JPH1084970A - 新規転写調節因子 - Google Patents
新規転写調節因子Info
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- JPH1084970A JPH1084970A JP8307085A JP30708596A JPH1084970A JP H1084970 A JPH1084970 A JP H1084970A JP 8307085 A JP8307085 A JP 8307085A JP 30708596 A JP30708596 A JP 30708596A JP H1084970 A JPH1084970 A JP H1084970A
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- polypeptide
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Abstract
(57)【要約】
【課題】小胞体ストレスによるＧＲＰ誘導の分子機構を
明らかにすることにより、酵母における有用外来タンパ
ク質の大量分泌発現を可能にする技術を確定すること。 【解決手段】配列表の配列番号：２又は３に記載のアミ
ノ酸配列、又はその一部であって、かつ、転写調節活性
を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤ
ＮＡ、配列表の配列番号：１に記載の塩基配列、又はそ
の一部であって、かつ、転写調節活性を有するポリペプ
チドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、前記ＤＮＡ
によりコードされるポリペプチド、前記ポリペプチドと
特異的に結合する抗体又はその断片、前記ＤＮＡを破壊
したサッカロミセス セレビシエ変異株、前記ＤＮＡ発
現ベクターで酵母を形質転換する酵母小胞体内腔の分子
シャペロン及びフォールディング酵素を制御する方法並
びに前記発現ベクターと外来タンパク質発現ベクターで
酵母を形質転換する外来タンパク質の発現方法。
明らかにすることにより、酵母における有用外来タンパ
ク質の大量分泌発現を可能にする技術を確定すること。 【解決手段】配列表の配列番号：２又は３に記載のアミ
ノ酸配列、又はその一部であって、かつ、転写調節活性
を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤ
ＮＡ、配列表の配列番号：１に記載の塩基配列、又はそ
の一部であって、かつ、転写調節活性を有するポリペプ
チドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、前記ＤＮＡ
によりコードされるポリペプチド、前記ポリペプチドと
特異的に結合する抗体又はその断片、前記ＤＮＡを破壊
したサッカロミセス セレビシエ変異株、前記ＤＮＡ発
現ベクターで酵母を形質転換する酵母小胞体内腔の分子
シャペロン及びフォールディング酵素を制御する方法並
びに前記発現ベクターと外来タンパク質発現ベクターで
酵母を形質転換する外来タンパク質の発現方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規転写調節因子
に関する。詳しくは、該転写調節因子を用いた真核細胞
のストレス応答の制御方法及び外来タンパク質の発現方
法に関する。
に関する。詳しくは、該転写調節因子を用いた真核細胞
のストレス応答の制御方法及び外来タンパク質の発現方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ストレスタンパク質の中心をなすものは
熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）であるが、これ以外に
もグルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）と総称される一
群のタンパク質の存在が古くから知られている。酵母か
ら哺乳動物までの真核細胞において、グルコース調節タ
ンパク質はよく保存された形でいずれも小胞体の内腔に
存在し、分子シャペロンやフォールディング酵素として
小胞体内での分泌系タンパク質の折り畳み（フォールデ
ィング）に極めて重要な役割を果たしている。例えば、
酵母のＫａｒ２ｐ（ＧＲＰ７８またはＢｉＰとも呼ばれ
る、以下ＧＲＰ７８を用いる）は酵母では生命活動に必
須であり、哺乳動物細胞のＧＲＰ７８とＧＲＰ９４は抗
体や細胞膜レセプターのフォールディング過程に深く関
与しており、さらにラットを用いた実験では虚血などの
ストレスを受けたときにＨＳＰ７０ｍＲＮＡとともにＧ
ＲＰ７８ｍＲＮＡが誘導されることが報告されている。
このように臨床的にも重要な分子であると考えられてい
るが、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）に代表される細
胞質のストレスタンパク質に比べて小胞体内のストレス
タンパク質（分子シャペロンやフォールディング酵素）
の研究は大きく立ち遅れているのが現状である。
熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）であるが、これ以外に
もグルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）と総称される一
群のタンパク質の存在が古くから知られている。酵母か
ら哺乳動物までの真核細胞において、グルコース調節タ
ンパク質はよく保存された形でいずれも小胞体の内腔に
存在し、分子シャペロンやフォールディング酵素として
小胞体内での分泌系タンパク質の折り畳み（フォールデ
ィング）に極めて重要な役割を果たしている。例えば、
酵母のＫａｒ２ｐ（ＧＲＰ７８またはＢｉＰとも呼ばれ
る、以下ＧＲＰ７８を用いる）は酵母では生命活動に必
須であり、哺乳動物細胞のＧＲＰ７８とＧＲＰ９４は抗
体や細胞膜レセプターのフォールディング過程に深く関
与しており、さらにラットを用いた実験では虚血などの
ストレスを受けたときにＨＳＰ７０ｍＲＮＡとともにＧ
ＲＰ７８ｍＲＮＡが誘導されることが報告されている。
このように臨床的にも重要な分子であると考えられてい
るが、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）に代表される細
胞質のストレスタンパク質に比べて小胞体内のストレス
