ｐの値も、下記表８に併せ示した。ここにおいて、Ｌ
ｏｇ Ｐの値とは、化合物のオクタノールと水との分配
係数であり、この値が大きい程、疎水性が大きい化合物
であることを示す。なお、両充填剤の疎水性の大きさに
は、著しい差があることから、３，４−ＯＨ型充填剤で
各種一置換ベンゼンを分離する際には、移動相としてメ
タノール：水＝３０：７０（容量比）の混合溶媒を用
い、またＣ₁₈型充填剤で各種一置換ベンゼンを分離する
際には、移動相としてメタノール：水＝６０：４０（容
量比）の混合溶媒を用いた。

【００８８】

【表８】

【００８９】この表８に示された結果から、ベンゼン
（置換基：−Ｈ）、トルエン（置換基：−ＣＨ₃ ）及び
エチルベンゼン（置換基：−ＣＨ₂ ＣＨ₃ ）の保持特性
の対数（Ｌｏｇ ｋ’値）の比較から、３，４−ＯＨ型
充填剤、Ｃ₁₈型充填剤共に、疎水性基であるメチレン基
（−ＣＨ₂ −）を多く有する化合物程、より強く保持し
得る、逆相クロマトグラフィー用充填剤の特徴的な性質
を有するところから、本発明に従う充填剤は、逆相クロ
マトグラフィー用充填剤としての分離特性を発揮し得る
ことが確認されたのである。

【００９０】また、一置換ベンゼンの保持特性の対数
と、Ｌｏｇ Ｐ値との相関をみると、Ｃ₁₈型充填剤のよ
うに、アルキル基をシリカゲルに結合した充填剤では、
相関係数が０．９９となり、Ｃ₁₈型充填剤の分離特性
が、主として疎水性相互作用により支配されていること
が示されたのに対して、本発明に従う３，４−ＯＨ型充
填剤では、相関係数は０．６９と、比較的低い値とな
り、３，４−ＯＨ型充填剤の保持特性が疎水性のみによ
るものでないことが示唆された。また、化合物の疎水性
の大きさから予測される保持特性よりも、ニトロ基やエ
ステル、或いはシアノ基等の電子吸引性の官能基が結合
している化合物の保持特性がより大きいことから、本発
明に従う充填剤は、疎水性相互作用の他にも、電子的相
互作用による分離特性を有するものであると考えられ
る。

【００９１】実施例 ７ ───電子吸引性基を有する化合物に対する保持特性─
── メタノール：水＝２０：８０（容量比）を移動相とし
て、３，４−ＯＨ型充填剤、３，４，５−ＯＨ型充填
剤、ＣＨ₃ 型充填剤、及びＣ₁₈型充填剤のそれぞれを用
いて、ベンゼン及びニトロベンゼンを分離して、それら
ベンゼンの保持特性（ｋ’_A ）、電子吸引性基であるニ
トロ基が結合したニトロベンゼンに対する保持特性
（ｋ’_C ）、並びにベンゼンに対するニトロベンゼンの
分離係数（ｋ’_C／ｋ’_A ）を求め、それを、下記表９
に示した。ここで、ベンゼンは電荷移動を与える官能基
を持たない化合物であることから、分離係数（ｋ’_C ／
ｋ’_A ）の値が大きい程、電子吸引性基を有する化合物
に対して強く相互作用する充填剤であると考えられる。

【００９２】

【表９】

【００９３】この表９に示されるように、３，４−ＯＨ
型充填剤の分離係数は、Ｃ₁₈型充填剤の分離係数の３．
４倍、芳香環や水酸基を有していないＣＨ₃ 型充填剤の
分離係数の１．８倍という高い値を与え、芳香環上の少
なくとも一組の隣合う炭素原子に水酸基が結合している
芳香族官能基の作用により、電子吸引性基を有する化合
物と強く相互作用する特性が発揮され得ることが示唆さ
れるのである。また、３，４−ＯＨ型充填剤と３，４，
５−ＯＨ型充填剤とを比較すると、３，４，５−ＯＨ型
充填剤のように、芳香環上の水酸基の数が増加した芳香
族官能基で化学修飾されてなる充填剤は、疎水性が低下
し易くなる反面、電子吸引性基を有する化合物との相互
作用が増大するところから、むしろ分離係数が大きくな
って、分離能が向上することが示された。なお、表９に
おいては、全ての充填剤において、同一の移動相を用い
て分離を行なったが、移動相に含有するメタノールの濃
度を低下させて、３，４−ＯＨ型充填剤における保持を
増大させることにより、疎水性相互作用の増大に基づい
て、ベンゼンとニトロベンゼンとの実質的な分離能は、
Ｃ₁₈型充填剤のそれよりも増大するものであると考えら
れる。

