JPH1072365A - 医薬製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】物質として安定で、毒性も低く、発熱性等の副
作用が少なく、優れた腫瘍細胞増殖抑制活性等を有する
医薬製剤を提供。 【解決手段】 天然型ＩＬ−１αのアミノ酸配列の３６
位Asn又はこれと１４１位Cysとを他のアミノ酸に置換し
た改変アミノ酸配列のＩＬ−１α誘導体を有効成分とし
て医薬製剤担体と共に含有する医薬製剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、インターロイキン
１α（ＩＬ−１α）誘導体を有効成分とする医薬製剤に
関する。

【０００２】

【従来の技術】第２回国際リンホカインワークショップ
において、かってリンパ球活性化因子（Lymphocyte Act
ivating Factor；ＬＡＦ）、マイトジェニック プロテ
イン（MitogenicProtein）、ヘルパーピーク−１（Help
er peak-1 ）、Ｔリンパ球代替因子〔T-cell replacing
factor III （ＴＲＦ−III ）、T-cell replacing fac
tor Ｍφ（ＴＲＦм）〕、Ｂセルアクチベーティング
ファクター（B-cell activating factor）、Ｂリンパ球
分化因子（B-cell differentiation factor ）等の呼称
で報告されてきた生理活性物質は、いずれもインターロ
イキン−１（ＩＬ−１）なる呼称に統一されることが決
定された〔Cellular Immunol.,４８，４３３−４３６
（１９７９）〕。この決定は、上記各生理活性物質は物
質として区別できず生理活性を異なる角度から把えて表
現しているにすぎないとの理由に基づいている。

【０００３】上記ＩＬ−１は、更に例えばＴリンパ球や
Ｂリンパ球を活性化し、インターロイキン２の産生亢進
作用や抗体産生を亢進させる作用を有し、また肝細胞に
作用して蛋白質合成を亢進させる作用、プロスタグラン
ディン産生を亢進させる作用等を有することも報告され
ている〔Reviews of Infectious Disease, Vol. ６，N
o. １，５１−５９（１９８４）、New England J. of M
ed., ３１１，１４１３（１９８４）等参照〕。

【０００４】しかして、物質としてのＩＬ−１の本体に
関しては現在尚不明ではあるが、最近になってＬＡＦ活
性を有するポリペプチドもしくはその前駆体をコードす
る遺伝子の存在がようやく報告された〔Proc.Natl.Aca
d.Sci.,Vol.８１，７９０７−７９１１（１９８４）、N
ature，Vol.３１５，６４１（１９８５）、Nucleic Aci
d Research, Vol. １３，（１６），５８６９（１９８
５）〕。

【０００５】上記によれば、遺伝子組換え技術に従って
得られた培養上清のＬＡＦ活性の確認より、配列番号：
１で表わされるポリペプチドをＬＡＦ活性を有するポリ
ペプチドであると推定し、これを「ＩＬ−１α」と称し
ている。

【０００６】しかしながら、上記活性物質は勿論のこ
と、従来より所謂ＩＬ−１として報告されている生理活
性物質についても、之等が均質な物質として製造単離さ
れた報告例はなく、勿論かかる均質な物質の有する生理
活性についての報告も皆無である。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、従来よ
り、均質な物質としてのＩＬ−１αにつき鋭意研究を重
ねた結果、既にその製造技術を確立すると共にその物質
としての特性、その有する生理活性等をも明らかにし
た。この研究結果に伴い、本発明者らはまた配列番号：
１で表わされるポリペプチドがＬＡＦ活性を有する事実
をも確認した。しかしながら、該ポリペプチドは、前記
報告の通り、生体の遺伝子に対応するものであるにも拘
わらず、驚くべきことに、物質としては不安定であるこ
とを見出した。

【０００８】本発明者らは引続く鋭意検討の結果、配列
番号：１で表わされるポリペプチドとは、そのアミノ酸
配列を異にする新しいポリペプチド（ＩＬ−１α誘導
体）が、物質としてより安定で、しかも医薬用途に好適
な特性を有することを新たに見出し、ここに本発明を完
成するに至った。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列の３６位Ａsnを他のア
ミノ酸に置換した改変されたアミノ酸配列を有するＩＬ
−１α誘導体及び同アミノ酸配列の３６位Asn及び１４
１位Ｃysをそれぞれ他のアミノ酸に置換した改変された
アミノ酸配列を有するＩＬ−１α誘導体から選択される
少なくとも１種を有効成分として、医薬製剤担体と共に
含有し且つ配列番号：１のアミノ酸配列のＩＬ−１αは
実質的に含有しないことを特徴とする医薬製剤が提供さ
れる。

【００１０】上記及び以下の本明細書におけるアミノ酸
及びポリペプチドの表示は、ＩＵＰＡＣ及びＩＵＰＡＣ
−ＩＵＢによる命名法又は規則における略号乃至当該分
野で慣用されている略号によるアミノ酸残基の表示法に
従うものとし、塩基配列における核酸の表示も同様とす
る。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下、本発明に有効成分として用
いる新しいＩＬ−１α誘導体（以下これを「本発明ポリ
ペプチド」という）及びその製法につき詳述する。

【００１２】本発明ポリペプチドは、例えばＬＡＦ活
性、腫瘍細胞増殖抑制活性、即ち腫瘍細胞に対して特異
的にその増殖を抑制する活性、ＣＳＦ（Colony stimula
ting factor ；コロニー刺激因子）、インターフエロン
（ＩＦＮ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、イン
ターロイキン−３（ＩＬ−３）等の種々のサイトカイン
類産生促進活性、即ち例えばヒト細胞に作用してそれら
サイトカイン類の産生を著しく促進させる活性、抗炎症
活性、特に例えば関節炎モデル動物に投与することによ
り関節炎の進行を効果的に抑制する活性、放射線障害防
止作用、即ち骨髄移植時の放射線全身照射、癌治療等に
おける放射線照射、放射線事故時等における生体障害乃
至は重篤な副作用等を予防する作用乃至防止する作用等
を有する。

【００１３】従ってこれは例えば抗体産生促進やワクチ
ンの効果増強等の免疫系刺激剤、抗腫瘍剤、ＣＳＦ、Ｉ
Ｌ−２、ＩＬ−３等のサイトカイン産生促進剤、抗炎症
剤、放射線障害防止剤等の医薬品として有用である。殊
に本発明ポリペプチドは、物質として極めて安定である
特徴を有し、しかも毒性も低く、之等の点でも上記医薬
品として好適である。また、ＩＬ−１は発熱性を有する
ことが知られているが、本発明ポリペプチドは、かかる
副作用がより少ない点においても優れている。

【００１４】本発明ポリペプチドは、例えばこれをＣＳ
Ｆ産生促進剤として、ヒトに投与するときには、ウイル
ス感染や抗原抗体反応等の危険性を生じることなく、癌
化学療法や放射線療法後の骨髄低形成による顆粒球減少
を有効に回復できる（顆粒球減少治療薬）。また本発明
ポリペプチドを利用した上記ＣＳＦ産生促進剤は、その
本来のＣＳＦ産生促進作用により、ＣＳＦの作用に基づ
く各種疾病の予防及び治療剤としても有効に利用でき
る。例えば、ＣＳＦは顆粒球やマクロフアージの機能を
促進させる作用がある〔ロペッツら（Ｌｏｐｅｚ，
Ａ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．）， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，
１３１，２９８３（１９８３）、ハンダムら（Ｈａｎｄ
ａｍ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．）， 同１２２，１１３４
（１９７９）及びバダスら（Vadas, M.A. et al.),同１
３０，７９５（１９８３）〕ので、種々の感染症の予防
及び治療薬として臨床応用が期待されており、上記ＣＳ
Ｆ産生促進剤も同様に臨床応用が期待できる。

【００１５】殊に、近年生体防御能が低下乃至障害され
た個体（compromised host）に、それまで無害であった
病原体が病原性を発揮して惹起される、いわゆる日和見
感染症（opportunistic infection 或いはterminal inf
ection）は、臨床的に問題となる病原体（起炎菌）が、
シュードモナス（Pseudomonas ）、セラティア（Serrat
ia）等のグラム陰性桿菌、ヘルペス（Herpes simplex,
ＨＳＶ）、バリセラ−ゾースタ（Varicella- zoster,Ｖ
ＺＶ）、サイトメガロウイルス（Cytomegalovirus,ＣＭ
Ｖ）等のウイルス、キャンディダ（Candida albican
s）、アスペルギルス（Aspergillus fumigatus ）、ノ
カルディア（Nocardia asteroidea ）等の真菌、カリニ
原虫（Pneumocystis carinii）、トキソプラズマ（Toxo
plasma gondii ）等の原虫等であり、現用の抗生物質
は、之等の病原菌に対して充分な効果を奏し難く、該日
和見感染症に対する新しい薬剤の研究開発が切望されて
いる。本発明ポリペプチドは、かかる日和見感染症の予
防及び治療剤としても有効であり、特にかかる日和見感
染症が高頻度に見られる抗癌剤投与時、即ち急性白血病
の化学療法や骨髄移植時等における各種の感染症、例え
ばガンジダ症、クリプトコックス症、アスペルギルス
症、接合菌症、黒色真菌感染症、ウイルス感染症、サイ
トメガロウイルス肺炎、之等の合併症等の予防及び治療
剤として有用なものである。

【００１６】また本発明ポリペプチドを有効成分とする
抗炎症剤は、関節炎等の予防及び治療剤として有効であ
る。

【００１７】更に、本発明ポリペプチドは、後記実施例
に記載した方法により測定される腫瘍細胞増殖抑制活性
（以下これを「ＧＩＦ活性」という）を有しており、種
々の腫瘍細胞に対して特異的にそれらの増殖を抑制する
作用を発揮する。従って、これを有効成分とする抗腫瘍
剤は、癌の化学療法剤として、特に各種抗悪性腫瘍剤と
の併用による寛解強化療法、寛解維持療法に有利に用い
られる。

