JPH1066566A - ストレプトミセス属の生産するｌ−グルタミン酸・ｌ−ピログルタミン酸相互変換酵素とその製造法 - Google Patents
ストレプトミセス属の生産するｌ−グルタミン酸・ｌ−ピログルタミン酸相互変換酵素とその製造法Info
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- JPH1066566A JPH1066566A JP8226895A JP22689596A JPH1066566A JP H1066566 A JPH1066566 A JP H1066566A JP 8226895 A JP8226895 A JP 8226895A JP 22689596 A JP22689596 A JP 22689596A JP H1066566 A JPH1066566 A JP H1066566A
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- glutamic acid
- acid
- pyroglutamic
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- pyroglutamic acid
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 生産菌の細胞外に分泌されるＬ−グルタミン
酸・Ｌ−ピログルタミン酸相互変換酵素の提供。 【解決手段】 ストレプトマイセス属に属し、Ｌ−グル
タミン酸・Ｌ−ピログルタミン酸相互変換酵素を細胞外
に分泌することができる微生物により生産されるＬ−グ
ルタミン酸・Ｌ−ピログルタミン酸相互変換酵素、及び
その製造方法、並びにその利用方法。 【効果】 本酵素は細胞外に分泌されるため、その構製
が容易であり、また工業的大量生産に適する。
酸・Ｌ−ピログルタミン酸相互変換酵素の提供。 【解決手段】 ストレプトマイセス属に属し、Ｌ−グル
タミン酸・Ｌ−ピログルタミン酸相互変換酵素を細胞外
に分泌することができる微生物により生産されるＬ−グ
ルタミン酸・Ｌ−ピログルタミン酸相互変換酵素、及び
その製造方法、並びにその利用方法。 【効果】 本酵素は細胞外に分泌されるため、その構製
が容易であり、また工業的大量生産に適する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ストレプトミセス
属の生産する、Ｌ−ピログルタミン酸からＬ−グルタミ
ン酸を生成する反応（本明細書において、Ｌ−ピログル
タミン酸開環反応と称する場合がある）、及びその逆反
応（本明細書においてＬ−グルタミン酸閉環反応と称す
る場合がある）を触媒する酵素及びその製造方法に関す
る。
属の生産する、Ｌ−ピログルタミン酸からＬ−グルタミ
ン酸を生成する反応（本明細書において、Ｌ−ピログル
タミン酸開環反応と称する場合がある）、及びその逆反
応（本明細書においてＬ−グルタミン酸閉環反応と称す
る場合がある）を触媒する酵素及びその製造方法に関す
る。
【０００２】本発明の酵素は、Ｌ−ピログルタミン酸か
らのＬ−グルタミン酸の生成（たとえば食品中のＬ−ピ
ログルタミン酸をＬ−グルタミン酸に変換することによ
る食品のうまみの向上）、Ｌ−グルタミン酸からのＬ−
ピログルタミン酸の生成、これらの反応を利用したグル
タミン酸のラセミ体からＤ−及びＬ−グルタミン酸の単
離、ピログルタミン酸のラセミ体からＤ−及びＬ−ピロ
グルタミン酸の単離、試料中のＬ−ピログルタミン酸の
定量等において有用である。
らのＬ−グルタミン酸の生成（たとえば食品中のＬ−ピ
ログルタミン酸をＬ−グルタミン酸に変換することによ
る食品のうまみの向上）、Ｌ−グルタミン酸からのＬ−
ピログルタミン酸の生成、これらの反応を利用したグル
タミン酸のラセミ体からＤ−及びＬ−グルタミン酸の単
離、ピログルタミン酸のラセミ体からＤ−及びＬ−ピロ
グルタミン酸の単離、試料中のＬ−ピログルタミン酸の
定量等において有用である。
【０００３】
【従来の技術】味噌や醤油などの発酵食品において、Ｌ
−グルタミン酸やグルタミンは呈味上非常に重要なアミ
ノ酸である。しかしながら、発酵食品の熟成過程におい
て、これらのアミノ酸は、非酵素的に環化し、無味のピ
ログルタミン酸に変化してしまうことは周知の事実であ
る。従来、このような問題を解決する手段として、麹菌
グルタミナーゼの力価向上が行われている。しかしなが
ら、この方法は熟成中に生成するグルタミンを効率よく
グルタミン酸に変換し、ピログルタミン酸の生成を抑え
るものであり、一旦生成してしまったピログルタミン酸
には作用しないという欠点がある。
−グルタミン酸やグルタミンは呈味上非常に重要なアミ
ノ酸である。しかしながら、発酵食品の熟成過程におい
て、これらのアミノ酸は、非酵素的に環化し、無味のピ
ログルタミン酸に変化してしまうことは周知の事実であ
る。従来、このような問題を解決する手段として、麹菌
グルタミナーゼの力価向上が行われている。しかしなが
ら、この方法は熟成中に生成するグルタミンを効率よく
グルタミン酸に変換し、ピログルタミン酸の生成を抑え
るものであり、一旦生成してしまったピログルタミン酸
には作用しないという欠点がある。
【０００４】また、現在までに知られているピログルタ
ミン酸開環酵素としては５−オキソプロリナーゼ(EC 3.
5.2.9, A. Meister et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.
S.A., 68, 2982 (1971))があるが、この酵素はいずれも
ＡＴＰやマグネシウムやカリウムイオンに依存してお
り、ＡＴＰの再生などの問題から、食品のうまみを向上
させるには困難であるといえる。
ミン酸開環酵素としては５−オキソプロリナーゼ(EC 3.
5.2.9, A. Meister et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.
S.A., 68, 2982 (1971))があるが、この酵素はいずれも
ＡＴＰやマグネシウムやカリウムイオンに依存してお
り、ＡＴＰの再生などの問題から、食品のうまみを向上
させるには困難であるといえる。
【０００５】一方、食品のうまみ以外の分野でみると、
ピログルタミン酸は非常に毒性が少なく、様々な分野で
利用されている。例えば、化粧品の保湿剤として既に実
用化されている他、様々な有用物質の合成原料として使
用されている。また、医学的分野では学習能力を改善す
る(F. Drago et al., Acta Ther., 13, 587 (1987)）、
アルコールによる記憶の欠落を防止する（E. Sinforian
i et al., Minerva Psichiatr., 26, 339 (1985)) 、エ
タノールから肝臓を保護する（H. Geoffroy, Parfumeri
e und Kosmetik, 72, 94 (1991))他５０以上もの報告が
ある。
ピログルタミン酸は非常に毒性が少なく、様々な分野で
利用されている。例えば、化粧品の保湿剤として既に実
用化されている他、様々な有用物質の合成原料として使
用されている。また、医学的分野では学習能力を改善す
る(F. Drago et al., Acta Ther., 13, 587 (1987)）、
アルコールによる記憶の欠落を防止する（E. Sinforian
i et al., Minerva Psichiatr., 26, 339 (1985)) 、エ
タノールから肝臓を保護する（H. Geoffroy, Parfumeri
e und Kosmetik, 72, 94 (1991))他５０以上もの報告が
ある。
【０００６】また、ピログルタミン酸は有用なカチオン
のキャリアーとしても使用可能である（H. Geoffroy, P
arfumerie und Kosmetik, 72, 94 (1991), P. Binet et
al., Therapie, 33, 491 (1978)) 。従来、ピログルタ
