JPH1057051A - インビトロの培養植物組織のパッケージ方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明の課題は、試験管の中で培養された植
物組織をパッケージする、特に体胚の輸送に適し、かつ
非常に小さな技術的手段および実施時間だけを必要とす
る、新しい非常に簡単な方法を供することである。 【課題を解決する手段】 インビトロで培養した植物組
織を、無菌の容器の中で、液体栄養培地を浸み込ませた
２つの固体の支持体の間に置き、その植物組織を少なく
とも１つの支持体の表面に毛管現象によって堅く付着さ
せ、又少なくとも１つ支持体の他の表面を毛管現象によ
って容器の面の１つに堅く付着させて、組織を保存す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はインビトロで培養さ
れた植物組織をパッケージする新しい方法に関し、その
方法は植物組織の保存状態を高めることが出来、且つ特
に植物材料の輸送に適する。

【０００２】

【従来の技術】インビトロで培養された植物組織の輸送
は適当なパッケージを必要とする。例えば植物組織は、
液体培地の中に又は半固体の寒天培地の上にそれらを置
くことによってパッケージすることができ、これらの培
地はペトリ皿又は瓶のようなインビトロ培養のための通
常の容器に含まれている。残念なことにこの形式のパッ
ケージは、個々の包装品が輸送途上に受ける次のような
危険に対応し得ない。即ち、(1) 液体培養の場合に攪拌
の欠如による組織の窒息、(2) 過剰な振盪により寒天で
組織を覆うことにより生ずる組織の窒息、(3) 培地と容
器の外側の間の接触から生ずる汚染、および(4) ある種
の場合の組織の過剰の成長。

【０００３】インビトロで培養された植物組織を冷蔵温
度の油層下でパッケージすることも可能である。ＥＰ特
許第４０８９２２号明細書 (ネスレ社）には、胚を油層
下で、液浸による低酸素状態に維持し、ついで冷却し、
考えられる胚の低温感受性閾値より大きな温度に保存す
る方法を開示する。このように保存された胚は数日の保
存後に満足すべき生存力を示すが、この方法はなお輸送
期間中の冷蔵温度の変化の危害を受ける。

【０００４】又インビトロで培養された植物組織をアル
ジネートおよびスクロースの混合物で被覆する時、その
植物組織を輸送することが可能である (Hasan 等、「植
物遺伝学資源公報 Plant Genetic Resources Newslett
er」、103 号、32-35 ページ、1995年) 。

【０００５】インビトロで培養された植物組織を凍結す
ることも可能である。例として、Chen等は、ソルビトー
ル（脱水剤）およびジメチルスルホキシド（凍結保護物
質）の存在下でカルスを培養し、それらを−４０℃でゆ
っくりと凍結し、ついで液体窒素の中で凍結することを
提案している（「植物生理学 Plant Physiol. 」、75
号、726-731 ページ、1984年) 。同様に、Delvallee 等
は、未成熟な接合体胚をスクロース（脱水剤）およびジ
メチルスルホキシドの存在下で培養し、ついでそれらを
液体窒素の中で凍結することを提案している（「植物科
学 Plant Science 」、60号、129-136 ぺージ、1989
年) 。最後に、ＥＰ特許第３９９１５８号明細書（ネス
レ社) は、体胚を浸透圧剤を含む培地上で予備処理し、
ついでそれら冷却し、つぎにそれらを−１５℃から−４
０℃温度で凍結する方法を開示する。凍結は、組織の死
滅に導く温度障害のために、植物組織の輸送に必ずしも
適しているわけではない。

【０００６】更に、異なる技術分野において、切断植物
又は種子を保存する方法が知られている。ＥＰ特許第６
６５８１号明細書（Piquepaille 等) は、例えば、種子
を発芽させるための又は切断植物を保存するための装置
について提案しており、その提案の中で生物学的物質を
第１の粘着性支持体および液状成分を浸み込ますことが
できる第２の柔軟な支持体の間に置き、両者の支持体は
第１の支持体の粘着性表面によって堅く付着し、そして
２つの支持体は接着剤によって容器の側面に保持される
容器から成ることを記載する。この装置は接着剤が存在
するために滅菌できないことに注目すべきである。更
に、第１の支持体の粘着面はインビトロで培養された植
物組織のような軟らかい組織を損傷しやすく、更にこの
装置の特徴は本発明の枠内を限定する。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】それ故に今までのとこ
ろ、使用が簡単で、かつ植物組織を十分に保護すること
ができる、インビトロで培養される植物組織をパッケー
ジする装置は知られていない。このように本発明は、イ
ンビトロで培養された植物組織をパッケージする、特に
体胚の輸送に適し、かつ非常に小さな技術的な手段およ
び実施時間だけを必要とする、新しい非常に簡単な方法
を供するものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】この目的のために、本発
明は、無菌の容器の中で、インビトロで培養された植物
組織を液体の栄養培地を浸み込ませた２つの固体の支持
体の表面の間に起き、その植物組織を支持体の少なくと
も１つの表面に毛管現象により堅く付着させ、支持体の
少なくとも１つの他の表面を容器の１つの面に毛管現象
によって堅く付着させ、そしてそれらの状態を変えずに
組織を保存する、インビトロで培養された植物組織をパ
ッケージする新しい方法に関する。

