JPH1068724A - Ｌｃ１３２（オピオイド様）受容体アゴニストのスクリーニング方法 - Google Patents
Ｌｃ１３２（オピオイド様）受容体アゴニストのスクリーニング方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＬＣ１３２受容体アゴニストが、精神医学的
及び神経学的障害に奏功することから、このアゴニスト
を試験するスクリーニング方法を提供する。 【解決手段】 ＬＣ１３２受容体を、その受容体のアゴ
ニストであると推測される化合物と接触させて、該化合
物の該受容体への結合及び／又はアゴニスト活性を検出
する、治療上有用な化合物のスクリーニング方法。
及び神経学的障害に奏功することから、このアゴニスト
を試験するスクリーニング方法を提供する。 【解決手段】 ＬＣ１３２受容体を、その受容体のアゴ
ニストであると推測される化合物と接触させて、該化合
物の該受容体への結合及び／又はアゴニスト活性を検出
する、治療上有用な化合物のスクリーニング方法。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、神経学的及び／又
は精神医学的障害に関するスクリーニングアッセイにお
いてＬＣ１３２受容体アゴニストを試験することを含
む、スクリーニング方法に関する。更に詳細には、本ス
クリーニング方法は、ＬＣ１３２受容体機能のアゴニス
トとして作用することが推測される物質にＬＣ１３２受
容体を接触させて、次にその化合物の、結合及び／又は
アゴニスト活性を検出し、そして抗癲癇、抗痙攣及び／
又は抗不安スクリーニング試験においてＬＣ１３２アゴ
ニスト活性を有する薬物を試験してこれらの疾患におけ
る治療に関連する活性を証明することに基づく。
は精神医学的障害に関するスクリーニングアッセイにお
いてＬＣ１３２受容体アゴニストを試験することを含
む、スクリーニング方法に関する。更に詳細には、本ス
クリーニング方法は、ＬＣ１３２受容体機能のアゴニス
トとして作用することが推測される物質にＬＣ１３２受
容体を接触させて、次にその化合物の、結合及び／又は
アゴニスト活性を検出し、そして抗癲癇、抗痙攣及び／
又は抗不安スクリーニング試験においてＬＣ１３２アゴ
ニスト活性を有する薬物を試験してこれらの疾患におけ
る治療に関連する活性を証明することに基づく。
【０００２】
【従来の技術】現在でもなお、ベンゾジアゼピン受容体
アゴニスト（例えば、アルプラゾラム、ジアゼパム、ロ
ラゼパム）が、臨床医学において不安障害、特に急性不
安の主流の治療法である。ベンゾジアゼピン受容体アゴ
ニストは、抗痙攣性を有するため、そのいくつかのもの
は抗癲癇薬としても使用されている。更に最近になっ
て、他の類の薬剤の、不安障害の治療における臨床用途
が見い出された（例えば、選択的セロトニン再取り込み
阻害剤（例えば、フルオキセチン（fluoxetine))及びブ
スピロン）。癲癇の治療では、カルバマゼピン、フェニ
トイン、バルプロ酸、エトスクシミド、及びフェノバル
ビタールのような薬剤が現在主流である。以下に記載さ
れるように、不安、癲癇、及び痙攣の薬物治療に使用さ
れている利用可能な薬剤は最適なものではない。
アゴニスト（例えば、アルプラゾラム、ジアゼパム、ロ
ラゼパム）が、臨床医学において不安障害、特に急性不
安の主流の治療法である。ベンゾジアゼピン受容体アゴ
ニストは、抗痙攣性を有するため、そのいくつかのもの
は抗癲癇薬としても使用されている。更に最近になっ
て、他の類の薬剤の、不安障害の治療における臨床用途
が見い出された（例えば、選択的セロトニン再取り込み
阻害剤（例えば、フルオキセチン（fluoxetine))及びブ
スピロン）。癲癇の治療では、カルバマゼピン、フェニ
トイン、バルプロ酸、エトスクシミド、及びフェノバル
ビタールのような薬剤が現在主流である。以下に記載さ
れるように、不安、癲癇、及び痙攣の薬物治療に使用さ
れている利用可能な薬剤は最適なものではない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】不安は、現実の又は潜
在的な危険に対する警告として作用する生理的現象であ
る。不安は、何も現実の危険がないのに起こるとき、又
はその感情の強さが激化するときに病的なものになる。
生理的及び病的不安は両方とも、器官障害が以前から存
在しているにもかかわらず発生すると生命を脅かしうる
し、また種々の生理的機能不全を起こすか又は永続させ
るかもしれない。多様な不安障害は、全人口の合計罹病
率が概算で約４〜８パーセントの、比較的ありふれた精
神障害である。不安障害の治療においてベンゾジアゼピ
ン受容体アゴニストによりすぐに軽減が得られること
が、多く報告されている。これらの薬剤の効力は、長期
にわたって維持されるようであるが、治療が数週間以上
続くと一連の問題が起こる。望まない副作用は、個々の
患者についてベンゾジアゼピン受容体アゴニストの用量
を最適化することによりかなり回避することができる
が、重症の不安及び癲癇、並びに病的な筋緊張を低下さ
せるために要する用量は、しばしば知的な機能を妨害
し、かつ種々の技能（機械の操作、自動車の運転）のた
めの注意力及び正確性を低下させるレベルまで、覚醒性
を抑制する。この過剰鎮静作用に対する個人の感受性は
非常に多様である。筋弛緩は、特に高齢の患者におい
て、不鮮明な話し方及び歩行の乱れを引き起こすことが
ある。行動の脱抑制は、高用量で起こるが、中枢作用性
薬剤の服薬経験の非常に少ない人には普通の用量でさえ
起こることもある。また、ベンゾジアゼピン受容体アゴ
ニストの長期持続投与による問題も起こることがある。
このような問題の１つは、治療効果に対する耐性の発生
である。かなりの割合の患者で抗癲癇作用の消失が発生
する（エスケープ現象として現われる）。急な投与中止
に続く、薬剤中止症候として現われる身体依存は、薬剤
投与期間、用量、薬剤の作用期間、及び患者の人格の関
数である。ベンゾジアゼピン受容体アゴニズムによる抗
不安作用（抗痙攣、筋弛緩、及び鎮静／催眠作用を示
す）とは好対照をなして、アザスピロデカンジオンであ
るブスピロンは抗不安活性のみを示す。ブスピロンの作
用機序は、セロトニン1A受容体での部分的アゴニズムが
関与するという仮説が立てられている。ブスピロンの利
点は、弱い鎮静作用、エタノール消費と関連した場合で
も精神運動の損傷が小さいこと、低い身体依存性、及び
ベンゾジアゼピン受容体の完全なアゴニストに比べては
るかに低い乱用傾向を含む。しかし、抗不安活性の出現
までの長い潜伏期は、迅速に作用する古典的なベンゾジ
アゼピントランキライザーとの大きな違いである。更
に、ブスピロンには治療コンプライアンスにおける問
題、及び以前にベンゾジアゼピン受容体アゴニストで治
療した患者又は重篤な不安を示している患者における有
効性に関する疑問が存在しうる。ブスピロンは、その位
置が徐々に明確に定義されてきた、医薬備蓄への価値あ
る追加物であるというだけでなく、現代の厳しい臨床効
果と安全性基準を充たす最初の抗不安薬であるという点
で、理論的な見地からも非常に重要である。選択的セロ
トニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）の作用機序の観点
から、シナプス間隙内の神経伝達物質セロトニンの利用
可能性の結果としての増大は、このクラスの薬剤の薬理
学的効果の原因であると思われる。しかし、ＳＳＲＩの
治療作用の出現は遅く、通常少なくとも数週間を要す
る。元来抗うつ薬として開発され広く使用されたが、Ｓ
ＳＲＩは恐慌性障害の治療（例えば、フルオキセチン）
又は強迫障害の治療（例えば、フルボキサミン（fluvox
amine)）に使用されることが多くなっている。ＳＳＲＩ
は、一般に許容量が大きいが、それにもかかわらず、こ
のクラスの化合物の通常の副作用は、神経質、振顫、眩
暈、頭痛、不眠、性機能不全、悪心、及び下痢を含む。
更に、三環系抗うつ薬のクロミプラミン（強力な非選択
的セロトニン再取り込み阻害剤である）は、強迫障害の
治療について認められている〔例えば、Martin及びHaef
ely のPrinciples of Pharmacology、Munsonら編、Chap
man & Hall、ニューヨーク、1995、243-277 頁を参照の
こと〕。
在的な危険に対する警告として作用する生理的現象であ
る。不安は、何も現実の危険がないのに起こるとき、又
はその感情の強さが激化するときに病的なものになる。
生理的及び病的不安は両方とも、器官障害が以前から存
在しているにもかかわらず発生すると生命を脅かしうる
し、また種々の生理的機能不全を起こすか又は永続させ
るかもしれない。多様な不安障害は、全人口の合計罹病
率が概算で約４〜８パーセントの、比較的ありふれた精
神障害である。不安障害の治療においてベンゾジアゼピ
ン受容体アゴニストによりすぐに軽減が得られること
が、多く報告されている。これらの薬剤の効力は、長期
にわたって維持されるようであるが、治療が数週間以上
続くと一連の問題が起こる。望まない副作用は、個々の
患者についてベンゾジアゼピン受容体アゴニストの用量
を最適化することによりかなり回避することができる
が、重症の不安及び癲癇、並びに病的な筋緊張を低下さ
せるために要する用量は、しばしば知的な機能を妨害
し、かつ種々の技能（機械の操作、自動車の運転）のた
めの注意力及び正確性を低下させるレベルまで、覚醒性
を抑制する。この過剰鎮静作用に対する個人の感受性は
非常に多様である。筋弛緩は、特に高齢の患者におい
て、不鮮明な話し方及び歩行の乱れを引き起こすことが
ある。行動の脱抑制は、高用量で起こるが、中枢作用性
薬剤の服薬経験の非常に少ない人には普通の用量でさえ
起こることもある。また、ベンゾジアゼピン受容体アゴ
ニストの長期持続投与による問題も起こることがある。
このような問題の１つは、治療効果に対する耐性の発生
である。かなりの割合の患者で抗癲癇作用の消失が発生
する（エスケープ現象として現われる）。急な投与中止
に続く、薬剤中止症候として現われる身体依存は、薬剤
投与期間、用量、薬剤の作用期間、及び患者の人格の関
数である。ベンゾジアゼピン受容体アゴニズムによる抗
不安作用（抗痙攣、筋弛緩、及び鎮静／催眠作用を示
す）とは好対照をなして、アザスピロデカンジオンであ
るブスピロンは抗不安活性のみを示す。ブスピロンの作
用機序は、セロトニン1A受容体での部分的アゴニズムが
関与するという仮説が立てられている。ブスピロンの利
点は、弱い鎮静作用、エタノール消費と関連した場合で
も精神運動の損傷が小さいこと、低い身体依存性、及び
ベンゾジアゼピン受容体の完全なアゴニストに比べては
るかに低い乱用傾向を含む。しかし、抗不安活性の出現
までの長い潜伏期は、迅速に作用する古典的なベンゾジ
アゼピントランキライザーとの大きな違いである。更
に、ブスピロンには治療コンプライアンスにおける問
題、及び以前にベンゾジアゼピン受容体アゴニストで治
療した患者又は重篤な不安を示している患者における有
効性に関する疑問が存在しうる。ブスピロンは、その位
置が徐々に明確に定義されてきた、医薬備蓄への価値あ
る追加物であるというだけでなく、現代の厳しい臨床効
果と安全性基準を充たす最初の抗不安薬であるという点
で、理論的な見地からも非常に重要である。選択的セロ
トニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）の作用機序の観点