タンパク質（分子シャペロンやフォールディング酵素）
の研究は大きく立ち遅れているのが現状である。
【０００３】ＨＳＰが熱ショックによって誘導されるの
に対し、ＧＲＰは熱ショックによっては誘導されず、細
胞が様々なストレス、例えば、グルコース飢餓、タンパ
ク質のグリコシル化阻害剤であるツニカマイシン（Ｔ
Ｍ）、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、カルシウ
ムキレート剤または還元剤等により小胞体内に正常な立
体構造をとれないタンパク質（アンフォールドタンパク
質）が蓄積することによって転写レベルで誘導されるこ
とから、ＧＲＰのストレス応答過程とＨＳＰの応答過程
とは別系統であると考えられる。しかしながら、ＧＲＰ
の発現誘導機構の解析はＨＳＰに比べて大きく遅れてお
り、小胞体から核へのストレスシグナルの伝達経路およ
びＧＲＰ遺伝子の転写制御配列や転写調節因子について
はほとんど解明されていない。
に対し、ＧＲＰは熱ショックによっては誘導されず、細
胞が様々なストレス、例えば、グルコース飢餓、タンパ
ク質のグリコシル化阻害剤であるツニカマイシン（Ｔ
Ｍ）、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、カルシウ
ムキレート剤または還元剤等により小胞体内に正常な立
体構造をとれないタンパク質（アンフォールドタンパク
質）が蓄積することによって転写レベルで誘導されるこ
とから、ＧＲＰのストレス応答過程とＨＳＰの応答過程
とは別系統であると考えられる。しかしながら、ＧＲＰ
の発現誘導機構の解析はＨＳＰに比べて大きく遅れてお
り、小胞体から核へのストレスシグナルの伝達経路およ
びＧＲＰ遺伝子の転写制御配列や転写調節因子について
はほとんど解明されていない。
【０００４】サッカロミセス セレビシエ（Saccharomy
ces cerevisiae）では、ストレスにより小胞体内にアン
フォールドタンパク質が蓄積すると、小胞体に存在する
Ｅｒｎ１ｐを介して情報が小胞体内腔から細胞質側、さ
らに核へ伝わり、転写調節因子（ＵＰＲＦ）が活性化さ
れ、最終的にＧＲＰ７８等小胞体内ストレスタンパク質
遺伝子の転写が誘導されることがこれまでに明らかにな
った（Mori,K.et al.,Cell 74,743-756(1993))。また、
酵母ＧＲＰ７８遺伝子のプローモーター上に小胞体スト
レスに応答するシス配列（ＵＰＲＥ）も同定された（Mo
ri,K.et al.,EMBO J.11,2583-2593(1992):Kohno,K.et a
l.,Mol.Cell.Biol.13,877-890(1993))。
ces cerevisiae）では、ストレスにより小胞体内にアン
フォールドタンパク質が蓄積すると、小胞体に存在する
Ｅｒｎ１ｐを介して情報が小胞体内腔から細胞質側、さ
らに核へ伝わり、転写調節因子（ＵＰＲＦ）が活性化さ
れ、最終的にＧＲＰ７８等小胞体内ストレスタンパク質
遺伝子の転写が誘導されることがこれまでに明らかにな
った（Mori,K.et al.,Cell 74,743-756(1993))。また、
酵母ＧＲＰ７８遺伝子のプローモーター上に小胞体スト
レスに応答するシス配列（ＵＰＲＥ）も同定された（Mo
ri,K.et al.,EMBO J.11,2583-2593(1992):Kohno,K.et a
l.,Mol.Cell.Biol.13,877-890(1993))。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】新規に合成された分泌
タンパク質や膜タンパク質は、小胞体内でペプチド鎖の
折り畳みやサブユニットの会合によるオリゴマータンパ
ク質の形成、ジスルフィド結合の形成により機能を持つ
タンパク質となり、ゴルジ体へ輸送される。小胞体での
このようなタンパク質の高次構造の形成は、小胞体内腔
の分子シャペロン及びフォールディング酵素の介在によ
り迅速かつ正確に進行すると考えられている。一方、組
換えＤＮＡにより有用外来タンパク質を宿主で分泌発現
させるとき、大量の外来タンパク質に対応するには小胞
体内の分子シャペロンあるいはフォールディング酵素が
不足し、正しい高次構造の形成ができずに小胞体内で分
解されたり蓄積することにより、目的のタンパク質を期
待通りに高レベルに発現させることができないことが多
かった。ＧＲＰを構成する分子シャペロン及びフォール
ディング酵素を量的に調節する技術は、有用外来タンパ
ク質の大量分泌発現を可能にする重要な技術である。
タンパク質や膜タンパク質は、小胞体内でペプチド鎖の
折り畳みやサブユニットの会合によるオリゴマータンパ
ク質の形成、ジスルフィド結合の形成により機能を持つ
タンパク質となり、ゴルジ体へ輸送される。小胞体での
このようなタンパク質の高次構造の形成は、小胞体内腔
の分子シャペロン及びフォールディング酵素の介在によ
り迅速かつ正確に進行すると考えられている。一方、組
換えＤＮＡにより有用外来タンパク質を宿主で分泌発現
させるとき、大量の外来タンパク質に対応するには小胞
体内の分子シャペロンあるいはフォールディング酵素が
不足し、正しい高次構造の形成ができずに小胞体内で分
解されたり蓄積することにより、目的のタンパク質を期
待通りに高レベルに発現させることができないことが多
かった。ＧＲＰを構成する分子シャペロン及びフォール
ディング酵素を量的に調節する技術は、有用外来タンパ
ク質の大量分泌発現を可能にする重要な技術である。
【０００６】従って、小胞体内にアンフォールドタンパ
ク質の蓄積を引き起こす、いわゆる小胞体ストレスによ
るＧＲＰ誘導の分子機構を明らかにすることにより、有
用外来タンパク質の大量分泌発現を可能にする技術を確
定することが求められる。本発明の第１の目的は、配列
表の配列番号：２又は３に記載のアミノ酸配列、又はそ
の一部であって、かつ、転写調節活性を有するポリペプ
チドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを提供するこ
とである。そして、本発明の第２の目的は、該ＤＮＡを
破壊したサッカロミセス セレビシエ変異株であるｅｒ
ｎ４Δを提供することである。さらに、本発明の第３の
目的は、該ＤＮＡを含む発現ベクターで酵母を形質転換
することにより酵母小胞体内の分子シャペロン及びフォ
ールディング酵素を制御する方法、ならびに、該ＤＮＡ
を含む発現ベクターと外来タンパク質発現ベクターで酵
母を形質転換することにより外来タンパク質を発現させ
