JPH1062425A - 生物マトリックスからの鉛イオンの放出および測定のための試薬および方法 - Google Patents

生物マトリックスからの鉛イオンの放出および測定のための試薬および方法

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JPH1062425A
JPH1062425A JP9177830A JP17783097A JPH1062425A JP H1062425 A JPH1062425 A JP H1062425A JP 9177830 A JP9177830 A JP 9177830A JP 17783097 A JP17783097 A JP 17783097A JP H1062425 A JPH1062425 A JP H1062425A
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Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 本発明は、ヘパリンまたはＥＤＴＡで抗
凝血化されたヒト全血、凍結乾燥ヒト血液およびウシＥ
ＤＴＡ全血などの各種の生物マトリックスから鉛イオン
を抽出するための試薬を提供する。 【効果】 放出された鉛は上清をさらに操作することな
く比色測定用ポルフィリン試薬を使用してin situ で測
定される。この鉛イオン放出試薬は各種の生物液中の鉛
の測定のための各種の検定形式と組み合わせて使用する
ことができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は血液中の鉛の放出お
よび測定のための試薬および方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】鉛およびその化合物は数世紀にわたっ
て、環境中に広く分布するようになった。鉛は毒性があ
ってヒトに有害な影響を及ぼすことが知られている。鉛
の毒性については十分な報告がある。微量の鉛が人体、
特に小さな子供の各種の器官の機能に有害作用を与える
ことがある。現在、鉛の毒性作用は血中レベルが10−15
μg/dLの低量で生じることが認識されている。したがっ
て、血液中の鉛の検出および測定は、一般的な血液スク
リーニングの実施において、および職業上の鉛の被曝の
監視において、極めて重要である。
【０００３】大部分の鉛のスクリーニングプログラム
は、微量の鉛の測定のために、原子吸光または陽極スト
リッピングボルタンメトリー法を使用する。どちらの方
法も使用するのに煩雑で、汚染されやすく、そして費用
がかかる。δ−アミノレブリン酸デヒドラーゼ（ＡＬＡ
Ｄ）およびイソクエン酸塩デヒドロゲナーゼを使用す
る、酵素に基づいた鉛の生物検出システムもまた提案さ
れている。鉛によるＡＬＡＤの阻害を利用する、自動蛍
光定量による鉛検定が、WongらのPCT 国際公開No.W095/
17679 に開示されている。この中で、鉛を含有する検定
溶液に鉛回収剤を添加し、この検定溶液にジスルフィド
酵素を添加し、そしてジスルフィド酵素の活性を試料中
の鉛の量に相関させることによる、試料中の鉛の検出が
開示されている。
【０００４】このWongらの特許には、血液試料から鉛イ
オンを分離する最初の処理段階として、トリクロロ酢
酸、硝酸、5-スルホサリチル酸、または過塩素酸などの
酸の使用が開示されている。しかし、分析する前に、生
成した鉛含有水性上清溶液を鉛回収剤を含有する緩衝液
で中和しなければならない。これをしないと、鉛を測定
のために使用することができない。
【０００５】試料の前処理のその他の方法として、原子
吸光による分析の前の、リン酸アンモニウムの硝酸溶液
および非イオン性界面活性剤などのマトリックス改変剤
での血液の酸消化または希釈が含まれる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、ヘパリンまた
はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの抗凝血物
質を含む全血などの生物マトリックスの鉛成分の放出お
よび測定に関する。鉛イオンの形態の鉛成分を生物マト
リックスから上清溶液中に抽出するために放出試薬を使
用するが、この放出試薬は生物マトリックスから鉛イオ
ンを放出させることができる酸溶液、及び生物マトリッ
クスから放出された鉛イオンを可溶化することができる
１以上の塩を含んでなる。
【０００７】抗凝血物質としてＥＤＴＡを使用する場合
は、放出された鉛イオンがＥＤＴＡと錯体化するのをブ
ロックするとともに、それによって放出された鉛イオン
がＥＤＴＡによって錯体化されるのを防止するため、Ｅ
ＤＴＡ錯体形成イオンを使用する。また、本発明は、ポ
ルフィリンおよび第４級アンモニウム塩を含んでなる、
放出された鉛イオンの量を測定するために使用する比色
分析用試薬にも関連している。
【０００８】
【発明の実施の態様】本発明は、ヒト若しくはウシ全
血、または凍結乾燥ヒト全血などの生物マトリックスか
ら鉛イオンを抽出するための、新規な試薬を提供する。
これらのマトリックスはヘパリンまたはＥＤＴＡによっ
て抗凝血化されていてもよい。本発明は、０から約100
μg/dLＰｂ2+の濃度範囲の放出された鉛イオンを測定す
る方法をも提供する。
【０００９】ここで使用する、生物マトリックスからの
鉛の「放出」、「抽出」および「回収」という用語は、
当初の生物マトリックス中に存在していた鉛イオンの実
質上全部が、本発明の酸性試薬での処理後、抽出された
鉛イオンを含有する上清溶液中に見出だされることを表
す。ここで使用する、「鉛」および「鉛成分」という用
語は鉛イオン成分を示すもので、便宜上短縮形で使用し
ている。また、ここで使用する「全血」という用語は、
ヘパリンまたはＥＤＴＡなどの抗凝血物質で抗凝血化さ