から、シナプス間隙内の神経伝達物質セロトニンの利用
可能性の結果としての増大は、このクラスの薬剤の薬理
学的効果の原因であると思われる。しかし、ＳＳＲＩの
治療作用の出現は遅く、通常少なくとも数週間を要す
る。元来抗うつ薬として開発され広く使用されたが、Ｓ
ＳＲＩは恐慌性障害の治療（例えば、フルオキセチン）
又は強迫障害の治療（例えば、フルボキサミン（fluvox
amine)）に使用されることが多くなっている。ＳＳＲＩ
は、一般に許容量が大きいが、それにもかかわらず、こ
のクラスの化合物の通常の副作用は、神経質、振顫、眩
暈、頭痛、不眠、性機能不全、悪心、及び下痢を含む。
更に、三環系抗うつ薬のクロミプラミン（強力な非選択
的セロトニン再取り込み阻害剤である）は、強迫障害の
治療について認められている〔例えば、Martin及びHaef
ely のPrinciples of Pharmacology、Munsonら編、Chap
man & Hall、ニューヨーク、1995、243-277 頁を参照の
こと〕。
【０００４】癲癇は、人口の約１パーセントまでがかか
る神経学的障害である。この慢性症状は、活動性の脳疾
患によらない反復性自発性発作を特徴とする。発作は、
大脳ニューロンの過剰な放電に関連した、突然で、不随
意で、時限的な行動の変質である。今日、癲癇は、通
常、患者が示す主な発作の型により分類されている（あ
る患者は、２つ以上の発作の型を有するかもしれない
が、通常その１つは他の型よりも頻発するため、これに
基づき分類する）。発作型による分類の実際的な利点
は、選択した治療に対する応答の予測がある程度可能に
なることである。一般に、抗癲癇薬により発作を十分に
制御することができるのは、約半数の患者のみである；
残り半数は、時々の発作を有する患者と、制御できない
発作を有するか、かつ／又は抗癲癇薬から許容できない
有害作用を受ける患者に分けられる。更には、現在使用
されている薬剤は、しばしば副作用を引き起こす。発作
には多数の病因があり、その原因はしばしば曖昧なまま
であり、そのため、抗癲癇薬は、抗痙攣作用を示す他の
薬剤同様に治療的には重要である（例えば、Lloyd 及び
Gillenwater のPrinciples of Pharmacology、Munsonら
編、Chapman & Hall、ニューヨーク、1995、363-398 頁
を参照のこと）。
る神経学的障害である。この慢性症状は、活動性の脳疾
患によらない反復性自発性発作を特徴とする。発作は、
大脳ニューロンの過剰な放電に関連した、突然で、不随
意で、時限的な行動の変質である。今日、癲癇は、通
常、患者が示す主な発作の型により分類されている（あ
る患者は、２つ以上の発作の型を有するかもしれない
が、通常その１つは他の型よりも頻発するため、これに
基づき分類する）。発作型による分類の実際的な利点
は、選択した治療に対する応答の予測がある程度可能に
なることである。一般に、抗癲癇薬により発作を十分に
制御することができるのは、約半数の患者のみである；
残り半数は、時々の発作を有する患者と、制御できない
発作を有するか、かつ／又は抗癲癇薬から許容できない
有害作用を受ける患者に分けられる。更には、現在使用
されている薬剤は、しばしば副作用を引き起こす。発作
には多数の病因があり、その原因はしばしば曖昧なまま
であり、そのため、抗癲癇薬は、抗痙攣作用を示す他の
薬剤同様に治療的には重要である（例えば、Lloyd 及び
Gillenwater のPrinciples of Pharmacology、Munsonら
編、Chapman & Hall、ニューヨーク、1995、363-398 頁
を参照のこと）。
【０００５】
【課題を解決するための手段】以前に、オーファニンＦ
Ｑ（Orphanin FQ)又はノシセプチン（nociceptin）と呼
ばれる１７アミノ酸の長さのペプチド（Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｆ
−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｒ−Ｋ−Ｓ−Ａ−Ｒ−Ｋ−Ｌ−Ａ−Ｎ−
Ｑ）が、ラット脳（Meunier ら, Nature 377:532-535,
1995 ）及びブタ視床下部（Reinscheidら, Science 27
0: 792-794, 1995）から単離された。オーファニンＦＱ
のアミノ酸配列は、ノシセプチンの配列と同一であり、
以下これをＯＦＱと呼ぶ。Julius（Nature 377: 476, 1
995)は、このペプチドが、オピオイド受容体の５つの確
定した内因性リガンドの１つであるダイノルフィンＡと
最も大きな配列類似性を有するとして、ＯＦＱ発見を論
じている。ＯＦＱは、培養ＣＨＯ（ＬＣ１３２+)細胞の
アデニル酸シクラーゼを阻害し、マウスに脳室内投与す
ると痛覚過敏を誘導する（Meunier ら, 上記文献）。結
果のパターンは、このヘプタデカペプチドが、ＬＣ１３
２受容体の内因性アゴニストであり、向侵害受容性（pr
o-nociceptive properties）を有すると考えられること
を示している。Reinscheidら（上記文献）は、マウスに
脳室内投与すると、ＯＦＱは、運動活性を低下させ、テ
ールフリックテスト（tail-flick test)において痛覚過
敏を誘導した（ホットプレート試験では誘導しなかっ
た）ことを報告している。ＯＦＱは、脳の神経伝達物質
として作用して、侵害受容的（nociceptive ：痛みを受
容あるいは伝達できる）挙動及び運動挙動を調節するこ
とが結論づけられた。
Ｑ（Orphanin FQ)又はノシセプチン（nociceptin）と呼
ばれる１７アミノ酸の長さのペプチド（Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｆ
−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｒ−Ｋ−Ｓ−Ａ−Ｒ−Ｋ−Ｌ−Ａ−Ｎ−
Ｑ）が、ラット脳（Meunier ら, Nature 377:532-535,
1995 ）及びブタ視床下部（Reinscheidら, Science 27
0: 792-794, 1995）から単離された。オーファニンＦＱ
のアミノ酸配列は、ノシセプチンの配列と同一であり、
以下これをＯＦＱと呼ぶ。Julius（Nature 377: 476, 1
995)は、このペプチドが、オピオイド受容体の５つの確
定した内因性リガンドの１つであるダイノルフィンＡと
最も大きな配列類似性を有するとして、ＯＦＱ発見を論
じている。ＯＦＱは、培養ＣＨＯ（ＬＣ１３２+)細胞の
アデニル酸シクラーゼを阻害し、マウスに脳室内投与す
ると痛覚過敏を誘導する（Meunier ら, 上記文献）。結
果のパターンは、このヘプタデカペプチドが、ＬＣ１３
２受容体の内因性アゴニストであり、向侵害受容性（pr
o-nociceptive properties）を有すると考えられること
を示している。Reinscheidら（上記文献）は、マウスに
脳室内投与すると、ＯＦＱは、運動活性を低下させ、テ
ールフリックテスト（tail-flick test)において痛覚過
敏を誘導した（ホットプレート試験では誘導しなかっ
た）ことを報告している。ＯＦＱは、脳の神経伝達物質
として作用して、侵害受容的（nociceptive ：痛みを受
容あるいは伝達できる）挙動及び運動挙動を調節するこ
とが結論づけられた。
【０００６】Vaughan 及びChristie（Br. J. Pharmaco
l. 177: 1609-1611, 1996）は、脳切片における全細胞
パッチクランプ記録法を使用して、ラットの背側縫線核
ニューロン（dorsal raphe nucleus neurons）の膜の性
質に及ぼすＯＦＱの作用を調査した。報告されている背
側縫線ニューロン中のＬＣ１３２受容体ｍＲＮＡの存在
（Lachowicz ら, J. Neurochem. 64: 34-40, 1995)及び
Ｋチャネルを活性化するクローン化ＬＣ１３２受容体の
Ｇタンパク質介在性カップリング（Zhang 及びYu, J. B
iol. Chem. 270: 22772-22776, 1995)と矛盾なく、ＬＣ
１３２受容体リガンドのノシセプチンは、背側縫線ニュ
ーロンにおける内部に向かって整流するＫコンダクタン
スを強力かつ有効に増大させることが見い出された。
l. 177: 1609-1611, 1996）は、脳切片における全細胞
パッチクランプ記録法を使用して、ラットの背側縫線核
ニューロン（dorsal raphe nucleus neurons）の膜の性
質に及ぼすＯＦＱの作用を調査した。報告されている背
側縫線ニューロン中のＬＣ１３２受容体ｍＲＮＡの存在
（Lachowicz ら, J. Neurochem. 64: 34-40, 1995)及び
Ｋチャネルを活性化するクローン化ＬＣ１３２受容体の
Ｇタンパク質介在性カップリング（Zhang 及びYu, J. B
iol. Chem. 270: 22772-22776, 1995)と矛盾なく、ＬＣ
１３２受容体リガンドのノシセプチンは、背側縫線ニュ
ーロンにおける内部に向かって整流するＫコンダクタン
スを強力かつ有効に増大させることが見い出された。
【０００７】驚くべきことに、本出願人らは、ＯＦＱの
ようなＬＣ１３２受容体アゴニストが、精神医学的及び
神経学的障害の動物モデル（患者における治療有効性を
予測する）において奏効したことを証明した（特に不安
障害、癲癇、及び痙攣の治療であるが、これらに限定さ
れない）。この測定により、出願人らは、治療上有用な
化合物、及び／又は治療的に有用な化合物の発見に使用
されるリード化合物の両方を提供する、有用な物質を同
定することができる方法とプロトコールを開発すること
ができた。したがって本発明は、精神医学的及び／又は
神経学的障害に関するスクリーニングアッセイ（特に、
抗癲癇、抗痙攣、又は抗不安薬スクリーニング試験）に
おいてＬＣ１３２受容体アゴニストを試験することを含
む、治療上有用な化合物のスクリーニング方法に関す
る。
ようなＬＣ１３２受容体アゴニストが、精神医学的及び
神経学的障害の動物モデル（患者における治療有効性を
予測する）において奏効したことを証明した（特に不安
障害、癲癇、及び痙攣の治療であるが、これらに限定さ
れない）。この測定により、出願人らは、治療上有用な
化合物、及び／又は治療的に有用な化合物の発見に使用
されるリード化合物の両方を提供する、有用な物質を同
定することができる方法とプロトコールを開発すること
ができた。したがって本発明は、精神医学的及び／又は
神経学的障害に関するスクリーニングアッセイ（特に、
抗癲癇、抗痙攣、又は抗不安薬スクリーニング試験）に
おいてＬＣ１３２受容体アゴニストを試験することを含
む、治療上有用な化合物のスクリーニング方法に関す
る。
【０００８】
【発明の実施の形態】好ましい実施態様において、治療
上有用な化合物の本スクリーニング方法は、精神医学的
及び／又は神経学的障害のスクリーニングアッセイにお
いてＬＣ１３２受容体アゴニストを試験することを含
む。好ましくは、本方法は、ＬＣ１３２受容体アゴニス
ト活性を有することが推測される物質にＬＣ１３２受容
体を接触させて、ＬＣ１３２受容体−該物質結合の検出
及び／又はＬＣ１３２受容体アゴニスト活性の測定を行