【００１８】本発明ポリペプチドは、上記医薬用途以外
に、そのサイトカイン産生促進活性に基づいて、例えば
細胞株からの各種有用サイトカインのインビトロ（in v
itro）製造に際して極めて有効に使用し得る。かかる細
胞株からの天然型サイトカインの製造は、殊に糖蛋白質
であるサイトカインにおいて着目されており、効率的に
かつ大量に有用サイトカインを収得することができる。

【００１９】本発明のＩＬ−１α誘導体において、前記
式（Ａ）で表わされるＩＬ−１αの３６位Asn（又はこ
れと１４１位Cysと）の置換を行ない得る他のアミノ酸
は、人体蛋白質を構成するα−アミノ酸であればいずれ
でもよいが、CysはそのＳＨ基に基づいて分子間結合を
形成することがあることを考慮して、Cys以外であるの
が好ましい。特に好ましいものとしては、例えば、３６
位Asnの場合はAspを、１４１位Cysの場合はSerをそれぞ
れ例示することができる。

【００２０】本発明ポリペプチドは、例えば遺伝子工学
的手法により製造することができる。即ち、前記本発明
に係る特定のポリペプチドをコードする遺伝子を利用
し、これを微生物のベクターに組込んで該微生物細胞内
で複製、転写、翻訳させることにより製造できる。この
方法は、特に大量生産が可能である点より有利である。

【００２１】上記方法において用いられる遺伝子は、通
常の方法、例えばホスファイト トリエステル法〔ネイ
チヤー(Nature), ３１ ０，１０５（１９８４）〕等の常
法に従って、核酸の化学合成により全合成することもで
きるが、ＩＬ−１αもしくはその前駆体をコードする遺
伝子を利用するのが簡便であり、該遺伝子より、上記化
学合成手段を含む常法に従って、前記特定のアミノ酸配
列をコードする核酸配列に改変することにより容易に製
造できる。

【００２２】ＩＬ−１α又はその前駆体をコードする遺
伝子は、公知（記述）であり、本発明者らも該遺伝子を
得、これを用いて遺伝子工学的手法でＩＬ−１αを収得
した。之等の一連の方法は後記参考例において明らかに
する。

【００２３】上記遺伝子の改変操作は目的とするポリペ
プチドのアミノ酸配列に応じて公知方法に従い実施され
得る（遺伝子工学的手法としては、例えば、Molecular
Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory（１９８２）
が参照される）。例えば、ＤＮＡの切断、結合、リン酸
化等を目的とする、制限酵素、ＤＮＡリガーゼ、ポリヌ
クレオチドキナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ等の各種酵素
処理等の常套手段が採用でき、それらの酵素は市販品と
して容易に入手できる。之等各操作における遺伝子乃至
核酸の単離、精製も常法、例えばアガロース電気泳動法
等に従えばよい。また得られる遺伝子の複製は、一部後
述するように通常のベクターを利用する方法に従えばよ
い。また所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片や
合成リンカーは、上記した化学合成により容易に製造で
きる。

【００２４】尚、上記において所望のアミノ酸に対応す
るコドン自体は公知であり、またその選択は任意でよ
く、例えば利用する宿主のコドン使用頻度等を考慮した
常法に従えばよい〔Nucl.Acids.Res.,９、４３−７４
（１９８１）〕。またこれらの核酸配列のコドンを一部
改変する操作には、例えば常法どおり、１５〜３０マー
程度の所望の改変をコードする合成ヌクレオチドからな
るプライマーを用いたサイト−スペシフィック ミユー
タジェネシス（Site-Specific Mutagenesis ）〔Proc.N
atl.Aad.Sci., ８１，５６６２−５６６６（１９８
４）〕等の方法を採用することができる。

【００２５】上記した方法により得られる所望の遺伝子
は、例えばマキサム−ギルバートの化学修飾法〔Maxam-
Gilbert, Meth.Enzym., ６５，４９９−５６０（１９８
０）〕やＭ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチ
ド鎖終結法〔Messing, J．and Vieira, J., Gene, １
９，２６９−２７６（１９８２）〕等により、その塩基
配列の決定及び確認を行なうことができる。

【００２６】上記操作及び方法の具体例は、後記参考例
及び実施例に記述するが、該方法は特に限定されず、当
業界において周知の各種方法によることができる。

【００２７】かくして、本発明によれば前記した特定の
アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする新規な
遺伝子も提供される（以下この遺伝子を「本発明遺伝
子」という）。

【００２８】本発明ポリペプチドは、上記特定の遺伝子
（本発明遺伝子）を利用し、従来公知の一般的な遺伝子
組換え技術に従い製造できる。より詳細には、上記本発
明遺伝子が宿主細胞中で発現できるような組換えＤＮＡ
を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形
質転換体を培養すればよい。

【００２９】ここで宿主細胞としては、真核生物及び原
核生物のいずれも用いることができる。該真核生物の細
胞には脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞
としては、例えばサルの細胞であるCos細胞〔Y.Gluzma
n, Cell, ２３，１７５−１８２（１９８１）〕やチャ
イニーズ・ハムスター卵巣細胞のジヒドロ葉酸レダクタ
ーゼ欠損株〔G.Urlaub and L.A.Chasin, Proc.Natl.Aca
d.Sci.,USA, ７７，４２１６−４２２０（１９８０）〕
等がよく用いられているが、之等に限定される訳ではな
い。脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現し
ようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮ
Ａのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了
配列等を保有するものを使用でき、これは更に必要によ
り複製起源を保有していてもよい。該発現ベクターの例
としてはＳＶ４０の初期プロモーターを保有するｐＳＶ
２dhfr〔S.Subramani, R.Mulligan and P.Berg, Mol.Ce
ll.Biol., １（９），８５４−８６４〕等を例示できる
が、これに限定されない。

【００３０】また真核微生物としては酵母が一般によく
用いられており、その中でもサッカロミセス属酵母が有
利に利用できる。該酵母等の真核微生物の発現ベクター
としては、例えば酸性ホスファターゼ遺伝子に対するプ
ロモーターを持つｐＡＭ８２〔A.Miyanohara et al., P
roc.Natl.Acad.Sci.,USA, ８０，１−５（１９８３）〕
等を好ましく利用できる。

【００３１】原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌
が一般によく用いられている。本発明では例えば該宿主
菌中で複製可能なプラスミドベクターを用い、このベク
ター中に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上
流にプロモーター及びＳＤ（シャイン・アンド・ダルガ
ーノ）塩基配列、更に蛋白合成開始に必要なＡＴＧを付
与した発現プラスミドが使用できる。上記宿主菌として
の大腸菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia
coli）Ｋ１２株等がよく用いられ、ベクターとしては一
般にｐＢＲ３２２がよく用いられるが、これに限定され
ず、公知の各種の菌株及びベクターがいずれも利用でき
る。プロモーターとしては、例えばトリプトファン・プ
ロモーター、Ｐ_Lプロモーター、lac プロモーター、lpp
プロモーター等を使用することができ、いずれの場合
にも本発明遺伝子を発現させることができる。

【００３２】トリプトファン・プロモーターを用いる場
合を例にとり詳述すれば、発現ベクターとしてトリプト
ファン・プロモーター及びＳＤ配列を持つベクターp Ｔ
Ｍ１〔今本文男、代謝、Ｖol. ２２，２８９（１９８
５）〕を使用し、ＳＤ配列の下流に存在する制限酵素Cl
a I部位に、必要に応じてＡＴＧを付与した所望のポリ
ペプチドをコードする遺伝子を連結させればよい。

【００３３】尚、直接発現系に限らず、例えばβ−ガラ
クトシダーゼやβ−ラクタマーゼ等を利用する融合蛋白
質発現系によることもできる。

【００３４】かくして得られる発現ベクターの宿主細胞
への導入及びこれによる形質転換の方法としては、一般
に用いられている方法、例えば主として対数増殖期にあ
る細胞を集め、ＣａＣｌ₂ 処理して自然にＤＮＡを取り
込みやすい状態にして、ベクターを取込ませる方法等を
採用できる。上記方法においては、通常知られているよ
うに形質転換の効率を一層向上させるためにＭｇＣｌ₂
やＲｂＣｌを更に共存させることもできる。また、宿主
細胞をスフェロプラスト又はプロトプラスト化してから
形質転換させる方法も採用することができる。

【００３５】かくして得られる所望の形質転換株は、常
法に従い培養することができ、該培養により、所望のポ
リペプチドが生産、蓄積される。該培養に用いられる培
地としては、通常の細胞培養に慣用される各種の培地の
いずれでもよく、その具体例としては、例えばＬ培地、
Ｅ培地、Ｍ９培地等及び之等に通常知られている各種の
炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン類等を添加した培地
を例示できる。尚、上記トリプトファン・プロモーター
を用いた場合には、一般にプロモーターが働くようにす
るためにカザミノ酸を添加した、例えばＭ９最小培地を
用いて培養することができ、該培地中には培養の適当な
時期にインドールアクリル酸等のトリプトファン・プロ
モーターの働きを強めるための薬剤を添加することもで
きる。

【００３６】このようにして得られる活性物質を含有す
る培養物からの目的ポリペプチド、即ち本発明ポリペプ
チドの精製、単離は常法に従って行なうことができる。
尚、本発明ポリペプチドを宿主から抽出するに当って
は、例えば浸透圧ショック法等の温和な条件を採用する
のが、その高次構造保持の面からより好ましい。

