JPH1057060A - 第ＶＩＩＩ因子凝固活性およびｖＷＦ結合活性を示す医薬製剤 - Google Patents
第ＶＩＩＩ因子凝固活性およびｖＷＦ結合活性を示す医薬製剤Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 第ＶＩＩＩ因子凝固促進活性およびｖＷＦ結
合活性を有する安定な医薬的製剤およびその製法と使用
法。 【解決手段】 第ＶＩＩＩ因子凝固促進活性およびｖＷ
Ｆ結合活性を有し、第ＶＩＩＩ因子蛋白質のアミノ酸配
列に由来するアミノ酸配列を持ち、第ＶＩＩＩ因子の免
疫優性領域中の少なくとも１個所に少なくとも１個の突
然変異を含む蛋白質を含有する安定な医薬的製剤を提供
する。また、この安定な医薬的製剤の製法およびその製
剤の医学的使用法を記載する。
合活性を有する安定な医薬的製剤およびその製法と使用
法。 【解決手段】 第ＶＩＩＩ因子凝固促進活性およびｖＷ
Ｆ結合活性を有し、第ＶＩＩＩ因子蛋白質のアミノ酸配
列に由来するアミノ酸配列を持ち、第ＶＩＩＩ因子の免
疫優性領域中の少なくとも１個所に少なくとも１個の突
然変異を含む蛋白質を含有する安定な医薬的製剤を提供
する。また、この安定な医薬的製剤の製法およびその製
剤の医学的使用法を記載する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は第ＶＩＩＩ因子凝固
促進（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ）活性およびｖＷＦ結
合活性を有する安定な医薬的製剤に関する。
促進（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ）活性およびｖＷＦ結
合活性を有する安定な医薬的製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】第ＶＩＩＩ因子は内因性血液凝固経路で
はＣａ2+および燐脂質の存在下に第Ｘ因子から第Ｘａ因
子への第ＩＸａ因子依存性変換に対する補助因子として
機能している。第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡの分子クローニ
ングで第ＶＩＩＩ因子は一連の相同的なドメインから構
成されており、Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２とし
て表示できることが判明した。血漿中では、第ＶＩＩＩ
因子はフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）に非共有結合
的に結合した金属イオン結合ヘテロ２量体として循環し
ている。分子量９００００から２０００００を持つ第Ｖ
ＩＩＩ因子の重鎖はＡ１−およびＡ２−ドメインならび
にＢドメインの可変部分を含む。８０ｋＤａの第ＶＩＩ
Ｉ因子軽鎖は、Ａ３−、Ｃ１−およびＣ２−ドメインか
ら構成されている。第ＶＩＩＩ因子の活性化は重鎖内の
Ａｒｇ372とＡｒｇ740および軽鎖内のＡｒｇ1609アミノ
酸位置におけるトロンビンによる限定的な蛋白質分解に
よって起きる。従って活性化された第ＶＩＩＩ因子はト
ロンビンが切断した軽鎖とともに独立したＡ１−および
Ａ２−ドメインのヘテロ３重体から構成されている。
はＣａ2+および燐脂質の存在下に第Ｘ因子から第Ｘａ因
子への第ＩＸａ因子依存性変換に対する補助因子として
機能している。第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡの分子クローニ
ングで第ＶＩＩＩ因子は一連の相同的なドメインから構
成されており、Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２とし
て表示できることが判明した。血漿中では、第ＶＩＩＩ
因子はフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）に非共有結合
的に結合した金属イオン結合ヘテロ２量体として循環し
ている。分子量９００００から２０００００を持つ第Ｖ
ＩＩＩ因子の重鎖はＡ１−およびＡ２−ドメインならび
にＢドメインの可変部分を含む。８０ｋＤａの第ＶＩＩ
Ｉ因子軽鎖は、Ａ３−、Ｃ１−およびＣ２−ドメインか
ら構成されている。第ＶＩＩＩ因子の活性化は重鎖内の
Ａｒｇ372とＡｒｇ740および軽鎖内のＡｒｇ1609アミノ
酸位置におけるトロンビンによる限定的な蛋白質分解に
よって起きる。従って活性化された第ＶＩＩＩ因子はト
ロンビンが切断した軽鎖とともに独立したＡ１−および
Ａ２−ドメインのヘテロ３重体から構成されている。
【０００３】Ｘ連鎖出血性疾患である血友病Ａは第ＶＩ
ＩＩ因子の不在（機能的）に関連付けられてきた。何年
もかかって、多数の血友病Ａ患者での第ＶＩＩＩ因子遺
伝子中の分子的欠陥が特定された（Ｔｕｄｄｅｎｈａｍ
など、ＮＡＲ、２２巻（１９９４年）：３５１１〜３５
３３頁；Ａｎｔｏｎａｒａｋｉｓなど、Ｈｕｍａｎ・Ｍ
ｕｔａｔｉｏｎ、５巻（１９９５年）：１〜２２頁）。
血漿中に交差反応物質（ＣＲＭ+）を有する血友病Ａ患
者には特別に注視されてきた。ＣＲＭ+−血友病Ａ患者
の血漿からの第ＶＩＩＩ因子の微細精製法を採用する洗
練された研究によって第ＶＩＩＩ因子の構造−機能相関
関係に関する現在の知識に明白な寄与がなされた。Ａｒ
ｇ372およびＡｒｇ1689のアミノ酸位置にあるトロンビ
ン切断部位における突然変異が第ＶＩＩＩ因子の活性化
を妨害することが証明されたが、これはトロンビンの切
断部位が部位特異的突然変異誘発によって変化させた組
換え蛋白質で得られたデータと符合した。
ＩＩ因子の不在（機能的）に関連付けられてきた。何年
もかかって、多数の血友病Ａ患者での第ＶＩＩＩ因子遺
伝子中の分子的欠陥が特定された（Ｔｕｄｄｅｎｈａｍ
など、ＮＡＲ、２２巻（１９９４年）：３５１１〜３５
３３頁；Ａｎｔｏｎａｒａｋｉｓなど、Ｈｕｍａｎ・Ｍ
ｕｔａｔｉｏｎ、５巻（１９９５年）：１〜２２頁）。
血漿中に交差反応物質（ＣＲＭ+）を有する血友病Ａ患
者には特別に注視されてきた。ＣＲＭ+−血友病Ａ患者
の血漿からの第ＶＩＩＩ因子の微細精製法を採用する洗
練された研究によって第ＶＩＩＩ因子の構造−機能相関
関係に関する現在の知識に明白な寄与がなされた。Ａｒ
ｇ372およびＡｒｇ1689のアミノ酸位置にあるトロンビ
ン切断部位における突然変異が第ＶＩＩＩ因子の活性化
を妨害することが証明されたが、これはトロンビンの切
断部位が部位特異的突然変異誘発によって変化させた組
換え蛋白質で得られたデータと符合した。
【０００４】さらに、第ＶＩＩＩ因子遺伝子中の２個の
突然変異がこの蛋白質に付加的なグリコシル化を招き、
これが第ＶＩＩＩ因子の活性を妨害することが証明され
た。血漿中の第ＶＩＩＩ因子濃度が低い患者での遺伝子
的欠陥の分子的根拠はまだこのような明確さでは解明さ
れていない。Ｈｉｇｕｃｈｉとその協力者は軽症血友病
Ａに罹患している患者の第ＶＩＩＩ因子遺伝子中にアミ
ノ酸番号１６８０にあるフェニルアラニンの代わりにチ
ロジンが置換した突然変異を確認した（ＰＮＡＳ、８８
巻（１９９１年）：８３０７〜８３１１頁）。この特定
のアミノ酸置換を有する組換え第ＶＩＩＩ因子蛋白質は
ｖＷＦとの結合に欠陥を持つことが証明された。
突然変異がこの蛋白質に付加的なグリコシル化を招き、
これが第ＶＩＩＩ因子の活性を妨害することが証明され
た。血漿中の第ＶＩＩＩ因子濃度が低い患者での遺伝子
的欠陥の分子的根拠はまだこのような明確さでは解明さ
れていない。Ｈｉｇｕｃｈｉとその協力者は軽症血友病
Ａに罹患している患者の第ＶＩＩＩ因子遺伝子中にアミ
ノ酸番号１６８０にあるフェニルアラニンの代わりにチ
ロジンが置換した突然変異を確認した（ＰＮＡＳ、８８
巻（１９９１年）：８３０７〜８３１１頁）。この特定
のアミノ酸置換を有する組換え第ＶＩＩＩ因子蛋白質は
ｖＷＦとの結合に欠陥を持つことが証明された。
【０００５】アミノ酸番号２３０７にあるアルギニンが
グルタミンによって置換された第ＶＩＩＩ因子分子の別
種の突然変異は軽症から中等度な血友病Ａに関連付けら
れている（Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、
２３２巻（１９８６年）：１４１５〜１４１６頁；Ｃａ
ｓｕｌａなど、Ｂｌｏｏｄ、（１９９０年）：６６２〜
６７０頁）。第ＶＩＩＩ因子の機能における残基Ａｒｇ
2307の機能的な重要性はこの特異的残基を有する合成ペ
プチドが第ＶＩＩＩ因子の燐脂質への結合を阻害する性
能によって示唆された。さらにその上、在来型第ＶＩＩ
Ｉ因子分子のこの部分がｖＷＦに結合することができる
という事実が証明された。血漿から精製した材料を用
い、この突然変異によって起される欠陥を特徴付ける最
初の試みは不成功に終わった。
グルタミンによって置換された第ＶＩＩＩ因子分子の別
種の突然変異は軽症から中等度な血友病Ａに関連付けら
れている（Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、
２３２巻（１９８６年）：１４１５〜１４１６頁；Ｃａ
ｓｕｌａなど、Ｂｌｏｏｄ、（１９９０年）：６６２〜
６７０頁）。第ＶＩＩＩ因子の機能における残基Ａｒｇ
2307の機能的な重要性はこの特異的残基を有する合成ペ
プチドが第ＶＩＩＩ因子の燐脂質への結合を阻害する性
能によって示唆された。さらにその上、在来型第ＶＩＩ
Ｉ因子分子のこの部分がｖＷＦに結合することができる
という事実が証明された。血漿から精製した材料を用
い、この突然変異によって起される欠陥を特徴付ける最
初の試みは不成功に終わった。
【０００６】その一方では、第ＶＩＩＩ因子濃縮物で処
置した血友病Ａ患者の約２０％は第ＶＩＩＩ因子阻害剤
（すなわち、第ＶＩＩＩ因子に対する抗体）を産生し、
それが投与した第ＶＩＩＩ因子製品の効果を阻害するこ
とが知られている。
置した血友病Ａ患者の約２０％は第ＶＩＩＩ因子阻害剤
（すなわち、第ＶＩＩＩ因子に対する抗体）を産生し、
それが投与した第ＶＩＩＩ因子製品の効果を阻害するこ
とが知られている。
【０００７】第ＶＩＩＩ因子阻害性患者の処置は非常に
困難で、現在までにこれら血友病Ａ阻害性患者を処置す
るための特効的な方法はごく僅かしかない。
困難で、現在までにこれら血友病Ａ阻害性患者を処置す
るための特効的な方法はごく僅かしかない。
【０００８】高用量の第ＶＩＩＩ因子を投与するのは非
常に高価ではあるが第ＶＩＩＩ因子抗体を生体内で中和
することも可能である。過剰な第ＶＩＩＩ因子が次に止
血剤として作用する。多くの場合、脱感作が起きるが、
そうすれば再び標準的な第ＶＩＩＩ因子処置を採用する
ことが可能である。しかしながら、このような高用量で
の処置には多量の第ＶＩＩＩ因子が必要であり、時間が
かかり、重症なアナフィラキシー副作用に苦しめられる
こともある。
常に高価ではあるが第ＶＩＩＩ因子抗体を生体内で中和
することも可能である。過剰な第ＶＩＩＩ因子が次に止
血剤として作用する。多くの場合、脱感作が起きるが、
そうすれば再び標準的な第ＶＩＩＩ因子処置を採用する
ことが可能である。しかしながら、このような高用量で
の処置には多量の第ＶＩＩＩ因子が必要であり、時間が
かかり、重症なアナフィラキシー副作用に苦しめられる
こともある。
【０００９】費用に拘らずに第ＶＩＩＩ因子阻害性を取
除く別法の一つでは免疫グロブリン（プロテインＡ、プ
ロテインＧ）に結合する植物性凝集素または固定化第Ｖ
ＩＩＩ因子への体外免疫吸着を用いる。この処置の間、
患者をアフェレース装置に結合しなければならないの
で、この方法は経済的にも患者にも大きな負担となる。
これとは別に、この方法による急性出血を凝血させるこ
とも可能ではない。
除く別法の一つでは免疫グロブリン（プロテインＡ、プ
ロテインＧ）に結合する植物性凝集素または固定化第Ｖ
ＩＩＩ因子への体外免疫吸着を用いる。この処置の間、
患者をアフェレース装置に結合しなければならないの
で、この方法は経済的にも患者にも大きな負担となる。
これとは別に、この方法による急性出血を凝血させるこ
とも可能ではない。
【００１０】しかしながら、現在選択すべき治療法はＦ
ＥＩＢＡ（商標）およびＡＵＴＯＰＬＥＸ（商標）のよ
うな活性化プロトロンビン複合体濃縮物（ＡＰＣＣ）の
投与であって、これは阻害性指数の高い患者でも急性出
血を処置するために適当である（たとえばドイツ特許公
報３１２７３１８参照）。
ＥＩＢＡ（商標）およびＡＵＴＯＰＬＥＸ（商標）のよ
うな活性化プロトロンビン複合体濃縮物（ＡＰＣＣ）の
投与であって、これは阻害性指数の高い患者でも急性出
血を処置するために適当である（たとえばドイツ特許公
報３１２７３１８参照）。
【００１１】現在活発に研究されているその他の方法に
は抗遺伝子型抗体を含む免疫グロブリン製品の投与およ
び組換え第ＶＩＩａ因子の投与がある。しかし、両方法
ともそれらの臨床的効果に最終的な評価を与えることは
現在のところ不可能である。
は抗遺伝子型抗体を含む免疫グロブリン製品の投与およ
び組換え第ＶＩＩａ因子の投与がある。しかし、両方法
ともそれらの臨床的効果に最終的な評価を与えることは
現在のところ不可能である。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】第ＶＩＩＩ因子阻害剤
およびそれに関連する凝血疾患を有する患者を処置する
ための医薬的製剤であって、簡単に投与でき、投与すべ
き製品が高度に安定であり、効果的に処置でき、そして
半減期が長いために患者の負担を軽減できるものを提供
することが本発明の目的の一つである。
およびそれに関連する凝血疾患を有する患者を処置する
ための医薬的製剤であって、簡単に投与でき、投与すべ
き製品が高度に安定であり、効果的に処置でき、そして
半減期が長いために患者の負担を軽減できるものを提供
することが本発明の目的の一つである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】この目的は第ＶＩＩＩ因
子凝固促進活性およびｖＷＦ結合活性を有し、第ＶＩＩ
Ｉ因子蛋白質、好ましくはヒトの第ＶＩＩＩ因子蛋白
質、のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を持ち、第
ＶＩＩＩ因子の免疫優性領域の少なくとも１個所に少な
くとも１個の突然変異を有する蛋白質を含有する安定な
医薬的製剤によって達せられる。第ＶＩＩＩ因子蛋白質
の免疫優性領域はこの蛋白質に存在して優先的に抗体形
成を起こすエピトープ、構造またはドメインであると定
義される。
子凝固促進活性およびｖＷＦ結合活性を有し、第ＶＩＩ
Ｉ因子蛋白質、好ましくはヒトの第ＶＩＩＩ因子蛋白
質、のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を持ち、第
ＶＩＩＩ因子の免疫優性領域の少なくとも１個所に少な
くとも１個の突然変異を有する蛋白質を含有する安定な
医薬的製剤によって達せられる。第ＶＩＩＩ因子蛋白質
の免疫優性領域はこの蛋白質に存在して優先的に抗体形
成を起こすエピトープ、構造またはドメインであると定
義される。
【００１４】この突然変異は、あるアミノ酸の交換、置
換または欠失（たとえば、生体内で第ＶＩＩＩ因子の活
性に必須ではない領域の欠失など）または挿入（たとえ
ばある領域の倍加など）を起こす点突然変異であっても
よい。
換または欠失（たとえば、生体内で第ＶＩＩＩ因子の活
性に必須ではない領域の欠失など）または挿入（たとえ
ばある領域の倍加など）を起こす点突然変異であっても
よい。
【００１５】この突然変異が第ＶＩＩＩ因子分子のＣ２
−および／またはＡ２−ドメインに存在するものが好ま
しい。
−および／またはＡ２−ドメインに存在するものが好ま
しい。
【００１６】本発明に従えば、この製品に含まれる蛋白
質は第ＶＩＩＩ因子凝固促進活性およびｖＷＦ結合活性
の双方を示すべきである。
質は第ＶＩＩＩ因子凝固促進活性およびｖＷＦ結合活性
の双方を示すべきである。
【００１７】本医薬的製剤中の第ＶＩＩＩ因子突然変異
体蛋白質が免疫優性領域において突然変異を有しない第
ＶＩＩＩ因子蛋白質、例えば組換え第ＶＩＩＩ因子：Ｃ
に基づく商業的に入手可能な第ＶＩＩＩ因子製品、の第
ＶＩＩＩ因子凝固促進活性および／またはｖＷＦ結合活
性に比べ少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０
％、さらに好ましくは少なくとも８０％、殊に少なくと
も１００％の第ＶＩＩＩ因子凝固促進活性および／また
はｖＷＦ結合活性を示すのが好都合である。
体蛋白質が免疫優性領域において突然変異を有しない第
ＶＩＩＩ因子蛋白質、例えば組換え第ＶＩＩＩ因子：Ｃ
に基づく商業的に入手可能な第ＶＩＩＩ因子製品、の第
ＶＩＩＩ因子凝固促進活性および／またはｖＷＦ結合活
性に比べ少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０
％、さらに好ましくは少なくとも８０％、殊に少なくと
も１００％の第ＶＩＩＩ因子凝固促進活性および／また
はｖＷＦ結合活性を示すのが好都合である。
【００１８】第ＶＩＩＩ因子凝固促進活性およびｖＷＦ
結合活性の評価は、それぞれ一段法凝固検定、たとえば
第ＶＩＩＩ因子ＩＭＭＵＮＯＣＨＲＯＭ（ＩＭＭＵＮＯ
社）のようなクロモーゲン検定法および固定化ｖＷＦへ
の第ＶＩＩＩ因子の吸着またはその逆、など特に第ＶＩ
ＩＩ因子試料を検定する時に通常実施する検査法による
これらの性質に適切な検査法のいずれによっても実行で
きる（Ｖｅｌｔｋａｍｐなど、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｄｉａｔ
ｈ．Ｈａｅｍｏｓ．、１９巻（１９６８年）：２７９〜
３０３頁も参照）。
結合活性の評価は、それぞれ一段法凝固検定、たとえば
第ＶＩＩＩ因子ＩＭＭＵＮＯＣＨＲＯＭ（ＩＭＭＵＮＯ
社）のようなクロモーゲン検定法および固定化ｖＷＦへ
の第ＶＩＩＩ因子の吸着またはその逆、など特に第ＶＩ
ＩＩ因子試料を検定する時に通常実施する検査法による
これらの性質に適切な検査法のいずれによっても実行で
きる（Ｖｅｌｔｋａｍｐなど、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｄｉａｔ
ｈ．Ｈａｅｍｏｓ．、１９巻（１９６８年）：２７９〜
３０３頁も参照）。
【００１９】本発明による突然変異体蛋白質の第ＶＩＩ
Ｉ因子凝固活性は、好ましくはたとえばＭｉｋａｅｌｓ
ｓｏｎとＯｓｗａｌｄｓｓｏｎ、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｈａ
ｅｍａｔｏｌ．、３３巻（１９８４年）Ｓｕｐｐｌ．、
７９〜８６頁に記載のような「１段法凝固検定」によっ
て検査する。
Ｉ因子凝固活性は、好ましくはたとえばＭｉｋａｅｌｓ