れた血液を示す。
【００１０】さらに具体的には、当初の未処理の生物マ
トリックス中の鉛成分の約90−110％および好ましくは1
00％が上清中に存在する。試薬中または分析環境中に存
在することがある鉛の混入によって、100％以上の鉛の
回収が可能となる。本発明、および全血の鉛イオン成分
の放出および測定のための特定の適用にしたがって、赤
血球から鉛イオンを遊離または放出させることができる
十分な量の酸を、血液から放出された鉛イオンを可溶化
することができる十分な量の１以上の塩を組み合わせて
使用する。この酸組成物もまた“放出試薬”として示さ
れる。
【００１１】赤血球から鉛イオンを遊離または放出させ
ることができる好適な酸として、トリクロロ酢酸、過塩
素酸、5-スルホサリチル酸、およびその他の等価の酸が
含まれる。特に好ましい酸は、例えばFluka AG,Switzer
landから入手可能な超純粋トリクロロ酢酸である。全血
から放出された鉛イオンを可溶化することができる塩と
して、ナトリウム、カリウムまたはリチウムなどのアル
カリ金属カチオンを有する塩が挙げられる。この塩のア
ニオン部分は硝酸塩、塩化物、臭化物などであってよ
い。
【００１２】好ましい塩はナトリウム、カリウムおよび
リチウムの硝酸塩であり、硝酸ナトリウムが特に好まし
い。抗凝血剤としてＥＤＴＡを使用する場合は、放出さ
れた鉛イオンがＥＤＴＡと錯体化するのをブロックする
とともに、それによって放出された鉛イオンがＥＤＴＡ
と錯体化するのを防止するのに、十分な量のＥＤＴＡ錯
体形成イオンを使用する。
【００１３】ＥＤＴＡによる鉛イオンの錯体化を防止す
るため、ＥＤＴＡと錯体化することができるイオンを供
給する塩として、カルシウム、バリウム、マグネシウム
およびストロンチウムなどのアルカリ土類金属カチオン
を有する塩が挙げられる。この塩のアニオン部分は硝酸
塩、塩化物、臭化物等であってよい。好ましい塩とし
て、カルシウム、バリウム、マグネシウムおよびストロ
ンチウムの硝酸塩が挙げられ、硝酸カルシウムが特に好
ましい。
【００１４】ヘパリンまたはＥＤＴＡのいずれかで抗凝
血化した全血から鉛イオンを遊離または放出させるため
の好ましい普遍的な試薬として、高濃度の硝酸ナトリウ
ムおよび硝酸カルシウムを含むトリクロロ酢酸溶液が使
用される。鉛イオン可溶化塩およびＥＤＴＡ錯体化塩を
加えないトリクロロ酢酸溶液のみを使用した場合は、微
量の鉛イオンが全血から放出されることがわかった。
【００１５】より具体的には、放出試薬は約5−25％（w
/v）、好ましくは約8−15％（w/v）、そして最も好まし
くは約10％（w/v）のトリクロロ酢酸を含有する。25％
（w/v）より多い量のトリクロロ酢酸を使用することは
できるが、このような多量の使用が放出試薬の効果を増
大することは観察されていない。
【００１６】トリクロロ酢酸溶液中の鉛イオン可溶化塩
の濃度は約0.2−1.0 M、好ましくは約0.3−0.8 M、最も
好ましくは約0.5 M の範囲とすることができる。トリク
ロロ酢酸溶液中のＥＤＴＡ錯体化塩の濃度は約0.04−1
M、好ましくは約0.05−0.5 M、最も好ましくは約0.08−
0.3 M の範囲とすることができ、特に好ましくは濃度0.
1 M である。硝酸ナトリウムおよび硝酸カルシウムを含
有するトリクロロ酢酸溶液を含む放出試薬を全血に接触
させる場合、実質的にすべての全血タンパク質が沈澱
し、実質的にすべての血液中鉛イオン成分が定量的に放
出され、そして上清溶液中に可溶性鉛イオンの溶液の形
態で抽出されることがわかった。沈殿物からの上清溶液
の分離は、遠心分離、濾過などによって都合よく実施す
ることができる。
【００１７】硝酸ナトリウムは、全血から血液タンパク
質を沈殿させ、そして全血からの鉛イオンを可溶性硝酸
鉛の形態で上清溶液中に抽出する際のトリクロロ酢酸の
効率および効力を増大させることがわかった。硝酸カル
シウム中のカルシウムイオンはＥＤＴＡの結合部位をマ
スクまたはブロックし、それによってＥＤＴＡが鉛イオ
ンと結合又は錯体化するのを妨げる作用をする。ＥＤＴ
Ａ以外で抗凝血化された全血とともに使用した時、存在
する硝酸カルシウムによって生じる逆効果は認められて
いない。したがって、トリクロロ酢酸／硝酸ナトリウム
／硝酸カルシウム組成物は、ヘパリン若しくはＥＤＴＡ
で抗凝血化された全血のための、または抗凝血物質の性
質が未知の場合の、優れた放出試薬であることがわかっ
た。
【００１８】放出試薬と全血の混合物をその後遠心分離
し、沈澱した全血タンパク質を、可溶性鉛イオンおよび
その他の血液被検体を含有する上清溶液から分離するこ
とができる。原子吸光、陽極ストリッピングボルタンメ
トリー、分光光度法、酵素に基づいた生物検出系などの
いかなる好適な分析法または装置によっても、上清溶液
中の鉛イオン成分量を測定することができる。
【００１９】分光分析装置を使用する場合は、上清溶液
中の放出された鉛イオンを、この上清をさらに操作する
ことなくそのまま、比色用ポルフィリンを主成分とする
試薬を使用して簡単に測定することができる。この測定
方法は、比色測定試薬中の遊離のテトラキス（トリメチ
ルアンモニオフェニル）ポルフィリンの極大波長の、鉛
が存在しないことを示す 410ナノメーターから、比色測
定用ポルフィリン試薬が鉛と完全に錯体化したことを示
す 463ナノメーターへのスペクトルの移行を基礎とする
ものである。
【００２０】テトラキス（1-メチル-4- ピリジル）ポル
フィリンまたはテトラキス（トリメチル−アンモニオベ
ンジル）ポルフィリンなどの、他のポルフィリン化合物
もまた使用することができる。吸光度の変化が試料中の
鉛の濃度に比例する。比色測定用ポルフィリン試薬に可
溶性第４級アンモニウム塩を添加すると、比色測定用ポ
ルフィリン試薬の感度が増大し、スペクトルの応答の程
度が１桁より多く改善されることが発見された。十分量