ミン酸の製造方法はＬ−グルタミン酸を酸性条件下で１
７５℃に加熱脱水することにより行われる。しかしなが
ら、この製造法は加熱温度が１７５℃と非常に高温高圧
で、さらに酸性条件下であるため危険が伴うと同時に、
それに見合った特殊な反応槽が必要となる。また、反応
産物が一部ラセミ化してしまうため、純粋なＬ体を得る
のは困難である。
のキャリアーとしても使用可能である（H. Geoffroy, P
arfumerie und Kosmetik, 72, 94 (1991), P. Binet et
al., Therapie, 33, 491 (1978)) 。従来、ピログルタ
ミン酸の製造方法はＬ−グルタミン酸を酸性条件下で１
７５℃に加熱脱水することにより行われる。しかしなが
ら、この製造法は加熱温度が１７５℃と非常に高温高圧
で、さらに酸性条件下であるため危険が伴うと同時に、
それに見合った特殊な反応槽が必要となる。また、反応
産物が一部ラセミ化してしまうため、純粋なＬ体を得る
のは困難である。
【０００７】ピログルタミン酸を生成する酵素は現在ま
でにＤ−グルタミン酸サイクラーゼ(A. Meister et a
l., Biochem. Z, 338, 217 (1963)) 、グルタミンシン
セターゼ（A. Meister et al., J. Biol. Chem., 237,
2932 (1962))、γ−グルタミルサイクロトランスフェラ
ーゼ（A. Meister et al., J. Biol. Chem., 253, 1799
(1978))、等が知られているが、上述のＬ−ピログルタ
ミン酸を工業的に生産するにはＤ−グルタミン酸サイク
ラーゼはその基質特異性、グルタミンシンセターゼはそ
のＡＴＰ依存性、γ−グルタミルサイクロトランスフェ
ラーゼは基質が高価であるなどの問題点がある。一方、
Ｄ−グルタミン酸やＤ−ピログルタミン酸は薬品や食品
添加物、農薬の生成における重要な出発物質である。し
かしながら、その製造工程には有機合成やラセミ体の分
割等が必要であるため、Ｌ−体やラセミ体と比較して、
高価である。
でにＤ−グルタミン酸サイクラーゼ(A. Meister et a
l., Biochem. Z, 338, 217 (1963)) 、グルタミンシン
セターゼ（A. Meister et al., J. Biol. Chem., 237,
2932 (1962))、γ−グルタミルサイクロトランスフェラ
ーゼ（A. Meister et al., J. Biol. Chem., 253, 1799
(1978))、等が知られているが、上述のＬ−ピログルタ
ミン酸を工業的に生産するにはＤ−グルタミン酸サイク
ラーゼはその基質特異性、グルタミンシンセターゼはそ
のＡＴＰ依存性、γ−グルタミルサイクロトランスフェ
ラーゼは基質が高価であるなどの問題点がある。一方、
Ｄ−グルタミン酸やＤ−ピログルタミン酸は薬品や食品
添加物、農薬の生成における重要な出発物質である。し
かしながら、その製造工程には有機合成やラセミ体の分
割等が必要であるため、Ｌ−体やラセミ体と比較して、
高価である。
【０００８】
【関連技術】本発明者らは、前述の課題を解決すべく、
Ｌ−グルタミン酸・Ｌ−ピログルタミン酸相互変換酵素
を鋭意探索した結果、アルカリゲネス属、シュウドモナ
ス属に属する細菌が該酵素を菌体内に生成蓄積すること
を見いだした（特願平７−１５５９８８）。しかしなが
ら、該菌株は菌体内に酵素を生成蓄積するため、それに
伴う種々の限界が存在する。
Ｌ−グルタミン酸・Ｌ−ピログルタミン酸相互変換酵素
を鋭意探索した結果、アルカリゲネス属、シュウドモナ
ス属に属する細菌が該酵素を菌体内に生成蓄積すること
を見いだした（特願平７−１５５９８８）。しかしなが
ら、該菌株は菌体内に酵素を生成蓄積するため、それに
伴う種々の限界が存在する。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、菌
体外に分泌される、Ｌ−ピログルタミン酸を加水分解し
てＬ−グルタミン酸に開環する反応及びＬ−グルタミン
酸を脱水縮合により閉環してＬ−ピログルタミン酸を生
成せしめる反応（可逆反応）を触媒する新規な酵素及び
その製造方法を提供するものである。
体外に分泌される、Ｌ−ピログルタミン酸を加水分解し
てＬ−グルタミン酸に開環する反応及びＬ−グルタミン
酸を脱水縮合により閉環してＬ−ピログルタミン酸を生
成せしめる反応（可逆反応）を触媒する新規な酵素及び
その製造方法を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
め、本発明は、次の性質： （１）作用：Ｌ−ピログルタミン酸からＬ−グルタミン
酸を生成する反応（Ｌ−ピログルタミン酸開環反応）、
及びこの逆反応（Ｌ−グルタミン酸閉環反応）を触媒す
る； （２）基質特異性：Ｌ−ピログルタミン酸開環反応：Ｌ
−ピログルタミン酸に作用し、Ｄ−ピログルタミン酸、
プロリン及びヒドロキシプロリンには作用しない；Ｌ−
グルタミン酸閉環反応：Ｌ−グルタミン酸に作用し、Ｄ
−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン
酸、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギンには作用し
ない；
め、本発明は、次の性質： （１）作用：Ｌ−ピログルタミン酸からＬ−グルタミン
酸を生成する反応（Ｌ−ピログルタミン酸開環反応）、
及びこの逆反応（Ｌ−グルタミン酸閉環反応）を触媒す
る； （２）基質特異性：Ｌ−ピログルタミン酸開環反応：Ｌ
−ピログルタミン酸に作用し、Ｄ−ピログルタミン酸、
プロリン及びヒドロキシプロリンには作用しない；Ｌ−
グルタミン酸閉環反応：Ｌ−グルタミン酸に作用し、Ｄ
−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン
酸、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギンには作用し
ない；
【００１１】（３）至適pH及び安定pH範囲：Ｌ−ピログ
ルタミン酸開環反応：至適pHは３０℃にて３０分間の反
応においては約７であり、pH安定性は３０℃にて１２０
分間の処理条件では約７〜１０の範囲内で安定である；
Ｌ−グルタミン酸閉環反応：至適pHは３０℃にて３０分
間の反応において約７であり、pH安定性は３０℃にて１
２０分間の処理条件では７〜１０の範囲内で安定であ
る；
ルタミン酸開環反応：至適pHは３０℃にて３０分間の反
応においては約７であり、pH安定性は３０℃にて１２０
分間の処理条件では約７〜１０の範囲内で安定である；
Ｌ−グルタミン酸閉環反応：至適pHは３０℃にて３０分
間の反応において約７であり、pH安定性は３０℃にて１
２０分間の処理条件では７〜１０の範囲内で安定であ
る；
【００１２】（４）温度安定性：Ｌ−ピログルタミン酸
開環反応：pH７にて３０分間の処理条件下では５０℃ま
で安定である；Ｌ−グルタミン酸閉環反応；pH７にて３
０分間の処理条件下では５０℃まで安定である； （５）至適温度：Ｌ−ピログルタミン酸開環反応：約５
０℃に至適作用温度を有する；Ｌ−グルタミン酸閉環反
応：約５０℃に至適作用温度を有する； （６）分子量：ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量
約３８，０００を有する；を有するＬ−グルタミン酸・
Ｌ−ピログルタミン酸相互変換酵素を提供する。
開環反応：pH７にて３０分間の処理条件下では５０℃ま
で安定である；Ｌ−グルタミン酸閉環反応；pH７にて３
０分間の処理条件下では５０℃まで安定である； （５）至適温度：Ｌ−ピログルタミン酸開環反応：約５
０℃に至適作用温度を有する；Ｌ−グルタミン酸閉環反
応：約５０℃に至適作用温度を有する； （６）分子量：ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量
