JPH1066576A - 突出末端を有する２本鎖ｄｎａ及びこれを用いたｄｎａのシャフリング方法 - Google Patents
突出末端を有する２本鎖ｄｎａ及びこれを用いたｄｎａのシャフリング方法Info
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- JPH1066576A JPH1066576A JP8208422A JP20842296A JPH1066576A JP H1066576 A JPH1066576 A JP H1066576A JP 8208422 A JP8208422 A JP 8208422A JP 20842296 A JP20842296 A JP 20842296A JP H1066576 A JPH1066576 A JP H1066576A
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Abstract
(57)【要約】
【解決課題】 天然に存在するＤＮＡについて従来の方
法とは大きく異なる変異法の提供およびそれによる有用
な遺伝子産物の提供。 【解決手段】 (a) 遺伝子の一部と同一の配列を有する
２本鎖ＤＮＡと(b) 前記遺伝子上で前記２本鎖ＤＮＡ相
当部分とは非連続な位置に存する塩基配列または前記遺
伝子上にない塩基配列を有する１本鎖ＤＮＡからなり、
１本鎖ＤＮＡが２本鎖ＤＮＡのいずれかの端部に連結し
て突出末端を形成していることを特徴とする突出末端を
有するＤＮＡ、その製造方法、そのＤＮＡを利用するＤ
ＮＡのシャフリング方法、そのシャフリング法で得られ
るＤＮＡ及びＤＮＡプール、ＤＮＡプールの製造方法、
並びにＤＮＡプールに存在する遺伝情報を発現すること
によって得られる遺伝子産物。
法とは大きく異なる変異法の提供およびそれによる有用
な遺伝子産物の提供。 【解決手段】 (a) 遺伝子の一部と同一の配列を有する
２本鎖ＤＮＡと(b) 前記遺伝子上で前記２本鎖ＤＮＡ相
当部分とは非連続な位置に存する塩基配列または前記遺
伝子上にない塩基配列を有する１本鎖ＤＮＡからなり、
１本鎖ＤＮＡが２本鎖ＤＮＡのいずれかの端部に連結し
て突出末端を形成していることを特徴とする突出末端を
有するＤＮＡ、その製造方法、そのＤＮＡを利用するＤ
ＮＡのシャフリング方法、そのシャフリング法で得られ
るＤＮＡ及びＤＮＡプール、ＤＮＡプールの製造方法、
並びにＤＮＡプールに存在する遺伝情報を発現すること
によって得られる遺伝子産物。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、所望の配列からな
る突出末端を有する２本鎖ＤＮＡおよびその製造方法、
突出末端を有するＤＮＡブロックを利用したＤＮＡのシ
ャフリング方法、当該方法によりシャフリングされたＤ
ＮＡおよび当該方法の応用により得られるＤＮＡプー
ル、並びに当該プールによる遺伝子産物に関する。
る突出末端を有する２本鎖ＤＮＡおよびその製造方法、
突出末端を有するＤＮＡブロックを利用したＤＮＡのシ
ャフリング方法、当該方法によりシャフリングされたＤ
ＮＡおよび当該方法の応用により得られるＤＮＡプー
ル、並びに当該プールによる遺伝子産物に関する。
【０００２】
【従来技術】天然に存在するタンパク質を人間にとって
より有用に改良するタンパク質工学の１つのアプローチ
として、部位特異的変異によるタンパク質の改良があ
り、いくつかの成果が得られている（特開平5-91876 号
公報）。しかし、これには標的タンパク質の立体構造が
判明していることが必要であり、立体構造の解析に多く
の労力が必要である。また、立体構造が判明していても
構造と機能の関係にはまだ不明なことが多く、狙った機
能を確実に付与することは依然として困難である。
より有用に改良するタンパク質工学の１つのアプローチ
として、部位特異的変異によるタンパク質の改良があ
り、いくつかの成果が得られている（特開平5-91876 号
公報）。しかし、これには標的タンパク質の立体構造が
判明していることが必要であり、立体構造の解析に多く
の労力が必要である。また、立体構造が判明していても
構造と機能の関係にはまだ不明なことが多く、狙った機
能を確実に付与することは依然として困難である。
【０００３】これらの困難を回避するために、ランダム
変異とスクリーニングからなる方法や、生物の進化を利
用した進化分子工学が脚光を浴びており、非常に有用で
あることが示されている（Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 83, 576 (1986)）。しかしながら、現在行なわれて
いる方法は、多くて数個のアミノ酸置換である。WO 95/
22625 には、複数の遺伝子をランダムに分割し、相同的
組み換えによって遺伝子を再構築し、新規な遺伝子を作
成する方法が記載されている。しかし、この方法はキメ
ラ遺伝子作成の一方法であり、作成される遺伝子は当初
の遺伝子と類似しており、塩基配列の大枠は維持されて
いる。
変異とスクリーニングからなる方法や、生物の進化を利
用した進化分子工学が脚光を浴びており、非常に有用で
あることが示されている（Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 83, 576 (1986)）。しかしながら、現在行なわれて
いる方法は、多くて数個のアミノ酸置換である。WO 95/
22625 には、複数の遺伝子をランダムに分割し、相同的
組み換えによって遺伝子を再構築し、新規な遺伝子を作
成する方法が記載されている。しかし、この方法はキメ
ラ遺伝子作成の一方法であり、作成される遺伝子は当初
の遺伝子と類似しており、塩基配列の大枠は維持されて
いる。
【０００４】このような既存の方法では生物が進化の過
程で獲得できなかった機能の付与を望むことは困難であ
る。自然界に存在するタンパク質等の遺伝子産物と機能
が大きく異なる遺伝子産物を取得するためには、天然に
存在する塩基配列空間とは大きく異なった核酸のプール
を作り、その中から目的の機能を有する遺伝子産物を取
得することが有効と考えられる。
程で獲得できなかった機能の付与を望むことは困難であ
る。自然界に存在するタンパク質等の遺伝子産物と機能
が大きく異なる遺伝子産物を取得するためには、天然に
存在する塩基配列空間とは大きく異なった核酸のプール
を作り、その中から目的の機能を有する遺伝子産物を取
得することが有効と考えられる。
【０００５】そのための一つの方法として、全ての塩基
の組合せからなる核酸プールを作ることが考えられる。
しかし、１００アミノ酸からなる比較的小さなタンパク
質をコードする塩基配列（３００塩基（ｂｐ））の総数
でさえ、４の３００乗（およそ１０の１８０乗）通りと
いう巨大な数となり、そのすべてを含む核酸プールを調
製することは実際上、不可能である。
の組合せからなる核酸プールを作ることが考えられる。
しかし、１００アミノ酸からなる比較的小さなタンパク
質をコードする塩基配列（３００塩基（ｂｐ））の総数
でさえ、４の３００乗（およそ１０の１８０乗）通りと
いう巨大な数となり、そのすべてを含む核酸プールを調
製することは実際上、不可能である。
【０００６】ある種のタンパク質についてモジュールと
呼ばれるサブ構造に着目し、各モジュールに対応する塩
基配列ブロックの順番を入れ換えて、モジュールの順番
を変えた変異体を作り出す試みもなされている（Viva O
rigino vol. 23, No.1 (1995) 86-87)。しかし、この試
みでは、それぞれの変異体について個別に遺伝子配列の
並べ換えが行われており、順番が入れ替わった全ての分
子種を含む核酸プールを作成すること、およびそのプー
ルから所望の性質の産物を発現する遺伝子を取得するこ
とは未だなされていなかった。
呼ばれるサブ構造に着目し、各モジュールに対応する塩
基配列ブロックの順番を入れ換えて、モジュールの順番
を変えた変異体を作り出す試みもなされている（Viva O
rigino vol. 23, No.1 (1995) 86-87)。しかし、この試
みでは、それぞれの変異体について個別に遺伝子配列の
並べ換えが行われており、順番が入れ替わった全ての分
子種を含む核酸プールを作成すること、およびそのプー
ルから所望の性質の産物を発現する遺伝子を取得するこ
とは未だなされていなかった。
【０００７】制限酵素を利用し、同じ突出末端若しくは
平滑末端を持つＤＮＡブロックを数種類混合し、それら
をランダムな順番に連結させることによりできた様々な
分子によって構成される核酸プールを作成し、そこから
所望の性質を持つ分子を選別することは可能である。し
かし、かかる方法ではＤＮＡ中に制限酵素認識部位が必
要となる上、仮に制限酵素認識部位が存在しても、当該
部位が希望の位置にある確率は極めて低い。またそのブ
ロックの両端は同じ切り口である必要があり、自己連結
する確率が高い。部位特異的変異により制限酵素認識部
位を形成することも考えられるが、フレームに合わせて
連結できるかどうかは偶然に支配される部分が大きい。
すなわち、遺伝暗号の読み枠がずれずに、タンパク質が
合成されるかどうかは偶然に支配され、極めて非効率的
な方法である。
平滑末端を持つＤＮＡブロックを数種類混合し、それら
をランダムな順番に連結させることによりできた様々な
分子によって構成される核酸プールを作成し、そこから
所望の性質を持つ分子を選別することは可能である。し
かし、かかる方法ではＤＮＡ中に制限酵素認識部位が必
要となる上、仮に制限酵素認識部位が存在しても、当該
部位が希望の位置にある確率は極めて低い。またそのブ
ロックの両端は同じ切り口である必要があり、自己連結
する確率が高い。部位特異的変異により制限酵素認識部
位を形成することも考えられるが、フレームに合わせて
連結できるかどうかは偶然に支配される部分が大きい。
すなわち、遺伝暗号の読み枠がずれずに、タンパク質が
合成されるかどうかは偶然に支配され、極めて非効率的
な方法である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、天然
に存在する塩基配列空間とは大きく異なった空間に存在
する塩基配列を効率的に得る方法、およびこのようにし
て得られた天然には存在しない核酸配列を遺伝子として
発現させることによって得られる遺伝子産物を提供する
ことにある。
に存在する塩基配列空間とは大きく異なった空間に存在
する塩基配列を効率的に得る方法、およびこのようにし
て得られた天然には存在しない核酸配列を遺伝子として
発現させることによって得られる遺伝子産物を提供する
ことにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】遺伝子の配列空間はＡ、
Ｇ、Ｃ、Ｔの塩基を用いて理論的に作り得る全配列から
なる。例えば、ｎ個のアミノ酸からなるタンパク質をコ
ードする塩基配列は、４つの塩基の中から任意の１つを
３ｎ回選択して順次並べることにより構成され、４の３
ｎ乗通り存在する。１００アミノ酸のタンパク質であれ
ば、前述の通り、およそ１０の１８０乗通りの対応する
塩基配列が存在する。実際にはタンパク質を構成するア
ミノ酸の数に制限は存在しないので、配列空間は無限の
広がりを持つことになる。生物は進化の過程では、この
配列空間のごく一部を試験したにすぎず、それ以外の大
きな配列空間に極めて優れた機能を持つタンパク質をコ
ードする配列がある可能性が大きい。現在多くの研究機
関で行われているタンパク質工学的取り組みも天然に存
在するタンパク質より機能において勝るタンパク質を創
造することを目的としており、その主たるアプローチ
は、上述の通りアミノ酸置換である。しかしながら、ア
ミノ酸置換は進化において生物が行なった主要な手法、
つまり、生物の模倣であり、生物が試験した配列のごく
近傍を探索するにすぎない。また、そうして得られた配
列は過去において淘汰された配列である可能性もある。
Ｇ、Ｃ、Ｔの塩基を用いて理論的に作り得る全配列から
なる。例えば、ｎ個のアミノ酸からなるタンパク質をコ
ードする塩基配列は、４つの塩基の中から任意の１つを
３ｎ回選択して順次並べることにより構成され、４の３
ｎ乗通り存在する。１００アミノ酸のタンパク質であれ
ば、前述の通り、およそ１０の１８０乗通りの対応する
塩基配列が存在する。実際にはタンパク質を構成するア
ミノ酸の数に制限は存在しないので、配列空間は無限の
広がりを持つことになる。生物は進化の過程では、この
配列空間のごく一部を試験したにすぎず、それ以外の大
きな配列空間に極めて優れた機能を持つタンパク質をコ
ードする配列がある可能性が大きい。現在多くの研究機
関で行われているタンパク質工学的取り組みも天然に存
在するタンパク質より機能において勝るタンパク質を創
造することを目的としており、その主たるアプローチ
は、上述の通りアミノ酸置換である。しかしながら、ア
ミノ酸置換は進化において生物が行なった主要な手法、
つまり、生物の模倣であり、生物が試験した配列のごく
近傍を探索するにすぎない。また、そうして得られた配
列は過去において淘汰された配列である可能性もある。
【００１０】本発明者らは、生物の試験した配列空間の
近傍から大きく離れるには、生物が行ない得なかったこ
とを実践すれば可能であると考えた。そして、遺伝子を
数個のブロックに分け、それらの順番を変えることが、
生物内で起きるには致死的であることから、この目的に
適した方法であると結論した。そして、鋭意研究を重ね
た結果、任意のＤＮＡに任意の突出末端を作る方法を発
明し、その方法を利用することによって、遺伝子を数個
のブロックに分け、それらの順番が入れ替わった配列空
間に位置する塩基配列を含む分子プールを作成すること
に成功し、本発明を完成するに至った。
近傍から大きく離れるには、生物が行ない得なかったこ
とを実践すれば可能であると考えた。そして、遺伝子を
数個のブロックに分け、それらの順番を変えることが、
生物内で起きるには致死的であることから、この目的に
適した方法であると結論した。そして、鋭意研究を重ね
た結果、任意のＤＮＡに任意の突出末端を作る方法を発
明し、その方法を利用することによって、遺伝子を数個
のブロックに分け、それらの順番が入れ替わった配列空
間に位置する塩基配列を含む分子プールを作成すること
に成功し、本発明を完成するに至った。
【００１１】すなわち本発明は以下のものを提供するも
のである。 １）(a) 遺伝子の一部と同一の配列を有する２本鎖ＤＮ
Ａと(b) 前記遺伝子上で前記２本鎖ＤＮＡ相当部分とは
非連続な位置に存する塩基配列または前記遺伝子上にな
い塩基配列を有する１本鎖ＤＮＡからなり、１本鎖ＤＮ
Ａが２本鎖ＤＮＡのいずれかの端部に連結して突出末端
を形成していることを特徴とする突出末端を有するＤＮ
Ａ。 ２）(a) 遺伝子の一部と同一の配列を有する２本鎖ＤＮ
Ａ、(b) 前記遺伝子上で前記２本鎖ＤＮＡ相当部分とは
非連続な位置に存する塩基配列または前記遺伝子上にな
い塩基配列を有する第１の１本鎖ＤＮＡ、および(c) 前
記遺伝子上で前記２本鎖ＤＮＡ相当部分と連続する位置
に存する塩基配列を有する第２の１本鎖ＤＮＡからな
り、第２の１本鎖ＤＮＡは前記２本鎖ＤＮＡの当該連続
する位置に相当する端部に、第１の１本鎖ＤＮＡは前記
端部とは反対側の相補鎖の端部に連結してそれぞれ突出
末端を形成していることを特徴とする突出末端を有する
ＤＮＡ。
のである。 １）(a) 遺伝子の一部と同一の配列を有する２本鎖ＤＮ
Ａと(b) 前記遺伝子上で前記２本鎖ＤＮＡ相当部分とは
非連続な位置に存する塩基配列または前記遺伝子上にな
い塩基配列を有する１本鎖ＤＮＡからなり、１本鎖ＤＮ
Ａが２本鎖ＤＮＡのいずれかの端部に連結して突出末端
を形成していることを特徴とする突出末端を有するＤＮ
Ａ。 ２）(a) 遺伝子の一部と同一の配列を有する２本鎖ＤＮ