ｓｏｎとＯｓｗａｌｄｓｓｏｎ、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｈａ
ｅｍａｔｏｌ．、３３巻（１９８４年）Ｓｕｐｐｌ．、
７９〜８６頁に記載のような「１段法凝固検定」によっ
て検査する。
【００２０】第ＶＩＩＩ因子活性はまた、第Ｘ因子から
第Ｘａ因子への変換における第ＩＸａ因子の補助因子と
して機能する第ＶＩＩＩ因子の性能を第Ｘａ因子に対す
る発色性基質を用いて（Ｃｏａｔｅｓｔ・Ｆａｃｔｏｒ
・ＶＩＩＩ、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ社、メルンダー
ル、スウェーデン）測定することによって評価してもよ
い。これに加えて、試料中の第ＶＩＩＩ因子活性量を測
定するために役立つその他の方法も本発明に記載する突
然変異体蛋白質の第ＶＩＩＩ因子活性を検査するために
利用しうる。
第Ｘａ因子への変換における第ＩＸａ因子の補助因子と
して機能する第ＶＩＩＩ因子の性能を第Ｘａ因子に対す
る発色性基質を用いて（Ｃｏａｔｅｓｔ・Ｆａｃｔｏｒ
・ＶＩＩＩ、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ社、メルンダー
ル、スウェーデン）測定することによって評価してもよ
い。これに加えて、試料中の第ＶＩＩＩ因子活性量を測
定するために役立つその他の方法も本発明に記載する突
然変異体蛋白質の第ＶＩＩＩ因子活性を検査するために
利用しうる。
【００２１】ある新規突然変異体第ＶＩＩＩ因子蛋白質
がどのような割合で第ＶＩＩＩ因子凝固促進活性を示す
かを測定する実際の検定法は、免疫優性領域に突然変異
のない同一の第ＶＩＩＩ因子分子に対する検定（たとえ
ば第ＶＩＩＩ因子野生型または完全な活性を示すＢ−ド
メイン欠失第ＶＩＩＩ因子）と並行して実施するのが好
ましい。このような突然変異第ＶＩＩＩ因子分子の補正
検定法で相対的凝固促進活性（野生型またはＢ−ドメイ
ン欠失第ＶＩＩＩ因子の活性を１００％として比較する
百分率活性）が環境的誤差の危険なしに検定しうる。
がどのような割合で第ＶＩＩＩ因子凝固促進活性を示す
かを測定する実際の検定法は、免疫優性領域に突然変異
のない同一の第ＶＩＩＩ因子分子に対する検定（たとえ
ば第ＶＩＩＩ因子野生型または完全な活性を示すＢ−ド
メイン欠失第ＶＩＩＩ因子）と並行して実施するのが好
ましい。このような突然変異第ＶＩＩＩ因子分子の補正
検定法で相対的凝固促進活性（野生型またはＢ−ドメイ
ン欠失第ＶＩＩＩ因子の活性を１００％として比較する
百分率活性）が環境的誤差の危険なしに検定しうる。
【００２２】ｖＷＦ結合活性はｖＷＦ結合のための検定
の間に形成された第ＶＩＩＩ因子：Ｃ／ｖＷＦ複合体を
測定することができるいかなる検査系によって検定して
もよい。ｖＷＦへの突然変異体第ＶＩＩＩ因子蛋白質の
結合は文献記載の検定法（たとえばＬｅｙｔｅなど、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２５７巻（１９９０年）、６７９
〜６８３頁；Ｄｏｎａｔｈなど、Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｊ．、３１２巻（１９９５年）、４９〜５５頁）を使用
して実施しうる。これらの検定法においては精製または
非精製ｖＷＦのいずれを使用してもよい。使用するｖＷ
Ｆは精製ｖＷＦであることが好ましい。これらの方法
は、これに限定するものではないがマイクロタイター板
ウェルの精製ｖＷＦ被覆（Ｌｅｙｔｅなど、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｊ．、２５７巻（１９９０年）、６７９〜６８３
頁）を包含する。これとは別に、ｖＷＦに対するモノク
ローナル抗体を使用して精製または非精製ｖＷＦを固定
化してもよい（Ｌｅｙｔｅなど、Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｊ．、２７４巻（１９９１年）、２５７〜２６１頁；Ｄ
ｏｎａｔｈなど、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３１２巻（１
９９５年）、４９〜５５頁）。これに続き、異なる量の
第ＶＩＩＩ因子を固定化ｖＷＦに添加して結合した第Ｖ
ＩＩＩ因子の量を通常の方法で測定する。前記の方法を
第ＶＩＩＩ因子突然変異体蛋白質の結合をｖＷＦに向け
るために使用しうる。同様にしてｖＷＦに対する第ＶＩ
ＩＩ因子蛋白質の親和性測定に役立つ別の方法を本発明
に開示する突然変異体蛋白質のｖＷＦ結合性に向けるた
めに採用しうる。
の間に形成された第ＶＩＩＩ因子：Ｃ／ｖＷＦ複合体を
測定することができるいかなる検査系によって検定して
もよい。ｖＷＦへの突然変異体第ＶＩＩＩ因子蛋白質の
結合は文献記載の検定法（たとえばＬｅｙｔｅなど、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２５７巻（１９９０年）、６７９
〜６８３頁；Ｄｏｎａｔｈなど、Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｊ．、３１２巻（１９９５年）、４９〜５５頁）を使用
して実施しうる。これらの検定法においては精製または
非精製ｖＷＦのいずれを使用してもよい。使用するｖＷ
Ｆは精製ｖＷＦであることが好ましい。これらの方法
は、これに限定するものではないがマイクロタイター板
ウェルの精製ｖＷＦ被覆（Ｌｅｙｔｅなど、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｊ．、２５７巻（１９９０年）、６７９〜６８３
頁）を包含する。これとは別に、ｖＷＦに対するモノク
ローナル抗体を使用して精製または非精製ｖＷＦを固定
化してもよい（Ｌｅｙｔｅなど、Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｊ．、２７４巻（１９９１年）、２５７〜２６１頁；Ｄ
ｏｎａｔｈなど、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３１２巻（１
９９５年）、４９〜５５頁）。これに続き、異なる量の
第ＶＩＩＩ因子を固定化ｖＷＦに添加して結合した第Ｖ
ＩＩＩ因子の量を通常の方法で測定する。前記の方法を
第ＶＩＩＩ因子突然変異体蛋白質の結合をｖＷＦに向け
るために使用しうる。同様にしてｖＷＦに対する第ＶＩ
ＩＩ因子蛋白質の親和性測定に役立つ別の方法を本発明
に開示する突然変異体蛋白質のｖＷＦ結合性に向けるた
めに採用しうる。
【００２３】第ＶＩＩＩ因子凝固促進活性およびｖＷＦ
結合活性のための試験管内検査においては結果はしばし
ば人工的設計に起因する誤差に影響されうるので、両性
質を生体内または生体外での試験法で検定して活性値に
ついてさらに信頼度の高い結果を得るのが好ましい。
結合活性のための試験管内検査においては結果はしばし
ば人工的設計に起因する誤差に影響されうるので、両性
質を生体内または生体外での試験法で検定して活性値に
ついてさらに信頼度の高い結果を得るのが好ましい。
【００２４】試験管内での検定のように生体内試験を実
施する時にも免疫優性領域において突然変異を有しない
第ＶＩＩＩ因子分子との並行検査をするのが好ましい。
阻害剤の存在下に第ＶＩＩＩ因子：Ｃ活性を評価するた
めに適当な動物モデルはＷＯ９５／０１５７０およびＡ
９８７／９５に記載されている。
施する時にも免疫優性領域において突然変異を有しない
第ＶＩＩＩ因子分子との並行検査をするのが好ましい。
阻害剤の存在下に第ＶＩＩＩ因子：Ｃ活性を評価するた
めに適当な動物モデルはＷＯ９５／０１５７０およびＡ
９８７／９５に記載されている。
【００２５】好適な態様によれば、本発明の安定な医薬
的製剤中の第ＶＩＩＩ因子突然変異体蛋白質は第ＶＩＩ
Ｉ因子阻害剤の存在下に第ＶＩＩＩ因子凝固促進活性お
よび／またはｖＷＦ結合活性を示すが、これは阻害性患
者から分離したものであることも、それと等価なハイブ
リドーマ技術によって、特に抗第ＶＩＩＩ因子抗体の存
在下に製造した抗体であることもでき、これに限定する
ものではないが第ＶＩＩＩ因子のＣ２−ドメインおよび
Ａ２−ドメインに対するヒト由来の抗体、これに限定す
るものではないがＣＬＢ−ＣＡｇ１１７を包含するマウ
スモノクローナル抗体を包含する。阻害剤複数、少なく
とも２種類の抗体、の存在下に活性で、第ＶＩＩＩ因子
分子の免疫優性領域に結合する第ＶＩＩＩ因子突然変異
体を提供することは好適である。
的製剤中の第ＶＩＩＩ因子突然変異体蛋白質は第ＶＩＩ
Ｉ因子阻害剤の存在下に第ＶＩＩＩ因子凝固促進活性お
よび／またはｖＷＦ結合活性を示すが、これは阻害性患
者から分離したものであることも、それと等価なハイブ
リドーマ技術によって、特に抗第ＶＩＩＩ因子抗体の存
在下に製造した抗体であることもでき、これに限定する
ものではないが第ＶＩＩＩ因子のＣ２−ドメインおよび
Ａ２−ドメインに対するヒト由来の抗体、これに限定す
るものではないがＣＬＢ−ＣＡｇ１１７を包含するマウ
スモノクローナル抗体を包含する。阻害剤複数、少なく
とも２種類の抗体、の存在下に活性で、第ＶＩＩＩ因子
分子の免疫優性領域に結合する第ＶＩＩＩ因子突然変異
体を提供することは好適である。
【００２６】これら好適な突然変異体蛋白質が第ＶＩＩ
Ｉ因子阻害剤によって阻害されないかまたは僅かしか阻
害されない事実があれば、第ＶＩＩＩ因子阻害性患者の
処置の成功のためにはそれらが適当であることになる。
本発明による製品の第ＶＩＩＩ因子分子の好適な突然変
異は第ＶＩＩＩ因子の免疫優性エピトープまたは領域、
特にＣ２−またはＡ２−ドメインに存在する。部位特異
的突然変異誘発に好適な領域は、例えばＴｈｒ2302およ
びＴｒｐ2313のように、アミノ酸番号２１８２から２３
３２までの領域など、Ａｒｇ2307およびＡｒｇ593の近
くに存在する。そこでアルギニンをグルタミンまたはシ
ステインに置換することが望ましい。好ましい例には突
然変異体Ｒ２３０７ＱおよびＲ５９３Ｃがある。Ａ２−
ドメインに存在する別種の免疫優性領域はＡｒｇ484お
よびＩｌｅ508の間（Ｈｅａｌｅｙ，Ｇ．Ｆ．など、Ｊ
ＢＣ、２７０巻（１９９５年）、１４５０５〜１４５０
９頁）およびここに近い領域に存在する。新規突然変異
体は各々本発明による製品のために必要な性質を示すか
どうかについて前に略述したようにして検定できる。
Ｉ因子阻害剤によって阻害されないかまたは僅かしか阻
害されない事実があれば、第ＶＩＩＩ因子阻害性患者の
処置の成功のためにはそれらが適当であることになる。
本発明による製品の第ＶＩＩＩ因子分子の好適な突然変
異は第ＶＩＩＩ因子の免疫優性エピトープまたは領域、
特にＣ２−またはＡ２−ドメインに存在する。部位特異
的突然変異誘発に好適な領域は、例えばＴｈｒ2302およ
びＴｒｐ2313のように、アミノ酸番号２１８２から２３
３２までの領域など、Ａｒｇ2307およびＡｒｇ593の近
くに存在する。そこでアルギニンをグルタミンまたはシ
ステインに置換することが望ましい。好ましい例には突
然変異体Ｒ２３０７ＱおよびＲ５９３Ｃがある。Ａ２−
ドメインに存在する別種の免疫優性領域はＡｒｇ484お
よびＩｌｅ508の間（Ｈｅａｌｅｙ，Ｇ．Ｆ．など、Ｊ
ＢＣ、２７０巻（１９９５年）、１４５０５〜１４５０
９頁）およびここに近い領域に存在する。新規突然変異
体は各々本発明による製品のために必要な性質を示すか
どうかについて前に略述したようにして検定できる。
【００２７】本発明による第ＶＩＩＩ因子突然変異体は
好ましくはその他の突然変異、すなわち第ＶＩＩＩ因子
の生理学的活性に必須ではない領域であるＢ−ドメイン
の少なくとも一部に欠失を示す。欧州特許第０６９０１
２６号に例示されている欠失突然変異体を本発明による
突然変異を作成するために使用できる。本発明によるこ
のようなＢ−ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子突然変異体の
ための第ＶＩＩＩ因子凝固活性およびｖＷＦ結合活性の
ための比較検定法はそこで免疫優性領域に突然変異を有
しないＢ−ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子蛋白質と並行し
て実施するのが好ましい。
好ましくはその他の突然変異、すなわち第ＶＩＩＩ因子
の生理学的活性に必須ではない領域であるＢ−ドメイン
の少なくとも一部に欠失を示す。欧州特許第０６９０１
２６号に例示されている欠失突然変異体を本発明による
突然変異を作成するために使用できる。本発明によるこ
のようなＢ−ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子突然変異体の
ための第ＶＩＩＩ因子凝固活性およびｖＷＦ結合活性の
ための比較検定法はそこで免疫優性領域に突然変異を有
しないＢ−ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子蛋白質と並行し
て実施するのが好ましい。
【００２８】その他の突然変異体および／または断片な
らびに第ＶＩＩＩ因子蛋白質の誘導体は第ＶＩＩＩ因
子：Ｃ活性およびｖＷＦ結合活性を有する限り使用でき
る。
らびに第ＶＩＩＩ因子蛋白質の誘導体は第ＶＩＩＩ因
子：Ｃ活性およびｖＷＦ結合活性を有する限り使用でき
る。
【００２９】本発明の第ＶＩＩＩ因子突然変異体が通常
の阻害剤によって阻害されないにもかかわらずなおｖＷ
Ｆ結合活性を維持していることは驚異に価する。当分野
ではｖＷＦおよび阻害剤の結合部位が重複していること
が以前から知られていたのでこの発見はなお驚異的であ
る。
の阻害剤によって阻害されないにもかかわらずなおｖＷ
Ｆ結合活性を維持していることは驚異に価する。当分野
ではｖＷＦおよび阻害剤の結合部位が重複していること
が以前から知られていたのでこの発見はなお驚異的であ
る。
【００３０】試験管内または生体内でのｖＷＦへの結合
は製品中または患者への製剤投与後における第ＶＩＩＩ
因子突然変異体の安定性についての必要条件である。ｖ
ＷＦ存在下では第ＶＩＩＩ因子：Ｃ活性は安定化してお
り、その活性は長期間貯蔵後にさえ実質的に維持されて
いる。また、患者の中での第ＶＩＩＩ因子：Ｃレベルも
ｖＷＦ結合およびこのように安定化された第ＶＩＩＩ因
子突然変異体の長い半減期のおかげで投与後長時間経過
後にさえ上昇したままである。
は製品中または患者への製剤投与後における第ＶＩＩＩ
因子突然変異体の安定性についての必要条件である。ｖ
ＷＦ存在下では第ＶＩＩＩ因子：Ｃ活性は安定化してお
り、その活性は長期間貯蔵後にさえ実質的に維持されて
いる。また、患者の中での第ＶＩＩＩ因子：Ｃレベルも
ｖＷＦ結合およびこのように安定化された第ＶＩＩＩ因
子突然変異体の長い半減期のおかげで投与後長時間経過
後にさえ上昇したままである。
【００３１】本発明の別の側面は前記第ＶＩＩＩ因子突
然変異体とｖＷＦまたはｖＷＦ断片とを含む生物学的に
活性な第ＶＩＩＩ因子複合体に関する。たとえば欧州特
許第０１９７５６２号に記載されているような組換えｖ
ＷＦを使用することは好適である。
然変異体とｖＷＦまたはｖＷＦ断片とを含む生物学的に
活性な第ＶＩＩＩ因子複合体に関する。たとえば欧州特
許第０１９７５６２号に記載されているような組換えｖ
ＷＦを使用することは好適である。
【００３２】本発明のさらに別の側面は哺乳類細胞中で
前記第ＶＩＩＩ因子突然変異体蛋白質を発現すること、
これらの細胞からこの突然変異体蛋白質を精製すること
および精製された突然変異体蛋白質を医薬的製剤に製剤
化することを包含する本発明による医薬的製剤の製法で
ある。
前記第ＶＩＩＩ因子突然変異体蛋白質を発現すること、
これらの細胞からこの突然変異体蛋白質を精製すること
および精製された突然変異体蛋白質を医薬的製剤に製剤
化することを包含する本発明による医薬的製剤の製法で
ある。
【００３３】発現および精製の段階は第ＶＩＩＩ因子、
第ＶＩＩＩ因子突然変異体またはこれらに関連する蛋白
質の組換え生産について公知の方法のいずれかによって
実施しうる。医薬的製剤への製剤化技術には医薬的に許
容しうる添加剤、安定化剤、別種活性成分の添加、なら
びに適当な用量剤型および即時使用型包装の提供、を包
含しうる。
第ＶＩＩＩ因子突然変異体またはこれらに関連する蛋白
質の組換え生産について公知の方法のいずれかによって
実施しうる。医薬的製剤への製剤化技術には医薬的に許
容しうる添加剤、安定化剤、別種活性成分の添加、なら
びに適当な用量剤型および即時使用型包装の提供、を包
含しうる。
【００３４】発現は２０℃から４５℃までの範囲内の温
度で実施するのが好ましい。この発明に開示する突然変
異体蛋白質の生産のためには２５℃から３７℃までの温
度での発現は調整培地中での第ＶＩＩＩ因子をかなりな
量を得るために有用かもしれず；さらに好ましくは突然
変異体蛋白質の発現を促進するためには２８℃の温度を
採用しうる。
度で実施するのが好ましい。この発明に開示する突然変
異体蛋白質の生産のためには２５℃から３７℃までの温
度での発現は調整培地中での第ＶＩＩＩ因子をかなりな
量を得るために有用かもしれず；さらに好ましくは突然
変異体蛋白質の発現を促進するためには２８℃の温度を
採用しうる。
【００３５】共発現の標準的な技術を使用して、第ＶＩ
ＩＩ因子突然変異体蛋白質をｖＷＦまたはその断片とと
もに共発現することも可能である。
ＩＩ因子突然変異体蛋白質をｖＷＦまたはその断片とと
もに共発現することも可能である。
【００３６】これとは別に、第ＶＩＩＩ因子の免疫優性
領域に特定の突然変異を有する患者の血漿から突然変異
体第ＶＩＩＩ因子蛋白質を精製して、その精製された蛋
白質を本発明の安定な医薬的製剤を調製するために使用
することも可能である。
領域に特定の突然変異を有する患者の血漿から突然変異
体第ＶＩＩＩ因子蛋白質を精製して、その精製された蛋
白質を本発明の安定な医薬的製剤を調製するために使用
することも可能である。
【００３７】ｖＷＦおよび／またはｖＷＦ断片の添加は
好ましくは精製または製剤化段階の間に実施する。
好ましくは精製または製剤化段階の間に実施する。
【００３８】本発明はまた第ＶＩＩＩ因子阻害性を持つ
患者または第ＶＩＩＩ因子阻害性の可能性がある患者を
処置するための医薬的製剤の製造への前記第ＶＩＩＩ因
子突然変異体蛋白質の使用に関する。
患者または第ＶＩＩＩ因子阻害性の可能性がある患者を
処置するための医薬的製剤の製造への前記第ＶＩＩＩ因
子突然変異体蛋白質の使用に関する。
【００３９】本発明によれば、このような患者を本安定
化医薬的製剤の有効量で処置する。この有効量は彼また
は彼女が患っている疾患の重症度および患者の阻害性指
数の高さによって各患者ごとに容易に決定しうる。また
標準的な第ＶＩＩＩ因子療法の用量は本発明による医薬
的製剤の初期用量として信頼するに足る重要な基準とな
りうる。この突然変異体蛋白質は半減期が長いので本製