以上の水酸化アンモニウムを添加すると、銅、亜鉛など
の妨害カチオンをマスクすることがわかり、またこれは
比色測定試薬へのアルカリ媒体を形成する。
【００２１】第４級アンモニウム塩は以下の一般式を有
する：
【００２２】
【化３】 ［式中、Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3 およびＲ4 はＣ1−Ｃ18アルキ
ル、またＲ1，Ｒ2，Ｒ3 又はＲ4 のいずれかがベンジル
などのアラルキルであり、ＸはＣｌ，ＢｒまたはＩであ
る］。好適な第４級アンモニウム塩として、セチルトリ
メチルアンモニウムブロマイド、ベンズアルコニウムク
ロライド、オクチルドデシルジメチルアンモニウムクロ
ライド、テトラペンチルアンモニウムブロマイド、およ
びテトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイドが挙
げられる。
【００２３】以下の一般構造のポリマー性第４級アンモ
ニウム塩がより好ましく、これは以下の一般構造を有す
る：
【００２４】
【化４】 ［式中、Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3 およびＲ4 はＣ1−Ｃ4 アルキ
ル、ｋ，ｍ＝２−10、Ｘ はＣｌ，ＢｒまたはＩ、ｎ＝
１−30である］。特に好ましいのはヘキサジメスリンブ
ロマイドである。放出された鉛イオンおよび残存する放
出試薬を含有する上清溶液を特定の前処理をしないでin
situ で比色測定用ポルフィリン試薬と接触させる。比
色測定試薬中のポルフィリン濃度は約5.0×10-6から2.0
×10-5M 、好ましくは約2.5×10-6から1×10-5M とする
ことができる。比色測定用試薬中の水酸化アンモニウム
の濃度は約0.2から2.0 M、好ましくは約0.5から1.0 Mと
することができる。第４級アンモニウム塩の濃度は比色
測定試薬の約0.002から0.1％（w/v）,好ましくは約0.00
25から0.05％（w/v）とすることができる。
【００２５】
【実施例】実施例１：鉛測定のための比色測定用ポルフィリン試薬
の調製 ａ）蒸留水中1.0 mM（ミリモル／リットル）テトラキス
（トリメチル−アンモニオフェニル）ポルフィリン原液
10-mLを調製した。この溶液の0.2 mL（ミリリットル）
アリコートを1.0 M ＮＨ4ＯＨ 20 mLに添加し、得られ
た溶液を攪拌した。
【００２６】ｂ）ａ）において調製した溶液に、Sigma
Chemical Companyから商標名“Polybrene ”として入手
し得るヘキサジメスリンブロマイド（0.01％ w/v）20 m
g(ミリグラム）を添加し、混合物を攪拌してヘキサジメ
スリンブロマイドを溶解させ、それによって比色測定用
ポルフィリン試薬を生成した。実施例２：鉛放出試薬の調製 ａ）トリクロロ酢酸 10.0 g(グラム) を100 mLメスフラ
スコ中の水 80 mLに溶解し、蒸留および脱イオン化した
水で100 mLにした。
【００２７】ｂ）トリクロロ酢酸 10.0 g(グラム) を10
0 mLメスフラスコ中の水 80 mLに溶解した。ＮａＮＯ3
4.3 g を添加し、内容物を蒸留および脱イオン化した水
で100 mLにし、トリクロロ酢酸含有 0.5 MＮａＮＯ3溶
液を生成した。 ｃ）ＮａＮＯ3 4.3 g をトリクロロ酢酸 10 g の脱イオ
ン水溶液に溶解した。この溶液にＣａ(ＮＯ3)2 1.64 g
を添加し、混合物を攪拌して、全固形物を溶解させた。
この溶液を100 mLメスフラスコに移し、蒸留および脱イ
オン化した水で100mLにし、 0.5 MＮａＮＯ3および0.1
M Ｃａ(ＮＯ3)2含有トリクロロ酢酸溶液を生成した。
【００２８】実施例３：鉛固定全血の調製 ヒト被検体からの 2.0 mL ずつの血液試料を、Becton D
ickinson,Rutherford,New Jersey製のヘパリン管および
ＥＤＴＡ管の両方に採取した。ヘパリン管およびＥＤＴ
Ａ管のそれぞれに、Aldrich Co.,Milwaukee,Wisconsin
製 1000 mg/dL原子吸光用鉛標準液から調製した 1.0 mM
ＨＮＯ3 中の 20 mg/mL 鉛原液のアリコートを添加し
た。10から100 μg/dLＰｂ2+まで10 mg 刻みで増加させ
た濃度の最終溶液を調製した。その後、各試験管をボル
テックスミキサー（Fisher Scientific Industries）上
で１分間ボルテックスし、ロータリーミキサー（Fisher
Scientific Industries）上に1/2 時間置いて、均一溶
液を得た。
【００２９】実施例４：放出試薬による全血の前処理 実施例３の各試験管からの全血 0.3 mL を別々の 1-mL
遠心管中にピペットで入れた。実施例２ａ，２ｂまたは
２ｃから選択した１つの鉛放出試薬 0.3 mL を各試験管
に添加した。得られた各管中の混合物を１分間ボルテッ
クスし、続いて遠心分離機（Eppendorf Model 5415C ）
上で 14,000 rpm （１分間当たりの回転数）で遠心分離
した。各遠心分離によって得られた上清（0.4 mL）を乾
燥試験管中にデカントし、脱イオン水で予備洗浄した。
以後の処理は以下の実施例に詳細を記載する。
【００３０】実施例５：鉛標準水溶液の調製 1000 mg/dL 原子吸光用鉛標準液 0.1 mL を100-mLメス
フラスコ中にピペットで入れることによって、100 μg/
dLＰｂ2+溶液を調製した。5％トリクロロ酢酸、 0.25 M
ＮａＮＯ3 および 0.05 M Ｃａ(ＮＯ3)2からなる溶液
で、このフラスコの容積を満たした。100 μg/dLＰｂ2+
溶液のアリコート（0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.