約３８，０００を有する；を有するＬ−グルタミン酸・
Ｌ−ピログルタミン酸相互変換酵素を提供する。
【００１３】本発明はまた前記のＬ−グルタミン酸・Ｌ
−ピログルタミン酸相互変換酵素の製造方法において、
該酵素を生産する能力を有するストレプトミセス属に属
する微生物を培養し、該培養物から該酵素を採取するこ
とを特徴とする方法を提供する。本発明はさらに、前記
の酵素をＬ−グルタミン酸とＤ−グルタミン酸との混合
物に作用させることにより該Ｌ−グルタミン酸をＬ−ピ
ログルタミン酸に変換し、そして該Ｌ−ピログルタミン
酸と前記Ｄ−グルタミン酸とを相互に分離することを特
徴とするＤ−グルタミン酸又はＬ−ピログルタミン酸の
製造法を提供する。
−ピログルタミン酸相互変換酵素の製造方法において、
該酵素を生産する能力を有するストレプトミセス属に属
する微生物を培養し、該培養物から該酵素を採取するこ
とを特徴とする方法を提供する。本発明はさらに、前記
の酵素をＬ−グルタミン酸とＤ−グルタミン酸との混合
物に作用させることにより該Ｌ−グルタミン酸をＬ−ピ
ログルタミン酸に変換し、そして該Ｌ−ピログルタミン
酸と前記Ｄ−グルタミン酸とを相互に分離することを特
徴とするＤ−グルタミン酸又はＬ−ピログルタミン酸の
製造法を提供する。
【００１４】本発明はさらに、前記の酵素を、Ｌ−ピロ
グルタミン酸とＤ−ピログルタミン酸との混合物に作用
せしめることにより該Ｌ−ピログルタミン酸をＬ−グル
タミン酸に転換し、そして生成したＬ−グルタミン酸と
残留するＤ−ピログルタミン酸とを相互に分離すること
を特徴とする、Ｄ−ピログルタミン酸の製造方法を提供
する。本発明はまた、前記の酵素を、Ｌ−グルタミン酸
に作用せしめることを特徴とするＬ−ピログルタミン酸
の製造方法を提供する。
グルタミン酸とＤ−ピログルタミン酸との混合物に作用
せしめることにより該Ｌ−ピログルタミン酸をＬ−グル
タミン酸に転換し、そして生成したＬ−グルタミン酸と
残留するＤ−ピログルタミン酸とを相互に分離すること
を特徴とする、Ｄ−ピログルタミン酸の製造方法を提供
する。本発明はまた、前記の酵素を、Ｌ−グルタミン酸
に作用せしめることを特徴とするＬ−ピログルタミン酸
の製造方法を提供する。
【００１５】本発明の酵素は次の性質を有するＬ−グル
タミン酸・Ｌ−ピログルタミン酸相互変換酵素である。 （１）作用：Ｌ−ピログルタミン酸に作用しＬ−グルタ
ミン酸を生成する反応（Ｌ−ピログルタミン酸開環反
応）、及びこの逆反応（Ｌ−グルタミン酸閉環反応）を
触媒する； （２）基質特異性：Ｌ−ピログルタミン酸開環反応：Ｌ
−ピログルタミン酸に作用し、Ｄ−ピログルタミン酸、
プロリン及びヒドロキシプロリンには作用しない；Ｌ−
グルタミン酸閉環反応：Ｌ−グルタミン酸に作用し、Ｄ
−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン
酸、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギンには作用し
ない；
タミン酸・Ｌ−ピログルタミン酸相互変換酵素である。 （１）作用：Ｌ−ピログルタミン酸に作用しＬ−グルタ
ミン酸を生成する反応（Ｌ−ピログルタミン酸開環反
応）、及びこの逆反応（Ｌ−グルタミン酸閉環反応）を
触媒する； （２）基質特異性：Ｌ−ピログルタミン酸開環反応：Ｌ
−ピログルタミン酸に作用し、Ｄ−ピログルタミン酸、
プロリン及びヒドロキシプロリンには作用しない；Ｌ−
グルタミン酸閉環反応：Ｌ−グルタミン酸に作用し、Ｄ
−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン
酸、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギンには作用し
ない；
【００１６】（３）至適pH及び安定pH範囲：Ｌ−ピログ
ルタミン酸開環反応：至適pHは３０℃にて３０分間の反
応においては約７であり、３０℃にて１２０分間の処理
の条件では約７〜１０の範囲内で安定である；Ｌ−グル
タミン酸閉環反応：至適pHは３０℃にて３０分間の反応
において約７であり、３０℃にて１２０分間の処理条件
では７−１０の範囲内で安定である； （４）温度安定性：Ｌ−ピログルタミン酸開環反応：pH
７にて３０分間の処理条件下では５０℃まで安定であ
る；Ｌ−グルタミン酸閉環反応；pH７にて３０分間の処
理条件下では５０℃まで安定である；
ルタミン酸開環反応：至適pHは３０℃にて３０分間の反
応においては約７であり、３０℃にて１２０分間の処理
の条件では約７〜１０の範囲内で安定である；Ｌ−グル
タミン酸閉環反応：至適pHは３０℃にて３０分間の反応
において約７であり、３０℃にて１２０分間の処理条件
では７−１０の範囲内で安定である； （４）温度安定性：Ｌ−ピログルタミン酸開環反応：pH
７にて３０分間の処理条件下では５０℃まで安定であ
る；Ｌ−グルタミン酸閉環反応；pH７にて３０分間の処
理条件下では５０℃まで安定である；
【００１７】（５）至適温度：Ｌ−ピログルタミン酸開
環反応：約５０℃に至適作用温度を有する；Ｌ−グルタ
ミン酸閉環反応：約５０℃に至適作用温度を有する； （６）分子量：ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量
約３８，０００を有する； （７）等電点：７〜８である； （８）ＡＴＰやＭｇ2+，Ｋ+ に対して非依存性である； （９）菌体外分泌型酵素である。
環反応：約５０℃に至適作用温度を有する；Ｌ−グルタ
ミン酸閉環反応：約５０℃に至適作用温度を有する； （６）分子量：ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量
約３８，０００を有する； （７）等電点：７〜８である； （８）ＡＴＰやＭｇ2+，Ｋ+ に対して非依存性である； （９）菌体外分泌型酵素である。
【００１８】本発明の酵素はストレプトミセス属に属
し、前記の酵素を生産する能力を有するものであればい
ずれも使用することができる。本発明において使用する
好ましい菌株の一例として本発明者らにより土壌より新
しく分離された菌株ストレプトミセスＳＹ−６及びスト
レプトミセスＳＹ−１６４を挙げることができる。この
微生物は、工業技術院生命工学工学技術研究所にそれぞ
れＦＥＲＭ Ｐ−１５４２９及びＦＥＲＭ Ｐ−１５４
３０として寄託されている。ストレプトミセスＳＹ−６
及びストレプトミセスＳＹ−１６４は次の性質を有す
る。
し、前記の酵素を生産する能力を有するものであればい
ずれも使用することができる。本発明において使用する
好ましい菌株の一例として本発明者らにより土壌より新
しく分離された菌株ストレプトミセスＳＹ−６及びスト
レプトミセスＳＹ−１６４を挙げることができる。この
微生物は、工業技術院生命工学工学技術研究所にそれぞ
れＦＥＲＭ Ｐ−１５４２９及びＦＥＲＭ Ｐ−１５４
３０として寄託されている。ストレプトミセスＳＹ−６
及びストレプトミセスＳＹ−１６４は次の性質を有す
る。
【００１９】ミクロ形態学 ＳＹ−６の胞子は気生菌糸上に分岐した輪生枝状の短い
直状の連鎖として生成する（１連鎖当たり最高１０胞
子）。胞子は、滑らかな表面を有する。ＳＹ−１６４の
胞子は形成されない。細胞壁組成 ＳＹ−６及びＳＹ−１６４の培養物の細胞壁加水分解物
は、ともにＬＬ−ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）を含有
する。メナキノン成分 ＳＹ−６及びＳＹ−１６４ともにメナキノン成分とし
て、ＭＫ−９（Ｈ６）、ＭＫ−９（Ｈ８）を持つ。
直状の連鎖として生成する（１連鎖当たり最高１０胞
子）。胞子は、滑らかな表面を有する。ＳＹ−１６４の
胞子は形成されない。細胞壁組成 ＳＹ−６及びＳＹ−１６４の培養物の細胞壁加水分解物
は、ともにＬＬ−ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）を含有
する。メナキノン成分 ＳＹ−６及びＳＹ−１６４ともにメナキノン成分とし