い、次に精神医学的及び／又は神経学的障害のスクリー
ニングアッセイ（即ち、抗癲癇、抗痙攣又は抗不安薬ス
クリーニングアッセイ）においてアゴニスト活性を有す
る薬物を試験することを含む。
上有用な化合物の本スクリーニング方法は、精神医学的
及び／又は神経学的障害のスクリーニングアッセイにお
いてＬＣ１３２受容体アゴニストを試験することを含
む。好ましくは、本方法は、ＬＣ１３２受容体アゴニス
ト活性を有することが推測される物質にＬＣ１３２受容
体を接触させて、ＬＣ１３２受容体−該物質結合の検出
及び／又はＬＣ１３２受容体アゴニスト活性の測定を行
い、次に精神医学的及び／又は神経学的障害のスクリー
ニングアッセイ（即ち、抗癲癇、抗痙攣又は抗不安薬ス
クリーニングアッセイ）においてアゴニスト活性を有す
る薬物を試験することを含む。
【０００９】「ＬＣ１３２受容体」又は「ＬＣ１３２受
容体タンパク質」という用語は、未変性受容体タンパク
質及びその誘導体を意味する。異なる動物種からのこの
受容体又はその誘導体は、文献上いくつかの名称で呼ば
れるが、最も一般的にはＯＲＬ1 が使用される。そのヒ
ト及び齧歯類の相補ＤＮＡが最近性状解析された、オー
ファン受容体であるＬＣ１３２受容体は、構造的にオピ
オイド受容体に類似している（Mollereau ら, FEBS Let
t. 341: 33-38, 1994; Fukuda , FEBS Lett. 343: 42-4
6, 1994; Chen ら, FEBS Lett. 347: 279-283, 1994; B
unzow ら, FEBSLett. 347: 284-288, 1994; Wang ら, F
EBS Lett. 348: 75-79, 1994; Lachowiczら, 上記文献;
Nishi ら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 205: 135
3-1357,1994 及びWickら, Molec. Brain Res. 27: 37-4
4, 1995)。ＬＣ１３２受容体の生物活性は、ＯＦＱの高
親和性結合をその特徴とし、アデニル酸シクラーゼとは
ネガティブにカップリングする（Meunier ら, 上記文
献; Reinscheidら, 1995,上記文献）。
容体タンパク質」という用語は、未変性受容体タンパク
質及びその誘導体を意味する。異なる動物種からのこの
受容体又はその誘導体は、文献上いくつかの名称で呼ば
れるが、最も一般的にはＯＲＬ1 が使用される。そのヒ
ト及び齧歯類の相補ＤＮＡが最近性状解析された、オー
ファン受容体であるＬＣ１３２受容体は、構造的にオピ
オイド受容体に類似している（Mollereau ら, FEBS Let
t. 341: 33-38, 1994; Fukuda , FEBS Lett. 343: 42-4
6, 1994; Chen ら, FEBS Lett. 347: 279-283, 1994; B
unzow ら, FEBSLett. 347: 284-288, 1994; Wang ら, F
EBS Lett. 348: 75-79, 1994; Lachowiczら, 上記文献;
Nishi ら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 205: 135
3-1357,1994 及びWickら, Molec. Brain Res. 27: 37-4
4, 1995)。ＬＣ１３２受容体の生物活性は、ＯＦＱの高
親和性結合をその特徴とし、アデニル酸シクラーゼとは
ネガティブにカップリングする（Meunier ら, 上記文
献; Reinscheidら, 1995,上記文献）。
【００１０】通常、好ましいＬＣ１３２受容体誘導体
は、対応するヒトＬＣ１３２受容体のアミノ酸配列と少
なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、そして
最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性
を有するアミノ酸配列を有し、これらが高い親和性でＯ
ＦＱに結合することができることを特徴とする。アッセ
イ法の特に有利な実施態様としては、未変性ヒトＬＣ１
３２受容体タンパク質の使用を含む。
は、対応するヒトＬＣ１３２受容体のアミノ酸配列と少
なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、そして
最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性
を有するアミノ酸配列を有し、これらが高い親和性でＯ
ＦＱに結合することができることを特徴とする。アッセ
イ法の特に有利な実施態様としては、未変性ヒトＬＣ１
３２受容体タンパク質の使用を含む。
【００１１】「ＬＣ１３２受容体タンパク質」という用
語はまた、少なくとも、ＯＦＱペプチドに結合すること
ができる部分的タンパク質配列を含む、天然又は非天然
の受容体タンパク質の誘導体及び関連タンパク質、即
ち、天然ＬＣ１３２受容体又はその断片のアミノ酸の１
つ以上が、結合活性の消失なしに置換又は欠失したタン
パク質を含む。このような誘導体は、ペプチド化学の既
知の方法により、又は組換えＤＮＡ法により生成するこ
とができる。「ＬＣ１３２受容体タンパク質」という用
語はまた、当該分野で既知の方法により、残基の側鎖又
はＮ−若しくはＣ−末端基として生じる官能基から調製
することができる誘導体を含む。これらの誘導体は、カ
ルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニア又は第１級
若しくは第２級アミンとカルボキシル基の反応によるア
ミド、アシル残基（例えば、アルカノイル又は炭素環ア
ロイル基）により生成するアミノ酸残基の遊離アミノ基
のＮ−アシル誘導体、あるいはアシル残基により生成す
る、遊離ヒドロキシル基（例えば、セリル−又はトレオ
ニル残基のヒドロキシル基）のＯ−アシル誘導体を含ん
でよい。
語はまた、少なくとも、ＯＦＱペプチドに結合すること
ができる部分的タンパク質配列を含む、天然又は非天然
の受容体タンパク質の誘導体及び関連タンパク質、即
ち、天然ＬＣ１３２受容体又はその断片のアミノ酸の１
つ以上が、結合活性の消失なしに置換又は欠失したタン
パク質を含む。このような誘導体は、ペプチド化学の既
知の方法により、又は組換えＤＮＡ法により生成するこ
とができる。「ＬＣ１３２受容体タンパク質」という用
語はまた、当該分野で既知の方法により、残基の側鎖又
はＮ−若しくはＣ−末端基として生じる官能基から調製
することができる誘導体を含む。これらの誘導体は、カ
ルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニア又は第１級
若しくは第２級アミンとカルボキシル基の反応によるア
ミド、アシル残基（例えば、アルカノイル又は炭素環ア
ロイル基）により生成するアミノ酸残基の遊離アミノ基
のＮ−アシル誘導体、あるいはアシル残基により生成す
る、遊離ヒドロキシル基（例えば、セリル−又はトレオ
ニル残基のヒドロキシル基）のＯ−アシル誘導体を含ん
でよい。
【００１２】ＬＣ１３２（オピオイド様）オーファン受
容体は、最近になって、オピオイド受容体の予測された
アミノ酸配列との高い相同性に基づいて同定された（Mo
llereau ら, 上記文献; Bunzowら, 上記文献; Lachowic
z ら, 上記文献）。ＬＣ１３２受容体を、異種の系（例
えば、ＣＨＯ細胞株）において発現したとき、エトルフ
ィン（etorphine)及びダイノルフィンＡはサイクリック
ＡＭＰ形成を弱く阻害したが、他のオピオイドは不活性
であった。ヘプタデカペプチドＯＦＱは、ＬＣ１３２受
容体の強力かつ有効な内因性アゴニストとして同定され
た（Meunier ら, 上記文献、Reinscheidら（1995),上記
文献）。ＬＣ１３２転写物は、視床下部、脳幹及び脊髄
背角を含む、痛みの調節に関与することが知られている
中枢神経系のいくつかの領域において発現する（Juliu
s, 上記文献）。
容体は、最近になって、オピオイド受容体の予測された
アミノ酸配列との高い相同性に基づいて同定された（Mo
llereau ら, 上記文献; Bunzowら, 上記文献; Lachowic
z ら, 上記文献）。ＬＣ１３２受容体を、異種の系（例
えば、ＣＨＯ細胞株）において発現したとき、エトルフ
ィン（etorphine)及びダイノルフィンＡはサイクリック
ＡＭＰ形成を弱く阻害したが、他のオピオイドは不活性
であった。ヘプタデカペプチドＯＦＱは、ＬＣ１３２受
容体の強力かつ有効な内因性アゴニストとして同定され
た（Meunier ら, 上記文献、Reinscheidら（1995),上記
文献）。ＬＣ１３２転写物は、視床下部、脳幹及び脊髄
背角を含む、痛みの調節に関与することが知られている
中枢神経系のいくつかの領域において発現する（Juliu
s, 上記文献）。
【００１３】ＬＣ１３２受容体タンパク質及びその誘導
体の発現は、従来の組換えＤＮＡ法により達成すること
ができる。このような方法は、文献で説明されている
（例えば、Sambrook, Fritsch 及びManiatis, Molecula
r Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, ニューヨーク, 1989並びにAusubel ら,C
urrent Protocols in Molecular Biology, Green Publi
shers Association & Wiley Interscience, 1987 を参
照のこと）。更に、完全な又は部分的ＬＣ１３２タンパ
ク質をコードするＤＮＡ分子又はその断片は、ポリメラ
ーゼチェーン反応（ＰＣＲ）法により得ることができ
る。ＬＣ１３２受容体をコードする核酸配列は、多様な
宿主／ベクターの組合せを使用して発現することができ
る。有用な発現ベクターは、染色体、非染色体及び合成
核酸配列のセグメントよりなっていてよい。このような
ベクターの例は、ＳＶ４０の種々の既知の誘導体のよう
なウイルスベクター；大腸菌（E. coli)からのプラスミ
ドのような細菌ベクター；λファージ誘導体、Ｍ１３及
び他の繊維状一本鎖ＤＮＡファージのようなファージＤ
ＮＡ；並びに２μプラスミドの誘導体のような酵母中で
有用なベクター；ＳＶ４０、アデノウイルス及び／又は
レトロウイルス由来ＤＮＡ配列を含有するベクターのよ
うな、真核細胞中で有用なベクター、更に好ましくは動
物細胞中で有用なベクターがある。
体の発現は、従来の組換えＤＮＡ法により達成すること
ができる。このような方法は、文献で説明されている
（例えば、Sambrook, Fritsch 及びManiatis, Molecula
r Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, ニューヨーク, 1989並びにAusubel ら,C
urrent Protocols in Molecular Biology, Green Publi
shers Association & Wiley Interscience, 1987 を参
照のこと）。更に、完全な又は部分的ＬＣ１３２タンパ
ク質をコードするＤＮＡ分子又はその断片は、ポリメラ
