JPH1057076A

JPH1057076A - ヒトＭｕｔＹ

Info

Publication number: JPH1057076A
Application number: JP9099540A
Authority: JP
Inventors: Fei Uei In; イン−フェイ・ウェイ
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1996-03-11
Filing date: 1997-03-11
Publication date: 1998-03-03
Also published as: US20110224415A1; US6013473A; US7470510B2; US7927803B2; US8268979B2; US20050074755A1; US20090029380A1; US6051222A

Abstract

(57)【要約】【課題】癌およびＤＮＡ修復に関連する疾患のマーカ
ーとして使用するための、ヒト細胞の突然変異率を調整
する遺伝子およびタンパク質の同定および特性化につい
ての課題がある。【解決手段】（ａ）配列番号２に示すアミノ酸１から
アミノ酸５３５を含むポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド；（ｂ）（ｂ）のポリペプチドに相補的なポ
リヌクレオチド；および（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポ
リヌクレオチドの少なくとも３０の連続した塩基を含む
ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレ
オチドと、少なくとも７０％の同一性を有するポリヌク
レオチドを有してなる単離されたポリヌクレオチドを利
用して、癌などの疾患を診断する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】ＧＯシステムは、ＧＯ損傷の主要な互変異
性型の構造体、７,８−ジヒドロ−８−オキソグアニン
を含む。酸化的障害はＤＮＡにＧＯ損傷をもたらす場合
がある。ＭｕｔＹは、ＧＯ損傷を過ぎて誤り易い複製の
原因となるＡ／ＧＯ誤対合から誤って取り込まれたアデ
ニンを取り除く。修復ポリメラーゼは、トランス損傷合
成する間は誤りはそれほど起こし易くなく、Ｃ／ＧＯ対
合を導くことができる。酸化的障害も８−オキソ−ｄＧ
ＴＰを導くことができる。不正確な複製は、Ａ／ＧＯ誤
対合を導く８−オキソ−ｄＧＴＰの取り込み違いを鋳型
Ａ残基の反対側に引き起こすであろう。ＭｕｔＹはＡ／
ＧＯ基質で活性であるので上記の突然変異工程に関与し
ている可能性があり、鋳型Ａを取り除いてＭｕｔＴ株の
特徴であるＡＴ(r)ＣＧトランスバージョンを導くこと
ができる。８−オキソ−ｄＧＴＰはさらに、鋳型シトシ
ンの反対側に取り込まれ、ＭｕｔＭによって正しくされ
得る障害性Ｃ／ＧＯ対合となる可能性がある。本発明
は、新たに同定されたポリヌクレオチド、このポリヌク
レオチドによってコードされるポリペプチド、そのポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドの用途、およびそのよ
うなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造に関す
る。さらに詳細には、本発明のポリペプチドは大腸菌Ｍ
ｕｔＹ遺伝子のヒト相同体であると推定されるものとし
て同定され、本明細書ではｈＭＹＨと称することがあ
る。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ＤＮ
Ａの誤対合は、ＤＮＡ複製の誤り、ＤＮＡ組換えおよび
脱アミノ化または酸化的環境へのＤＮＡの暴露の後に起
こる。細胞は、塩基対の誤対合および化学的障害に起因
する遺伝子の完全性に対する脅威に対処する宿主のスト
ラテジーを有している[Friedberg, EC ＤＮＡ repai
r, W.H.Freeman, New York（1985）]。特に複製の誤り
のミスマッチ修復に関しては、大腸菌(Escherichia col
i)およびサルモネラ菌(Salmonella typhimurium)は、Ｍ
ｕｔＨＬＳシステムを使用し、ｄ（ＧＡＴＣ）配列のｄ
ａｍメチル化によってメチル化されていない新たに合成
されたＤＮＡ鎖に修復を指令する[Clavery,J.P.およびL
acks,S.A., Microbiol.,Rev.50: 133-165 (1986)； Mod
rich,P. Annu.Rev.Genet. 25:229-253 (1991);Radman,
M.およびR.Wagner, Annu.Rev.Genet. 20:523-528(198
6)]。大腸菌の非常に短い修繕経路はＴ／Ｇミスマッチ
（斜線でミスマッチが示される）の矯正に特異的であ
り、脱アミノ化５−メチルシトシンの矯正に関与してい
る[Jones,M.ら、Genetics, 115:605-610 (1987); Lieb,
M., Gen.Genet. 181:118-125(1983); Lieb,M.,およびD.
Read, Genetics 114:1041-1060 (1986); Raposa,S.およ
びN.S.Fox, Genetics 117:381-390(1987)]。

【０００３】大腸菌ＭｕｔＹ経路はＡ／ＧおよびＡ／Ｃ
ミスマッチの矯正のみならず、７,８−ジヒドロ−８−
オキソ−デオキシグアニン（８−オキソＧまたはＧＯ）
と対合しているアデニンをも矯正する[Au,K.G.ら、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 85:9163-9166 (1988)； Lu,A.L.
およびD.Y.Chang, Genetics, 118:593-600(1988); Mich
aels,M.L.,ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7022-7025
(1992); Michaels,M.L.,ら、Biochemistry, 31:10964-1
0968(1992); Radicella,J.P.,ら、Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 85:9674-9678(1988); Su,S.-S.,ら、J.Biol.Chem.2
63:6829-6835(1988)]。３９ｋＤａＭｕｔＹタンパク質
は大腸菌エンドヌクレアーゼＩＩＩと若干の相同性を有
し、[４Ｆｅ−４Ｓ]２＋クラスターを含有する[Lu,A.-
L.,ら、1994, 未公開データ; Michaels,M.L.,ら、Nucle
ic Acids Res. 18:3841-3845(1990);Tsai-Wu,J.-J.,
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:8779-8783(1992); Tsa
i-Wu,J.-J., J.Bacteriol. 173:1902-1910(1991)]。Tsa
i-WuらのＭｕｔＹ製造[Tsai-Wu,J.-J., ら、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 89:8779-8783(1992)]はＤＮＡＮ−グリ
コシラーゼおよびアプリンまたはアピリミジン（ＡＰ）
エンドヌクレアーゼ活性の両者を有しているが、他方Au
ら[Au,K.G.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8877-8881
(1989)]および Michaelsら[Michaels,M.L.,ら、Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA89:7022-7025(1992); Michaels,M.L.,
ら、Biochemistry, 31:10964-10968(1992)]によって精
製されたものはグリコシラーゼ活性しか有していなかっ
た。ＤＮＡグリコシラーゼはミスマッチから誤対合アデ
ニンを特異的に切除し、ＡＰエンドヌクレアーゼは最初
のホスホジエステル結合３「を切断してＡＰ部位とする
[Au,K.G.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8877-8881 (1
989)；Tsai-Wu,J.-J., ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
9:8779-8783(1992)]。

【０００４】ＭｕｔＹ経路による修復には短修復トラッ
クおよびＤＮＡポリメラーゼＩが絡んでいる[Radicell
a,J.P.,ら、J.Bacteriol.,175:7732-7736(1993); Tsai-
Wu,J.-J.,およびA.-L.Lu, Mol.Gen.Genet.244:444-450
(1994)]。

【０００５】ミスマッチ修復の上記ストラテジーは進化
論的に保存されている。遺伝分析は、サッカロマイセス
・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)が細菌性ｄａ
ｍメチル化依存性経路に類似した修復システムを有して
いることを示している[Bishop,D.K.ら、Nature(London)
243:362-364(1987); Reenan,R.A.およびR.D.Kolodner,
Genetics, 132:963-973(1992); Reenan,R.A.およびR.
D.Kolodner, Genetics,132:975-985(1992); Williamso
n,M.ら、Genetics,110:609-646(1985)]。この経路は脱
アミノ化５−メチルシトシンの矯正のための大腸菌にお
ける正にその種の修繕経路に機能的に類似している。

【０００６】大腸菌における２つの突然変異誘発遺伝子
ｍｕｔＹおよびｍｕｔＭ遺伝子[Cabreraら、J.Bacterio
l., 170:5405-5407(1988); およびNghiem,Y.ら、PNAS,
USA,85:9163-9166(1988)]が記載されており、これらは
共同して働いて特定の型の酸化的障害に由来する突然変
異を防ぎ、特に酸化グアニン損傷、８−オキソｄグアニ
ンを処理する[Michaelsら、PNAS,USA, 89:7022-7025(19
92)]。Michaels,M.L.およびMiller,J.H.、J. Bacterio
l.,174:6321-6325(1992)では、これら２つの共にグリコ
シラーゼである酵素の作用関係が要約されている。Ｍｕ
ｔＭタンパク質はＤＮＡから８−オキソｄＧを取り除
き、残余ＡＰ部位は修復されてＧ：Ｃ塩基対が回復され
る。損傷の中には複製の前に修復されないものがあり、
８−オキソｄＧと対のＡが５０％挿入され、これは次回
の複製ではＧ：ＣからＴ：Ａへのトランスバージョンを
引き起こし得る。しかし、ＭｕｔＹタンパク質は８−オ
キソｄＧと対のＡを取り除き、合成を修復して殆どの場
合はＣを回復させ、ＭｕｔＭタンパク質が別の機会に損
傷を修復できるようにする。これによれば、ＭｕｔＭま
たはＭｕｔＹタンパク質のいずれかが欠如した突然変異
誘発は特に、Ｇ：ＣからＴ：Ａへのトランスバージョン
が増加し[Cabreraら、前掲(1988); およびNghiem,Y.
ら、前掲(1988)]、両酵素を欠く細胞はこの塩基置換が
極めて増加している[Michaelsら、前掲(1992)]。第三の
タンパク質であるｍｕｔＴ遺伝子の産物は酸化三リン酸
を加水分解して一リン酸に戻すことによって、８−オキ
ソｄＧＴＰの組み込みを妨げ[Maki,H.およびSekiguchi,
M., Nature, 355:273-275(1992)]、Ａ：ＴからＣ：Ｇト
ランスバージョンを防止する。

【０００７】従って、癌およびＤＮＡ修復に関連する疾
患のマーカーとして特に使用するための、ヒト細胞の突
然変異率を調整する遺伝子およびタンパク質の同定およ
び特性化が当業界では切望されている。具体的には、結
腸などの組織や器官の適切な発達や健康に必須であり、
かつ機能不全または疾患、具体的には癌、より具体的に
は例えばＨＮＰＣＣ（ポリープ症でない結腸癌）などの
結腸癌の予防、改善、診断または矯正に特に役割を果た
すヒトミスマッチ修復遺伝子およびタンパク質の単離や
特性化が要望されている。

【０００８】

【課題を解決するための手段および発明の実施の形態】
本発明は１つの態様として、新規な成熟ポリペプチド、
ならびに生物学的に活性かつ診断的または治療的に有用
なその断片、同族体および誘導体に関する。本発明のポ
リペプチドはヒト起源のものである。

【０００９】本発明の他の態様は、本発明のポリペプチ
ドをコードする、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡな
らびにその同族体および生物学的に活性かつ診断的また
は治療的に有用なその断片などの単離された核酸分子に
関する。

【００１０】本発明の他の態様は、本発明のポリペプチ
ドをコードする核酸配列を含有する組換え原核生物およ
び／または真核生物宿主細胞を該タンパク質の発現を促
進させる条件下に培養し、次いで得られたタンパク質を
回収することを包含する組換え手法によって本発明のポ
リペプチドを生産する方法に関する。