0，8.0，10.0 mL ）を 10-mLメスフラスコ中にピペット
で入れて、5 ％トリクロロ酢酸、0.25 MＮａＮＯ3 およ
び 0.05 M Ｃａ(ＮＯ3)2からなる溶液でこのフラスコの
容積を満たし、それぞれ 5，10，20，30，40，50，60，
80，100μg/dLＰｂ2+標準液を製造した。
【００３１】実施例６：ポルフィリン試薬による鉛の測
定 Ａ．標準曲線 実施例１ｂ）の比色測定用ポルフィリン試薬 1 mL を一
群の 1.5-mL キュベット（パスレングス、ｌ＝1 cm）中
にピペットで入れた。各キュベットに実施例５の鉛標準
濃度水溶液の１つを 0.2 mL 添加した。これによって生
成した混合物を攪拌して均一溶液とし、10分間室温で放
置した。Cary-3 分光光度計（Varian Analytical Instr
uments ）で、鉛を添加しない試薬（試薬ブランク）に
対する 463 nm における吸光度を読み取った。463 nmの
吸光度データを表１に示し、これをμg/dLＰｂ2+に対し
てプロットして図１の応答曲線を得た。図２はスペクト
ル応答を示す。
【００３２】
【表１】 図１は、比色測定用ポルフィリン試薬の鉛応答の線形性
を示すとともに、この比色測定用ポルフィリン試薬によ
って、広い濃度範囲（0−100μg/dL）にわたって鉛イオ
ンを測定できることを示す。
【００３３】銅および亜鉛などの妨害性カチオンに対す
るポルフィリン試薬の応答についても評価した。150μg
/dLＺｎ2+または100μg/dLＣｕ2+および100μg/dLＺｎ
2+の混合物の存在下でＡ463 nm（463 ナノメートルにお
ける吸光度）における変化は何ら観察されなかった。実
施例１におけるマスクとしての水酸化アンモニウムの使
用によって、これらのカチオンの潜在的妨害は消去され
た。
【００３４】Ｂ．放出試薬での全血の予備処理によって
得られた上清の分析操作法 1.5 mL 遠心分離管に実施例１の比色測定用ポルフィリ
ン試薬 1.0 mL をピペットで入れた。実施例２ａ、２ｂ
および２ｃから選択した放出試薬で全血を予備処理した
上清溶液（0.2 mL）を添加して検定用混合物を生成させ
た。各混合物を混合し、Eppendorf Model 5415C 遠心分
離機で14,000 rpmで10分間遠心分離した。１アリコート
（1.0 mL）を 1.5 mL キュベット（ｌ＝1 cm）中に移
し、Cary 3分光分析計上で463 nmにおける吸光度を読み
取った。
【００３５】実施例７：ヘパリン化全血の分析 Ａ．この実施例は、実施例４の操作法にしたがって、実
施例２ａにおいて調製した10％(w/v) トリクロロ酢酸で
予備処理した、実施例３のヘパリン化全血の分析の詳細
を記載するものである。0.01％ w/vヘキサジメスリンブ
ロマイドを含有する（実施例１ｂ）、またはヘキサジメ
スリンブロマイドを含有しない（実施例１ａ）比色測定
用ポルフィリン試薬を使用して、上清を実施例６Ｂの操
作法にしたがって分析した。上清の存在下で、比色測定
用ポルフィリン試薬の吸光度の変化は何ら観察されなか
った。これは100 μg/dLＰｂ2+まで添加した全血試料の
上清中に、検出し得る量の鉛が放出されなかったことを
示している。
【００３６】Ｂ．この実施例は、実施例４の操作法にし
たがって、実施例２ｂにおいて調製した10％(w/v) トリ
クロロ酢酸および0.5 M ＮａＮＯ3 で予備処理した、ヘ
パリン化全血の分析の詳細を記載するものである。表２
は実施例６Ｂの操作法にしたがって実施例１の比色測定
用ポルフィリン試薬を使用して分析した上清のデータを
示すものである。
【００３７】
【表２】 表２、Ａ欄における△Ａ463 の増加は、トリクロロ酢酸
へのＮａＮＯ3 の添加が鉛イオンの放出を促進したこと
を示している。表２、Ｂ欄のデータはポルフィリン試薬
へのヘキサジメスリンブロマイドの添加が感度を増大さ
せたことを示している。ヘパリンのアンタゴニストであ
るヘキサジメスリンブロマイドは、残存するヘパリンに
弱い相互作用を受けている上清中の鉛イオンを解放し
て、スペクトルの応答を１桁以上大きく改善した。
【００３８】表３のデータは、実施例６Ｂの操作法にし
たがって 0.01％ w/vヘキサジメスリンブロマイドを含
有する比色測定用ポルフィリン試薬を使用して上清を分
析した時の、各種濃度の鉛イオンを有するヘパリン化全
血の吸光度の読みを示すものである。データを記録する
ために Cary-3 分光光度計を使用した。
【００３９】
【表３】 表４のデータは、実施例６Ａにしたがって、実施例２ｂ
の放出試薬で１：１に希釈した、実施例５からの20およ
び40μg/dLＰｂ2+鉛標準液と接触させた、比色測定用ポ
ルフィリン試薬の吸光度の読みの変化（△Ａ463nm ）を
表すものである。
【００４０】
【表４】 表５の回収データは、表４に示された標準液からの吸光
度情報および表３に示されたヘパリン化全血の吸光度を
使用して、以下の等式にしたがって計算したものであ
る： μg/dLＰｂ2+（測定値）＝Ａ46 3(試料）／Ａ46 3(標準
液）×μg/dLＰｂ2+（標準液）[I]
【００４１】
【表５】 上記の結果は、トリクロロ酢酸のみを使用した時に無視
し得る量の鉛イオンが放出されたのとは対照的に、10％
トリクロロ酢酸に0.5 M ＮａＮＯ3 を添加した時には、
ヘパリン化全血に添加した鉛イオンの定量的放出が促進
されたことを示している。
【００４２】実施例８：ＥＤＴＡ処理全血の分析 Ａ．この実施例は、実施例４の操作法にしたがって、実
施例２ｂの10％(w/v)トリクロロ酢酸および0.5 M Ｎａ
ＮＯ3 で予備処理した、ＥＤＴＡ処理全血の分析の詳細
を記載するものである。表６の吸光度データは実施例６
Ｂの操作法にしたがって得られた。
【００４３】表６に示されたデータは、10％(w/v) トリ
クロロ酢酸および0.5 M ＮａＮＯ3からなる放出試薬は
ＥＤＴＡで抗凝血化した全血から鉛イオンを定量的に抽
出することができないことを示している。鉛イオンがＥ
ＤＴＡによって錯体化されたので、大部分の鉛イオンは
比色測定用ポルフィリン試薬と錯体化するのに使用され
なかった。
【００４４】