Ａ、(b) 前記遺伝子上で前記２本鎖ＤＮＡ相当部分とは
非連続な位置に存する塩基配列または前記遺伝子上にな
い塩基配列を有する第１の１本鎖ＤＮＡ、および(c) 前
記遺伝子上で前記２本鎖ＤＮＡ相当部分と連続する位置
に存する塩基配列を有する第２の１本鎖ＤＮＡからな
り、第２の１本鎖ＤＮＡは前記２本鎖ＤＮＡの当該連続
する位置に相当する端部に、第１の１本鎖ＤＮＡは前記
端部とは反対側の相補鎖の端部に連結してそれぞれ突出
末端を形成していることを特徴とする突出末端を有する
ＤＮＡ。
【００１２】３）１本鎖ＤＮＡが２塩基以上の長さを有
する前記１または２に記載の突出末端を有するＤＮＡ。 ４）突出末端が３’端に位置する前記１乃至３のいずれ
かに記載の突出末端を有するＤＮＡ。 ５）ＤＮＡの一部を鋳型とし、少なくとも１つのリボヌ
クレオチドを含むオリゴヌクレオチドをプライマーとし
てＤＮＡポリメラーゼ反応を行なうことにより２本鎖Ｄ
ＮＡを調製し、しかる後、酵素反応または化学反応によ
ってリボヌクレオチドを除去し、さらに該リボヌクレオ
チドの存在していた位置よりも５’端側に残存するヌク
レオチドを除去することを特徴とする、突出末端を有す
るＤＮＡの製造方法。
する前記１または２に記載の突出末端を有するＤＮＡ。 ４）突出末端が３’端に位置する前記１乃至３のいずれ
かに記載の突出末端を有するＤＮＡ。 ５）ＤＮＡの一部を鋳型とし、少なくとも１つのリボヌ
クレオチドを含むオリゴヌクレオチドをプライマーとし
てＤＮＡポリメラーゼ反応を行なうことにより２本鎖Ｄ
ＮＡを調製し、しかる後、酵素反応または化学反応によ
ってリボヌクレオチドを除去し、さらに該リボヌクレオ
チドの存在していた位置よりも５’端側に残存するヌク
レオチドを除去することを特徴とする、突出末端を有す
るＤＮＡの製造方法。
【００１３】６）下記ａ）〜ｄ）の工程： ａ）(i) 遺伝子ＤＮＡの一部と同一の塩基配列を有する
オリゴヌクレチドと(ii)遺伝子上で(i) の塩基配列とは
非連続な位置に存する塩基配列またはその遺伝子上にな
い塩基配列を有し、少なくとも１つのリボヌクレオチド
を含むオリゴヌクレオチドを(ii)のオリゴヌクレオチド
が(i) のオリゴヌクレオチドの５’端側に位置するよう
に連結する工程； ｂ）前記ａ）(i) のオリゴヌクレオチド相当部分を含む
ＤＮＡを鋳型とし、工程ａ）で得られた連結オリゴヌク
レオチドをプライマーとしてＤＮＡポリメラーゼ反応を
行ない２本鎖ＤＮＡを調製する工程； ｃ）酵素反応もしくは化学反応によって前記２本鎖ＤＮ
Ａ中のリボヌクレオチドを除去する工程；および ｄ）前記リボヌクレオチドの存在していた位置よりも
５’端側に残存するヌクレオチドを除去する工程；を有
することを特徴とする、前記１に規定する突出末端を有
するＤＮＡの製造方法。
オリゴヌクレチドと(ii)遺伝子上で(i) の塩基配列とは
非連続な位置に存する塩基配列またはその遺伝子上にな
い塩基配列を有し、少なくとも１つのリボヌクレオチド
を含むオリゴヌクレオチドを(ii)のオリゴヌクレオチド
が(i) のオリゴヌクレオチドの５’端側に位置するよう
に連結する工程； ｂ）前記ａ）(i) のオリゴヌクレオチド相当部分を含む
ＤＮＡを鋳型とし、工程ａ）で得られた連結オリゴヌク
レオチドをプライマーとしてＤＮＡポリメラーゼ反応を
行ない２本鎖ＤＮＡを調製する工程； ｃ）酵素反応もしくは化学反応によって前記２本鎖ＤＮ
Ａ中のリボヌクレオチドを除去する工程；および ｄ）前記リボヌクレオチドの存在していた位置よりも
５’端側に残存するヌクレオチドを除去する工程；を有
することを特徴とする、前記１に規定する突出末端を有
するＤＮＡの製造方法。
【００１４】７）下記ａ）〜ｄ）の工程： ａ）(i) 遺伝子ＤＮＡの一部と同一の塩基配列を有する
オリゴヌクレチドと(ii)遺伝子上で(i) の塩基配列とは
非連続な位置に存する塩基配列またはその遺伝子上にな
い塩基配列を有し、少なくとも１つのリボヌクレオチド
を含むオリゴヌクレオチドを(ii)のオリゴヌクレオチド
が(i) のオリゴヌクレオチドの５’端側に位置するよう
に連結する工程； ｂ）前記ａ）(i) のオリゴヌクレオチド相当部分を含む
ＤＮＡを鋳型とし、(i) 工程ａ）で得られた連結オリゴ
ヌクレオチドと、(ii)その遺伝子上にあってより前記オ
リゴヌクレオチド相当部分から３’端側に少なくとも３
塩基以上離れた位置に存するオリゴヌクレオチドの相補
鎖であって少なくとも１つのリボヌクレオチドを含むオ
リゴヌクレオチドをプライマーとしてＤＮＡポリメラー
ゼ反応を行ない２本鎖ＤＮＡを調製する工程； ｃ）酵素反応もしくは化学反応によって前記２本鎖ＤＮ
Ａ中のリボヌクレオチドを除去する工程；および ｄ）前記リボヌクレオチドの存在していた位置よりも
５’端側に残存するヌクレオチドをそれぞれ除去する工
程；を有することを特徴とする、前記２に規定する突出
末端を有するＤＮＡの製造方法。
オリゴヌクレチドと(ii)遺伝子上で(i) の塩基配列とは
非連続な位置に存する塩基配列またはその遺伝子上にな
い塩基配列を有し、少なくとも１つのリボヌクレオチド
を含むオリゴヌクレオチドを(ii)のオリゴヌクレオチド
が(i) のオリゴヌクレオチドの５’端側に位置するよう
に連結する工程； ｂ）前記ａ）(i) のオリゴヌクレオチド相当部分を含む
ＤＮＡを鋳型とし、(i) 工程ａ）で得られた連結オリゴ
ヌクレオチドと、(ii)その遺伝子上にあってより前記オ
リゴヌクレオチド相当部分から３’端側に少なくとも３
塩基以上離れた位置に存するオリゴヌクレオチドの相補
鎖であって少なくとも１つのリボヌクレオチドを含むオ
リゴヌクレオチドをプライマーとしてＤＮＡポリメラー
ゼ反応を行ない２本鎖ＤＮＡを調製する工程； ｃ）酵素反応もしくは化学反応によって前記２本鎖ＤＮ
Ａ中のリボヌクレオチドを除去する工程；および ｄ）前記リボヌクレオチドの存在していた位置よりも
５’端側に残存するヌクレオチドをそれぞれ除去する工
程；を有することを特徴とする、前記２に規定する突出
末端を有するＤＮＡの製造方法。
【００１５】８）ＤＮＡを突出末端を有する複数のＤＮ
Ａブロックに分割し、これらを分割前とは異なる配列で
連結することによるＤＮＡのシャフリング方法。 ９） ＤＮＡの各部に前記５乃至７のいずれかに規定す
る方法を適用することにより、ＤＮＡを、１のブロック
の突出末端はもとのＤＮＡ上で隣接位置にないブロック
の突出末端と相補的であるように、突出末端を有する複
数のブロックに分割した後、分割前とは異なる配列で連
結することによるＤＮＡのシャフリング方法。 １０）ＤＮＡを３個以上のブロックに分割する前記８ま
たは９に記載のシャフリング方法。 １１）ＤＮＡリガーゼを使用してブロックを連結する前
記８乃至１０のいずれかに記載のシャフリング方法。 １２）前記８乃至１１のいずれかに規定の方法でシャフ
リングしてなるＤＮＡ。
Ａブロックに分割し、これらを分割前とは異なる配列で
連結することによるＤＮＡのシャフリング方法。 ９） ＤＮＡの各部に前記５乃至７のいずれかに規定す
る方法を適用することにより、ＤＮＡを、１のブロック
の突出末端はもとのＤＮＡ上で隣接位置にないブロック
の突出末端と相補的であるように、突出末端を有する複
数のブロックに分割した後、分割前とは異なる配列で連
結することによるＤＮＡのシャフリング方法。 １０）ＤＮＡを３個以上のブロックに分割する前記８ま
たは９に記載のシャフリング方法。 １１）ＤＮＡリガーゼを使用してブロックを連結する前
記８乃至１０のいずれかに記載のシャフリング方法。 １２）前記８乃至１１のいずれかに規定の方法でシャフ
リングしてなるＤＮＡ。
【００１６】１３）酵素機能をコードする遺伝子または
その制御遺伝子をシャフリングしてなる前記１２に記載
のＤＮＡ。 １４）遺伝子が、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラー
ゼ、アミラーゼ、カタラーゼ、キシラナーゼ、オキシダ
ーゼ、デヒドロゲナーゼ、オキシゲナーゼ、レダクター
ゼのうちのいずれかをコードする遺伝子である前記１３
に記載のＤＮＡ。 １５）遺伝子が原核生物由来である前記１３または１４
に記載のＤＮＡ。 １６）遺伝子がバチルス属細菌由来である前記１５に記
載のＤＮＡ。 １７）遺伝子がプロテアーゼＡＰＩ２１遺伝子である前
記１６に記載のＤＮＡ。
その制御遺伝子をシャフリングしてなる前記１２に記載
のＤＮＡ。 １４）遺伝子が、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラー
ゼ、アミラーゼ、カタラーゼ、キシラナーゼ、オキシダ
ーゼ、デヒドロゲナーゼ、オキシゲナーゼ、レダクター
ゼのうちのいずれかをコードする遺伝子である前記１３
に記載のＤＮＡ。 １５）遺伝子が原核生物由来である前記１３または１４
に記載のＤＮＡ。 １６）遺伝子がバチルス属細菌由来である前記１５に記
載のＤＮＡ。 １７）遺伝子がプロテアーゼＡＰＩ２１遺伝子である前
記１６に記載のＤＮＡ。
【００１７】１８）前記８乃至１１のいずれかに規定す
るシャフリング方法によって得られる相異なる構造を有
する複数種類のＤＮＡを含有するＤＮＡプール。 １９） １０種類以上のＤＮＡを含む前記１８に記載の
ＤＮＡプール。 ２０） 鋳型ＤＮＡの各部に前記５乃至７のいずれかに
規定する方法を適用することにより、以下の条件を満た
す突出末端を有するＤＮＡブロックの混合物を調製し、
これを任意の配列で連結することによるＤＮＡプールの
製造方法。 条件１：各ブロックは、それぞれ鋳型ＤＮＡの一部と同
一の配列を有する２本鎖部分を有する。 条件２：ブロック混合物の成分であるブロックのうち、
少なくとも２つは前記２本鎖部分に加えて鋳型ＤＮＡ上
で隣接位置にないブロックの突出末端と相補的である１
本鎖部分（突出末端）を有する。 条件３：ブロック混合物は、２本鎖部分が同一であり１
本鎖部分のみ異なる、条件２を満たすブロックを少なく
とも２種類含む。
るシャフリング方法によって得られる相異なる構造を有
する複数種類のＤＮＡを含有するＤＮＡプール。 １９） １０種類以上のＤＮＡを含む前記１８に記載の
ＤＮＡプール。 ２０） 鋳型ＤＮＡの各部に前記５乃至７のいずれかに
規定する方法を適用することにより、以下の条件を満た
す突出末端を有するＤＮＡブロックの混合物を調製し、
これを任意の配列で連結することによるＤＮＡプールの
製造方法。 条件１：各ブロックは、それぞれ鋳型ＤＮＡの一部と同
一の配列を有する２本鎖部分を有する。 条件２：ブロック混合物の成分であるブロックのうち、
少なくとも２つは前記２本鎖部分に加えて鋳型ＤＮＡ上
で隣接位置にないブロックの突出末端と相補的である１
本鎖部分（突出末端）を有する。 条件３：ブロック混合物は、２本鎖部分が同一であり１
本鎖部分のみ異なる、条件２を満たすブロックを少なく
とも２種類含む。
【００１８】２１） 鋳型ＤＮＡが、酵素機能をコード
する遺伝子またはその制御遺伝子ＤＮＡである前記２０
に記載のＤＮＡプールの製造方法。 ２２） 鋳型ＤＮＡが、プロテアーゼ、リパーゼ、セル
ラーゼ、アミラーゼ、カタラーゼ、キシラナーゼ、オキ
シダーゼ、デヒドロゲナーゼ、オキシゲナーゼ、レダク
ターゼのうちのいずれかをコードする遺伝子ＤＮＡであ
る前記２１に記載のＤＮＡプールの製造方法。 ２３） 鋳型ＤＮＡが、原核生物由来である前記２２に
記載のＤＮＡプールの製造方法。 ２４） 鋳型ＤＮＡがバチルス属細菌由来である前記２
３に記載のＤＮＡプールの製造方法。 ２５） 鋳型ＤＮＡがプロテアーゼＡＰＩ２１遺伝子で
ある前記２４に記載のＤＮＡプールの製造方法。 ２６） ＤＮＡブロックをＤＮＡリガーゼにより連結す
る前記２０乃至２５に記載のＤＮＡプールの製造方法。 ２７） 前記１８乃至２６に規定するＤＮＡプールに存
在するＤＮＡ分子の遺伝情報を発現することによって得
られる遺伝子産物。
する遺伝子またはその制御遺伝子ＤＮＡである前記２０
に記載のＤＮＡプールの製造方法。 ２２） 鋳型ＤＮＡが、プロテアーゼ、リパーゼ、セル
ラーゼ、アミラーゼ、カタラーゼ、キシラナーゼ、オキ
シダーゼ、デヒドロゲナーゼ、オキシゲナーゼ、レダク
ターゼのうちのいずれかをコードする遺伝子ＤＮＡであ
る前記２１に記載のＤＮＡプールの製造方法。 ２３） 鋳型ＤＮＡが、原核生物由来である前記２２に
記載のＤＮＡプールの製造方法。 ２４） 鋳型ＤＮＡがバチルス属細菌由来である前記２
３に記載のＤＮＡプールの製造方法。 ２５） 鋳型ＤＮＡがプロテアーゼＡＰＩ２１遺伝子で
ある前記２４に記載のＤＮＡプールの製造方法。 ２６） ＤＮＡブロックをＤＮＡリガーゼにより連結す
る前記２０乃至２５に記載のＤＮＡプールの製造方法。 ２７） 前記１８乃至２６に規定するＤＮＡプールに存
在するＤＮＡ分子の遺伝情報を発現することによって得
られる遺伝子産物。
【００１９】以下、本発明を詳細に説明する。 ［突出末端を有するＤＮＡ］本発明は任意の突出末端を
有するＤＮＡ（以下、特に断らない限り「末端突出ＤＮ
Ａ」という。）を提供する。ここで、突出末端とは、２
本鎖ＤＮＡの端部に突出した１本鎖部分をいう。このよ
うな突出末端はＥｃｏＲＩのような制限酵素でＤＮＡを
切断した場合にも生じるが、この場合、突出末端の塩基
配列は制限酵素により定まっており、その長さも通常は
数塩基程度である。また、天然のＤＮＡを制限酵素によ
り切断する場合は、２本鎖部分の配列も制限酵素認識部
位に挟まれる領域に限定される。これに対し、本発明の
末端突出ＤＮＡは、任意の配列を有する２本鎖ＤＮＡの
末端に所望の長さおよび配列の突出末端を付加した構造
をとるものである。
有するＤＮＡ（以下、特に断らない限り「末端突出ＤＮ
Ａ」という。）を提供する。ここで、突出末端とは、２
本鎖ＤＮＡの端部に突出した１本鎖部分をいう。このよ
うな突出末端はＥｃｏＲＩのような制限酵素でＤＮＡを
切断した場合にも生じるが、この場合、突出末端の塩基
配列は制限酵素により定まっており、その長さも通常は
数塩基程度である。また、天然のＤＮＡを制限酵素によ
り切断する場合は、２本鎖部分の配列も制限酵素認識部
位に挟まれる領域に限定される。これに対し、本発明の
末端突出ＤＮＡは、任意の配列を有する２本鎖ＤＮＡの
末端に所望の長さおよび配列の突出末端を付加した構造
をとるものである。
【００２０】上述の通り、本発明の末端突出ＤＮＡにお
ける２本鎖部分の配列は特に限定されない。例えば、遺
伝子の一部と同一の配列とすることができる。その長さ
も特に限定されないが、通常は、３０塩基対（ｂｐ）以
上、好ましくは４５ｂｐ以上である。突出末端の配列も
限定されないが、各種の反応において自己連結すること
を防ぐためにはステム構造をとる配列ではないことが好
ましい。ここで、「ステム構造をとる配列」とは、例え
ば、ＡＡＴＴのような、その相補鎖（ＴＴＡＡ）と配列
が全く同じになる配列のことである。突出末端の長さは
通常は２塩基以上、好ましくは１５塩基以上３０塩基以
下である。突出末端が長すぎると二次構造を形成し、分
子間アニーリングが困難になり、短すぎると、融解温度
（Ｔｍ）が低下し、アニーリングが不安定になる。突出
末端は、２本鎖ＤＮＡの３’末端または５’末端のいず
れに連結したものでもよいが、３’末端への連結が好ま
しい。一方の端部のみ突出末端を有する構造でもよい
し、両端に突出末端を有する構造でもよい。
ける２本鎖部分の配列は特に限定されない。例えば、遺
伝子の一部と同一の配列とすることができる。その長さ
も特に限定されないが、通常は、３０塩基対（ｂｐ）以
上、好ましくは４５ｂｐ以上である。突出末端の配列も
限定されないが、各種の反応において自己連結すること
を防ぐためにはステム構造をとる配列ではないことが好
ましい。ここで、「ステム構造をとる配列」とは、例え
ば、ＡＡＴＴのような、その相補鎖（ＴＴＡＡ）と配列
が全く同じになる配列のことである。突出末端の長さは