【００３７】上記精製、単離は、例えば当該ポリペプチ
ドの物理、化学的性質を利用した各種の処理操作に従い
実施することができる〔例えば「生化学データーブツク
II」pp１１７５〜１２５９、第１版第１印刷、１９８０
年６月２３日、株式会社東京化学同人発行参照〕。該方
法としては、具体的には例えば通常の蛋白沈澱剤による
処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル
濾過）、液体クロマトグラフィー、遠心分離、電気泳
動、アフィニティクロマトグラフィー、透析法、之等の
組合せ等を採用できる。

【００３８】より具体的には、上記操作は、例えば以下
のごとくして実施できる。即ち、まず培養上清より予め
目的とするポリペプチドを部分精製する。この部分精製
は、例えばアセトン、メタノール、エタノール、プロパ
ノール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の有機溶媒
や酢酸、過塩素酸（ＰＣＡ）、トリクロロ酢酸（ＴＣ
Ａ）等の酸を蛋白沈澱剤として用いる処理、硫酸アンモ
ニウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等の塩析剤
を用いる処理及び／又は透析膜、平板膜、中空繊維膜等
を用いる限外濾過処理等により行なわれる。之等の各処
理の操作及び条件は、通常のこの種方法のそれらと同様
のものとすればよい。

【００３９】次いで上記で得られた粗精製物を、ゲル濾
過に付すことにより目的物質の活性が認められる画分を
収得する。ここで用いられるゲル濾過剤としては、特に
限定はなく、例えばデキストランゲル、ポリアクリルア
ミドゲル、アガロースゲル、ポリアクリルアミド−アガ
ロースゲル、セルロース等を素材とするものをいずれも
利用できる。之等の具体例としては、セファデックスＧ
タイプ、同ＬＨタイプ、セファロースタイプ、セファク
リルタイプ（以上、ファルマシア社）、セルロファイン
（チッソ株式会社）、バイオゲルＰタイプ、同Ａタイプ
（バイオ−ラド社）、ウルトロゲル（ＬＫＢ社）、ＴＳ
Ｋ−Ｇタイプ（東洋曹達株式会社）等の市販品を例示で
きる。

【００４０】目的とするポリペプチドは、上記ゲル濾過
により得られる活性画分を、例えばハイドロキシアパタ
イトカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィ
ー、ＤＥＡＥ法、ＣＭ法、ＳＰ法等のイオン交換カラム
クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、逆相
高速液体クロマトグラフィー等に付すことにより、又は
之等各操作の組合せにより更に精製でき、均質な物質と
して単離できる。

【００４１】上記クロマトフォーカシング法は、公知の
各種方法により実施できる。カラムとしては、例えばＰ
ＢＥ９４（ファルマシア社製）等を、開始緩衝液として
は、例えばイミダゾール−塩酸等を、また溶出液として
は、例えばポリバッファー７４（ファルマシア社製）−
塩酸（p Ｈ４．０）等を使用できる。

【００４２】上記逆相高速液体クロマトグラフィーは、
例えばＣ₄ ハイポアー逆相ＨＰＬＣカラム（バイオ−ラ
ド社（Bio-Rad Laboratories））等を用いて、移動剤と
してアセトニトリル、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、水
等及び之等の混合溶媒を用いて実施できる。かくして本
発明のポリペプチドを単離、収得できる。

【００４３】得られる本発明ポリペプチドは、これを有
効成分として、前述した各種の医薬用途に有用な医薬製
剤とすることができる。該医薬製剤は、通常本発明ポリ
ペプチドと共に適当な医薬製剤担体を配合して製剤組成
物の形態に調製される。該製剤担体としては使用形態に
応じた製剤を調製するのに通常慣用される充填剤、増量
剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤等の賦形剤乃
至は希釈剤をいずれも使用できる。製剤組成物の形態
は、これが本発明ポリペプチドを効果的に含有する状態
であれば、特に限定はなく、例えば錠剤、粉末剤、顆粒
剤、丸剤等の固剤であつてもよいが、通常液剤、懸濁
剤、乳剤等の注射剤形態とするのが好適である。またこ
れは使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る
乾燥品とすることもできる。之等製剤組成物はいずれも
常法に従い調製され得る。

【００４４】得られる医薬製剤は、該製剤組成物の形態
に応じた適当な投与経路、例えば注射剤形態の医薬製剤
は、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内投与等により
投与され、固剤形態の医薬製剤は、経口乃至は経腸投与
され得る。医薬製剤中の有効成分の量及び該製剤の投与
量は、該製剤の投与方法、投与形態、使用目的、之を適
用される患者の症状等に応じて適宜選択され、一定では
ないが、通常有効成分を約１〜８０重量％程度含有する
製剤形態に調製して、この製剤をこれに含有される有効
成分量が一日成人一人当り約０．１μｇ〜１０ｍｇ程度
となる範囲で投与するのが望ましい。該投与は、一日１
回である必要はなく一日３〜４回に分けることもでき
る。

【００４５】

【実施例】以下、参考例及び実施例を挙げて本発明を更
に詳しく説明する。

【００４６】尚、以下の例において各種生理活性は、次
の方法により測定した。

【００４７】〈活性の測定〉 （１）ＩＬ−１活性の測定 オッペンハインら（J.J.Oppenhein et al ）の方法〔J.
Immunol., １１６，１４６６（１９７６）〕に従い、Ｃ
３Ｈ／Ｈe Ｊ系マウスの胸腺細胞を利用して測定したＬ
ＡＦ活性により表示した。

【００４８】（２）ＧＩＦ活性の測定 ９６ウエルマイクロプレート（コーニング社）に種々の
濃度に希釈した供試液０．１ｍｌを入れ、次に各ウエル
にヒトメラノーマ細胞Ａ３７５を２×１０⁴ 個／ｍｌの
濃度で含有する１０％ＦＣＳを含むイーグルスＭＥＭ浮
遊液０．１ｍｌを加え、炭酸ガス培養器（ナフコ社製）
内で４日間培養する。培養終了後、０．０５％ニュウト
ラルレッド（和光純薬社製）０．０５ｍｌを各ウエルに
加え、３７℃で２時間培養する。上澄液を除去した後、
リン酸緩衝生理食塩水０．３ｍｌを各ウエルに静かに加
えてウエルを洗浄する。洗浄液を除去した後、各ウエル
にリン酸１ナトリウム−エタノール等量混合液０．１ｍ
ｌを加え、マイクロミキサーで数分間振盪し、細胞内に
取込まれた色素量を、９６ウエル−マイクロタイトレー
ションプレート用光度計（タイターチェックマルチスキ
ャン、フロウラボラトリーズ社製）を用いて、吸光度５
４０ｍμにて測定し、増殖抑制活性を求める。対照群
（コントロール群）の細胞増殖の５０％抑制を示す試験
群、即ち対照群の吸光度測定値の１／２の吸光度測定値
を示す試験群、の希釈率の逆数をとり、これをＧＩＦ活
性単位とする。従つて例えばこのＧＩＦ活性が１０単位
の場合、この供試液は１０倍希釈してもなお細胞増殖を
５０％抑制する活性を有する。

【００４９】

【参考例１】 (1) Ｕ９３７細胞の培養 ヒトリンパ組織球腫Ｕ９３７細胞（Ascenso, J.L.et a
l., Blood, Vol ．５７，p １７０（１９８１）〕１．
４×１０⁹ 個を、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボー
ル−１３−アセテート（ＴＰＡ）（ファルマシア社製）
２５ｎｇ／ｍｌ、コンカナバリンＡ（ConＡ）（シグマ
社製）１０μｇ／ｍｌ及び１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）
を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に入れて、４×１０⁵ 個
／ｍｌの濃度の細胞浮遊液を調製した。

【００５０】この細胞浮遊液１０ｍｌずつを、直径９ｃ
ｍのシャーレ（ファルコン３００３）に分注し、５％炭
酸ガス中、３７℃で３日間培養後、培養上清をアスピレ
ーターにて除去し、１０％ＦＣＳ、細菌リポポリサッカ
ライド（ＬＰＳ）（デイフコ社製）１０μｇ／ｍｌ、ム
ラミルジペプチド（ＭＤＰ）（和光純薬社製）１μｇ／
ｍｌ及びＴＰＡ１ｎｇ／ｍｌを含むＲＰＭＩ−１６４０
培地１０ｍｌを、各シャーレに分注した。この培地にて
５％炭酸ガス中、３７℃で１８時間培養し、シャーレ底
部に付着したＵ９３７細胞をｍＲＮＡ調製用の材料とし
て利用した。

【００５１】(2) ｍＲＮＡの調製 ＲＮＡの抽出は、グアニジニウム／熱フェノール（guan
idium ／hot phenol）法〔Feramisco, J.R., et al.,
J.Biol.Chem., Vol. ２５７，p １１０２４（１９８
２）〕とグアニジニウム／セシウムクロライド（guanid
inium ／cesium chloride ）法〔Glisin, V., et al.,
Biochemistry, Vol.１３，p ２６３３（１９７４）〕と
の組合せにより行なった。