【表６】 Ｂ．この実施例は、実施例４の操作法にしたがって、実
施例２ｃの10％(w/v)トリクロロ酢酸、0.5 M ＮａＮＯ
3 および 0.1 M Ｃａ(ＮＯ3)2 からなる放出試薬で予備
処理した、ＥＤＴＡ処理全血の分析の詳細を記載するも
のである。表７の吸光度データは実施例６Ａにしたがっ
て得られた。表８の吸光度データは実施例６Ｂにしたが
って得られた。
【００４５】
【表７】
【００４６】
【表８】 上清溶液中の鉛イオンの濃度は、表７の△Ａ463nm （標
準液）データおよび表８の△Ａ463nm （試料）データか
ら、以下の等式にしたがって計算したものである： μg/dLＰｂ2+（測定値）＝Ａ46 3(試料）／Ａ46 3(標準
液）×２×μg/dLＰｂ2+（標準液）[II] 表８の結果は、放出試薬へのカルシウムイオンの添加
が、鉛イオンと錯体化するはずのＥＤＴＡの結合部位を
ブロックすることによって、ＥＤＴＡ抗凝血化全血から
の鉛イオンの放出を促進したことを示している。
【００４７】実施例９：鉛対照および標準物質の分析 Ａ．Valencia,California のUtak Laboratories より入
手した凍結乾燥ヒト全血を、実施例４の操作法にしたが
って、実施例２ｃの10％トリクロロ酢酸／0.5M ＮａＮ
Ｏ3 ／ 0.1 M Ｃａ(ＮＯ3)2 放出試薬で予備処理した。
この凍結乾燥全血中にどの抗凝血物質が存在しているか
はわかっていなかった。抗凝血物質が未知である、こう
した条件下において、全血の凝血物質の性質に無関係
に、実施例２ｃの放出試薬が普遍的に適用し得ることが
わかった。実施例６Ｂの操作法にしたがって、上清を検
定した。
【００４８】
【表９】（μg/dLＰｂ2+） 測定値 △Ａ463 Level I(8-16) 9.1 0.0060 Level II(21-29) 20.5 0.0144 Level III(32-40) 29.8 0.0207 Level IV(51-63) 49.4 0.0340 表９に詳述した鉛イオン濃度は実施例８Ｂに示した等式
IIにしたがって算出した。
【００４９】Ｂ．National Institute of Standards(NI
ST) 標準物質の分析 NIST標準物質はＥＤＴＡで抗凝血化されたウシ全血で構
成されている。このNISTウシ血液を、実施例４の操作法
にしたがって、実施例２ｃの10％トリクロロ酢酸／0.5
M ＮａＮＯ3 ／ 0.1 M Ｃａ(ＮＯ3)2 放出試薬で予備処
理した。上清を実施例６Ｂの操作法にしたがって検定
し、以下のデータを得た。
【００５０】
【表10】（μg/dLＰｂ2+） 測定値 △Ａ463 955a-1*(5.01) 3.7 0.003 955a-2*(13.53) 14.0 0.010 955a-3*(30.63) 28.7 0.020 955a-4*(54.40) 58.2 0.040 ─────────* NIST対照番号 図３に示すように、NIST上清と接触させた、実施例１ｂ
の比色測定用ポルフィリン試薬のスペクトルによる鉛応
答によって、NIST標準物質からの鉛イオンの抽出が確認
された。実施例６Ｂの操作法にしたがって得られた検定
用混合物をCary-3 分光分析計上で700 から300 nmまで
走査することによって、スペクトルを記録した。
【００５１】実施例８Ｂ，９Ａおよび９Ｂの結果は、放
出試薬の実用的な製剤が各種のマトリックスから鉛イオ
ンを定量的に抽出することを表している。本発明は、血
清、尿、乳などの各種の生物マトリックスから鉛イオン
を抽出するための普遍的な放出試薬を提供する。この放
出試薬は、ヘパリンまたはＥＤＴＡで抗凝血化したヒト
全血、およびウシＥＤＴＡ全血からの鉛イオンの抽出、
あるいは凍結乾燥ヒト全血においてしばしば生じる、抗
凝血物質の性質が未知の場合の鉛イオンの抽出に特に有
用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】比色測定用ポリフィリン試薬の鉛応答の線形性
を示す図。
【図２】鉛標準液を添加したポリフィリン試薬のスペク
トル応答を示す図。
【図３】比色測定用ポリフィリン試薬のスペクトルによ
る鉛応答によつて、ＮＩＳＴ標準物質からの鉛イオンの
抽出を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジァナスァン、クレイン アメリカ合衆国ニューヨーク州10952、マ ンシ、トウィン・レイクス・ドライヴ 26 番

Claims (95)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 生物マトリックスから鉛イオンを放出さ
    せることができる十分な量の酸および放出された鉛イオ
    ンを可溶化することができる十分な量の物質を含んでな
    る鉛イオン放出試薬に生物マトリックスを接触させ、そ
    れによって放出された鉛イオンを含有する上清溶液およ
    び生物マトリックスの残渣を含む沈殿物を生成させるこ
    とを含む、生物マトリックスから鉛イオン成分を放出さ
    せる方法。
  2. 【請求項２】 前記酸がトリクロロ酢酸、過塩素酸およ
    び5-スルホサリチル酸からなる群から選択される、請求
    項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記酸がトリクロロ酢酸である、請求項
    ２記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記酸が約５％(w/v) から約25％(w/v)
    の濃度で存在する、請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記放出された鉛イオンを可溶化するこ
    とができる物質が、硝酸塩、塩化物、臭化物からなる群
    から選択されるアニオンを有するアルカリ金属塩であ
    る、請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記アルカリ金属がナトリウム、カリウ
    ムおよびリチウムからなる群から選択される、請求項５