て、ＭＫ−９（Ｈ６）、ＭＫ−９（Ｈ８）を持つ。
【００２０】成長の量 ＳＹ−６では良好な成長は、グルコース・アスパラギン
寒天培地、グリセリン・アスパラギン寒天培地、スター
チ寒天培地、チロシン寒天培地、栄養寒天培地、イース
ト・麦芽寒天培地、及びオートミール寒天培地上で認め
られ、中程度の成長はシュクロース・硝酸塩寒天培地上
で認められる。ＳＹ−１６４では良好な成長は、グルコ
ース・アスパラギン寒天培地、スターチ寒天培地、チロ
シン寒天培地、イースト・麦芽寒天培地、及びオートミ
ール寒天培地上で認められ、中程度の成長はグリセリン
・アスパラギン寒天培地で認められ、不十分な成長はシ
ュクロース・硝酸塩寒天培地、及び栄養寒天培地上で認
められる。
寒天培地、グリセリン・アスパラギン寒天培地、スター
チ寒天培地、チロシン寒天培地、栄養寒天培地、イース
ト・麦芽寒天培地、及びオートミール寒天培地上で認め
られ、中程度の成長はシュクロース・硝酸塩寒天培地上
で認められる。ＳＹ−１６４では良好な成長は、グルコ
ース・アスパラギン寒天培地、スターチ寒天培地、チロ
シン寒天培地、イースト・麦芽寒天培地、及びオートミ
ール寒天培地上で認められ、中程度の成長はグリセリン
・アスパラギン寒天培地で認められ、不十分な成長はシ
ュクロース・硝酸塩寒天培地、及び栄養寒天培地上で認
められる。
【００２１】栄養菌糸 ＳＹ−６では良好な成長が生じる培地上では、栄養菌糸
の盛り上がりが認められ、黄色がかった灰色の色調を有
している。また、ＳＹ−１６４では良好な成長が生じる
培地上では、栄養菌糸の盛り上がりが認められ、褐色の
色調を有している。気生菌糸及び胞子の色 ＳＹ−６では気生菌糸及び／又は胞子体の色は白乃至淡
灰色であり、ＳＹ−１６４の気生菌糸は白色である。
の盛り上がりが認められ、黄色がかった灰色の色調を有
している。また、ＳＹ−１６４では良好な成長が生じる
培地上では、栄養菌糸の盛り上がりが認められ、褐色の
色調を有している。気生菌糸及び胞子の色 ＳＹ−６では気生菌糸及び／又は胞子体の色は白乃至淡
灰色であり、ＳＹ−１６４の気生菌糸は白色である。
【００２２】可溶性色素 ＳＹ−６ではグルコース・アスパラギン寒天培地、スタ
ーチ寒天培地及びオートミール寒天培地では淡い黄色色
素、グリセリン・アスパラギン寒天培地では淡い橙色の
色素が生産される。ＳＹ−１６４ではグリセリン・アス
パラギン寒天培地、チロシン寒天培地及びイースト・麦
芽寒天培地上では褐色の色素、スター寒天培地上では淡
い緑色色素、オートミール寒天培地上では緑色がかった
褐色色素が生産される。
ーチ寒天培地及びオートミール寒天培地では淡い黄色色
素、グリセリン・アスパラギン寒天培地では淡い橙色の
色素が生産される。ＳＹ−１６４ではグリセリン・アス
パラギン寒天培地、チロシン寒天培地及びイースト・麦
芽寒天培地上では褐色の色素、スター寒天培地上では淡
い緑色色素、オートミール寒天培地上では緑色がかった
褐色色素が生産される。
【００２３】生理学的反応 生育温度範囲；ＳＹ−６では１０℃から４０℃の間で生
育し、１８℃から３３℃の間で良好な生育を示す。；Ｓ
Ｙ−１６４では１０℃から４５℃の間で生育し、２０℃
から３４℃の間で良好な生育を示す；ＳＹ−６及びＳＹ
−１６４ともにゼラチンの液化はなし：ＳＹ−６ではス
ターチの強い加水分解、ＳＹ−１６４では弱い加水分
解：ＳＹ−６ではペプトン・イースト・鉄寒天培地（Ｉ
ＳＰ培地 No.６）及びチロシン寒天培地（ＩＳＰ培地 N
o.７）上ではメラニン様色素生産あり、またＳＹ−１６
４ではペプトン・イースト・鉄寒天培地（ＩＳＰ培地 N
o.６）及びチロシン寒天培地（ＩＳＰ培地 No.７）上で
はメラニン様色素生産あり；各炭素源の同化性：ＳＹ−
６では、グルコースの良好な利用；イノシトールの中程
度の利用；Ｄ−フラクトースの不十分な利用；Ｌ−アラ
ビノース、Ｄ−キシロース、シュクロース、Ｌ−ラムノ
ース、ラフィノース、Ｄ−マンニットの利用はない。Ｓ
Ｙ−１６４では、グルコースの中程度の利用；Ｌ−アラ
ビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−フラクトース、シュク
ロース、イノシトール、Ｌ−ラムノース、ラフィノー
ス、Ｄ−マンニットの利用なし。各種培地における培養性状
育し、１８℃から３３℃の間で良好な生育を示す。；Ｓ
Ｙ−１６４では１０℃から４５℃の間で生育し、２０℃
から３４℃の間で良好な生育を示す；ＳＹ−６及びＳＹ
−１６４ともにゼラチンの液化はなし：ＳＹ−６ではス
ターチの強い加水分解、ＳＹ−１６４では弱い加水分
解：ＳＹ−６ではペプトン・イースト・鉄寒天培地（Ｉ
ＳＰ培地 No.６）及びチロシン寒天培地（ＩＳＰ培地 N
o.７）上ではメラニン様色素生産あり、またＳＹ−１６
４ではペプトン・イースト・鉄寒天培地（ＩＳＰ培地 N
o.６）及びチロシン寒天培地（ＩＳＰ培地 No.７）上で
はメラニン様色素生産あり；各炭素源の同化性：ＳＹ−
６では、グルコースの良好な利用；イノシトールの中程
度の利用；Ｄ−フラクトースの不十分な利用；Ｌ−アラ
ビノース、Ｄ−キシロース、シュクロース、Ｌ−ラムノ
ース、ラフィノース、Ｄ−マンニットの利用はない。Ｓ
Ｙ−１６４では、グルコースの中程度の利用；Ｌ−アラ
ビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−フラクトース、シュク
ロース、イノシトール、Ｌ−ラムノース、ラフィノー
ス、Ｄ−マンニットの利用なし。各種培地における培養性状
【００２４】
【表１】
【００２５】
【表２】
【００２６】ＳＹ−６及びＳＹ−１６４の分類学的特性 “BERGEY'S MANUAL OF Systematic Bacteriology Vol.4
（1989）”、及び“放線菌の同定実験法”、日本放線菌
学会編（1988）、H.Nonomuraの“Key for Classificati
on and Identification of 458 Species of the Strept
omycetes Included in ISP”、J.Ferment.Technol., Vo
l.52, No.2, p.78〜92,1974 、に準拠して、SY-6及びSY
-164の培養、生理学及び形態学的特徴について観察を行
った結果から以下のように同定された。SY-6では輪生状
の胞子連鎖が観察され、また、DAP の立体異性型ならび
にメナキノンの分子種からStreptoverticillium 属に分
類された。しかしながら、International Journal of S
ystematic Bacteriologyでは、Streptoverticillium 属
はStreptomyces属に統合されたため、SY-6株をStreptom
yces属であると同定した。SY-164では胞子形成が観察さ
れなかったが、DAP の立体異性型ならびにメナキノンの
分子種からSY-164はStreptomyces属と同定された。ＳＹ
−６及びＳＹ−１６４株は上に示すような特徴を有し、
ストレプトミセス属と同定される。
（1989）”、及び“放線菌の同定実験法”、日本放線菌
学会編（1988）、H.Nonomuraの“Key for Classificati
on and Identification of 458 Species of the Strept
omycetes Included in ISP”、J.Ferment.Technol., Vo
l.52, No.2, p.78〜92,1974 、に準拠して、SY-6及びSY
-164の培養、生理学及び形態学的特徴について観察を行
った結果から以下のように同定された。SY-6では輪生状
の胞子連鎖が観察され、また、DAP の立体異性型ならび
にメナキノンの分子種からStreptoverticillium 属に分
類された。しかしながら、International Journal of S
ystematic Bacteriologyでは、Streptoverticillium 属