【００５２】上記(1)で培養したＵ９３７細胞を洗浄す
るために、培養上清を除去した後、各シャーレを５ｍｌ
のＰＢＳ（−）溶液にてすすぎ、その後、各シャーレに
１ｍｌの４Ｍ−グアニジン・イソチオシアネート混合液
〔４Ｍ−グアニジンイソチオシアネート（Ｆluka社
製）、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、２％ラウロイリルザルコシン酸ナトリウム〕
を添加し、細胞を溶解させた。溶解液をラバーポリスマ
ンとパスツールピペットにて回収して、細胞溶解液４２
０ｍｌを得た。この溶解液を６０℃に保ち、１８Ｇ注射
針に通過させることにより、染色体ＤＮＡをせん断し、
その後６０℃に保温したフェノールを等量加え、１８Ｇ
注射針にて更に溶液を混合し、せん断した。次いでこの
混合液に０．１Ｍ酢酸ナトリウム−１０ｍＭトリスＨＣ
ｌ（ｐＨ７．４）−１ｍＭ ＥＤＴＡ液２１０ｍｌとク
ロロホルム−イソアミルアルコール（２４：１容積比）
混液４２０ｍｌとを加え、６０℃に保温しながら、１５
分間激しく攪拌した。混合液を氷冷後、３０００rpm 、
４℃で２０分間遠心し、水層を回収した。水層に２容の
エタノールを加え、−７０℃にて一夜放置後、粗ＲＮＡ
沈澱を得た。該粗ＲＮＡを、６Ｍグアニジン・イソチオ
シアナート−５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）
−０．１Ｍβ−メルカプトエタノール−０．５％ラウロ
イリルザルコシン酸ナトリウム液４８ｍｌに溶解させ、
塩化セシウム１９．２ｇを添加して溶解させた。次にこ
の混合液７ｍｌずつを、５．７Ｍ塩化セシウム−０．１
Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）の４ｍｌに重層し、ベック
マンＳＷ４０Ｔｉローターにて、２５℃、３１５００rp
m で２０時間遠心して、ＲＮＡを分取した。

【００５３】かくして得られたＲＮＡ量は９．７ｍｇで
あった。

【００５４】次に上記で得られたＲＮＡからｍＲＮＡを
取得するために、オリゴ（ｄＴ）−セルロース（コラボ
レィティブ リサーチ（Collaborative Research, Inc.
社製）を用いて、カラムクロマトグラフィーを行なっ
た。吸着は１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）−０．
５Ｍ ＮａＣｌ−１ｍＭ ＥＤＴＡにて行ない、溶出は
１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴ
Ａにて行なった。

【００５５】この結果、得られたｍＲＮＡは、４００μ
ｇであった。

【００５６】(3) ｃＤＮＡライブラリーの調製 ｃＤＮＡライブラリーの調製は、以下の通り、ｃＤＮＡ
が動物細胞において発現可能なオカヤマ−ベルグ（Okay
ama-Berg）法により行なった。即ち、ｃＤＮＡクローニ
ングに用いるｄＴ鎖の付加したベクター・プライマー
は、プラスミドｐＣＤＶ１より、またｄＧ鎖の付加した
リンカーＤＮＡは、プラスミドｐＬ１より、各々オカヤ
マらの方法〔Okayama, H. and P.Berg., Molecular an
d CellularBiology., Vol．３，p ２８０（１９８
３）〕に従って調製した。

【００５７】次に上記(2)で得たｍＲＮＡ１５μｇを、
５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）−０．５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ（ｐＨ７．５）水溶液２０μｌに溶解し、６５℃で
５分間、次いで３７℃で５分間インキユベートした後、
反応液（全量４０μｌ）を、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．３）、８ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、３０ｍＭ ＫＣｌ、
０．３ｍＭジチオスレイトール、２ｍＭの各ｄＡＴＰ、
ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ、ベクター・プライマ
ーＤＮＡ２．８μｇ、ＲＮase インヒビター（Promega
Biotech 社製）６０ユニット、逆転写酵素（バイオ−ラ
ド社製）４０ユニットになるように調整して、３７℃で
１時間インキュベートし、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ
７．５）２μｌ及び１０％ＳＤＳ２μｌを加えて反応を
停止させた。その後、フェノール・クロロホルム抽出及
びクロロホルム抽出を行い、エタノール沈澱としてベク
ター・プライマーｃＤＮＡ：ｍＲＮＡを回収した。

【００５８】回収されたベクター・プライマーｃＤＮ
Ａ：ｍＲＮＡを、１４０ｍＭカコジル酸ナトリウム、３
０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１ｍＭ ＣａＣｌ
2 、０．１ｍＭジチオスレイトール、０．３μｇポリ
（Ａ）、６６μＭｄＣＴＰ及び３８ユニツトのターミナ
ルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ファル
マシァ社製）からなる反応液３０μｌ中で３７℃、５分
間インキュベートした後、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ
７．５）１．５μｌ及び１０％ＳＤＳ１．５μｌを加え
て反応を停止させ、フェノール・クロロホルム抽出及び
クロロホルム抽出を行なって、エタノール沈澱としてオ
リゴｄＣ鎖付加 cＤＮＡ：ｍＲＮＡ−ベクター・プライ
マーを回収した。

【００５９】この回収された核酸を、７ｍＭトリスＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、６０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、１００μｇ／ｍｌ牛血清アルブミン及び１２ユ
ニットの制限酵素Ｈind III （日本ジーン社製）からな
る反応液２０μｌ中で、３７℃で９０分間インキュベー
トし、次いで０．５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）１μｌ及
び１０％ＳＤＳ１μｌを加えて反応を停止させた。その
後、フェノール・クロロホルム抽出及びクロロホルム抽
出を行ない、エタノール沈澱として、Ｈind III 分解さ
れたオリゴｄＣ鎖付加ｃＤＮＡ：ｍＲＮＡ−ベクター・
プライマーを回収した。これを１０ｍＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）（Ｔ
Ｅ（ｐＨ７．５））１０μｌに溶解させた。このうちの
１μｌを用いて、上記ＴＥ（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ
ＮａＣｌ及びオリゴｄＣ鎖の付加されたリンカーＤＮＡ
１４ｎｇからなる反応液１０μｌ中で、６５℃で２分間
インキュベートし、次いで４２℃で３０分間インキュベ
ートした後、０℃に冷却した。

【００６０】上記反応液を、更に２０ｍＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、４ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭ（ＮＨ
₄）₂ＳＯ₄ 、０．１Ｍ ＫＣｌ、５０μｇ／ｍｌ牛血清
アルブミン、０．１ｍＭ β−ＮＡＤ（ニコチンアミド
・アデニン・ジヌクレオチド、ファルマシァ社製）及び
０．６μｇのエシェリヒア・コリＤＮＡリガーゼ（ファ
ルマシァ社製）を含む反応液１００μｌとなるように調
整し、１２℃で一夜インキュベートした。この反応液
に、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰの各々
を４０μＭになるように、またβ−ＮＡＤを０．１５ｍ
Ｍになるようにそれぞれ加え、更にエシェリヒア・コリ
ＤＮＡリガーゼの０．４μｇ、エシェリヒア・コリＤＮ
Ａポリメラーゼ I（ベーリンガー・マンハイム社製）の
４．６ユニット及びエシェリヒア・コリＲＮase Ｈ（フ
ァルマシァ社製）の１ユニットを加え、１２℃で１時
間、次いで２５℃で１時間インキュベートした。

【００６１】上記で得られた反応液を用いて、エシェリ
ヒア・コリＨＢ１０１株を形質転換させた。エシェリヒ
ア・コリＨＢ１０１株のコンピテント・セルとしては、
ベテスダ リサーチ ラボラトリーズ社（Bethesda Res
earch Laboratories：ＢＲＬ）の製品を使用し、該ＢＲ
Ｌ社のマニュアルに従って、上記形質転換を行なった。

【００６２】かくして、約２１０００個からなるｃＤＮ
Ａライブラリーが得られた。

【００６３】(4) サルＣＯＳ−１細胞へのトランスフ
ェクション 上記(3)で得られたｃＤＮＡライブラリーを、１グルー
プ当り平均７０クローンのグループに分け、各グループ
からプラスミドＤＮＡを調整した。

【００６４】プラスミドＤＮＡは、アルカリ溶菌法（Mo
lecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring H
arbor Laboratory，１９８２，p ３６８）に従い調製し
た。

【００６５】かくして各グループから調製されたプラス
ミドＤＮＡを、それぞれサル培養細胞のＣＯＳ−１細胞
〔Gluzman, Y., Cell, Vol. ２３，p １７５（１９８
１）〕にトランスフェクションした。該トランスフェク
ションは、ＤＥＡＥ−デキストラン法によった〔Yokot
a,T. et al., Proc.Natl.Acad.Sci., USA., Vol. ８, p
１０７０（１９８４）〕。即ち、ＣＯＳ−１細胞をトリ
プシン処理により、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６
４０培地に懸濁させ、細胞数を１×１０⁶ 個／ｍｌに調
整後、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を２
ｍｌ／ウエル加えた６ウエルプレートに、各々５００μ
ｌずつ分注した。一晩３７℃で培養後、上清を除き、血
清を含まない培地で細胞を洗浄し、１０μｇ／ｍｌプラ
スミドＤＮＡ、０．４ｍｇ／ｍｌＤＥＡＥ−デキストラ
ン（ファルマシァ社製）、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
７．４）及び１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培
地を１ｍｌ／ウエル加えて、４．５時間３７℃で培養し
た。その後、上清を除き、血清を含まない培地で細胞を
洗浄し、１５０μＭクロロキン（シグマ社製）及び１０
％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を２ｍｌ／ウエ
ル加えて、更に３７℃で３時間培養した。上清を除き、
血清を含まない培地で細胞を洗浄後、１０％ＦＣＳを含
むＲＰＭＩ−１６４０培地を３ｍｌ／ウエル加えて、３
７℃で７２時間培養した。上清を回収した後、１０％Ｆ
ＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を２ｍｌ／ウエル加
え、凍結融解を２回繰返し、細胞抽出液を回収した。こ
の培養上清及び細胞抽出液について、ＧＩＦ活性を測定
した。

【００６６】ＧＩＦ活性を示したグループを１０クロー
ン／グループの２４グループに分け、上記と同様の操作
を行ない、ＧＩＦ活性を測定し、活性を示したグループ
について、更にグループ内の各クローンにつき、上記と
同様の操作を行なって、ＧＩＦ活性を示すクローンを同
定した。