【０００９】本発明は又、インビトロで培養された植物
組織を液体栄養培地を浸み込ませた２つの固体の支持体
の間に置き、その植物組織を少なくとも１つの支持体の
表面に毛管現象によって堅く付着させ、又少なくとも１
つの支持体の他の表面を容器の１つの面に毛管現象によ
って堅く付着させることを特徴とする、インビトロで培
養された、密閉可能な無菌の容器からなるパッケージ装
置に関する。

【００１０】先行技術はかなり更に複雑化した技術を推
奨しているが、本発明によるパッケージ条件下でインビ
トロで培養された植物組織は、１から１００日の範囲の
輸送時間の間に完全に生き残ることが分かった。このよ
うに本発明の方法は、実行するのが容易であり、汚染の
危険が減少し、組織は栄養培地の中に完全に浸漬する危
険がなく、組織を支持体の間への挿入による衝撃から保
護するが故に先行技術の欠点が回避され、かつ組織は例
えば半固形の寒天培地又は液体の栄養培地の中に単に置
くだけなので組織は保存の後に非常に容易に培養され
る。

【００１１】驚くべきことに、例えば、木質植物のよう
にゆるやかに成長する植物種の多くは、そのようなパッ
ケージ条件によって生育が阻害されることが分かった。
これに反して、豆科植物のような急速に成長する植物種
の成長を制限することが望ましい場合に、例えばそれら
をパッケージする前に脱水することもできる。

【００１２】驚くべきことに、本発明によるパッケージ
条件は、体胚を小植物に発育させる能力を高めることす
らできることが分かった。

【００１３】

【発明の実施形態】それ故に、本発明を行うために、イ
ンビトロの培養から得た植物組織、即ちカルス、カルス
上に発育された芽、体胚および根を使用することができ
る。しかし、本発明は、特に、環境条件に敏感であるこ
とが知られている、植物の体胚の保存を目的にするのが
望ましい。

【００１４】使用される容器は、例えば滅菌することが
でき、かつ可逆的に密閉することができる容器でよい。
当業者に知られており、かつ大量に入手し得る容器はペ
トリ皿であり、ぺトリ皿は例えばプラスチックフイル
ム、ワックス又は当業者に既知の他の適切な物質によっ
て密閉することができる。

【００１５】使用する固体支持体は、柔軟な物質から成
るのが望ましい。しかし必ずでなく、植物組織の集合体
の形態をとることができ、かつ保存時間中に崩壊しない
ものである。この目的のために、この物質は部分的に又
は完全に繊維質であることができ、かつ液体を保持し得
る物質を含むことができ、前記の繊維質は例えばこの保
持機能を満たし得るものである。これらの支持体は、単
独で又は組合せで、例えば、セルロース（吸取紙）、シ
リカ、ガラス、デキストラン又はキチンの重合体、絹の
ようなタンパク質、又は、ポリスチレン、ポリアクリレ
ート、ポリメタクリレート、ポリビニルおよびナイロン
のようなポリアミドの合成重合体で構成することができ
る。更に、水を保持し、かつ繊維の中に含まれることが
可能な物質は、例えばポリアクリルアミド又は寒天のよ
うな多糖類のように水性液体を吸収してヒドロゲルを形
成する、有機又は無機の化合物で構成することができ
る。しかし、この物質は支持体から流出してはならな
い。

【００１６】支持体は、組織の生存のために必須の栄養
要素を含む液体を浸み込ませることができるべきであ
る。当業者に知られている栄養培地の中に、例として、
Skoog又はLinsmayer からビタミンを補足したMurashige
およびSkoog 培地について述べることができる（「Phy
siol. Plant. 」，1962年, 15号, 473 ページ、「Physi
ol. Plant. 」, 1965年, 18号, 100 ページ) 。