はStreptomyces属に統合されたため、SY-6株をStreptom
yces属であると同定した。SY-164では胞子形成が観察さ
れなかったが、DAP の立体異性型ならびにメナキノンの
分子種からSY-164はStreptomyces属と同定された。ＳＹ
−６及びＳＹ−１６４株は上に示すような特徴を有し、
ストレプトミセス属と同定される。
【００２７】本発明の微生物を培養する場合、培地は炭
素源としてはシュクロース、グルコース、フラクトー
ス、イノシトール、可溶性デンプンなどの糖質、酢酸、
クエン酸、リンゴ酸などの有機酸、炭化水素などが使用
可能であり、窒素源としては肉エキス、ペプトン、ピロ
グルタミン酸及び硫安、アンモニアなどの有機及び無機
窒素源を用いる。更に、リン酸第一カリウム、リン酸第
二カリウムなどのリン酸塩、硫酸マグネシウム、塩化マ
グネシウムなどのマグネシウム塩、鉄、マンガン、亜
鉛、カルシウム等の金属イオン及び各々の菌株の生育に
必要な微量物質等を適量添加したものが使用される。
素源としてはシュクロース、グルコース、フラクトー
ス、イノシトール、可溶性デンプンなどの糖質、酢酸、
クエン酸、リンゴ酸などの有機酸、炭化水素などが使用
可能であり、窒素源としては肉エキス、ペプトン、ピロ
グルタミン酸及び硫安、アンモニアなどの有機及び無機
窒素源を用いる。更に、リン酸第一カリウム、リン酸第
二カリウムなどのリン酸塩、硫酸マグネシウム、塩化マ
グネシウムなどのマグネシウム塩、鉄、マンガン、亜
鉛、カルシウム等の金属イオン及び各々の菌株の生育に
必要な微量物質等を適量添加したものが使用される。
【００２８】培養は振盪培養または通気撹拌培養等の条
件下で実施される。培養温度は２０〜４０℃、好ましく
は２５〜３７℃、pH５．０〜８．０、好ましくはpH７．
０〜８．０で行う。培養時間は通常１３〜７２時間であ
る。上記方法で培養した培養上清及び菌体にはＬ−グル
タミン酸・Ｌ−ピログルタミン酸相互変換酵素が生産さ
れている。この酵素の精製は、硫安塩析、イオン交換ク
ロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過
法、もしくはそれらを組み合わせに付して分離、採取す
ることにより精製される。
件下で実施される。培養温度は２０〜４０℃、好ましく
は２５〜３７℃、pH５．０〜８．０、好ましくはpH７．
０〜８．０で行う。培養時間は通常１３〜７２時間であ
る。上記方法で培養した培養上清及び菌体にはＬ−グル
タミン酸・Ｌ−ピログルタミン酸相互変換酵素が生産さ
れている。この酵素の精製は、硫安塩析、イオン交換ク
ロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過
法、もしくはそれらを組み合わせに付して分離、採取す
ることにより精製される。
【００２９】なお、Ｌ−グルタミン酸閉環反応の活性測
定法ならびに活性表示法は以下の通りである。すなわ
ち、０．１２ＭＬ−グルタミン酸０．５ml，０．４Ｍト
リス塩酸緩衝（pH７．０）０．４５ml、酵素液５０μｌ
を混合し、３０℃、３０分間放置する。その後、１００
℃、１０分間熱処理を行い酵素を失活させた後、Ｓｈｉ
ｍ−ｐａｃｋ ＳＣＲ−１０１Ｈ（島津製）を用いたＨ
ＰＬＣにより生成したピログルタミン酸の定量を行う。
また、酵素活性の単位は前述の条件下で１分間に１μmo
l のピログルタミン酸を生成するのに必要な酵素量を１
単位として表示する。また、ピログルタミン酸開環反応
の活性測定法ならびに活性の表示法は以下のとおりであ
る。
定法ならびに活性表示法は以下の通りである。すなわ
ち、０．１２ＭＬ−グルタミン酸０．５ml，０．４Ｍト
リス塩酸緩衝（pH７．０）０．４５ml、酵素液５０μｌ
を混合し、３０℃、３０分間放置する。その後、１００
℃、１０分間熱処理を行い酵素を失活させた後、Ｓｈｉ
ｍ−ｐａｃｋ ＳＣＲ−１０１Ｈ（島津製）を用いたＨ
ＰＬＣにより生成したピログルタミン酸の定量を行う。
また、酵素活性の単位は前述の条件下で１分間に１μmo
l のピログルタミン酸を生成するのに必要な酵素量を１
単位として表示する。また、ピログルタミン酸開環反応
の活性測定法ならびに活性の表示法は以下のとおりであ
る。
【００３０】すなわち、タイタープレート上で酵素液１
０μｌ、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（pH７．０）４０μ
ｌ、１％ピログルタミン酸（pH７．０）５０μｌを混合
し、３０℃、３０分間放置する。反応液に７．５mM Ｎ
ＡＤ、１．２mM ＩＮＴ、１．５Ｕディアフォラーゼ、
１％トリトンＸ−１００を含む０．２Ｍトリエタノール
アミン緩衝液（pH８．６）１００μｌとグルタミン酸脱
水素酵素６Ｕを加え、室温で１５分放置する。その後、
４９２nmの吸光度を測定することによって生成したグル
タミン酸を定量する。また、酵素活性の単位は前述の条
件下で１分間に１μmol のグルタミン酸を生成するのに
必要な酵素量として表示する。
０μｌ、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（pH７．０）４０μ
ｌ、１％ピログルタミン酸（pH７．０）５０μｌを混合
し、３０℃、３０分間放置する。反応液に７．５mM Ｎ
ＡＤ、１．２mM ＩＮＴ、１．５Ｕディアフォラーゼ、
１％トリトンＸ−１００を含む０．２Ｍトリエタノール
アミン緩衝液（pH８．６）１００μｌとグルタミン酸脱
水素酵素６Ｕを加え、室温で１５分放置する。その後、
４９２nmの吸光度を測定することによって生成したグル
タミン酸を定量する。また、酵素活性の単位は前述の条
件下で１分間に１μmol のグルタミン酸を生成するのに
必要な酵素量として表示する。
【００３１】本発明の酵素は、Ｌ−グルタミン酸からＬ
−ピログルタミン酸を生成するために使用することがで
きる。従って、本発明は、本発明の酵素をＬ−グルタミ
ン酸に作用せしめることを特徴とするＬ−ピログルタミ
ン酸の製造または生成法を提供する。
−ピログルタミン酸を生成するために使用することがで
きる。従って、本発明は、本発明の酵素をＬ−グルタミ
ン酸に作用せしめることを特徴とするＬ−ピログルタミ
ン酸の製造または生成法を提供する。
【００３２】また、本発明の酵素はＬ−ピログルタミン
酸とＤ−ピログルタミン酸の混合物（例えばラセミ体）
からＤ−ピログルタミン酸を分割するために使用でき
る。従って、本発明は、本発明の酵素をＬ−ピログルタ
ミン酸とＤ−ピログルタミン酸の混合物（例えばラセミ
体）に作用せしめることを特徴とするＤ−ピログルタミ
ン酸の製造または生成方法を提供する。例えば、Ｌ−ピ
ログルタミン酸とＤ−ピログルタミン酸の混合物（例え
ばラセミ体）中のＬ−ピログルタミン酸をＬ−グルタミ
ン酸に変換し、生成したＤ−ピログルタミン酸とＬ−グ
ルタミン酸を常法に従って相互に分離し、Ｄ−ピログル
タミン酸を得ることができる。
酸とＤ−ピログルタミン酸の混合物（例えばラセミ体）
からＤ−ピログルタミン酸を分割するために使用でき
る。従って、本発明は、本発明の酵素をＬ−ピログルタ
ミン酸とＤ−ピログルタミン酸の混合物（例えばラセミ
体）に作用せしめることを特徴とするＤ−ピログルタミ
ン酸の製造または生成方法を提供する。例えば、Ｌ−ピ
ログルタミン酸とＤ−ピログルタミン酸の混合物（例え
ばラセミ体）中のＬ−ピログルタミン酸をＬ−グルタミ
ン酸に変換し、生成したＤ−ピログルタミン酸とＬ−グ
ルタミン酸を常法に従って相互に分離し、Ｄ−ピログル
タミン酸を得ることができる。
【００３３】本発明の酵素はまた、Ｌ−グルタミン酸と
Ｄ−グルタミン酸の混合物（例えばラセミ体）を分割す
るためにも用いることができる。例えば、Ｌ−グルタミ
ン酸とＤ−グルタミン酸の混合物に本発明の酵素を作用
せしめることにより、Ｌ−グルタミン酸のみを特異的に
Ｌ−ピログルタミン酸に変換し、Ｄ−グルタミン酸とＬ
−ピログルタミン酸とを容易に分離し、Ｄ−グルタミン
酸を得ることができる。原料となるＬ−グルタミン酸と