る方法を提供することである。
ク質の蓄積を引き起こす、いわゆる小胞体ストレスによ
るＧＲＰ誘導の分子機構を明らかにすることにより、有
用外来タンパク質の大量分泌発現を可能にする技術を確
定することが求められる。本発明の第１の目的は、配列
表の配列番号：２又は３に記載のアミノ酸配列、又はそ
の一部であって、かつ、転写調節活性を有するポリペプ
チドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを提供するこ
とである。そして、本発明の第２の目的は、該ＤＮＡを
破壊したサッカロミセス セレビシエ変異株であるｅｒ
ｎ４Δを提供することである。さらに、本発明の第３の
目的は、該ＤＮＡを含む発現ベクターで酵母を形質転換
することにより酵母小胞体内の分子シャペロン及びフォ
ールディング酵素を制御する方法、ならびに、該ＤＮＡ
を含む発現ベクターと外来タンパク質発現ベクターで酵
母を形質転換することにより外来タンパク質を発現させ
る方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らはサ
ッカロミセス セレビシエを用いた解析においては遺伝
学的手法を駆使できることを利用して鋭意検討を重ね、
まずＧＲＰ遺伝子プロモーター上の小胞体ストレスに応
答するシス配列（ＵＰＲＥ）について詳細に解析し、こ
の知見をもとに小胞体ストレスタンパク質の誘導にかか
わる新規転写調節因子（ＵＰＲＦ）遺伝子（ＥＲＮ４と
命名）のクローニングに成功し、本発明を完成するに至
ったものである。
ッカロミセス セレビシエを用いた解析においては遺伝
学的手法を駆使できることを利用して鋭意検討を重ね、
まずＧＲＰ遺伝子プロモーター上の小胞体ストレスに応
答するシス配列（ＵＰＲＥ）について詳細に解析し、こ
の知見をもとに小胞体ストレスタンパク質の誘導にかか
わる新規転写調節因子（ＵＰＲＦ）遺伝子（ＥＲＮ４と
命名）のクローニングに成功し、本発明を完成するに至
ったものである。
【０００８】すなわち、本発明の要旨は、（１） 配列
表の配列番号：２に記載のアミノ酸配列、又はその一部
であって、かつ、転写調節活性を有するポリペプチドを
コードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、（２） 配列表の
配列番号：３に記載のアミノ酸配列、又はその一部であ
って、かつ、転写調節活性を有するポリペプチドをコー
ドするＤＮＡを含有するＤＮＡ、（３） 配列表の配列
番号：１に記載の塩基配列、又はその一部であって、か
つ、転写調節活性を有するポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを含有する前記（１）又は（２）記載のＤＮＡ、
（４） 配列表の配列番号：２に記載のアミノ酸配列、
又はその一部からなるアミノ酸配列において、１又は２
以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換の少な
くとも１つを生じさせ、かつ、転写調節活性を有するポ
リペプチドをコードするＤＮＡ、（５） 配列表の配列
番号：３に記載のアミノ酸配列、又はその一部からなる
アミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸残基の
欠失、付加、挿入又は置換の少なくとも１つを生じさ
せ、かつ、転写調節活性を有するポリペプチドをコード
するＤＮＡ、（６） 前記（１）〜（５）いずれか記載
のＤＮＡにハイブリダイズ可能なＤＮＡであって、か
つ、転写調節活性又はその機能的に同等の活性を有する
ポリペプチドをコードするＤＮＡ、（７） ＤＮＡがサ
ッカロミセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisia
e）の転写調節因子遺伝子ＥＲＮ４、又はその変異遺伝
子である前記（１）〜（６）いずれか記載のＤＮＡ、
（８） 前記（１）〜（７）いずれか記載のＤＮＡによ
りコードされるポリペプチド、（９） 酵母内で機能す
る転写調節因子の転写活性化ドメインと前記（８）記載
のポリペプチドとの融合タンパク質、（１０） 転写活
性化ドメインがサッカロミセス セレビシエの転写調節
因子Ｇａｌ４ｐの転写活性化ドメインＧａｌ４ｐ（ａ
ｄ）である前記（９）記載の融合タンパク質、（１１）
前記（９）又は（１０）記載の融合タンパク質をコー
ドするＤＮＡ、（１２） 前記（１）〜（７）又は（１
１）いずれか記載のＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ、
（１３） 前記（１２）記載の組換えＤＮＡを含有する
発現ベクター、（１４） 前記（８）記載のポリペプチ
ド又は前記（９）もしくは（１０）記載の融合タンパク
質と特異的に結合する抗体又はその断片、（１５） Ｅ
ＲＮ４遺伝子を破壊したサッカロミセス セレビシエ変
異株であるｅｒｎ４Δ、（１６） 前記（１３）記載の
発現ベクターで酵母を形質転換することを特徴とする酵
母小胞体内腔の分子シャペロン及びフォールディング酵
素を制御する方法、（１７） 酵母がＥＲＮ４遺伝子を
破壊した変異株ｅｒｎ４Δである前記（１６）記載の制
御方法、（１８） 前記（１３）記載の発現ベクターと
外来タンパク質発現ベクターで酵母を形質転換すること
を特徴とする外来タンパク質の発現方法、（１９） 酵
母がＥＲＮ４遺伝子を破壊した変異株ｅｒｎ４Δである
前記（１８）記載の外来タンパク質の発現方法、に関す
る。
表の配列番号：２に記載のアミノ酸配列、又はその一部
であって、かつ、転写調節活性を有するポリペプチドを
コードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、（２） 配列表の
配列番号：３に記載のアミノ酸配列、又はその一部であ
って、かつ、転写調節活性を有するポリペプチドをコー
ドするＤＮＡを含有するＤＮＡ、（３） 配列表の配列
番号：１に記載の塩基配列、又はその一部であって、か
つ、転写調節活性を有するポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを含有する前記（１）又は（２）記載のＤＮＡ、
（４） 配列表の配列番号：２に記載のアミノ酸配列、
又はその一部からなるアミノ酸配列において、１又は２
以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換の少な
くとも１つを生じさせ、かつ、転写調節活性を有するポ