    記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記アルカリ金属が硝酸ナトリウムであ
    る、請求項５記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記アルカリ金属塩の濃度が約0.1 M か
    ら約1.0 M である、請求項１記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記生物マトリックスがヘパリンで抗凝
    血化された全血である、請求項１記載の方法。
  10. 【請求項10】 前記生物マトリックスがＥＤＴＡで抗凝
    血化された全血である、請求項１記載の方法。
  11. 【請求項11】 前記鉛イオン放出試薬が、放出された鉛
    イオンがＥＤＴＡ抗凝血物質と錯体を形成するのを防止
    することができる十分な量の物質をさらに含有する、請
    求項10記載の方法。
  12. 【請求項12】 前記放出された鉛イオンがＥＤＴＡ抗凝
    血物質と錯体を形成するのを防止することができる物質
    が、硝酸塩、塩化物および臭化物からなる群から選択さ
    れるアニオンを有するアルカリ土類金属塩から誘導され
    る、請求項11記載の方法。
  13. 【請求項13】 前記アルカリ土類金属塩が硝酸カルシウ
    ムである、請求項12記載の方法。
  14. 【請求項14】 前記アルカリ土類金属塩の濃度が約0.04
    Mから約1.0 M である、請求項12記載の方法。
  15. 【請求項15】 前記生物マトリックスが凍結乾燥全血で
    ある、請求項１記載の方法。
  16. 【請求項16】 前記生物マトリックスが全血、血清、尿
    および乳からなる群から選択される、請求項１記載の方
    法。
  17. 【請求項17】 上清溶液が遠心分離および濾過からなる
    群から選択される方法によって沈殿物から分離される、
    請求項１記載の方法。
  18. 【請求項18】 生物マトリックスから鉛イオンを放出さ
    せることができる十分な量の酸および放出された鉛イオ
    ンを可溶化することができる十分な量の物質の溶液を含
    み、それによって放出された鉛イオンを含有する上清溶
    液および生物マトリックスの残渣を含む沈殿物を生成さ
    せる、生物マトリックスから鉛イオン成分を放出させる
    ための試薬。
  19. 【請求項19】 前記酸が約５％(w/v) から約25％(w/v)
    の濃度で存在する、請求項18記載の試薬。
  20. 【請求項20】 前記酸がトリクロロ酢酸、過塩素酸およ
    び5-スルホサリチル酸からなる群から選択される、請求
    項18記載の試薬。
  21. 【請求項21】 前記酸がトリクロロ酢酸である、請求項
    20記載の試薬。
  22. 【請求項22】 前記放出された鉛イオンを可溶化するこ
    とができる物質が、硝酸塩、塩化物、臭化物からなる群
    から選択されるアニオンを有するアルカリ金属塩であ
    る、請求項18記載の試薬。
  23. 【請求項23】 前記アルカリ金属塩の濃度が約0.1 M か
    ら約1.0 M である、請求項22記載の試薬。
  24. 【請求項24】 前記アルカリ金属がナトリウム、カリウ
    ムおよびリチウムからなる群から選択される、請求項22
    記載の試薬。
  25. 【請求項25】 前記アルカリ金属塩が硝酸ナトリウムで
    ある、請求項22記載の試薬。
  26. 【請求項26】 前記生物マトリックスがヘパリンで抗凝
    血化された全血である、請求項18記載の試薬。
  27. 【請求項27】 前記生物マトリックスがＥＤＴＡで抗凝
    血化された全血である、請求項18記載の試薬。
  28. 【請求項28】 前記鉛イオン放出試薬が、放出された鉛
    イオンがＥＤＴＡ抗凝血物質と錯体を形成するのを防止
    することができる十分な量の物質をさらに含有する、請
    求項18記載の試薬。
  29. 【請求項29】 前記放出された鉛イオンがＥＤＴＡ抗凝
    血物質と錯体を形成するのを防止することができる物質
    が、硝酸塩、塩化物および臭化物からなる群から選択さ
    れるアニオンを有するアルカリ土類金属塩から誘導され
    る、請求項18記載の試薬。
  30. 【請求項30】 前記アルカリ土類金属塩の濃度が約0.04
    Mから約1.0 M である、請求項29記載の試薬。
  31. 【請求項31】 前記アルカリ土類金属塩が硝酸カルシウ
    ムである、請求項29記載の試薬。
  32. 【請求項32】 前記生物マトリックスが凍結乾燥全血で
    ある、請求項18記載の試薬。
  33. 【請求項33】 前記生物マトリックスが全血、血清、尿
    および乳からなる群から選択される、請求項18記載の試
    薬。
  34. 【請求項34】 前記上清溶液が遠心分離および濾過から
    なる群から選択される方法によって沈殿 物から分離さ
    れる、請求項18記載の試薬。
  35. 【請求項35】ａ）全血からイオンを放出させることがで
    きる十分な量の酸および放出された鉛イオンを可溶化す
    ることができる十分な量の物質を含んでなる鉛イオン放
    出試薬に全血を接触させ、それによって放出された鉛イ
    オンを含有する上清溶液および沈殿した全血タンパク質
    成分を含む残渣を生成させ、 ｂ）沈殿物から上清溶液を分離し、そして、 ｃ）上清溶液中の鉛イオン成分を測定する、ことを含
    む、ヘパリンで抗凝血化させた全血中の鉛イオン量の測
    定方法。
  36. 【請求項36】 前記上清溶液が遠心分離および濾過から
    なる群から選択される方法によって沈殿物から分離され
    る、請求項35記載の方法。
  37. 【請求項37】 前記鉛イオン成分を、原子吸光、陽極ス
    トリッピングボルタンメトリー、分光光度法、および酵
    素に基づいた生物検出系からなる群から選択される方法
    によって測定する、請求項35記載の方法。
  38. 【請求項38】 前記上清溶液中の鉛イオン成分を分光光