剤によるその後の処置の間に用量を減少させるのがよい
（本質的に必須ではないが）と思われる。
化医薬的製剤の有効量で処置する。この有効量は彼また
は彼女が患っている疾患の重症度および患者の阻害性指
数の高さによって各患者ごとに容易に決定しうる。また
標準的な第ＶＩＩＩ因子療法の用量は本発明による医薬
的製剤の初期用量として信頼するに足る重要な基準とな
りうる。この突然変異体蛋白質は半減期が長いので本製
剤によるその後の処置の間に用量を減少させるのがよい
（本質的に必須ではないが）と思われる。
【００４０】さらに別の側面によれば、本発明は前記第
ＶＩＩＩ因子突然変異体蛋白質に対して産生した抗体を
含む抗体製品を提供する。これらの抗体製品は、たとえ
ば本発明にによる第ＶＩＩＩ因子突然変異体蛋白質の精
製または検出および／または測定のためにまたは、殊に
患者の血液または血漿中の、第ＶＩＩＩ因子突然変異体
および在来型第ＶＩＩＩ因子を識別するために使用しう
る。
ＶＩＩＩ因子突然変異体蛋白質に対して産生した抗体を
含む抗体製品を提供する。これらの抗体製品は、たとえ
ば本発明にによる第ＶＩＩＩ因子突然変異体蛋白質の精
製または検出および／または測定のためにまたは、殊に
患者の血液または血漿中の、第ＶＩＩＩ因子突然変異体
および在来型第ＶＩＩＩ因子を識別するために使用しう
る。
【００４１】
【実施例】以下の実施例および付随する図面によって本
発明をさらに詳細に説明するものであるが、しかしなが
らこれを限定するものではない。
発明をさらに詳細に説明するものであるが、しかしなが
らこれを限定するものではない。
【００４２】実施例１：プラスミドの構築 Ａｌａ867がＡｓｐ1583に融合している第ＶＩＩＩ因子
突然変異体をコードするプラスミドｐＣＬＢ−ＢＰＶｄ
Ｂ６９５はＭｅｒｔｅｎｓなどが（Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａ
ｅｍａｔｏｌ、８５巻（１９９３年）、１３３〜１４５
頁）記載している。プラスミドｐＣＬＢ−ＢＰＶｄＢ６
９５は合成リンカー（５’−ＴＣＧＡＣＣＴＣＣＡＧＴ
ＴＧＡＡＣＡＴＴＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧ
ＧＡＡＡＴＡＧＡＧＣＴ−３’）を導入することによっ
て修正したもので、第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡの５’−末
端において出発コドン（下線部分）の前に翻訳開始のた
めの共通配列に連結する第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡの５’
−非翻訳領域の一部を含む（Ｋｏｚａｋ、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６巻（１９９１年）：１９８６７
〜１９８７０頁）。３’−末端である第ＶＩＩＩ因子ｃ
ＤＮＡのヌクレオチド番号７０６６にあるＰｓｔＩ部位
（出発コドンの第一ヌクレオチドに対応するヌクレオチ
ド１）に第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５ｃＤＮＡをプラスミ
ドＢＰＶにクローニングするために使用するＮｏｔＩ部
位を含むリンカーを挿入してプラスミドｐＣＬＢ−ＢＰ
ＶｄＢ６９５を得た。プラスミドｐＣＬＢ−ＢＰＶｄＢ
６９５−Ｒ２３０７Ｑは重複伸長法を使用する部位特異
的突然変異誘発によって構築した（Ｈｏなど、Ｇｅｎ
ｅ、７７巻（１９８９年）：５１〜５９頁）。オリゴヌ
クレオチドプライマーＲＱ２３０７−１（５’−ＣＧＣ
ＴＡＣＣＴＴＣＡＡＡＴＴＣＡＣＣＣＣ−３’；第ＶＩ
ＩＩ因子のヌクレオチド番号６９６７〜６９８７；セン
ス配列）およびオリゴヌクレオチドプライマーＲＱ２３
０７−２（５’−ＣＣＡＴＡＧＧＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡ
Ａ−３’；ｐＢＰＶのヌクレオチド番号１２２１〜１２
３９；アンチセンス配列）を使用して、第ＶＩＩＩ因子
ｃＤＮＡの一部およびプラスミドｐＢＰＶを含む３０２
ｂｐ断片を増幅した。オリゴヌクレオチドプライマーＲ
Ｑ２３０７−３（５’−ＴＴＡＧＧＡＴＣＣＣＡＣＴＡ
ＡＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴ−３’；ヌクレオチド番号５５
３０〜５５４７；センス配列）をオリゴヌクレオチドプ
ライマーＲＱ２３０７−４（５’−ＧＧＧＧＴＧＡＡＴ
ＴＴＧＡＡＧＧＴＡＣＣＣ−３’；第ＶＩＩＩ因子のヌ
クレオチド番号６９６７〜６９８７；アンチセンス配
列）と共に使用して、第ＶＩＩＩ因子の１４６４ｂｐ断
片を増幅した。反応条件は次の通り：２分間９０℃、２
０分間５０℃、３分間７２℃；３７回、４５秒間９０
℃、９０秒間５０℃、３分間７２℃；５分間６５℃、１
ｍＭ−ｄＮＴＰｓ、Ｐｆｕ−ポリメラーゼ反応緩衝液、
各オリゴヌクレオチドプライマー５０ｐＭｏｌ、および
Ｐｆｕ−ポリメラーゼ（Ｌｕｎｄｂｅｒｇなど、Ｇｅｎ
ｅ、１０８巻（１９９１年）、１〜６頁）２．５Ｕ存在
下。３０２ｂｐおよび１４６４ｂｐ断片の両方を精製し
てＡｒｇ2307をＧｌｎに交換した第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮ
Ａのカルボキシ末端を含む１７３８ｂｐ断片を増幅する
ためにプライマーＲＱ２３０７−１およびプライマーＲ
Ｑ２３０７−４を使用する第二のＰＣＲで鋳型として使
用した。増幅した断片をＳａｌＩおよびＡｐａＩで消化
して得たアミノ酸番号Ａｒｇ2307での突然変異を含む８
７９ｂｐ断片を用いて対応するｐＣＬＢ−ｄＢ６９５の
ＡｐａＩ−ＳａｌＩ断片を置換した。得られた構築物を
ｐＣＬＢ−ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑと命名した。ｐＣ
ＬＢ−ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑを構築するために使用
したこのＳａｌＩ−ＡｐａＩ断片のヌクレオチド配列は
検証がなされたものである。
突然変異体をコードするプラスミドｐＣＬＢ−ＢＰＶｄ
Ｂ６９５はＭｅｒｔｅｎｓなどが（Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａ
ｅｍａｔｏｌ、８５巻（１９９３年）、１３３〜１４５
頁）記載している。プラスミドｐＣＬＢ−ＢＰＶｄＢ６
９５は合成リンカー（５’−ＴＣＧＡＣＣＴＣＣＡＧＴ
ＴＧＡＡＣＡＴＴＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧ
ＧＡＡＡＴＡＧＡＧＣＴ−３’）を導入することによっ
て修正したもので、第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡの５’−末
端において出発コドン（下線部分）の前に翻訳開始のた
めの共通配列に連結する第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡの５’
−非翻訳領域の一部を含む（Ｋｏｚａｋ、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６巻（１９９１年）：１９８６７
〜１９８７０頁）。３’−末端である第ＶＩＩＩ因子ｃ
ＤＮＡのヌクレオチド番号７０６６にあるＰｓｔＩ部位
（出発コドンの第一ヌクレオチドに対応するヌクレオチ
ド１）に第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５ｃＤＮＡをプラスミ
ドＢＰＶにクローニングするために使用するＮｏｔＩ部
位を含むリンカーを挿入してプラスミドｐＣＬＢ−ＢＰ
ＶｄＢ６９５を得た。プラスミドｐＣＬＢ−ＢＰＶｄＢ
６９５−Ｒ２３０７Ｑは重複伸長法を使用する部位特異
的突然変異誘発によって構築した（Ｈｏなど、Ｇｅｎ
ｅ、７７巻（１９８９年）：５１〜５９頁）。オリゴヌ
クレオチドプライマーＲＱ２３０７−１（５’−ＣＧＣ
ＴＡＣＣＴＴＣＡＡＡＴＴＣＡＣＣＣＣ−３’；第ＶＩ
ＩＩ因子のヌクレオチド番号６９６７〜６９８７；セン
ス配列）およびオリゴヌクレオチドプライマーＲＱ２３
０７−２（５’−ＣＣＡＴＡＧＧＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡ
Ａ−３’；ｐＢＰＶのヌクレオチド番号１２２１〜１２
３９；アンチセンス配列）を使用して、第ＶＩＩＩ因子
ｃＤＮＡの一部およびプラスミドｐＢＰＶを含む３０２
ｂｐ断片を増幅した。オリゴヌクレオチドプライマーＲ
Ｑ２３０７−３（５’−ＴＴＡＧＧＡＴＣＣＣＡＣＴＡ
ＡＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴ−３’；ヌクレオチド番号５５
３０〜５５４７；センス配列）をオリゴヌクレオチドプ
ライマーＲＱ２３０７−４（５’−ＧＧＧＧＴＧＡＡＴ
ＴＴＧＡＡＧＧＴＡＣＣＣ−３’；第ＶＩＩＩ因子のヌ
クレオチド番号６９６７〜６９８７；アンチセンス配
列）と共に使用して、第ＶＩＩＩ因子の１４６４ｂｐ断
片を増幅した。反応条件は次の通り：２分間９０℃、２
０分間５０℃、３分間７２℃；３７回、４５秒間９０
℃、９０秒間５０℃、３分間７２℃；５分間６５℃、１
ｍＭ−ｄＮＴＰｓ、Ｐｆｕ−ポリメラーゼ反応緩衝液、
各オリゴヌクレオチドプライマー５０ｐＭｏｌ、および
Ｐｆｕ−ポリメラーゼ（Ｌｕｎｄｂｅｒｇなど、Ｇｅｎ
ｅ、１０８巻（１９９１年）、１〜６頁）２．５Ｕ存在
下。３０２ｂｐおよび１４６４ｂｐ断片の両方を精製し
てＡｒｇ2307をＧｌｎに交換した第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮ
Ａのカルボキシ末端を含む１７３８ｂｐ断片を増幅する
ためにプライマーＲＱ２３０７−１およびプライマーＲ
Ｑ２３０７−４を使用する第二のＰＣＲで鋳型として使
用した。増幅した断片をＳａｌＩおよびＡｐａＩで消化
して得たアミノ酸番号Ａｒｇ2307での突然変異を含む８
７９ｂｐ断片を用いて対応するｐＣＬＢ−ｄＢ６９５の
ＡｐａＩ−ＳａｌＩ断片を置換した。得られた構築物を
ｐＣＬＢ−ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑと命名した。ｐＣ
ＬＢ−ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑを構築するために使用
したこのＳａｌＩ−ＡｐａＩ断片のヌクレオチド配列は
検証がなされたものである。
【００４３】実施例２：組織培養および遺伝子移入 Ｃ１２７細胞を１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍＬペ
ニシリンおよび１００ｐｇ／ｍＬストレプトマイシン添
加Ｉｓｃｏｖｅ培地に維持した。Ｃ１２７細胞の亜密集
成長単層に本質的にＤｏｎａｔｈなど（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｊ．、３１２巻（１９９５年）、４９〜５５頁）の
記載のようにして遺伝子移入した。培養培地中における
第ＶＩＩＩ因子蛋白質の存在は第ＶＩＩＩ因子活性なら
びに第ＶＩＩＩ因子抗体（Ｍｅｒｔｅｎｓなど（１９９
３年））の測定によって監視した。第ＶＩＩＩ因子補助
因子活性は第Ｘａ因子の第ＩＸａ因子依存性形成に対す
る補助因子として機能する第ＶＩＩＩ因子の性能によっ
て第Ｘａ因子に対する発色性基質（Ｃｏａｔｅｓｔ・Ｆ
ａｃｔｏｒ・ＶＩＩＩ、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ社、Ｍ
ｏｌｎｄａｌ、スウェーデン）を採用して評価した。第
ＶＩＩＩ因子抗原は前に確認された（Ｌｅｎｔｉｎｇな
ど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４巻（１９９４
年）、７１５０〜７１５５頁）モノクローナル抗体を使
用して測定した。第ＶＩＩＩ因子軽鎖に対するモノクロ
ーナル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ１２を固相として使用し、他
方では第ＶＩＩＩ因子軽鎖に対するペルオキシダーゼ標
識モノクローナル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ１１７を結合した
第ＶＩＩＩ因子を定量するために使用した。第ＶＩＩＩ
因子重鎖の量は以下の通りに測定した：マイクロタイタ
ーのウェルにモノクローナル抗体ＥＳＨ−５（２．５μ
ｇ／ｍＬ）を５０ｍＭ−ＮａＨＣＯ3（ｐＨ９．５）
中、４℃で一夜固定化した。ウェルを５０ｍＭ−トリス
−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ−ＮａＣｌ、０．
１％（ｖ／ｖ）トゥイーン−２０で洗浄し、１％（ｗ／
ｖ）ＨＳＡを含有する同一の緩衝液中で１時間ブロック
した。第ＶＩＩＩ因子の試料はブロッキング緩衝液で希
釈し、固定化抗体とともに２時間３７℃でインキュベー
ションした。続いてウェルを洗浄して、結合した第ＶＩ
ＩＩ因子重鎖の量をペルオキシダーゼ標識モノクローナ
ル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ９を０．７ｐｇ／ウェルの濃度で
採用して測定した。この特殊なＥＬＩＳＡの検出限界は
１０ｍＵ／ｍＬである。提供者４０名からの正常血漿の
プールを標準として使用した。これらの発現実験の結果
を表１（測定値はｍＵ／ｍＬで示す）に示す。
ニシリンおよび１００ｐｇ／ｍＬストレプトマイシン添
加Ｉｓｃｏｖｅ培地に維持した。Ｃ１２７細胞の亜密集
成長単層に本質的にＤｏｎａｔｈなど（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｊ．、３１２巻（１９９５年）、４９〜５５頁）の
記載のようにして遺伝子移入した。培養培地中における
第ＶＩＩＩ因子蛋白質の存在は第ＶＩＩＩ因子活性なら
びに第ＶＩＩＩ因子抗体（Ｍｅｒｔｅｎｓなど（１９９
３年））の測定によって監視した。第ＶＩＩＩ因子補助
因子活性は第Ｘａ因子の第ＩＸａ因子依存性形成に対す
る補助因子として機能する第ＶＩＩＩ因子の性能によっ
て第Ｘａ因子に対する発色性基質（Ｃｏａｔｅｓｔ・Ｆ
ａｃｔｏｒ・ＶＩＩＩ、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ社、Ｍ
ｏｌｎｄａｌ、スウェーデン）を採用して評価した。第
ＶＩＩＩ因子抗原は前に確認された（Ｌｅｎｔｉｎｇな
ど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４巻（１９９４
年）、７１５０〜７１５５頁）モノクローナル抗体を使
用して測定した。第ＶＩＩＩ因子軽鎖に対するモノクロ
ーナル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ１２を固相として使用し、他
方では第ＶＩＩＩ因子軽鎖に対するペルオキシダーゼ標
識モノクローナル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ１１７を結合した
第ＶＩＩＩ因子を定量するために使用した。第ＶＩＩＩ
因子重鎖の量は以下の通りに測定した：マイクロタイタ
ーのウェルにモノクローナル抗体ＥＳＨ−５（２．５μ
ｇ／ｍＬ）を５０ｍＭ−ＮａＨＣＯ3（ｐＨ９．５）
中、４℃で一夜固定化した。ウェルを５０ｍＭ−トリス
−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ−ＮａＣｌ、０．
１％（ｖ／ｖ）トゥイーン−２０で洗浄し、１％（ｗ／
ｖ）ＨＳＡを含有する同一の緩衝液中で１時間ブロック
した。第ＶＩＩＩ因子の試料はブロッキング緩衝液で希
釈し、固定化抗体とともに２時間３７℃でインキュベー
ションした。続いてウェルを洗浄して、結合した第ＶＩ
ＩＩ因子重鎖の量をペルオキシダーゼ標識モノクローナ
ル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ９を０．７ｐｇ／ウェルの濃度で
採用して測定した。この特殊なＥＬＩＳＡの検出限界は
１０ｍＵ／ｍＬである。提供者４０名からの正常血漿の
プールを標準として使用した。これらの発現実験の結果
を表１（測定値はｍＵ／ｍＬで示す）に示す。
【００４４】
【表１】 表１ 第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５ 第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５ −Ｒ２３０７Ｑ 補助因子活性 １８１．４± ２．４ １．７３±０．０６ 抗体（軽鎖） １９９ ± ４．４ 検出不能 抗体（重鎖） ２２５ ±３９ 検出不能
【００４５】第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５とは対照的に、
第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７ＱｃＤＮＡを遺
伝子移入した細胞の培地中には補助因子活性は僅かしか
検出できなかった。第ＶＩＩＩ因子軽鎖に特異的なＥＬ
ＩＳＡでは免疫反応性物質は検出できなかった。Ａｒｇ
2307のＧｌｎへの突然変異の存在が使用したモノクロー
ナル抗体の結合に影響を与えることもあるので、第ＶＩ
ＩＩ因子のＡ２−ドメインのカルボキシ末端にある酸性
領域に対するモノクローナル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ９を、
第ＶＩＩＩ因子の重鎖に対するモノクローナル抗体ＥＳ
Ｈ−５（Ｇｒｉｆｆｉｎなど、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍ
ｏｓｔａｓｉｓ、５５巻（１９８６年）：４０〜４６
頁）とともに採用して第ＶＩＩＩ因子抗原を試験した。
第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７ＱのｃＤＮＡを
安定に遺伝子移入した細胞の培地には第ＶＩＩＩ因子の
抗原は検出できなかったが、この抗体の組合せを使用し
て第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５は検出できた。
第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７ＱｃＤＮＡを遺
伝子移入した細胞の培地中には補助因子活性は僅かしか
検出できなかった。第ＶＩＩＩ因子軽鎖に特異的なＥＬ
ＩＳＡでは免疫反応性物質は検出できなかった。Ａｒｇ
2307のＧｌｎへの突然変異の存在が使用したモノクロー