【００６７】かくして、pcＤ−ＧＩＦ−１６及びpcＤ−
ＧＩＦ−２０７の２種類のクローンを得た。

【００６８】之等のクローンのＧＩＦ活性（ＧＩＦ単位
／ｍｌ）を第１表に示す。

【００６９】第１表クローン 培養上清 細胞抽出物 pcＤ−ＧＩＦ−１６ ４８．３ １２０．７ pcＤ−ＧＩＦ−２０７ ６２．６ １９６．９pcＤＶ１ （対照） ０ ０

【００７０】(5) クローンの解析 プラスミドpcＤ−ＧＩＦ−１６及びpcＤ−ＧＩＦ−２０
７のｃＤＮＡの制限酵素地図を図１に示す。

【００７１】また之等のｃＤＮＡの塩基配列を塩基特異
的化学修飾法〔Methods in Enzymology, Vol. ６５，p
４９９（１９８０）〕及びファージＭ１３ベクター〔Ge
ne,Vol.１９，p ２６９（１９８２）〕を使用したジデ
オキシ・チェーン・ターミネーション〔Proc.Natl.Aca
d.Sci., USA, Vol.７４ ,p ５４６３（１９７７）〕に
より決定した。

【００７２】その結果、pcＤ−ＧＩＦ−２０７の有する
ｃＤＮＡは、マーチらの報告するＩＬ−１α〔Carl J.M
arch et al., Nature, Vol．３１５，p ６４１（１９８
５）〕の翻訳領域ｃＤＮＡ配列と同一であることが確認
された。

【００７３】上記ＩＬ−１α前駆体蛋白質をコードする
ｃＤＮＡを有するプラスミドpcＤ−ＧＩＦ−２０７をエ
ッシェリヒアコリχ１７７６株に保有させた株を工業技
術院微生物工業研究所に「エッシェリヒア コリχ１７
７６／ｐｃＤ−ＧＩＦ−２０７」なる名称で微工研条寄
第１２９４号（ＦＥＲＭ ＢＰ１２９４）として寄託し
た。

【００７４】(6) ポリペプチドの発現及び製造 上記プラスミドpcＤ−ＧＩＦ−２０７を、制限酵素Ｈin
d III 及びＨinc IIにより切断した後、約０．６６ｋｂ
のＨind III −Ｈinc IIＤＮＡフラグメントをアガロー
スゲル電気泳動法により単離、精製した。このＤＮＡフ
ラグメントを更に制限酵素Ａlu Iで切断して、約０．５
kbのＡlu I−Ｈinc IIＤＮＡフラグメントを同様にして
単離した。

【００７５】次に、配列番号：２及び：３に示す合成オ
リゴヌクレオチドの各５′末端を、Ｔ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼによりリン酸化し、上記で得たＡlu I−Ｈin
c IIＤＮＡフラグメントに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い
て連結後、制限酵素Ｃla Iで切断し、得られた反応物を
アガロースゲル電気泳動に付して、約０．５４ｋｂのＣ
la I−Ｃla IＤＮＡフラグメントを単離精製した。

【００７６】他方、プラスミドp ＴＭＩ〔今本文男，代
謝，Vol.２２，２８９（１９８５）〕を、制限酵素Ｃla
Iで切断し、子牛腸アルカリホスホターゼ（ＣＩＡＰ；
calfintestine alkaline phosphatase ）で反応させた
後、先に調製した約０．５４ｋｂのＣla I−Ｃla IＤＮ
Ａフラグメントと、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結して目的
のポリペプチド発現用プラスミドp trp ＩＬ−１α−１
１３を得た。

【００７７】該プラスミドを、エシェリヒア・コリＨＢ
１０１にトランスフォームさせ、目的のトランスフォー
マントを、ボイリング法により得られるプラスミドＤＮ
Ａの制限酵素による切断フラグメントの大きさを解析す
ることにより選択した。

【００７８】以上の概略を図２に示す。

【００７９】上記で得たトランスフォーマントより、プ
ラスミドp trp ＩＬ−１α−１１３を抽出し、これをエ
シェリヒア・コリＷ３１１０にトランスホームして、エ
シェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｗ３１１０／p
trp ＩＬ−１α−１１３を得た。

【００８０】

【実施例１】 （１） 形質転換体の培養 参考例１の(6)で得た形質転換体（エシェリヒア・コリ
Ｗ３１１０／p trp ＩＬ−１α−１１３）を、アンピシ
リン５０μｇ／ｍｌ及びＬ−トリプトファン２０μｇ／
ｍｌを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エ
キス及び０．５％Ｎa Ｃｌ）１０ｍｌ中で、３７℃で一
晩振盪培養し、この８ｍｌを５０μｇ／ｍｌアンピシリ
ン及び１％カザミノ酸を含むＭ９最小培地（０．６％Ｎ
ａ₂ＨＰＯ₄ 、０．３％ＫＨ₂ＰＯ₄ 、０．０５％ＮａＣ
ｌ、０．１％ＮＨ₄Ｃｌ、２ｍＭＭｇＳＯ₄ 、０．２％
グルコース及び０．１ｍＭ ＣａＣｌ₂ ）４００ｍｌ中
に植菌し、３７℃で振盪培養した。９時間後に大腸菌を
１Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄ １０ｍｌに懸濁させ、一夜冷室に
放置した後、１０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．
０）に対して２日間透析した。

【００８１】得られた透析液を遠心分離し、上清と沈澱
物とに分離した。得られた上清は２８ｍｌであり、ＧＩ
Ｆ活性として７．３×１０⁷ ユニットであった。

【００８２】（２） ポリペプチドの精製 上記（１）で得た上清の２ｍｌを、ＧＴi ウルトロクロ
ム ハイパフォーマンス リキッド クロマトグラフィ
ー システム（ＬＫＢ社製）を用いたイオン交換クロマ
トグラフィー（ＤＥＡＥ−ＨＰＬＣ）により、以下の条
件で精製した。

【００８３】カラム：ＴＳＫゲルＤＥＡＥ−５ＰＷ
（７．５×７５ｍｍ、東洋曹達社製） 溶離液Ａ：２０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０） 溶離液Ｂ：０．５Ｍ Ｎa Ｃｌ含有２０ｍＭトリスＨＣ
ｌ緩衝液（ｐＨ８．０） 流速：１ｍｌ／分 フラクシヨン容積：１ｍｌ／分／チユーブ

【００８４】上記ＤＥＡＥ−ＨＰＬＣの結果、ＧＩＦ活
性画分は、リテンションタイム２６〜２８分及び３２．
５〜３４．５分の２ヵ所に認められた。以下この２６〜
２８分の活性画分を「フラクション１」とし、３２．５
〜３４．５分のものを「フラクション２」とする。

【００８５】上記各フラクションについて、再度ＤＥＡ
Ｅ−ＨＰＬＣ及び高速ゲルクロマトグラフィーを行なっ
て、純粋なフラクション１及びフラクション２のそれぞ
れを得た。

【００８６】上記の通りＧＩＦ活性フラクションが分れ
て得られたため、之等につき以下の確認試験を行なっ
た。

【００８７】（３） ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） Laemmli, U.K. の方法〔Nature, ２７ ７，６８０（１９
７０）〕に従い、上記フラクション１及び２のＳＤＳ−
ＰＡＧＥを行なつた。その条件は次の通りである。

【００８８】試料：上記フラクション１又は２を乾固し
た後、ラエメリーのサンプルバッファー〔１／２０体積
の２−メルカプトエタノールを含む（２ＭＥ⁺ ）〕に溶
解し、１００℃で４分間処理した。

【００８９】ゲル：厚さ１．５ｍｍの１５％ポリアクリ
ルアミドゲルを使用した。

【００９０】電気泳動装置：バイオ−ラド（Bio-Rad ）
社製プロテアンを用いた。

【００９１】泳動条件：４０ｍＡの定電流で２時間泳動
させた。

【００９２】泳動後のゲルをバイオ−ラド社製シルバー
スタインキット（Silver stain kit）を用いて染色し
た。その結果、フラクション１及び２の両方とも、約１
８．３ｋに単一のバンドとして泳動され、いずれも遺伝
子から予測される分子量１８ｋにほぼ一致した。

【００９３】（４） 等電点電気泳動法（ＩＥＦ） 上記フラクション１及び２の等電点電気泳動を、ｐＨ範
囲３．５〜９．５のアンフォラインＰＡＧプレート（Ｌ
ＫＢ社製）及びモデル１４１５（バイオ−ラド社製）を
用いて行なった。その条件は次の通りである。

【００９４】試料：上記で得たフラクション１のＰＢＳ
溶液で２日間放置したもの、同２週間放置したもの、上
記で得たフラクション２のＰＢＳ溶液で２週間放置した
もの、対照のＰＢＳ溶液及び以下のマーカープロテイン
（ｐＩマーカープロテイン）の計５レーンを使用した。

【００９５】〈マーカープロテイン〉アミログルコシダ
ーゼ（３．５０）、大豆トリプシンインヒビター（４．
５５）、β−ラクトグロブリンＡ（５．２０）、ウシ
カルボニック アンヒドラーゼ（bovine carbonic anhy
drase ）Ｂ（５．８５）、ヒト カルボニック アンヒ
ドラーゼ（human carbonic anhydrase）Ｂ（６．５
５）、ウマ ミオグロビン−アシディックバンド（hors
e myoglobin-acidic band ）（６．８５）、ウマ ミオ
グロビン−ベイシックバンド（horse myoglobin-basic
band）（７．３５）、レンチル レクチン−アシディッ
クバンド（lentil lectin-acidic band ）（８．１
５）、レンチル レクチン−ミドルバンド（lentil lec
tin-middle band ）（８．４５）、レンチル レクチン
−ベイシックバンド（lentil lectin-basic band）
（８．６５）及びトリプシノーゲン（９．３０）。