Ｄ−グルタミン酸との混合物（例えばラセミ体）は合成
法や酵素法など様々な方法で製造可能であり、これらに
ついて限定されるものではない。
Ｄ−グルタミン酸の混合物（例えばラセミ体）を分割す
るためにも用いることができる。例えば、Ｌ−グルタミ
ン酸とＤ−グルタミン酸の混合物に本発明の酵素を作用
せしめることにより、Ｌ−グルタミン酸のみを特異的に
Ｌ−ピログルタミン酸に変換し、Ｄ−グルタミン酸とＬ
−ピログルタミン酸とを容易に分離し、Ｄ−グルタミン
酸を得ることができる。原料となるＬ−グルタミン酸と
Ｄ−グルタミン酸との混合物（例えばラセミ体）は合成
法や酵素法など様々な方法で製造可能であり、これらに
ついて限定されるものではない。
【００３４】
【実施例】次に実施例により本発明を更に具体的に説明
する。実施例１ ．種菌としてストレプトミセスＳＹ−６を使用
した。肉エキス１０ｇ／ｌ、ポリペプトン１０ｇ／ｌ、
グルコース１０ｇ／ｌ、ＮａＣｌ３ｇ／ｌ及びアデカノ
ール０．１５ｇ／ｌ（pH７．０）を含有する培地８mlを
内径２２mmの試験管に入れ、１２０℃にて１５分殺菌し
た。上記培地に前記菌株を１白金耳接種し、３０℃で４
８時間振盪培養した。培養終了後、培養液０．５mlを上
記培地１００mlの入った５００ml容坂口フラスコ３本に
接種し、３０℃、４８時間振盪培養した。培養終了後、
培養液のすべてを５０ｌ容ジャーファーメンター中の本
培養液３０ｌに接種した。本培養は３０℃、３００rpm
／分、通気量１ｌ／培地１ｌ・１分間で３０時間実施し
た。
する。実施例１ ．種菌としてストレプトミセスＳＹ−６を使用
した。肉エキス１０ｇ／ｌ、ポリペプトン１０ｇ／ｌ、
グルコース１０ｇ／ｌ、ＮａＣｌ３ｇ／ｌ及びアデカノ
ール０．１５ｇ／ｌ（pH７．０）を含有する培地８mlを
内径２２mmの試験管に入れ、１２０℃にて１５分殺菌し
た。上記培地に前記菌株を１白金耳接種し、３０℃で４
８時間振盪培養した。培養終了後、培養液０．５mlを上
記培地１００mlの入った５００ml容坂口フラスコ３本に
接種し、３０℃、４８時間振盪培養した。培養終了後、
培養液のすべてを５０ｌ容ジャーファーメンター中の本
培養液３０ｌに接種した。本培養は３０℃、３００rpm
／分、通気量１ｌ／培地１ｌ・１分間で３０時間実施し
た。
【００３５】培養終了液３０ｌから酵素を採取するた
め、該液を遠心分離（１５，０００rpm シャープレスＡ
Ｓ−１６（巴工業）２０℃）して培養上清３８ｌを得
た。この培養上清に硫酸アンモニウムを添加して８０％
飽和硫安沈殿画分を得た。この沈殿を０．１Ｍトリス塩
酸緩衝液（pH７．０）３ｌに溶解した。得られた溶液に
硫酸アンモニウムを２５％飽和になるように添加し、２
５％飽和硫酸アンモニウムを含む０．０５Ｍトリス塩酸
緩衝液（pH７．０）で平衡化させたブチルトヨパール６
５０Ｃに吸着させ、同緩衝液で洗い、２０％飽和硫酸ア
ンモニウムを含む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（pH７．
０）で溶出させた。活性画分を５mMトリス塩酸緩衝液
（pH８．０）に対して透析した。透析内液を０．０２Ｍ
トリス塩酸緩衝液（pH８．０）で平衡化したＤＥＡＥト
ヨパール６５０Ｍに吸着させ、同緩衝液で洗い、０→
０．１５Ｍ ＮａＣｌグラジェントで溶出した。活性画
分を５mMトリス塩酸緩衝液（pH７．０）に対して透析し
た。
め、該液を遠心分離（１５，０００rpm シャープレスＡ
Ｓ−１６（巴工業）２０℃）して培養上清３８ｌを得
た。この培養上清に硫酸アンモニウムを添加して８０％
飽和硫安沈殿画分を得た。この沈殿を０．１Ｍトリス塩
酸緩衝液（pH７．０）３ｌに溶解した。得られた溶液に
硫酸アンモニウムを２５％飽和になるように添加し、２
５％飽和硫酸アンモニウムを含む０．０５Ｍトリス塩酸
緩衝液（pH７．０）で平衡化させたブチルトヨパール６
５０Ｃに吸着させ、同緩衝液で洗い、２０％飽和硫酸ア
ンモニウムを含む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（pH７．
０）で溶出させた。活性画分を５mMトリス塩酸緩衝液
（pH８．０）に対して透析した。透析内液を０．０２Ｍ
トリス塩酸緩衝液（pH８．０）で平衡化したＤＥＡＥト
ヨパール６５０Ｍに吸着させ、同緩衝液で洗い、０→
０．１５Ｍ ＮａＣｌグラジェントで溶出した。活性画
分を５mMトリス塩酸緩衝液（pH７．０）に対して透析し
た。
【００３６】透析内液に硫酸アンモニウムを３０％飽和
になるように添加し、３０％飽和硫酸アンモニウムを含
む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（pH７．０）で平衡化さ
せたブチルトヨパール６５０Ｍに吸着させ、同緩衝液で
洗い、３０→１５％飽和硫酸アンモニウムを含む０．０
５Ｍトリス塩酸緩衝液（pH７．０）で溶出させた。活性
画分を濃縮後、トヨパールＨＷ−５０Ｆによりゲル濾過
を行った。以上の操作により、ＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ゲル濃度１２％、pH８．８）において
単一な酵素標品１６mgが得られた。活性収率は４４．９
％であり、Ｌ−ピログルタミン酸開環反応の比活性は
２，２４０Ｕ／mgであった。また、Ｌ−グルタミン酸閉
環反応の比活性は４２，６００Ｕ／mgであった。
になるように添加し、３０％飽和硫酸アンモニウムを含
む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（pH７．０）で平衡化さ
せたブチルトヨパール６５０Ｍに吸着させ、同緩衝液で
洗い、３０→１５％飽和硫酸アンモニウムを含む０．０
５Ｍトリス塩酸緩衝液（pH７．０）で溶出させた。活性
画分を濃縮後、トヨパールＨＷ−５０Ｆによりゲル濾過
を行った。以上の操作により、ＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ゲル濃度１２％、pH８．８）において
単一な酵素標品１６mgが得られた。活性収率は４４．９
％であり、Ｌ−ピログルタミン酸開環反応の比活性は
２，２４０Ｕ／mgであった。また、Ｌ−グルタミン酸閉
環反応の比活性は４２，６００Ｕ／mgであった。
【００３７】実施例２．種菌としてストレプトミセスＳ
Ｙ−１６４を使用した。肉エキス１０ｇ／ｌ、ポリペプ
トン１０ｇ／ｌ、グルコース１０ｇ／ｌ、ＮａＣｌ３ｇ
／ｌ及びアデカノール０．１５ｇ／ｌ（pH７．０）を含
有する培地８mlを内径２２mmの試験管に入れ、１２０℃
にて１５分殺菌した。上記培地に前記菌株を１白金耳接
種し、３０℃で４８時間振盪培養した。培養終了後、培
養液０．５mlを上記培地１００mlの入った５００ml容坂
口フラスコ３本に接種し、３０℃、４８時間振盪培養し
た。培養終了後、培養液のすべてを５０ｌ容ジャーファ
ーメンター中の本培養液３０ｌに接種した。本培養は３
０℃、３００rpm ／分、通気量１ｌ／培地１ｌ・１分間
で３０時間実施した。
Ｙ−１６４を使用した。肉エキス１０ｇ／ｌ、ポリペプ
トン１０ｇ／ｌ、グルコース１０ｇ／ｌ、ＮａＣｌ３ｇ
／ｌ及びアデカノール０．１５ｇ／ｌ（pH７．０）を含
有する培地８mlを内径２２mmの試験管に入れ、１２０℃
にて１５分殺菌した。上記培地に前記菌株を１白金耳接
種し、３０℃で４８時間振盪培養した。培養終了後、培
養液０．５mlを上記培地１００mlの入った５００ml容坂
口フラスコ３本に接種し、３０℃、４８時間振盪培養し
た。培養終了後、培養液のすべてを５０ｌ容ジャーファ
ーメンター中の本培養液３０ｌに接種した。本培養は３
０℃、３００rpm ／分、通気量１ｌ／培地１ｌ・１分間
で３０時間実施した。
【００３８】培養終了液３０ｌから酵素を採取するた
め、該液を遠心分離（１５，０００rpm シャープレスＡ
Ｓ−１６（巴工業）２０℃）して培養上清３８ｌを得
た。この培養上清に硫酸アンモニウムを添加して８０％
飽和硫安沈殿画分を得た。この沈殿を０．１Ｍトリス塩
酸緩衝液（pH７．０）３ｌに溶解した。得られた溶液に