ナル抗体の結合に影響を与えることもあるので、第ＶＩ
ＩＩ因子のＡ２−ドメインのカルボキシ末端にある酸性
領域に対するモノクローナル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ９を、
第ＶＩＩＩ因子の重鎖に対するモノクローナル抗体ＥＳ
Ｈ−５（Ｇｒｉｆｆｉｎなど、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍ
ｏｓｔａｓｉｓ、５５巻（１９８６年）：４０〜４６
頁）とともに採用して第ＶＩＩＩ因子抗原を試験した。
第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７ＱのｃＤＮＡを
安定に遺伝子移入した細胞の培地には第ＶＩＩＩ因子の
抗原は検出できなかったが、この抗体の組合せを使用し
て第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５は検出できた。
【００４６】実施例３：代謝標識および免疫沈降 １０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび
１００ｐｇ／ｍＬストレプトマイシン添加Ｉｓｃｏｖｅ
培地に維持した遺伝子移入細胞を８０％密集成長下に代
謝的に標識した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２５ｍＭ
−ＨＥＰＥＳに対して（ｐＨ７．０）透析した１０％ウ
シ胎仔血清を添加したメチオニン不含のＲＰＭＩ中で３
０分間インキュベーションした（Ｖｏｏｒｂｅｒｇな
ど、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１１３巻（１９９１
年）：１９５〜２０５頁）。続いて細胞を［35Ｓ］−メ
チオニン（５０μＣｉ／ｍＬ、比放射能＞８００μＣｉ
／ミリモル）の存在下に３０分間標識した。代謝的に標
識した細胞の培地を１％ＮＰ−４０、５０ｍＭ−トリス
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、０．
５％ＳＤＳ、１０μｇ／ｍＬの大豆トリプシン阻害剤、
１０ｍＭ−ベンズアミジンおよび５ｍＭ−Ｎ−エチルマ
レイミドからなる同容の２倍濃縮免疫沈降緩衝液（ＩＰ
Ｂ）に入れた。細胞を燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２
回洗浄し、細胞をＩＰＢで溶解した。溶解物および調整
培地は−２０℃で貯蔵するか、直ちに免疫沈降に使用し
た。細胞抽出物および調整培地をゼラチン−セファロー
スと室温で１時間インキュベーションし、プロテインＡ
セファロースと２回連続してインキュベーションするこ
とによって事前処理した。血漿から精製した第ＶＩＩＩ
因子に対して産生したウサギのポリクローナル抗第ＶＩ
ＩＩ因子抗血清とともにプロテインＡ−セファロースか
ら予め準備しておいた複合体によって一夜４℃で特異的
吸着を行った。免疫沈降物をＩＰＢで十分に洗浄し、最
後に２０ｍＭ−トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で洗浄
し、還元条件下に７．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲルで分析した。電気泳動後、ゲルを３０％
メタノールと１０％酢酸で固定し、２０％ジフェニルオ
キサゾール酢酸用役で３０分間処理した。続いて、ゲル
をＨ2Ｏ中でインキュベーションし、乾燥し、異なる時
間に露光した。免疫沈降物のエンドグリコシダーゼＨ消
化はＶｏｏｒｂｅｒｇなど（Ｊ．Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏ
ｌ．、１１３巻（１９９１年）：１９５〜２０５頁）に
よって実行した。
１００ｐｇ／ｍＬストレプトマイシン添加Ｉｓｃｏｖｅ
培地に維持した遺伝子移入細胞を８０％密集成長下に代
謝的に標識した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２５ｍＭ
−ＨＥＰＥＳに対して（ｐＨ７．０）透析した１０％ウ
シ胎仔血清を添加したメチオニン不含のＲＰＭＩ中で３
０分間インキュベーションした（Ｖｏｏｒｂｅｒｇな
ど、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１１３巻（１９９１
年）：１９５〜２０５頁）。続いて細胞を［35Ｓ］−メ
チオニン（５０μＣｉ／ｍＬ、比放射能＞８００μＣｉ
／ミリモル）の存在下に３０分間標識した。代謝的に標
識した細胞の培地を１％ＮＰ−４０、５０ｍＭ−トリス
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、０．
５％ＳＤＳ、１０μｇ／ｍＬの大豆トリプシン阻害剤、
１０ｍＭ−ベンズアミジンおよび５ｍＭ−Ｎ−エチルマ
レイミドからなる同容の２倍濃縮免疫沈降緩衝液（ＩＰ
Ｂ）に入れた。細胞を燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２
回洗浄し、細胞をＩＰＢで溶解した。溶解物および調整
培地は−２０℃で貯蔵するか、直ちに免疫沈降に使用し
た。細胞抽出物および調整培地をゼラチン−セファロー
スと室温で１時間インキュベーションし、プロテインＡ
セファロースと２回連続してインキュベーションするこ
とによって事前処理した。血漿から精製した第ＶＩＩＩ
因子に対して産生したウサギのポリクローナル抗第ＶＩ
ＩＩ因子抗血清とともにプロテインＡ−セファロースか
ら予め準備しておいた複合体によって一夜４℃で特異的
吸着を行った。免疫沈降物をＩＰＢで十分に洗浄し、最
後に２０ｍＭ−トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で洗浄
し、還元条件下に７．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲルで分析した。電気泳動後、ゲルを３０％
メタノールと１０％酢酸で固定し、２０％ジフェニルオ
キサゾール酢酸用役で３０分間処理した。続いて、ゲル
をＨ2Ｏ中でインキュベーションし、乾燥し、異なる時
間に露光した。免疫沈降物のエンドグリコシダーゼＨ消
化はＶｏｏｒｂｅｒｇなど（Ｊ．Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏ
ｌ．、１１３巻（１９９１年）：１９５〜２０５頁）に
よって実行した。
【００４７】本実験によって細胞中で第ＶＩＩＩ因子ｄ
Ｂ６９５は単鎖分子として出現し、時間と共に徐々に細
胞から消失することが証明できた（図２Ａ：チェース時
間の異なる遺伝子移入細胞の細胞抽出物の分析。レーン
１：０時間チェース、レーン２：１時間チェース、レー
ン３：３時間チェース、レーン４：４時間チェース、レ
ーン５：６時間チェース、レーン６：対照。図２Ｂ：チ
ェース時間の異なる調整培地の分析。レーン１：０時間
チェース、レーン２：１時間チェース、レーン３：３時
間チェース、レーン４：４時間チェース、レーン５：６
時間チェース、レーン６：対照。第ＶＩＩＩ因子の単鎖
（ｓｃ）、軽鎖（ｌｃ）および重鎖（ｈｃ）を図中に示
す。分子量マーカーは図の右端に示す。
Ｂ６９５は単鎖分子として出現し、時間と共に徐々に細
胞から消失することが証明できた（図２Ａ：チェース時
間の異なる遺伝子移入細胞の細胞抽出物の分析。レーン
１：０時間チェース、レーン２：１時間チェース、レー
ン３：３時間チェース、レーン４：４時間チェース、レ
ーン５：６時間チェース、レーン６：対照。図２Ｂ：チ
ェース時間の異なる調整培地の分析。レーン１：０時間
チェース、レーン２：１時間チェース、レーン３：３時
間チェース、レーン４：４時間チェース、レーン５：６
時間チェース、レーン６：対照。第ＶＩＩＩ因子の単鎖
（ｓｃ）、軽鎖（ｌｃ）および重鎖（ｈｃ）を図中に示
す。分子量マーカーは図の右端に示す。
【００４８】細胞中に観察されるシグナルの減少と同時
に培地中には第ＶＩＩＩ因子反応性物質の増加が観察さ
れた。以前のデータと一致して、第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６
９５は一部が単鎖蛋白質として分泌されるが、他方では
以前に第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５のＢドメインの一部を
含有する軽鎖および重鎖と同定されている（Ｍｅｒｔｅ
ｎｓなど（１９９１年））二型を検出できる。細胞内に
ある第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑの生合成
は第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５で観察されたものと同様で
ある。しかしながら、安定に遺伝子移入した細胞の培地
には免疫反応性物質は検出できず、第ＶＩＩＩ因子ｄＢ
６９５−Ｒ２３０７Ｑは細胞から分泌されないことが判
明した（図３Ａ：チェース時間の異なる遺伝子移入細胞
からの細胞抽出物の分析：レーン１：０時間、レーン
２：１時間、レーン３：３時間、レーン４：４時間、レ
ーン５：６時間、レーン６：対照。図３Ｂ：チェース時
間の異なる調整培地の分析：レーン１：０時間、レーン
２：１時間、レーン３：３時間、レーン４：４時間、レ
ーン５：６時間、レーン６：対照。分子量マーカーは図
の右端に示し、単鎖第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３
０７Ｑを図の左端に示す）。この観察は最初に合成され
た第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑの大部分が
細胞内で第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５とは異なる機序を経
てプロセッシングされることを示唆する。
に培地中には第ＶＩＩＩ因子反応性物質の増加が観察さ
れた。以前のデータと一致して、第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６
９５は一部が単鎖蛋白質として分泌されるが、他方では
以前に第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５のＢドメインの一部を
含有する軽鎖および重鎖と同定されている（Ｍｅｒｔｅ
ｎｓなど（１９９１年））二型を検出できる。細胞内に
ある第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑの生合成
は第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５で観察されたものと同様で
ある。しかしながら、安定に遺伝子移入した細胞の培地
には免疫反応性物質は検出できず、第ＶＩＩＩ因子ｄＢ
６９５−Ｒ２３０７Ｑは細胞から分泌されないことが判
明した（図３Ａ：チェース時間の異なる遺伝子移入細胞
からの細胞抽出物の分析：レーン１：０時間、レーン
２：１時間、レーン３：３時間、レーン４：４時間、レ
ーン５：６時間、レーン６：対照。図３Ｂ：チェース時
間の異なる調整培地の分析：レーン１：０時間、レーン
２：１時間、レーン３：３時間、レーン４：４時間、レ
ーン５：６時間、レーン６：対照。分子量マーカーは図
の右端に示し、単鎖第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３
０７Ｑを図の左端に示す）。この観察は最初に合成され
た第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑの大部分が
細胞内で第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５とは異なる機序を経
てプロセッシングされることを示唆する。
【００４９】実施例４：細胞内部にある第ＶＩＩＩ因子
の生化学的分析 第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５および第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６
９５−Ｒ２０３Ｑ双方の細胞内配置を検討するために、
瞬間標識追跡分析を実行した。免疫精製蛋白質のエンド
Ｈに対する感受性は両蛋白質の分子内局在についてのマ
ーカーを提供した。図４に示す通り、第ＶＩＩＩ因子ｄ
Ｂ６９５ならびに第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２０３
Ｑの双方は提示した異なる時点でエンドＨに対する感受
性を維持した（図４Ａ：第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５ｃＤ
ＮＡ遺伝子移入細胞：レーン１：チェース０時間＋エン
ドＨ、レーン２：チェース０時間−エンドＨ、レーン
３：チェース２時間＋エンドＨ、レーン４：チェース４
時間＋エンドＨ、レーン５：チェース６時間＋エンド
Ｈ。図４Ｂ：第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑ
・ｃＤＮＡ遺伝子移入細胞：レーン１：チェース０時間
−エンドＨ、レーン２：チェース０時間＋エンドＨ、レ
ーン３：チェース２時間＋エンドＨ、レーン４：チェー
ス４時間＋エンドＨ、レーン５：チェース５時間＋エン
ドＨ、分子量マーカーは各ゲルの右端に示す。
の生化学的分析 第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５および第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６
９５−Ｒ２０３Ｑ双方の細胞内配置を検討するために、
瞬間標識追跡分析を実行した。免疫精製蛋白質のエンド
Ｈに対する感受性は両蛋白質の分子内局在についてのマ
ーカーを提供した。図４に示す通り、第ＶＩＩＩ因子ｄ
Ｂ６９５ならびに第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２０３
Ｑの双方は提示した異なる時点でエンドＨに対する感受
性を維持した（図４Ａ：第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５ｃＤ
ＮＡ遺伝子移入細胞：レーン１：チェース０時間＋エン
ドＨ、レーン２：チェース０時間−エンドＨ、レーン
３：チェース２時間＋エンドＨ、レーン４：チェース４
時間＋エンドＨ、レーン５：チェース６時間＋エンド
Ｈ。図４Ｂ：第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑ
・ｃＤＮＡ遺伝子移入細胞：レーン１：チェース０時間
−エンドＨ、レーン２：チェース０時間＋エンドＨ、レ
ーン３：チェース２時間＋エンドＨ、レーン４：チェー
ス４時間＋エンドＨ、レーン５：チェース５時間＋エン
ドＨ、分子量マーカーは各ゲルの右端に示す。
【００５０】これらの結果は第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５
および第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑの双方
とも中間ゴルジに移行する前は主としてコンパートメン
ト区画内に存在することを示す。
および第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑの双方
とも中間ゴルジに移行する前は主としてコンパートメン
ト区画内に存在することを示す。
【００５１】実施例５：２８℃および３７℃における第
ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５および第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９
５−Ｒ２３０７Ｑの発現 前パラグラフに提示した結果は第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９
５−Ｒ２３０７Ｑはマウス繊維芽細胞Ｃ１２７株から殆
ど分泌されないことを示す。第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５
−Ｒ２３０７Ｑの細胞内残留がＣ１２７細胞に特異的な
現象であるかどうかを判断するために第ＶＩＩＩ因子ｄ
Ｂ６９５−Ｒ２３０７Ｑおよび第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９
５のｃＤＮＡをＳＫＨＥＰ細胞中で発現させた。第ＶＩ
ＩＩ因子ｄＢ６９５および第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−
Ｒ２３０７Ｑの双方のｃＤＮＡを用いてプラスミドｐＣ
ＭＶ−ｄＢ９２８（欧州特許公開０７１１８３５号−
Ａ）にある第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５ｃＤＮＡを交換し
た。
ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５および第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９
５−Ｒ２３０７Ｑの発現 前パラグラフに提示した結果は第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９
５−Ｒ２３０７Ｑはマウス繊維芽細胞Ｃ１２７株から殆
ど分泌されないことを示す。第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５
−Ｒ２３０７Ｑの細胞内残留がＣ１２７細胞に特異的な
現象であるかどうかを判断するために第ＶＩＩＩ因子ｄ
Ｂ６９５−Ｒ２３０７Ｑおよび第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９
５のｃＤＮＡをＳＫＨＥＰ細胞中で発現させた。第ＶＩ
ＩＩ因子ｄＢ６９５および第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−
Ｒ２３０７Ｑの双方のｃＤＮＡを用いてプラスミドｐＣ
ＭＶ−ｄＢ９２８（欧州特許公開０７１１８３５号−
Ａ）にある第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５ｃＤＮＡを交換し
た。
【００５２】プラスミドｐＣＬＢ−ＢＰＶｄＢ６９５
（実施例１参照）を次の通りに修正して合成二重鎖リン
カー５’−ＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣ−３’をｐＣＬＢ