【００１１】本発明の他の態様は、本発明のポリペプチ
ド、または該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドを治療目的、例えばＤＮＡに対する酸化的障害の修
復、酸化的損傷に由来する突然変異の予防、変異型ｈＭ
ＹＨ遺伝子に関連する遺伝子疾患、例えば色素性乾皮症
および新形成の処置、および細胞の異常なトランスフォ
メーション、特に癌、最も具体的には例えばＨＮＰＣＣ
などの結腸癌の診断、および／または細胞の異常なトラ
ンスフォメーション、特に癌、最も具体的には例えばＨ
ＮＰＣＣなどの結腸癌への感受性の診断に利用する方法
に関する。

【００１２】本発明の他の態様は、本発明のポリペプチ
ドに対する抗体に関する。本発明の他の態様は、本発明
の核酸配列と特異的にハイブリダイズする十分な長さの
核酸分子からなる核酸プローブに関する。本発明の他の
態様は、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列内
の突然変異に関連する疾患を検出またはその疾患への感
受性を検出するための診断検定に関する。本発明はさら
に、配列番号２の配列を有するポリペプチドの活性レベ
ルの減少を患者由来のサンプルから測定することを特徴
とする癌の診断方法に関する。本発明はさらに、患者由
来のサンプルから、配列番号２の配列を有するポリペプ
チドをコードする遺伝子の発現レベルの減少を測定する
ことを特徴とする癌の診断方法に関する。

【００１３】本発明はさらに、配列番号９の配列を有す
るポリペプチドの活性レベルの減少を患者由来のサンプ
ルから測定することを特徴とする癌の診断方法に関す
る。本発明はさらに、配列番号９の配列を有するポリヌ
クレオチドをコードする遺伝子の発現レベルの減少を患
者由来のサンプルから測定することを特徴とする癌の診
断方法に関する。本発明はさらに、本発明のポリペプチ
ド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、
科学的研究、例えばＤＮＡ合成およびＤＮＡベクターの
製造に関連するインビトロの目的に利用する方法に関す
る。

【００１４】上記のおよび他の本発明の態様は本明細書
に記載している技術から当業者には明白である。添付の
図面は本発明の具体例を説明するものであり、特許請求
の範囲を限定するものでない。図１は、本発明のポリペ
プチドのｃＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列
の図である。ｈＭＹＨのヌクレオチド配列は、ＡＴＧ翻
訳開始部位のＡ（＋１）からの番号付けによって示して
いる。アミノ酸配列は１文字コードにより下方に示し、
欄外に番号も付している。図２は、本発明（上列）およ
び大腸菌ＭｕｔＹタンパク質（下列）のポリペプチドの
アミノ酸配列の比較である。

【００１５】本発明は、図１の推定アミノ酸配列（配列
番号２）を有する成熟ポリペプチドをコードする単離さ
れた核酸（ポリヌクレオチド）を提供する。本発明のポ
リヌクレオチドは脳および睾丸などのヒト体内の多くの
組織から入手することができる。本発明のポリヌクレオ
チドは、ヒト小脳から誘導されたｃＤＮＡライブラリー
から発見された。ｈＭＹＨ遺伝子は１５のイントロンを
含有し、７.１ｋｂの長さを有する。１６のエキソンは
５３５個のアミノ酸の核タンパク質をコードしており、
これは大腸菌ＭｕｔＹタンパク質と４１％の同一性を示
し、このことが酸化的に障害をうけたＤＮＡの修復に重
要な機能を与え、酸化的損傷から突然変異を防いでいる
のである。ｈＭＹＨ遺伝子は染色体１の短腕、ｐ３２．
１とｐ３４．３の間に位置している。ｈＭＹＨタンパク
質と大腸菌ＭｕｔＹタンパク質には広範囲に相同性があ
り、大腸菌タンパク質の始まり付近にある相同性では、
１４個の同一アミノ酸の一続きが特徴的である。

【００１６】本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡの形態
またはＤＮＡの形態をとることができ、ＤＮＡにはｃＤ
ＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡが包含される。Ｄ
ＮＡは二本鎖または一本鎖であってよく、一本鎖である
場合、コード鎖または非コード鎖（アンチセンス）のい
ずれでもよい。成熟ポリペプチドをコードするコード配
列は図１に示すコード配列（配列番号１）と同一であっ
てよく、または遺伝子コードの重複性または同義性の結
果として、図１のＤＮＡ（配列番号１）と同じ成熟ポリ
ペプチドをコードする異なるコード配列であってもよ
い。

【００１７】図１の成熟ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド（配列番号２）には成熟ポリペプチドのコ
ード配列のみ；成熟ポリペプチドおよび、リーダー配列
または分泌配列またはプロタンパク質配列などの付加的
なコード配列；成熟ポリペプチド（付加的なコード配列
が付加されていることがある）、およびイントロンまた
は成熟ポリペプチドのコード配列の５‘および／または
３’非コード配列などの非コード配列があるが、これら
に限定されない。

【００１８】このように、「ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド」なる用語は、ポリペプチドのコード
配列のみならず、付加的なコード配列および／または非
コード配列を包含するポリヌクレオチドを含むポリヌク
レオチドを意味する。

【００１９】本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列
を有するポリペプチド（配列番号２）の断片、同族体お
よび誘導体をコードする、上記のポリヌクレオチドの変
異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌク
レオチドの天然に存在するアレル変異体または天然に存
在しないポリヌクレオチドの変異体であってよい。

【００２０】このように、本発明は、図１に示す成熟ポ
リペプチドと同一のものをコードするポリヌクレオチド
（配列番号２）ならびに図１のポリペプチド（配列番号
２）の断片、誘導体または同族体をコードする、上記ポ
リヌクレオチドの変異体を包含する。このようなヌクレ
オチド変異体には欠失変異体、置換変異体および付加ま
たは挿入変異体が含まれる。特に本発明によって提供さ
れる特定の具体的な変異体には例えば、図１のヌクレオ
チド配列（配列番号１）の３６６位および／または７２
９位にシトシン（Ｃ）を有する単離された核酸がある。
特に本発明によって提供される他の具体的な変異体には
例えば、図１のヌクレオチド配列（配列番号１）の１０
９５位にシトシン（Ｃ）を有する単離された核酸があ
る。さらなる具体的な変異体には、図１のアミノ酸配列
（配列番号２）の３６５位にグルタミン（Ｑ）を有する
単離されたポリペプチド配列があるが、これに限定され
ない。

【００２１】上記のように、本発明のポリヌクレオチド
は、図１に示すコード配列の天然に存在するアレル変異
体であるコード配列を有することができる。当業者には
既知のように、アレル変異体は、コードされるポリペプ
チドの機能を実質的に変更しない１つまたはそれ以上の
ヌクレオチドを置換、欠失または付加するかもしれな
い、ポリヌクレオチド配列の別の形態である。

【００２２】本発明はさらに、成熟ポリペプチドのコー
ド配列が宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌
を助けるポリヌクレオチド配列、例えば細胞からのポリ
ペプチドの輸送を制御する分泌配列として機能するリー
ダー配列と同じ解読枠内で融合されていてもよいポリヌ
クレオチドを包含する。従って、本発明のポリヌクレオ
チドは例えば、成熟タンパク質、またはプロ配列を有す
るタンパク質もしくはプロ配列およびプレ配列（リーダ
ー配列）の両者を有するタンパク質をコードすることが
できる。

【００２３】本発明のポリヌクレオチドはさらに、本発
明のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列と解
読枠内で融合しているコード配列を含むことができる。
このマーカー配列としては、細菌宿主の場合にはそのマ
ーカーと融合した成熟ポリペプチドの精製を可能にする
ｐＱＥベクターによって供給されるヘキサ−ヒスチジン
・タグが挙げられ、または例えばＣＯＳ−７細胞などの
哺乳動物細胞を使用する場合は、ヘマグルチニン（Ｈ
Ａ）タグがマーカー配列として挙げられる。ＨＡタグは
インフルエンザ・ヘマグルチニンタンパク質由来のエピ
トープに対応する[Wilson,I.,ら、Cell, 37:767(198
4)]。

【００２４】「遺伝子」なる用語は、ポリペプチド鎖の
産生に関与するＤＮＡセグメントを意味し、コード領域
の前および後の領域（リーダーおよびトレーラー）なら
びに個々のコードセグメント（エキソン）間にある挿入
配列（イントロン）を包含する。

【００２５】本発明の完全長遺伝子の断片は、完全長ｃ
ＤＮＡを単離するための、およびこの遺伝子と高い配列
類似性または類似した生物活性を有する他のｃＤＮＡを
単離するための、ｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイ
ゼーション用プローブとして使用することができる。こ
の型のプローブは少なくとも１５塩基を有し、好ましく
は３０塩基、最も好ましくは５０またはそれ以上の塩基
を有する。プローブはまた、完全長転写物に相当するｃ
ＤＮＡクローンおよびゲノムクローン、または調節およ
びプロモーター領域、エキソンおよびイントロンを含む
完全遺伝子を含有するcＤＮＡクローンを同定するため
に使用することができる。スクリーニングの例として
は、既知のＤＮＡ配列を使用してオリゴヌクレオチドプ
ローブを合成し、遺伝子のコード領域を単離することが
挙げられる。本発明の遺伝子の配列と相補的な配列を有
する標識オリゴヌクレオチドを使用すれば、ヒトｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーがスク
リーニングされ、ライブラリーのどれがプローブとハイ
ブリダイズするか決定される。

【００２６】本発明はさらに、配列間に少なくとも７０
％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少な
くとも９５％の同一性を有する、上記の配列とハイブリ
ダイズするポリヌクレオチドに関する。具体的には、本
発明は上記のポリヌクレオチドと緊縮条件下でハイブリ
ダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書にて使
用する「緊縮条件」とは、少なくとも９５％、好ましく
は少なくとも９７％の配列間の同一性がある場合にのみ
ハイブリダイゼーションが起こる条件を意味する。上記
のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオ
チドは好ましい態様では、図１のｃＤＮＡによってコー
ドされる成熟ポリペプチド（配列番号１）と同じ生物学
的機能または活性のいずれかを実質的に保持しているポ
リペプチドをコードしている。

【００２７】あるいは、このようなポリヌクレオチド
は、本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズし、上
記のような同一性を有し、活性を保持できるまたはでき
ない、少なくとも１５塩基、好ましくは少なくとも３０
塩基、より好ましくは少なくとも５０塩基を有すること
ができる。例えば、このようなポリヌクレオチドは配列
番号１のポリヌクレオチドのプローブとして、例えばポ
リヌクレオチドの回収のために、または診断プローブと
して、またはＰＣＲプライマーとして使用することがで
きる。

【００２８】このように本発明は、配列番号２のポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも７０
％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、よ
り好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリヌ
クレオチドおよびその相補的ポリヌクレオチド、ならび
にその部分であって少なくとも１５個の連続した塩基、
好ましくは３０個の連続した塩基、最も好ましくは少な
くとも５０個の連続した塩基を有するもの、ならびにそ
のようなポリヌクレオチドによってコードされているポ
リペプチドに関する。