【００９６】 泳動条件：定電力１Ｗ／ｃｍゲル幅で９０分間冷却下
（１０℃）に泳動させた。

【００９７】染色：染色は、シルバー スタイン キッ
トで行なった。

【００９８】上記泳動後、ゲルを１ｃｍ間隔でスライス
し、蒸留水１ｍｌにて振盪抽出（２日）し、ｐＨを測定
し、等電点を算出した。

【００９９】その結果、フラクション２の等電点（ｐ
Ｉ）は約５．０であり、この位置に単一のバンドとして
泳動された。フラクション１においては等電点が約５．
２及び約５．０に２つのバンドとして泳動された。

【０１００】（５） アミノ酸組成 上記フラクション１及び２の各々３０μｌを、１２ｍｍ
×１２０ｍｍのパイレックス製肉厚硬質試験管の底部に
注意深く入れ、水酸化ナトリウム粒を入れたデシケータ
ーにて減圧乾燥した。乾燥試料の入った試験管に４Ｎ−
メタンスルホン酸〔０．２％の３−（２−アミノエチ
ル）インドール含有、ピアース（Pierce）社製〕５０μ
ｌを加え、０．１〜０．２ｍｍＨｇで１分間脱気後、減
圧封管した。加水分解は１１８℃のヒーター中で２４時
間を要して行なった。開管後、４Ｎ−水酸化ナトリウム
４６μｌで中和し、希釈用クエン酸緩衝液で４５０μｌ
とした。

【０１０１】アミノ酸分析は、アミノ酸アナライザー
（日立製作所製、日立８３５型分析計）を用い、上記試
料溶液２５０μｌを注入して行なった。分離されたアミ
ノ酸は、オルトフタルアルデヒド法で検出した。また定
量は、試料の前後に分析した標準アミノ酸で作成した検
量線によって行なった。

【０１０２】その結果を、Ｐheを基準（１０モル）とし
て、各アミノ酸の含有モル比で下記第２表に示す。尚、
上記分析条件下においては、Ｐro及びＣysは測定できな
い。

【０１０３】

【０１０４】（６） アミノ酸配列 上記フラクション１及び２の各々１５０μｌを、アプラ
イドバイオシステムズ社製プロテインシークエンサー
（モデル４７０Ａ）にて分析した。生じたＰＴＨ−アミ
ノ酸を、３３％アセトニトリル水溶液１００〜５０μｌ
にて適宜希釈し、その５μｌをウオーターズ７１０Ｂ型
オートサンプラーにて注入した。クロマトグラフィーの
システムは、ベックマン１１２型ポンプ２台を４２１型
コントローラーで作働させた。カラムはウルトラスフェ
アーＯＤＳ−５μｍの充填された２ｍｍ×２５０ｍｍを
用い、カラムヒーターにて５５℃に保った。流速は０．
３ｍｌ／分とし、２０ｍＭ酢酸ナトリウムとアセトニト
リルとの混合液を用い、グラジエント溶出法で分離し、
２６９ｎｍでモニターした。分析は４５分とした。

【０１０５】４０サイクルの分析の結果、両者のアミノ
酸配列は、第３６番目のアミノ酸を除いて同一であり、
配列番号：４に示す通りであった。

【０１０６】フラクション１の第３６番目のアミノ酸
（配列番号：４中のAsx）は、遺伝子の配列から予想さ
れるアミノ酸、即ちAsnであり、フラクション２のそれ
はAspであった。

【０１０７】以上のことより、フラクション１は、配列
番号：１で表わされるポリペプチド、即ちＩＬ−１αで
あり、一方、フラクション２は、該ＩＬ−１αの第３６
番目のアミノ酸がAspに置換された本発明ポリペプチド
であることが確認された。以下この本発明ポリペプチド
を「ポリペプチド I」という。

【０１０８】尚、上記ＩＬ−１αは、物質的に安定性に
欠け、例えばトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中にお
いても、一部より安定なポリペプチド Iに変化すること
が認められた。

【０１０９】

【実施例２】 （１） 本発明ポリペプチド Iの製造 参考例１で得たプラスミドp trp ＩＬ−１α−１１３を
利用して、サイト−スペシフィック ミュータジエネシ
ス（Site-Specific Mutagenesis ）〔Proc.Nat.Acad.Sc
i., ８１，５６６２−５６６６（１９８４）〕の方法に
従い、ポリペプチド I発現用プラスミドを得、これより
ポリペプチド Iを以下の通り製造した。

【０１１０】即ち、Ｍ１３mp１１ファージベクターを、
一本鎖（ss）ＤＮＡ鋳型として用いた。まず、プラスミ
ドp trp ＩＬ−１α−１１３より、ＥcoＲＩ／ＢamＨＩ
ＤＮＡフラグメントを切り出し、Ｍ１３mp１１ファー
ジ（ＲＦ）のＥcoＲＩとＢamＨＩの制限酵素サイトにク
ローニングし、これから一本鎖（ss）ＤＮＡ（Ｍ１３−
ＩＬ−１α−１１３）を得、これをミュータジエネシス
の鋳型とした。

【０１１１】配列番号：５に示す配列の合成オリゴヌク
レオチド（プライマー）を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼでリン酸化し、これをssＭ１３−ＩＬ−１α−１１
３ＤＮＡとハイブリダイズし、アニーリング後、ｄＮＴ
Ｐｓの存在下、ＤＮＡポリメラーゼ I（クレノーフラグ
メント）及びＴ４ＤＮＡリガーゼで各々処理し、１５℃
で１８時間インキュベートした。

【０１１２】得られたＤＮＡをＪＭ１０５コンピテント
細胞にトランスフォームし、生じたコロニーを、寒天プ
レート上に５０コロニー植菌し、３７℃で１８時間培養
した。生育したコロニーを含むフィルターを通常の方法
によりアルカリ変性し、乾燥後、８０℃で２時間ベーキ
ング処理を行なった。このフィルターをプレハイブリダ
イズした後、このものと、上記プライマーの５′末端を
³²Ｐ−γ−ＡＴＰでラベルした³²Ｐ−プローベとを、室
温でハイブリダイズさせた。ハイブリダイズさせたフィ
ルターを、６×ssc バッファーで、室温で１０分間、次
いで５４℃で５分間各々洗浄し、乾燥後、−７０℃で１
８時間オートラジオグラフィーを行なった。

【０１１３】変異した５クローンの内から代表としてＭ
１３−ＩＬ−１α−３６Ｄを選び、これをＪＭ１０５に
感染させて培養し、ssＤＮＡ及びＲＦＤＮＡを調製し
た。

【０１１４】上記で得たssＤＮＡのＭ１３ジデオキシチ
ェイン ターミネーション シークエンシングにより目
的の遺伝子の変異の確認を行なった。

【０１１５】ＪＭ１０５で増殖させたＲＦＤＮＡより、
ＥcoＲＩ／ＢamＨＩフラグメントを調製し、これを前記
参考例と同様にして発現プラスミドに組込み、所望のポ
リペプチド I発現プラスミド（ＩＬ−１α−３６Ｄ）を
得た。

【０１１６】このプラスミドを用いて、実施例１と同様
にして、ポリペプチド Iを発現させ、これを精製（ＤＥ
ＡＥ−ＨＰＬＣの結果は単一のＧＩＦ活性ピークを与え
た）することにより、前記物性を示す目的のポリペプチ
ド Iを得た。その比活性は約１×１０⁷ ＧＩＦ単位／ｍ
ｇ蛋白であった。

【０１１７】

【実施例３】 （１） 本発明ポリペプチドII及びIII の製造 実施例２においてプライマーとして配列番号：６に示す
配列の合成オリゴヌクレオチドを用いて、同様にして、
ＩＬ−１αの第１４１番目のアミノ酸（Ｃys）がＳerに
置換された本発明ポリペプチドの発現用プラスミドであ
るp trp ＩＬ−１α−１４１Ｓを得た。

【０１１８】該プラスミドを用いて、実施例１と同様に
して、発現及び精製を行なった結果、同様にＤＥＡＥ−
ＨＰＬＣでＧＩＦ活性の２つのピークが得られた。

【０１１９】之等につき、同様に解析を行なった結果、
リテンシヨンタイムの早い方のピークフラクションは、
遺伝子配列から予想されるポリペプチド、即ちＩＬ−１
αの第１４１番目のアミノ酸（Ｃys）がＳerに置換され
た本発明ポリペプチド（ポリペプチドIII ）であること
が確認された。

【０１２０】また、他方のピークフラクションは、同様
の解析の結果、ＩＬ−１αの第３６番目のアミノ酸（Ａ
sn）及び第１４１番目のアミノ酸（Ｃys）が、それぞれ
Ａsp及びＳerに置換された本発明ポリペプチドであると
同定された。以下このポリペプチドを「ポリペプチドI
I」という。

【０１２１】

【実施例４】 （１） 本発明ポリペプチドIIの製造 実施例３と同様にして、該実施例３で調製したプラスミ
ドp trp ＩＬ−１α−１４１Ｓを利用して、プライマー
として配列番号：７に示す配列を用いることにより、目
的のポリペプチドII発現用プラスミドp trp ＩＬ−１α
−３６Ｄ・１４１Ｓを得た。

【０１２２】上記プラスミドp trp ＩＬ−１α−３６Ｄ
・１４１Ｓを、ＨＢ１０１株に保有させ、これを微工研
に「エッシェリヒア コリＨＢ１０１／ＩＬ−１α−３
６Ｄ・１４１Ｓ（Esherichia coli HB101/IL-1α-36D 1
41S）」なる名称で微工研条寄第１２９５号（ＦＥＲＭ
ＢＰ１２９５）として寄託した。

【０１２３】該プラスミドを用いて、実施例１と同様に
して、発現及び精製して、本発明の目的ポリペプチドII
を得た。

【０１２４】このものの分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
より、約１８ｋｄであることが確認された。またこのも
ののＩＥＦによる等電点（ｐＩ）は、約５．０であっ
た。ポリペプチドII及びIII の比活性（ＧＩＦ活性）
は、ポリペプチド Iと同等であった。