−ｄＢ６９５およびｐＣＬＢ−ｄＢ６９５−Ｒ２３０７
ＱのＮｏｔＩ部位に挿入した。続いて第ＶＩＩＩ因子・
ｃＤＮＡのカルボキシ末端に対応するｐＣＬＢ−ｄＢ６
９５から誘導されたＫｐｎＩ−ＸｍａＩ断片を使用して
ｐＣＭＶ−ｄＢ９２８の対応するＫｐｎＩ−ＸｍａＩ断
片と交換した。得られたプラスミドをｐＣＬＢ−ＣＭＶ
−ｄＢ６９５と命名した。同様にして第ＶＩＩＩ因子−
ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑ・ｃＤＮＡのカルボキシ末端
に対応するＢｇｌＩＩ−ＸｍａＩ断片を用いてｐＣＭＶ
−ｄＢ９２８の対応する断片と交換してプラスミドｐＣ
ＬＢ−ＣＭＶ−ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑを得た。ＳＫ
ＨＥＰ細胞を１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍＬペニ
シリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン添加
Ｉｓｃｏｖｅ培地に維持した。本質的にＤｏｎａｔｈな
ど（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３１２巻（１９９５年）、
４９〜５５頁）に記載のようにしてＳＫＨＥＰ細胞の亜
密集成長単層に遺伝子移入した。遺伝子移入した細胞を
ハイグロマイシン濃度１００〜１０５０ｍｇ／ｍＬで選
択し、各クローンを分離して選択培地中で増殖させた。
遺伝子移入細胞の調整培地中に存在する第ＶＩＩＩ因子
蛋白質は第ＶＩＩＩ因子活性ならびに第ＶＩＩＩ因子抗
原の測定によって監視した。第ＶＩＩＩ因子補助因子活
性は第Ｘａ因子の第ＩＸａ因子依存性形成に対する補助
因子として機能する第ＶＩＩＩ因子の性能によって第Ｘ
ａ因子に対する発色性基質（Ｃｏａｔｅｓｔ・Ｆａｃｔ
ｏｒ・ＶＩＩＩ、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ社、Ｍｏｌｎ
ｄａｌ、スウェーデン）を採用して測定した。第ＶＩＩ
Ｉ因子抗原は以前に確認されたモノクローナル抗体（Ｌ
ｅｙｔｅなど、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ．Ｊ．、２６３
巻（１９８９年）、１８７〜１９４頁）を使用して測定
した。第ＶＩＩＩ因子軽鎖に対するモノクローナル抗体
ＣＬＢ−ＣＡｇ１２を固相として使用し、他方では第Ｖ
ＩＩＩ因子軽鎖に対するペルオキシダーゼ複合モノクロ
ーナル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ６９またはＣＬＢ−ＣＡｇ１
１７を使用して、結合した第ＶＩＩＩ因子を定量した。
（実施例１参照）を次の通りに修正して合成二重鎖リン
カー５’−ＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣ−３’をｐＣＬＢ
−ｄＢ６９５およびｐＣＬＢ−ｄＢ６９５−Ｒ２３０７
ＱのＮｏｔＩ部位に挿入した。続いて第ＶＩＩＩ因子・
ｃＤＮＡのカルボキシ末端に対応するｐＣＬＢ−ｄＢ６
９５から誘導されたＫｐｎＩ−ＸｍａＩ断片を使用して
ｐＣＭＶ−ｄＢ９２８の対応するＫｐｎＩ−ＸｍａＩ断
片と交換した。得られたプラスミドをｐＣＬＢ−ＣＭＶ
−ｄＢ６９５と命名した。同様にして第ＶＩＩＩ因子−
ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑ・ｃＤＮＡのカルボキシ末端
に対応するＢｇｌＩＩ−ＸｍａＩ断片を用いてｐＣＭＶ
−ｄＢ９２８の対応する断片と交換してプラスミドｐＣ
ＬＢ−ＣＭＶ−ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑを得た。ＳＫ
ＨＥＰ細胞を１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍＬペニ
シリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン添加
Ｉｓｃｏｖｅ培地に維持した。本質的にＤｏｎａｔｈな
ど（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３１２巻（１９９５年）、
４９〜５５頁）に記載のようにしてＳＫＨＥＰ細胞の亜
密集成長単層に遺伝子移入した。遺伝子移入した細胞を
ハイグロマイシン濃度１００〜１０５０ｍｇ／ｍＬで選
択し、各クローンを分離して選択培地中で増殖させた。
遺伝子移入細胞の調整培地中に存在する第ＶＩＩＩ因子
蛋白質は第ＶＩＩＩ因子活性ならびに第ＶＩＩＩ因子抗
原の測定によって監視した。第ＶＩＩＩ因子補助因子活
性は第Ｘａ因子の第ＩＸａ因子依存性形成に対する補助
因子として機能する第ＶＩＩＩ因子の性能によって第Ｘ
ａ因子に対する発色性基質（Ｃｏａｔｅｓｔ・Ｆａｃｔ
ｏｒ・ＶＩＩＩ、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ社、Ｍｏｌｎ
ｄａｌ、スウェーデン）を採用して測定した。第ＶＩＩ
Ｉ因子抗原は以前に確認されたモノクローナル抗体（Ｌ
ｅｙｔｅなど、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ．Ｊ．、２６３
巻（１９８９年）、１８７〜１９４頁）を使用して測定
した。第ＶＩＩＩ因子軽鎖に対するモノクローナル抗体
ＣＬＢ−ＣＡｇ１２を固相として使用し、他方では第Ｖ
ＩＩＩ因子軽鎖に対するペルオキシダーゼ複合モノクロ
ーナル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ６９またはＣＬＢ−ＣＡｇ１
１７を使用して、結合した第ＶＩＩＩ因子を定量した。
【００５３】第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５を発現する遺伝
子移入ＳＫＨＥＰ細胞を２８℃および３７℃で増殖させ
て培地中に分泌される第ＶＩＩＩ因子蛋白質の量を前に
略述した第ＶＩＩＩ因子補助因子活性を測定することに
よって監視した。３７℃では第ＶＩＩＩ因子−ｄＢ６９
５は遺伝子移入ＳＫＨＥＰ細胞から２Ｕ／ｍＬの濃度で
分泌された。４日目に第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５の発現
はいくらか上昇して５Ｕ／ｍＬに達した（図５）。２８
℃では調整培地中にある第ＶＩＩＩ因子活性の量は２〜
１０Ｕ／ｍＬの範囲内であった（図５）。第ＶＩＩＩ因
子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑを発現する遺伝子移入ＳＫ
ＨＥＰ細胞を同様な手法で分析した。３７℃では遺伝子
移入細胞からはごく僅かな量の第ＶＩＩＩ因子活性（±
１０ｍＵ／ｍＬ）が分泌された。驚くべきことに２８℃
ではかなりな量の第ＶＩＩＩ因子活性が第ＶＩＩＩ因子
ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑ・ｃＤＮＡを遺伝子移入した
細胞の調整培地中に認められた（図６）。次に第ＶＩＩ
Ｉ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑ・ｃＤＮＡを安定に遺
伝子移入したＳＫＨＥＰ細胞の調整培地中の第ＶＩＩＩ
因子抗原の量を前記のモノクローナル抗体を使用して測
定した。モノクローナル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ１２および
モノクローナル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ６９で測定した第Ｖ
ＩＩＩ因子抗原の量（Ａｇ（１２−６９）：■）は調整
培地中に存在する補助因子活性（Ａｃｔ：○）の量と同
様であることが判明した（図７）。この観察は第ＶＩＩ
Ｉ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑは遺伝子移入ＳＫＨＰ
細胞から２８℃では機能的に完全に活性な第ＶＩＩＩ因
子蛋白質として分泌されることを示す。次に第ＶＩＩＩ
因子抗原の量をモノクローナル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ１２
およびＣＬＢ−ＣＡｇ１１７を用いて検討した。驚くべ
きことに、モノクローナル抗体のこの特殊な組合せを使
用すると第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑ・ｃ
ＤＮＡを遺伝子移入した細胞の調整培地中には第ＶＩＩ
Ｉ因子抗原は検出できなかった（Ａｇ（１２−１１
７）：●）（図７）。これらのデータはモノクローナル
抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ１１７は第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５
−Ｒ２３０７Ｑとは反応しないことを示す。遺伝子移入
したＳＫＨＥＰ細胞を免疫螢光法で分析したところＣＬ
Ｂ−ＣＡｇ１１７が第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３
０７Ｑと反応しないことが確認された。ＣＬＢ−ＣＡｇ
１１７と第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑとの
反応性がないという観察は第ＶＩＩＩ因子中でのアミノ
酸残基Ａｒｇ2307→Ｇｌｎの置換がモノクローナル抗体
ＣＬＢ−ＣＡｇ１１７の結合を阻害することを証明す
る。
子移入ＳＫＨＥＰ細胞を２８℃および３７℃で増殖させ
て培地中に分泌される第ＶＩＩＩ因子蛋白質の量を前に
略述した第ＶＩＩＩ因子補助因子活性を測定することに
よって監視した。３７℃では第ＶＩＩＩ因子−ｄＢ６９
５は遺伝子移入ＳＫＨＥＰ細胞から２Ｕ／ｍＬの濃度で
分泌された。４日目に第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５の発現
はいくらか上昇して５Ｕ／ｍＬに達した（図５）。２８
℃では調整培地中にある第ＶＩＩＩ因子活性の量は２〜
１０Ｕ／ｍＬの範囲内であった（図５）。第ＶＩＩＩ因
子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑを発現する遺伝子移入ＳＫ
ＨＥＰ細胞を同様な手法で分析した。３７℃では遺伝子
移入細胞からはごく僅かな量の第ＶＩＩＩ因子活性（±
１０ｍＵ／ｍＬ）が分泌された。驚くべきことに２８℃
ではかなりな量の第ＶＩＩＩ因子活性が第ＶＩＩＩ因子
ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑ・ｃＤＮＡを遺伝子移入した
細胞の調整培地中に認められた（図６）。次に第ＶＩＩ
Ｉ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑ・ｃＤＮＡを安定に遺
伝子移入したＳＫＨＥＰ細胞の調整培地中の第ＶＩＩＩ
因子抗原の量を前記のモノクローナル抗体を使用して測
定した。モノクローナル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ１２および
モノクローナル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ６９で測定した第Ｖ
ＩＩＩ因子抗原の量（Ａｇ（１２−６９）：■）は調整
培地中に存在する補助因子活性（Ａｃｔ：○）の量と同
様であることが判明した（図７）。この観察は第ＶＩＩ
Ｉ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑは遺伝子移入ＳＫＨＰ
細胞から２８℃では機能的に完全に活性な第ＶＩＩＩ因
子蛋白質として分泌されることを示す。次に第ＶＩＩＩ
因子抗原の量をモノクローナル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ１２
およびＣＬＢ−ＣＡｇ１１７を用いて検討した。驚くべ
きことに、モノクローナル抗体のこの特殊な組合せを使
用すると第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑ・ｃ
ＤＮＡを遺伝子移入した細胞の調整培地中には第ＶＩＩ
Ｉ因子抗原は検出できなかった（Ａｇ（１２−１１
７）：●）（図７）。これらのデータはモノクローナル
抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ１１７は第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５
−Ｒ２３０７Ｑとは反応しないことを示す。遺伝子移入
したＳＫＨＥＰ細胞を免疫螢光法で分析したところＣＬ
Ｂ−ＣＡｇ１１７が第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３
０７Ｑと反応しないことが確認された。ＣＬＢ−ＣＡｇ
１１７と第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑとの
反応性がないという観察は第ＶＩＩＩ因子中でのアミノ
酸残基Ａｒｇ2307→Ｇｌｎの置換がモノクローナル抗体
ＣＬＢ−ＣＡｇ１１７の結合を阻害することを証明す
る。
【００５４】実施例６：モノクローナル抗体ＣＬＢ−Ｃ
Ａｇ１１７の確認 前実施例中ではモノクローナル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ１１
７は第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑには反応
性がないことを示した。これに加えて第ＶＩＩＩ因子ｄ
Ｂ６９５−Ｒ２３０７Ｑは機能的に完全に活性な第ＶＩ
ＩＩ因子蛋白質であってＳＫＨＥＰ細胞中で２８℃で発
現できることを証明できた。モノクローナル抗体ＣＬＢ
−ＣＡｇ１１７の性質をさらに確認した。モノクローナ
ル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ１１７のエピトープは第ＶＩＩＩ
因子軽鎖にある。モノクローナル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ１
１７が第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑと反応
しないとの観察はこの抗体のエピトープが第ＶＩＩＩ因
子のＣ２−ドメインに存在していることを強く示唆す
る。プラスミドｐＣＬＢ−ＧＰ６７−８０ＫおよびｐＣ
ＬＢ−ＧＰ６７−Ｃ２を構築した。第ＶＩＩＩ因子の軽
鎖をコードするプラスミドｐＣＬＢ−ＧＰ６７−８０Ｋ
をオリゴヌクレオチドプライマー８０Ｋ−１（５’−Ｇ
ＣＣＣＣＡＴＧＧＧＧＧＡＡＡＴＡＡＣＴＣＧＴＡＣＴ
ＡＣＴＣ−３’；第ＶＩＩＩ因子のヌクレオチド番号５
０００〜５０２０、センス配列）およびオリゴヌクレオ
チドプライマー８０Ｋ−２（５’−ＣＴＧＴＡＣＴＧＴ
ＣＡＣＴＴＧＴＣＴＣＣＣ−３’；第ＶＩＩＩ因子のヌ
クレオチド番号５６５９〜５６７９、アンチセンス配
列）を利用して６８９ｂｐ断片を増幅することによって
構築した。この６８９ｂｐ生産物を精製してＮｃｏＩお
よびＮｄｅＩで消化した。プラスミドｐＣＬＢ−ｄＢ６
９５をＮｄｅＩ（第ＶＩＩＩ因子のヌクレオチド番号５
５２１）およびＮｏｔＩで消化して第ＶＩＩＩ因子軽鎖
のカルボキシ末端部分に対応する断片を得た。このＮｃ
ｏＩ−ＮｄｅＩ断片とＮｄｅＩ−ＮｃｏＩ断片とをプラ
スミドｐＡｃＧＰ６７８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、サ
ンジェゴ、ＣＡ、米国）に共クローニングしてプラスミ
ドｐＣＬＢ−ＧＰ６７−８０Ｋを得た。プラスミドｐＣ
ＬＢ−ＧＰ６７−Ｃ２はオリゴヌクレオチドプライマー
Ｃ２−１（５’−ＧＴＧＣＣＡＴＧＧＧＴＡＧＴＴＧＣ
ＡＧＣＡＴＧＣＣＡＴＴＧ−３’；第ＶＩＩＩ因子のヌ
クレオチド番号６５７４〜６５９１；センス配列）およ
びプライマーＣ２−２（５’−ＣＣＡＴＡＧＧＴＴＧＧ
ＡＡＴＧＴＡＡ−３’；ｐＢＰＶのヌクレオチド番号１
２２２〜１２３９；アンチセンス配列）を使用して構築
し、これを用いて第ＶＩＩＩ因子のＣ２−ドメインに対
応する断片を増幅した。増幅に続いて断片をＮｃｏＩお
よびＮｏｔＩで消化してプラスミドＰＡｃＧＰ６７Ｂに
クローニングした。クローニングした配列のヌクレオチ
ド配列はオリゴヌクレオチド配列決定によって確証し
た。Ｓｆ−９細胞にＢａｃｕｌｏｇｏｌｄ（商品名）Ｂ
ａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ・Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ・ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉｃａ・ＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、
サンジェゴ、ＣＡ、米国）とともに遺伝子移入すること
によって第ＶＩＩＩ因子軽鎖および第ＶＩＩＩ因子Ｃ２
−ドメインを発現する組換えバキュロウイルスが得られ
た。第ＶＩＩＩ因子軽鎖および第ＶＩＩＩ因子Ｃ２−ド
メインを発現する組換えウイルスを使用してＨｉｇｈ・
Ｆｉｖｃ（商品名）細胞を感染多重度７で感染させた。
この細胞を２．５％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍＬペニ
シリンおよび１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン添加
ＥＸ−ＣＥＬＬ４０１培地を７５％（ｖ／ｖ）およびＧ
ｒａｃｅ昆虫培地を２５％（ｖ／ｖ）からなる培地中に
維持した。感染の２４時間後にメチオニン不含の同様な
培養培地中、細胞を２４時間［35Ｓ］メチオニン（５０
μＣｉ／ｍＬ、比放射能＞８００Ｃｉ／ミリモル）でパ
ルス標識した。代謝的に標識した細胞の培地を同容の２
倍濃縮免疫沈降緩衝液（ＩＰＢＢ）に投入した。ＩＰＢ
Ｂは５０ｍＭ−トリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１Ｍ−Ｎ
ａＣｌ、１．２％（ｖ／ｖ）トリトン−Ｘ−１００、
０．１％（ｗ／ｖ）トゥイーン−２０、１．０％（ｖ／
ｖ）ＢＳＡ、３５ｍＭ−ＥＤＴＡ、１０μｇ／ｍＬの大
豆トリプシン阻害剤、１０ｍＭ−ベンズアミジンおよび
５ｍＭ−Ｎ−エチルマレイミドからなる。モノクローナ