リペプチドをコードするＤＮＡ、（５） 配列表の配列
番号：３に記載のアミノ酸配列、又はその一部からなる
アミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸残基の
欠失、付加、挿入又は置換の少なくとも１つを生じさ
せ、かつ、転写調節活性を有するポリペプチドをコード
するＤＮＡ、（６） 前記（１）〜（５）いずれか記載
のＤＮＡにハイブリダイズ可能なＤＮＡであって、か
つ、転写調節活性又はその機能的に同等の活性を有する
ポリペプチドをコードするＤＮＡ、（７） ＤＮＡがサ
ッカロミセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisia
e）の転写調節因子遺伝子ＥＲＮ４、又はその変異遺伝
子である前記（１）〜（６）いずれか記載のＤＮＡ、
（８） 前記（１）〜（７）いずれか記載のＤＮＡによ
りコードされるポリペプチド、（９） 酵母内で機能す
る転写調節因子の転写活性化ドメインと前記（８）記載
のポリペプチドとの融合タンパク質、（１０） 転写活
性化ドメインがサッカロミセス セレビシエの転写調節
因子Ｇａｌ４ｐの転写活性化ドメインＧａｌ４ｐ（ａ
ｄ）である前記（９）記載の融合タンパク質、（１１）
前記（９）又は（１０）記載の融合タンパク質をコー
ドするＤＮＡ、（１２） 前記（１）〜（７）又は（１
１）いずれか記載のＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ、
（１３） 前記（１２）記載の組換えＤＮＡを含有する
発現ベクター、（１４） 前記（８）記載のポリペプチ
ド又は前記（９）もしくは（１０）記載の融合タンパク
質と特異的に結合する抗体又はその断片、（１５） Ｅ
ＲＮ４遺伝子を破壊したサッカロミセス セレビシエ変
異株であるｅｒｎ４Δ、（１６） 前記（１３）記載の
発現ベクターで酵母を形質転換することを特徴とする酵
母小胞体内腔の分子シャペロン及びフォールディング酵
素を制御する方法、（１７） 酵母がＥＲＮ４遺伝子を
破壊した変異株ｅｒｎ４Δである前記（１６）記載の制
御方法、（１８） 前記（１３）記載の発現ベクターと
外来タンパク質発現ベクターで酵母を形質転換すること
を特徴とする外来タンパク質の発現方法、（１９） 酵
母がＥＲＮ４遺伝子を破壊した変異株ｅｒｎ４Δである
前記（１８）記載の外来タンパク質の発現方法、に関す
る。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明の転写調節活性を有するポ
リペプチドをコードするＤＮＡとは、ＤＮＡからｍＲＮ
Ａへの転写を活性化させたり、または抑制する活性を有
するポリペプチドをコードするＤＮＡであれば特に限定
されないが、例えば、配列表の配列番号：２又は３に記
載のアミノ酸配列、又はその一部をコードするＤＮＡで
あり、配列表の配列番号：１に記載の塩基配列、又はそ
の一部を有するＤＮＡである。また、配列表の配列番
号：２又は３に記載のアミノ酸配列、又はその一部から
なるアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸残
基の欠失、付加、挿入又は置換の少なくとも１つを生じ
させるポリペプチドをコードするＤＮＡでも構わない。
さらに、これらのＤＮＡにハイブリダイズ可能なＤＮＡ
も本発明のＤＮＡに含まれる。具体的には、サッカロミ
セス セレビシエの転写調節因子遺伝子ＥＲＮ４、又は
その変異遺伝子が挙げられる。
リペプチドをコードするＤＮＡとは、ＤＮＡからｍＲＮ
Ａへの転写を活性化させたり、または抑制する活性を有
するポリペプチドをコードするＤＮＡであれば特に限定
されないが、例えば、配列表の配列番号：２又は３に記
載のアミノ酸配列、又はその一部をコードするＤＮＡで
あり、配列表の配列番号：１に記載の塩基配列、又はそ
の一部を有するＤＮＡである。また、配列表の配列番
号：２又は３に記載のアミノ酸配列、又はその一部から
なるアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸残
基の欠失、付加、挿入又は置換の少なくとも１つを生じ
させるポリペプチドをコードするＤＮＡでも構わない。
さらに、これらのＤＮＡにハイブリダイズ可能なＤＮＡ
も本発明のＤＮＡに含まれる。具体的には、サッカロミ
セス セレビシエの転写調節因子遺伝子ＥＲＮ４、又は
その変異遺伝子が挙げられる。
【００１０】本発明のポリペプチドは、前記記載のＤＮ
Ａによりコードされ、転写調節活性を有するポリペプチ
ドであれば特に限定されるものではなく、酵母内で機能
する転写調節因子の転写活性化ドメイン（ａｄ）と該ポ
リペプチドとの融合タンパク質も含まれる。転写活性化
ドメインとしては、サッカロミセス セレビシエの転写
調節因子Ｇａｌ４ｐに由来するＧａｌ４ｐ（ａｄ）等が
好適である。
Ａによりコードされ、転写調節活性を有するポリペプチ
ドであれば特に限定されるものではなく、酵母内で機能
する転写調節因子の転写活性化ドメイン（ａｄ）と該ポ
リペプチドとの融合タンパク質も含まれる。転写活性化
ドメインとしては、サッカロミセス セレビシエの転写
調節因子Ｇａｌ４ｐに由来するＧａｌ４ｐ（ａｄ）等が
好適である。
【００１１】本発明の組換えＤＮＡは、前記記載の融合
タンパク質をコードするＤＮＡをも含めた本発明の転写
調節活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含
有するものである。
タンパク質をコードするＤＮＡをも含めた本発明の転写
調節活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含
有するものである。
【００１２】本発明の発現ベクターとは、本発明の組換
えＤＮＡを含有し、目的の宿主に導入され所望のタンパ
ク質を発現するものであれば、特に限定されない。
えＤＮＡを含有し、目的の宿主に導入され所望のタンパ
ク質を発現するものであれば、特に限定されない。
【００１３】本発明のポリペプチドと特異的に結合する
抗体は、例えば常法（Current Protocols in Immunolog
y (Coligan,J.E.et al.eds)2.4.1-2.4.7,John Wiley &
Sons,New York(1991))に従って該ポリペプチドを抗原と
してウサギ等に免疫した後、採血して抗血清として得る
ことができる。さらに、該ポリペプチドを抗原として、