【００２９】本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列
を有するポリペプチド（配列番号２）、ならびにそのよ
うなポリペプチドの断片、同族体および誘導体に関す
る。

【００３０】図１のポリペプチド（配列番号２）を引用
して使用する「断片」、「誘導体」および「同族体」な
る用語は、このポリペプチドと同じ生物学的機能または
活性を本質的に保持しているポリペプチドを意味する。
従って、同族体には、プロタンパク質部分が切断されて
活性な成熟ポリペプチドとなる、活性化され得るプロタ
ンパク質が包含される。

【００３１】本発明のポリペプチドは組換えポリペプチ
ド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチド、好まし
くは組換えポリペプチドであることができる。図１（配
列番号２）のポリペプチドの断片、誘導体または同族体
としては、(1) １またはそれ以上のアミノ酸残基が保
存または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸
残基）と置換しているものであり、このような置換アミ
ノ酸残基は遺伝子コードによってコードされていても、
されていなくてもよい、または(2) １つまたはそれ以
上のアミノ酸残基が置換グループを包含するもの、また
は(3) 成熟ポリペプチドが他の化合物、例えばポリペ
プチドの半減期を増大させる化合物（例えばポリエチレ
ングリコール）と融合しているもの、または(4)リーダ
ーまたは分泌配列または成熟ポリペプチドもしくはプロ
タンパク質配列の精製に使用される配列などの付加的な
アミノ酸が成熟ポリペプチドと融合しているもの、が挙
げられる。このような断片、誘導体または同族体は、本
明細書の記載により、当業者の範疇になると考える。

【００３２】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは好ましくは単離された形態のものであり、好まし
くは均質になるまで精製されている。「単離されてい
る」なる用語は、物質がその元の環境（例えば、それが
天然に存在するものであれば、その天然環境）から取り
出されていることを意味する。例えば、天然に存在する
ポリヌクレオチドまたは生存動物に存在するポリペプチ
ドは単離されておらず、天然系に共に存在する物質のい
くつかまたはそのすべてと分離されているその同じポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されているもの
である。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部
であってよく、および／またはこのようなポリヌクレオ
チドまたはポリペプチドは組成物の一部であってよく、
このようなベクターまたは組成物がその天然環境の一部
でない場合は単離されていることになる。

【００３３】本発明のポリペプチドは、配列番号２のポ
リペプチド（具体的には成熟ポリペプチド）ならびに、
配列番号２のポリペプチドと少なくとも７０％の類似性
（好ましくは少なくとも７０％の同一性）、より好まし
くは配列番号２のポリペプチドと少なくとも９０％の類
似性（より好ましくは少なくとも９０％の同一性）、さ
らにより好ましくは配列番号２のポリペプチドと少なく
とも９５％の類似性（さらにより好ましくは少なくとも
９５％の同一性）を有するポリペプチドを包含し、さら
にこのようなポリペプチドの部分であって一般には少な
くとも３０アミノ酸、より好ましくは少なくとも５０ア
ミノ酸を含有するそのような部分を包含する。

【００３４】２つのポリペプチド間の「類似性」は当業
者に既知のように、第１のポリペプチドのアミノ酸配列
およびその保存アミノ酸置換物を第２のポリペプチドの
配列と比較することによって決定される。さらに、これ
も当業者には既知のように、２つのポリペプチドまたは
２つのポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度を意
味する「同一性」は、このような配列の２つの連続間の
適合の同一性によって決定される。同一性および類似性
はともに容易に計算することができる。２つのポリヌク
レオチドまたはポリペプチド配列間の同一性および類似
性を計算する方法は多数あり、「同一性」および「類似
性」なる用語は当業者に周知である[Carillo,H.,および
Lipman,D., SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)]。２
つの配列間の同一性または類似性を決定するのに普通に
使用される方法には、Guide to Huge Computers, Marti
n J.Bishop編、Academic Press,San Diego,1994、およ
びCarillo,H.,およびLipman,D., SIAM J.Applied Mat
h.,48:1073(1988)に記載されているものがあるが、これ
らに限定されない。同一性を決定する好ましい方法は、
試験する２つの配列が最も適合するように改変されてい
る。同一性および類似性を決定する方法はコンピュータ
ープログラムに組織立てられている。２つの配列間の同
一性および類似性を決定するための好ましいコンピュー
タープログラムの方法にはＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴ
Ｎ、ＦＡＳＴＡなどがあるが、これらに限定されない。

【００３５】本発明のポリペプチドの断片または部分は
ペプチド合成によって対応する完全長のポリペプチドを
製造するのに使用できる；従って、本発明の断片は完全
長ポリペプチドを製造するための中間体として使用でき
る。本発明のポリヌクレオチドの断片または部分は本発
明の完全長ポリヌクレオチドを製造するのに使用できる

【００３６】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
を含むベクター、本発明のベクターによって遺伝子的に
操作された宿主細胞および組換え手法による本発明のポ
リペプチドの製造に関する。

【００３７】宿主細胞は、例えばクローニングベクター
または発現ベクターであり得る本発明のベクターによっ
て遺伝子的に操作される（形質導入または形質転換また
はトランスフェクトされる）。ベクターは例えば、プラ
スミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得
る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、
形質転換体を選択でき、本発明の遺伝子を増幅できるよ
うに改変された通常の栄養培地で培養すればよい。温
度、ｐＨなどの培養条件は発現のために選択された宿主
細胞に既に使用されているものであり、当業者には明ら
かである。

【００３８】本発明のポリヌクレオチドは組換え手法に
よってポリペプチドを製造するために使用できる。従っ
て、例えばポリヌクレオチドはポリペプチドを発現する
種々の発現ベクターのいずれかに包含させることができ
る。このようなベクターには染色体、非染色体および合
成ＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミ
ド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス、酵母プラスミ
ド、プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせ物由
来のベクター、ウイルスＤＮＡ、例えばワクチン、アデ
ノウイルス、鶏痘ウイルスおよび仮性狂犬病ウイルスな
どがある。しかし、他のあらゆるベクターも、それが宿
主内で複製でき生存できる限り使用することができる。

【００３９】適当なＤＮＡ配列は種々の手法によってベ
クターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列
は当業者に既知の手法によって適当な制限エンドヌクレ
アーゼ部位（群）に挿入する。このような手法および他
のものは当業者の技術常識である。

【００４０】発現ベクター内のＤＮＡ配列は適当な発現
制御配列（群）（プロモーター）と作動可能に結合さ
せ、ｍＲＮＡ合成を指令する。このようなプロモーター
の代表として、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、大
腸菌ｌａｃまたはｔｒｐ、ファージλＰＬプロモーター
および原核生物または真核生物細胞またはそれらのウイ
ルス内で遺伝子の発現を制御することが知られている他
のプロモーターが挙げられる。発現ベクターはさらに、
翻訳開始のためのリボゾーム結合部位および転写ターミ
ネーターを含有する。ベクターはまた、発現を増幅する
ために適当な配列を含む。

【００４１】さらに、発現ベクターは、形質転換宿主細
胞を選択するための表現型特性、例えば真核細胞培養の
ためにはジヒドロ葉酸リダクターゼまたはネオマイシン
耐性または大腸菌ではテトラサイクリンまたはアンピシ
リン耐性を付与するための１つまたはそれ以上の選択マ
ーカー遺伝子、を含有するのが好ましい。

【００４２】上記の適当なＤＮＡ配列および適当なプロ
モーターまたは制御配列を含有するベクターは、適当な
宿主を形質転換するのに使用でき、それによりその宿主
にタンパク質を発現させることができる。

【００４３】適当な宿主の代表例は、大腸菌、ストレプ
トマイセス、サルモネラ・チフィムリウムなどの細菌細
胞；酵母などの真菌細胞；Drosophila S2およびSpodopt
eraSf9などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはBowesメ
ラノーマなどの動物細胞；アデノウイルス；植物細胞な
どである。適当な宿主の選択は本明細書に記載の手法か
ら当業者の技術常識と見做せる。

【００４４】より具体的には、本発明は先に詳述した１
つまたはそれ以上の配列を含有する組換え構築物を包含
する。本発明の構築物には、本発明の配列が正方向また
は逆方向に既に挿入されているプラスミドまたはウイル
スベクターなどのベクターが含まれる。好ましい態様で
は、本発明の構築物はさらに、例えばその配列に作動可
能に連結されたプロモーターなどの調節配列を含有す
る。多数の適当なベクターおよびプロモーターが当業者
に既知であり、市販されている。以下にベクターを例示
する；細菌：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９
（Qiagen）、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐ
ｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、
ｐＢＳＫＳ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８
Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＴＲＣ
９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ
５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；真核生
物：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸ
Ｔ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、
ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）。しかし、これら以外のプラスミドまたはベクター
も宿主内で複製でき生存できる限り、使用することがで
きる。

【００４５】プロモーター領域はＣＡＴ（クロラムフェ
ニコール・トランスフェラーゼ）ベクターまたは他の選
択マーカーを有するベクターを使用して所望の遺伝子か
ら選択することができる。適当な２つのベクターはｐＫ
Ｋ２３２−８およびｐＣＭ７である。具体的に細菌プロ
モーターの名称を挙げれば、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ
３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰＲ、ＰＬおよびｔｒｐが挙
げられる。真核生物プロモーターにはＣＭＶ即時型、Ｈ
ＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レト
ロウイルス由来のＬＴＰ、およびマウスメタロチオネイ
ン−Ｉなどがある。適当なベクターおよびプロモーター
の選択は当業者の技術常識の範囲内である。

【００４６】本発明はさらなる態様として、上記の構築
物を含有する宿主細胞を提供する。本発明の宿主細胞は
哺乳動物細胞などの高等真核生物細胞または酵母細胞な
どの下等真核生物細胞であってよく、または細菌細胞な
どの原核生物細胞であってもよい。上記の構築物を宿主
細胞に導入するには、リン酸カルシウムトランスフェク
ション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェク
ション、またはエレクトロポレーション[Davis,L., Dib
ner,M.,Battey,I., Basic Methods in Molecular Biolo
gy,(1986)]を用いることができる。

【００４７】宿主細胞内の構築物は常法により、組換え
配列によりコードされている遺伝子産物を製造するため
に使用できる。あるいは、本発明のポリペプチドは通常
のペプチド合成装置により合成的に製造できる。

【００４８】成熟タンパク質は哺乳動物細胞、酵母、細
菌または他の細胞において適当なプロモーターの制御下
に発現させることができる。本発明のＤＮＡ構築物から
誘導されるＲＮＡを使用すれば、無細胞翻訳系もこのよ
うなタンパク質を製造するために使用できる。原核生物
および真核生物宿主に使用される適当なクローニングお
よび発現ベクターはSambrook,ら、Molecular Cloning:
A Laboratory Manual,２版、コールド・スプリング・ハ
ーバー、N.Y.(１９８９)（これは引用によって本明細書
に包含される）に記載されている。

【００４９】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物における転写を増大させるにはエンハン
サー配列をベクター内に挿入させる。エンハンサーとは
通常、プロモーターに作用しその転写を増大させる約１
０から３００ｂｐＤＮＡのｃｉｓ作動要素である。例
示すれば、複製起点のｂｐ１００から２７０後側にある
ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロ
モーターエンハンサー、複製起点の後側にあるポリオー
マエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーな
どが挙げられる。