ーゼチェーン反応（ＰＣＲ）法により得ることができ
る。ＬＣ１３２受容体をコードする核酸配列は、多様な
宿主／ベクターの組合せを使用して発現することができ
る。有用な発現ベクターは、染色体、非染色体及び合成
核酸配列のセグメントよりなっていてよい。このような
ベクターの例は、ＳＶ４０の種々の既知の誘導体のよう
なウイルスベクター；大腸菌（E. coli)からのプラスミ
ドのような細菌ベクター；λファージ誘導体、Ｍ１３及
び他の繊維状一本鎖ＤＮＡファージのようなファージＤ
ＮＡ；並びに２μプラスミドの誘導体のような酵母中で
有用なベクター；ＳＶ４０、アデノウイルス及び／又は
レトロウイルス由来ＤＮＡ配列を含有するベクターのよ
うな、真核細胞中で有用なベクター、更に好ましくは動
物細胞中で有用なベクターがある。
【００１４】ＬＣ１３２受容体をコードする核酸配列の
発現に使用される宿主細胞は、種々の既知の宿主から選
択することができる。多くの宿主が、例えば、The Amer
icanType Culture Collection（ＡＴＣＣ）から入手可
能である。ＬＣ１３２発現用の好適な宿主は、ＣＨＯ細
胞のような哺乳動物細胞である。ＬＣ１３２受容体発現
細胞株の調製は、当該分野で既知であり、例えば、Rein
scheidら（1995, 上記文献）により記載されている。
発現に使用される宿主細胞は、種々の既知の宿主から選
択することができる。多くの宿主が、例えば、The Amer
icanType Culture Collection（ＡＴＣＣ）から入手可
能である。ＬＣ１３２発現用の好適な宿主は、ＣＨＯ細
胞のような哺乳動物細胞である。ＬＣ１３２受容体発現
細胞株の調製は、当該分野で既知であり、例えば、Rein
scheidら（1995, 上記文献）により記載されている。
【００１５】「ＬＣ１３２受容体アゴニスト」という用
語は、ＬＣ１３２受容体に結合することができ、それに
よりＬＣ１３２受容体機能を調節する、即ち、ＬＣ１３
２受容体を発現することができるベクターで形質転換し
た細胞において、フォルスコリンに刺激されたアデニリ
ルシクラーゼ活性を阻害することができる化合物を意味
する。典型的なアゴニストは、好ましくは１μM 未満の
ＩＣ50値を有する高親和性リガンドであり、例えばＯＦ
Ｑ又はその誘導体である。
語は、ＬＣ１３２受容体に結合することができ、それに
よりＬＣ１３２受容体機能を調節する、即ち、ＬＣ１３
２受容体を発現することができるベクターで形質転換し
た細胞において、フォルスコリンに刺激されたアデニリ
ルシクラーゼ活性を阻害することができる化合物を意味
する。典型的なアゴニストは、好ましくは１μM 未満の
ＩＣ50値を有する高親和性リガンドであり、例えばＯＦ
Ｑ又はその誘導体である。
【００１６】「ＬＣ１３２受容体アゴニスト活性を有す
ることが推測される物質とＬＣ１３２受容体を接触させ
る」という用語は、以下の特徴を含む：ＬＣ１３２受容
体タンパク質、好ましくはヒトＬＣ１３２受容体タンパ
ク質は、適切な緩衝条件で固相に結合している。この固
相は、通常ポリ（ビニルクロリド）であるが、セルロー
ス、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン又は
ポリプロピレンのような他のポリマーであってもよい。
この固体支持体は、管、ビーズ、ディスク又はマイクロ
プレートの形であっても、あるいはアッセイを実施する
のに適切な任意の他の表面であってもよく、これが、Ｌ
Ｃ１３２受容体を受動的に結合させることにより、受容
体の高親和性結合部位を露出させる。洗浄後、ＬＣ１３
２受容体に結合しうるか、及び／又はＬＣ１３２受容体
アゴニスト活性を有することが推測される薬物が、適切
な緩衝液溶液として添加される。
ることが推測される物質とＬＣ１３２受容体を接触させ
る」という用語は、以下の特徴を含む：ＬＣ１３２受容
体タンパク質、好ましくはヒトＬＣ１３２受容体タンパ
ク質は、適切な緩衝条件で固相に結合している。この固
相は、通常ポリ（ビニルクロリド）であるが、セルロー
ス、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン又は
ポリプロピレンのような他のポリマーであってもよい。
この固体支持体は、管、ビーズ、ディスク又はマイクロ
プレートの形であっても、あるいはアッセイを実施する
のに適切な任意の他の表面であってもよく、これが、Ｌ
Ｃ１３２受容体を受動的に結合させることにより、受容
体の高親和性結合部位を露出させる。洗浄後、ＬＣ１３
２受容体に結合しうるか、及び／又はＬＣ１３２受容体
アゴニスト活性を有することが推測される薬物が、適切
な緩衝液溶液として添加される。
【００１７】ＬＣ１３２受容体の好ましい調製方法は、
哺乳動物細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞株）を、ＬＣ１３
２受容体をコードする核酸配列を含有するベクターによ
りトランスフェクションを行い、次に受容体タンパク質
を発現させることを特徴とする。次に受容体タンパク質
を含有する精製した膜を、上述の固体表面に結合させ
て、ＬＣ１３２受容体アゴニストであることが推測され
る薬物と共にインキュベートする。これらの方法は、当
該分野で既知であり、例えば、Reinscheidら（上記文
献）により記載されている。この場合に、本発明の方法
は、（ａ）ＬＣ１３２受容体を含有する細胞膜を調製
し、（ｂ）ＬＣ１３２受容体アゴニストであることが推
測される化合物とこの膜を接触させて；そして（ｃ）こ
の化合物が、ＬＣ１３２受容体に結合してアゴニストに
特有な活性を発揮するかどうかを測定し、続いて精神医
学的及び／又は神経学的障害のスクリーニングアッセイ
を行うことを含む。
哺乳動物細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞株）を、ＬＣ１３
２受容体をコードする核酸配列を含有するベクターによ
りトランスフェクションを行い、次に受容体タンパク質
を発現させることを特徴とする。次に受容体タンパク質
を含有する精製した膜を、上述の固体表面に結合させ
て、ＬＣ１３２受容体アゴニストであることが推測され
る薬物と共にインキュベートする。これらの方法は、当
該分野で既知であり、例えば、Reinscheidら（上記文
献）により記載されている。この場合に、本発明の方法
は、（ａ）ＬＣ１３２受容体を含有する細胞膜を調製
し、（ｂ）ＬＣ１３２受容体アゴニストであることが推
測される化合物とこの膜を接触させて；そして（ｃ）こ
の化合物が、ＬＣ１３２受容体に結合してアゴニストに
特有な活性を発揮するかどうかを測定し、続いて精神医
学的及び／又は神経学的障害のスクリーニングアッセイ
を行うことを含む。
【００１８】アゴニストであることが推測される薬物
の、ＬＣ１３２受容体に対する結合の検出は、薬物の直
接標識化、又はＯＦＱのような競合薬物の標識化により
行われる。この薬物又は競合薬物は、例えば、放射活性
標識によりマーク付けされる。好ましい実施態様は、Re
inscheidら（1995, 上記文献）及び実施例１にも記載さ
れている。
の、ＬＣ１３２受容体に対する結合の検出は、薬物の直
接標識化、又はＯＦＱのような競合薬物の標識化により
行われる。この薬物又は競合薬物は、例えば、放射活性
標識によりマーク付けされる。好ましい実施態様は、Re
inscheidら（1995, 上記文献）及び実施例１にも記載さ
れている。
【００１９】ＬＣ１３２受容体アゴニスト活性の薬理学
的性状解析は、ＬＣ１３２受容体を発現することができ
るベクターでトランスフェクトされた宿主細胞（例えば
ＣＨＯ細胞）における、フォルスコリン刺激によるｃＡ
ＭＰ蓄積の阻害の程度により測定することができる。ｃ
ＡＭＰの濃度は、Reinscheidら（1995, 上記文献）又は
当該分野で既知の他の方法により測定することができ
る。ＬＣ１３２受容体アゴニスト活性の測定を含む本発
明の特に好ましい実施態様は、実施例１に記載されてい
る。
的性状解析は、ＬＣ１３２受容体を発現することができ
るベクターでトランスフェクトされた宿主細胞（例えば
ＣＨＯ細胞）における、フォルスコリン刺激によるｃＡ
ＭＰ蓄積の阻害の程度により測定することができる。ｃ
ＡＭＰの濃度は、Reinscheidら（1995, 上記文献）又は
当該分野で既知の他の方法により測定することができ
る。ＬＣ１３２受容体アゴニスト活性の測定を含む本発
明の特に好ましい実施態様は、実施例１に記載されてい
る。
【００２０】次いでＬＣ１３２受容体アゴニストは、精
神医学的及び／又は神経学的障害スクリーニングアッセ
イにより更に性状解析することができる。「精神医学的
及び／又は神経学的スクリーニングアッセイ」という用
語は、抗不安、抗癲癇及び／又は抗痙攣薬スクリーニン
グアッセイを意味するが、これらに限定されない。これ
らのアッセイは当該分野で既知であり、以下に記載され
る：
神医学的及び／又は神経学的障害スクリーニングアッセ
イにより更に性状解析することができる。「精神医学的
及び／又は神経学的スクリーニングアッセイ」という用
語は、抗不安、抗癲癇及び／又は抗痙攣薬スクリーニン
グアッセイを意味するが、これらに限定されない。これ
らのアッセイは当該分野で既知であり、以下に記載され
る：
【００２１】不安試験（Martin及びHaefely, 上記文
献）。ヒトにおける新規化合物の抗不安活性を予測する
試みにおいて、多数の動物モデルが開発されてきた。こ
れらのパラダイムの多くは、いわゆる「葛藤」状況にあ
る動物の行動（即ち、行動応答が、同時に接近及び回避
の傾向のような２つの相反する動機づけ状態の影響下に
ある）を評価する。恐らく既知の最良のモデルは、動物
が、報酬（例えば、空腹の動物に対する食物）を受ける
ために自発的にある種の応答（例えば、レバーを押す）
を示すように訓練される、条件づけられた懲罰葛藤パラ
ダイムである。一旦動物が一定速度のレバー押し応答を
示すようになると、次にレバー押しにより、食物で報い
られると同時に足への穏やかな電気ショックで罰せられ
る、短い時間を導入する（通常目に見えるシグナル又は
音によるシグナルにより合図される）。動物はこの葛藤
の期間、応答速度の著しい低下を示し、また、表面に現
われた種々の感情の徴候により特徴づけられる。ベンゾ
ジアゼピン受容体アゴニスト（例えば、抗不安薬のジア
ゼパム）の特徴的な作用は、懲罰されない応答を中断し
ない用量での、懲罰される行動の脱抑制である（懲罰下
の応答速度の増大を引き起こす）。更には、これら同じ
活性の薬剤は、実際の懲罰が存在しない場合、即ち、レ
バー押しの速度が、条件づけられた懲罰恐怖により低下
するとき、抗不安様作用をもたらす。この葛藤タスク
は、条件づけられた行動応答を必要としない：実験経験
のない喉の渇いた動物は、飲み物をとる機会を与えられ
るが、飲むと帯電した飲み口と接触することで罰せられ
る。このような懲罰により抑制される水飲みは、ベンゾ
ジアゼピン受容体アゴニスト（例えば、ジアゼパム）に
より用量依存的に脱抑制される。探査のための活動も同
様に付随する懲罰により低下し、既知の抗不安薬の投与
で解放される。懲罰のない葛藤モデルは、一方では探検
する傾向、及びもう一方では新規な環境（例えば、明暗
室タスク、上昇するプラス迷路、未知の食物又は未知の
環境での通常の食物の消費、相互に未知の動物の間の社
会的相互作用）への恐怖という、自然な相反する動機づ