通常は２塩基以上、好ましくは１５塩基以上３０塩基以
下である。突出末端が長すぎると二次構造を形成し、分
子間アニーリングが困難になり、短すぎると、融解温度
（Ｔｍ）が低下し、アニーリングが不安定になる。突出
末端は、２本鎖ＤＮＡの３’末端または５’末端のいず
れに連結したものでもよいが、３’末端への連結が好ま
しい。一方の端部のみ突出末端を有する構造でもよい
し、両端に突出末端を有する構造でもよい。
【００２１】［末端突出ＤＮＡの製造方法］本発明の末
端突出ＤＮＡは、典型的には、以下に示す工程ａ）〜
ｄ）により製造することができる。なお、ここでは、次
式(1):
端突出ＤＮＡは、典型的には、以下に示す工程ａ）〜
ｄ）により製造することができる。なお、ここでは、次
式(1):
【化１】 （αおよびｃは任意の配列。ａとγはそれぞれαとｃに
相補的な配列である。）で表わされる２本鎖ＤＮＡ（鋳
型ＤＮＡ）をもとに次式(2):
相補的な配列である。）で表わされる２本鎖ＤＮＡ（鋳
型ＤＮＡ）をもとに次式(2):
【化２】 （式中、βは突出末端の配列を示す。他の記号の意味は
上記と同じ。）で表わされる構造を有する末端突出ＤＮ
Ａを製造する方法について説明するが、他の構造を有す
る末端突出ＤＮＡについても同様に製造できる。
上記と同じ。）で表わされる構造を有する末端突出ＤＮ
Ａを製造する方法について説明するが、他の構造を有す
る末端突出ＤＮＡについても同様に製造できる。
【００２２】工程ａ (a-1) オリゴヌクレオチドの調製 初めに、突出末端ＤＮＡの２本鎖部分として選択する部
分を鋳型ＤＮＡ上で定め、その端部αに相補的なオリゴ
ヌクレオチドａおよびもう一方の端部ｃと同一の配列を
有するオリゴヌクレオチドｃを調製する。αおよびｃは
１５〜３０個程度の塩基長を有する配列であればよい。
また、突出末端配列（β）の５’末端から１塩基（Ｘと
する。）を除いた配列に対し相補的なオリゴヌクレオチ
ドｂを調製する。塩基配列βは上記ＤＮＡ上の一部でも
よいし、上記ＤＮＡ上にはない任意の配列でもよい。こ
れらのオリゴヌクレオチドａ、ｂおよびｃはどのような
方法により得られるものでもよい。予め配列がわかって
いれば、既知のＤＮＡ合成装置を用いて合成してもよ
い。
分を鋳型ＤＮＡ上で定め、その端部αに相補的なオリゴ
ヌクレオチドａおよびもう一方の端部ｃと同一の配列を
有するオリゴヌクレオチドｃを調製する。αおよびｃは
１５〜３０個程度の塩基長を有する配列であればよい。
また、突出末端配列（β）の５’末端から１塩基（Ｘと
する。）を除いた配列に対し相補的なオリゴヌクレオチ
ドｂを調製する。塩基配列βは上記ＤＮＡ上の一部でも
よいし、上記ＤＮＡ上にはない任意の配列でもよい。こ
れらのオリゴヌクレオチドａ、ｂおよびｃはどのような
方法により得られるものでもよい。予め配列がわかって
いれば、既知のＤＮＡ合成装置を用いて合成してもよ
い。
【００２３】(a-2) リボヌクレオチド含有断片の調製 次にオリゴヌクレオチドａとｂとをリボヌクレオチドを
介して連結する。これは通常の合成法によってもよい
が、次に示す方法も用いることができる。まず、オリゴ
ヌクレオチドａの５’末端にリン酸基を付加する（次式
(3)):
介して連結する。これは通常の合成法によってもよい
が、次に示す方法も用いることができる。まず、オリゴ
ヌクレオチドａの５’末端にリン酸基を付加する（次式
(3)):
【化３】 の（式中、(P) はリン酸基を表わす。）。この反応は、
ポリヌクレオチドキナーゼを作用させて行なうことがで
きる。ＡＴＰはオリゴヌクレオチドａに対しモル比で２
〜１０倍程度を用いる。反応温度は３０〜４０℃程度で
あり、反応時間は１０分〜１時間程度である。ｐＨ７〜
９程度が最適である。リン酸基付加後のオリゴヌクレオ
チドをａ′で表わす。
ポリヌクレオチドキナーゼを作用させて行なうことがで
きる。ＡＴＰはオリゴヌクレオチドａに対しモル比で２
〜１０倍程度を用いる。反応温度は３０〜４０℃程度で
あり、反応時間は１０分〜１時間程度である。ｐＨ７〜
９程度が最適である。リン酸基付加後のオリゴヌクレオ
チドをａ′で表わす。
【００２４】また、オリゴヌクレオチドｂの３’末端に
はリボヌクレオチドを付加する（次式(4))：
はリボヌクレオチドを付加する（次式(4))：
【化４】 （式中、ＸＴＰはＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰのい
ずれかを、(rX)はリボヌクレオチドを表わす。）。この
反応は、例えば、ターミナルデオキシヌクレオチジルト
ランスフェラーゼを作用させて行なうことができる。用
いるヌクレオシド三リン酸（ＸＴＰ）には、工程(a-1)
における塩基Ｘに対応するリボヌクレオチドが選択され
る。ヌクレオシド三リン酸はオリゴヌクレオチドｂに対
しモル比で２〜１０倍程度を用いる。反応温度は３０〜
４０℃程度であり反応時間は３０分〜２時間程度であ
る。付加後のオリゴヌクレオチドをｂ′で表わす。ｂ′
は配列βと相補的な配列となる。
ずれかを、(rX)はリボヌクレオチドを表わす。）。この
反応は、例えば、ターミナルデオキシヌクレオチジルト
ランスフェラーゼを作用させて行なうことができる。用
いるヌクレオシド三リン酸（ＸＴＰ）には、工程(a-1)
における塩基Ｘに対応するリボヌクレオチドが選択され
る。ヌクレオシド三リン酸はオリゴヌクレオチドｂに対
しモル比で２〜１０倍程度を用いる。反応温度は３０〜
４０℃程度であり反応時間は３０分〜２時間程度であ
る。付加後のオリゴヌクレオチドをｂ′で表わす。ｂ′
は配列βと相補的な配列となる。
【００２５】このようにして得られたオリゴヌクレオチ
ドａ′とｂ′を混合し、ｂ′のリボヌクレオチド３’末
端（水酸基）にａ′の５’末端（リン酸基）を結合する
（次式(5))：
ドａ′とｂ′を混合し、ｂ′のリボヌクレオチド３’末
端（水酸基）にａ′の５’末端（リン酸基）を結合する
（次式(5))：
【化５】 この反応は、例えば、ＡＴＰと２価金属イオンの存在下
にＲＮＡリガーゼを作用させることにより行なうことが
できる（特開平5-292967号公報）。有用な２価の金属イ
オンはマグネシウムイオン、マンガンイオン等であり、
好ましくはマグネシウムイオンである。リガーゼとして
はＲＮＡリガーゼを用いることができる。ＲＮＡリガー
ゼはＲＮＡを３’末端の水酸基と５’末端のリン酸基と
で連結させる酵素であるが、３’端のみがリボヌクレオ
チドであるポリデオキシリボヌクレオチドと５’リン酸
基末端のポリデオキシリボヌクレオチドも効率的に連結
する。好ましくはＴ４ＲＮＡリガーゼを用いる。反応
は、通常、緩衝液中、ｐＨ７〜９、１０〜４０℃の温度
で３０〜１８０分間かけて行なわれる。例えば、５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ 8.0）、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2 、0.1 ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍｇ／ｌ ＢＳＡ、１ｍ
Ｍ ヘキサアンミンコバルトクロライド（ＨＣＣ）、２
５％ポリエチレングリコール６０００溶液中、２５℃で
６０分以上反応させる。
にＲＮＡリガーゼを作用させることにより行なうことが
できる（特開平5-292967号公報）。有用な２価の金属イ
オンはマグネシウムイオン、マンガンイオン等であり、
好ましくはマグネシウムイオンである。リガーゼとして
はＲＮＡリガーゼを用いることができる。ＲＮＡリガー
ゼはＲＮＡを３’末端の水酸基と５’末端のリン酸基と
で連結させる酵素であるが、３’端のみがリボヌクレオ
チドであるポリデオキシリボヌクレオチドと５’リン酸
基末端のポリデオキシリボヌクレオチドも効率的に連結
する。好ましくはＴ４ＲＮＡリガーゼを用いる。反応
は、通常、緩衝液中、ｐＨ７〜９、１０〜４０℃の温度
で３０〜１８０分間かけて行なわれる。例えば、５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ 8.0）、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2 、0.1 ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍｇ／ｌ ＢＳＡ、１ｍ
Ｍ ヘキサアンミンコバルトクロライド（ＨＣＣ）、２
５％ポリエチレングリコール６０００溶液中、２５℃で
６０分以上反応させる。
【００２６】工程ｂ 工程 (a-1)の配列αを含むＤＮＡを鋳型とし、工程 (a-
2)で得られた連結オリゴヌクレオチドｂ′−ａ′をプラ
イマーとしてＤＮＡポリメラーゼ反応を行ない２本鎖Ｄ
ＮＡを調製する。通常は、工程 (a-1)の配列αとγとを
それぞれの鎖上に含む２本鎖ＤＮＡを熱またはアルカリ
変性してそれぞれ１本鎖ＤＮＡとし、プライマーとして
ｂ′−ａ′に加え工程 (a-1)のオリゴヌクレオチドｃを
用いてＰＣＲを行なう。プライマーのアニーリング条
件、ポリメラーゼの反応条件は一般のポリメラーゼ反応
における条件と同様である。ＤＮＡポリメラーゼとして
は、Ｔａｑポリメラーゼ、クレノー断片(Klenow Fragme
nt) 、ＤＮＡポリメラーゼＩ等、ＤＮＡ伸長反応を触媒
する酵素ならば種類を問わない。反応の結果、下記式
(6)：
2)で得られた連結オリゴヌクレオチドｂ′−ａ′をプラ
イマーとしてＤＮＡポリメラーゼ反応を行ない２本鎖Ｄ
ＮＡを調製する。通常は、工程 (a-1)の配列αとγとを
それぞれの鎖上に含む２本鎖ＤＮＡを熱またはアルカリ
変性してそれぞれ１本鎖ＤＮＡとし、プライマーとして
ｂ′−ａ′に加え工程 (a-1)のオリゴヌクレオチドｃを
用いてＰＣＲを行なう。プライマーのアニーリング条
件、ポリメラーゼの反応条件は一般のポリメラーゼ反応
における条件と同様である。ＤＮＡポリメラーゼとして
は、Ｔａｑポリメラーゼ、クレノー断片(Klenow Fragme
nt) 、ＤＮＡポリメラーゼＩ等、ＤＮＡ伸長反応を触媒
する酵素ならば種類を問わない。反応の結果、下記式
(6)：
【化６】 で表わされる末端が平滑な２本鎖ＤＮＡが得られる。
【００２７】工程ｃ 次いで、酵素反応もしくは化学反応によって前記２本鎖
ＤＮＡ中のリボヌクレオチドを除去する。有用な酵素の
例としてはリボヌクレアーゼが挙げられる。反応は通
常、ｐＨ６〜８、３０〜７０℃で１０〜６０分間程度で
進行する。非酵素的な薬剤としては水酸化ナトリウム等
が有用である。反応の結果、次式 (7)：
ＤＮＡ中のリボヌクレオチドを除去する。有用な酵素の
例としてはリボヌクレアーゼが挙げられる。反応は通
常、ｐＨ６〜８、３０〜７０℃で１０〜６０分間程度で
進行する。非酵素的な薬剤としては水酸化ナトリウム等
が有用である。反応の結果、次式 (7)：
【化７】 で表わされる、前記塩基Ｘに対応する部分が欠失した一
部非連続な２本鎖ＤＮＡが得られる。
部非連続な２本鎖ＤＮＡが得られる。
【００２８】工程ｄ しかる後、前記欠失部よりも５’端側に残存するヌクレ
オチドを除去する。ヌクレオチドの除去は、例えば工程
ｃでリボヌクレオチドの除去された２本鎖ＤＮＡを５０
〜９０℃程度に加熱することにより行なうことができ
る。この操作によって鎖から離れてできたポリヌクレオ
チドはスパンカラム等を用いて除くことができる。かく
して、式（2)で表わされる末端突出２本鎖ＤＮＡを得る
ことができる。以上の説明では、一方の３’末端のみを
突出末端としているが、上記方法に準じて他方の３’末
端を突出末端とすることも可能である。また、上記の方
法は、鋳型ＤＮＡにおいて配列αに連続する位置に存在
しない任意の配列βを導入して突出末端としたが、鋳型
ＤＮＡにおいて連続する位置に存在するオリゴヌクレオ
チドを突出末端とすることも可能である。例えば、上記
の例で、オリゴヌクレオチドｃに代えて、その３’末端
のデオキシリボヌクレオチドがリボヌクレオチドに置換
されたオリゴヌクレオチドｃ′をプライマーに用いるこ
とにより、次式 (8)：
オチドを除去する。ヌクレオチドの除去は、例えば工程
ｃでリボヌクレオチドの除去された２本鎖ＤＮＡを５０
〜９０℃程度に加熱することにより行なうことができ
る。この操作によって鎖から離れてできたポリヌクレオ
チドはスパンカラム等を用いて除くことができる。かく
して、式（2)で表わされる末端突出２本鎖ＤＮＡを得る
ことができる。以上の説明では、一方の３’末端のみを
突出末端としているが、上記方法に準じて他方の３’末
端を突出末端とすることも可能である。また、上記の方
法は、鋳型ＤＮＡにおいて配列αに連続する位置に存在
しない任意の配列βを導入して突出末端としたが、鋳型
ＤＮＡにおいて連続する位置に存在するオリゴヌクレオ
チドを突出末端とすることも可能である。例えば、上記
の例で、オリゴヌクレオチドｃに代えて、その３’末端
のデオキシリボヌクレオチドがリボヌクレオチドに置換
されたオリゴヌクレオチドｃ′をプライマーに用いるこ
とにより、次式 (8)：
【化８】 で表わされる両端突出ＤＮＡを調製してもよい。
【００２９】［ＤＮＡのシャフリング方法］本発明は、
さらに、末端突出ＤＮＡを用いることを特徴とするＤＮ
Ａのシャフリング方法を提供する。ここで「シャフリン
グ」(shuffling) とは、ＤＮＡを分割しこれを任意に配
列し直す操作をいう。例えば、１個のＤＮＡが次式
(9)：
さらに、末端突出ＤＮＡを用いることを特徴とするＤＮ
Ａのシャフリング方法を提供する。ここで「シャフリン
グ」(shuffling) とは、ＤＮＡを分割しこれを任意に配
列し直す操作をいう。例えば、１個のＤＮＡが次式
(9)：
【化９】Ａ−ａ1 −ａ2 −……−ａn −Ｂ (9) （始端部Ａおよび／または終端部Ｂはなくてもよい。）
のようにｎ個のブロックの連結部分を含む配列で表され
る場合に、シャフリングは次式：
のようにｎ個のブロックの連結部分を含む配列で表され
る場合に、シャフリングは次式：
【化１０】Ａ−ａ1'−ａ2'−……−ａx −Ｂ (10) （式中、ａ1'，ａ2'，……，ａx は、ａ1 ，ａ2 ，…
…，ａn からなる群よりそれぞれ独立に選ばれるブロッ
クである。但し、ａ1'，ａ2'，……，ａx のブロックの
総数はａ1 ，ａ2 ，……，ａn のブロックの総数に一致
しなくてもよい。）で表されるＤＮＡを与える操作であ
る。
…，ａn からなる群よりそれぞれ独立に選ばれるブロッ
クである。但し、ａ1'，ａ2'，……，ａx のブロックの
総数はａ1 ，ａ2 ，……，ａn のブロックの総数に一致
しなくてもよい。）で表されるＤＮＡを与える操作であ
る。
【００３０】本発明による末端突出ＤＮＡを利用したＤ
ＮＡシャフリングの原理を図１に模式的に示す。図１で
は、ＤＮＡをその両端の部分ｐA とｐB については変更
せず、中間部をｐ1 −ｐ2 −ｐ3 （最上段）からｐ3 −
ｐ1 −ｐ2 （最下段）にシャフルしている。このような
シャフリングは、プロモータとターミネータの配列を変
えないまま、従来存在しなかった遺伝子配列を得る方法
として有用である。具体的には、初めに、鋳型ＤＮＡの
各部ｐA ，ｐ1 ，ｐ2 ，ｐ3 ，ｐB に対して上記の突出
末端ＤＮＡ方法を適用し、両端突出型（式 (8)）構造を
有するＤＮＡブロックａ1 ，ａ2 ，ａ3 ，並びに片端突
出型（式 (2)）構造を有するＤＮＡブロックＡおよびＢ
を調製する。突出末端ａA およびａ1fとａ2fとａ3fは、
ブロックｐA ，ｐ1 ，ｐ2 およびｐ3 からそれぞれに対
応する相補鎖を除去して突出末端としたものである。
ＮＡシャフリングの原理を図１に模式的に示す。図１で
は、ＤＮＡをその両端の部分ｐA とｐB については変更
せず、中間部をｐ1 −ｐ2 −ｐ3 （最上段）からｐ3 −
ｐ1 −ｐ2 （最下段）にシャフルしている。このような