【００５０】一般に、組換え発現ベクターには複製起点
および宿主細胞の形質転換を許容する選択マーカー、例
えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子およびＳ．セレビ
シエＴＲＰ１遺伝子、および高度発現遺伝子から誘導さ
れる下流の構造配列を転写させるプロモーターが含まれ
る。このようなプロモーターは、３−ホスホグリセレー
トキナーゼ（ＰＧＫ）などの解糖系酵素、ａ−因子、酸
ホスファターゼまたは熱ショックタンパク質などをコー
ドするオペロンから誘導することができる。外来の構造
配列は、転写開始配列および終止配列、および好ましく
は翻訳されたタンパク質をペリプラズム空間または細胞
外培地中に分泌させることのできるリーダー配列と適当
な相となるように並べる。要すれば、外来配列は、例え
ば発現される組換え産物の安定化または単純化された精
製を可能とする所望の特性を与えるＮ末端同定ペプチド
を含む融合タンパク質をコードしていてもよい。

【００５１】細菌用に有用な発現ベクターは、所望のタ
ンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を適当な翻訳開始
および終止シグナルとともに機能的プロモーターの作動
可能な解読枠で挿入することによって構築される。ベク
ターには、１つまたはそれ以上の表現型選択マーカーお
よびベクターの維持を確実にし、かつ要すれば宿主内で
の増幅を可能にする複製起点が含有される。形質転換に
適した原核生物宿主には、大腸菌、バシラス・ズブチリ
ス、サルモネラ・チフィムリウムおよび、シュードモナ
ス、ストレプトマイセスおよびスタフィロコッカス属の
種々の種などがあるが、他のものも選択することができ
る。

【００５２】有用な細菌用の発現ベクターは、周知のク
ローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１
７）の遺伝子要素を含む、市販されているプラスミド由
来の選択マーカーおよび細菌複製起点を含有することが
できる。このような市販ベクターには例えば、ｐＫＫ２
２３−３（Pharmacia Fine Chemicals、ウプサラ、スウ
ェーデン）およびＧＥＭ１（Promega Biotec、マジソ
ン、ウィスコンシン州、米国）がある。これらのｐＢＲ
３２２「骨格」部分を、適当なプロモーターや発現させ
るべき構造配列と結合させる。

【００５３】適当な宿主株を形質転換し、その宿主株を
適当な細胞密度で発育させた後、選択したプロモーター
を適当な手段（例えば、温度変更または化学的誘導）に
よって誘導し、さらに細胞を培養する。細胞の収穫は遠
心によって通常行い、物理的または化学的手段によって
その細胞を破壊し、得られた粗製抽出物を保持してさら
に精製する。タンパク質の発現に使用する微生物細胞
は、凍結−解凍サイクル、超音波処理、機械的破壊また
は細胞溶解剤の使用などの常法によって破壊することが
でき、これらの方法は当業者に周知である。

【００５４】組換えタンパク質を発現するためには、種
々の哺乳動物細胞培養系も使用できる。哺乳動物発現系
としては、Gluzman, Cell, 23:175(1981)に記載されて
いるサル腎繊維芽細胞のＣＯＳ−７株および適合するベ
クターを発現できる他の細胞株、例えばＣ１２７、３Ｔ
３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞株が例示され
る。哺乳動物発現ベクターは複製起点、適当なプロモー
ターおよびエンハンサー、ならびに必須のリボソーム結
合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよび
アクセプター部位、転写終止配列および５’フランキン
グ非転写配列も含有する。ＳＶ４０スプライス由来のＤ
ＮＡ配列およびポリアデニル化部位は必要な非転写遺伝
子要素を提供するために使用できる。

【００５５】ポリペプチドは硫安もしくはエタノール沈
殿、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグ
ラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水
性相互クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーお
よびレクチンクロマトグラフィーなどの方法によって組
換え細胞培養から回収し、精製できる。成熟タンパク質
の立体配座をとらせるには要すれば、タンパク質再折り
畳み工程を使用すればよい。最後に、最終精製工程とし
て、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を利用す
ればよい。

【００５６】本発明のポリペプチドは天然から精製され
る産物または化学合成法の産物であってよく、または原
核生物もしくは真核生物（例えば、培養内細菌、酵母、
高等植物、昆虫および哺乳動物細胞）から組換え手法に
よって調製してもよい。組換え調製法に使用する宿主に
応じて、本発明のポリペプチドはグリコシル化される場
合があり、またはグリコシル化されない場合がある。本
発明のポリペプチドは開始メチオニンアミノ酸残基を包
含することもある。

【００５７】本発明のポリペプチドの断片、同族体およ
び誘導体はミスマッチ−ニッキング活性(mismatch-nick
ing activity)およびグリコシラーゼ活性を測定するた
めに検定することができる。このような検定の例として
は、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（pH７.６），５ｍＭＺｎ
Ｃｌ２、０.５ｍＭＤＴＴ、０.５ｍＭＥＤＴＡおよび
１.５％グリセリンを含有する反応混合物２０ｍｌ中、
５「末端標識１１６ｍｅｒ、３「末端標識１２０ｍｅｒま
たは３’末端標識２０ｍｅｒ二本鎖ＤＮＡ（ミスマッチ
を含有する）のいずれか１.８ｆｍｏｌとともにタンパ
ク質サンプルを、インキュベートする[Yeh,Y.−C.ら、1
991,J.Bio.Chem. 266:6480-6486]；[Roelen,H.C.P.F.,
ら，Nucleic Acids Res. 19:4361-4369を参照]。３７℃
にて２時間インキュベートした後、反応産物を凍結乾燥
し、９０％（vol/vol）ホルムアミド、１０ｍＭＥＤＴ
Ａ、０.１％（wt/vol）キシレン・シアノールおよび０.
１％（wt/vol）ブロモフェノールブルーを含有する溶液
中に溶解する。９０℃にて３分間加熱した後、ＤＮＡサ
ンプルを８％ポリアクリルアミド−８.３Ｍ尿素ＤＮＡ
配列決定用ゲル上で分析し[Maxam,A.M.およびW.Gilber
t,1980,Methods Enzymol.,65:499-560]、次いで得られ
たゲルをオートラジオグラフにかける。ＤＮＡグリコシ
ラーゼ活性は、酵素インキュベーションの後、ピペリジ
ンを終濃度１Ｍまで添加することによってモニターし
た。９０℃にて３０分間インキュベートした後、反応産
物を上記のようにして分析する。

【００５８】タンパク質−ＤＮＡ複合体を５０ｍＭトリ
ス−ホウ酸(pH８.３)および１ｍＭＥＤＴＡ中、４％ポ
リアクリルアミドゲル上にて分析する、酵素結合試験も
行うことができる。各反応混合物に２０ｎｇまたはポリ
（ｄＩ−ｄＣ）を加える以外は上記ニッキング検定のよ
うにしてタンパク質サンプルを３「末端標識２０ｂｐオ
リゴヌクレオチドとともにインキュベートする。結合検
定には指摘されているようにウシ血清アルブミン（１ｍ
ｇ）を加える。結合競合検定では、標識化２０ｍｅｒ基
質１.８ｆｍｏｌに加え、Ａ／Ｇ、Ａ／ＧＯまたはＣ・
Ｇ対合を含有する非標識１９ｍｅｒＤＮＡを１８０ｆｍ
ｏｌ以上過剰に加える。

【００５９】本発明は、図１（配列番号２）の配列を有
するポリペプチドの活性レベルの減少を患者由来のサン
プルから測定することを特徴とする、疾患、特に癌の診
断方法に関する。活性の減少は、当業者であれば容易に
測定でき、例えば図１（配列番号２）の配列からアミノ
酸変化の存在を決定し、次いで上記の酵素結合検定を使
用しまたは測定ミスマッチ−ニッキング活性およびグリ
コシラーゼ活性によって活性の減少は測定できる。本発
明はさらに、図１（配列番号２）の配列を有するポリペ
プチドの発現レベルの減少を患者由来のサンプルから測
定することを特徴とする、癌の診断方法に関する。タン
パク質発現の減少は、タンパク質の既知の特性に基づい
て上記の酵素結合検定を使用しまたは測定ミスマッチ−
ニッキング活性およびグリコシラーゼ活性によって測定
でき、これらの活性を非変異型ｈＭＹＨポリペプチドの
既知の特性と比較する。

【００６０】ｈＭＹＨポリペプチドはインビボにて発現
させることによって本発明に従って使用でき、これは
「遺伝子治療」と呼ばれることが多い。従って、例えば
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡま
たはＲＮＡ）を用いて患者由来の細胞をエクソビボにて
操作し、次いでその操作した細胞を本発明のポリペプチ
ドで処置すべき患者に投与すればよい。例えば、細胞
は、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有す
るレトロウイルスプラスミドベクターを使用することに
よって操作することができる。

【００６１】同様に、ポリペプチドのインビボ発現用に
細胞をインビボにおいて例えば当業者に既知の手法によ
って操作することができる。例えば、本発明のポリペプ
チドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラ
スミドベクターをパッキング細胞に導入すれば、パッキ
ング細胞は目的の遺伝子を含有する感染ウイルス粒子を
産生するようになる。これらの産生細胞はインビボ細胞
操作用におよびポリペプチドのインビボ発現用に患者に
投与すればよい。本発明のポリペプチドを投与するこれ
らの方法および他の方法は本発明の技術から当業者に明
白である。

【００６２】上記のレトロウイルスプラスミドベクター
を誘導できるレトロウイルスにはMolonyネズミ白血病ウ
イルス、脾壊死ウイルス、ギボン猿白血病ウイルス、ヒ
ト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫
ウイルス、および乳房腫瘍ウイルスがあるが、これらに
限定されない。１つの態様では、レトロウイルスプラス
ミドベクターはMolonyネズミ白血病ウイルスから誘導さ
れる。

【００６３】ベクターは１つまたはそれ以上のプロモー
ターを含有する。使用できる適当なプロモーターにはレ
トロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびMi
llerら、Biotechniques,Vol.７,No.9,980-990(1989)に
記載されているヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プ
ロモーターまたは他のプロモーター（例えば限定するも
のでないがヒストン、ポリＩＩＩおよびｂ−アクチンプ
ロモーターなどの真核生物細胞プロモーターなどの細胞
プロモーター）があるが、これらに限定されない。使用
できる他のウイルスプロモーターにはアデノウイルスプ
ロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターお
よびＢ１９パルボウイルスプロモーターなどがあるが、
これらに限定されない。適当なプロモーターの選択は、
本明細書の教示から当業者に明らかであろう。

【００６４】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は適当なプロモーターの制御下にある。使用できる適
当なプロモーターにはアデノウイルス主要後期プロモー
ターなどのアデノウイルスプロモーター、またはサイト
メガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどの外来プロ
モーター、呼吸性合胞体ウイルス（ＲＳＶ）プロモータ
ー；ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモータ
ーなどの誘導性プロモーター；熱ショックプロモータ
ー；アルブミンプロモーター；アポＡＩプロモーター；
ヒトグロビンプロモーター；単純ヘルペスチミジンキナ
ーゼプロモーターなどのウイルス性チミジンキナーゼプ
ロモーター；レトロウイルスＬＴＲ（上記の修飾レトロ
ウイルスＬＴＲなど）；ｂ−アクチンプロモーター；お
よびヒト成長ホルモンプロモーターなどがあるが、これ
らに限定されない。プロモーターはポリペプチドをコー
ドする遺伝子を制御する本来のプロモーターであっても
よい。