け状態の存在に基づいている。これらの実験状況でのベ
ンゾジアゼピン受容体アゴニズムの、行動を脱抑制する
作用を抗不安作用に似た作用に帰すことは自明である
が、これらの作用はまた、嫌悪となる要因の影響の一般
的な低下、又は生得の若しくは条件づけられた応答を抑
える能力の障害として解釈することができる。ベンゾジ
アゼピン受容体アゴニズムから生じる抗欲求不満作用
は、報償が減らされたり又は割愛されている状況下で、
応答次第で与えられる報償によって維持される応答の増
大により示唆される。動物に長期に移植された電極によ
る中脳水道周囲灰白部の電気刺激は、忌避すべきもの
で、多くの情動反応を誘発する；ベンゾジアゼピン受容
体アゴニストは、この忌避閾値を上昇させる。行動及び
生理的症状（心血管系、内分泌系）により特徴づけられ
る急性不安の状態は、ヒトにおいて不安を誘起すること
が知られている化学物質（例えば、ペンチレンテトラゾ
ールのような痙攣薬、痙攣誘発用量未満で投与されたベ
ンゾジアゼピン受容体アゴニストの逆アゴニスト、又は
更に高用量の鎮静薬による長期治療後の突然の投薬中
止）により誘導することができる。急にその母親から隔
離されたラットの仔の超音波の苦痛の啼き声は、ベンゾ
ジアゼピン受容体アゴニストにより減少する。上記パラ
ダイムにおいて抗うつ薬、鎮痛薬、及び抗精神病薬が全
て相対的に無効であるのに対して、ベンゾジアゼピン受
容体アゴニストの薬理学的特異性は印象的である。
献）。ヒトにおける新規化合物の抗不安活性を予測する
試みにおいて、多数の動物モデルが開発されてきた。こ
れらのパラダイムの多くは、いわゆる「葛藤」状況にあ
る動物の行動（即ち、行動応答が、同時に接近及び回避
の傾向のような２つの相反する動機づけ状態の影響下に
ある）を評価する。恐らく既知の最良のモデルは、動物
が、報酬（例えば、空腹の動物に対する食物）を受ける
ために自発的にある種の応答（例えば、レバーを押す）
を示すように訓練される、条件づけられた懲罰葛藤パラ
ダイムである。一旦動物が一定速度のレバー押し応答を
示すようになると、次にレバー押しにより、食物で報い
られると同時に足への穏やかな電気ショックで罰せられ
る、短い時間を導入する（通常目に見えるシグナル又は
音によるシグナルにより合図される）。動物はこの葛藤
の期間、応答速度の著しい低下を示し、また、表面に現
われた種々の感情の徴候により特徴づけられる。ベンゾ
ジアゼピン受容体アゴニスト（例えば、抗不安薬のジア
ゼパム）の特徴的な作用は、懲罰されない応答を中断し
ない用量での、懲罰される行動の脱抑制である（懲罰下
の応答速度の増大を引き起こす）。更には、これら同じ
活性の薬剤は、実際の懲罰が存在しない場合、即ち、レ
バー押しの速度が、条件づけられた懲罰恐怖により低下
するとき、抗不安様作用をもたらす。この葛藤タスク
は、条件づけられた行動応答を必要としない：実験経験
のない喉の渇いた動物は、飲み物をとる機会を与えられ
るが、飲むと帯電した飲み口と接触することで罰せられ
る。このような懲罰により抑制される水飲みは、ベンゾ
ジアゼピン受容体アゴニスト（例えば、ジアゼパム）に
より用量依存的に脱抑制される。探査のための活動も同
様に付随する懲罰により低下し、既知の抗不安薬の投与
で解放される。懲罰のない葛藤モデルは、一方では探検
する傾向、及びもう一方では新規な環境（例えば、明暗
室タスク、上昇するプラス迷路、未知の食物又は未知の
環境での通常の食物の消費、相互に未知の動物の間の社
会的相互作用）への恐怖という、自然な相反する動機づ
け状態の存在に基づいている。これらの実験状況でのベ
ンゾジアゼピン受容体アゴニズムの、行動を脱抑制する
作用を抗不安作用に似た作用に帰すことは自明である
が、これらの作用はまた、嫌悪となる要因の影響の一般
的な低下、又は生得の若しくは条件づけられた応答を抑
える能力の障害として解釈することができる。ベンゾジ
アゼピン受容体アゴニズムから生じる抗欲求不満作用
は、報償が減らされたり又は割愛されている状況下で、
応答次第で与えられる報償によって維持される応答の増
大により示唆される。動物に長期に移植された電極によ
る中脳水道周囲灰白部の電気刺激は、忌避すべきもの
で、多くの情動反応を誘発する；ベンゾジアゼピン受容
体アゴニストは、この忌避閾値を上昇させる。行動及び
生理的症状（心血管系、内分泌系）により特徴づけられ
る急性不安の状態は、ヒトにおいて不安を誘起すること
が知られている化学物質（例えば、ペンチレンテトラゾ
ールのような痙攣薬、痙攣誘発用量未満で投与されたベ
ンゾジアゼピン受容体アゴニストの逆アゴニスト、又は
更に高用量の鎮静薬による長期治療後の突然の投薬中
止）により誘導することができる。急にその母親から隔
離されたラットの仔の超音波の苦痛の啼き声は、ベンゾ
ジアゼピン受容体アゴニストにより減少する。上記パラ
ダイムにおいて抗うつ薬、鎮痛薬、及び抗精神病薬が全
て相対的に無効であるのに対して、ベンゾジアゼピン受
容体アゴニストの薬理学的特異性は印象的である。
【００２２】抗癲癇／抗痙攣試験（Martin及びHaefely,
上記文献）。ベンゾジアゼピン受容体アゴニストは、
全身投与（例えば、ペンチレンテトラゾール、ビククリ
ン、ピクロトキシン、ＧＡＢＡ生合成の阻害剤、ペニシ
リン、局所麻酔薬、アセチルコリンエステラーゼ阻害
剤）、皮質表面若しくは脳室系中への局所適用（強心配
糖体、グルタミン酸受容体刺激物質ＮＭＤＡ）、又は皮
質中への長期適用（焦点性アルミニウム又はコバルト癲
癇）により投与される化学物質により急性的に誘導され
る動物の発作を、予防又は消失させる用途が知られてい
る最も強力な薬剤の１つである。これらはまた、高圧発
作（hyperbaric seizures)に対する防御、及び閾値未満
の強度で開始する大脳辺縁系における長期の間欠性電気
刺激後に発生する発作（燃上り発作）の防御にも有効で
ある。電気痙攣発作もまた、多くの（全てではない）ベ
ンゾジアゼピン受容体アゴニストにより防御されるが、
化学物質誘導性発作を遮断する用量よりもかなり高い用
量を要する。癲癇の種々の遺伝的モデル（ラットにおけ
る小発作様表現型、遺伝的に影響を受けやすいマウス種
における音刺激で誘導される発作、又は遺伝的に影響を
受けやすいヒヒにおける光刺激で誘導されるミオクロー
ヌス発作）は、ベンゾジアゼピン受容体アゴニストに応
答する。即ち、ベンゾジアゼピン受容体アゴニストは、
多くの形のヒトの癲癇又は痙攣状態における効力を予測
できる、現時点の全ての動物癲癇モデルにおいて有効で
ある。これらの広い抗痙攣活性と矛盾なく、ベンゾジア
ゼピン受容体アゴニストは、インビトロで維持した脳切
片、特に海馬切片における、種々の方法（痙攣薬、イオ
ン性組成物）で誘導される癲癇様の電気的な活性を防止
又は抑制する。これらはまた、電気刺激により種々の脳
領域で誘導されるニューロンの後放電を減少させる。ベ
ンゾジアゼピン受容体アゴニストは、焦点における癲癇
様活性を減少させ、同様に全身性発作を阻害することが
見い出された。
上記文献）。ベンゾジアゼピン受容体アゴニストは、
全身投与（例えば、ペンチレンテトラゾール、ビククリ
ン、ピクロトキシン、ＧＡＢＡ生合成の阻害剤、ペニシ
リン、局所麻酔薬、アセチルコリンエステラーゼ阻害
剤）、皮質表面若しくは脳室系中への局所適用（強心配
糖体、グルタミン酸受容体刺激物質ＮＭＤＡ）、又は皮
質中への長期適用（焦点性アルミニウム又はコバルト癲
癇）により投与される化学物質により急性的に誘導され
る動物の発作を、予防又は消失させる用途が知られてい
る最も強力な薬剤の１つである。これらはまた、高圧発
作（hyperbaric seizures)に対する防御、及び閾値未満
の強度で開始する大脳辺縁系における長期の間欠性電気
刺激後に発生する発作（燃上り発作）の防御にも有効で
ある。電気痙攣発作もまた、多くの（全てではない）ベ
ンゾジアゼピン受容体アゴニストにより防御されるが、
化学物質誘導性発作を遮断する用量よりもかなり高い用
量を要する。癲癇の種々の遺伝的モデル（ラットにおけ
る小発作様表現型、遺伝的に影響を受けやすいマウス種
における音刺激で誘導される発作、又は遺伝的に影響を
受けやすいヒヒにおける光刺激で誘導されるミオクロー
ヌス発作）は、ベンゾジアゼピン受容体アゴニストに応
答する。即ち、ベンゾジアゼピン受容体アゴニストは、
多くの形のヒトの癲癇又は痙攣状態における効力を予測
できる、現時点の全ての動物癲癇モデルにおいて有効で
ある。これらの広い抗痙攣活性と矛盾なく、ベンゾジア
ゼピン受容体アゴニストは、インビトロで維持した脳切
片、特に海馬切片における、種々の方法（痙攣薬、イオ
ン性組成物）で誘導される癲癇様の電気的な活性を防止
又は抑制する。これらはまた、電気刺激により種々の脳
領域で誘導されるニューロンの後放電を減少させる。ベ
ンゾジアゼピン受容体アゴニストは、焦点における癲癇
様活性を減少させ、同様に全身性発作を阻害することが
見い出された。
【００２３】上述のＬＣ１３２受容体アゴニストである
ＯＦＱを、マウスに脳室内注射して、抗不安作用検出の
ために使用される試験でマウスを評価した（オペラント
葛藤試験、明暗試験；実施例２及び３）。ＯＦＱが抗不
安作用を示すことが両方の試験パラダイムにおいて証明
された。更に、脳室内注射されたＯＦＱは癲癇のマウス
モデル（聴原性発作モデル；実施例４）において活性で
あることが証明され、一般的な抗痙攣作用及び患者にお
ける抗癲癇作用を予測させる。ＯＦＱのこれらの強力な
治療効果のいずれも文献に報告されていない。
ＯＦＱを、マウスに脳室内注射して、抗不安作用検出の
ために使用される試験でマウスを評価した（オペラント
葛藤試験、明暗試験；実施例２及び３）。ＯＦＱが抗不
安作用を示すことが両方の試験パラダイムにおいて証明
された。更に、脳室内注射されたＯＦＱは癲癇のマウス
モデル（聴原性発作モデル；実施例４）において活性で
あることが証明され、一般的な抗痙攣作用及び患者にお
ける抗癲癇作用を予測させる。ＯＦＱのこれらの強力な
治療効果のいずれも文献に報告されていない。
【００２４】好ましい試験は、以下実施例１、２、３及
び４に記載したとおりである。
び４に記載したとおりである。
【００２５】ＬＣ１３２受容体アゴニスト活性及びフォ
ルスコリン刺激によるｃＡＭＰ蓄積の阻害の測定（実施
例１） ＯＦＱが、トランスフェクトしていないＣＨＯ細胞に比
較してＬＣ１３２でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に
おいて、フォルスコリン刺激ｃＡＭＰ蓄積を阻害するこ
とが証明された。ＯＦＱは、１．０５±０．２１nMの５
０％有効濃度（ＥＣ50）で、ＬＣ１３２受容体でトラン
スフェクトしたＣＨＯ細胞におけるフォルスコリン刺激
ｃＡＭＰ蓄積を阻害し、最大効果は、１００nMで約８０
％阻害である。トランスフェクトしていない細胞には効
果がない。その受容体に対するＯＦＱの結合速度論の測
定のために、放射性リガンド〔 125Ｉ〕Ｔｙｒ14−オー
ファニンを製造し性状解析した（Reinscheidら, J. Bio
l. Chem. 271: 14163-14168, 1996 。〔 125Ｉ〕Ｔｙｒ
14−オーファニンは、飽和可能かつ置換可能な様式で、
５６．２±７．３pMのＫd 及びＢmax 約２００fmol/mg
タンパク質で、ＬＣ１３２受容体を発現したＣＨＯ細胞
から調製された膜に結合した。ＯＦＱは、０．１９±