    度法によって測定する、請求項35記載の方法。
  39. 【請求項39】 前記分光光度法において、比色測定用ポ
    ルフィリンを主成分とする試薬を使用する、請求項38記
    載の方法。
  40. 【請求項40】 前記酸がトリクロロ酢酸、過塩素酸およ
    び5-スルホサリチル酸からなる群から選択される、請求
    項35記載の方法。
  41. 【請求項41】 前記酸がトリクロロ酢酸である、請求項
    40記載の方法。
  42. 【請求項42】 前記酸が約５％(w/v) から約25％(w/v)
    の濃度で存在する、請求項35記載の方法。
  43. 【請求項43】 前記放出された鉛イオンを可溶化するこ
    とができる物質が、硝酸塩、塩化物、臭化物からなる群
    から選択されるアニオンを有するアルカリ金属塩であ
    る、請求項35記載の方法。
  44. 【請求項44】 前記アルカリ金属がナトリウム、カリウ
    ムおよびリチウムからなる群から選択される、請求項43
    記載の方法。
  45. 【請求項45】 前記アルカリ金属塩が硝酸ナトリウムで
    ある、請求項44記載の方法。
  46. 【請求項46】 アルカリ金属塩の濃度が約0.1 M から約
    1.0 M である、請求項43記載の方法。
  47. 【請求項47】ａ）全血から鉛イオンを放出させることが
    できる十分な量の酸、放出された鉛イオンを可溶化する
    ことができる十分な量の第１の物質、およびＥＤＴＡが
    放出された鉛イオンと錯体を形成するのを防止すること
    ができる第２の物質を含んでなる鉛イオン放出試薬に全
    血を接触させ、それによって放出された鉛イオンを含有
    する上清溶液および全血タンパク質成分を含む沈殿物を
    生成させ、 ｂ）沈殿物から上清溶液を分離し、そして、 ｃ）上清溶液中の鉛イオン成分を測定する、ことを含
    む、ＥＤＴＡで抗凝血化させた全血中の鉛イオン量の測
    定方法。
  48. 【請求項48】 前記上清溶液が遠心分離および濾過から
    なる群から選択される方法によって沈殿物から分離され
    る、請求項47記載の方法。
  49. 【請求項49】 前記鉛イオン成分を、原子吸光、陽極ス
    トリッピングボルタンメトリー、分光光度法、および酵
    素に基づいた生物検出系からなる群から選択される方法
    によって測定する、請求項47記載の方法。
  50. 【請求項50】 前記上清溶液中の鉛イオン成分を分光光
    度法によって測定する、請求項47記載の方法。
  51. 【請求項51】 前記分光光度法において、比色測定用ポ
    ルフィリンを主成分とする試薬を使用する、請求項50記
    載の方法。
  52. 【請求項52】 前記酸がトリクロロ酢酸、過塩素酸およ
    び5-スルホサリチル酸からなる群から選択される、請求
    項47記載の方法。
  53. 【請求項53】 前記酸がトリクロロ酢酸である、請求項
    52記載の方法。
  54. 【請求項54】 前記酸が約５％(w/v) から約25％(w/v)
    の濃度で存在する、請求項47記載の方法。
  55. 【請求項55】 前記放出された鉛イオンを可溶化するこ
    とができる物質が、硝酸塩、塩化物、臭化物からなる群
    から選択されるアニオンを有するアルカリ金属塩であ
    る、請求項47記載の方法。
  56. 【請求項56】 前記アルカリ金属がナトリウム、カリウ
    ムおよびリチウムからなる群から選択される、請求項55
    記載の方法。
  57. 【請求項57】 前記アルカリ金属塩が硝酸ナトリウムで
    ある、請求項56記載の方法。
  58. 【請求項58】 前記アルカリ金属塩の濃度が約0.1 M か
    ら約1.0 M である、請求項55記載の方法。
  59. 【請求項59】 前記放出された鉛イオンがＥＤＴＡ抗凝
    血物質と錯体を形成するのを防止することができる物質
    が、硝酸塩、塩化物および臭化物からなる群から選択さ
    れるアニオンを有するアルカリ土類金属塩から誘導され
    る、請求項47記載の方法。
  60. 【請求項60】 前記アルカリ土類金属塩が硝酸カルシウ
    ムである、請求項59記載の方法。
  61. 【請求項61】 前記アルカリ土類金属塩の濃度が約0.04
    Mから約1.0 M である、請求項59記載の方法。
  62. 【請求項62】 ａ）全血から鉛イオンを放出させること
    ができる十分な量の酸、放出された鉛イオンを可溶化す
    ることができる十分な量の第１の物質、および放出され
    たイオンが存在するいかなるＥＤＴＡとも錯体を形成す
    るのを防止することができる十分な量の第２の物質を含
    む鉛イオン放出試薬に全血を接触させ、それによって放
    出された鉛イオンを含有する上清溶液および全血タンパ
    ク質成分を含む沈殿物を生成させ、 ｂ）沈殿物から上清溶液を分離し、そして、 ｃ）上清溶液中の鉛イオン成分を測定する、ことを含
    む、未知の抗凝血物質を含有する全血中の鉛イオン量の
    測定方法。
  63. 【請求項63】 前記上清溶液が遠心分離および濾過から
    なる群から選択される方法によって沈殿物から分離され
    る、請求項62記載の方法。
  64. 【請求項64】 前記鉛イオン成分を、原子吸光、陽極ス
    トリッピングボルタンメトリー、分光光度法、および酵
    素に基づいた生物検出系からなる群から選択される方法
    によって測定する、請求項62記載の方法。
  65. 【請求項65】 前記前記上清溶液中の鉛イオン成分を分
    光光度法によって測定する、請求項62記載の方法。
  66. 【請求項66】 前記分光光度法において、比色測定用ポ
    ルフィリンを主成分とする試薬を使用する、請求項65記
    載の方法。
  67. 【請求項67】 前記酸がトリクロロ酢酸、過塩素酸およ
    び5-スルホサリチル酸からなる群から選択される、請求
    項62記載の方法。