【００６５】レトロウイルスプラスミドベクターをパッ
キング細胞系に導入し、産生細胞系を作成する。トラン
スフェクトできるパッキング細胞を例示すれば、ＰＥ５
０１、ＰＡ３１７、ｙ−２、ｙ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１
９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ｖＣＲＥ、ｙＣ
ＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２および
Miller，Human Gene Therapy,Vol.１,5-14頁(1990)に記
載されているＤＡＮ細胞系（これらは引用によって本明
細書に包含される）があるが、これらに限定されない。
ベクターは当業者に既知の手段によってパッキング細胞
に導入することができる。このような手段にはエレクト
ロポレーション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ４
沈殿などがあるが、これらに限定されない。１つの別法
としては、レトロウイルスプラスミドベクターをリポソ
ーム内に包嚢し、または脂質と結合させ、次いで宿主に
投与することができる。

【００６６】産生細胞系は、ポリペプチドをコードする
核酸配列を包含する感染レトロウイルスベクター粒子を
生成させる。次いで、このレトロウイルスベクター粒子
を使用し、真核生物細胞にインビトロまたはインビボに
おいて導入する。導入し得る真核生物細胞には胚性幹細
胞、胎児性癌細胞、および造血幹細胞、肝細胞、繊維芽
細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞および気管
支上皮細胞などがあるが、これらに限定されない。ｈＭ
ＹＨ遺伝子を細胞内で発現させれば、ＤＮＡミスマッチ
の修復にそれは使用できるので、癌や腫瘍で起こるよう
な制御できない増殖および新生物形成から細胞を防止す
ることができる。

【００６７】本発明のｈＭＹＨ遺伝子および遺伝子産生
物は、ｈＭＹＨ遺伝子に欠陥を有する患者の処置に用い
ることができる。このような場合に処置できる障害のひ
とつは、癌、とりわけ結腸癌、例えばＨＮＰＣＣおよび
色素性乾皮症である。ｈＭＹＨはさらに、ＤＮＡの酸化
およびそれに対する酸化的障害の修復に用いることがで
き、またｈＭＹＨにより修復できるＤＮＡの酸化的損傷
およびその他の変化から変異を防ぐこともできる。当業
者ならば、本発明のＤＮＡ修復検定を用いることで、ｈ
ＭＹＨによってどのＤＮＡ欠陥および／または変化が修
復できるかを決定することができる。

【００６８】さらなる態様よれば、本発明は、癌、特に
結腸癌および最も具体的にはＨＮＰＣＣに対する感受性
を決定する方法を提供する。即ち、ｈＭＹＨにおける変
異は、癌に対する感受性を示し、上述の核酸配列はこの
ような感受性を確認する検定に用いることができる。従
って、例えば、本発明の検定は上述の様に、ヒトＤＮＡ
修復タンパクにおける変異、例えば欠失、トランケーシ
ョン、挿入、フレームシフト等を決定するのに使用で
き、このような変異が癌に対する感受性の指標となる。

【００６９】変異は例えばＤＮＡ配列決定検定により確
認できる。限定はしないが、血液サンプルなどのを含む
組織サンプルをヒト患者より入手する。サンプルを当業
者に周知の方法で加工してＲＮＡを得る。ｍＲＮＡ上に
あるポリアデノシン伸張にハイブリダイズするポリチミ
ジン残基から成るオリゴヌクレオチドプライマーを添加
することにより、最初のｃＤＮＡ鎖をＲＮＡサンプルか
ら合成する。逆転写酵素およびデオキシヌクレオチドを
加えて最初のｃＤＮＡ鎖を合成させる。プライマー配列
は本発明のＤＮＡ修復タンパクのＤＮＡ配列に基づいて
合成する。プライマー配列は一般的に少なくとも１５の
連続した塩基から成り、少なくとも３０または５０もの
連続した塩基を含有できる。

【００７０】本発明の遺伝子における変異を担持する個
体はまた、種々の方法によってＤＮＡレベルで検出する
ことができる。限定はしないが、血液、尿、唾液、組織
生検および剖検材料などの患者の細胞から、診断用の核
酸を入手できる。ゲノムＤＮＡは直接検出に使用でき、
あるいは分析に先立ち、ＰＣＲ（Sakiら、Nature，324:
163-166（1986））を用いて酵素的に増幅してもよい。
ＲＴ−ＰＣＲも変異の検出に使用できる。自動検出系、
例えばジーンスキャンをＲＴ−ＰＣＲと組み合わせて使
用するのが特に好ましい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもま
た、同一の目的で、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲを用いる
ことができる。例としては、ｈＭＹＨをコードする核酸
に相補的なＰＣＲプライマーは、変異の同定および分析
に使用することができる。代表的なプライマーの例を表
１に示す。例えば欠損および挿入は、正常な遺伝子型と
比較して増幅産物のサイズの変化により検出できる。点
変異は、増幅ＤＮＡを放射性標識化ＲＮＡと、あるいは
放射性標識化アンチセンスＤＮＡ配列とハイブリダイズ
することにより同定できる。完全にマッチする配列とミ
スマッチ二重らせんとは、ＲＮａｓｅＡ消化により、ま
たは融解温度の差により区別できる。

【００７１】

【表１】ｈＭＹＨ遺伝子における変異の検出に使用するプライマー配列番号１ 5'TCCTCTGAAGCTTGAGGAGCCTCTAGAACT3' １０２ 5'TAGCTCCATGGCTGCTTGGTTGAAA3' １１３ 5'GCCATCATGAGGAAGCCACGAGCAG3' １２４ 5'TAGCTCCATGGCTGCTTGGTTGAAA3' １３５ 5'TTGACCGGAAACTGCTGAATAG3' １４６ 5'CAGTGGAGATGTGAGACCGAAAGAA3' １５７ 5'CAGCCCGGCCAGGAGATTTCAACCA3' １６８ 5'CAGTGGAGATGTGAGACCGAAAGAA3' １７９ 5'CCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGG3' １８

【００７２】上記プライマーは、患者由来のサンプルか
ら単離される、ｈＭＹＨｃＤＮＡの増幅に使用するこ
とができる。本発明はまた、5'および／または3'末端か
ら1、2、３または４ヌクレオチドが除去された表１のプ
ライマーをも提供する。遺伝子をＤＮＡ配列の解明のた
めの種々の方法に供することができるような患者から単
離した遺伝子を増幅するために、このプライマーを使用
することができる。このようにして、ＤＮＡ配列におけ
る変異を診断することができる。

【００７３】参照遺伝子および変異を有する遺伝子の間
の配列の差異は、直接的なＤＮＡ配列決定法により示す
ことができる。さらに、クローンＤＮＡセグメントは、
特異的ＤＮＡセグメントを検出するためのプローブとし
て用いることができる。この方法の感度は、ＰＣＲと組
み合わせると非常に増強される。例えば配列決定プライ
マーは、二本鎖ＰＣＲ産生物、または改変ＰＣＲにより
生じた一本鎖鋳型分子と共に使用できる。配列決定は、
放射性ヌクレオチドを用いる通常の方法により、または
蛍光タグと共に自動配列決定法により実施できる。

【００７４】ＤＮＡの配列の差異に基づく遺伝的試験
は、変性因子を含有または不含のゲル中のＤＮＡ断片の
電気泳動移動度における変化を検出することにより達成
できる。小規模な配列の欠損および挿入は高分解能ゲル
電気泳動により可視化できる。異なるＤＮＡ断片の移動
度が、特異的な溶融または部分的な溶融温度に準じてゲ
ル中の異なった位置で遅延する、変性ホルムアミドグラ
ジエントゲルで、異なる配列のＤＮＡ断片を区別できる
（例えばMyersら、Science，230：1242（1985）参
照）。特定の位置における配列の変化はまた、ＲＮａｓ
ｅおよびＳ１保護などのヌクレアーゼ保護検定、または
化学的切断法（例えばCottonら、ＰＮＡＳ,ＵＳＡ85：4
397-4401（1985））により示すことができる。

【００７５】このように特定のＤＮＡ配列の検出および
／または配列レベルの定量は、ハイブリダイゼーショ
ン、ＲＮａｓｅ保護、化学的切断、制限酵素を用いた直
接的ＤＮＡ配列決定（例えば制限断片長多形性（Restri
ction Fragment Length Polymorphisms：ＲＦＬＰ））
およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティングにより達成
できる。本発明は患者由来のサンプルから、表１（配列
番号１）の配列を有するポリヌクレオチドの発現レベル
の低下を検出ことを含む、疾患とりわけ癌、および最も
具体的にはＨＮＰＣＣなどの結腸癌の診断方法を提供す
る。ポリヌクレオチドの発現の低下は、ポリヌクレオチ
ドの定量のための、当業者に周知の任意の方法、例えば
ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護、ノーザンブロ
ッティングおよびその他のハイブリダイゼーション法を
用いて測定することができる。

【００７６】より通常的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配
列決定に加え、正常部位分析によっても突然変異を検出
できる。正確な染色体位置を知るために、ｃＤＮＡクロ
ーンの分裂中期染色体スプレッドへの蛍光正常部位ハイ
ブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いることができ
る。

【００７７】実施方法を例示すると、ｈＭＹＨＤＮＡ
を消化し、ＱＬＡＥＸＩＩＤＮＡ精製キット（QIAGE
N,Inc.、チャッツウォース、カルフォルニア州）で精製
し、スーパーＣｏｓ１コスミドベクター（STRATAGENE、
ラジョーラ、カリフォルニア州）にライゲートした。Ｄ
ＮＡをキアゲンプラスミド精製キット（QIAGEN,Inc.、
チャッツウォース、カルフォルニア州）を用いて精製
し、BioNickラベリングキット（GibucoＢＲＬ、Life Te
chnologies,Inc.、ガイザースバーグ、メリーランド
州）を用いて、ビオチン−ｄＡＴＰの存在下、ニック翻
訳により、１ｍｇを標識した。ＧＥＮＥ−ＴＥＣＴ検出
系（CLONTECH Laboratories，Inc.、パロアルト、カリ
フォルニア州）で、ビオチニル化を検出した。正常位置
ハイブリダイゼーションはONCORライトハイブリダイゼ
ーションキット（ONCOR、ガイザースバーグ、メリーラ
ンド州）を用いてスライド上で実施し、分裂中期染色体
の単一の複製配列を検出した。正常な供与体の末梢血
を、２０％ＦＣＳ、３％ＰＨＡおよびペニシリン／スト
レプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０中3日間培
養し、１０-7Ｍメソトレキサートで17時間同調化（sync
hronize）し、ＲＰＭＩを補充せずに2回洗浄した。20分
のインキュベーションの後に、コルセミド（0.５ｍｇ／
ｍｌ）で、続いて７５ｍＭＫＣｌ中低張リジンで、３
７℃15分間、細胞を分裂中期で阻止した。細胞ペレット
を次いで放置（spin out）し、カルノー固定液（３：１
メタノール／酢酸）で固定した。