【００１７】望ましくは、少なくとも１つの支持体は、
栄養液を支持体の最高の水分保持閾値（その後液をより
長く保持できない）まで浸み込ませる。栄養液の含浸量
は少なくとも９５から１００％の容器中の相対湿度、望
ましくは少なくとも９８％で、少なくとも１から５日間
確保するような量が望ましい。植物組織を乾燥した支持
体と第２の液を浸み込ませた支持体の間に置く作業は、
組織のゆっくりとした制御された脱水を行うことを可能
にし、前記の乾燥した支持体は実に、浸み込ませた支持
体から乾燥した支持体に移動する液体を、ゆっくりと浸
み込ませる。

【００１８】組織を損傷しないように、かつ又酸素の良
好な拡散、および毛管現象による支持体のお互いのおよ
び容器の表面への付着を増進するように、厚みも重量も
小さい支持体を使用するのが有利である。例として、
０．０３から１ｇの重量の、例えば０．０３から０．１
ｇの重量で例えばそれらの最初の重量の２から１０倍以
上の栄養液を吸収することが可能なフィルターを使用す
ることができる。

【００１９】植物組織は、支持体の間に多数で又は個々
に、組織の生存能力をそれにより影響されることなく置
くことができる。組織を置く前に、植物組織から残余の
培養液を例えばフィルターを通す真空吸引等によって分
離する必要はない。しかし、上記のような組織の更に著
しい脱水を確実に行うことが望ましい場合には、残余の
培養液を分離することもできる。最後に、インビトロで
培養した植物組織を支持体のｃｍ² 当たり１から１００
の割合で置き、その組織は０．０５から１ｃｍの長さ
で、かつ例えば魚雷型胚の発育段階からとった体胚の場
合に０．０５から０．３ｃｍの長さであることができる
ことが分かっている。

【００２０】支持体は、毛管現象によって均等に、かつ
堅く付着し続けることが望ましい。そのために、支持体
に、植物組織を置く範囲の周辺に全ての組織が残留して
いない、且つ支持体が相互に良好な付着を確保する、組
織周辺の少なくとも１ｃｍの水準の充分に広い円形帯を
供することができる。

【００２１】最後に、インビトロで培養された植物組織
を含む両方の支持体は、適切な容器入れ、少なくとも１
つの支持体は、その支持体の１つの表面との毛管現象に
よって、容器の１つの表面に単に保持される。

【００２２】本発明の方法は小型の対象物に使用するこ
とができ、それは多数の対象物を容易に輸送できるから
商業的配送と両立できる。例えば植物種の大量の体胚を
配送しようと望む場合、本発明の方法により、直径５．
５ｃｍおよび高さ１ｃｍの標準のペトリ皿の中に、長さ
が０．０５から０．２ｃｍの約１００の胚を置くことが
可能である。このように１ｍ³ の包みは３２８０個のペ
トリ皿を含み、即ち約３２８，０００の胚を含む。比較
のために、根と１対の葉を有する葉のある小植物の輸送
は、一般に例えばｍ³ あたり５，０００から１０，００
０の小植物を含む。

【００２３】本発明の方法は、全ての種類の植物に、特
にコーヒーの木、カカオの木、パラゴムの木、バナナの
木、ココナツの木およびオイルパームの木のような木質
植物、および特にトマト、ニンジン、エンドウ、セロリ
およびウイキョウのような野菜植物に使用する。当業者
は、インビトロで培養された植物組織を得るための多く
の技術を有し、かつそれらを、例えば、胚、芽又は根の
ようなある種の組織を得ることに関して特殊な条件を必
要とする各植物の種類に使用することができる。指針と
して、カカオの木、コーヒーの木、オイルパームの木の
およびニンジンの体胚の発生は、それぞれ、ＵＳ特許第
５，３１２，８０１号明細書に、Zamarripa による
(「Cafe Cacao et The 」、35号、233-244 ページ、199
1年) に、Engelmann 等による（「Oleagineux」、41号,
169-172 ページ，1986年) に、およびＥＰ特許第３９
９１５８号明細書に記載されている方法により、行うこ
とができる。

【００２４】本発明の方法は、特にインビトロで培養に
おいて、例えば週当たり１０未満の増殖速度、即ち毎週
１０倍以下の更に新鮮な物質を特徴とするゆるやかな成
長をもつ全の植物種、特に木質植物に適用する。基準と
して、ゆっくりとした成長を有する胚は、１から２ヶ月
あたり１ｍｍから１０ｍｍの大きさ（最大の長さとみな
される) に推移する。