常法（Cell & Tissue Culture;Laboratory Procedure(D
oyle,A.et al.,eds)25A:1-25C:4,John Wiley & Sons,Ne
w York(1994)) に従ってモノクローナル抗体として得る
こともできる。これらの抗体を精製後、プロテアーゼ消
化により生じた断片も本発明の抗体に含まれる。
抗体は、例えば常法（Current Protocols in Immunolog
y (Coligan,J.E.et al.eds)2.4.1-2.4.7,John Wiley &
Sons,New York(1991))に従って該ポリペプチドを抗原と
してウサギ等に免疫した後、採血して抗血清として得る
ことができる。さらに、該ポリペプチドを抗原として、
常法（Cell & Tissue Culture;Laboratory Procedure(D
oyle,A.et al.,eds)25A:1-25C:4,John Wiley & Sons,Ne
w York(1994)) に従ってモノクローナル抗体として得る
こともできる。これらの抗体を精製後、プロテアーゼ消
化により生じた断片も本発明の抗体に含まれる。
【００１４】本発明において、小胞体内腔の分子シャペ
ロンとは、標的タンパク質の折り畳みされていないまた
は一部折り畳みされた領域を一時的に安定化させ、不適
当な分子内または分子間の相互作用の形成を防止するも
ので、サッカロミセス セレビシエでは、ＧＲＰ７８
（大腸菌のＤｎａＫホモログ）とＳｃｊｌｐ（大腸菌の
ＤｎａＪホモログ）等が挙げられる。
ロンとは、標的タンパク質の折り畳みされていないまた
は一部折り畳みされた領域を一時的に安定化させ、不適
当な分子内または分子間の相互作用の形成を防止するも
ので、サッカロミセス セレビシエでは、ＧＲＰ７８
（大腸菌のＤｎａＫホモログ）とＳｃｊｌｐ（大腸菌の
ＤｎａＪホモログ）等が挙げられる。
【００１５】フォールディング酵素とは、ある種のタン
パク質の折り畳みの速度を限定する特異的な異性化を触
媒するアクセサリータンパク質の一群である。サッカロ
ミセス セレビシエでは、Ｐｄｉｌｐ（ジスルフィド結
合の形成促進）、Ｅｕｇｌｐ（ＰＤＩ〔プロテインジス
ルフィドイソメラーゼ〕１破壊株のマルチコピーサプレ
ッサー）、Ｆｋｂ２ｐ（プロリンのシス−トランス異性
化酵素）等が挙げられる。
パク質の折り畳みの速度を限定する特異的な異性化を触
媒するアクセサリータンパク質の一群である。サッカロ
ミセス セレビシエでは、Ｐｄｉｌｐ（ジスルフィド結
合の形成促進）、Ｅｕｇｌｐ（ＰＤＩ〔プロテインジス
ルフィドイソメラーゼ〕１破壊株のマルチコピーサプレ
ッサー）、Ｆｋｂ２ｐ（プロリンのシス−トランス異性
化酵素）等が挙げられる。
【００１６】サッカロミセス セレビシエの小胞体内ス
トレスタンパク質の誘導機構についてこれまでに明らか
になっていることは、次の３点である。 ｉ）誘導されるタンパク質は、分子シャペロンとして機
能すると考えられるＧＲＰ７８とＳｃｊｌｐおよびフォ
ールディング酵素であるＰｄｉｌｐ、Ｅｕｇｌｐ、Ｆｋ
ｂ２ｐの計５種類であること。 ii) ストレスにより小胞体内にアンフォールドタンパク
質が蓄積すると、小胞体に存在する膜貫通型糖タンパク
質であるＥｒｎｌｐが活性化され、情報が細胞質側に伝
達される（小胞体内の変化がＥｒｎｌｐの二量体化を促
進し、その結果Ｅｒｎｌｐの細胞質側に存在するリン酸
化酵素領域が活性化されて細胞質に存在する基質がリン
酸化される）こと。 iii) 細胞質側に伝えられた情報は何らかの機構により
核へ伝わり、転写調節因子ＵＰＲＦが活性化され、誘導
される遺伝子のプロモーター上に存在するシス配列ＵＰ
ＲＥを介して転写誘導が起こること。ＵＰＲＥはＧＲＰ
７８遺伝子のプロモーター上に存在し、誘導に関し必要
十分条件として機能する２２ｂｐの配列として同定され
ている（図１）。
トレスタンパク質の誘導機構についてこれまでに明らか
になっていることは、次の３点である。 ｉ）誘導されるタンパク質は、分子シャペロンとして機
能すると考えられるＧＲＰ７８とＳｃｊｌｐおよびフォ
ールディング酵素であるＰｄｉｌｐ、Ｅｕｇｌｐ、Ｆｋ
ｂ２ｐの計５種類であること。 ii) ストレスにより小胞体内にアンフォールドタンパク
質が蓄積すると、小胞体に存在する膜貫通型糖タンパク
質であるＥｒｎｌｐが活性化され、情報が細胞質側に伝
達される（小胞体内の変化がＥｒｎｌｐの二量体化を促
進し、その結果Ｅｒｎｌｐの細胞質側に存在するリン酸
化酵素領域が活性化されて細胞質に存在する基質がリン
酸化される）こと。 iii) 細胞質側に伝えられた情報は何らかの機構により
核へ伝わり、転写調節因子ＵＰＲＦが活性化され、誘導
される遺伝子のプロモーター上に存在するシス配列ＵＰ
ＲＥを介して転写誘導が起こること。ＵＰＲＥはＧＲＰ
７８遺伝子のプロモーター上に存在し、誘導に関し必要
十分条件として機能する２２ｂｐの配列として同定され
ている（図１）。
【００１７】（１）転写調節因子ＵＰＲＦのクローニン
グ そこでまずＵＰＲＥに関する詳細な構造活性相関を明ら
かにし、この情報をもとに、酵母を用いて転写調節因子
等のＤＮＡ結合タンパク質を遺伝学的にクローニングす
る方法であるワン−ハイブリッド（Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉ
ｄ）法により、ＵＰＲＦをクローニングする。
グ そこでまずＵＰＲＥに関する詳細な構造活性相関を明ら
かにし、この情報をもとに、酵母を用いて転写調節因子
等のＤＮＡ結合タンパク質を遺伝学的にクローニングす
る方法であるワン−ハイブリッド（Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉ
ｄ）法により、ＵＰＲＦをクローニングする。
【００１８】シス配列ＵＰＲＥの解析 レポータープラスミドは、酵母でよく用いられるＣＹＣ
１−ｌａｃＺ（チトクロームＣイソフォーム１プロモー
ターにβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を結合したもの）発
現プラスミドｐＬＧΔ−１７８（Guarente,L.and Maso
n,T. Cell 32,1279-1286(1983))を改良して使用する。
野生型（Ｙと命名）のＵＰＲＥをＣＹＣ１−ｌａｃＺの
上流に挿入し、酵母細胞に形質転換により導入する。ス
トレスとしてツニカマイシン（ＴＭ）を５μｇ／ｍｌの