シャフリングは、プロモータとターミネータの配列を変
えないまま、従来存在しなかった遺伝子配列を得る方法
として有用である。具体的には、初めに、鋳型ＤＮＡの
各部ｐA ，ｐ1 ，ｐ2 ，ｐ3 ，ｐB に対して上記の突出
末端ＤＮＡ方法を適用し、両端突出型（式 (8)）構造を
有するＤＮＡブロックａ1 ，ａ2 ，ａ3 ，並びに片端突
出型（式 (2)）構造を有するＤＮＡブロックＡおよびＢ
を調製する。突出末端ａA およびａ1fとａ2fとａ3fは、
ブロックｐA ，ｐ1 ，ｐ2 およびｐ3 からそれぞれに対
応する相補鎖を除去して突出末端としたものである。
【００３１】突出部分ａ1rとａ2rとａ3rおよびａB は所
望のシャフリング配列にしたがって設計される。図１の
例では、ａ1rはａ3fの相補鎖として設計されており、シ
ャフリング後にブロックａ1 はブロックａ3 と連結す
る。連結は、ＡＴＰ存在下、ＤＮＡリガーゼを用いて連
結する。ＤＮＡリガーゼの種類を問わないが、突出末端
の一本鎖部分が長いので、通常の１６℃で反応させる必
要はなく、好熱性のＤＮＡリガーゼを用いるのが有利で
ある。同様に、図１の例ではａ2rとａ3rおよびａB はそ
れぞれａ1fとａA およびａ2fの相補鎖として設計されて
いる。この結果、最終的にＡ−ａ3 −ａ1 −ａ2 −Ｂな
る配列の構造が得られるが、これは、見掛け上は、分割
前のＤＮＡをブロックｐ1 ，ｐ2 ，ｐ3 ，ｐA ，ｐB に
分割し、ｐA −ｐ3 −ｐ1 −ｐ2 −ｐB の順番に並べ換
えたのと同じ結果になっている。
望のシャフリング配列にしたがって設計される。図１の
例では、ａ1rはａ3fの相補鎖として設計されており、シ
ャフリング後にブロックａ1 はブロックａ3 と連結す
る。連結は、ＡＴＰ存在下、ＤＮＡリガーゼを用いて連
結する。ＤＮＡリガーゼの種類を問わないが、突出末端
の一本鎖部分が長いので、通常の１６℃で反応させる必
要はなく、好熱性のＤＮＡリガーゼを用いるのが有利で
ある。同様に、図１の例ではａ2rとａ3rおよびａB はそ
れぞれａ1fとａA およびａ2fの相補鎖として設計されて
いる。この結果、最終的にＡ−ａ3 −ａ1 −ａ2 −Ｂな
る配列の構造が得られるが、これは、見掛け上は、分割
前のＤＮＡをブロックｐ1 ，ｐ2 ，ｐ3 ，ｐA ，ｐB に
分割し、ｐA −ｐ3 −ｐ1 −ｐ2 −ｐB の順番に並べ換
えたのと同じ結果になっている。
【００３２】他の任意の配列も上記と同様に実現するこ
とができる。ブロックＡまたはＢを両端突出型とし、他
のブロックを片端突出型とすれば、当該他のブロックを
端に位置させるシャフリングも可能である。さらに、シ
ャフリングに際し、もとの遺伝子に含まれない末端突出
ＤＮＡブロックを導入してもよい。例えば、２個以上の
遺伝子ＤＮＡに対してシャフリングを行なうことも可能
である。この場合は、必要に応じ、一方の遺伝子の末端
部、例えば上記例のブロックＡについても両端突出ＤＮ
Ａとする。
とができる。ブロックＡまたはＢを両端突出型とし、他
のブロックを片端突出型とすれば、当該他のブロックを
端に位置させるシャフリングも可能である。さらに、シ
ャフリングに際し、もとの遺伝子に含まれない末端突出
ＤＮＡブロックを導入してもよい。例えば、２個以上の
遺伝子ＤＮＡに対してシャフリングを行なうことも可能
である。この場合は、必要に応じ、一方の遺伝子の末端
部、例えば上記例のブロックＡについても両端突出ＤＮ
Ａとする。
【００３３】シャフリングの単位となるブロックは、２
個以上のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまた
はポリヌクレオチド（以下、単に「オリゴヌクレオチ
ド」という。）である。通常は、３０個以上のヌクレオ
チド単位を含有することが好ましく、４５個以上のヌク
レオチド単位を含有することがより好ましい。ブロック
長の上限は１遺伝子の長さより短ければ特に限定されな
いが、ブロック長が長すぎると変異のない塩基配列部分
が多く含まれることになるため、通常は遺伝子の長さの
１０〜３５％以下が好ましい。
個以上のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまた
はポリヌクレオチド（以下、単に「オリゴヌクレオチ
ド」という。）である。通常は、３０個以上のヌクレオ
チド単位を含有することが好ましく、４５個以上のヌク
レオチド単位を含有することがより好ましい。ブロック
長の上限は１遺伝子の長さより短ければ特に限定されな
いが、ブロック長が長すぎると変異のない塩基配列部分
が多く含まれることになるため、通常は遺伝子の長さの
１０〜３５％以下が好ましい。
【００３４】また、シャフリングされる遺伝子がタンパ
ク質をコードする遺伝子である場合、遺伝子ブロックで
あるオリゴヌクレオチドは、分割前後で読み枠が合うこ
とが望ましい。つまり、シャフルされる遺伝子ブロック
は、シャフリング後、相対的にどの位置に来てもそのブ
ロック部分が翻訳されて生ずるアミノ酸配列は同じであ
るように設計することが望ましい。このためには、遺伝
子ＤＮＡの読み枠にしたがいコドン単位で２本鎖部分お
よび突出末端を選択すればよい。もっとも、ブロックへ
の分割は遺伝子上の意味的なセグメントごとに行なう必
要はない。すなわち、エクソンごとあるいはコードする
タンパク質のドメインまたはモジュールに対応するセグ
メントごとに分割する必要はない。このような部位での
シャフリングは過去において自然界で試験された可能性
がある。従来、自然界で試験されていない塩基配列を得
るためには、エクソン内部、あるいはコードするタンパ
ク質のドメインまたはモジュール内に相当する部位での
分割が好ましい。
ク質をコードする遺伝子である場合、遺伝子ブロックで
あるオリゴヌクレオチドは、分割前後で読み枠が合うこ
とが望ましい。つまり、シャフルされる遺伝子ブロック
は、シャフリング後、相対的にどの位置に来てもそのブ
ロック部分が翻訳されて生ずるアミノ酸配列は同じであ
るように設計することが望ましい。このためには、遺伝
子ＤＮＡの読み枠にしたがいコドン単位で２本鎖部分お
よび突出末端を選択すればよい。もっとも、ブロックへ
の分割は遺伝子上の意味的なセグメントごとに行なう必
要はない。すなわち、エクソンごとあるいはコードする
タンパク質のドメインまたはモジュールに対応するセグ
メントごとに分割する必要はない。このような部位での
シャフリングは過去において自然界で試験された可能性
がある。従来、自然界で試験されていない塩基配列を得
るためには、エクソン内部、あるいはコードするタンパ
ク質のドメインまたはモジュール内に相当する部位での
分割が好ましい。
【００３５】このような手法を採ることにより、全体と
しては天然のタンパク質とは構造が異なるが、部分的に
は自然界において有用であることが確認されているアミ
ノ酸配列を含むタンパク質を得ることができ、完全にラ
ンダムに合成するよりも有用なタンパク質を得る確率が
高くなる。
しては天然のタンパク質とは構造が異なるが、部分的に
は自然界において有用であることが確認されているアミ
ノ酸配列を含むタンパク質を得ることができ、完全にラ
ンダムに合成するよりも有用なタンパク質を得る確率が
高くなる。
【００３６】シャフリングの対象とする遺伝子の種類は
特に限定されない。ポリヌクレオチド鎖から構成され、
タンパク質またはＲＮＡを発現するのに必要なコード領
域であればよい。ヌクレオチド単位はデオキシリボヌク
レオチドまたはリボヌクレオチドのいずれの分子を含む
ものでもよい。有用な塩基配列を見出すという目的から
は、タンパク質、特に酵素をコードする遺伝子または酵
素機能の制御遺伝子が好ましい。このような酵素の例と
しては、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アミラ
ーゼ、カタラーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、デヒ
ドロゲナーゼ、オキシゲナーゼ、レダクターゼ等が挙げ
られる。
特に限定されない。ポリヌクレオチド鎖から構成され、
タンパク質またはＲＮＡを発現するのに必要なコード領
域であればよい。ヌクレオチド単位はデオキシリボヌク
レオチドまたはリボヌクレオチドのいずれの分子を含む
ものでもよい。有用な塩基配列を見出すという目的から
は、タンパク質、特に酵素をコードする遺伝子または酵
素機能の制御遺伝子が好ましい。このような酵素の例と
しては、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アミラ
ーゼ、カタラーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、デヒ
ドロゲナーゼ、オキシゲナーゼ、レダクターゼ等が挙げ
られる。
【００３７】遺伝子は生命体からクローニングしたも
の、人工合成したもの、また、生命体からクローニング
し、それに人工的に変異を加えたもの等、それを適当な
宿主に導入すれば当該遺伝子の発現により遺伝子産物を
生産するものであれば種類を問わない。生命体由来とす
る場合には、酵素産生能力の明確な原核生物を用いるこ
とができる。このような原核生物の例としては、バチル
ス属細菌が挙げられ、かかる細菌に由来の遺伝子の例と
しては、バチルスＮＫＳ−２１（受託番号：ＦＥＲＭ
ＢＰ−９３−１）に由来するプロテアーゼAPI 21遺伝子
（特開平 5ー91876号公報）（配列番号１）が挙げられ
る。
の、人工合成したもの、また、生命体からクローニング
し、それに人工的に変異を加えたもの等、それを適当な
宿主に導入すれば当該遺伝子の発現により遺伝子産物を
生産するものであれば種類を問わない。生命体由来とす
る場合には、酵素産生能力の明確な原核生物を用いるこ
とができる。このような原核生物の例としては、バチル
ス属細菌が挙げられ、かかる細菌に由来の遺伝子の例と
しては、バチルスＮＫＳ−２１（受託番号：ＦＥＲＭ
ＢＰ−９３−１）に由来するプロテアーゼAPI 21遺伝子
（特開平 5ー91876号公報）（配列番号１）が挙げられ
る。
【００３８】［ＤＮＡプール］本発明はまた、前記のシ
ャフリング方法を応用して得られるＤＮＡプールに関す
る。ここで、「ＤＮＡプール」とは、２種類以上のＤＮ
Ａを高密度で含む混合物を意味する。本発明のＤＮＡプ
ールは、特定の数以上、例えば１０種類以上の相異なる
構造を有するＤＮＡ分子を含有するものとすることがで
きる。生化学的な操作ないし反応に混合物のまま使用し
たときに複数の核酸成分について反応が進行し得る状態
にあることが望ましいが、溶液状態、乾燥状態等の状態
は問わない。ＤＮＡプールの製造は、前記シャフリング
において、各ブロックごとに突出末端を複数用意するこ
とにより行なうことができる。例えば、図１の例で、ブ
ロックａ1 の突出末端ａ1rとして、ａ3fの相補鎖に加え
て、他の突出末端ａA ，ａ2fの相補鎖をも用いることに
より、Ａ−ａ1 −ａ2 −Ｂ、Ａ−ａ1 −ａ2 −ａ1 のよ
うなＤＮＡが得られる。ａ1 の他方の突出末端ａ1fの相
補鎖を加えれば、Ａ−ａ1 −ａ1 −ａ1 等、同一ブロッ
クが連続するＤＮＡも調製可能である。同様に、ａ2 お
よびａ3 の突出末端についても、他のブロックのまたは
自己の他方の突出末端と相補的なオリゴヌクレオチドを
加えれば、これらを含む他の配列が可能となる。
ャフリング方法を応用して得られるＤＮＡプールに関す
る。ここで、「ＤＮＡプール」とは、２種類以上のＤＮ
Ａを高密度で含む混合物を意味する。本発明のＤＮＡプ
ールは、特定の数以上、例えば１０種類以上の相異なる
構造を有するＤＮＡ分子を含有するものとすることがで
きる。生化学的な操作ないし反応に混合物のまま使用し
たときに複数の核酸成分について反応が進行し得る状態
にあることが望ましいが、溶液状態、乾燥状態等の状態
は問わない。ＤＮＡプールの製造は、前記シャフリング
において、各ブロックごとに突出末端を複数用意するこ
とにより行なうことができる。例えば、図１の例で、ブ
ロックａ1 の突出末端ａ1rとして、ａ3fの相補鎖に加え
て、他の突出末端ａA ，ａ2fの相補鎖をも用いることに
より、Ａ−ａ1 −ａ2 −Ｂ、Ａ−ａ1 −ａ2 −ａ1 のよ
うなＤＮＡが得られる。ａ1 の他方の突出末端ａ1fの相
補鎖を加えれば、Ａ−ａ1 −ａ1 −ａ1 等、同一ブロッ
クが連続するＤＮＡも調製可能である。同様に、ａ2 お
よびａ3 の突出末端についても、他のブロックのまたは
自己の他方の突出末端と相補的なオリゴヌクレオチドを
加えれば、これらを含む他の配列が可能となる。
【００３９】一般的には、あるＤＮＡをａ1 ，ａ2 ，ａ
3 ，・・・，ａn のブロックに分割する。各ブロックに
は、上記の方法に従い、突出末端を設ける。突出末端
は、他のブロックのまたは自己の他方の突出末端と相補
的なオリゴヌクレオチドとして設計する。得られたＤＮ
Ａブロックの全てまたは一部を混合し、これらを連結す
ることにより、ランダムな順番にブロックが連結した核
酸プールを作成することが出来る。
3 ，・・・，ａn のブロックに分割する。各ブロックに
は、上記の方法に従い、突出末端を設ける。突出末端
は、他のブロックのまたは自己の他方の突出末端と相補
的なオリゴヌクレオチドとして設計する。得られたＤＮ
Ａブロックの全てまたは一部を混合し、これらを連結す
ることにより、ランダムな順番にブロックが連結した核
酸プールを作成することが出来る。
【００４０】［シャフルされたＤＮＡまたはＤＮＡプー
ル中の遺伝情報の発現］このようにしてシャフルされた
単一のまたは混合物である二本鎖ＤＮＡを平滑化する。
連結反応時に端部に片端突出型のＤＮＡブロックを用い
て平滑化を省略してもよい。例えば、一定のプロモータ
ー配列を含むＤＮＡブロックのプロモーターの向きを基
準にした時の５’側を突出末端にせず、平滑末端にし、
ターミネーター配列を含むＤＮＡブロックのターミネー
ターの向きを基準にした時の３’側を突出末端にせず、
平滑末端にする。これにより、プロモーターとターミネ
ーターの間に目的遺伝子のブロックがシャフルした遺伝
子を得ることができるとともに平滑化の省略が可能であ
る。しかる後、ＤＮＡリガーゼを用い、任意のベクタ
ー、好ましくはｐＫＫ２２３−３の如き発現ベクターに
シャフルされたＤＮＡを組み込む。なお、プロモーター
配列、ターミネーター配列は一種でも、複数種でもかま
わない。
ル中の遺伝情報の発現］このようにしてシャフルされた
単一のまたは混合物である二本鎖ＤＮＡを平滑化する。
連結反応時に端部に片端突出型のＤＮＡブロックを用い
て平滑化を省略してもよい。例えば、一定のプロモータ
ー配列を含むＤＮＡブロックのプロモーターの向きを基
準にした時の５’側を突出末端にせず、平滑末端にし、
ターミネーター配列を含むＤＮＡブロックのターミネー
ターの向きを基準にした時の３’側を突出末端にせず、
平滑末端にする。これにより、プロモーターとターミネ
ーターの間に目的遺伝子のブロックがシャフルした遺伝
子を得ることができるとともに平滑化の省略が可能であ
る。しかる後、ＤＮＡリガーゼを用い、任意のベクタ
ー、好ましくはｐＫＫ２２３−３の如き発現ベクターに
シャフルされたＤＮＡを組み込む。なお、プロモーター
配列、ターミネーター配列は一種でも、複数種でもかま
わない。
【００４１】あるいは、両端に位置するポリヌクレオチ
ドブロックに適当な制限酵素認識部位を作ることによ
り、その制限酵素を利用してベクターに連結することも
可能である。次に、上記の如く作成したベクターライブ
ラリーを適当な宿主に導入し、その遺伝情報を発現させ
ることによって、好ましい性質を持つ遺伝子産物、およ
びそれをコードする遺伝子を取得することが出来る。宿
主は慣用のものでよい。好ましい例としては、大腸菌E.
coli、バチルス属細菌、酵母、乳酸菌等が挙げられる。