【００２５】ゆっくりと成長する植物組織は、輸送期間
中（１から１００日) 、好ましくは暗所で、および／又
は１０℃から３５℃の温度で、特に１５から３０℃で保
存される。

【００２６】組織が脱水されている場合、本発明による
組織を暗所でおよび／又は冷蔵又は冷凍温度（例えば−
４℃) から３０−３５℃迄で保存することも可能であ
る。しかし、そのような処理は組織を不可逆的に損傷し
がちであるから、葉緑素を含有する組織が脱水しないよ
うな注意が必要である。

【００２７】組織を脱水するために、さらに上記の技術
以外にあるいは加えて、例えば伝統的培養基に、浸透圧
剤を加え、またビタミンＢ１、ニコチン酸又はアデニン
のようなある種の有機物質も加えて、組織は充分に培養
される。この試剤は、細胞膜の浸透性に影響することな
く細胞の満足すべき脱水を得るように、組織に浸透しか
つ適当な浸透圧を確保し得る物質から当業者によって選
択することができる。この試剤は、スクロース又はトレ
ハロースのような糖、又は同様な機能を行うことが知ら
れている他の物質であることができる。培養基中の浸透
圧剤の濃度は、細胞の満足すべき脱水を確保するよう
に、余り低すぎないのが望ましい。それは、組織を損傷
しないよう、又保存後再び成長するのを防止するために
余り高過ぎないようにすべきである。基準として、組織
を５０から１９０ｇ／ｌの、特に１００から１５ｇ／ｌ
のスクロースを含有する培養基で脱水することができ
る。

【００２８】本発明による方法が組織の成長を充分に抑
制するのに充分でないと思われる時に、組織の脱水も組
織の成長を可逆的に抑制する手段である。この目的のた
めに、週当たり１０より大きな増殖速度（１０倍のさら
に新しい物質) を有する組織を、上記のごとく脱水する
のが望ましい。基準として、急速に成長する胚は、例え
ば１ｍｍの大きさから１０ｍｍに、４から６日に推移す
る（最も大きな長さとみなされる）。インビトロの培養
で急速な成長をする植物の中に、例えばニンジン、セロ
リ、ウイキョウの名が挙げられる。

【００２９】輸送後、組織の取出しは非常に容易であ
る。培養基をおおう支持体を充分に振動して組織をそれ
から取出す。組織は、当業者に既知の器具で移植するこ
とができる。

【００３０】本発明は、下文に示す適用例においておよ
び本発明による装置を図示する図１を参照しながら、更
に詳細に記述する。本発明による方法の特徴は、下記の
特定例に限定せず、当業者によってある植物種と組織に
採用することができる。

【００３１】図１において、栄養液を浸みこませた支持
体１（ガラス繊維で作られたフィルター）は、毛管現象
によってペトリ皿の底部２に可逆的に取り付けられ、そ
の支持体の他の表面は、インビトロで培養された植物組
織３を受け入れる。栄養液を浸み込ませることができ
る、第２の支持体４（ガラス繊維で作られたフィルタ
ー）は組織３および第１の支持体２と接触する。最後に
ペトリ皿のカバー５は容器を閉じることを可能にし、例
えばプラスチックフイルムによって最終的な密閉を行う
ことができる。

【００３２】例１ ロバスタコーヒーの木（Coffea canephora) の１００の
体胚を、魚雷型胚の段階で、Zamarripa 等の方法（「Ca
fe Cacao et The 」、35号、233-244 ページ、1991年)
により得、それを１つずつ、Murashige およびSkoog の
液体培地を浸み込ませた、ガラス繊維で作られた２つの
フィルター (Whatman GFC,直径５ｃｍ，０．０１ｇの乾
燥重量) の間に置く。浸み込ませたフィルターは液を放
出しないことを認めることがきる。フィルターをペトリ
皿の中に配置する。コーヒーの木の胚を含む数個のペト
リ皿を同様な方法で調製し、それらを２０℃で保存し、
ついで定期的にそれらの胚を、培養皿の半固体の培地の
上に入れ、生き残っている胚の数（生存能力）および小
植物に発育することができる胚の数（転換）を測定す
る。下記の表に示された結果は、全ての胚が１５日の保
存で完全に生き残り、且つ１から３０日保存された胚の
小植物への転換は、魚雷型胚の段階で得た、パッケージ
していない胚の転換よりかなり良好であることを示して
いる。