  68. 【請求項68】 前記酸がトリクロロ酢酸である、請求項
    67記載の方法。
  69. 【請求項69】 前記酸が約５％(w/v) から約25％(w/v)
    の濃度で存在する、請求項62記載の方法。
  70. 【請求項70】 前記放出された鉛イオンを可溶化するこ
    とができる物質が、硝酸塩、塩化物、臭化物からなる群
    から選択されるアニオンを有するアルカリ金属塩であ
    る、請求項62記載の方法。
  71. 【請求項71】 前記アルカリ金属がナトリウム、カリウ
    ムおよびリチウムからなる群から選択される、請求項70
    記載の方法。
  72. 【請求項72】 前記アルカリ金属塩が硝酸ナトリウムで
    ある、請求項71記載の方法。
  73. 【請求項73】 前記アルカリ金属塩の濃度が約0.1 M か
    ら約1.0 M である、請求項70記載の方法。
  74. 【請求項74】 前記放出された鉛イオンがＥＤＴＡ抗凝
    血物質と錯体を形成するのを防止することができる物質
    が、硝酸塩、塩化物および臭化物からなる群から選択さ
    れるアニオンを有するアルカリ土類金属塩から誘導され
    る、請求項62記載の方法。
  75. 【請求項75】 前記アルカリ土類金属塩が硝酸カルシウ
    ムである、請求項74記載の方法。
  76. 【請求項76】 前記アルカリ土類金属塩の濃度が約0.04
    Mから約1.0 M である、請求項74記載の方法。
  77. 【請求項77】 生物マトリックスから放出試薬を使用し
    て抽出された鉛イオン溶液の分光光度分析において使用
    する比色測定用試薬であって、ポルフィリン化合物およ
    び該比色測定用試薬の感度を増強することができるとと
    もにスペクトルの応答を改善することができる十分な量
    の第１の添加剤を含む前記比色測定用試薬。
  78. 【請求項78】 前記感度増強添加剤が第４級アンモニウ
    ム塩を含む、請求項77記載の比色測定用試薬。
  79. 【請求項79】 鉛イオン溶液中に存在する妨害性カチオ
    ンをマスクすることができる十分な量の第２の添加剤を
    さらに含む、請求項77記載の比色測定用試薬。
  80. 【請求項80】 前記妨害性カチオンをマスクすることが
    できる添加剤が水酸化アンモニウムである、請求項79記
    載の比色測定用試薬。
  81. 【請求項81】 前記妨害性カチオンが銅イオンおよび亜
    鉛イオンからなる群から選択される、請求項79記載の比
    色測定用試薬。
  82. 【請求項82】 前記ポルフィリン化合物がテトラキス
    （トリメチルアンモニオフェニル）ポルフィリン、テト
    ラキス（1-メチル-4- ピリジル）ポルフィリンおよびテ
    トラキス（トリメチルアンモニオベンジル）ポルフィリ
    ンからなる群から選択される、請求項77記載の比色測定
    用試薬。
  83. 【請求項83】 前記ポルフィリン化合物がテトラキス
    （トリメチルアンモニオフェニル）ポルフィリンであ
    る、請求項82記載の比色測定用試薬。
  84. 【請求項84】 前記ポルフィリン化合物の濃度が約5×1
    0-6 Mから約2×10-5 Mの範囲である、請求項77記載の比
    色測定用試薬。
  85. 【請求項85】 前記ポルフィリン化合物の濃度が約2.5
    ×10-6 Mから約1×10-5 Mの範囲である、請求項84記載
    の比色測定用試薬。
  86. 【請求項86】 前記第４級アンモニウム塩の濃度が約0.
    002％(w/v)から約0.1％(w/v)の範囲である、請求項78記
    載の比色測定用試薬。
  87. 【請求項87】 前記第４級アンモニウム塩の濃度が約0.
    0025％(w/v)から約0.005％(w/v) の範囲である、請求項
    78記載の比色測定用試薬。
  88. 【請求項88】 前記水酸化アンモニウムの濃度が約0.2
    Mから約2.0 Mの範囲である、請求項80記載の比色測定用
    試薬。
  89. 【請求項89】 前記水酸化アンモニウムの濃度が約0.5
    Mから約1.0 Mの範囲である、請求項88記載の比色測定用
    試薬。
  90. 【請求項90】 前記第４級アンモニウム塩が下記の式： 【化１】 ［式中、Ｒ1，Ｒ2，及びＲ3 はＣ1−Ｃ18アルキルであ
    り、Ｒ1，Ｒ2 ，Ｒ3 またはＲ4 のいずれかがベンジル
    などのアラルキルであり、ＸはＣｌ，ＢｒまたはＩであ
    る］で示される、請求項78記載の比色測定用試薬。
  91. 【請求項91】 前記第４級アンモニウム塩がポリマー性
    であるとともに、下記の式： 【化２】 ［式中、Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3 およびＲ4 はＣ1−Ｃ4 アルキ
    ルであり、ｋ，ｍ＝２−10であり、ＸはＣｌ，Ｂｒまた
    はＩであり，ｎ＝１−30である］で示される、請求項78
    記載の比色測定用試薬。
  92. 【請求項92】 前記第４級アンモニウム塩が、セチルト
    リメチルアンモニウムブロマイド、ベンズアルコニウム
    クロライド、オクチルドデシルジメチルアンモニウムク
    ロライド、テトラペンチルアンモニウムブロマイド、お
    よびテトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイドか
    らなる群から選択される、請求項78記載の比色測定用試
    薬。
  93. 【請求項93】 前記第４級アンモニウム塩がヘキサジメ
    スリンブロマイドである、請求項78記載の試薬。
  94. 【請求項94】 前記鉛イオンの溶液が放出試薬を含有す
    る、請求項77記載の比色測定用試薬。
  95. 【請求項95】 前記比色測定用試薬と前記抽出された鉛
    イオン溶液との容積比が約1.0：0.2である、請求項77記
    載の比色測定用試薬。
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