【００９４】実施例 ８ ───充填剤の水素結合性─── 分子内にカルボニル基や含窒素複素環の構造を有するカ
フェインは、水素結合性の化合物であるところから、こ
のカフェインに対する保持特性を調べることにより、充
填剤の水素結合性化合物に対する相互作用の評価が可能
となる。従って、本実施例では、カフェインに対する保
持特性を検討することとする。

【００９５】より詳細には、メタノール：水＝２０：８
０（容量比）の混合溶媒をを移動相として、３，４−Ｏ
Ｈ型充填剤、３，４，５−ＯＨ型充填剤、ＣＨ₃ 型充填
剤及びＣ₁₈型充填剤のそれぞれを用いて、フェノール及
びカフェインを分離して、フェノールの保持特性（ｋ’
_D ）及びカフェインの保持特性（ｋ’_E ）を測定し、更
にフェノールに対するカフェインの分離係数（ｋ’_E ／
ｋ’_D ）を求めた。そして、その結果を、下記表１０に
示した。なお、フェノールは、カフェインと比較して水
素結合の作用を受け難く、主として疎水性相互作用によ
り保持される化合物であるところから、フェノールに対
するカフェインの分離係数が大きい程、水素結合性の化
合物に対して強く相互作用する充填剤であると考えられ
る。

【００９６】

【表１０】

【００９７】この表１０に示される結果から明らかなよ
うに、３，４−ＯＨ型充填剤の分離係数は、ＣＨ₃ 型充
填剤の約６４倍であり、Ｃ₁₈型充填剤の分離係数の約２
２倍という非常に大きな値となったのである。従って、
本発明に従う充填剤は、水素結合性の化合物に対して、
より強い相互作用を発揮することが示唆されたのであ
る。このように、本発明に従う充填剤は、疎水性相互作
用や電子吸引性基を有する化合物に対する相互作用の他
にも、水素結合性の化合物に対する相互作用をも有する
充填剤であると考えられる。また、３，４−ＯＨ型充填
剤と３，４，５−ＯＨ型充填剤の分離係数を比較する
と、前記実施例７で得られた結果と同様に、３，４，５
−ＯＨ型充填剤は、芳香環上の水酸基の数が増加するこ
とにより、疎水性が低下する反面、水素結合性の化合物
との相互作用が増大するところから、むしろ分離係数が
大きくなって、分離能が向上することが示された。更
に、表１０に示される充填剤の内で、カフェインの保持
特性とフェノールの保持特性との差が最も大きいのは、
３，４−ＯＨ型充填剤であり、Ｃ₁₈型充填剤よりも有利
に、カフェインとフェノールを分離し得ることが示され
たのである。

【００９８】実施例 ９ ───異性体の分離─── ３，４−ＯＨ型充填剤、ＣＨ₃ 型充填剤、及びＣ₁₈型充
填剤のそれぞれを用いて、下記表１１に示される混合溶
媒を移動相として、官能基の結合位置の違いにより、３
つの異性体が存在するメチルアセトフェノンの分離を行
なって、保持特性を測定し、それから各異性体同士の分
離係数を求めて、下記表１１に示した。なお、下記表１
１中において、移動相の混合割合は、容量比で示してい
る。また、表１１において、ｍ−体／ｏ−体は、ｏ−異
性体に対するｍ−異性体の分離係数、ｐ−体／ｏ−体
は、ｏ−異性体に対するｐ−異性体の分離係数、ｐ−体
／ｍ−体は、ｍ−異性体に対するｐ−異性体の分離係数
を表わしている。