【表１】

【００３３】例２ Zamarripa 等の方法により魚雷型胚の段階で得た、１ｇ
のロバスタコーヒーの木（Coffea canephora) の体胚
を、集塊として、Murashige およびSkoog の液体培地を
浸み込ませた２つのガラスフィルター（Whatman GFC,
直径５ｃｍ，０．０１ｇの乾燥重量) の間に置く。つい
でフィルターをペトリ皿に入れる。コーヒーの木の胚を
含む数個のペトリ皿を同じ方法で調製し、それらを２０
℃で４週間保存し、ついで２４５０個の胚を半固体の培
地の上に入れ、小植物に発育することができる胚の数
（転換）を測定する。結果は５カ月間に７９４の小植物
が発育することを示す。それ故に、包装された胚は３２
％の転換率を示し、それは伝統的な包装していないコー
ヒーの胚が示す転換率に類似する（表参照）。

【００３４】例３ 例２と同様な方法で、ロバスタコーヒーの木（Coffea c
anephora) からの０．１ｇのカルスをペトリ皿ごとにパ
ッケージし、カルスを２０℃で１月間保存する。ついで
このようにして得た植物物質の重量を測定し (０．５５
±０．２３ｇの新鮮な物質）、次にそれを対照の、０．
１ｇの新鮮なカルスを摂取してパッケージせずに１月間
培養した植物物質の重量 (０．５９±０．１８ｇの新鮮
物質) と比較する。結果は、コーヒーの木のカルスがそ
のパッケージで完全に生き残ることを示す。

【００３５】例４ ＥＰ特許第３９９１５８号明細書に記載のごとく、魚雷
型胚の段階でとった体胚を、浸透圧剤を含む培地で前も
って処理し、ついでそれらを例２に記載のごとくパッケ
ージする。このようにパッケージしたニンジンの胚は数
日間、生存能力およびパッケージしていないニンジンの
胚に匹敵する小植物に生育する能力を保持する。

【００３６】例５ 魚雷型胚の段階で取ったニンジンの体胚を例２に記載の
如くパッケージし、唯一の差は、胚を前もって１００ｇ
／ｌのスクロースを含む培地で脱水することである。つ
いで、それらを栄養液を浸み込ませたガラス繊維製のフ
ィルターと他の乾燥したフィルターの間に置く。このよ
うにパッケージしたニンジンの胚は数日間、生存能力お
よびパッケージしていないニンジンの胚に匹敵する小植
物に成長する能力を保持する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の装置の概要の図である。

【符号の説明】

１ 栄養液を浸み込ませた第１の支持体( ガラス繊維で
作ったフィルター） ２ ペトリ皿の底部 ３ 試験管の中で培養された植物組織 ４ 栄養液を浸み込ませることのできる第２の支持体
（ガラス繊維で作ったフィルター） ５ ペトリ皿のカバー

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 無菌容器中、インビトロで培養された植
   物組織を、液体栄養培地を含浸させた２つの固体支持体
   の表面の間に置き、その植物組織を少なくとも１つの支
   持体の表面に毛管現象によって堅く付着させ、又他の支
   持体面の少なくとも１つを毛管現象によって容器の面の
   １つに堅く付着させ、そして組織を保存することを特徴
   とする、インビトロで培養された植物組織をパッケージ
   する方法。
2. 【請求項２】 支持体は、部分的に又は完全に液体を含
   む繊維状の物質、又は液体を保持し得る物質から成る、
   請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 少なくとも１つの支持体に含浸させた液
   体の量は、容器の中の相対湿度を少なくとも９５％に、
   少なくとも１から５日間確保することを可能にする量で
   ある、請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 週あたり１０未満の増殖速度を有する胚
   を使用する、請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】 ２つの支持体の１つを最初に乾燥する、
   請求項１記載の方法。
6. 【請求項６】 脱水した胚を使用する、請求項１から５
   のいずれか１項に記載の方法。
7. 【請求項７】 週あたり１０以上の増殖速度を有する胚
   を使用する、請求項５又は６に記載の方法。
8. 【請求項８】 胚を−４℃から３５℃で保存する、請求
   項７記載する方法。
9. 【請求項９】 インビトロで培養された植物組織を含む
   パッケージ器具において、パッケージ器具は密閉可能な
   無菌の容器から成り、その容器の中で、インビトロで培
   養された植物組織を液体栄養培地を浸み込ませた２つの
   固体の支持体の表面の間に置き、その植物組織を少なく
   とも１つの支持体の表面に毛管現象で堅く付着させ、又
   少なくとも１つの支持体の他の表面を容器の１つの面に
   毛管現象によって堅く付着させることを特徴とする、上
   記の植物組織を含むパッケージ器具。