【０１２５】

【薬理試験例１】 (1) ＧＩＦ活性及びＬＡＦ活性 本発明ポリペプチドのＧＩＦ活性については、既に記載
した通りであり、また、ポリペプチド I、II及びIII の
いずれもそのＧＩＦ活性とほぼ同等のＬＡＦ活性を示し
た。

【０１２６】更に本発明ポリペプチドにつき、以下の試
験を行なった。

【０１２７】(2) 抗腫瘍作用 腫瘍細胞メスＡ（Meth A）の２０００００細胞を、ＢＡ
ＬＢ／ｃマウスに皮内接種（i.d.）した（第０日目）。
次いで、第７日目と第８日目に、ポリペプチドIの０．
３、１又は３μｇ／マウスを、各１回実験動物の腫瘍内
に投与した。

【０１２８】実験動物各７匹を１試験群とした。対照
（コントロール）群には、溶媒（１％マウス血清）のみ
を同様に投与した。

【０１２９】試験結果を図３に示す。該図において横軸
は腫瘍細胞接種後日数（日）を、縦軸は腫瘍重量（ｍ
ｇ）を示し、曲線（１）は対照群を、曲線（２）はポリ
ペプチド Iの０．３μｇ投与群を、曲線（３）はポリペ
プチド Iの１μｇ投与群を、また曲線（４）はポリペプ
チド Iの３μｇ投与群をそれぞれ示す。また腫瘍重量
は、平均（mean）±標準偏差（ＳＤ）で示されており、
＊はスチュウデンツＴ−テストにおけるＰ＜０．０５
を、＊＊は同Ｐ＜０．０１を示す。

【０１３０】(3) ＣＳＦ産生促進効果試験 (3)-1 細胞株Ｕ−３７３ＭＧ〔ＡＴＣＣ ＨＴＢ１
７，Glioblastoma,Astrocytoma, Human 〕を用いて以下
の試験を行なった。

【０１３１】即ち、まず、上記細胞を２×１０⁵ 個／ｍ
ｌの細胞濃度となるように、１０％ウシ胎児血清(GIBCO
社）、ＭＥＭ非必須アミノ酸（Flow社）及びＭＥＭピル
ビン酸ナトリウム（Flow社）を添加したイーグルスＭＥ
Ｍ培地（日水社）に浮遊させた。

【０１３２】上記細胞浮遊液中に、種々の濃度となるよ
うにポリペプチド Iを加え、炭酸ガス培養器内で３７℃
で２４時間培養し、各培養上清を集め、之等培養上清中
に産生蓄積されたＣＳＦ量を、マウス骨髄腫細胞を使用
して測定した〔Lewis, I.C.et al., J.Immunol., １２
８，１６８（１９８２）〕。

【０１３３】得られた結果を図４に示す。該図におい
て、横軸はポリペプチド Iの濃度（ｎｇ／ｍｌ）を、縦
軸はＣＳＦ活性（単位／ｍｌ，×１０^-2）を各々示す。

【０１３４】(3)-2 ポリペプチド Iを生体内に投与し
た場合、生体内でのＣＳＦ産生亢進作用が発現されるこ
とを以下の実験により試験した。

【０１３５】即ち、正常マウス（ＢＡＬＢ／ｃ系マウ
ス、静岡県実験動物協同組合より購入）に、種々の量の
ポリペプチド Iを皮下投与した。上記投与後、８時間目
に各実験動物より採血し、血清中のＣＳＦ活性を上記
(3)-1と同様にして、マウス骨髄腫細胞を用いて測定し
た。尚、対照として、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）投
与群を作成し、同一試験に供した。

【０１３６】結果を図５に示す。該図において、横軸は
ポリペプチド I投与量又はＨＳＡ投与量（いずれもμｇ
／マウス）を、縦軸はＣＳＦ活性（単位／ｍｌ血清，×
１０ ^-3）を各々示す。

【０１３７】(4) 抗炎症試験 ウインター（Winter）らの方法〔Proc.Soc.Exptl.Biol.
Med., １１１，５４４−５４７（１９６２）〕に準じ
て、この試験を行なった。

【０１３８】即ち、６〜８週齢の雄ラット（Spraque Da
wley系、日本チャールスリバー社）を、実験前日に体重
に基づいて１群６〜８匹の各群に分けて用いた。起炎剤
としてカラゲニン（Marine Colloid社製）を、生理食塩
水に１％となるように懸濁させたものを使用し、ラット
の右後肢足蹠皮下に０．１ｍｌ注射して足浮腫を惹起さ
せた。足浮腫を評価するため、起炎剤注射の前後の一定
時間に、右後肢足蹠容積を、プレシモメーター（plethy
smometer，Ugo-Vasile社製）を用いて測定した。前値に
対する起炎剤注射後の容積増加率を浮腫率（swelliｎｇ
％）として表わした。

【０１３９】被検物質は、ダルベッコのリン酸塩緩衝食
塩水（Dulbeco's phosphate buffered saline ）に溶解
希釈し、ラットの背部皮内に０．１ｍｌ宛、起炎剤注射
の１時間前に注射した。尚、対照群として、溶媒投与群
を作成し、同一実験に供した。

【０１４０】結果を図６に示す。該図において、横軸は
起炎剤投与後時間（hr）を、縦軸は浮腫率（％）を示
す。図中、曲線（１）は対照群を、曲線（２）はポリペ
プチドIの０．１μｇ投与群を、曲線（３）はポリペプ
チド Iの１μｇ投与群を、また曲線（４）はポリペプチ
ド Iの１０μｇ投与群をそれぞれ示す。

【０１４１】(5) 放射線障害防止作用試験 ＢＡＬＢ／ｃ系マウス（９週齢）に致死量のＸ線を照射
する２０時間前に、ポリペプチド Iの１μｇ／マウス又
は０．３μｇ／マウスを腹腔内注射した。

【０１４２】Ｘ線照射装置（ＭＢＲ−１５０５Ｒ、日立
メディコ社）を使用し、８５０レントゲンのＸ線を、上
記マウスに全身照射し、以後、毎日その生存を確認し
た。尚、コントロールとして、ＰＢＳ投与群をおいた。

【０１４３】結果を図７に示す。図において横軸はＸ線
照射後の日数（日）を、縦軸は供試動物の生存率（％）
を示し、曲線（１）はポリペプチド Iの１μｇ投与群
を、曲線（２）はポリペプチド Iの０．３μｇ投与群
を、また曲線（３）はコントロール群をそれぞれ示す。

【０１４４】図７より、コントロール群では、Ｘ線照射
後１８日目に全例死亡したのに対し、ポリペプチド I投
与群では、その投与量に依存して、放射線障害の防止作
用が認められ、特に１μｇ投与群では、約８割が放射線
障害による死亡から回避され、生存することが確認され
た。

【０１４５】(6) 日和見感染防御効果試験 易感染モデルマウスを用いて、以下の試験を実施した。

【０１４６】（１）ＩＣＲ系雄性マウス（６週齢）を供
試動物（１群７匹）とし、第１日目に、５−フルオロウ
ラシル（５−Ｆu 、協和醗酵社製）１００ｍｇ／ｋｇを
静脈内投与した。第２日目、第４日目及び第６日目に、
ポリペプチド Iの１μｇ／マウスを皮下投与し、第７日
目に、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa E-2）の所定量
を腹腔内投与して感染させた。第１０日目に供試動物の
生存数を計数して、生存率（％）を求めた。

【０１４７】結果を図８に示す。

【０１４８】図８中、（１）は上記実験群の結果を、同
（２）はポリペプチド Iを投与しなかった（５−Ｆu の
みを投与した）対照群の結果を、また同（３）は５−Ｆ
u 及びポリペプチド Iのいずれも投与しなかった対照群
の結果をそれぞれ示す。また、図８中、縦軸は生存率
（％）を、横軸は下記各緑膿菌投与量を採用した群Ａ〜
Ｅを各々示す。

【０１４９】 Ａ群…１９０００菌数／マウス投与群 Ｂ群… ３８００菌数／マウス投与群 Ｃ群… ７５０菌数／マウス投与群 Ｄ群… １５０菌数／マウス投与群 Ｅ群… ３０菌数／マウス投与群 Ｆ群… ６菌数／マウス投与群

【０１５０】(7) ＩＬ−１αのＣＳＦ産生促進効果試
験 ＣＳＦ産生株として、ヒト肺細胞由来株ＨＦＬ−１（Hu
man Embryonic Lung Fibroblasts, ＡＴＣＣ登録細胞株
Ｎo.ＣＣＬ−１５３）を用い、以下の試験を行なった。

【０１５１】まず、上記ＨＦＬ−１細胞を２×１０⁵ 個
／ｍｌの細胞濃度となるように、１０％ウシ胎児血清加
ハムスター１２Ｋ培養液［Ham, R.G., Proc.Natl.Acad.
Sci., ５３，２８８（１９６５）］に浮遊させた。次い
で上記細胞懸濁液中に、種々の濃度に調製した前記実施
例１で得たＩＬ−１αを加え、炭酸ガス培養器内で３７
℃で２４時間、４８時間及び７２時間各々培養し、各培
養上清を集め、之等培養上清中に産生蓄積されたＣＳＦ
量を、マウス骨髄細胞を使用して測定した［Lews,I.C.
et al., J.Immunol,１２８，１６８（１９８２）］。