０．０２nMの阻害定数（Ｋi)で、ＬＣ１３２受容体への
〔 125Ｉ〕Ｔｙｒ14−オーファニンの結合を阻害した
（Reinscheidら（1996）, 上記文献）。
ルスコリン刺激によるｃＡＭＰ蓄積の阻害の測定（実施
例１） ＯＦＱが、トランスフェクトしていないＣＨＯ細胞に比
較してＬＣ１３２でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に
おいて、フォルスコリン刺激ｃＡＭＰ蓄積を阻害するこ
とが証明された。ＯＦＱは、１．０５±０．２１nMの５
０％有効濃度（ＥＣ50）で、ＬＣ１３２受容体でトラン
スフェクトしたＣＨＯ細胞におけるフォルスコリン刺激
ｃＡＭＰ蓄積を阻害し、最大効果は、１００nMで約８０
％阻害である。トランスフェクトしていない細胞には効
果がない。その受容体に対するＯＦＱの結合速度論の測
定のために、放射性リガンド〔 125Ｉ〕Ｔｙｒ14−オー
ファニンを製造し性状解析した（Reinscheidら, J. Bio
l. Chem. 271: 14163-14168, 1996 。〔 125Ｉ〕Ｔｙｒ
14−オーファニンは、飽和可能かつ置換可能な様式で、
５６．２±７．３pMのＫd 及びＢmax 約２００fmol/mg
タンパク質で、ＬＣ１３２受容体を発現したＣＨＯ細胞
から調製された膜に結合した。ＯＦＱは、０．１９±
０．０２nMの阻害定数（Ｋi)で、ＬＣ１３２受容体への
〔 125Ｉ〕Ｔｙｒ14−オーファニンの結合を阻害した
（Reinscheidら（1996）, 上記文献）。
【００２６】抗不安作用のオペラント葛藤試験（実施例
２） ＯＦＱ（平均±標準誤差＝２４．６±３．６）が、担体
注射（平均±標準誤差＝３６．３±７．４）に比較して
懲罰されない応答を有意でないが低下させる（極く僅か
な運動障害を示す）ことを証明した。これとは対照的
に、ＯＦＱ（平均±標準誤差＝１６．２±６．０）は、
担体注射（平均±標準誤差＝４．３±１．６）に比較し
て懲罰される応答を有意（Ｐ＜０．０５）に増強した
（抗不安作用を示す）。この結果のパターンは、これら
同じ２群のマウスに経口投与された市販の抗不安化合物
ジアゼパムによって得られるパターンと同様であり、患
者における抗不安薬としてのＯＦＱの可能性を示してい
る。
２） ＯＦＱ（平均±標準誤差＝２４．６±３．６）が、担体
注射（平均±標準誤差＝３６．３±７．４）に比較して
懲罰されない応答を有意でないが低下させる（極く僅か
な運動障害を示す）ことを証明した。これとは対照的
に、ＯＦＱ（平均±標準誤差＝１６．２±６．０）は、
担体注射（平均±標準誤差＝４．３±１．６）に比較し
て懲罰される応答を有意（Ｐ＜０．０５）に増強した
（抗不安作用を示す）。この結果のパターンは、これら
同じ２群のマウスに経口投与された市販の抗不安化合物
ジアゼパムによって得られるパターンと同様であり、患
者における抗不安薬としてのＯＦＱの可能性を示してい
る。
【００２７】抗不安作用の明暗箱タスク（実施例３） ＯＦＱが、担体注射（平均±標準誤差＝１１±５秒）に
比較して、０．３nmol／マウス（平均±標準誤差＝５４
±１４秒）及び１nmol/ マウス（平均±標準誤差＝５８
±１９秒）の用量で、照明した箱での滞在時間を有意
（Ｐ′＜０．０５）に増大させることを証明した。また
ＯＦＱは、担体注射（平均±標準誤差＝３．０±０．
５）に比較して、０．３nmol／マウス（平均±標準誤差
＝１．２±０．６）、１nmol／マウス（平均±標準誤差
＝０．７±０．２）、及び３nmol／マウス（平均±標準
誤差＝０．４±０．３）の用量で、移動試行回数を有意
（Ｐ＜０．０５）に低下させた。この結果のパターン
は、ＯＦＱの抗不安活性を示している。
比較して、０．３nmol／マウス（平均±標準誤差＝５４
±１４秒）及び１nmol/ マウス（平均±標準誤差＝５８
±１９秒）の用量で、照明した箱での滞在時間を有意
（Ｐ′＜０．０５）に増大させることを証明した。また
ＯＦＱは、担体注射（平均±標準誤差＝３．０±０．
５）に比較して、０．３nmol／マウス（平均±標準誤差
＝１．２±０．６）、１nmol／マウス（平均±標準誤差
＝０．７±０．２）、及び３nmol／マウス（平均±標準
誤差＝０．４±０．３）の用量で、移動試行回数を有意
（Ｐ＜０．０５）に低下させた。この結果のパターン
は、ＯＦＱの抗不安活性を示している。
【００２８】抗癲癇／抗痙攣作用の聴原性発作モデル
（実施例４） ＯＦＱが、０．７nmol／マウスのＥＤ50用量で、遺伝的
に音に感受性の高いマウスにおける、聴覚的に誘導され
た強直発作に対する防御作用を示したことを証明した。
この結果は、癲癇及び痙攣の低下におけるＯＦＱの治療
価値を予測させる。
（実施例４） ＯＦＱが、０．７nmol／マウスのＥＤ50用量で、遺伝的
に音に感受性の高いマウスにおける、聴覚的に誘導され
た強直発作に対する防御作用を示したことを証明した。
この結果は、癲癇及び痙攣の低下におけるＯＦＱの治療
価値を予測させる。
【００２９】したがって本発明はまた、上述の方法によ
り得ることのできる化合物、例えば、ＯＦＱ及びその誘
導体、並びに１つ以上のこれらの化合物と治療的に不活
性な担体物質を含む医薬組成物に関する。更に本発明
は、精神医学的及び／又は神経学的障害の治療用の組成
物の製造におけるこれらの化合物の用途、並びに治療的
に有効量のＯＦＱ又はその誘導体を投与することを含む
精神医学的及び／又は神経学的障害の治療方法に関す
る。精神医学的及び／又は神経学的障害の例としては、
癲癇、不安又は痙攣がある。
り得ることのできる化合物、例えば、ＯＦＱ及びその誘
導体、並びに１つ以上のこれらの化合物と治療的に不活
性な担体物質を含む医薬組成物に関する。更に本発明
は、精神医学的及び／又は神経学的障害の治療用の組成
物の製造におけるこれらの化合物の用途、並びに治療的
に有効量のＯＦＱ又はその誘導体を投与することを含む
精神医学的及び／又は神経学的障害の治療方法に関す
る。精神医学的及び／又は神経学的障害の例としては、
癲癇、不安又は痙攣がある。
【００３０】「ＯＦＱ及びその誘導体」という用語は、
ペプチドＦ−Ｇ−Ｇ−Ｆ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｒ−Ｋ−Ｓ−Ａ
−Ｒ−Ｋ−Ｌ−Ａ−Ｎ−Ｑ、その断片及び／又はその非
天然ペプチド若しくは変異体を意味する。これらの種類
の誘導体は、天然ＯＦＱペプチド又はその断片の１つ以
上のアミノ酸が、アゴニスト活性を消失することなくに
置換されるか又は欠失しているペプチドである。このよ
うな誘導体は、ペプチド化学の既知の方法により生成す
ることができた。
ペプチドＦ−Ｇ−Ｇ−Ｆ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｒ−Ｋ−Ｓ−Ａ
−Ｒ−Ｋ−Ｌ−Ａ−Ｎ−Ｑ、その断片及び／又はその非
天然ペプチド若しくは変異体を意味する。これらの種類
の誘導体は、天然ＯＦＱペプチド又はその断片の１つ以
上のアミノ酸が、アゴニスト活性を消失することなくに
置換されるか又は欠失しているペプチドである。このよ
うな誘導体は、ペプチド化学の既知の方法により生成す
ることができた。
【００３１】「ＯＦＱ及びその誘導体」という用語はま
た、当該分野で既知の方法により、残基の側鎖又はＮ−
若しくはＣ−末端基として生じる官能基から調製するこ
とができ、そして薬剤学的に許容しうるものであるかぎ
り（即ち、これらがペプチドのアゴニスト活性を破壊せ
ず、かつこれを含有する組成物に毒性を与えないかぎ
り）、本発明に含まれる誘導体を含む。これらの誘導体
は、例えば、抗原部位をマスクし、及び／又は体液中の
ＯＦＱペプチド誘導体の滞留時間を延長するポリエチレ
ングリコール側鎖を含んでよい。他の誘導体は、カルボ
キシル基の脂肪族エステル、アンモニア又は第１級若し
くは第２級アミンとカルボキシル基との反応によるアミ
ド、アシル残基（例えば、アルカノイル又は炭素環アロ
イル基）により生成するアミノ酸残基の遊離アミノ基の
Ｎ−アシル誘導体、あるいはアシル残基により生成する
遊離ヒドロキシル基（例えば、セリル−又はトレオニル
残基のヒドロキシル基）のＯ−アシル誘導体を含む。
た、当該分野で既知の方法により、残基の側鎖又はＮ−
若しくはＣ−末端基として生じる官能基から調製するこ
とができ、そして薬剤学的に許容しうるものであるかぎ
り（即ち、これらがペプチドのアゴニスト活性を破壊せ
ず、かつこれを含有する組成物に毒性を与えないかぎ
り）、本発明に含まれる誘導体を含む。これらの誘導体
は、例えば、抗原部位をマスクし、及び／又は体液中の
ＯＦＱペプチド誘導体の滞留時間を延長するポリエチレ
ングリコール側鎖を含んでよい。他の誘導体は、カルボ
キシル基の脂肪族エステル、アンモニア又は第１級若し
くは第２級アミンとカルボキシル基との反応によるアミ
ド、アシル残基（例えば、アルカノイル又は炭素環アロ
イル基）により生成するアミノ酸残基の遊離アミノ基の
Ｎ−アシル誘導体、あるいはアシル残基により生成する
遊離ヒドロキシル基（例えば、セリル−又はトレオニル
残基のヒドロキシル基）のＯ−アシル誘導体を含む。
【００３２】「ＯＦＱ及びその誘導体」という用語はま
た、上記誘導体の可溶型を含む。可溶型は、例えば化学
合成により、当該分野で既知の方法により調製すること
ができる。
た、上記誘導体の可溶型を含む。可溶型は、例えば化学
合成により、当該分野で既知の方法により調製すること
ができる。
【００３３】ＯＦＱ及びその誘導体の投与用量の範囲
は、実験によらなくても当該分野の普通の技術者であれ
ば決定することができる。一般に、適切な用量は、目的
の効果を得るのに十分に多い用量である。用量は、望ま
ない交差反応、アナフィラキシー反応などのような有害
な副作用を引き起こすほど多量であってはならない。一
般に、用量は、患者の年齢、症状、性別及び疾患の範
囲、禁忌（もしあれば）、免疫寛容及び他のこのような
変化要素により変動し、個々の医師により調整される。
予想される用量範囲は、約０．１ng/kg/日〜約０．１mg
/kg/日である。ＯＦＱペプチド及びその誘導体は、注射
又は時間をかけて徐々に注入することにより、非経口的
に投与することができる。これらは、静脈内、腹腔内、
筋肉内、又は皮下に投与することができる。
は、実験によらなくても当該分野の普通の技術者であれ
ば決定することができる。一般に、適切な用量は、目的
の効果を得るのに十分に多い用量である。用量は、望ま
ない交差反応、アナフィラキシー反応などのような有害
な副作用を引き起こすほど多量であってはならない。一
般に、用量は、患者の年齢、症状、性別及び疾患の範
囲、禁忌（もしあれば）、免疫寛容及び他のこのような
変化要素により変動し、個々の医師により調整される。
予想される用量範囲は、約０．１ng/kg/日〜約０．１mg
/kg/日である。ＯＦＱペプチド及びその誘導体は、注射
又は時間をかけて徐々に注入することにより、非経口的
に投与することができる。これらは、静脈内、腹腔内、
筋肉内、又は皮下に投与することができる。
【００３４】非経口投与のための製剤は、滅菌した、又
は水性若しくは非水性の液剤、懸濁剤、及び乳剤を含
む。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、
ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、
及びオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステル
がある。水性担体は、食塩水及び緩衝化媒体を含む、
水、アルコール性／水性溶液、乳液又は懸濁液を含む。
非経口投与用担体は、塩化ナトリウム溶液、リンガーの
デキストロース液（Ringer's dextrose)、デキストロー
ス及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、又は不揮発性
油を含む。静脈内投与用担体は、リンガーのデキストロ
ース液などをベースにした担体のような、流体及び栄養
補給液、電解質補給液を含む。例えば、抗菌剤、抗酸化
剤、キレート化剤、不活性ガスなど、保存料及び他の添
加剤も存在してよい。一般には、レミントンの製剤科学
（Remington's Pharmaceutical Science）、第１８版、
Mack編、1990年を参照のこと。
は水性若しくは非水性の液剤、懸濁剤、及び乳剤を含
む。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、
ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、
及びオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステル
がある。水性担体は、食塩水及び緩衝化媒体を含む、
水、アルコール性／水性溶液、乳液又は懸濁液を含む。
非経口投与用担体は、塩化ナトリウム溶液、リンガーの
デキストロース液（Ringer's dextrose)、デキストロー
ス及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、又は不揮発性
油を含む。静脈内投与用担体は、リンガーのデキストロ
ース液などをベースにした担体のような、流体及び栄養
補給液、電解質補給液を含む。例えば、抗菌剤、抗酸化
剤、キレート化剤、不活性ガスなど、保存料及び他の添
加剤も存在してよい。一般には、レミントンの製剤科学
（Remington's Pharmaceutical Science）、第１８版、
Mack編、1990年を参照のこと。
【００３５】本発明はまた、上述の方法により得ること
のできる化合物、及び１つ以上のこれらの化合物と治療
的に不活性な担体物質を含む医薬組成物に関する。
のできる化合物、及び１つ以上のこれらの化合物と治療
的に不活性な担体物質を含む医薬組成物に関する。
【００３６】更に本発明は、精神及び／又は神経障害の
治療、特に上述のように不安、癲癇及び痙攣の治療に有
用な化合物のスクリーニングのためのＬＣ１３２受容体
の用途を含む。
治療、特に上述のように不安、癲癇及び痙攣の治療に有
用な化合物のスクリーニングのためのＬＣ１３２受容体
の用途を含む。
【００３７】
【実施例】以下の実施例の方法に関する記載は、本発明
の詳細を説明するものであるが、これにより本発明を何
ら限定するものではない。
の詳細を説明するものであるが、これにより本発明を何
ら限定するものではない。
【００３８】実施例１の方法：ＬＣ１３２アゴニスト活
性及びフォルスコリン刺激ｃＡＭＰ蓄積の阻害の測定 ｃＡＭＰの濃度の測定のため、ＬＣ１３２受容体でトラ
ンスフェクトしたＣＨＯ細胞又はＣＨＯｄｈｆｒ- （野
生型）細胞を２４ウェルプレートに蒔いて、コンフルエ
ントになるまで増殖させた。培地の除去後、１０mMＨＥ
ＰＥＳ（pH７．４）、１mMフォルスコリン及び１mMＲｏ
２０−１７２４（ＲＢＩから入手可能）を含有するダル
ベッコー改変イーグル培地全容量０．２mlに溶解した試
験化合物又はペプチドを添加して、細胞を３７℃で１０
分間インキュベートした。氷冷エタノール０．５mlの添
加により反応を停止して、プレートを−８０℃で１２時
間凍結した。プレートの遠心分離後、上清部分を取り出
して、ｃＡＭＰ測定のために乾燥した。製造業者の取り
扱い説明書により、ｃＡＭＰアッセイ（Biotrak SPA 、
Amersham）を行った。リガンド結合アッセイは、９６ウ
ェル深底マイクロウェルプレートで行った。安定的にＬ
Ｃ１３２受容体を発現しているＣＨＯ細胞を回収し、５
０mMトリス−ＨＣｌ（pH７．８）、５mMＭｇＣｌ2 、１
mMＥＧＴＡ、０．１％ＢＳＡ、並びにアプロチニン、ロ
イペプチン及びペプスタチン各０．１mg/ml を含有する
結合緩衝液１０倍容量に再懸濁した。組織ホモジナイザ
ー（設定４で３０秒間；ＰＴ２０、Kinematica、ルツェ
ルン、スイス）を使用して膜を調製した。全膜粒子は、
４５，０００×ｇで、４℃で１０分間遠心分離した後に
得た。得られたペレットを、上述のように再懸濁及び２
回遠心分離した。最後に膜を、結合緩衝液適量に希釈し
て、−７０℃で保存した。ＢＣＡタンパク質アッセイキ
ット（Pierce）を使用してタンパク質濃度を測定した。
〔 125Ｉ〕Ｔｙｒ14−オーファニンと膜（１０〜１８μ
g タンパク質）とのインキュベーションは、室温で１時
間、結合緩衝液全容量２００μl 中で行った。競合結合
実験のため、５０，０００cpm の〔 125Ｉ〕Ｔｙｒ14
オーファニン（６２．５pM）を指示濃度の未標識ペプチ
ドと一緒に添加した。５０nMＯＦＱの存在下で非特異結
合を測定した。結合したリガンド及び遊離リガンドを、
Brandel マルチチャネルハーベスターを使用して、What
man ＧＦ／Ｃフィルターで迅速な真空濾過により分離し
た。ＧＦ／Ｃフィルターは、０．１％ＢＳＡを含有する
０．３％ポリエチレンイミンで室温で１時間、前処理し
ておいた。氷冷５０mMトリス−ＨＣｌ（pH７．５）１ml
でフィルターを６回洗浄し、次にガンマカウンターで計
測した。
性及びフォルスコリン刺激ｃＡＭＰ蓄積の阻害の測定 ｃＡＭＰの濃度の測定のため、ＬＣ１３２受容体でトラ
ンスフェクトしたＣＨＯ細胞又はＣＨＯｄｈｆｒ- （野
生型）細胞を２４ウェルプレートに蒔いて、コンフルエ
ントになるまで増殖させた。培地の除去後、１０mMＨＥ
ＰＥＳ（pH７．４）、１mMフォルスコリン及び１mMＲｏ
２０−１７２４（ＲＢＩから入手可能）を含有するダル
ベッコー改変イーグル培地全容量０．２mlに溶解した試
験化合物又はペプチドを添加して、細胞を３７℃で１０
分間インキュベートした。氷冷エタノール０．５mlの添
加により反応を停止して、プレートを−８０℃で１２時
間凍結した。プレートの遠心分離後、上清部分を取り出
して、ｃＡＭＰ測定のために乾燥した。製造業者の取り
扱い説明書により、ｃＡＭＰアッセイ（Biotrak SPA 、
Amersham）を行った。リガンド結合アッセイは、９６ウ
ェル深底マイクロウェルプレートで行った。安定的にＬ
Ｃ１３２受容体を発現しているＣＨＯ細胞を回収し、５
０mMトリス−ＨＣｌ（pH７．８）、５mMＭｇＣｌ2 、１
mMＥＧＴＡ、０．１％ＢＳＡ、並びにアプロチニン、ロ
イペプチン及びペプスタチン各０．１mg/ml を含有する
結合緩衝液１０倍容量に再懸濁した。組織ホモジナイザ
ー（設定４で３０秒間；ＰＴ２０、Kinematica、ルツェ
ルン、スイス）を使用して膜を調製した。全膜粒子は、
４５，０００×ｇで、４℃で１０分間遠心分離した後に
得た。得られたペレットを、上述のように再懸濁及び２
回遠心分離した。最後に膜を、結合緩衝液適量に希釈し
て、−７０℃で保存した。ＢＣＡタンパク質アッセイキ
ット（Pierce）を使用してタンパク質濃度を測定した。
〔 125Ｉ〕Ｔｙｒ14−オーファニンと膜（１０〜１８μ
g タンパク質）とのインキュベーションは、室温で１時
間、結合緩衝液全容量２００μl 中で行った。競合結合
実験のため、５０，０００cpm の〔 125Ｉ〕Ｔｙｒ14
オーファニン（６２．５pM）を指示濃度の未標識ペプチ
ドと一緒に添加した。５０nMＯＦＱの存在下で非特異結
合を測定した。結合したリガンド及び遊離リガンドを、
Brandel マルチチャネルハーベスターを使用して、What
man ＧＦ／Ｃフィルターで迅速な真空濾過により分離し
た。ＧＦ／Ｃフィルターは、０．１％ＢＳＡを含有する
０．３％ポリエチレンイミンで室温で１時間、前処理し
ておいた。氷冷５０mMトリス−ＨＣｌ（pH７．５）１ml
でフィルターを６回洗浄し、次にガンマカウンターで計
測した。
【００３９】実施例２の方法：抗不安作用のオペラント
葛藤試験 メスのアルビノマウス（Ｉｂｍ：MORO (SPF)；Biologic
al Research Labs、Fuellinsdorf、スイス）を使用し
た。本実験の開始時点で、これらのマウスは少なくとも
２〜３ケ月齢であり、前もってオペラント葛藤タスクで
十分に訓練しておいた。マウスは、おがくず床のあるMa
crolon（登録商標）型のプラスチックケージ（約１３×
２３×１３cm）で個別に飼育した。自然な明暗サイクル
で維持した動物飼育区画で室温及び湿度を調節した。水
道水は自由に摂取させたが、一方標準的実験室用餌の摂
餌は制限した。マウスの体重を、自由に摂餌させた場合
の体重の約８０〜８５％に維持した。訓練及び試験方法
は、Martinら（Pharmacol. Biochem. Behav. 46: 905-9
10, 1993）の方法によった：食餌欠乏マウスを、最初の
５分間はレバーを押すたびに食物の報償を自動的に与え
（懲罰されない応答）、次の１５分間はレバーを押すた
びに食物の報償は与えたが、これに伴い穏やかな足への
ショックも与える（懲罰される応答）タスクで十分に訓
練した。文献と矛盾なく、試験３０分前のジアゼパム１
０mg/kg の経口投与により、これらのマウスの懲罰され
ない応答はある程度減少するが、懲罰されるレバー押し
は増加した。２つの群（Ｎ＝９）を形成した。脳室内注
射の容量は２μl とした。担体は、人工脳脊髄液とし
た。ＯＦＱ（Research Genetics, Inc. 、ハンツヴィ
ル、アラバマ州）を３nmol／マウスの用量で与えた。懲
罰されない部分（即ち、葛藤試験の最初の５分間）及び
懲罰される部分（即ち、次の１５分間の、レバー押しが
食物とこれに伴うショックをもたらす葛藤試験）の両方
の葛藤試験を評価した。行動の評価を行う実験者は、個
々のマウスに関する処理条件を知らなかった（知らされ
なかった）。統計解析は、統計的に有意として許容しう
る０．０５未満のｐ値で、マン−ホイットニーのＵ検定
（Mann-Whitney U test)を用いて２つの処理群を比較し
て行った。
葛藤試験 メスのアルビノマウス（Ｉｂｍ：MORO (SPF)；Biologic
al Research Labs、Fuellinsdorf、スイス）を使用し
た。本実験の開始時点で、これらのマウスは少なくとも
２〜３ケ月齢であり、前もってオペラント葛藤タスクで
十分に訓練しておいた。マウスは、おがくず床のあるMa
crolon（登録商標）型のプラスチックケージ（約１３×
２３×１３cm）で個別に飼育した。自然な明暗サイクル
で維持した動物飼育区画で室温及び湿度を調節した。水
道水は自由に摂取させたが、一方標準的実験室用餌の摂
餌は制限した。マウスの体重を、自由に摂餌させた場合
の体重の約８０〜８５％に維持した。訓練及び試験方法
は、Martinら（Pharmacol. Biochem. Behav. 46: 905-9
10, 1993）の方法によった：食餌欠乏マウスを、最初の
５分間はレバーを押すたびに食物の報償を自動的に与え
（懲罰されない応答）、次の１５分間はレバーを押すた