【００９９】

【表１１】

【０１００】かかる表１１の結果から明らかなように、
ＣＨ₃ 型充填剤或いはＣ₁₈型充填剤のメチルアセトフェ
ノンのオルト異性体に対するメタ異性体の分離係数（ｍ
−／ｏ−）は、それぞれ１．１１及び１．００であり、
殆ど分離することが出来ないのに対して、３，４−ＯＨ
型充填剤のオルト異性体に対するメタ異性体の分離係数
（ｍ−／ｏ−）は、１．２２であり、オルト異性体とメ
タ異性体とを分離することが出来ることが示された。オ
ルト異性体に対するパラ異性体の分離係数（ｐ−／ｏ
−）も、同様に、３，４−ＯＨ型充填剤を用いて分離し
た時に、最も高い値が得られた。また、メタ異性体に対
するパラ異性体の分離係数（ｐ−／ｍ−）については、
３，４−ＯＨ型充填剤は、Ｃ₁₈型充填剤と同等（０．９
６の逆数は１．０４）の分離係数を与えた。従って、本
発明に従う充填剤を用い液体クロマトグラフィー手法を
行なえば、従来から広範囲の化合物の分離に適用されて
いるアルキル基結合型充填剤であるＣ₁₈型充填剤では分
離が困難である異性体を、有利に分離し得ることが確認
されたのである。

【０１０１】ところで、前記の各実施例では、カラムと
して、内径：４．６ｍｍφ、長さ：１５０ｍｍのものを
使用しているが、何等、このようなものに限定されるわ
けではなく、カラムの内径や長さは、目的とする化合物
の分離が行なわれる範囲において、適宜に選定され得る
ものである。また、移動相溶媒の送液方法についても、
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の如き送液ポ
ンプを使用する方法に限定されることなく、圧縮空気に
よる加圧送液方法を採用するフラッシュクロマトグラフ
ィー手法、重力を利用した自然流下を利用するオープン
カラムクロマトグラフィー手法、或いは毛細管現象によ
って溶媒の移動を利用する薄層クロマトグラフィー手法
にも適用出来ることは、言うまでもないことである。

【０１０２】また、本発明に従う液体クロマトグラフィ
ー用充填剤は、液体クロマトグラフィー手法に利用され
るだけでなく、ボロン酸誘導体に対する吸着剤として使
用され得るものである。

【０１０３】

【発明の効果】以上の説明から明らかなように、本発明
に従う液体クロマトグラフィー用充填剤によれば、それ
を用いて液体クロマトグラフィー分離を行なうことによ
り、有利にボロン酸誘導体を保持、分離することが出来
るのである。また、かかる充填剤は、汎用的な逆相クロ
マトグラフィー用充填剤としても用いることが出来、各
種の化合物を有利に保持、分離することが出来る。更
に、本発明に従う充填剤にあっては、芳香環上の少なく
とも一組の隣合う炭素原子に水酸基が結合せしめられて
いることにより、その保持特性は、疎水性相互作用のみ
でなく、電子的相互作用や水素結合性相互作用によっ
て、発現されるのである。

【０１０４】また、本発明に従うボロン酸誘導体の分離
方法によれば、充填剤として、ボロン酸誘導体を有利に
保持し得る液体クロマトグラフィー用充填剤が用いられ
ているところから、ボロン酸誘導体を効率的に分離する
ことが出来るのである。

【０１０５】さらに、本発明に従う逆相クロマトグラフ
ィー手法による分離方法にあっては、前記の如き優れた
特性を有する充填剤を用いるところから、従来の逆相ク
ロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には分離するこ
とが出来なかった、疎水性の類似する化合物でも、電子
的相互作用や水素結合性相互作用の相違によって、効率
的に分離し得るのである。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 芳香環上の少なくとも一組の隣合う炭素
   原子に水酸基が結合せしめられている芳香族官能基にて
   化学修飾された多孔性担体より構成されていることを特
   徴とする液体クロマトグラフィー用充填剤。
2. 【請求項２】 前記多孔性担体が、シリカゲル或いは多
   孔性ポリマーである請求項１に記載の液体クロマトグラ
   フィー用充填剤。
3. 【請求項３】 液体クロマトグラフィー手法によってボ
   ロン酸誘導体を分離するに際して、かかるボロン酸誘導
   体を特異的に保持する充填剤として、芳香環上の少なく
   とも一組の隣合う炭素原子に水酸基が結合せしめられて
   いる芳香族官能基にて化学修飾された多孔性担体より構
   成される充填剤を用いることを特徴とする分離方法。
4. 【請求項４】 逆相液体クロマトグラフィー手法による
   分離に際して、充填剤を、芳香環上の少なくとも一組の
   隣合う炭素原子に水酸基が結合せしめられている芳香族
   官能基にて化学修飾された多孔性担体にて構成したこと
   を特徴とする分離方法。
5. 【請求項５】 前記多孔性担体が、シリカゲル或いは多
   孔性ポリマーである請求項３又は請求項４に記載の分離
   方法。