ドブロックに適当な制限酵素認識部位を作ることによ
り、その制限酵素を利用してベクターに連結することも
可能である。次に、上記の如く作成したベクターライブ
ラリーを適当な宿主に導入し、その遺伝情報を発現させ
ることによって、好ましい性質を持つ遺伝子産物、およ
びそれをコードする遺伝子を取得することが出来る。宿
主は慣用のものでよい。好ましい例としては、大腸菌E.
coli、バチルス属細菌、酵母、乳酸菌等が挙げられる。
【００４２】但し、試験管内転写系、翻訳系を使用する
ことも可能であり、その場合は、ベクターに連結しなく
ても遺伝情報の発現が可能である。なお、「遺伝情報」
とはＤＮＡによって担われ、それ単独で、または他の配
列からなるＤＮＡまたはＲＮＡと連結することによっ
て、適当な生体内でタンパク質に翻訳される、あるいは
ＲＮＡに転写されるものを言う。本発明の方法により発
現が期待される遺伝情報は特に限定されないが、各種の
遺伝子産物、例えば、酵素、抗体、ホルモン、レセプタ
ータンパク質、リボザイム等あるいは、各種の制御機
能、例えば、オペレーター、プロモーター、アテニュエ
ーター等がその例として挙げられる。
ことも可能であり、その場合は、ベクターに連結しなく
ても遺伝情報の発現が可能である。なお、「遺伝情報」
とはＤＮＡによって担われ、それ単独で、または他の配
列からなるＤＮＡまたはＲＮＡと連結することによっ
て、適当な生体内でタンパク質に翻訳される、あるいは
ＲＮＡに転写されるものを言う。本発明の方法により発
現が期待される遺伝情報は特に限定されないが、各種の
遺伝子産物、例えば、酵素、抗体、ホルモン、レセプタ
ータンパク質、リボザイム等あるいは、各種の制御機
能、例えば、オペレーター、プロモーター、アテニュエ
ーター等がその例として挙げられる。
【００４３】
【実施例】以下、実施例により本発明をより具体的に説
明するが、これらは本発明を限定するものではない。実施例１：ＤＮＡプールの製造 配列番号１に示すプロテアーゼ API21（バチルスＮＫＳ
ー２１（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−９３−１）からク
ローニングされた野生型アルカリプロテアーゼ（特開平
5-91876 号公報))に基づく核酸プールを以下の手順によ
り製造した。 (1) 工程ａ：プライマー用オリゴヌクレオチドブロック
の調製 (1-1) オリゴヌクレオチドブロックの合成 パーキンエルマー社のＤＮＡ自動合成機モデル３９２を
用い、１４種のオリゴヌクレオチド：オリゴＦＷ（配列
番号２）、オリゴＲＶ（配列番号３）、オリゴ１ｒ（配
列番号４）、オリゴ１ｂ（配列番号５）、オリゴ１ａ
（配列番号６）、オリゴ２ｒ（配列番号７）、オリゴ２
ｂ（配列番号８）、オリゴ２ａ（配列番号９）、オリゴ
３ｒ（配列番号１０）、オリゴ３ｂ（配列番号１１）、
オリゴ３ａ（配列番号１２）、オリゴ４ｒ（配列番号１
３）、オリゴ４ｂ（配列番号１４）、オリゴ４ａ（配列
番号１５）およびオリゴＡ（配列番号１６）を合成し
た。これらはＡＰＩ２１の塩基配列（特開平5-91876 号
公報）（相補鎖も含む）の一部からなる、若しくは一部
を含むオリゴヌクレオチドである。但し、オリゴ４ａは
配列番号１のグルタミンの後の配列で遺伝子の終始コド
ン等を含む。また、これらのオリゴヌクレオチドは以後
の実験でＴａｑポリメラーゼを用い、増幅ＤＮＡの３’
末端にＡがオーバーハングしたときに最適になるように
設計した。各オリゴヌクレオチドの合成は、ＤＭトリチ
ルオンで行ない（すなわち、ジメトキシトリチル基で
５’水酸基を保護した。）、ＯＰＣカラムで精製した。
試薬はパーキンエルマー社から購入したものを用いた。
明するが、これらは本発明を限定するものではない。実施例１：ＤＮＡプールの製造 配列番号１に示すプロテアーゼ API21（バチルスＮＫＳ
ー２１（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−９３−１）からク
ローニングされた野生型アルカリプロテアーゼ（特開平
5-91876 号公報))に基づく核酸プールを以下の手順によ
り製造した。 (1) 工程ａ：プライマー用オリゴヌクレオチドブロック
の調製 (1-1) オリゴヌクレオチドブロックの合成 パーキンエルマー社のＤＮＡ自動合成機モデル３９２を
用い、１４種のオリゴヌクレオチド：オリゴＦＷ（配列
番号２）、オリゴＲＶ（配列番号３）、オリゴ１ｒ（配
列番号４）、オリゴ１ｂ（配列番号５）、オリゴ１ａ
（配列番号６）、オリゴ２ｒ（配列番号７）、オリゴ２
ｂ（配列番号８）、オリゴ２ａ（配列番号９）、オリゴ
３ｒ（配列番号１０）、オリゴ３ｂ（配列番号１１）、
オリゴ３ａ（配列番号１２）、オリゴ４ｒ（配列番号１
３）、オリゴ４ｂ（配列番号１４）、オリゴ４ａ（配列
番号１５）およびオリゴＡ（配列番号１６）を合成し
た。これらはＡＰＩ２１の塩基配列（特開平5-91876 号
公報）（相補鎖も含む）の一部からなる、若しくは一部
を含むオリゴヌクレオチドである。但し、オリゴ４ａは
配列番号１のグルタミンの後の配列で遺伝子の終始コド
ン等を含む。また、これらのオリゴヌクレオチドは以後
の実験でＴａｑポリメラーゼを用い、増幅ＤＮＡの３’
末端にＡがオーバーハングしたときに最適になるように
設計した。各オリゴヌクレオチドの合成は、ＤＭトリチ
ルオンで行ない（すなわち、ジメトキシトリチル基で
５’水酸基を保護した。）、ＯＰＣカラムで精製した。
試薬はパーキンエルマー社から購入したものを用いた。
【００４４】(1-2) リボヌクレオチドの付加 続いて、下記の組成： ５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ 8.0） １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ５ｍＭ ＤＴＴ（ジチオスレイトール） ２５％ ＰＥＧ６０００ １ｍＭ ＨＣＣ（ヘキサアンミンコバルトクロライド） １０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ（牛血清アルブミン） を有する標準溶液に、オリゴ１ｒを５００ｐｍｏｌ、Ａ
ＴＰを１ｎｍｏｌ及びターミナルデオキシヌクレオチジ
ルトランスフェラーゼを１０ユニット添加し、全量を１
０μｌとした。この溶液を３７℃で１時間放置した。同
様の操作をオリゴ２ｒ、オリゴ３ｒ、オリゴ４ｒ、オリ
ゴ１ｂ、オリゴ２ｂ、オリゴ３ｂ、オリゴ４ｂについて
も行なった。この操作で生成したポリヌクレオチド４種
をそれぞれオリゴ１ｒ′、オリゴ２ｒ′、オリゴ３
ｒ′、オリゴ４ｒ′、オリゴ１ｂ′、オリゴ２ｂ′、オ
リゴ３ｂ′、オリゴ４ｂ′と呼ぶ。
ＴＰを１ｎｍｏｌ及びターミナルデオキシヌクレオチジ
ルトランスフェラーゼを１０ユニット添加し、全量を１
０μｌとした。この溶液を３７℃で１時間放置した。同
様の操作をオリゴ２ｒ、オリゴ３ｒ、オリゴ４ｒ、オリ
ゴ１ｂ、オリゴ２ｂ、オリゴ３ｂ、オリゴ４ｂについて
も行なった。この操作で生成したポリヌクレオチド４種
をそれぞれオリゴ１ｒ′、オリゴ２ｒ′、オリゴ３
ｒ′、オリゴ４ｒ′、オリゴ１ｂ′、オリゴ２ｂ′、オ
リゴ３ｂ′、オリゴ４ｂ′と呼ぶ。
【００４５】(1-3) リン酸化 オリゴ１ａを５００ｐｍｏｌ、ＡＴＰを１ｎｍｏｌ及
び、１０ユニットのポリヌクレオチドキナーゼを前記と
同じ組成の標準溶液に溶解して全量を１０μｌにした。
この溶液を３７℃で１時間放置した。同様の操作をオリ
ゴ２ａ、オリゴ３ａ、オリゴ４ａについても行った。こ
の操作で生成したポリヌクレオチドをオリゴ１ａ′、オ
リゴ２ａ′、オリゴ３ａ′、オリゴ４ａ′と呼ぶ。
び、１０ユニットのポリヌクレオチドキナーゼを前記と
同じ組成の標準溶液に溶解して全量を１０μｌにした。
この溶液を３７℃で１時間放置した。同様の操作をオリ
ゴ２ａ、オリゴ３ａ、オリゴ４ａについても行った。こ
の操作で生成したポリヌクレオチドをオリゴ１ａ′、オ
リゴ２ａ′、オリゴ３ａ′、オリゴ４ａ′と呼ぶ。
【００４６】(1-4) オリゴヌクレオチドブロックの連結 前記で得られた、オリゴ１ａ′を５００ｐｍｏｌと、オ
リゴ１ｂ′、オリゴ２ｂ′、オリゴ３ｂ′、オリゴ４
ｂ′それぞれ１００ｐｍｏｌ、ＡＴＰ１ｎｍｏｌ及び、
Ｔ４ＲＮＡリガーゼ５０ユニットを前記標準溶液に添加
し、全量を１０μｌとして２５℃で４時間反応させた。
同様の反応をオリゴ２ａ′とオリゴ１ｂ′、オリゴ２
ｂ′、オリゴ３ｂ′、オリゴ４ｂ′、オリゴ３ａ′とオ
リゴ１ｂ′、オリゴ２ｂ′、オリゴ３ｂ′、オリゴ４
ｂ′、オリゴ４ａ′とオリゴ１ｂ′、オリゴ２ｂ′、オ
リゴ３ｂ′、オリゴ４ｂ′の組合せでも行う。これらの
反応によって生成したオリゴ１ａ′とオリゴ１ｂ′、オ
リゴ２ｂ′、オリゴ３ｂ′、オリゴ４ｂ′が連結した４
種のポリヌクレオチドの混合物をオリゴ１Ｍ、オリゴ２
ａ′とオリゴ１ｂ′、オリゴ２ｂ′、オリゴ３ｂ′、オ
リゴ４ｂ′が連結した４種のポリヌクレオチドの混合物
をオリゴ２Ｍ、オリゴ３ａ′とオリゴ１ｂ′、オリゴ２
ｂ′、オリゴ３ｂ′、オリゴ４ｂ′が連結した４種のポ
リヌクレオチドの混合物をオリゴ３Ｍ、オリゴ４ａ′と
オリゴ１ｂ′、オリゴ２ｂ′、オリゴ３ｂ′、オリゴ４
ｂ′が連結した４種のポリヌクレオチドの混合物をオリ
ゴ４Ｍと呼ぶ。
リゴ１ｂ′、オリゴ２ｂ′、オリゴ３ｂ′、オリゴ４
ｂ′それぞれ１００ｐｍｏｌ、ＡＴＰ１ｎｍｏｌ及び、
Ｔ４ＲＮＡリガーゼ５０ユニットを前記標準溶液に添加
し、全量を１０μｌとして２５℃で４時間反応させた。
同様の反応をオリゴ２ａ′とオリゴ１ｂ′、オリゴ２
ｂ′、オリゴ３ｂ′、オリゴ４ｂ′、オリゴ３ａ′とオ
リゴ１ｂ′、オリゴ２ｂ′、オリゴ３ｂ′、オリゴ４
ｂ′、オリゴ４ａ′とオリゴ１ｂ′、オリゴ２ｂ′、オ
リゴ３ｂ′、オリゴ４ｂ′の組合せでも行う。これらの
反応によって生成したオリゴ１ａ′とオリゴ１ｂ′、オ
リゴ２ｂ′、オリゴ３ｂ′、オリゴ４ｂ′が連結した４
種のポリヌクレオチドの混合物をオリゴ１Ｍ、オリゴ２
ａ′とオリゴ１ｂ′、オリゴ２ｂ′、オリゴ３ｂ′、オ
リゴ４ｂ′が連結した４種のポリヌクレオチドの混合物
をオリゴ２Ｍ、オリゴ３ａ′とオリゴ１ｂ′、オリゴ２
ｂ′、オリゴ３ｂ′、オリゴ４ｂ′が連結した４種のポ
リヌクレオチドの混合物をオリゴ３Ｍ、オリゴ４ａ′と
オリゴ１ｂ′、オリゴ２ｂ′、オリゴ３ｂ′、オリゴ４
ｂ′が連結した４種のポリヌクレオチドの混合物をオリ
ゴ４Ｍと呼ぶ。
【００４７】(2) 工程ｂ〜ｄ：遺伝子ブロックの作成 バチルスＮＫＳ−２１からクローニングされた野生型ア
ルカリプロテアーゼの遺伝子がｐＨＳＧ３９６のＣｌａ
Ｉ切断部位に挿入されているプラスミドｐＳＤＴ８１２
（特開平1-141596号公報）を鋳型、オリゴ１Ｍとオリゴ
２ｒ′をプライマーとしてＰＣＲを行なった。この反応
により増幅した遺伝子断片をリボヌクレアーゼ処理した
後、８０℃で５分熱処理し、両鎖若しくは一方の鎖に存
在するリボヌクレオチドから５’側に位置するポリヌク
レオチドを取り除く。これによって末端が突出末端であ
る遺伝子ブロックを調製できる。この遺伝子ブロックを
ブロック１Ｍと呼ぶ。上記と同様の操作を、オリゴ２Ｍ
とオリゴ３ｒ′、オリゴ３Ｍとオリゴ４ｒ′、オリゴ４
ＭとオリゴＲＶ、オリゴＦＷとオリゴ１ｒ′の４種の組
合せでも行う。それぞれをブロック２Ｍ、ブロック３
Ｍ、ブロックＢ、ブロックＦと呼ぶ。
ルカリプロテアーゼの遺伝子がｐＨＳＧ３９６のＣｌａ
Ｉ切断部位に挿入されているプラスミドｐＳＤＴ８１２
（特開平1-141596号公報）を鋳型、オリゴ１Ｍとオリゴ
２ｒ′をプライマーとしてＰＣＲを行なった。この反応
により増幅した遺伝子断片をリボヌクレアーゼ処理した
後、８０℃で５分熱処理し、両鎖若しくは一方の鎖に存
在するリボヌクレオチドから５’側に位置するポリヌク
レオチドを取り除く。これによって末端が突出末端であ
る遺伝子ブロックを調製できる。この遺伝子ブロックを
ブロック１Ｍと呼ぶ。上記と同様の操作を、オリゴ２Ｍ
とオリゴ３ｒ′、オリゴ３Ｍとオリゴ４ｒ′、オリゴ４
ＭとオリゴＲＶ、オリゴＦＷとオリゴ１ｒ′の４種の組
合せでも行う。それぞれをブロック２Ｍ、ブロック３
Ｍ、ブロックＢ、ブロックＦと呼ぶ。
【００４８】実施例２：シャフリング ブロック１Ｍ、ブロック２Ｍ、ブロック３Ｍ、ブロック
Ｂ、ブロックＦを等量混合し、ＰｆｕＤＮＡリガーゼで
連結反応を行った。反応後、アガロースゲル電気泳動を
行い、 1.5キロ塩基対近傍を回収した。
Ｂ、ブロックＦを等量混合し、ＰｆｕＤＮＡリガーゼで
連結反応を行った。反応後、アガロースゲル電気泳動を
行い、 1.5キロ塩基対近傍を回収した。
【００４９】実施例３：核酸プールの確認 回収した約 1.5キロ塩基対のＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ、ＢａｍＨＩで消化し、制限酵素ＥｃｏＲＩ、Ｂａｍ
ＨＩで消化し、アルカリフォスファターゼ処理をしたヤ
クルト本社製のプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫと混合
し、ライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結
した。このＤＮＡを用い、大腸菌ＪＭ１０５を形質転換
し、テトラサイクリン耐性の形質転換体を選択した。こ
れらの形質転換体から常法によりプラスミドＤＮＡを抽
出、精製、分析を行ない、ｐＨＹ３００ＰＬＫのＥｃｏ
ＲＩ、ＢａｍＨＩ認識部位間に 1.5キロ塩基対のＤＮＡ
が挿入されているクローンを９７取得した。上記の如く
して取得したＤＮＡの塩基配列を解析し、ブロック１
Ｍ、ブロック２Ｍ、ブロック３Ｍ、ブロックＦ、ブロッ
クＢがどの様な順番で連結しているのか、つまり、どの
ようにシャフルしているのか確認した。理論通り、ブロ
ックＦが第一番目に位置し、ブロックＢが第五番目に位
置し、その二つの間でブロック１Ｍ、ブロック２Ｍ、ブ
ロック３Ｍがシャフルしていた。表１に各シャフルの種
類とそれに対するクローン数を記した。
Ｉ、ＢａｍＨＩで消化し、制限酵素ＥｃｏＲＩ、Ｂａｍ
ＨＩで消化し、アルカリフォスファターゼ処理をしたヤ
クルト本社製のプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫと混合
し、ライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結
した。このＤＮＡを用い、大腸菌ＪＭ１０５を形質転換
し、テトラサイクリン耐性の形質転換体を選択した。こ
れらの形質転換体から常法によりプラスミドＤＮＡを抽
出、精製、分析を行ない、ｐＨＹ３００ＰＬＫのＥｃｏ
ＲＩ、ＢａｍＨＩ認識部位間に 1.5キロ塩基対のＤＮＡ
が挿入されているクローンを９７取得した。上記の如く
して取得したＤＮＡの塩基配列を解析し、ブロック１
Ｍ、ブロック２Ｍ、ブロック３Ｍ、ブロックＦ、ブロッ
クＢがどの様な順番で連結しているのか、つまり、どの
ようにシャフルしているのか確認した。理論通り、ブロ
ックＦが第一番目に位置し、ブロックＢが第五番目に位
置し、その二つの間でブロック１Ｍ、ブロック２Ｍ、ブ
ロック３Ｍがシャフルしていた。表１に各シャフルの種
類とそれに対するクローン数を記した。
【００５０】
【表１】 シャフルの種類 数 シャフルの種類 数 １１１ ２ ２２３ ２ １１２ ５ ２３１ ５ １１３ ２ ２３２ ２ １２１ ３ ２３３ ３ １２２ ４ ３１１ ２ １２３ ７ ３１２ ６ １３１ ４ ３１３ ５ １３２ ５ ３２１ ７ １３３ ３ ３２２ ２ ２１１ １ ３２３ ５ ２１２ ５ ３３１ ２ ２１３ ４ ３３２ ５ ２２１ １ ３３３ ２ ２２２ ３
【００５１】このように、本発明の方法によって遺伝子
中の３つのブロックをシャフリングした場合、これらの
ブロックを重複を許して３個選択してなる全ての組合せ