硫酸アンモニウムを２５％飽和になるように添加し、２
５％飽和硫酸アンモニウムを含む０．０５Ｍトリス塩酸
緩衝液（pH７．０）で平衡化させたブチルトヨパール６
５０Ｃに吸着させ、同緩衝液で洗い、２０％飽和硫酸ア
ンモニウムを含む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（pH７．
０）で溶出させた。
め、該液を遠心分離（１５，０００rpm シャープレスＡ
Ｓ−１６（巴工業）２０℃）して培養上清３８ｌを得
た。この培養上清に硫酸アンモニウムを添加して８０％
飽和硫安沈殿画分を得た。この沈殿を０．１Ｍトリス塩
酸緩衝液（pH７．０）３ｌに溶解した。得られた溶液に
硫酸アンモニウムを２５％飽和になるように添加し、２
５％飽和硫酸アンモニウムを含む０．０５Ｍトリス塩酸
緩衝液（pH７．０）で平衡化させたブチルトヨパール６
５０Ｃに吸着させ、同緩衝液で洗い、２０％飽和硫酸ア
ンモニウムを含む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（pH７．
０）で溶出させた。
【００３９】活性画分に硫酸アンモニウムを３０％にな
るように添加し、再度ブチルトヨパール６５０Ｃに吸着
させ、同緩衝液で洗い、３０→１５％飽和硫酸アンモニ
ウムを含む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（pH７．０）で
溶出させた。活性画分を５mMトリス塩酸緩衝液（pH９．
０）に対して透析した。透析内液を０．０５Ｍトリス塩
酸緩衝液（pH９．０）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗに吸着させ、同緩衝液で洗
い、０→０．５Ｍ ＮａＣｌグラジェントで溶出した。
るように添加し、再度ブチルトヨパール６５０Ｃに吸着
させ、同緩衝液で洗い、３０→１５％飽和硫酸アンモニ
ウムを含む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（pH７．０）で
溶出させた。活性画分を５mMトリス塩酸緩衝液（pH９．
０）に対して透析した。透析内液を０．０５Ｍトリス塩
酸緩衝液（pH９．０）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗに吸着させ、同緩衝液で洗
い、０→０．５Ｍ ＮａＣｌグラジェントで溶出した。
【００４０】活性画分を濃縮後、トヨパールＨＷ−５０
Ｆによりゲル濾過を行った。活性画分を濃縮後、再度、
ＴＳＫｇｅｌ Ｇ２０００ＳＷによりゲル濾過を行っ
た。以上の操作により、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ゲル濃度１２％、pH８．８）において単一な
酵素標品５．２mgが得られた。活性収率は１９．９％で
あり、Ｌ−ピログルタミン酸開環反応の比活性は２，２
１０Ｕ／mgであった。また、Ｌ−グルタミン酸閉環反応
の比活性は４２，０００Ｕ／mgであった。
Ｆによりゲル濾過を行った。活性画分を濃縮後、再度、
ＴＳＫｇｅｌ Ｇ２０００ＳＷによりゲル濾過を行っ
た。以上の操作により、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ゲル濃度１２％、pH８．８）において単一な
酵素標品５．２mgが得られた。活性収率は１９．９％で
あり、Ｌ−ピログルタミン酸開環反応の比活性は２，２
１０Ｕ／mgであった。また、Ｌ−グルタミン酸閉環反応
の比活性は４２，０００Ｕ／mgであった。
【００４１】実施例３．ストレプトミセスＳＹ−６を肉
エキス０．３％、ペプトン１％及び塩化ナトリウム０．
５％を含む培地（pH７．０）８mlに植菌し、３０℃で６
０時間振盪培養し、培養終了後、培養液を遠心分離し、
培養上清７mlと菌体に分離した。得られた菌体は超音波
破砕し、無細胞抽出液５mlを得た。培養上清のＬ−ピロ
グルタミン酸開環反応の力価は３．３Ｕ／mlで、Ｌ−グ
ルタミン酸閉環反応は６２．７Ｕ／mlであった。無細胞
抽出液のＬ−ピログルタミン酸開環反応の力価は０．０
５４Ｕ／mlで、Ｌ−グルタミン酸閉環反応は１．０３Ｕ
／mlであった。
エキス０．３％、ペプトン１％及び塩化ナトリウム０．
５％を含む培地（pH７．０）８mlに植菌し、３０℃で６
０時間振盪培養し、培養終了後、培養液を遠心分離し、
培養上清７mlと菌体に分離した。得られた菌体は超音波
破砕し、無細胞抽出液５mlを得た。培養上清のＬ−ピロ
グルタミン酸開環反応の力価は３．３Ｕ／mlで、Ｌ−グ
ルタミン酸閉環反応は６２．７Ｕ／mlであった。無細胞
抽出液のＬ−ピログルタミン酸開環反応の力価は０．０
５４Ｕ／mlで、Ｌ−グルタミン酸閉環反応は１．０３Ｕ
／mlであった。
【００４２】実施例４．ストレプトミセスＳＹ−１６４
を肉エキス０．３％、ペプトン１％及び塩化ナトリウム
０．５％を含む培地（pH７．０）８mlに植菌し、３０℃
で６０時間振盪培養し、培養終了後、培養液を遠心分離
し、培養上清７mlと菌体に分離した。得られた菌体は超
音波破砕し、無細胞抽出液５mlを得た。培養上清のＬ−
ピログルタミン酸開環反応の力価は０．４３Ｕ／mlで、
Ｌ−グルタミン酸閉環反応は８．１７Ｕ／mlであった。
無細胞抽出液のＬ−ピログルタミン酸開環反応の力価は
０．０３７Ｕ／mlで、Ｌ−グルタミン酸閉環反応は０．
７０３Ｕ／mlであった。
を肉エキス０．３％、ペプトン１％及び塩化ナトリウム
０．５％を含む培地（pH７．０）８mlに植菌し、３０℃
で６０時間振盪培養し、培養終了後、培養液を遠心分離
し、培養上清７mlと菌体に分離した。得られた菌体は超
音波破砕し、無細胞抽出液５mlを得た。培養上清のＬ−
ピログルタミン酸開環反応の力価は０．４３Ｕ／mlで、
Ｌ−グルタミン酸閉環反応は８．１７Ｕ／mlであった。
無細胞抽出液のＬ−ピログルタミン酸開環反応の力価は
０．０３７Ｕ／mlで、Ｌ−グルタミン酸閉環反応は０．
７０３Ｕ／mlであった。
【００４３】実施例５．Ｌ−グルタミン酸３０５nmol、
実施例１で得た酵素６３ngを含む２０mMトリス塩酸緩衝
液（pH７．０）１０mlを混合し、３０℃で放置し、ピロ
グルタミン酸の製造を行った。その結果、２９５nmolの
ピログルタミン酸（収率９６．７％）が生成した。
実施例１で得た酵素６３ngを含む２０mMトリス塩酸緩衝
液（pH７．０）１０mlを混合し、３０℃で放置し、ピロ
グルタミン酸の製造を行った。その結果、２９５nmolの
ピログルタミン酸（収率９６．７％）が生成した。
【００４４】実施例６．Ｄ，Ｌ−ピログルタミン酸（東
京化成）５．０ｇを１Ｎ ＮａＯＨに溶解した後、０．
５Ｎになるように１Ｎ ＮａＯＨを加え、蒸留水で１０
０mlにした。該溶液を１２１℃、２０分オートクレーブ
し、加水分解を行った。加水分解終了後、３Ｎ ＨＣｌ
でpHを７．１に調整し、蒸留水で２００mlにした。該溶
液中にはＤ−グルタミン酸２．６ｇ、Ｌ−グルタミン酸
２．３ｇが含まれていた。該溶液に実施例２で得た酵素
７３μｇ（１６１Ｕ）を加え、４０℃で６時間作用させ
た。反応終了後、１００℃、５分間熱処理し、酵素を失
活させた。
京化成）５．０ｇを１Ｎ ＮａＯＨに溶解した後、０．
５Ｎになるように１Ｎ ＮａＯＨを加え、蒸留水で１０
０mlにした。該溶液を１２１℃、２０分オートクレーブ
し、加水分解を行った。加水分解終了後、３Ｎ ＨＣｌ
でpHを７．１に調整し、蒸留水で２００mlにした。該溶
液中にはＤ−グルタミン酸２．６ｇ、Ｌ−グルタミン酸
２．３ｇが含まれていた。該溶液に実施例２で得た酵素
７３μｇ（１６１Ｕ）を加え、４０℃で６時間作用させ
た。反応終了後、１００℃、５分間熱処理し、酵素を失
活させた。
【００４５】反応液中には２．６ｇのＤ−グルタミン酸
と８８mgのＬ−グルタミン酸が含まれていた（図１参
照）。反応液をエバポレーターで４０mlまで減圧濃縮
し、３ＮＨＣｌでpHを３．２に調整した後、５℃で一晩
放置した。生成した白色結晶をNo.２で濾紙で濾集し、