ル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ１１７による免疫沈降は次の通り
に行った。調整培地をゼラチン−セファロース４Ｂと室
温で２時間インキュベーションし、さらにプロテインＧ
セファロース４ＦＦと連続して２回インキュベーション
することによって前処理した。プロテインＧ−セファロ
ースに１μｇ／ｍＬのモノクローナル抗体ＣＬＢ−ＣＡ
ｇ１１７を添加することによって一夜４℃で特異的吸着
を行った。免疫沈降物をＩＰＢＢで十分に洗浄し、最後
に２０ｍＭ−トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で洗浄し
た。結合した蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ−試料緩衝液中
で５分間煮沸することによって溶離し、還元条件下に１
０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分析
した。電気泳動後、ゲルを３０％メタノールと１０％酢
酸で固定し、１０％ジフェニルオキサゾール−酢酸で３
０分間処理した。最後にゲルをＨ2Ｏ中でインキュベー
ションし、乾燥し、異なる時間に露光した。モノクロー
ナル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ１１７による免疫沈降でこの特
定の抗体が放射能標識第ＶＩＩＩ因子軽鎖およびＣ２−
ドメインの双方と反応することが判明した。ＣＬＢ−Ｃ
Ａｇ１１７のエピトープは第ＶＩＩＩ因子のＣ２−ドメ
インに存在する。ＣＬＢ−ＣＡｇ１１７自体は第ＶＩＩ
Ｉ因子処置後の血友病Ａ患者に産生される抗第ＶＩＩＩ
因子抗体に類似している。これらの抗第ＶＩＩＩ因子抗
体のエピトープのかなりの部分はＣ２−ドメインに存在
する。明らかにＣＬＢ−ＣＡｇ１１７は血友病Ａの罹患
者を第ＶＩＩＩ因子で処置すると産生される抗第ＶＩＩ
Ｉ因子抗体の作用を真似るために有用なモデルを提供す
る。第ＶＩＩＩ因子活性を阻害するＣＬＢ−ＣＡｇ１１
７の性能を検討した。量の異なるＣＬＢ−ＣＡｇ１１７
を正常な血漿とともに３７℃で２時間インキュベーショ
ンした。続いて正常血漿の第ＶＩＩＩ因子活性を１段凝
固検定法を使用して測定した（Ｍｅｒｔｅｎｓなど、Ｂ
ｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、８５巻（１９９３
年）、１３３〜１４５頁）。実験結果を図８に掲載する
が、これはモノクローナル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ１１７は
第ＶＩＩＩ因子活性の強力な阻害剤であることを示す。
１０μｇ／ｍＬと僅かなＣＬＢ−ＣＡｇ１１７でも第Ｖ
ＩＩＩ因子活性を初期値の１０％まで低下させることが
できる。要するにこれらの結果はＣＬＢ−ＣＡｇ１１７
がそのエピトープを第ＶＩＩＩ因子軽鎖のＣ２−ドメイ
ン上に有しており第ＶＩＩＩ因子活性の強力な阻害剤と
して作用することを解明した。前記実験はＣＬＢ−ＣＡ
ｇ１１７の性質が特発性にまたは第ＶＩＩＩ因子置換療
法の結果として血友病Ａ患者に産生される第ＶＩＩＩ因
子のＣ２−ドメインに対するヒトのアロ抗体または自己
抗体の性質によく近似していることを示す。
Ａｇ１１７の確認 前実施例中ではモノクローナル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ１１
７は第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑには反応
性がないことを示した。これに加えて第ＶＩＩＩ因子ｄ
Ｂ６９５−Ｒ２３０７Ｑは機能的に完全に活性な第ＶＩ
ＩＩ因子蛋白質であってＳＫＨＥＰ細胞中で２８℃で発
現できることを証明できた。モノクローナル抗体ＣＬＢ
−ＣＡｇ１１７の性質をさらに確認した。モノクローナ
ル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ１１７のエピトープは第ＶＩＩＩ
因子軽鎖にある。モノクローナル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ１
１７が第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑと反応
しないとの観察はこの抗体のエピトープが第ＶＩＩＩ因
子のＣ２−ドメインに存在していることを強く示唆す
る。プラスミドｐＣＬＢ−ＧＰ６７−８０ＫおよびｐＣ
ＬＢ−ＧＰ６７−Ｃ２を構築した。第ＶＩＩＩ因子の軽
鎖をコードするプラスミドｐＣＬＢ−ＧＰ６７−８０Ｋ
をオリゴヌクレオチドプライマー８０Ｋ−１（５’−Ｇ
ＣＣＣＣＡＴＧＧＧＧＧＡＡＡＴＡＡＣＴＣＧＴＡＣＴ
ＡＣＴＣ−３’；第ＶＩＩＩ因子のヌクレオチド番号５
０００〜５０２０、センス配列）およびオリゴヌクレオ
チドプライマー８０Ｋ−２（５’−ＣＴＧＴＡＣＴＧＴ
ＣＡＣＴＴＧＴＣＴＣＣＣ−３’；第ＶＩＩＩ因子のヌ
クレオチド番号５６５９〜５６７９、アンチセンス配
列）を利用して６８９ｂｐ断片を増幅することによって
構築した。この６８９ｂｐ生産物を精製してＮｃｏＩお
よびＮｄｅＩで消化した。プラスミドｐＣＬＢ−ｄＢ６
９５をＮｄｅＩ（第ＶＩＩＩ因子のヌクレオチド番号５
５２１）およびＮｏｔＩで消化して第ＶＩＩＩ因子軽鎖
のカルボキシ末端部分に対応する断片を得た。このＮｃ
ｏＩ−ＮｄｅＩ断片とＮｄｅＩ−ＮｃｏＩ断片とをプラ
スミドｐＡｃＧＰ６７８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、サ
ンジェゴ、ＣＡ、米国）に共クローニングしてプラスミ
ドｐＣＬＢ−ＧＰ６７−８０Ｋを得た。プラスミドｐＣ
ＬＢ−ＧＰ６７−Ｃ２はオリゴヌクレオチドプライマー
Ｃ２−１（５’−ＧＴＧＣＣＡＴＧＧＧＴＡＧＴＴＧＣ
ＡＧＣＡＴＧＣＣＡＴＴＧ−３’；第ＶＩＩＩ因子のヌ
クレオチド番号６５７４〜６５９１；センス配列）およ
びプライマーＣ２−２（５’−ＣＣＡＴＡＧＧＴＴＧＧ
ＡＡＴＧＴＡＡ−３’；ｐＢＰＶのヌクレオチド番号１
２２２〜１２３９；アンチセンス配列）を使用して構築
し、これを用いて第ＶＩＩＩ因子のＣ２−ドメインに対
応する断片を増幅した。増幅に続いて断片をＮｃｏＩお
よびＮｏｔＩで消化してプラスミドＰＡｃＧＰ６７Ｂに
クローニングした。クローニングした配列のヌクレオチ
ド配列はオリゴヌクレオチド配列決定によって確証し
た。Ｓｆ−９細胞にＢａｃｕｌｏｇｏｌｄ（商品名）Ｂ
ａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ・Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ・ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉｃａ・ＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、
サンジェゴ、ＣＡ、米国）とともに遺伝子移入すること
によって第ＶＩＩＩ因子軽鎖および第ＶＩＩＩ因子Ｃ２
−ドメインを発現する組換えバキュロウイルスが得られ
た。第ＶＩＩＩ因子軽鎖および第ＶＩＩＩ因子Ｃ２−ド
メインを発現する組換えウイルスを使用してＨｉｇｈ・
Ｆｉｖｃ（商品名）細胞を感染多重度７で感染させた。
この細胞を２．５％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍＬペニ
シリンおよび１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン添加
ＥＸ−ＣＥＬＬ４０１培地を７５％（ｖ／ｖ）およびＧ
ｒａｃｅ昆虫培地を２５％（ｖ／ｖ）からなる培地中に
維持した。感染の２４時間後にメチオニン不含の同様な
培養培地中、細胞を２４時間［35Ｓ］メチオニン（５０
μＣｉ／ｍＬ、比放射能＞８００Ｃｉ／ミリモル）でパ
ルス標識した。代謝的に標識した細胞の培地を同容の２
倍濃縮免疫沈降緩衝液（ＩＰＢＢ）に投入した。ＩＰＢ
Ｂは５０ｍＭ−トリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１Ｍ−Ｎ
ａＣｌ、１．２％（ｖ／ｖ）トリトン−Ｘ−１００、
０．１％（ｗ／ｖ）トゥイーン−２０、１．０％（ｖ／
ｖ）ＢＳＡ、３５ｍＭ−ＥＤＴＡ、１０μｇ／ｍＬの大
豆トリプシン阻害剤、１０ｍＭ−ベンズアミジンおよび
５ｍＭ−Ｎ−エチルマレイミドからなる。モノクローナ
ル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ１１７による免疫沈降は次の通り
に行った。調整培地をゼラチン−セファロース４Ｂと室
温で２時間インキュベーションし、さらにプロテインＧ
セファロース４ＦＦと連続して２回インキュベーション
することによって前処理した。プロテインＧ−セファロ
ースに１μｇ／ｍＬのモノクローナル抗体ＣＬＢ−ＣＡ
ｇ１１７を添加することによって一夜４℃で特異的吸着
を行った。免疫沈降物をＩＰＢＢで十分に洗浄し、最後
に２０ｍＭ−トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で洗浄し
た。結合した蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ−試料緩衝液中
で５分間煮沸することによって溶離し、還元条件下に１
０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分析
した。電気泳動後、ゲルを３０％メタノールと１０％酢
酸で固定し、１０％ジフェニルオキサゾール−酢酸で３
０分間処理した。最後にゲルをＨ2Ｏ中でインキュベー
ションし、乾燥し、異なる時間に露光した。モノクロー
ナル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ１１７による免疫沈降でこの特
定の抗体が放射能標識第ＶＩＩＩ因子軽鎖およびＣ２−
ドメインの双方と反応することが判明した。ＣＬＢ−Ｃ
Ａｇ１１７のエピトープは第ＶＩＩＩ因子のＣ２−ドメ
インに存在する。ＣＬＢ−ＣＡｇ１１７自体は第ＶＩＩ
Ｉ因子処置後の血友病Ａ患者に産生される抗第ＶＩＩＩ
因子抗体に類似している。これらの抗第ＶＩＩＩ因子抗
体のエピトープのかなりの部分はＣ２−ドメインに存在
する。明らかにＣＬＢ−ＣＡｇ１１７は血友病Ａの罹患
者を第ＶＩＩＩ因子で処置すると産生される抗第ＶＩＩ
Ｉ因子抗体の作用を真似るために有用なモデルを提供す
る。第ＶＩＩＩ因子活性を阻害するＣＬＢ−ＣＡｇ１１
７の性能を検討した。量の異なるＣＬＢ−ＣＡｇ１１７
を正常な血漿とともに３７℃で２時間インキュベーショ
ンした。続いて正常血漿の第ＶＩＩＩ因子活性を１段凝
固検定法を使用して測定した（Ｍｅｒｔｅｎｓなど、Ｂ
ｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、８５巻（１９９３
年）、１３３〜１４５頁）。実験結果を図８に掲載する
が、これはモノクローナル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ１１７は
第ＶＩＩＩ因子活性の強力な阻害剤であることを示す。
１０μｇ／ｍＬと僅かなＣＬＢ−ＣＡｇ１１７でも第Ｖ
ＩＩＩ因子活性を初期値の１０％まで低下させることが
できる。要するにこれらの結果はＣＬＢ−ＣＡｇ１１７
がそのエピトープを第ＶＩＩＩ因子軽鎖のＣ２−ドメイ
ン上に有しており第ＶＩＩＩ因子活性の強力な阻害剤と
して作用することを解明した。前記実験はＣＬＢ−ＣＡ
ｇ１１７の性質が特発性にまたは第ＶＩＩＩ因子置換療
法の結果として血友病Ａ患者に産生される第ＶＩＩＩ因
子のＣ２−ドメインに対するヒトのアロ抗体または自己
抗体の性質によく近似していることを示す。
【００５５】実施例７：ＣＬＢ−ＣＡｇ１１７による第
ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑの阻害 前実施例では第ＶＩＩＩ因子のＣ２−ドメインに対する
阻害性抗体であるモノクローナル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ１
１７を確認した。実施例５にはＳＫＨＥＰ細胞中での第
ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑの発現を記載し
た。驚くべきことに第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３
０７Ｑの分泌は温度依存性であって、相当量の第ＶＩＩ
Ｉ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑが２８℃の調整培地中
に分泌された。分泌された第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−
Ｒ２３０７Ｑは機能的に活性であることが判明した。第
ＶＩＩＩ因子抗原検定法および免疫螢光法の両方を採用
してＣＬＢ−ＣＡｇ１１７の反応性を研究した結果、第
ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑはモノクローナ
ル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ１１７とは反応しないことが判明
した。この観察は第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０
７ＱはＣＬＢ−ＣＡｇ１１７の第ＶＩＩＩ因子阻害活性
に対しても非感受性であることを示唆する。この仮説を
検証するためにモノクローナル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ１１
７が第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑを阻害す
る性能を測定した。対照としてはモノクローナル抗体Ｃ
ＬＢ−ＣＡｇ１１７による第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５の
阻害を試験した。量の異なるＣＬＢ−ＣＡｇ１１７を第
ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５または第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９
５−Ｒ２３０７Ｑとともに室温で２時間インキュベーシ
ョンした。続いて、残留第ＶＩＩＩ因子活性を１段法凝
固検定（Ｍｅｒｔｅｎｓなど、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍ
ａｔｏｌ．、８５巻（１９９３年）：１３３〜１４５
頁）を使用して測定した。モノクローナル抗体ＣＬＢ−
ＣＡｇ１１７による第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５の阻害か
ら得られたパターンを観察すると０．２μｇ／ｍＬと僅
かなＣＬＢ−ＣＡｇ１１７でも残留活性を２０％にする
ことが明らかになった。ＣＬＢ−ＣＡｇ１１７を増量し
てもそれ以上の第ＶＩＩＩ因子活性阻害は得られなかっ
た。ＣＬＢ−ＣＡｇ１１７と第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５
−Ｒ２３０７Ｑとのインキュベーションで得られたパタ
ーンは全く相違していた。第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−
Ｒ２３０７Ｑの活性はＣＬＢ−ＣＡｇ１１７には阻害さ
れなかった。高濃度の抗体（２０μｇ／ｍＬ）でさえ第
ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑの第ＶＩＩＩ因
子活性を阻害することができなかった（図９）。これら
の結果は第ＶＩＩＩ因子の免疫優性領域における点突然
変異を第ＶＩＩＩ因子活性を維持しながら阻害抗体の結
合を選択的に妨害するために使用できることを示す。Ａ
ｒｇ2307からＧｌｎへの交換と同様にして、第ＶＩＩＩ
因子阻害抗体の結合を阻害するために他のアミノ酸置換
も使用しうるであろう。
ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑの阻害 前実施例では第ＶＩＩＩ因子のＣ２−ドメインに対する
阻害性抗体であるモノクローナル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ１
１７を確認した。実施例５にはＳＫＨＥＰ細胞中での第
ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑの発現を記載し
た。驚くべきことに第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３
０７Ｑの分泌は温度依存性であって、相当量の第ＶＩＩ
Ｉ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑが２８℃の調整培地中
に分泌された。分泌された第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−
Ｒ２３０７Ｑは機能的に活性であることが判明した。第
ＶＩＩＩ因子抗原検定法および免疫螢光法の両方を採用
してＣＬＢ−ＣＡｇ１１７の反応性を研究した結果、第
ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑはモノクローナ
ル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ１１７とは反応しないことが判明
した。この観察は第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０
７ＱはＣＬＢ−ＣＡｇ１１７の第ＶＩＩＩ因子阻害活性
に対しても非感受性であることを示唆する。この仮説を
検証するためにモノクローナル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ１１
７が第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑを阻害す
る性能を測定した。対照としてはモノクローナル抗体Ｃ
ＬＢ−ＣＡｇ１１７による第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５の
阻害を試験した。量の異なるＣＬＢ−ＣＡｇ１１７を第
ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５または第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９