のクローンを含む核酸プールを得られることが確認され
た。
中の３つのブロックをシャフリングした場合、これらの
ブロックを重複を許して３個選択してなる全ての組合せ
のクローンを含む核酸プールを得られることが確認され
た。
【００５２】実施例４：核酸プールから得られる遺伝子
産物の選抜 実施例３で調製したＤＮＡを混合し、これを用いて、枯
草菌（Bacillus subti lis ）UOTO999 を形質転換した。
テトラサイクリン耐性で形質転換体を選択した。形質転
換体３００ヶをスキムミルク含有プレートにレプリカし
たところ、１２形質転換体のコロニーの周りにクリアゾ
ーンを確認できた。これによって、シャフリングされた
遺伝子によってコードされた酵素を活性によって選別出
来ることが分かる。これらクリアゾーンを形成する１２
クローンの塩基配列を解析した結果、これらは野生型と
同じブロック順になっていることがわかった。
産物の選抜 実施例３で調製したＤＮＡを混合し、これを用いて、枯
草菌（Bacillus subti lis ）UOTO999 を形質転換した。
テトラサイクリン耐性で形質転換体を選択した。形質転
換体３００ヶをスキムミルク含有プレートにレプリカし
たところ、１２形質転換体のコロニーの周りにクリアゾ
ーンを確認できた。これによって、シャフリングされた
遺伝子によってコードされた酵素を活性によって選別出
来ることが分かる。これらクリアゾーンを形成する１２
クローンの塩基配列を解析した結果、これらは野生型と
同じブロック順になっていることがわかった。
【００５３】実施例５：遺伝子産物の検出 実施例３で得られた形質転換体の中から選んだ１０クロ
ーン（１クローンは、ハロー形成、９クローンは非形
成）及び宿主である枯草菌（Bacillus subtilis）UOTO9
99 からそれぞれ全ＲＮＡを調製した。また以後のハイ
ブリダイゼーションでプラスミドの影響を除くためにリ
ボヌクレアーゼフリーのデオキシリボヌクレアーゼ処理
をした。続いて、プローブにオリゴ１ｒを用い、常法に
従ってノザーンハイブリダイゼーションを行った。その
結果、形質転換体のＲＮＡに対応するレーンには、すべ
てバンドが検出できたが、宿主のＲＮＡに対応するレー
ンにはバンドが検出できなかった。
ーン（１クローンは、ハロー形成、９クローンは非形
成）及び宿主である枯草菌（Bacillus subtilis）UOTO9
99 からそれぞれ全ＲＮＡを調製した。また以後のハイ
ブリダイゼーションでプラスミドの影響を除くためにリ
ボヌクレアーゼフリーのデオキシリボヌクレアーゼ処理
をした。続いて、プローブにオリゴ１ｒを用い、常法に
従ってノザーンハイブリダイゼーションを行った。その
結果、形質転換体のＲＮＡに対応するレーンには、すべ
てバンドが検出できたが、宿主のＲＮＡに対応するレー
ンにはバンドが検出できなかった。
【００５４】
【発明の効果】本発明によれば、任意の突出末端を有す
る２重鎖ＤＮＡ分子を得ることができる。また、これを
用いることにより、天然の塩基配列空間とは大きく離れ
た多様な塩基配列を含むＤＮＡあるいはその混合物であ
るＤＮＡプールを簡単な手順で得ることができるため、
従来の方法では得られない、また、過去、生物により試
験されたことのない優れた遺伝子産物、例えば、タンパ
ク質や酵素を得ることが可能である。また、本発明の核
酸プール製造方法では、必要に応じ、中間部ではランダ
ムなシャフリングを実行しながら末端配置は所望の配列
に固定した核酸の混合物を得ることが可能であり、ま
た、各ブロックによりコードされるアミノ酸配列は変更
せずにそのシャフリングを行なうことが可能であるた
め、完全にランダムな核酸プール製造方法と比較して、
有用な遺伝子産物を生成する可能性が高い。
る２重鎖ＤＮＡ分子を得ることができる。また、これを
用いることにより、天然の塩基配列空間とは大きく離れ
た多様な塩基配列を含むＤＮＡあるいはその混合物であ
るＤＮＡプールを簡単な手順で得ることができるため、
従来の方法では得られない、また、過去、生物により試
験されたことのない優れた遺伝子産物、例えば、タンパ
ク質や酵素を得ることが可能である。また、本発明の核
酸プール製造方法では、必要に応じ、中間部ではランダ
ムなシャフリングを実行しながら末端配置は所望の配列
に固定した核酸の混合物を得ることが可能であり、ま
た、各ブロックによりコードされるアミノ酸配列は変更
せずにそのシャフリングを行なうことが可能であるた
め、完全にランダムな核酸プール製造方法と比較して、
有用な遺伝子産物を生成する可能性が高い。
【００５５】
配列番号：１ 配列の長さ：１１２２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源：バチルスNKS-21（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−９
３−１） 配列の特徴 特徴を表わす記号：sig peptide 存在位置：1..93 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：104..1112 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ATG AAT CTT CAA AAA ATA GCC TCA GCG TTG AAG GTT AAG CAA TCG GCA 48 Met Asn Leu Gln Lys Ile Ala Ser Ala Leu Lys Val Lys Gln Ser Ala -100 -95 -90 TTG GTC AGC AGT TTA ACT ATT TTG TTT CTA ATC ATG CTA GTA GGT ACG 96 Leu Val Ser Ser Leu Thr Ile Leu Phe Leu Ile Met Leu Val Gly Thr -85 -80 -75 ACT AGT GCA AAT GGT GCG AAG CAA GAG TAC TTA ATT GGT TTC AAC TCA 144 Thr Ser Ala Asn Gly Ala Lys Gln Glu Tyr Leu Ile Gly Phe Asn Ser -70 -65 -60 -55 GAC AAG GCA AAA GGA CTT ATC CAA AAT GCA GGT GGA GAA ATT CAT CAT 192 Asp Lys Ala Lys Gly Leu Ile Gln Asn Ala Gly Gly Glu Ile His His -50 -45 -40 GAA TAT ACA GAG TTT CCA GTT ATC TAT GCA GAG CTT CCA GAA GCA GCG 240 Glu Tyr Thr Glu Phe Pro Val Ile Tyr Ala Glu Leu Pro Glu Ala Ala -35 -30 -25 GTA AGT GGA TTG AAA AAT AAT CCT CAT ATT GAT TTT ATT GAG GAA AAC 288 Val Ser Gly Leu Lys Asn Asn Pro His Ile Asp Phe Ile Glu Glu Asn -20 -15 -10 GAA GAA GTT GAA ATT GCA CAG ACT GTT CCT TGG GGA ATC CCT TAT ATT 336 Glu Glu Val Glu Ile Ala Gln Thr Val Pro Trp Gly Ile Pro Tyr Ile -5 1 5 10 TAC TCG GAT GTT GTT CAT CGT CAA GGT TAC TTT GGG AAC GGA GTA AAA 384 Tyr Ser Asp Val Val His Arg Gln Gly Tyr Phe Gly Asn Gly Val Lys 15 20 25 GTA GCA GTA CTT GAT ACA GGA GTG GCT CCT CAT CCT GAT TTA CAT ATT 432 Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Val Ala Pro His Pro Asp Leu His Ile 30 35 40 AGA GGA GGA GTA AGC TTT ATC TCT ACA GAA AAC ACT TAT GTG GAT TAT 480 Arg Gly Gly Val Ser Phe Ile Ser Thr Glu Asn Thr Tyr Val Asp Tyr 45 50 55 AAT GGT CAC GGT ACT CAC GTA GCT GGT ACT GTA GCT GCC CTA AAC AAT 528 Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn 60 65 70 TCA TAT GGC GTA TTG GGA GTG GCT CCT GGA GCT GAA CTA TAT GCT GTT 576 Ser Tyr Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Gly Ala Glu Leu Tyr Ala Val 75 80 85 90 AAA GTT CTT GAT CGT AAC GGA AGC GGT TCG CAT GCA TCC ATT GCT CAA 624 Lys Val Leu Asp Arg Asn Gly Ser Gly Ser His Ala Ser Ile Ala Gln 95 100 105 GGA ATT GAA TGG GCG ATG AAT AAT GGG ATG GAT ATT GCC AAC ATG AGT 672 Gly Ile Glu Trp Ala Met Asn Asn Gly Met Asp Ile Ala Asn Met Ser 110 115 120 TTA GGA AGT CCT TCT GGG TCT ACA ACC CTG CAA TTA GCA GCA GAC CGC 720 Leu Gly Ser Pro Ser Gly Ser Thr Thr Leu Gln Leu Ala Ala Asp Arg 125 130 135 GCT AGG AAT GCA GGT GTC TTA TTA ATT GGG GCG GCT GGA AAC TCA GGA 768 Ala Arg Asn Ala Gly Val Leu Leu Ile Gly Ala Ala Gly Asn Ser Gly 140 145 150 CAA CAA GGC GGC TCG AAT AAC ATG GGC TAC CCA GCG CGC TAT GCA TCT 816 Gln Gln Gly Gly Ser Asn Asn Met Gly Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Ser 155 160 165 170 GTC ATG GCT GTT GGA GCG GTG GAC CAA AAT GGA AAT AGA GCG AAC TTT 864 Val Met Ala Val Gly Ala Val Asp Gln Asn Gly Asn Arg Ala Asn Phe 175 180 185 TCA AGC TAT GGA TCA GAA CTT GAG ATT ATG GCG CCT GGT GTC AAT ATT 912 Ser Ser Tyr Gly Ser Glu Leu Glu Ile Met Ala Pro Gly Val Asn Ile 190 195 200 AAC AGT ACG TAT TTA AAT AAC GGA TAT CGC AGT TTA AAT GGT ACG TCA 960 Asn Ser Thr Tyr Leu Asn Asn Gly Tyr Arg Ser Leu Asn Gly Thr Ser 205 210 215 ATG GCA TCT CCA CAT GTT GCT GGG GTA GCT GCA TTA GTT AAA CAA AAA 1008 Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Val Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys 220 225 230 CAC CCT CAC TTA ACG GCG GCA CAA ATT CGT AAT CGT ATG AAT CAA ACA 1056 His Pro His Leu Thr Ala Ala Gln Ile Arg Asn Arg Met Asn Gln Thr 235 240 245 250 GCA ATT CCG CTT GGT AAC AGC ACG TAT TAT GGA AAT GGC TTA GTG GAT 1104 Ala Ile Pro Leu Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Gly Leu Val Asp 255 260 265 GCT GAG TAT GCG GCT CAA 1122 Ala Glu Tyr Ala Ala Gln 270 272
３−１） 配列の特徴 特徴を表わす記号：sig peptide 存在位置：1..93 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：104..1112 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ATG AAT CTT CAA AAA ATA GCC TCA GCG TTG AAG GTT AAG CAA TCG GCA 48 Met Asn Leu Gln Lys Ile Ala Ser Ala Leu Lys Val Lys Gln Ser Ala -100 -95 -90 TTG GTC AGC AGT TTA ACT ATT TTG TTT CTA ATC ATG CTA GTA GGT ACG 96 Leu Val Ser Ser Leu Thr Ile Leu Phe Leu Ile Met Leu Val Gly Thr -85 -80 -75 ACT AGT GCA AAT GGT GCG AAG CAA GAG TAC TTA ATT GGT TTC AAC TCA 144 Thr Ser Ala Asn Gly Ala Lys Gln Glu Tyr Leu Ile Gly Phe Asn Ser -70 -65 -60 -55 GAC AAG GCA AAA GGA CTT ATC CAA AAT GCA GGT GGA GAA ATT CAT CAT 192 Asp Lys Ala Lys Gly Leu Ile Gln Asn Ala Gly Gly Glu Ile His His -50 -45 -40 GAA TAT ACA GAG TTT CCA GTT ATC TAT GCA GAG CTT CCA GAA GCA GCG 240 Glu Tyr Thr Glu Phe Pro Val Ile Tyr Ala Glu Leu Pro Glu Ala Ala -35 -30 -25 GTA AGT GGA TTG AAA AAT AAT CCT CAT ATT GAT TTT ATT GAG GAA AAC 288 Val Ser Gly Leu Lys Asn Asn Pro His Ile Asp Phe Ile Glu Glu Asn -20 -15 -10 GAA GAA GTT GAA ATT GCA CAG ACT GTT CCT TGG GGA ATC CCT TAT ATT 336 Glu Glu Val Glu Ile Ala Gln Thr Val Pro Trp Gly Ile Pro