【０１５２】結果を第３表に示す。

【０１５３】

【０１５４】上記各結果により、ＩＬ−１αの添加によ
れば、ＨＦＬ−１細胞株のＣＳＦ産生量は、その無添加
に比べて亢進されることが明らかである。

【０１５５】(8) 動物細胞からのサイトカインの製造
方法 種々の濃度のポリペプチドII及び０．０１％ＰＨＡ−Ｐ
存在下に、ＨＢＳ−２Ｃ５Ｂ２細胞〔J.Immunol., １３
１，１６８２−１６８９（１９８５）〕を、２×１０⁵
cells ／wellにて培養した。培養２４時間後の上清を採
取し、そのＩＬ−２活性を、スミス（K.A.Smith ）らの
方法に従い、ＩＬ−２依存性マウスＴ細胞（ＣＴＬＬ
２）を用いて測定した〔J.Immunol., １２０，２０２７
（１９７８）〕。結果を下記第４表に示す。

【０１５６】 第４表ポリペプチドIIの濃度(ng/ml) ＩＬ−２活性(cpm×１０ ^-3)平均（n=5) ０ ０．４ ０．０００５ ０．４ ０．００５ ０．６ ０．０５ ２．１ ０．５ ３．２ ５ ３．５ ５０ ３．９ ５００ ３．８

【０１５７】以上に示す結果より、本発明ポリペプチド
を用いることにより、動物細胞からの天然サイトカイン
類の生産が効率よく行い得ることが判る。

【０１５８】また、本発明のポリペチドの、かかる方法
への適用に際しては、極めて微量、通常１０ｎｇ／ｍｌ
程度の使用で十分であり、誘導されたサイトカイン類の
精製過程をも容易にする。

【０１５９】(9) 動物細胞よりサイトカインを生産す
る場合、産生誘引に使用する本発明ポリペプチドがその
条件下において構造的に安定であり、細胞表面上のＩＬ
−１受容体に結合することが必須である。すなわち、本
発明ポリペプチドがＩＬ−１受容体に結合し、サイトカ
イン産生に必要なシグナルを細胞内に伝えることが重要
である。そこで、線維芽細胞上のＩＬ−１受容体への結
合に関して、以下の試験を行なった。

【０１６０】６−ウエルプレート上で、一面にほぼ均一
にまで増殖したＢalb ／３Ｔ３細胞（クローンＡ３１：
ＡＴＣＣ，ＣＣＬ−１６３，１×１０⁶ cells ／well）
に、¹²⁵Ｉで標識したＩＬ−１β［生化学，５８，８
号、ｐ８４０（１９８６）；ＥＰＯ１８７９９１号］の
５００００cpm／well及び事前に１０％ＦＣＳ加Ｄ−Ｍ
ＥＭ中で３７℃下に２４時間インキュベートした２０ｎ
ｇ／ｍｌのＩＬ−１β又はポリペプチドIIを加え、４℃
で反応させた。反応液をパスツールピペットで除き、１
０％ＦＣＳ加Ｄ−ＭＥＭの１ｍｌ加えて静かに洗い上清
をすてた。この洗浄操作を２回繰返した後、１ｍｌの１
％ＳＤＳ、０．２Ｎ ＮａＯＨで細胞を可溶化し、可溶
化液及び更にウエルを洗浄した可溶化液中の放射能（結
合放射能）をγ−カウンターにて測定した。

【０１６１】尚、上記 ¹²⁵Ｉ標識ＩＬ−１βは、ボルト
ンとハンター（Bolton and Hunter）の方法〔Biochem.
J.,１３３，５２９（１９７３）〕に従い製造、精製し
た（比活性；２５０μＣｉ／μｇ蛋白以上）。

【０１６２】得られた結果を下記第５表に示す。

【０１６３】 なお、表において阻止能（％）は、下式により求めた。

【０１６４】 結合能力（％）＝（Ａ−Ｃ）／（Ａ−Ｂ）×１００ 尚、式中Ａは未標識ポリペプチド Iが存在しない時の結
合した放射能、Ｂはプレートに非特異的に吸着した放射
能、Ｃは結合した放射能の実測値を示す。

【０１６５】かかる指標は、共存させたＩＬ−１β又は
ポリペプチドIIのＩＬ−１受容体への結合力を表わす。
尚、ＩＬ−１β受容体は、ＩＬ−１α及びＩＬ−βに共
通であることが知られている。

【０１６６】上記第５表よりポリペプチドIIは、サイト
カイン誘導産生条件下においても、ＩＬ−１受容体への
結合力が低下することなく、かかる適用に際して極めて
好ましいことが判る。

【０１６７】

【製剤例１】ＧＩＦ活性として１×１０⁷ 単位／ｍｌの
ポリペプチド Iの生理食塩水溶液に、ヒト血清アルブミ
ン（ＨＳＡ）を０．５％となるように添加して、濾過
（０．２２μｍメンブランフイルター）後、これを無菌
的に１ｍｌずつバイアル瓶に分注して凍結乾燥し、注射
用製剤を調製した。

【０１６８】かくして得られた製剤は、これを用時注射
用蒸留水１ｍｌに溶解して利用される。

【０１６９】

【配列表】

【０１７０】配列番号：１ 配列の長さ：159 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：蛋白 配列： Ser Ala Pro Phe Ser Phe Leu Ser Asn Val Lys Tyr Asn Phe Met Arg 5 10 15 Ile Ile Lys Tyr Glu Phe Ile Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gln Ser Ile 20 25 30 Ile Arg Ala Asn Asp Gln Tyr Leu Thr Ala Ala Ala Leu His Asn Leu 35 40 45 Asp Glu Ala Val Lys Phe Asp Met Gly Ala Tyr Lys Ser Ser Lys Asp 50 55 60 Asp Ala Lys Ile Thr Val Ile Leu Arg Ile Ser Lys Thr Gln Leu Tyr 65 70 75 80 Val Thr Ala Gln Asp Glu Asp Gln Pro Val Leu Leu Lys Glu Met Pro 85 90 95 Glu Ile Pro Lys Thr Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe 100 105 110 Trp Glu Thr His Gly Thr Lys Asn Tyr Phe Thr Ser Val Ala His Pro 115 120 125 Asn Leu Phe Ile Ala Thr Lys Gln Asp Tyr Trp Val Cys Leu Ala Gly 130 135 140 Gly Pro Pro Ser Ile Thr Asp Phe Gln Ile Leu Glu Asn Gln Ala 145 150 155 Met Glu Asp Tyr Gln Ala Ala Glu Glu Thr Ala Phe Val Val Asp Glu 1 5 10 15

【０１７１】配列番号：２ 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： CGATAATGTC AGCACCTTTT AG 22

【０１７２】配列番号：３ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： CTAAAAGGTG CTGACATTAT 20

【０１７３】配列番号：４ 配列の長さ：40 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：蛋白 配列： Ser Ala Pro Phe Ser Phe Leu Ser Asn Val Lys Tyr Asn Phe Met Arg 5 10 15 Ile Ile Lys Tyr Glu Phe Ile Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gln Ser Ile 20 25 30 Ile Arg Ala Asx Asp Gln Tyr Leu 35 40

【０１７４】配列番号：５ 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： ACTGGGTGAG CTTGGCAG 18

【０１７５】配列番号：６ 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： ACTGGGTGAG CTTGGCAG 18

【０１７６】配列番号：７ 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： ＡＴＴＣＧＡＧＣＣＧ ＡＴＧＡＴＣＡＧ
１８

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドpcＤ−ＧＩＦ−１６及びプラスミド
pcＤ−ＧＦ−２０７のｃＤＮＡの制限酵素地図を示す。

【図２】プラスミドpcＤ−ＧＩＦ−２０７とプラスミド
p ＴＭ１とからプラスミドp trpＩＬ−１α−１１３を
構築する概略図を示す。

【図３】抗腫瘍作用試験の結果を示す。

【図４】ＣＳＦ産生促進効果試験の結果を示す。

【図５】ＣＳＦ産生促進効果試験の結果を示す。

【図６】抗炎症試験の結果を示す。

【図７】放射線障害防止作用試験の結果を示す。

【図８】日和見感染防御効果試験の結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 特願昭61−160250 (32)優先日 昭61(1986)７月８日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号 特願昭61−200323 (32)優先日 昭61(1986)８月27日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (72)発明者 洪 英満 徳島県鳴門市撫養町北浜字宮ノ西129−４ サンラウンジハウス105号 (72)発明者 河合 一吉 徳島県板野郡松茂町満穂字満穂開拓130− ２ ソレイユ503号 (72)発明者 嶽肩 世津子 徳島県徳島市川内町加賀須野1090−18 (72)発明者 石井 清士 徳島県板野郡藍住町住吉字逆藤39−46 (72)発明者 柳原 康夫 徳島県徳島市川内町大松891−６ (72)発明者 平井 嘉勝 徳島県板野郡北島町新喜来字江古川５−49

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：１で表わされるインターロイ
   キン−１αのアミノ酸配列の３６位Asnを他のアミノ酸
   に置換した改変されたアミノ酸配列を有するインターロ
   イキン−１α誘導体及び同アミノ酸配列の３６位Asn及
   び１４１位Cysをそれぞれ他のアミノ酸に置換した改変
   されたアミノ酸配列を有するインターロイキン−１α誘
   導体から選択される少なくとも１種を有効成分として、
   医薬製剤担体と共に含有し且つ上記配列のインターロイ
   キン−１αは実質的に含有しないことを特徴とする医薬
   製剤。
2. 【請求項２】 抗腫瘍剤である請求項１に記載の医薬製
   剤。
3. 【請求項３】 抗炎症剤である請求項１に記載の医薬製
   剤。
4. 【請求項４】 放射線障害防止剤である請求項１に記載
   の医薬製剤。
5. 【請求項５】 感染症予防及び治療剤である請求項１に
   記載の医薬製剤。
6. 【請求項６】 皮下投与に適した形態を有する請求項１
   に記載の医薬製剤。
7. 【請求項７】 有効成分が３６位AsnをAspに且つ１４１
   位CysをSerにそれぞれ置換した改変されたアミノ酸配列
   を有するインターロイキン−１α誘導体である請求項１
   に記載の医薬製剤。