びに食物の報償は与えたが、これに伴い穏やかな足への
ショックも与える（懲罰される応答）タスクで十分に訓
練した。文献と矛盾なく、試験３０分前のジアゼパム１
０mg/kg の経口投与により、これらのマウスの懲罰され
ない応答はある程度減少するが、懲罰されるレバー押し
は増加した。２つの群（Ｎ＝９）を形成した。脳室内注
射の容量は２μl とした。担体は、人工脳脊髄液とし
た。ＯＦＱ（Research Genetics, Inc. 、ハンツヴィ
ル、アラバマ州）を３nmol／マウスの用量で与えた。懲
罰されない部分（即ち、葛藤試験の最初の５分間）及び
懲罰される部分（即ち、次の１５分間の、レバー押しが
食物とこれに伴うショックをもたらす葛藤試験）の両方
の葛藤試験を評価した。行動の評価を行う実験者は、個
々のマウスに関する処理条件を知らなかった（知らされ
なかった）。統計解析は、統計的に有意として許容しう
る０．０５未満のｐ値で、マン−ホイットニーのＵ検定
（Mann-Whitney U test)を用いて２つの処理群を比較し
て行った。
【００４０】実施例３の方法：抗不安作用の明暗箱タス
ク オスのアルビノマウス〔Ｉｂｍ：MORO (SPF)；Biologic
al Research Labs、Fuellingsdorf 4414、スイス）を使
用した。マウスは、試験前の数日間、実験室区画にある
おがくず床のあるグループケージで飼った。室温及び湿
度を調節し、動物飼育区画は逆転した明暗サイクルを維
持した。水道水及び標準的実験室用餌は自由に摂取させ
た。明暗箱タスクにおける探査活動は、未経験のマウス
で測定した。装置は、不透明プラスチックトンネル（５
×７×１０cm）で連結された同じサイズ（２０×２０×
１４cm）の、１つは不透明で、もう１つは透明なプレキ
シガラス（登録商標）の箱で構成した。透明な方の箱は
照明しておいた（この箱の中央部で４，４００ルク
ス）。脳室内注射の５分後、マウスを暗い方の箱に向け
てトンネルに入れた。照明した箱での滞在時間、移動試
行回数（頭と前足のみが光を当てた箱に入った）、及び
不透明な箱から透明な箱への移動を完結した回数を５分
のセッションで記録した。４つの足蹠全てが次の区画に
入ったときに、マウスは区画を変更したと判定した。床
は各試験後、完全に掃除した。各処理群には１０〜２０
匹のマウスを含めた。脳室内注射の容量は２μl とし
た。ＯＦＱ（Research Genetics, Inc. 、ハンツヴィ
ル、アラバマ州）を３、１、０．３及び０．１nmol／マ
ウスの用量で与えた。担体として人口脳脊髄液を使用し
た。行動の評価を行う実験者は、個々のマウスに関する
処理条件を知らなかった（知らされなかった）。処理群
間の差は、統計的に有意として許容しうるｐ値≦０．０
５でスチューデントｔ検定（Student's t-test）により
評価した。
ク オスのアルビノマウス〔Ｉｂｍ：MORO (SPF)；Biologic
al Research Labs、Fuellingsdorf 4414、スイス）を使
用した。マウスは、試験前の数日間、実験室区画にある
おがくず床のあるグループケージで飼った。室温及び湿
度を調節し、動物飼育区画は逆転した明暗サイクルを維
持した。水道水及び標準的実験室用餌は自由に摂取させ
た。明暗箱タスクにおける探査活動は、未経験のマウス
で測定した。装置は、不透明プラスチックトンネル（５
×７×１０cm）で連結された同じサイズ（２０×２０×
１４cm）の、１つは不透明で、もう１つは透明なプレキ
シガラス（登録商標）の箱で構成した。透明な方の箱は
照明しておいた（この箱の中央部で４，４００ルク
ス）。脳室内注射の５分後、マウスを暗い方の箱に向け
てトンネルに入れた。照明した箱での滞在時間、移動試
行回数（頭と前足のみが光を当てた箱に入った）、及び
不透明な箱から透明な箱への移動を完結した回数を５分
のセッションで記録した。４つの足蹠全てが次の区画に
入ったときに、マウスは区画を変更したと判定した。床
は各試験後、完全に掃除した。各処理群には１０〜２０
匹のマウスを含めた。脳室内注射の容量は２μl とし
た。ＯＦＱ（Research Genetics, Inc. 、ハンツヴィ
ル、アラバマ州）を３、１、０．３及び０．１nmol／マ
ウスの用量で与えた。担体として人口脳脊髄液を使用し
た。行動の評価を行う実験者は、個々のマウスに関する
処理条件を知らなかった（知らされなかった）。処理群
間の差は、統計的に有意として許容しうるｐ値≦０．０
５でスチューデントｔ検定（Student's t-test）により
評価した。
【００４１】実施例４の方法：抗癲癇／抗痙攣作用の聴
原性発作モデル 若いマウス〔ＤＢＡ／２Ｊ (SPF)；Biological Researc
h Labs、Fuellinsdorf4414 、スイス）を使用した。マ
ウスは、試験前に実験室区画にあるおがくず床のあるグ
ループケージで飼った。室温及び湿度を調節し、動物飼
育区画は自然な明暗サイクルで維持した。水道水及び標
準的実験室用餌は自由に摂取させた。聴原性発作からの
防御は、未経験の３週齢のＤＢＡ／２Ｊマウス（遺伝的
に発作を起こしやすいことが知られている）で調査し
た。更なる実験の詳細は他に記載されている（Martin
ら, Psychopharmacology 111: 415-422, 1993)。要約す
れば、脳室内注射の直後に、各マウスを、おがくず床を
含む別々の蓋のない透明プレキシガラスの箱（２１×４
４×２１cm）に入れた。試験は、音で隔離されたチャン
バーで行い、１４KHz のシヌソイドの音に１分間１１０
dB（０dBは、２０μPaの圧力レベルとして定義した）で
暴露し、この間観察を行った。聴覚刺激は、処理５分後
に与えた。８匹のマウスの群を使用して、各用量及び担
体条件を評価した。脳室内注射の容量は、２μl とし
た。ＯＦＱ（Research Genetics, Inc. 、ハンツヴィ
ル、アラバマ州）を１０、３、１、０．１及び０．０１
nmol／マウスの用量で与えた。担体として人口脳脊髄液
を使用した。行動の評価を行う実験者は、個々のマウス
に関する処理条件を知らなかった（知らされなかっ
た）。強直痙攣を示さなかった群の割合を記録した。プ
ロビット解析によりＥＤ50値を計算した。
原性発作モデル 若いマウス〔ＤＢＡ／２Ｊ (SPF)；Biological Researc
h Labs、Fuellinsdorf4414 、スイス）を使用した。マ
ウスは、試験前に実験室区画にあるおがくず床のあるグ
ループケージで飼った。室温及び湿度を調節し、動物飼
育区画は自然な明暗サイクルで維持した。水道水及び標
準的実験室用餌は自由に摂取させた。聴原性発作からの
防御は、未経験の３週齢のＤＢＡ／２Ｊマウス（遺伝的
に発作を起こしやすいことが知られている）で調査し
た。更なる実験の詳細は他に記載されている（Martin
ら, Psychopharmacology 111: 415-422, 1993)。要約す
れば、脳室内注射の直後に、各マウスを、おがくず床を
含む別々の蓋のない透明プレキシガラスの箱（２１×４
４×２１cm）に入れた。試験は、音で隔離されたチャン
バーで行い、１４KHz のシヌソイドの音に１分間１１０
dB（０dBは、２０μPaの圧力レベルとして定義した）で
暴露し、この間観察を行った。聴覚刺激は、処理５分後
に与えた。８匹のマウスの群を使用して、各用量及び担
体条件を評価した。脳室内注射の容量は、２μl とし
た。ＯＦＱ（Research Genetics, Inc. 、ハンツヴィ
ル、アラバマ州）を１０、３、１、０．１及び０．０１
nmol／マウスの用量で与えた。担体として人口脳脊髄液
を使用した。行動の評価を行う実験者は、個々のマウス
に関する処理条件を知らなかった（知らされなかっ
た）。強直痙攣を示さなかった群の割合を記録した。プ
ロビット解析によりＥＤ50値を計算した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＪ (72)発明者 ジェイムズ・リチャード・マーチン スイス国、ツェーハー−4106 テルヴィ ル、シュルガッセ 14 (72)発明者 フレデリック・モンスマ スイス国、ツェーハー−4125 リーヘン、 ヘーエンシュトラーセ 45 (72)発明者 ジャン−リュック・モロー フランス国、エフ−68170 リックスハイ ム、リュ・デュ・ドクトゥール・アルバー ト・シュヴァイツァー、50 (72)発明者 ハンス−ペーター・ノートハッカー ドイツ連邦共和国、デー−79418 シュリ ンゲン、イン・デン・ホフマッテン ５ベ ー (72)発明者 ライナー・ラインシャイド ドイツ連邦共和国、デー−79100 フライ ブルク、アトミラール−シュペ−シュトラ ーセ ３
Claims (13)
- 【請求項１】 精神医学的及び／又は神経学的障害に関
するスクリーニングアッセイにおいてＬＣ１３２受容体
アゴニストを試験することを特徴とする、治療的に有用
な化合物のスクリーニング方法。 - 【請求項２】 所定の化合物のＬＣ１３２受容体アゴニ
スト活性の測定が、ＬＣ１３２受容体機能のアゴニスト
であることが推測される化合物とＬＣ１３２受容体を接
触させて、次に所定の化合物の、受容体への結合及び／
又はアゴニスト活性を検出することを特徴とする、請求
項１記載の方法。 - 【請求項３】 （ａ）ＬＣ１３２受容体を含有する細胞
膜を調製し； （ｂ）ＬＣ１３２受容体アゴニストであることが推測さ
れる化合物とこの膜を接触させて；そして （ｃ）この化合物が、ＬＣ１３２受容体に結合して、ア
ゴニストに特有な活性を発揮するかどうかを測定するこ
とを特徴とする、請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 アゴニストに特有な活性が、フォルスコ
リン刺激ｃＡＭＰ蓄積の阻害の検出により測定される、
請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 アゴニストが、ＬＣ１３２受容体に対す
る高い親和性を有するリガンドである、請求項１記載の
方法。 - 【請求項６】 ＬＣ１３２受容体アゴニストが、１μM
未満のＩＣ50値により特徴づけられる、請求項５記載の
方法。 - 【請求項７】 精神医学的及び／又は神経学的障害に関
するスクリーニングアッセイが、抗癲癇、抗痙攣又は抗
不安スクリーニングアッセイである、請求項１〜６のい
ずれか１項記載の方法。 - 【請求項８】 該精神医学的及び／又は神経学的障害の
スクリーニングアッセイが、オペラント葛藤試験、明暗
箱タスク又は聴原性発作モデルである、請求項１〜６の
いずれか１項記載の方法。 - 【請求項９】 精神医学的及び／又は神経学的障害の治
療に有用な化合物のスクリーニングのための、請求項１
〜８のいずれか１項記載の方法の用途。 - 【請求項１０】 オーファニンＦＱ又はその誘導体を含
有する精神医学的及び／又は神経学的障害の治療用医
薬。 - 【請求項１１】 障害が、癲癇、不安、及び痙攣であ
る、請求項１０記載の医薬。 - 【請求項１２】 精神医学的及び／又は神経学的障害の
治療に有用な化合物のスクリーニングのためにＬＣ１３
２受容体タンパク質を使用する方法。 - 【請求項１３】 治療的に許容しうる担体とオーファニ
ンＦＱ又はその誘導体を含むことを特徴とする、医薬組
成物。
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