Tyr Ile -5 1 5 10 TAC TCG GAT GTT GTT CAT CGT CAA GGT TAC TTT GGG AAC GGA GTA AAA 384 Tyr Ser Asp Val Val His Arg Gln Gly Tyr Phe Gly Asn Gly Val Lys 15 20 25 GTA GCA GTA CTT GAT ACA GGA GTG GCT CCT CAT CCT GAT TTA CAT ATT 432 Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Val Ala Pro His Pro Asp Leu His Ile 30 35 40 AGA GGA GGA GTA AGC TTT ATC TCT ACA GAA AAC ACT TAT GTG GAT TAT 480 Arg Gly Gly Val Ser Phe Ile Ser Thr Glu Asn Thr Tyr Val Asp Tyr 45 50 55 AAT GGT CAC GGT ACT CAC GTA GCT GGT ACT GTA GCT GCC CTA AAC AAT 528 Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn 60 65 70 TCA TAT GGC GTA TTG GGA GTG GCT CCT GGA GCT GAA CTA TAT GCT GTT 576 Ser Tyr Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Gly Ala Glu Leu Tyr Ala Val 75 80 85 90 AAA GTT CTT GAT CGT AAC GGA AGC GGT TCG CAT GCA TCC ATT GCT CAA 624 Lys Val Leu Asp Arg Asn Gly Ser Gly Ser His Ala Ser Ile Ala Gln 95 100 105 GGA ATT GAA TGG GCG ATG AAT AAT GGG ATG GAT ATT GCC AAC ATG AGT 672 Gly Ile Glu Trp Ala Met Asn Asn Gly Met Asp Ile Ala Asn Met Ser 110 115 120 TTA GGA AGT CCT TCT GGG TCT ACA ACC CTG CAA TTA GCA GCA GAC CGC 720 Leu Gly Ser Pro Ser Gly Ser Thr Thr Leu Gln Leu Ala Ala Asp Arg 125 130 135 GCT AGG AAT GCA GGT GTC TTA TTA ATT GGG GCG GCT GGA AAC TCA GGA 768 Ala Arg Asn Ala Gly Val Leu Leu Ile Gly Ala Ala Gly Asn Ser Gly 140 145 150 CAA CAA GGC GGC TCG AAT AAC ATG GGC TAC CCA GCG CGC TAT GCA TCT 816 Gln Gln Gly Gly Ser Asn Asn Met Gly Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Ser 155 160 165 170 GTC ATG GCT GTT GGA GCG GTG GAC CAA AAT GGA AAT AGA GCG AAC TTT 864 Val Met Ala Val Gly Ala Val Asp Gln Asn Gly Asn Arg Ala Asn Phe 175 180 185 TCA AGC TAT GGA TCA GAA CTT GAG ATT ATG GCG CCT GGT GTC AAT ATT 912 Ser Ser Tyr Gly Ser Glu Leu Glu Ile Met Ala Pro Gly Val Asn Ile 190 195 200 AAC AGT ACG TAT TTA AAT AAC GGA TAT CGC AGT TTA AAT GGT ACG TCA 960 Asn Ser Thr Tyr Leu Asn Asn Gly Tyr Arg Ser Leu Asn Gly Thr Ser 205 210 215 ATG GCA TCT CCA CAT GTT GCT GGG GTA GCT GCA TTA GTT AAA CAA AAA 1008 Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Val Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys 220 225 230 CAC CCT CAC TTA ACG GCG GCA CAA ATT CGT AAT CGT ATG AAT CAA ACA 1056 His Pro His Leu Thr Ala Ala Gln Ile Arg Asn Arg Met Asn Gln Thr 235 240 245 250 GCA ATT CCG CTT GGT AAC AGC ACG TAT TAT GGA AAT GGC TTA GTG GAT 1104 Ala Ile Pro Leu Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Gly Leu Val Asp 255 260 265 GCT GAG TAT GCG GCT CAA 1122 Ala Glu Tyr Ala Ala Gln 270 272
【００５６】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATTTTAGAA TTCGCAGCGG
【００５７】配列番号：３ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCGGATTCCT TAAAGCCCTG AATAA
【００５８】配列番号：４ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACAGTCTGTG CAATTTC
【００５９】配列番号：５ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GAAATTGCAC AGACTGT
【００６０】配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCTTGGGGAA TCCCTTATAT
【００６１】配列番号：７ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCCAATACGC CATATGA
【００６２】配列番号：８ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCATATGGCG TATTGGG
【００６３】配列番号：９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTGGCTCCTG GAGCTGAACT
【００６４】配列番号：１０ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCTGATCCAT AGCTTG
【００６５】配列番号：１１ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAAGCTATGG ATCAGA
【００６６】配列番号：１２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTTGAGATTA TGGCGCCTGG
【００６７】配列番号：１３ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGAGCCGCAT ACTCAGC
【００６８】配列番号：１４ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCTGAGTATG CGGCTCA
【００６９】配列番号：１５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TAATCCCTAA GGATGTACTG
【図１】 本発明のＤＮＡシャフリング方法の一態様を
示す模式図。
示す模式図。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:125）
Claims (27)
- 【請求項１】 (a) 遺伝子の一部と同一の配列を有する
２本鎖ＤＮＡと(b)前記遺伝子上で前記２本鎖ＤＮＡ相
当部分とは非連続な位置に存する塩基配列または前記遺
伝子上にない塩基配列を有する１本鎖ＤＮＡからなり、
１本鎖ＤＮＡが２本鎖ＤＮＡのいずれかの端部に連結し
て突出末端を形成していることを特徴とする突出末端を
有するＤＮＡ。 - 【請求項２】 (a) 遺伝子の一部と同一の配列を有する
２本鎖ＤＮＡ、(b)前記遺伝子上で前記２本鎖ＤＮＡ相
当部分とは非連続な位置に存する塩基配列または前記遺
伝子上にない塩基配列を有する第１の１本鎖ＤＮＡ、お
よび(c) 前記遺伝子上で前記２本鎖ＤＮＡ相当部分と連
続する位置に存する塩基配列を有する第２の１本鎖ＤＮ
Ａからなり、第２の１本鎖ＤＮＡは前記２本鎖ＤＮＡの
当該連続する位置に相当する端部に、第１の１本鎖ＤＮ
Ａは前記端部とは反対側の相補鎖の端部に連結してそれ
ぞれ突出末端を形成していることを特徴とする突出末端
を有するＤＮＡ。 - 【請求項３】 １本鎖ＤＮＡが２塩基以上の長さを有す
る請求項１または２に記載の突出末端を有するＤＮＡ。 - 【請求項４】 突出末端が３’端側に位置する請求項１
乃至３のいずれかに記載の突出末端を有するＤＮＡ。 - 【請求項５】 ＤＮＡの一部を鋳型とし、少なくとも１
つのリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとしてＤＮＡポリメラーゼ反応を行なうことによ
り２本鎖ＤＮＡを調製し、しかる後、酵素反応または化
学反応によってリボヌクレオチドを除去し、さらに該リ
ボヌクレオチドの存在していた位置よりも５’端側に残
存するヌクレオチドを除去することを特徴とする、突出
末端を有するＤＮＡの製造方法。 - 【請求項６】 下記ａ）〜ｄ）の工程： ａ）(i) 遺伝子ＤＮＡの一部と同一の塩基配列を有する
オリゴヌクレチドと(ii)遺伝子上で(i) の塩基配列とは
非連続な位置に存する塩基配列またはその遺伝子上にな
い塩基配列を有し、少なくとも１つのリボヌクレオチド
を含むオリゴヌクレオチドを(ii)のオリゴヌクレオチド
が(i) のオリゴヌクレオチドの５’端側に位置するよう
に連結する工程； ｂ）前記ａ）(i) のオリゴヌクレオチド相当部分を含む
ＤＮＡを鋳型とし、工程ａ）で得られた連結オリゴヌク
レオチドをプライマーとしてＤＮＡポリメラーゼ反応を
行ない２本鎖ＤＮＡを調製する工程； ｃ）酵素反応もしくは化学反応によって前記２本鎖ＤＮ
Ａ中のリボヌクレオチドを除去する工程；および ｄ）前記リボヌクレオチドの存在していた位置よりも
５’端側に残存するヌクレオチドを除去する工程；を有
することを特徴とする、請求項１に規定する突出末端を
有するＤＮＡの製造方法。 - 【請求項７】 下記ａ）〜ｄ）の工程： ａ）(i) 遺伝子ＤＮＡの一部と同一の塩基配列を有する
オリゴヌクレチドと(ii)遺伝子上で(i) の塩基配列とは
非連続な位置に存する塩基配列またはその遺伝子上にな
い塩基配列を有し、少なくとも１つのリボヌクレオチド
を含むオリゴヌクレオチドを(ii)のオリゴヌクレオチド
が(i) のオリゴヌクレオチドの５’端側に位置するよう
に連結する工程； ｂ）前記ａ）(i) のオリゴヌクレオチド相当部分を含む
ＤＮＡを鋳型とし、(i) 工程ａ）で得られた連結オリゴ
ヌクレオチドと、(ii)その遺伝子上にあってより前記オ
リゴヌクレオチド相当部分から３’端側に少なくとも３
塩基以上離れた位置に存するオリゴヌクレオチドの相補
鎖であって少なくとも１つのリボヌクレオチドを含むオ
リゴヌクレオチドをプライマーとしてＤＮＡポリメラー
ゼ反応を行ない２本鎖ＤＮＡを調製する工程； ｃ）酵素反応もしくは化学反応によって前記２本鎖ＤＮ
Ａ中のリボヌクレオチドを除去する工程；および ｄ）前記リボヌクレオチドの存在していた位置よりも
５’端側に残存するヌクレオチドをそれぞれ除去する工
程；を有することを特徴とする、請求項２に規定する突
出末端を有するＤＮＡの製造方法。 - 【請求項８】 ＤＮＡを突出末端を有する複数のＤＮＡ
ブロックに分割し、これらを分割前とは異なる配列で連
結することによるＤＮＡのシャフリング方法。 - 【請求項９】 ＤＮＡの各部に請求項５乃至７のいずれ
かに規定する方法を適用することにより、ＤＮＡを、１
のブロックの突出末端はもとのＤＮＡ上で隣接位置にな
いブロックの突出末端と相補的であるように、突出末端
を有する複数のブロックに分割した後、分割前とは異な
る配列で連結することによるＤＮＡのシャフリング方
法。 - 【請求項１０】 ＤＮＡを３個以上のブロックに分割す
る請求項８または９に記載のシャフリング方法。 - 【請求項１１】 ＤＮＡリガーゼを使用してブロックを
連結する請求項８乃至１０のいずれかに記載のシャフリ
ング方法。 - 【請求項１２】 請求項８乃至１１のいずれかに規定の
方法でシャフリングしてなるＤＮＡ。 - 【請求項１３】 酵素機能をコードする遺伝子またはそ
の制御遺伝子をシャフリングしてなる請求項１２に記載
のＤＮＡ。 - 【請求項１４】 遺伝子が、プロテアーゼ、リパーゼ、
セルラーゼ、アミラーゼ、カタラーゼ、キシラナーゼ、
オキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ、オキシゲナーゼ、レ
ダクターゼのうちのいずれかをコードする遺伝子である
請求項１３に記載のＤＮＡ。 - 【請求項１５】 遺伝子が原核生物由来である請求項１
３または１４に記載のＤＮＡ。 - 【請求項１６】 遺伝子がバチルス属細菌由来である請
求項１５に記載のＤＮＡ。 - 【請求項１７】 遺伝子がプロテアーゼＡＰＩ２１遺伝
子である請求項１６に記載のＤＮＡ。 - 【請求項１８】 請求項８乃至１１のいずれかに規定す
るシャフリング方法によって得られる相異なる構造を有
する複数種類のＤＮＡを含有するＤＮＡプール。 - 【請求項１９】 １０種類以上のＤＮＡを含む請求項１
８に記載のＤＮＡプール。 - 【請求項２０】 鋳型ＤＮＡの各部に請求項５乃至７の
いずれかに規定する方法を適用することにより、以下の
条件を満たす突出末端を有するＤＮＡブロックの混合物
を調製し、これを任意の配列で連結することによるＤＮ
Ａプールの製造方法。 条件１：各ブロックは、それぞれ鋳型ＤＮＡの一部と同
一の配列を有する２本鎖部分を有する。 条件２：ブロック混合物の成分であるブロックのうち、
少なくとも２つは前記２本鎖部分に加えて鋳型ＤＮＡ上
で隣接位置にないブロックの突出末端と相補的である１
本鎖部分（突出末端）を有する。 条件３：ブロック混合物は、２本鎖部分が同一であり１
本鎖部分のみ異なる、条件２を満たすブロックを少なく
とも２種類含む。 - 【請求項２１】 鋳型ＤＮＡが、酵素機能をコードする
遺伝子またはその制御遺伝子ＤＮＡである請求項２０に
記載のＤＮＡプールの製造方法。 - 【請求項２２】 鋳型ＤＮＡが、プロテアーゼ、リパー
ゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カタラーゼ、キシラナー
ゼ、オキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ、オキシゲナー