【００７８】分裂中期スプレッドは、スライド上に懸濁
液を滴下し、空気乾燥して調製した。ハイブリダイゼー
ション混合物（５０％ホルムアミド、２ｘＳＳＣ、１％
硫酸デキストラン）１０ｍｌに懸濁したプローブ１００
ｎｇを遮断ヒト胎盤ＤＮＡ１ｍｇ／ｍｌとともに添加す
ることにより、ハイブリダイゼーションを実施した。７
０℃湯浴中、１０分間、プローブ混合物を変性し、３７
℃で１時間インキュベートした後、予め加温（３７℃）
したスライドに載せ、予め７０％ホルムアルデヒド／２
ｘＳＳＣ中７０℃で変性し、エタノールシリーズで脱水
し、４℃に冷却した。

【００７９】スライドを加湿器中で３７℃で１６時間イ
ンキュベートした。スライドを５０％ホルムアルデヒド
／２ｘＳＳＣで４１℃で１０分間、および２ｘＳＳＣで
３７℃で７分間洗浄した。製造プロトコールに準じて、
スライドをＦＩＴＣ−アビデン（ONCOR、ガイザースバ
ーグ、メリーランド州）とともにインキュベートするこ
とにより、ハイブリダイゼーションプローブを検出し
た。マウント用溶媒に懸濁したプロプリジウムヨウ素
で、染色体を対比染色した。ライツオルトプラン２−エ
ピ蛍光顕微鏡を用いて可視化し、イマジェネティックス
コンピューターおよびマッキントッシュプリンターを用
いて、５個のコンピューター画像を得た。ｈＭＹＨは、
p３２.１およびp３４.３の間で、染色体１の短腕に位置
する。

【００８０】一度配列を正確な染色体位置に位置づける
と、染色体上の物理的な位置が、遺伝子マップデータに
相関する。このようなデータは、例えばＶ．McKusick、
Mendelian Inheritance in Man（コンピューターを介し
たライン上で公に入手可能）に見出される。次に、同一
の染色体領域に位置する遺伝子と疾患との関係を、連鎖
分析（物理的に近接した遺伝子の共有遺伝）により同定
する。

【００８１】ポリペプチド、それらの断片もしくはその
他の誘導体、またはそれらの類似体、またはそれらを発
現する細胞を免疫原として使用して、それらに抗する抗
体を産生できる。これらの抗体は、例えばポリクローナ
ルまたはモノクローナル抗体にできる。本発明はまたキ
メラ、一本鎖、およびヒト化抗体並びにＦａｂ断片、ま
たはＦａｂ発現ライブラリーの産生物をも包含する。こ
のような抗体および断片の産生には、当業者に周知の種
々の方法を用いることができる。

【００８２】本発明の配列に対応するポリペプチドに抗
して生じる抗体は、動物、好ましくはヒト以外の動物に
ポリペプチドを直接注射して、または動物にポリペプチ
ドを投与することにより得ることができる。このように
して得られた抗体を、次にポリペプチド自体に結合させ
る。この方法で、ポリペプチドの断片のみをコードする
配列さえも、無欠の天然のポリペプチドに結合する抗体
を産生するために使用することができる。このような抗
体は、次に、そのポリペプチドを発現する組織からポリ
ペプチドを単離するために使用できる。

【００８３】モノクローナル抗体を調製するために、連
続的なセルライン培養により産生した抗体を提供する任
意の方法を用いることができる。例を挙げると、ハイブ
リドーマ法（KohlerおよびMilstein、1975、Nature，25
6:495-497）、トリオーマ法、ヒトＢセルハイブリドー
マ法（Kozborら、1983、Immunology Today，4:72）、お
よびＥＢＶ−ハイブリドーマ法などがあり、ヒトモノク
ローナル抗体を産生できる（Coleら、1985、Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss,Inc.、
77-96頁）。

【００８４】本発明の免疫原性ポリペプチド産生物に抗
する一本鎖抗体を産生するために、一本鎖抗体の産生に
ついて記載された方法（米国特許第4946778号）を適合
させることができる。また、本発明の免疫原性ポリペプ
チド産生物に抗したヒト化抗体を発現させるために、ト
ランスジェニックマウスを用いることができる。

【００８５】以下の実施例を、更なる参照のために本発
明に記載する；しかしながら本発明をこれらの実施例に
限定するものではないことを理解されたい。全ての割合
または量は、具体的に示さない場合、重量で表す。以下
の実施例を容易く理解できるように、特定の高頻度で用
いる方法および／または用語を記載する。

【００８６】「プラスミド」は、小文字のｐが先行し、
および／または続いて大文字および／または数字で表
す。本明細書の開始プラスミドは、市販されているか、
もしくは非制限的に公に入手可能であるか、または確立
された方法に準じて入手可能なプラスミドから構築でき
る。さらに、これらの記載されたものに等価なプラスミ
ドは、当業者に周知であり、技術者に明らかである。

【００８７】ＤＮＡの「消化」とは、ＤＮＡの特定の配
列でのみ作用する制限酵素を用いた、ＤＮＡの触媒切断
を意味する。本明細書で使用する種々の制限酵素は市販
されており、反応条件、コファクターおよびその他の必
要条件は、通常の熟練した技術者に周知の様に用いた。
分析の目的では、典型的なものでは１ｍｇのプラスミド
またはＤＮＡ断片を、約２０ｍｌの緩衝液中約２単位の
酵素と共に使用する。プラスミド構築のためのＤＮＡ断
片の単離の目的では、典型的なものでは、５〜５０ｍｇ
のＤＮＡを大容量の２０〜２５０単位の酵素で消化す
る。特定の制限酵素に適当な緩衝液および基質の量は、
製造者により規定されている。３７℃で１時間のインキ
ュベーション時間が通常用いられるが、提供者の指示に
従って変更できる。消化後、反応物をポリアクリルアミ
ドゲルで直接的に電気泳動し、望ましい断片を単離す
る。

【００８８】切断した断片のサイズによる選別は、Goed
el，Ｄ．ら、Nucleic Acids Res，8:4057（1980）に記
載される８％ポリアクリルアミドゲルを用いて実施す
る。［オリゴヌクレオチド］は、化学的に合成できる一
本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは2本の相補的ポリ
デオキシヌクレオチド鎖を意味する。このような合成オ
リゴヌクレオチドは５’リン酸塩を持たないので、従っ
て、キナーゼの存在下、ＡＴＰを有するリン酸塩を添加
しないとその他のオリゴヌクレオチドにライゲートしな
い。合成オリゴヌクレオチドは脱リン酸化していない断
片にライゲートする。

【００８９】「ライゲーション」は二本鎖核酸断片の間
のホスホジエステル結合を形成する工程を意味する（Ma
niatis，Ｔ．ら、前掲146頁）。その他に提示しない場
合、ライゲーションは既知の緩衝液およびライゲートす
るＤＮＡ断片のおよそ等モル濃度量の0.５ｍｇあたりの
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）１０単位の条件
を用いて達成できる。その他に記載しない場合、形質転
換は、Graham，Ｆ．およびVan der Eb，Ａ．、Virolog
y，52:456-457（1973）に記載するように実施した。

【００９０】

【実施例】実施例１ｈＭＹＨの細菌発現および精製ｈＭＹＨをコードするＤＮＡ配列を、最初、プロセッシ
ングしたｈＭＹＨタンパクの５'配列（シグナルペプチ
ド配列を欠損している）およびｈＭＹＨ遺伝子に対する
ベクター配列３'に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチド
プライマーを用いて増幅する。ｈＭＹＨに対応する更な
るヌクレオチドを、各々、５'および３'に加えた。５'
オリゴヌクレオチドプライマーは、５'CGCGGATCCGCCATC
ATGACACCGCTCGTCTCC３'(配列番号３)を有し、BamHI制限
酵素部位、続いてプロセッシングしたタンパクコドンの
推定される末端アミノ酸から出発する、ｈＭＹＨコード
化配列の１８ヌクレオチドを含有する。３'配列５'GCGT
CTAGATCACTGGGCTGCACTGTTG３'（配列番号４）はＸbaＩ
部位に対して相補的な配列を含有し、ｈＭＹＨの１９ヌ
クレオチドが続く。制限酵素部位は、細菌発現ベクター
ｐＱＥ−９（Qiagen,Inc.、9259イートンアベニュー、
チャッツウォース、カリフォルニア州、91311）の制限
酵素部位に対応する。ｐＱＥ−９は抗生物質耐性（Am
p'）、複製の細菌源（ori）、ＩＰＴＧ制御可能なプロ
モーターオペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位
（ＲＢＳ）、６−Ｈis標識および制限酵素部位をコード
する。次にｐＱＥ−９をＢamＨＩおよびＸbaＩで消化す
る。増幅した配列をｐＱＥ−９にライゲートし、ヒスチ
ジン標識およびＲＢＳをコードする配列でフレームに挿
入した。次いでライゲートした混合物を用いて大腸菌Ｍ
１５／ｒｅｐ４株（Qiagen,Inc.）をSambrook,Ｊら、Mo
lecular Cloning：A Laboratory Manual、コールドスプ
リングラボラトリープレス（1989）に記載する方法に
より形質転換する。Ｍ１５／ｒｅｐ４は、プラスミドｐ
ＲＥＰ４の多重複製物を含有し、lacIリプレッサーを発
現し、カナマイシン耐性（Kan'）をも付与する。形質転
換体はＬＢプレート上の成長能力により同定し、アンピ
シリン／カナマイシン耐性コロニーを選別した。プラス
ミドＤＮＡを単離し、制限分析により確認した。望まし
い構築物を含有するコロニーを一晩（Ｏ／Ｎ）、Ａmp
（100ug/ml）およびＫan（25ug/ml）の両方を補充した
ＬＢ培地中液体培養して成長させる。Ｏ／Ｎ培養物は、
１：１００から１：２５０の比率で大きな培養に接種す
るために用いる。細胞は光学密度６００（O.D.600）の
０.４から０.６の間になるように、成長させる。次に、
ＩＰＴＧ（“イソプロピル-B-D-チオガラクトピラノシ
ド”）を最終濃度１mＭで加える。ＩＰＴＧはｌacＩレ
プレッサーの不活化、遺伝子発現を増強するＰ／Ｏ先導
の除去により誘起される。細胞をさらに３から４時間成
長させる。次いで細胞を遠心により収穫する。細胞ペレ
ットをカオトロピック剤（chaotropic agent）６Ｍグア
ニジンHClに溶解する。清澄化の後、溶解したｈＭＹＨ
を、６−Ｈis（ヒスチジン）標識（Hochuli,E.ら、J.Ch
romatography 411:177〜184（1984））を含有するタン
パクにより固く結合させた状態で、ニッケルキレートカ
ラムのクロマトグラフィーで、この溶液から精製する。
ｈＭＹＨは６ＭグアニジンＨＣl、pＨ５.０でカラムか
ら溶出し、復元するために、３ＭグアニジンＨＣl、１
００mＭリン酸ナトリウム、１０mＭグルタチオン（還元
体）および２mＭグルタチオン（酸化体）に調製する。
この溶液を12時間インキュベーションした後、タンパク
質を10mMリン酸ナトリウムで透析した。