濃度で添加して３時間培養する。ツニカマイシンは小胞
体内での新生タンパク質への糖鎖の付加過程を阻害する
ことにより、折り畳み構造の異常なタンパク質を蓄積さ
せ小胞体ストレスを惹起することが知られている。レポ
ータープラスミドが導入された形質転換体をストレス存
在下あるいは非存在下で培養し、細胞内で発現している
β−ガラクトシダーゼ活性を測定する。
１−ｌａｃＺ（チトクロームＣイソフォーム１プロモー
ターにβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を結合したもの）発
現プラスミドｐＬＧΔ−１７８（Guarente,L.and Maso
n,T. Cell 32,1279-1286(1983))を改良して使用する。
野生型（Ｙと命名）のＵＰＲＥをＣＹＣ１−ｌａｃＺの
上流に挿入し、酵母細胞に形質転換により導入する。ス
トレスとしてツニカマイシン（ＴＭ）を５μｇ／ｍｌの
濃度で添加して３時間培養する。ツニカマイシンは小胞
体内での新生タンパク質への糖鎖の付加過程を阻害する
ことにより、折り畳み構造の異常なタンパク質を蓄積さ
せ小胞体ストレスを惹起することが知られている。レポ
ータープラスミドが導入された形質転換体をストレス存
在下あるいは非存在下で培養し、細胞内で発現している
β−ガラクトシダーゼ活性を測定する。
【００１９】次に、ＵＰＲＥに関する詳細な構造活性相
関を知る目的で、２２ｂｐのＵＰＲＥ配列のうち１９の
塩基について点変異体を作製し、それらの活性を野生型
Ｙの場合と同様に測定する（図１）。その結果、１０〜
１２番目のＣＡＧと１４〜１６番目のＧＴＧに変異を導
入すると、ストレスを与えてもβ−ガラクトシダーゼ活
性の上昇があまり見られなくなり、ＵＰＲＥとしての活
性がほとんど失われる。ＣＡＧ−ＧＴＧという配列はい
わゆるＥボックス（ＣＡＮＮＴＧ）コンセンサス配列と
同じであることから、塩基性アミノ酸に富んだ領域をＤ
ＮＡ結合ドメインとして持つ転写調節因子がこの部分に
結合する可能性が高いと考えられる。ＣＡＧとＧＴＧの
間の１３番目のＣをＧ、Ａ、Ｔにそれぞれ置換させる
と、β−ガクトシダーゼ活性は低下する。また、ＣＡＧ
とＧＴＧの間のスペーシングを０にすると活性は７％程
度になり、逆にＣを挿入することによりスペーシングを
２以上にすると活性は完全に消失する（図２）。したが
って、ＣＡＧとＧＴＧの間にＣが１個だけ存在すること
がＵＰＲＥの活性に極めて重要である。
関を知る目的で、２２ｂｐのＵＰＲＥ配列のうち１９の
塩基について点変異体を作製し、それらの活性を野生型
Ｙの場合と同様に測定する（図１）。その結果、１０〜
１２番目のＣＡＧと１４〜１６番目のＧＴＧに変異を導
入すると、ストレスを与えてもβ−ガラクトシダーゼ活
性の上昇があまり見られなくなり、ＵＰＲＥとしての活
性がほとんど失われる。ＣＡＧ−ＧＴＧという配列はい
わゆるＥボックス（ＣＡＮＮＴＧ）コンセンサス配列と
同じであることから、塩基性アミノ酸に富んだ領域をＤ
ＮＡ結合ドメインとして持つ転写調節因子がこの部分に
結合する可能性が高いと考えられる。ＣＡＧとＧＴＧの
間の１３番目のＣをＧ、Ａ、Ｔにそれぞれ置換させる
と、β−ガクトシダーゼ活性は低下する。また、ＣＡＧ
とＧＴＧの間のスペーシングを０にすると活性は７％程
度になり、逆にＣを挿入することによりスペーシングを
２以上にすると活性は完全に消失する（図２）。したが
って、ＣＡＧとＧＴＧの間にＣが１個だけ存在すること
がＵＰＲＥの活性に極めて重要である。
【００２０】また、この領域は部分的にパリンドローム
構造になっている。表１に示すように、野生型Ｙでは４
ｂｐからなるパリンドロームである。１２番目のＧをＣ
に置換したり（１２Ｃ）、１９番目のＧをＣに置換した
り（１９Ｃ）、さらに、両方置換して７ｂｐからなる完
全なパリンドロームにする（ＵＹ）。これらの変異とβ
−ガラクトシダーゼ活性の相関を、ストレス存在下、非
存在下で調べる。ＵＹは、野生型Ｙの約２倍の活性を示
し、ＵＰＲＦは、パリンドロームを認識すると推定され
る。
構造になっている。表１に示すように、野生型Ｙでは４
ｂｐからなるパリンドロームである。１２番目のＧをＣ
に置換したり（１２Ｃ）、１９番目のＧをＣに置換した
り（１９Ｃ）、さらに、両方置換して７ｂｐからなる完
全なパリンドロームにする（ＵＹ）。これらの変異とβ
−ガラクトシダーゼ活性の相関を、ストレス存在下、非
存在下で調べる。ＵＹは、野生型Ｙの約２倍の活性を示
し、ＵＰＲＦは、パリンドロームを認識すると推定され
る。
【００２１】さらに、ＵＰＲＥの２〜４番目のＧＡＡの
部分も活性に重要な働きをしており、この部分に変異が
導入されると誘導活性がかなり低下する（図１）。以上
の結果から、ＵＰＲＥには２〜４番目のＧＡＡ、１０〜
１２番目のＣＡＧおよび１４〜１６番目のＧＴＧを中心
に認識する３つの転写調節因子が結合し、このうち１０
〜１６番目のＣＧＣＣＧＴＧ部分には塩基性アミノ酸に
富んだ領域をＤＮＡ結合ドメインとして持つ転写調節因
子がホモあるいはヘテロダイマーとして結合する可能性
が高いと推定される。
部分も活性に重要な働きをしており、この部分に変異が
導入されると誘導活性がかなり低下する（図１）。以上
の結果から、ＵＰＲＥには２〜４番目のＧＡＡ、１０〜
１２番目のＣＡＧおよび１４〜１６番目のＧＴＧを中心
に認識する３つの転写調節因子が結合し、このうち１０
〜１６番目のＣＧＣＣＧＴＧ部分には塩基性アミノ酸に
富んだ領域をＤＮＡ結合ドメインとして持つ転写調節因
子がホモあるいはヘテロダイマーとして結合する可能性
が高いと推定される。
【００２２】ＵＰＲＦのクローニング ＵＰＲＥに関する情報をもとに、まずＣＡＧＣＧＴＧに
結合するタンパク質をコードする遺伝子をクローニング
する手法としてワン−ハイブリッド法を選択する。ワン
−ハイブリッド法とは、酵母の転写調節因子Ｇａｌ４ｐ
の転写活性化ドメイン（ａｄ）との融合タンパク質を用
いて、酵母内でのレポーター遺伝子の活性化を指標とし
てＤＮＡ結合タンパク質をクローニングする方法であ
る。すなわち、レポーターの上流にＵＰＲＦが認識する
配列ＵＰＲＥを挿入しておけば、ＵＰＲＦがＧａｌ４ｐ
の転写活性化ドメインと融合タンパク質を形成した場
合、この融合タンパク質はレポーター遺伝子の転写をス
トレスにかかわりなく構成的に活性化すると考えられ
る。レポーター遺伝子として酵母ＨＩＳ３を用いれば、
目的の融合タンパク質を発現した細胞は培地中にヒスチ
ジンが無くても生育することができ、さらにＨＩＳ３の