ゼ、レダクターゼのうちのいずれかをコードする遺伝子
ＤＮＡである請求項２１に記載のＤＮＡプールの製造方
法。 - 【請求項２３】 鋳型ＤＮＡが、原核生物由来である請
求項２２に記載のＤＮＡプールの製造方法。 - 【請求項２４】 鋳型ＤＮＡがバチルス属細菌由来であ
る請求項２３に記載のＤＮＡプールの製造方法。 - 【請求項２５】 鋳型ＤＮＡがプロテアーゼＡＰＩ２１
遺伝子である請求項２４に記載のＤＮＡプールの製造方
法。 - 【請求項２６】 ＤＮＡブロックをＤＮＡリガーゼによ
り連結する請求項２０乃至２５に記載のＤＮＡプールの
製造方法。 - 【請求項２７】 請求項１８乃至２６に規定するＤＮＡ
プールに存在するＤＮＡ分子の遺伝情報を発現すること
によって得られる遺伝子産物。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8208422A JPH1066576A (ja) | 1996-08-07 | 1996-08-07 | 突出末端を有する２本鎖ｄｎａ及びこれを用いたｄｎａのシャフリング方法 |
| AU36917/97A AU3691797A (en) | 1996-08-07 | 1997-07-23 | Double-stranded dna with cohesive end(s), and method of shuffling dna using the same |
| PCT/DK1997/000317 WO1998005765A1 (en) | 1996-08-07 | 1997-07-23 | Double-stranded dna with cohesive end(s), and method of shuffling dna using the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8208422A JPH1066576A (ja) | 1996-08-07 | 1996-08-07 | 突出末端を有する２本鎖ｄｎａ及びこれを用いたｄｎａのシャフリング方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1066576A true JPH1066576A (ja) | 1998-03-10 |
Family
ID=16555966
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP8208422A Pending JPH1066576A (ja) | 1996-08-07 | 1996-08-07 | 突出末端を有する２本鎖ｄｎａ及びこれを用いたｄｎａのシャフリング方法 |
Country Status (3)
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|---|---|
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004500027A (ja) * | 1999-06-14 | 2004-01-08 | ディベルサ コーポレーション | 定方向進化における合成ライゲーション再集合 |
| US6958213B2 (en) | 2000-12-12 | 2005-10-25 | Alligator Bioscience Ab | Method for in vitro molecular evolution of protein function |
| US7153655B2 (en) | 1998-06-16 | 2006-12-26 | Alligator Bioscience Ab | Method for in vitro molecular evolution of protein function involving the use of exonuclease enzyme and two populations of parent polynucleotide sequence |
| US7662551B2 (en) | 2000-12-22 | 2010-02-16 | Alligator Bioscience Ab | Synthesis of hybrid polynucleotide molecules using single-stranded polynucleotide molecules |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6808904B2 (en) | 1994-06-16 | 2004-10-26 | Syngenta Participations Ag | Herbicide-tolerant protox genes produced by DNA shuffling |
| US7390619B1 (en) | 1998-02-11 | 2008-06-24 | Maxygen, Inc. | Optimization of immunomodulatory properties of genetic vaccines |
| US20020048772A1 (en) | 2000-02-10 | 2002-04-25 | Dahiyat Bassil I. | Protein design automation for protein libraries |
| US7315786B2 (en) | 1998-10-16 | 2008-01-01 | Xencor | Protein design automation for protein libraries |
| AU2005225057A1 (en) * | 1999-03-26 | 2005-12-01 | Bp Corporation North America Inc. | Synthetic ligation reassembly in directed evolution |
| AU2001253001A1 (en) * | 2000-04-21 | 2001-11-07 | Genencor International, Inc. | Non-pcr based recombination of nucleic acids |
| US6248541B1 (en) | 2000-04-21 | 2001-06-19 | Genencor International, Inc. | Screening under nutrient limited conditions |
| US6534292B1 (en) | 2000-05-08 | 2003-03-18 | Genencor International, Inc. | Methods for forming recombined nucleic acids |
| US6994963B1 (en) | 2000-07-10 | 2006-02-07 | Ambion, Inc. | Methods for recombinatorial nucleic acid synthesis |
| AUPQ974900A0 (en) * | 2000-08-29 | 2000-09-21 | Macquarie Research Limited | Degenerate oligonucleotide gene-shuffling |
| US6582914B1 (en) | 2000-10-26 | 2003-06-24 | Genencor International, Inc. | Method for generating a library of oligonucleotides comprising a controlled distribution of mutations |
| EP1484699A3 (en) * | 2001-08-10 | 2006-04-19 | Xencor, Inc. | Protein design automation for protein libraries |
| CA2485506C (en) | 2002-05-17 | 2012-02-28 | Alligator Bioscience Ab | A method for in vitro molecular evolution of protein function |
| WO2006047669A2 (en) * | 2004-10-27 | 2006-05-04 | Monsanto Technology Llc | Non-random method of gene shuffling |
| US8053191B2 (en) | 2006-08-31 | 2011-11-08 | Westend Asset Clearinghouse Company, Llc | Iterative nucleic acid assembly using activation of vector-encoded traits |
| US10207240B2 (en) | 2009-11-03 | 2019-02-19 | Gen9, Inc. | Methods and microfluidic devices for the manipulation of droplets in high fidelity polynucleotide assembly |
| US9216414B2 (en) | 2009-11-25 | 2015-12-22 | Gen9, Inc. | Microfluidic devices and methods for gene synthesis |
| US9217144B2 (en) | 2010-01-07 | 2015-12-22 | Gen9, Inc. | Assembly of high fidelity polynucleotides |
| US10457935B2 (en) | 2010-11-12 | 2019-10-29 | Gen9, Inc. | Protein arrays and methods of using and making the same |
| US9295965B2 (en) | 2010-11-12 | 2016-03-29 | Gen9, Inc. | Methods and devices for nucleic acid synthesis |
| ES2737957T3 (es) * | 2011-08-26 | 2020-01-17 | Gen9 Inc | Composiciones y métodos para el ensamblaje de alta fidelidad de ácidos nucleicos |
| US9150853B2 (en) | 2012-03-21 | 2015-10-06 | Gen9, Inc. | Methods for screening proteins using DNA encoded chemical libraries as templates for enzyme catalysis |
| EP2841601B1 (en) | 2012-04-24 | 2019-03-06 | Gen9, Inc. | Methods for sorting nucleic acids and multiplexed preparative in vitro cloning |
| CA2877823A1 (en) | 2012-06-25 | 2014-01-03 | Gen9, Inc. | Methods for nucleic acid assembly and high throughput sequencing |
| CN111019938B (zh) * | 2019-12-06 | 2023-07-18 | 天津大学 | 一种带有粘性末端的长链dna及制备方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU6886991A (en) * | 1989-11-08 | 1991-06-13 | United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The | A method of synthesizing double-stranded dna molecules |
| DE4343591A1 (de) * | 1993-12-21 | 1995-06-22 | Evotec Biosystems Gmbh | Verfahren zum evolutiven Design und Synthese funktionaler Polymere auf der Basis von Formenelementen und Formencodes |
| US5605793A (en) * | 1994-02-17 | 1997-02-25 | Affymax Technologies N.V. | Methods for in vitro recombination |
-
1996
- 1996-08-07 JP JP8208422A patent/JPH1066576A/ja active Pending
-
1997
- 1997-07-23 AU AU36917/97A patent/AU3691797A/en not_active Abandoned
- 1997-07-23 WO PCT/DK1997/000317 patent/WO1998005765A1/en not_active Ceased
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7153655B2 (en) | 1998-06-16 | 2006-12-26 | Alligator Bioscience Ab | Method for in vitro molecular evolution of protein function involving the use of exonuclease enzyme and two populations of parent polynucleotide sequence |
| JP2004500027A (ja) * | 1999-06-14 | 2004-01-08 | ディベルサ コーポレーション | 定方向進化における合成ライゲーション再集合 |
| US6958213B2 (en) | 2000-12-12 | 2005-10-25 | Alligator Bioscience Ab | Method for in vitro molecular evolution of protein function |
| US7282334B2 (en) | 2000-12-12 | 2007-10-16 | Alligator Bioscience, Ab | Method for in vitro molecular evolution of protein function |
| US7662551B2 (en) | 2000-12-22 | 2010-02-16 | Alligator Bioscience Ab | Synthesis of hybrid polynucleotide molecules using single-stranded polynucleotide molecules |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU3691797A (en) | 1998-02-25 |
| WO1998005765A1 (en) | 1998-02-12 |
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