【００９１】実施例２バキュロウイルス発現系を用いたｈＭＹＨのクローニン
グおよび発現ｈＭＹＨタンパク質の全長をコードするＤＮＡ配列を、
遺伝子の５'および３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌク
レオチドプライマーを用いて増幅した：５'プライマー
は５'CGCGGATCCCGCAATCATGACACCGCTCGTCTCC３'（配列番
号５）の配列を有し、ＢamＨＩ制限酵素部位（太字）、
続いて、ｈＭＹＨ遺伝子の最初の６ヌクレオチドのすぐ
後にある、真核細胞における翻訳の開始に有効なシグナ
ル（Kozak,Ｍ.、J.Mol.Biol.、196：947〜950（198
7））に類似した、１８ヌクレオチドを含有する。３'プ
ライマーは配列５'GCGTCTAGATCACTGGGCTGCACTGTTG３'
（配列番号６）を有し、制限エンドヌクレアーゼＸbaＩ
の切断部位、および安定したハイブリッドに十分なｈＭ
ＹＨ遺伝子の３'非翻訳配列に相補的な多くのヌクレオ
チドを含有する。増幅した配列は、市販により入手可能
なキット（「Geneclean」、BIO 101,Inc.、ラジョー
ラ、カリフォルニア州）を用いて、1%寒天ゲルから単離
した。次に断片を、エンドヌクレアーゼＢamＨＩおよび
ＸbaＩで消化し、次いで再び１％寒天ゲルで精製した。
この断片をＦ２と称する。

【００９２】ベクターＰＡ２（後記するpVL941ベクター
の修飾体）を、バキュロウイルス発現系を用いてｈＭＹ
Ｈタンパクの発現に使用する（Summers,M.D.およびSmit
h,G.E. 1987、A manual of methods for baculovirus v
ectors and insect cell culture procedures、Texas A
gricultural Experimental Station Bulletin No.1555
を参照のこと）。この発現ベクターは、オートグラファ
・カリフォルニカ・ニュークレア・ポリヘドロシス・ウ
イルス（AcMNPV）の強力なポリヘドリンプロモーター、
続いて制限エンドヌクレアーゼＢamＨＩおよびＸbaＩの
認識部位を含有する。サルのウイルスＳＶ４０のポリア
デニル化部位を、効果的なポリアデニル化のために使用
する。組換えウイルスの選別を容易にするために、大腸
菌のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子をポリヘドリン遺伝子
のポリアデニル化シグナルに続くポリヘドリンプロモー
ターと同一の配向に挿入する。同時形質転換した野生型
ウイルスＤＮＡの細胞媒介による均質な組換えのため
に、ポリヘドリン配列は、ウイルス配列により両側でフ
ランキングされる。多くのその他のバキュロウイルスベ
クターは、pＡ２、例えばpＡc３７３、pＶＬ９４１、p
ＲＧ１およびpＡcＩＭ１の代わりに用いることができる
（Luckow,V.A.およびSummers,M.D.、Virology，170:31
〜39）。

【００９３】プラスミドを、制限酵素ＢamＨＩおよびＸ
baＩで消化し、次いで仔牛腸管フォスファターゼを用い
て、当業者に周知の方法により、脱リン酸化する。次に
ＤＮＡを、市販のキット（「Geneclean」BIO101,Inc.、
ラジョーラ、カリフォルニア州）を用いて、１％寒天
ゲルで単離する。このベクターＤＮＡをＶ２と称する。
断片Ｆ２および脱リン酸化プラスミドＶ２を、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼでライゲートした。次に大腸菌ＨＢ１０１
細胞を形質転換し、ｈＭＹＨ遺伝子を有するプラスミド
（pBacｈＭＹＨ）を含有する細菌を、酵素ＢamＨＩおよ
びＸbaＩを用いて同定する。クローン断片をＤＮＡ配列
決定により確認する。５ｍｇのプラスミドpＢacｈＭＹ
Ｈを、市販の直線化バキュロウイルス（「BaculoGoldヤ
バキュロウイルスＤＮＡ」Pharmingen、サンディエ
ゴ、カリフォルニア州）１.0mgで、リポフェクション法
（Felgnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84:7413〜741
7、1987）を用いて同時形質転換する。５０ｍｌの血清
不含グレース培地（Life Technologies，Inc.、ガイザ
ースバーグ、メリーランド州）を含有するマイクロプレ
ートの無菌ウェル中、１ｍｇのBaculoGoldＯウイルスＤ
ＮＡおよび５ｍｇのプラスミドpＢacｈＭＹＨを混合す
る。その後、１０ｍｌリポフェクチン＋９０ｍｌグレー
ス培地を加え、混合し、室温で１５分間インキュベート
する。次に形質転換混合物を、１ｍｌの血清不含グレー
ス培地の入った３５ｍｍ培養プレートに播種したＳｆ９
昆虫細胞（ATCCCRL1711）に滴加する。プレートを前後
に振動させ、新しく加えた溶液を混合させる。次にプレ
ートを２７℃で５時間インキュベートする。５時間後形
質転換溶液をプレートから除去し、１０％ウシ胎仔血清
を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を加える。プレー
トをインキュベーターに戻し、２７℃で４日間培養を続
ける。

【００９４】４日後、上澄を回収し、SummersおよびSmi
th（上述）により記載されているのと同様にプラーク検
定を実施する。寒天ゲルを「Blue Gal」（Life Technol
ogies，Inc.、ガイザースバーグ）に変更して使用した
が、これは青色染色したプラークの単離を容易にする。
（“プラーク検定”の詳細は、Life Technologies，In
c.により配布された、昆虫細胞培養およびバキュロウイ
ルス学のユーザーズガイドで見ることができる。）連続希釈後４日目に、細胞にウイルスを加え、青色染色
プラークをエッペンドルフピペットのチップで採る。組
換えウイルスを含有する寒天を、次いで２００ｍｌグレ
ース培地を含有するエッペンドルフ管に再懸濁する。短
時間の遠心により、寒天を除去し、組換えバキュロウイ
ルスを含有する上澄を、３５ｍｍ皿に播種したＳｆ９細
胞に感染させるのに使用する。４日後、これらの培養皿
の上澄を収穫し、４℃で保存する。Ｓｆ９細胞は、１０
％の加熱し不活化したＦＢＳを補充したグレース培地中
成長させる。２の多重感染（ＭＯＩ）により、細胞を、
組換えバキュロウイルスＶ−ｈＭＹＨで感染させる。６
時間後、培地を除去し、メチオニンとシステインを除い
たＳＦ９００II培地（Life Technologies，Inc.、ガイ
ザースバーグ）と置き換える。４２時間後、５mＣiの³⁵
Ｓ-メチオニンおよび５mＣiの³⁵Ｓ-システイン（Amersh
am）を加える。細胞をさらに１６時間インキュベート
し、遠心により収穫し、標識部分をＳＤＳ−ＰＡＧＥお
よびオートラジオグラフィーにより可視化する。

【００９５】実施例３ＣＯＳ細胞における組換えｈＭＹＨの発現プラスミドｈＭＹＨ HAの発現は、１）ＳＶ４０複製起
点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）大腸菌複製起
点、４）ポリリンカー部域、ＳＶイントロンおよびポリ
アデニル化部位に続く、ＣＭＶプロモーターを含有す
る、ベクターpcＤＮＡＩ／Ａmp（Invitrogen）から誘導
する。全ｈＭＹＨ前駆体および３'末端にフレーム内に
融合したＨＡタグをコードするＤＮＡ断片を、ベクター
のポリリンカー部域にクローン化し、従って、組換えタ
ンパク発現はCNVプロモーターの支配下になる。ＨＡタ
グは、前述の、インフルエンザヘマググルチニンタンパ
クに由来するエピトープに対応する（I.Wilson、H.Nima
n、R.Heighten、A.Cherenson、M.ConnollyおよびR.Lern
er、1984、Cell 37:767（1984））。ＨＡタグの標的タ
ンパクへの注入により、ＨＡエピトープを認識する抗体
を有する組換えタンパクの検出が容易になる。

【００９６】プラスミド構築方法は、以下に記載する：
ｈＭＹＨをコードするＤＮＡを、２個のプライマーを用
いたＰＣＲにより構築する：ＢamＨＩ部位、続いて開始
コドンから出発するｈＭＹＨコード化配列の１８ヌクレ
オチドを含む、５'プライマー５'-CGCGGATCCGCCATCATGA
CACCGCTCGTCTCC-３'（配列番号７）；３'配列５'-GCGCT
CGAGCTGGGCTGCACTGTTGAGG（配列番号８）は、ＸhoＩ部
位、翻訳停止コドンＨＡタグおよびｈＭＹＨコード化配
列の最後の１９ヌクレオチド（停止コドンは含まない）
に対する相補的配列を含有する。従って、ＰＣＲ産生物
はＢamＨＩ部位、ｈＭＹＨコード化配列およびＸhoＩ部
位を含有する。ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片およびベクター、
pcＤＮＡＩ／Ａmp（３'末端にＨＡタグを含む）をＢam
ＨＩおよびＸhoＩ制限酵素で消化し、ライゲートする。
ライゲーション混合物は、大腸菌ＳＵＲＥ株（Stratage
ne Cloning System、ラジョーラより入手可能）に形質
転換し、形質転換した培養物をアンピシリン培地プレー
トに載せ、耐性コロニーを選別する。プラスミドＤＮＡ
を形質転換物から単離し、適切な断片の存在下制限分析
により試験する。組換えｈＭＹＨを発現させるために、
ＣＯＳ細胞を、ＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ法（J.Sambro
ok、E.Fritsch、T.Maniatis、Molecular Cloning：A La
boratory Manual、コールドスプリングラボラトリープ
レス（1989））により、発現ベクターで形質転換する。
ｈＭＹＨ HAタンパクの発現は、放射性標識化、および
免疫沈降法（E.Harlow、D.Lane、Antibodies：ＡLabora
tory Manual、コールドスプリングハ−バーラボラトリ
ープレス（1988））により検出する。形質転換の２日
後、³⁵Ｓ-システインで細胞を８時間標識する。次に培
養培地を回収し、細胞をデタージェント（RIPA緩衝液
（１５０mＭＮaＣl、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４
０、０.５％ＤＯＣ、５０ｍＭトリス、pＨ７.５）（Wi
lsonI.ら、前掲37：767（1984）））で細胞溶解させ
る。両方の細胞のリゼートおよび培養培地を、HA特異性
モノクローナル抗体で沈殿させる。沈殿したタンパク
は、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析する。

【００９７】実施例４遺伝子療法による発現皮膚生検により対象から繊維芽細胞を得る。得られた組
織を組織培養培地に載せ、小片に分ける。組織の小片を
組織培養フラスコの湿った表面に載せ、約１０片を各フ
ラスコに載せる。フラスコをひっくり返して、固く閉
じ、室温で一晩放置する。室温で２４時間後、フラスコ
を逆さにし、組織片をフラスコの底に固着したままに
し、新鮮な培地（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリンお
よびストレプトマイシン含有ＨamのＦ１２培地）を加え
る。次にこれを３７℃で約１週間インキュベートする。
この時、新鮮な培地を加え、引き続いて数日毎に変え
る。さらに２週間後、繊維芽細胞の単一層が現れる。単
一層はトリプシン処理し、大きなフラスコに剥ぎ取る。