発現量が高ければ、3-アミノトリアゾール（ＨＩＳ３遺
伝子産物の拮抗的阻害剤) に対し抵抗性を獲得すること
ができる。ただし得られたクローンの中にはＵＰＲＥに
特異的ではなく、もっと一般的に転写を促進するものも
含まれていると思われる。これらをスクリーニングの早
い段階で排除するため、もう一つのネガティブなレポー
ターとしてｌａｃＺを用い、その上流にＵＰＲＦが認識
しない変異体のシス配列ＵＰＲＥを挿入しておく。目的
とするクローンはＨＩＳ３の転写を促進し薬物抵抗性を
細胞に与えるがｌａｃＺの転写は促進せず、細胞内のβ
- ガラクトシダーゼ活性は低いままであるという表現型
を示すことが期待される。
結合するタンパク質をコードする遺伝子をクローニング
する手法としてワン−ハイブリッド法を選択する。ワン
−ハイブリッド法とは、酵母の転写調節因子Ｇａｌ４ｐ
の転写活性化ドメイン（ａｄ）との融合タンパク質を用
いて、酵母内でのレポーター遺伝子の活性化を指標とし
てＤＮＡ結合タンパク質をクローニングする方法であ
る。すなわち、レポーターの上流にＵＰＲＦが認識する
配列ＵＰＲＥを挿入しておけば、ＵＰＲＦがＧａｌ４ｐ
の転写活性化ドメインと融合タンパク質を形成した場
合、この融合タンパク質はレポーター遺伝子の転写をス
トレスにかかわりなく構成的に活性化すると考えられ
る。レポーター遺伝子として酵母ＨＩＳ３を用いれば、
目的の融合タンパク質を発現した細胞は培地中にヒスチ
ジンが無くても生育することができ、さらにＨＩＳ３の
発現量が高ければ、3-アミノトリアゾール（ＨＩＳ３遺
伝子産物の拮抗的阻害剤) に対し抵抗性を獲得すること
ができる。ただし得られたクローンの中にはＵＰＲＥに
特異的ではなく、もっと一般的に転写を促進するものも
含まれていると思われる。これらをスクリーニングの早
い段階で排除するため、もう一つのネガティブなレポー
ターとしてｌａｃＺを用い、その上流にＵＰＲＦが認識
しない変異体のシス配列ＵＰＲＥを挿入しておく。目的
とするクローンはＨＩＳ３の転写を促進し薬物抵抗性を
細胞に与えるがｌａｃＺの転写は促進せず、細胞内のβ
- ガラクトシダーゼ活性は低いままであるという表現型
を示すことが期待される。
【００２３】図３に示すように、ポジティブなレポータ
ーとしてＵＰＲＥ（ＵＹ）−ＰERN1−ＨＩＳ３、ネガテ
ィブなレポーターとしてＵＰＲＥ（Ｔｖ１０）−ＰERNI
−ｌａｃＺを１つのプラスミド内に構築し（ｐＲＣＥ４
と命名）、ＵＲＡ３遺伝子を用いた相同的組み換えによ
り宿主細胞のＥＲＮ１破壊株（ｅｒｎ１Δ）の染色体中
に組み込む。ＥＲＮ１破壊株では小胞体から核への情報
伝達経路が遮断されているため、融合タンパク質が小胞
体内へ移行して小胞体ストレスとなった場合でも内在性
のＵＰＲＦを活性化することはなく、バックグラウンド
を低く押さえることができる。ＵＰＲＦはＵＰＲＥ（Ｕ
Ｙ）には野生型のＹよりも強く結合するが、ＵＰＲＥ
（Ｔｖ１０）にはほとんど結合しない。プロモーターと
しては基礎転写活性の低いＥＲＮ１の上流約３００ｂｐ
（ＰERNI) を用いる。得られた形質転換体をスクリーニ
ングし、ｕｒａ３−５２遺伝子座に組み込まれたｐＲＣ
Ｅ４を１コピー有するＹＨＣＥ４株を得る。
ーとしてＵＰＲＥ（ＵＹ）−ＰERN1−ＨＩＳ３、ネガテ
ィブなレポーターとしてＵＰＲＥ（Ｔｖ１０）−ＰERNI
−ｌａｃＺを１つのプラスミド内に構築し（ｐＲＣＥ４
と命名）、ＵＲＡ３遺伝子を用いた相同的組み換えによ
り宿主細胞のＥＲＮ１破壊株（ｅｒｎ１Δ）の染色体中
に組み込む。ＥＲＮ１破壊株では小胞体から核への情報
伝達経路が遮断されているため、融合タンパク質が小胞
体内へ移行して小胞体ストレスとなった場合でも内在性
のＵＰＲＦを活性化することはなく、バックグラウンド
を低く押さえることができる。ＵＰＲＦはＵＰＲＥ（Ｕ
Ｙ）には野生型のＹよりも強く結合するが、ＵＰＲＥ
（Ｔｖ１０）にはほとんど結合しない。プロモーターと
しては基礎転写活性の低いＥＲＮ１の上流約３００ｂｐ
（ＰERNI) を用いる。得られた形質転換体をスクリーニ
ングし、ｕｒａ３−５２遺伝子座に組み込まれたｐＲＣ
Ｅ４を１コピー有するＹＨＣＥ４株を得る。
【００２４】米国ヒューストンのエリッジ博士（Ｄｒ．
Ｅｌｌｅｄｇｅ）によって作製された酵母のｃＤＮＡラ
イブラリーを入手し、図４のｐＡＣＴベクターのＧａｌ
４ｐ（ａｄ）をコードするＤＮＡの下流に該ｃＤＮＡを
挿入したプラスミドでＹＨＣＥ４株を形質転換し、Ｈｉ
ｓ+ とβ−ガラクトシダーゼ活性の二重スクリーニング
及びシークエンスにより、目的のｃＤＮＡを単離する。
Ｅｌｌｅｄｇｅ）によって作製された酵母のｃＤＮＡラ
イブラリーを入手し、図４のｐＡＣＴベクターのＧａｌ
４ｐ（ａｄ）をコードするＤＮＡの下流に該ｃＤＮＡを
挿入したプラスミドでＹＨＣＥ４株を形質転換し、Ｈｉ
ｓ+ とβ−ガラクトシダーゼ活性の二重スクリーニング
及びシークエンスにより、目的のｃＤＮＡを単離する。
【００２５】つぎに、この遺伝子がコードするタンパク
質のＤＮＡ結合特異性が図１、２および表１で示した内
在性のＵＰＲＦの特異性と一致するかどうかを調べる。
Ｇａｌ４ｐ（ａｄ）とこの遺伝子産物との融合タンパク
質を発現するｐＡＣＴベクターと、種々のＵＰＲＥをＣ
ＹＣ１−ｌａｃＺの上流に持つレポーター遺伝子とを共
に酵母細胞に導入し、構成的に発現されたβ−ガラクト
シダーゼ活性を測定する（図５）。この遺伝子産物のＵ
ＰＲＥ特異的結合性はＵＰＲＦとしての期待されるもの
とよく一致する。
質のＤＮＡ結合特異性が図１、２および表１で示した内
在性のＵＰＲＦの特異性と一致するかどうかを調べる。
Ｇａｌ４ｐ（ａｄ）とこの遺伝子産物との融合タンパク
質を発現するｐＡＣＴベクターと、種々のＵＰＲＥをＣ
ＹＣ１−ｌａｃＺの上流に持つレポーター遺伝子とを共
に酵母細胞に導入し、構成的に発現されたβ−ガラクト
シダーゼ活性を測定する（図５）。この遺伝子産物のＵ
ＰＲＥ特異的結合性はＵＰＲＦとしての期待されるもの
とよく一致する。
【００２６】このＵＰＲＥ結合性を示す遺伝子産物であ
るＥｒｎ４ｐは、配列番号：２記載の２３０個のアミノ
酸からなり、図４に示すようにＮ末端側に塩基性領域−
ロイシンジッパー構造を有する転写調節因子であると考
えられ、活性の面でも構造の面でもＵＰＲＦとして期待
されるものとよく一致していることから、この遺伝子を
ＥＲＮ４と名付ける。
るＥｒｎ４ｐは、配列番号：２記載の２３０個のアミノ
酸からなり、図４に示すようにＮ末端側に塩基性領域−
ロイシンジッパー構造を有する転写調節因子であると考