冷エタノールで洗浄した後、乾燥した。白色結晶は１．
４１ｇ得られた。得られたＤ−グルタミン酸の結晶の融
点（分解）は、２１４−２１６℃、〔α〕22 D ＝−２
４．４°、０．６％のＬ−グルタミン酸を含有してい
た。
と８８mgのＬ−グルタミン酸が含まれていた（図１参
照）。反応液をエバポレーターで４０mlまで減圧濃縮
し、３ＮＨＣｌでpHを３．２に調整した後、５℃で一晩
放置した。生成した白色結晶をNo.２で濾紙で濾集し、
冷エタノールで洗浄した後、乾燥した。白色結晶は１．
４１ｇ得られた。得られたＤ−グルタミン酸の結晶の融
点（分解）は、２１４−２１６℃、〔α〕22 D ＝−２
４．４°、０．６％のＬ−グルタミン酸を含有してい
た。
【図１】図１は、グルタミン酸のラセミ体に本発明の酵
素を作用させた場合の、Ｄ，Ｌ−グルタミン酸の合計量
及びＬ−グルタミン酸の量の経時的変化を示すグラフで
ある。
素を作用させた場合の、Ｄ，Ｌ−グルタミン酸の合計量
及びＬ−グルタミン酸の量の経時的変化を示すグラフで
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/14 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 13/14 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者 村尾 澤夫 大阪府堺市堀上緑町２丁目８−12
Claims (5)
- 【請求項１】 次の性質： （１）作用：Ｌ−ピログルタミン酸からＬ−グルタミン
酸を生成する反応（Ｌ−ピログルタミン酸開環反応）、
及びこの逆反応（Ｌ−グルタミン酸閉環反応）を触媒す
る； （２）基質特異性：Ｌ−ピログルタミン酸開環反応：Ｌ
−ピログルタミン酸に作用し、Ｄ−ピログルタミン酸、
プロリン及びヒドロキシプロリンには作用しない；Ｌ−
グルタミン酸閉環反応：Ｌ−グルタミン酸に作用し、Ｄ
−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン
酸、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギンには作用し
ない； （３）至適pH及び安定pH範囲：Ｌ−ピログルタミン酸開
環反応：至適pHは３０℃にて３０分間の反応においては
約７であり、pH安定性は３０℃にて１２０分間の処理条
件では約７〜１０の範囲内で安定である；Ｌ−グルタミ
ン酸閉環反応：至適pHは３０℃にて３０分間の反応にお
いて約７であり、pH安定性は３０℃にて１２０分間の処
理条件では７〜１０の範囲内で安定である； （４）温度安定性：Ｌ−ピログルタミン酸開環反応：pH
７にて３０分間の処理条件下では５０℃まで安定であ
る；Ｌ−グルタミン酸閉環反応；pH７にて３０分間の処
理条件下では５０℃まで安定である； （５）至適温度：Ｌ−ピログルタミン酸開環反応：約５
０℃に至適作用温度を有する；Ｌ−グルタミン酸閉環反
応：約５０℃に至適作用温度を有する； （６）分子量：ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量
約３８，０００を有する；を有するＬ−グルタミン酸・
Ｌ−ピログルタミン酸相互変換酵素。 - 【請求項２】 請求項１に記載のＬ−グルタミン酸・Ｌ
−ピログルタミン酸相互変換酵素の製造方法において、
該酵素を生産する能力を有するストレプトミセス属に属
する微生物を培養し、該培養物から該酵素を採取するこ
とを特徴とする方法。 - 【請求項３】 請求項１に記載の酵素をＬ−グルタミン
酸とＤ−グルタミン酸との混合物に作用させることによ
り該Ｌ−グルタミン酸をＬ−ピログルタミン酸に変換
し、そして該Ｌ−ピログルタミン酸と前記Ｄ−グルタミ
ン酸とを相互に分離することを特徴とするＤ−グルタミ
ン酸又はＬ−ピログルタミン酸の製造法。 - 【請求項４】 請求項１に記載の酵素を、Ｌ−ピログル
タミン酸とＤ−ピログルタミン酸との混合物に作用せし
めることにより該Ｌ−ピログルタミン酸をＬ−グルタミ
ン酸に転換し、そして生成したＬ−グルタミン酸と残留
するＤ−ピログルタミン酸とを相互に分離することを特
徴とする、Ｄ−ピログルタミン酸の製造方法。 - 【請求項５】 請求項１に記載の酵素を、Ｌ−グルタミ
ン酸に作用せしめることを特徴とするＬ−ピログルタミ
ン酸の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8226895A JPH1066566A (ja) | 1996-08-28 | 1996-08-28 | ストレプトミセス属の生産するｌ−グルタミン酸・ｌ−ピログルタミン酸相互変換酵素とその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8226895A JPH1066566A (ja) | 1996-08-28 | 1996-08-28 | ストレプトミセス属の生産するｌ−グルタミン酸・ｌ−ピログルタミン酸相互変換酵素とその製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1066566A true JPH1066566A (ja) | 1998-03-10 |
Family
ID=16852275
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8226895A Pending JPH1066566A (ja) | 1996-08-28 | 1996-08-28 | ストレプトミセス属の生産するｌ−グルタミン酸・ｌ−ピログルタミン酸相互変換酵素とその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1066566A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011102395A1 (ja) * | 2010-02-16 | 2011-08-25 | 味の素株式会社 | ピロリドンカルボン酸またはその塩の製造方法 |
| WO2014126186A1 (ja) * | 2013-02-15 | 2014-08-21 | キッコーマン株式会社 | ５－オキソプロリナーゼ、５－オキソプロリナーゼ遺伝子、および５－オキソプロリナーゼの製造方法 |
| WO2019070018A1 (ja) | 2017-10-05 | 2019-04-11 | 味の素株式会社 | 光学活性ピロリドンカルボン酸またはそのアルカリ金属塩の製造方法 |
-
1996
- 1996-08-28 JP JP8226895A patent/JPH1066566A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011102395A1 (ja) * | 2010-02-16 | 2011-08-25 | 味の素株式会社 | ピロリドンカルボン酸またはその塩の製造方法 |
| JP5935689B2 (ja) * | 2010-02-16 | 2016-06-15 | 味の素株式会社 | ピロリドンカルボン酸またはその塩の製造方法 |
| WO2014126186A1 (ja) * | 2013-02-15 | 2014-08-21 | キッコーマン株式会社 | ５－オキソプロリナーゼ、５－オキソプロリナーゼ遺伝子、および５－オキソプロリナーゼの製造方法 |
| JPWO2014126186A1 (ja) * | 2013-02-15 | 2017-02-02 | キッコーマン株式会社 | ５−オキソプロリナーゼ、５−オキソプロリナーゼ遺伝子、および５−オキソプロリナーゼの製造方法 |
| WO2019070018A1 (ja) | 2017-10-05 | 2019-04-11 | 味の素株式会社 | 光学活性ピロリドンカルボン酸またはそのアルカリ金属塩の製造方法 |
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