【００９８】モロニーネズミサルコーマウイルスの長い
末端の繰り返しによりフランキングされている、pMV-7
（Kirschmeier,P.T.ら、ＤＮＡ、7:219〜25（1988））
を、EcoRIおよびHindIIIにより消化し、続いて仔牛腸管
フォスファターゼで処理する。ガラスビーズを用いて、
直線ベクターを寒天ゲルで分画化し、精製する。本発明
のポリペプチドをコードするcＤＮＡを、各々５'および
３'末端に対応するＰＣＲプライマーを用いて増幅す
る。５'プライマーはEcoRI部位を含有し、３'プライマ
ーはＨindIII部位を含む。Ｔ4 ＤＮＡリガーゼの存在
下、モロニーネズミサルコーマウイルスの直線の骨格お
よび、増幅したＥcoＲＩおよびＨindIII断片を一緒に加
える。得られた混合物を２個の断片のライゲーションに
適した条件下で保持する。ライゲーション混合物を用い
て、細菌ＨＢ１０１を形質転換し、次にカナマイシン含
有寒天に載せ、ベクターが適切に挿入された目的の遺伝
子を有することを確認する。

【００９９】アンフォトロピックpＡ３１７またはＧＰ
＋am１２は１０％仔牛血清（ＣＳ）、ペニシリンおよび
ストレプトマイシン含有デュルベッコ改変イーグル培地
（ＤＭＥＭ）中、コンフルエントな密度になるまで、組
織培養中成長させる。その遺伝子を含有するＭＳＶベク
ターを、次いで培地に添加し、パッキング細胞をベクタ
ーに形質導入する。今度はパッキング細胞が、その遺伝
子を含有する感染性ウイルス粒子を産生する（ここでは
パッキング細胞を、産生細胞と称する。）新鮮な培地
を、産生細胞に添加し、続いて融合産生細胞の１０ｃｍ
プレートから培地を収穫する。感染性ウイルス粒子を含
有する、消費した培地を、マイクロポアフィルターを通
してろ過し、剥離した産生細胞を除去し、次いでこの培
地を用いて繊維芽細胞を感染させる。繊維芽細胞のサブ
コンフルエント平板（sub-confluent plate）から培地
を除去し、産生細胞からの培地と速やかに入れ替える。
この培地を除去し、新鮮な培地と入れ替える。ウイルス
の力価が高ければ、実質的に全ての繊維芽細胞が感染し
ており、選別は不要である。力価が低ければ、次いで選
別可能なマーカー、例えばneoまたはhisを有するレトロ
ウイルスベクターを使用する必要がある。次に、遺伝子
操作した繊維芽細胞を、宿主に単独でまたはサイトデッ
クス３マイクロキャリヤービーズにゆうごうさせて成長
させた後、注入する。繊維芽細胞は、今度はタンパク産
生物を産生する。上記の記載に鑑みて、本発明の多数の
改変および変更が可能であり、従って、添付の特許請求
の範囲の範疇で、個別に記載する以外にも、本発明を実
施することができる。

【０１００】

【配列表】

（１）一般的情報（i）出願人：ヒューマン・ジェノム・サイエンシズ・
インコーポレイテッド（ii）発明の名称：ヒトＭｕｔＹ（iii）配列の数：１８（iv）連絡用住所：（Ａ）受取人：スミスクライン・ビーチャム・コーポレ
イション（Ｂ）通り名：スウェードランド・ロード７０９番（Ｃ）都市名：キング・オブ・プルシア（Ｄ）州名：ペンシルベニア州（Ｅ）国名：ＵＳＡ（Ｆ）ジップ番号：１９４０６（v）コンピューター読み取り可能な形態：（Ａ）媒体型：３.５インチ・ディスケット（Ｂ）コンピューター：Ｃompaq ＬＴＥＬite ４／３
３Ｃ（Ｃ）操作システム：ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：ＭＳＷＯＲＤ（vi）現出願のデータ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：（Ｃ）分類番号：（vii）先の出願のデータ（Ａ）出願番号：ＡＴＧ５０００２Ｐ（Ｂ）出願日：１９９６年３月１１日（viii）代理人等の情報：（Ａ）名前：ウィリアム・ティ，ハン（Ｂ）登録番号：３４３４４（Ｃ）処理番号：ＡＴＧ５０００２（ix）電気通信情報：（Ａ）電話番号：６１０−２７０−５２１９（Ｂ）テレファックス番号：６１０−２７０−４０２６

【０１０１】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１に関する情
報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１８１１塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ｃＤＮＡ（xi）配列記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：１：

【化１】

【化２】

【化３】

【化４】

【０１０２】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：２に関する情
報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：５３５アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：蛋白質（xi）配列記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：２：

【化５】

【化６】

【化７】

【０１０３】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：３に関する情
報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：３４塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：オリゴヌクレオチド（xi）配列記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：３： CGCGGATCCG CCATCATTGA CACCGCTCGT CTCC 34

【０１０４】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：４に関する情
報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２８塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：オリゴヌクレオチド（xi）配列記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：４： GCGTCTAGAT CACTGGGCTG CACTGTTG 28

【０１０５】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：５に関する情
報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：３４塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：オリゴヌクレオチド（xi）配列記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：５： CGCGGATCCC GCAATCATGA CACCGCTCGT CTCC 34

【０１０６】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：６に関する情
報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２８塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：オリゴヌクレオチド（xi）配列記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：６： GCGTCTAGAT CACTGGGCTG CACTGTTG 28

【０１０７】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：７に関する情
報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：オリゴヌクレオチド（xi）配列記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：７：

【０１０８】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：８に関する情
報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：オリゴヌクレオチド（xi）配列記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：８：

【０１０９】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：９に関する情
報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：３５５アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：蛋白質（xi）配列記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：９：

【化８】

【化９】

【０１１０】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１０に関する
情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：３０塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：オリゴヌクレオチド（xi）配列記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：１０： TCCTCTGAAG CTTGAGGAGC CTCTAGAACT 30

【０１１１】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１１に関する
情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２５塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：オリゴヌクレオチド（xi）配列記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：１１： TAGCTCCATG GCTGCTTGGT TGAAA 25

【０１１２】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１２に関する
情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２５塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：オリゴヌクレオチド（xi）配列記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：１２： GCCATCATGA GGAAGCCACG AGCAG 25

【０１１３】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１３に関する
情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２５塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：オリゴヌクレオチド（xi）配列記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：１３： TAGCTCCATG GCTGCTTGGT TGAAA 25

【０１１４】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１４に関する
情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２２塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：オリゴヌクレオチド（xi）配列記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：１４： TTGACCCGAA ACTGCTGAAT AG 22

【０１１５】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１５に関する
情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２５塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：オリゴヌクレオチド（xi）配列記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：１５： CAGTGGAGAT GTGAGACCGA AAGAA 25

【０１１６】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１６に関する
情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２５塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：オリゴヌクレオチド（xi）配列記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：１６： CAGCCCGGCC AGGAGATTTC AACCA 25

【０１１７】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１７に関する
情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２５塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：オリゴヌクレオチド（xi）配列記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：１７： CAGTGGAGAT GTGAGACCGA AAGAA 25

【０１１８】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１８に関する
情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２６塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：オリゴヌクレオチド（xi）配列記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：１８： CCCTCACTAA AGGGAACAAA AGCTGG 26

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｋ 16/30 Ｃ０７Ｋ 16/30 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 21/08 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）配列番号２に示すアミノ酸１から
アミノ酸５３５を含むポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド；（ｂ）（ｂ）のポリペプチドに相補的なポ
リヌクレオチド；および（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポ
リヌクレオチドの少なくとも３０の連続した塩基を含む
ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレ
オチドと、少なくとも７０％の同一性を有するポリヌク
レオチドを有してなる単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】ＤＮＡである請求項１記載のポリヌクレ
オチド。
【請求項３】ＲＮＡである請求項１記載のポリヌクレ
オチド。
【請求項４】ゲノムＤＮＡである請求項１記載のポリ
ヌクレオチド。
【請求項５】配列番号２のアミノ酸１から５３５を含
むポリペプチドをコードする、請求項２記載のポリヌク
レオチド。
【請求項６】配列番号１のヌクレオチド１からヌクレ
オチド１８１１に示す配列を含む、請求項２記載のポリ
ヌクレオチド。
【請求項７】配列番号１のヌクレオチド１７２からヌ
クレオチド１７２９に示す配列を含む、請求項２記載の
ポリヌクレオチド。
【請求項８】（ａ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補
的なポリヌクレオチド；および（ｂ）（ａ）のポリヌク
レオチドの少なくとも３０の連続した塩基を含むポリヌ
クレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチド
と少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド
を有してなる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】上記ポリヌクレオチドがｈＭＹＨを発現
するポリヌクレオチドである、請求項８記載の単離され
たポリヌクレオチド。
【請求項１０】（ａ）（ｉ）配列番号１のヌクレオチド
１からヌクレオチド１８１１からなる群から選択される
少なくとも１５の連続した塩基を含むＤＮＡ；（ii）
（ｉ）に相補的なＤＮＡ、からなる群から選択したもの
に少なくとも７０％相補的である、少なくとも１５の連
続した塩基を有するＤＮＡ；および（ｂ）（ａ）のＤＮ
Ａに対応するＲＮＡ、からなる群から選択したものを有
してなる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】請求項２に記載のＤＮＡを含むベクタ
ー。
【請求項１２】請求項１１に記載のベクターによって
遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項１３】ベクターに含まれるＤＮＡによりコー
ドされるポリペプチドを宿主細胞から発現させることか
らなる、請求項１２記載の宿主細胞の使用方法。
【請求項１４】細胞がベクターに含まれるＤＮＡによ
ってコードされるポリペプチドを発現するように、該細
胞を請求項１１に記載のベクターで遺伝子操作すること
からなる、細胞の使用方法。
【請求項１５】（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を
有するポリペプチド；および（ｂ）（ａ）のポリペプチ
ドと少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドか
らなる群から選択されるものを有してなるポリペプチ
ド。
【請求項１６】配列番号２のアミノ酸１からアミノ酸
５３５を有してなる、請求項１５記載のポリペプチド。
【請求項１７】ｈＭＹＨを必要とする患者の処置方法
であって、該患者に請求項１５のポリペプチドをコード
するＤＮＡを付与し、インビボにおいて該ポリペプチド
を発現させることによる、治療上有効量の該ポリペプチ
ドを該患者に投与することからなる方法。
【請求項１８】宿主に由来するサンプル中の請求項１
５に記載のポリペプチドの存在を分析することからなる
診断方法。
【請求項１９】患者に由来するサンプルから請求項１
に記載のポリヌクレオチド配列の変異を測定することか
らなる癌に対する感受性の診断方法。
【請求項２０】患者に由来のサンプルから請求項１５
に記載の配列を有するポリペプチドの活性レベルの低下
を測定することからなる癌の診断方法。
【請求項２１】患者に由来のサンプルから請求項１５
に記載の配列を有するポリペプチドの発現の低下を測定
することからなる癌の診断方法。
【請求項２２】患者に由来のサンプルから請求項１に
記載の配列を有するポリヌクレオチドの発現レベルの低
下を測定することからなる癌の診断方法。
【請求項２３】患者に由来のサンプルから請求項１に
記載のポリヌクレオチド配列の変異を測定することから
なる癌の診断方法。
【請求項２４】請求項１５に記載のポリペプチドに対
する抗体。