５−Ｒ２３０７Ｑとともに室温で２時間インキュベーシ
ョンした。続いて、残留第ＶＩＩＩ因子活性を１段法凝
固検定（Ｍｅｒｔｅｎｓなど、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍ
ａｔｏｌ．、８５巻（１９９３年）：１３３〜１４５
頁）を使用して測定した。モノクローナル抗体ＣＬＢ−
ＣＡｇ１１７による第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５の阻害か
ら得られたパターンを観察すると０．２μｇ／ｍＬと僅
かなＣＬＢ−ＣＡｇ１１７でも残留活性を２０％にする
ことが明らかになった。ＣＬＢ−ＣＡｇ１１７を増量し
てもそれ以上の第ＶＩＩＩ因子活性阻害は得られなかっ
た。ＣＬＢ−ＣＡｇ１１７と第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５
−Ｒ２３０７Ｑとのインキュベーションで得られたパタ
ーンは全く相違していた。第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−
Ｒ２３０７Ｑの活性はＣＬＢ−ＣＡｇ１１７には阻害さ
れなかった。高濃度の抗体（２０μｇ／ｍＬ）でさえ第
ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑの第ＶＩＩＩ因
子活性を阻害することができなかった（図９）。これら
の結果は第ＶＩＩＩ因子の免疫優性領域における点突然
変異を第ＶＩＩＩ因子活性を維持しながら阻害抗体の結
合を選択的に妨害するために使用できることを示す。Ａ
ｒｇ2307からＧｌｎへの交換と同様にして、第ＶＩＩＩ
因子阻害抗体の結合を阻害するために他のアミノ酸置換
も使用しうるであろう。
【００５６】実施例８：第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ
２３０７ＱのｖＷＦ結合活性の測定 前実施例ではＣＬＢ−ＣＡｇ１１７は第ＶＩＩＩ因子ｄ
Ｂ６９５−Ｒ２３０７Ｑの生物学的活性を阻害できない
ことを示した。ここでは以前に記載されている結合検定
（Ｌｅｙｔｅなど、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２５７巻
（１９９０年）、６７９〜６８３頁；Ｄｏｎａｔｈな
ど、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３１２巻（１９９５年）、
４９〜５５頁）を使用して第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−
Ｒ２３０７ＱのｖＷＦへの結合活性を測定した。マイク
ロタイターウェル上に精製フォンビルブラント因子（５
μｇ／ｍＬ）を一夜４℃で固定化した。続いて、量の異
なる第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑおよび第
ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５を含有する血清不含培地を固定
化フォンビルブラント因子とともに１時間インキュベー
ションした。この固定化したフォンビルブラント因子に
結合した第ＶＩＩＩ因子を定量した。この結果を図１０
に示すが、これらのデータから第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９
５は以前のデータ（Ｍｅｒｔｅｎｓなど、Ｂｒｉｔ．
Ｊ．Ｈａｅｍｏａｔｏｌ．、８５巻（１９９３年）、１
３３〜１４５頁）に一致して固定化フォンビルブラント
因子に結合することができることが明らかである。驚く
べきことに、第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑ
も固定化フォンビルブラント因子に定量的に結合した。
これらの結果は第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５と同様にして
第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑもフォンビル
ブラント因子に高度な親和性で結合することができるこ
とを示す。現在のデータは第ＶＩＩＩ因子のＡｒｇ2307
→Ｇｌｎ置換がこの分子のフォンビルブラント因子への
結合性に影響を与えないことを示す。総合すると、これ
らの結果は第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑは
正常な第ＶＩＩＩ因子活性を持ち、フォンビルブラント
因子に結合することができることを示す。これに加えて
第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑは抗第ＶＩＩ
Ｉ因子抗体の阻害効果に抵抗性であることが示された。
これが第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑを第Ｖ
ＩＩＩ因子の凝固活性を阻害することができ、患者の抗
第ＶＩＩＩ因子抗体の処理に有用にするかもしれない。
そこで、第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑは後
天的な血友病Ａの患者の処置または第ＶＩＩＩ因子交換
療法に続いて産生されるアロ型抗体を獲得した血友病Ａ
患者の処置に医薬的製剤の一部分として使用されるかも
知れない。
２３０７ＱのｖＷＦ結合活性の測定 前実施例ではＣＬＢ−ＣＡｇ１１７は第ＶＩＩＩ因子ｄ
Ｂ６９５−Ｒ２３０７Ｑの生物学的活性を阻害できない
ことを示した。ここでは以前に記載されている結合検定
（Ｌｅｙｔｅなど、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２５７巻
（１９９０年）、６７９〜６８３頁；Ｄｏｎａｔｈな
ど、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３１２巻（１９９５年）、
４９〜５５頁）を使用して第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−
Ｒ２３０７ＱのｖＷＦへの結合活性を測定した。マイク
ロタイターウェル上に精製フォンビルブラント因子（５
μｇ／ｍＬ）を一夜４℃で固定化した。続いて、量の異
なる第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑおよび第
ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５を含有する血清不含培地を固定
化フォンビルブラント因子とともに１時間インキュベー
ションした。この固定化したフォンビルブラント因子に
結合した第ＶＩＩＩ因子を定量した。この結果を図１０
に示すが、これらのデータから第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９
５は以前のデータ（Ｍｅｒｔｅｎｓなど、Ｂｒｉｔ．
Ｊ．Ｈａｅｍｏａｔｏｌ．、８５巻（１９９３年）、１
３３〜１４５頁）に一致して固定化フォンビルブラント
因子に結合することができることが明らかである。驚く
べきことに、第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑ
も固定化フォンビルブラント因子に定量的に結合した。
これらの結果は第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５と同様にして
第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑもフォンビル
ブラント因子に高度な親和性で結合することができるこ
とを示す。現在のデータは第ＶＩＩＩ因子のＡｒｇ2307
→Ｇｌｎ置換がこの分子のフォンビルブラント因子への
結合性に影響を与えないことを示す。総合すると、これ
らの結果は第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑは
正常な第ＶＩＩＩ因子活性を持ち、フォンビルブラント
因子に結合することができることを示す。これに加えて
第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑは抗第ＶＩＩ
Ｉ因子抗体の阻害効果に抵抗性であることが示された。
これが第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑを第Ｖ
ＩＩＩ因子の凝固活性を阻害することができ、患者の抗
第ＶＩＩＩ因子抗体の処理に有用にするかもしれない。
そこで、第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑは後
天的な血友病Ａの患者の処置または第ＶＩＩＩ因子交換
療法に続いて産生されるアロ型抗体を獲得した血友病Ａ
患者の処置に医薬的製剤の一部分として使用されるかも
知れない。
【００５７】実施例９：Ａ２−ドメイン突然変異体の調
製 前実施例では第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑ
は、第ＶＩＩＩ因子のＣ２−ドメインに対する抗第ＶＩ
ＩＩ因子抗体であるＣＬＢ−ＣＡｇ１１７によっては阻
害されないことを確認した。抗第ＶＩＩＩ因子抗体は第
ＶＩＩＩ因子蛋白質の別の領域に対するものであっても
よい。第ＶＩＩＩ因子の免疫優性エピトープの一つは第
ＶＩＩＩ因子のＡ２ドメインに存在する。一群の患者集
団を第ＶＩＩＩ因子のＡ２−ドメインに対する抗第ＶＩ
ＩＩ因子抗体の存在について検索した。患者の検索を促
進するために第ＶＩＩＩ因子の重鎖およびＡ２−ドメイ
ンを発現する組換えバキュロウイルスを構築した。第Ｖ
ＩＩＩ因子のＡ２−ドメインをコードするプラスミドＰ
ＣＬＢ−ＧＰ６７−Ａ２をオリゴヌクレオチドプライマ
ーＡ２−１（５’−ＡＴＴＣＣＡＴＧＧＧＡＴＣＡＧＴ
ＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧＣＡＴ−３’、第ＶＩＩＩ因子の
ヌクレオチド番号１１７４〜１１９１、センス配列）お
よびオリゴヌクレオチドプライマーＡ２−２（５’−Ｃ
ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＧＡＡＴＣＡＴＣＴＴＧＧ
ＴＴＣＡＡＴＧＧＣ−３’、第ＶＩＩＩ因子のヌクレオ
チド番号２２６３〜２２７７、アンチセンス配列）を採
用して１１３５ｂｐの断片を増幅することによって構築
した。１１３５ｂｐ断片を精製し、ＮｃｏＩおよびＮｏ
ｔＩで消化し、プラスミドｐＡｃＧＰ６７Ｂにクローニ
ングした。得られた構築物をｐＣＬＢ−ＧＰ６７−Ａ２
と命名したが、ここでは第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列
Ｓｅｒ373〜Ａｒｇ740が酸性糖蛋白質ＧＰ６７のリーダ
ーペプチドに融合している。第ＶＩＩＩ因子の重鎖のＡ
ｌａ1〜Ａｒｇ740アミノ酸をコードするプラスミドｐＣ
ＬＢ−ＧＰ６７−９０Ｋをオリゴヌクレオチドプライマ
ー９０Ｋ−１（５’−ＴＣＴＣＣＡＴＧＧＧＴＧＣＣＡ
ＣＣＡＧＡＡＧＡＴＡＣＴＡＣ−３’、第ＶＩＩＩ因子
のヌクレオチド番号５８〜７５、センス配列）およびオ
リゴヌクレオチドプライマー９０Ｋ−２（５’−ＡＣＡ
ＴＡＣＴＡＧＴＡＧＧＧＣＴＣＣ−３’、第ＶＩＩＩ因
子のヌクレオチド番号５７７〜５９４、アンチセンス配
列）を使用して５４８ｂｐ断片を増幅することによって
構築した。５４８ｂｐのＰＣＲ生成物を精製し、Ｎｃｏ
ＩおよびＮｄｅＩで消化した。プラスミドｐＣＬＢ−Ｂ
ＰＶｄＢ６９５をＮｄｅＩ（第ＶＩＩＩ因子のヌクレオ
チド番号４６１）およびＫｐｎＩ（第ＶＩＩＩ因子のヌ
クレオチド番号１８１１）で消化して１３５１ｂｐ断片
を得た。プラスミドｐＣＬＢ−ＧＰ６７−Ａ２をＫｐｎ
ＩおよびＮｏｔＩで消化し、得られた断片を前記Ｎｃｏ
Ｉ−ＮｄｅＩ断片およびこのＫｐｎＩ−ＮｏｔＩ断片と
ともにｐＡｃＧＰ６７Ｂにクローニングした。得られた
構築物をｐＣＬＢ−ＧＰ６７−９０Ｋと命名した。実施
例５に記載したようにして第ＶＩＩＩ因子重鎖およびＡ
２−ドメインを発現する組換えウイルスを調製した。患
者血漿２０μＬを使用する免疫沈降実験を実施例５に記
載のようにして実施した。以下に記載の研究では代謝的
に標識したＡ２−ドメインおよび第ＶＩＩＩ因子重鎖を
使用した。血友病Ａ患者集団の検索によって軽症血友病
Ａ患者に由来する血漿は代謝的に標識したＡ２−ドメイ
ンおよび第ＶＩＩＩ因子重鎖の双方と反応性のある抗第
ＶＩＩＩ因子抗体を含むことが示された。軽症血友病患
者での抗第ＶＩＩＩ因子抗体の産生はこれらの患者の血
漿中にはしばしば内因性第ＶＩＩＩ因子がかなりな量が
存在するので比較的希である。このことは軽症病状下に
産生される抗第ＶＩＩＩ因子抗体は外因性第ＶＩＩＩ因
子には存在するが、内因性第ＶＩＩＩ因子には存在しな
いエピトープに指向することを示唆する。この可能性を
検討するため抗第ＶＩＩＩ因子抗体を有する患者の第Ｖ
ＩＩＩ因子遺伝子内の突然変異を第ＶＩＩＩ因子のエク
ソン２６個をポリメラーゼ連鎖反応を採用して増幅する
ことによって決定した。第ＶＩＩＩ因子遺伝子内にある
点突然変異の存在は単鎖配置多型（ＳＳＣＰ）を増幅し
たＰＣＲ断片の直接配列決定法と組合せて利用して検討
した。ＳＳＣＰによって第ＶＩＩＩ因子遺伝子のエクソ
ン１２に対応するＰＣＲ断片の異所移動が見出された。
直接的な配列決定でＡｒｇ593のＣｙｓによる置換を示
す点突然変異（Ｃ→Ｔ）を見出した。このミスセンス突
然変異が内因的に合成された第ＶＩＩＩ因子蛋白質に立
体配座的な変化を起こしているのであろうと思われる。
この問題を解くためにＡｒｇ593→Ｃｙｓ突然変異を第
ＶＩＩＩ因子のＡ２−ドメインをコードする構築物に導
入した。Ａｒｇ593がＣｙｓで置換された第ＶＩＩＩ因
子のＡ２−ドメインをコードするプラスミドｐＣＬＢ−
ＧＰ６７Ｂ−Ａ２−Ｒ５９３Ｃを重複伸長法を用いる部
位特異的突然変異誘発によって構築した。オリゴヌクレ
オチドプライマーＲ５９３Ｃ（５’−ＧＡＧＡＡＴＡＴ
ＡＣＡＡＴＧＣＴＴＴＣＴＣＣＣ−３’、第ＶＩＩＩ因
子のヌクレオチド番号１８２２〜１８４４、センス配
列）をオリゴヌクレオチドプライマーＡ２−２とともに
使用して４７６ｂｐの断片を増幅した。オリゴヌクレオ
チドプライマーＲ５９３Ｃ−２（５’−ＧＧＧＡＧＡＡ
ＡＧＣＡＴＴＧＴＡＴＡＴＴＣＴＣ−３’、第ＶＩＩＩ
因子のヌクレオチド番号１８２２〜１８４４、アンチセ
ンス配列）およびオリゴヌクレオチドプライマーＡ２−
１を使用して６８２ｂｐ断片を増幅した。増幅した両断
片を精製して鋳型として使用するＰＣＲでオリゴヌクレ
オチドプライマーＡ２−１およびＡ２−２を使用してＤ
ＮＡ断片を増幅し、増幅した断片を精製した後にＮｃｏ
ＩおよびＮｏｔＩで消化し、プラスミドｐＡｃＧＰ６７
ＢにクローニングしてプラスミドｐＣＬＢ−ＧＰ６７−
Ａ２Ｒ５９３Ｃを得た。Ａ２−ドメインを修飾したヌク
レオチド配列はオリゴヌクレオチド配列決定によって検
証した。実施例２および３に記載のようにしてＡｒｇ
593→Ｃｙｓ突然変異を有する代謝的に標識したＡ２−
ドメインを含む調整培地を調製した。この代謝的に標識
した修正Ａ２−ドメインをＡ２Ｒ５９３Ｃと命名した
が、これをモノクローナル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ９で免疫
沈降するとＡ２Ｒ５９３Ｃは野生型Ａ２−ドメインと同
様な量で調整培地中に存在することが判明した。しかし
ながら、患者の血漿中に存在する抗体は修正Ａ２−ドメ
イン（Ａ２Ｒ５９３Ｃ）とは反応しなかった。この観察
は第ＶＩＩＩ因子での処置の間に患者体内に産生される
抗第ＶＩＩＩ因子抗体は野生型第ＶＩＩＩ因子に特異的
なことを示唆する。この抗第ＶＩＩＩ因子抗体はＡｒｇ
593→Ｃｙｓ突然変異を含む組換えＡ２−ドメインとは
反応しない。以上のデータは抗第ＶＩＩＩ因子抗体の結
合は第ＶＩＩＩ因子蛋白質上にある免疫優性部位の選択
的な修正によって調節できることを示す。この実施例と
同様にして第ＶＩＩＩ因子上にある他の免疫優性領域の
選択的な修正を抗第ＶＩＩＩ因子抗体の結合を妨害する
ために利用しうるであろう。
製 前実施例では第ＶＩＩＩ因子ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑ
は、第ＶＩＩＩ因子のＣ２−ドメインに対する抗第ＶＩ
ＩＩ因子抗体であるＣＬＢ−ＣＡｇ１１７によっては阻
害されないことを確認した。抗第ＶＩＩＩ因子抗体は第
ＶＩＩＩ因子蛋白質の別の領域に対するものであっても
よい。第ＶＩＩＩ因子の免疫優性エピトープの一つは第
ＶＩＩＩ因子のＡ２ドメインに存在する。一群の患者集
団を第ＶＩＩＩ因子のＡ２−ドメインに対する抗第ＶＩ
ＩＩ因子抗体の存在について検索した。患者の検索を促
進するために第ＶＩＩＩ因子の重鎖およびＡ２−ドメイ
ンを発現する組換えバキュロウイルスを構築した。第Ｖ
ＩＩＩ因子のＡ２−ドメインをコードするプラスミドＰ
ＣＬＢ−ＧＰ６７−Ａ２をオリゴヌクレオチドプライマ
ーＡ２−１（５’−ＡＴＴＣＣＡＴＧＧＧＡＴＣＡＧＴ
ＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧＣＡＴ−３’、第ＶＩＩＩ因子の
ヌクレオチド番号１１７４〜１１９１、センス配列）お
よびオリゴヌクレオチドプライマーＡ２−２（５’−Ｃ
ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＧＡＡＴＣＡＴＣＴＴＧＧ
ＴＴＣＡＡＴＧＧＣ−３’、第ＶＩＩＩ因子のヌクレオ
チド番号２２６３〜２２７７、アンチセンス配列）を採
用して１１３５ｂｐの断片を増幅することによって構築
した。１１３５ｂｐ断片を精製し、ＮｃｏＩおよびＮｏ
ｔＩで消化し、プラスミドｐＡｃＧＰ６７Ｂにクローニ
ングした。得られた構築物をｐＣＬＢ−ＧＰ６７−Ａ２
と命名したが、ここでは第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列
Ｓｅｒ373〜Ａｒｇ740が酸性糖蛋白質ＧＰ６７のリーダ
ーペプチドに融合している。第ＶＩＩＩ因子の重鎖のＡ
ｌａ1〜Ａｒｇ740アミノ酸をコードするプラスミドｐＣ
ＬＢ−ＧＰ６７−９０Ｋをオリゴヌクレオチドプライマ
ー９０Ｋ−１（５’−ＴＣＴＣＣＡＴＧＧＧＴＧＣＣＡ
ＣＣＡＧＡＡＧＡＴＡＣＴＡＣ−３’、第ＶＩＩＩ因子
のヌクレオチド番号５８〜７５、センス配列）およびオ
リゴヌクレオチドプライマー９０Ｋ−２（５’−ＡＣＡ
ＴＡＣＴＡＧＴＡＧＧＧＣＴＣＣ−３’、第ＶＩＩＩ因
子のヌクレオチド番号５７７〜５９４、アンチセンス配
列）を使用して５４８ｂｐ断片を増幅することによって
構築した。５４８ｂｐのＰＣＲ生成物を精製し、Ｎｃｏ
ＩおよびＮｄｅＩで消化した。プラスミドｐＣＬＢ−Ｂ
ＰＶｄＢ６９５をＮｄｅＩ（第ＶＩＩＩ因子のヌクレオ
チド番号４６１）およびＫｐｎＩ（第ＶＩＩＩ因子のヌ
クレオチド番号１８１１）で消化して１３５１ｂｐ断片
を得た。プラスミドｐＣＬＢ−ＧＰ６７−Ａ２をＫｐｎ
ＩおよびＮｏｔＩで消化し、得られた断片を前記Ｎｃｏ
Ｉ−ＮｄｅＩ断片およびこのＫｐｎＩ−ＮｏｔＩ断片と
ともにｐＡｃＧＰ６７Ｂにクローニングした。得られた
構築物をｐＣＬＢ−ＧＰ６７−９０Ｋと命名した。実施
例５に記載したようにして第ＶＩＩＩ因子重鎖およびＡ
２−ドメインを発現する組換えウイルスを調製した。患
者血漿２０μＬを使用する免疫沈降実験を実施例５に記
載のようにして実施した。以下に記載の研究では代謝的
に標識したＡ２−ドメインおよび第ＶＩＩＩ因子重鎖を
使用した。血友病Ａ患者集団の検索によって軽症血友病
Ａ患者に由来する血漿は代謝的に標識したＡ２−ドメイ
ンおよび第ＶＩＩＩ因子重鎖の双方と反応性のある抗第
ＶＩＩＩ因子抗体を含むことが示された。軽症血友病患
者での抗第ＶＩＩＩ因子抗体の産生はこれらの患者の血
漿中にはしばしば内因性第ＶＩＩＩ因子がかなりな量が
存在するので比較的希である。このことは軽症病状下に
産生される抗第ＶＩＩＩ因子抗体は外因性第ＶＩＩＩ因
子には存在するが、内因性第ＶＩＩＩ因子には存在しな
いエピトープに指向することを示唆する。この可能性を
検討するため抗第ＶＩＩＩ因子抗体を有する患者の第Ｖ
ＩＩＩ因子遺伝子内の突然変異を第ＶＩＩＩ因子のエク
ソン２６個をポリメラーゼ連鎖反応を採用して増幅する
ことによって決定した。第ＶＩＩＩ因子遺伝子内にある
点突然変異の存在は単鎖配置多型（ＳＳＣＰ）を増幅し
たＰＣＲ断片の直接配列決定法と組合せて利用して検討
した。ＳＳＣＰによって第ＶＩＩＩ因子遺伝子のエクソ
ン１２に対応するＰＣＲ断片の異所移動が見出された。
直接的な配列決定でＡｒｇ593のＣｙｓによる置換を示
す点突然変異（Ｃ→Ｔ）を見出した。このミスセンス突
然変異が内因的に合成された第ＶＩＩＩ因子蛋白質に立
体配座的な変化を起こしているのであろうと思われる。
この問題を解くためにＡｒｇ593→Ｃｙｓ突然変異を第
ＶＩＩＩ因子のＡ２−ドメインをコードする構築物に導
入した。Ａｒｇ593がＣｙｓで置換された第ＶＩＩＩ因
子のＡ２−ドメインをコードするプラスミドｐＣＬＢ−
ＧＰ６７Ｂ−Ａ２−Ｒ５９３Ｃを重複伸長法を用いる部
位特異的突然変異誘発によって構築した。オリゴヌクレ
オチドプライマーＲ５９３Ｃ（５’−ＧＡＧＡＡＴＡＴ
ＡＣＡＡＴＧＣＴＴＴＣＴＣＣＣ−３’、第ＶＩＩＩ因
子のヌクレオチド番号１８２２〜１８４４、センス配
列）をオリゴヌクレオチドプライマーＡ２−２とともに
使用して４７６ｂｐの断片を増幅した。オリゴヌクレオ
チドプライマーＲ５９３Ｃ−２（５’−ＧＧＧＡＧＡＡ
ＡＧＣＡＴＴＧＴＡＴＡＴＴＣＴＣ−３’、第ＶＩＩＩ
因子のヌクレオチド番号１８２２〜１８４４、アンチセ
ンス配列）およびオリゴヌクレオチドプライマーＡ２−
１を使用して６８２ｂｐ断片を増幅した。増幅した両断
片を精製して鋳型として使用するＰＣＲでオリゴヌクレ
オチドプライマーＡ２−１およびＡ２−２を使用してＤ
ＮＡ断片を増幅し、増幅した断片を精製した後にＮｃｏ
ＩおよびＮｏｔＩで消化し、プラスミドｐＡｃＧＰ６７
ＢにクローニングしてプラスミドｐＣＬＢ−ＧＰ６７−
Ａ２Ｒ５９３Ｃを得た。Ａ２−ドメインを修飾したヌク
レオチド配列はオリゴヌクレオチド配列決定によって検
証した。実施例２および３に記載のようにしてＡｒｇ
593→Ｃｙｓ突然変異を有する代謝的に標識したＡ２−
ドメインを含む調整培地を調製した。この代謝的に標識
した修正Ａ２−ドメインをＡ２Ｒ５９３Ｃと命名した
が、これをモノクローナル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ９で免疫
沈降するとＡ２Ｒ５９３Ｃは野生型Ａ２−ドメインと同
様な量で調整培地中に存在することが判明した。しかし
ながら、患者の血漿中に存在する抗体は修正Ａ２−ドメ
イン（Ａ２Ｒ５９３Ｃ）とは反応しなかった。この観察
は第ＶＩＩＩ因子での処置の間に患者体内に産生される
抗第ＶＩＩＩ因子抗体は野生型第ＶＩＩＩ因子に特異的
なことを示唆する。この抗第ＶＩＩＩ因子抗体はＡｒｇ
593→Ｃｙｓ突然変異を含む組換えＡ２−ドメインとは
反応しない。以上のデータは抗第ＶＩＩＩ因子抗体の結
合は第ＶＩＩＩ因子蛋白質上にある免疫優性部位の選択
的な修正によって調節できることを示す。この実施例と
同様にして第ＶＩＩＩ因子上にある他の免疫優性領域の
選択的な修正を抗第ＶＩＩＩ因子抗体の結合を妨害する
ために利用しうるであろう。
【００５８】実施例１０：精製した突然変異体蛋白質製
品の医薬的製剤への製剤化 実施例２および９に従って製造した突然変異体蛋白質を
クロマトグラフィー操作および／または沈降技術を含む
常法によって精製しておく。精製した蛋白質製品を次に
無菌濾過および限外濾過／透析濾過のような標準的技術
を使用して生理学的に許容される製品に製剤化した。こ
の医薬的製品に使用した好適な緩衝液は生理学的ＮａＣ
ｌ緩衝液またはトリス緩衝液で、ｐＨ範囲が６〜８、好
ましくは７と７．５との間のものである。この医薬的製
剤中の蛋白質の濃度は患者を処置するために必要な用量
に従って選択する。
品の医薬的製剤への製剤化 実施例２および９に従って製造した突然変異体蛋白質を
クロマトグラフィー操作および／または沈降技術を含む
常法によって精製しておく。精製した蛋白質製品を次に
無菌濾過および限外濾過／透析濾過のような標準的技術
を使用して生理学的に許容される製品に製剤化した。こ
の医薬的製品に使用した好適な緩衝液は生理学的ＮａＣ
ｌ緩衝液またはトリス緩衝液で、ｐＨ範囲が６〜８、好
ましくは７と７．５との間のものである。この医薬的製
剤中の蛋白質の濃度は患者を処置するために必要な用量
に従って選択する。
【００５９】本発明による第ＶＩＩＩ因子製品の用量は
各々出血損傷の性質、程度、および期間ならびに血友病
の重症度および阻害性指数に依存する。初期用量は通常
１Ｕ／ｋｇ体重と５００Ｕ／ｋｇ体重との間、好ましく
は１０Ｕ／ｋｇ体重と２００Ｕ／ｋｇ体重との間に存在
する。
各々出血損傷の性質、程度、および期間ならびに血友病
の重症度および阻害性指数に依存する。初期用量は通常
１Ｕ／ｋｇ体重と５００Ｕ／ｋｇ体重との間、好ましく
は１０Ｕ／ｋｇ体重と２００Ｕ／ｋｇ体重との間に存在
する。
【図１】 第ＶＩＩＩ因子・ｄＢ６９５および第ＶＩＩ
Ｉ因子・ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑの図示。
Ｉ因子・ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑの図示。
【図２】 第ＶＩＩＩ因子・ｄＢ６９５−ｃＤＮＡを遺
伝子移入した細胞の瞬間標識追跡分析。
伝子移入した細胞の瞬間標識追跡分析。
【図３】 第ＶＩＩＩ因子・ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑ
−ｃＤＮＡを遺伝子移入した細胞の瞬間標識追跡分析。
−ｃＤＮＡを遺伝子移入した細胞の瞬間標識追跡分析。
【図４】 第ＶＩＩＩ因子・ｄＢ６９５および第ＶＩＩ
Ｉ因子・ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑのエンドグリコシダ
ーゼＨ消化。
Ｉ因子・ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑのエンドグリコシダ
ーゼＨ消化。
【図５】 ＳＫＨＥＰ細胞中における第ＶＩＩＩ因子・
ｄＢ６９５の発現。
ｄＢ６９５の発現。
【図６】 ＳＫＨＥＰ細胞中における第ＶＩＩＩ因子・
ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑの発現。
ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑの発現。
【図７】 ＳＫＨＥＰ細胞中における第ＶＩＩＩ因子・
ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑの発現。
ｄＢ６９５−Ｒ２３０７Ｑの発現。
【図８】 ＣＬＢ−ＣＡｇ１１７による第ＶＩＩＩ因子
の阻害。
の阻害。
【図９】 ＣＬＢ−ＣＡｇ１１７による第ＶＩＩＩ因子
の阻害。
の阻害。
【図１０】 第ＶＩＩＩ因子−ｖＷＦ結合。
Claims (20)
- 【請求項１】 第ＶＩＩＩ因子凝固促進活性およびｖＷ
Ｆ結合活性を有する蛋白質を含有する安定な医薬的製剤
であって、その蛋白質は第ＶＩＩＩ因子蛋白質のアミノ
酸配列から誘導されたアミノ酸配列を持ち、その誘導さ
れたアミノ酸配列は第ＶＩＩＩ因子の免疫優性領域の少
なくとも１個に少なくとも１個の突然変異を含むもの。 - 【請求項２】 その免疫優性領域がＣ２−および／また
はＡ２−ドメインであることを特徴とする請求項１の製
剤。 - 【請求項３】 その蛋白質が前記突然変異を有しない第
ＶＩＩＩ因子蛋白質の第ＶＩＩＩ因子凝固促進活性と比
べて少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、
さらに好ましくは少なくとも８０％、特に少なくとも１
００％の第ＶＩＩＩ因子凝固促進活性を示すことを特徴
とする請求項１または請求項２の製剤。 - 【請求項４】 その蛋白質が前記突然変異を有しない第
ＶＩＩＩ因子蛋白質のｖＷＦ結合活性と比べて少なくと
も３０％、好ましくは少なくとも５０％、さらに好まし
くは少なくとも８０％、特に少なくとも１００％のｖＷ
Ｆ結合活性を示すことを特徴とする請求項１から請求項
３までのいずれかの製剤。 - 【請求項５】 その蛋白質が第ＶＩＩＩ因子阻害剤の存
在下に第ＶＩＩＩ因子凝固促進活性を示すことを特徴と
する請求項１から請求項４までのいずれかの製剤。 - 【請求項６】 その蛋白質が第ＶＩＩＩ因子阻害剤の存
在下にｖＷＦ結合活性を示すことを特徴とする請求項１
から請求項５までのいずれかの製剤。 - 【請求項７】 その蛋白質が第ＶＩＩＩ因子阻害性患者
から分離した第ＶＩＩＩ因子阻害剤の存在下またはＣＬ
Ｂ−ＣＡｇ１１７のようにハイブリドーマ技術によって
製造した等価な抗体の存在下に活性を示す請求項５また
は請求項６の製剤。 - 【請求項８】 その免疫優性領域が第ＶＩＩＩ因子阻害
性患者から分離した第ＶＩＩＩ因子阻害剤によって認識
されるか、またはＣＬＢ−ＣＡｇ１１７のようにハイブ
リドーマ技術によって製造された等価な抗体によって認
識されることを特徴とする請求項１から請求項７までの
いずれかの製剤。 - 【請求項９】 その突然変異が突然変異体Ｒ２３０７Ｑ
および突然変異体Ｒ５６３Ｃを含む群から選択されるこ
とを特徴とする請求項１から請求項８までのいずれかの
製剤。 - 【請求項１０】 その蛋白質が前記突然変異を含むＢ−
ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子蛋白質であることを特徴と
する請求項１から請求項９までのいずれかの製剤。 - 【請求項１１】 さらにｖＷＦおよび／またはその断片
を含む請求項１から請求項１０までのいずれかの製剤。 - 【請求項１２】 請求項１から請求項１１までのいずれ
かによる蛋白質およびｖＷＦまたはその断片を含有する
生物学的に活性な第ＶＩＩＩ因子複合体。 - 【請求項１３】 その蛋白質が哺乳類細胞中で発現さ
れ、その細胞から精製され、さらに医薬的製品に製剤化
されることを特徴とする請求項１から請求項１１までの
いずれかによる製品を製造する方法。 - 【請求項１４】 その発現が２０℃から４５℃までの間
の温度、好ましくは２５℃から３７℃までの温度で実行
されることを特徴とする請求項１３の方法。 - 【請求項１５】 その蛋白質がｖＷＦまたはその断片と
ともに共発現されることを特徴とする請求項１３または
請求項１４の方法。 - 【請求項１６】 その蛋白質が第ＶＩＩＩ因子の免疫優
性領域に前記突然変異を有する患者の血漿から精製した
ものであって、それを医薬的製品に製剤化することを特
徴とする請求項１から請求項１１までのいずれかの製品
を製造する方法。 - 【請求項１７】 ｖＷＦおよび／またはその断片を精製
または製剤化の段階の間に添加することを特徴とする請
求項１３から請求項１６までのいずれかの方法。 - 【請求項１８】 請求項１から請求項１１までのいずれ
かによる蛋白質を含有する第ＶＩＩＩ因子阻害性を有す
る患者または第ＶＩＩＩ因子阻害性の可能性を有する患
者を処置するための医薬的製品。 - 【請求項１９】 請求項１から請求項１１までのいずれ
かによる蛋白質に対して産生される抗体を含む抗体製
品。 - 【請求項２０】 請求項１から請求項１１までのいずれ
かによる蛋白質を精製または測定するための請求項１９
による抗体製品の使用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT0092196A AT403438B (de) | 1996-05-24 | 1996-05-24 | Pharmazeutische präparation mit faktor viii prokoagulationsaktivität und vwf-bindungsaktivität |
| AT921/96 | 1996-05-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1057060A true JPH1057060A (ja) | 1998-03-03 |
Family
ID=3502907
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9134976A Pending JPH1057060A (ja) | 1996-05-24 | 1997-05-26 | 第ＶＩＩＩ因子凝固活性およびｖＷＦ結合活性を示す医薬製剤 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0808901A3 (ja) |
| JP (1) | JPH1057060A (ja) |
| AT (1) | AT403438B (ja) |
| CA (1) | CA2205824A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6376463B1 (en) | 1992-04-07 | 2002-04-23 | Emory University | Modified factor VIII |
| EP1129186B2 (de) | 1998-11-10 | 2016-11-30 | Stichting Sanquin Bloedvoorziening | Ein faktor viii-polypeptid mit faktor viii:c-aktivität |
| EP1183354A2 (en) * | 1999-05-24 | 2002-03-06 | The American National Red Cross | Methods of reducing factor viii clearance and compositions therefor |
| EP1351986A2 (en) * | 2001-01-12 | 2003-10-15 | The American National Red Cross | Methods and compositions for reducing heparan sulfate proteoglycan-mediated clearance of factor viii |
| US7211559B2 (en) | 2003-10-31 | 2007-05-01 | University Of Maryland, Baltimore | Factor VIII compositions and methods |
| US7632921B2 (en) | 2004-11-12 | 2009-12-15 | Bayer Healthcare Llc | Site-directed modification of FVIII |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988005825A1 (en) * | 1987-01-30 | 1988-08-11 | Biogen N.V. | A method for producing factor viii in high yield |
| EP0294910B1 (en) * | 1987-06-12 | 1996-09-11 | Immuno Ag | Novel proteins with factor VIII activity, process for their preparation using genetically engineered cells and pharmaceutical compositions containing them |
| US5663060A (en) * | 1992-04-07 | 1997-09-02 | Emory University | Hybrid human/animal factor VIII |
| AU1382595A (en) * | 1994-01-07 | 1995-08-01 | Novo Nordisk A/S | Factor viii derivatives |
-
1996
- 1996-05-24 AT AT0092196A patent/AT403438B/de not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-05-22 CA CA002205824A patent/CA2205824A1/en not_active Abandoned
- 1997-05-23 EP EP97890095A patent/EP0808901A3/de not_active Withdrawn
- 1997-05-26 JP JP9134976A patent/JPH1057060A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AT403438B (de) | 1998-02-25 |
| EP0808901A2 (de) | 1997-11-26 |
| ATA92196A (de) | 1997-07-15 |
| EP0808901A3 (de) | 1999-05-06 |
| CA2205824A1 (en) | 1997-11-24 |
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