えられ、活性の面でも構造の面でもＵＰＲＦとして期待
されるものとよく一致していることから、この遺伝子を
ＥＲＮ４と名付ける。
【００２７】ｐＡＣＴライブラリーから単離したＥＲＮ
４ｃＤＮＡを使用して、マルチコピー酵母ベクターであ
るＹＥｐ１３上に構築された酵母のゲノムライブラリー
（ＡＴＣＣ３７３２３；Nasmyth,K.A. and Reed,S.I.,P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 77,2119-2123(1980)）をスクリ
ーニングすることによりゲノムＥＲＮ４ＤＮＡを得る。
得られたクローンをＤＮＡシークエンサーで合成オリゴ
ヌクレオチドプライマーを使用して、タンパク質をコー
ドする領域の配列を決定する。配列番号：１記載のＥＲ
Ｎ４遺伝子は、塩基番号１０３７番目のＡＴＧから翻訳
を開始し、１７２７番目のＴＧＡの終止コドンで翻訳を
終了する。配列番号：１記載の全ＥＲＮ４遺伝子を含む
２．５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＮＩ断片をＹＣｐ−Ｌ
２に接続し、ＹＣｐ−ＥＲＮ４を作製する。ＹＣｐ−Ｌ
２は、ＬＥＵ２選択マーカーを含むＣＥＮ４−ＡＲＳ１
ベースのシングルコピーの酵母ベクターであり、ｐＳＢ
３２（Rose,M.D.and Broach,J.R.,Meth.Enzymol.194,19
5-230(1991)) の０．５３ｋｂのＨｉｎｄIII −Ｓｐｈ
Ｉ断片をｐＵＣ１１９のマルチクローニング部位に置換
することにより構築する。ＹＣｐ−ＥＲＮ１は、公知の
ｐＥＲＮ１ＢＣと同一である（Mori,K.et al,Cell 74,7
43-756(1993)）。
４ｃＤＮＡを使用して、マルチコピー酵母ベクターであ
るＹＥｐ１３上に構築された酵母のゲノムライブラリー
（ＡＴＣＣ３７３２３；Nasmyth,K.A. and Reed,S.I.,P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 77,2119-2123(1980)）をスクリ
ーニングすることによりゲノムＥＲＮ４ＤＮＡを得る。
得られたクローンをＤＮＡシークエンサーで合成オリゴ
ヌクレオチドプライマーを使用して、タンパク質をコー
ドする領域の配列を決定する。配列番号：１記載のＥＲ
Ｎ４遺伝子は、塩基番号１０３７番目のＡＴＧから翻訳
を開始し、１７２７番目のＴＧＡの終止コドンで翻訳を
終了する。配列番号：１記載の全ＥＲＮ４遺伝子を含む
２．５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＮＩ断片をＹＣｐ−Ｌ
２に接続し、ＹＣｐ−ＥＲＮ４を作製する。ＹＣｐ−Ｌ
２は、ＬＥＵ２選択マーカーを含むＣＥＮ４−ＡＲＳ１
ベースのシングルコピーの酵母ベクターであり、ｐＳＢ
３２（Rose,M.D.and Broach,J.R.,Meth.Enzymol.194,19
5-230(1991)) の０．５３ｋｂのＨｉｎｄIII −Ｓｐｈ
Ｉ断片をｐＵＣ１１９のマルチクローニング部位に置換
することにより構築する。ＹＣｐ−ＥＲＮ１は、公知の
ｐＥＲＮ１ＢＣと同一である（Mori,K.et al,Cell 74,7
43-756(1993)）。
【００２８】（２）ＥＲＮ４破壊サッカロミセス セレ
ビシエ変異株（ｅｒｎ４△）の作製 染色体上のＥＲＮ１及びＥＲＮ４遺伝子を公知の方法に
より破壊する（Rothstein,R.,Meth.Enzymol.194,281-30
1(1991))。ＥＲＮ１の中央のＳａｌＩ−ＳａｃＩ断片
（アミノ酸配列１−７４７に相当）又はＥＲＮ４の中央
のＳｐｅＩ−ＭｆｅＩ断片（アミノ酸配列１１−２１５
に相当）を酵母ＴＲＰ１遺伝子に置換することにより、
それぞれｐＫＯＥ１ＴＲＰ又はｐＫＯＥ４ＴＲＰを作製
する。該プラスミドを直鎖状にし、ＳＥＣ+ 及びｓｅｃ
５３ハプロイド細胞を形質転換後、Ｔｒｐ+ の形質転換
体を単離し、適当なプローブを用いてサザン分析により
破壊を確認する。１段階の相同的組換えによりＥＲＮ４
破壊株の作製を試みたところ、ハプロイド細胞でも破壊
株を得ることができたことからＥＲＮ４は必須遺伝子で
はないことがわかる。
ビシエ変異株（ｅｒｎ４△）の作製 染色体上のＥＲＮ１及びＥＲＮ４遺伝子を公知の方法に
より破壊する（Rothstein,R.,Meth.Enzymol.194,281-30
1(1991))。ＥＲＮ１の中央のＳａｌＩ−ＳａｃＩ断片
（アミノ酸配列１−７４７に相当）又はＥＲＮ４の中央
のＳｐｅＩ−ＭｆｅＩ断片（アミノ酸配列１１−２１５
に相当）を酵母ＴＲＰ１遺伝子に置換することにより、
それぞれｐＫＯＥ１ＴＲＰ又はｐＫＯＥ４ＴＲＰを作製
する。該プラスミドを直鎖状にし、ＳＥＣ+ 及びｓｅｃ
５３ハプロイド細胞を形質転換後、Ｔｒｐ+ の形質転換
体を単離し、適当なプローブを用いてサザン分析により
破壊を確認する。１段階の相同的組換えによりＥＲＮ４
破壊株の作製を試みたところ、ハプロイド細胞でも破壊
株を得ることができたことからＥＲＮ４は必須遺伝子で
はないことがわかる。
【００２９】つぎに、ハプロイド細胞を用いてＥＲＮ４
破壊株でストレスによるリポーター遺伝子の活性化が起
こるかどうかを調べる。図６に示すように、野生株（Ｅ
ＲＮ+ ）ではツニカマイシン添加によりＵＰＲＥ（Ｙ）
−ＣＹＣ１−ｌａｃＺレポーター遺伝子から発現される
β−ガラクトシダーゼ活性が約１０倍誘導されるのに対
し、ＥＲＮ１破壊株（ｅｒｎｌ△）の場合と同様に、Ｅ
ＲＮ４破壊株（ｅｒｎ４△）でも全く誘導が見られな
い。また、ＥＲＮ１はイノシトール要求性変異株を相補
する遺伝子として単離されたＩＲＥ１と同一のものであ
り、ＥＲＮ１破壊株は、至適な生育のためにイノシトー
ル要求性を示す。そこで、６００ｎｍにおける吸光度
（Ａ600 ）が０．１になるように水で希釈した細胞懸濁
液をイノシトールを含まない培地上にスポットして調べ
たところ、ＥＲＮ４破壊株もシノシトール要求性を示す
（図６）。
破壊株でストレスによるリポーター遺伝子の活性化が起
こるかどうかを調べる。図６に示すように、野生株（Ｅ
ＲＮ+ ）ではツニカマイシン添加によりＵＰＲＥ（Ｙ）
−ＣＹＣ１−ｌａｃＺレポーター遺伝子から発現される
β−ガラクトシダーゼ活性が約１０倍誘導されるのに対
し、ＥＲＮ１破壊株（ｅｒｎｌ△）の場合と同様に、Ｅ
ＲＮ４破壊株（ｅｒｎ４△）でも全く誘導が見られな
い。また、ＥＲＮ１はイノシトール要求性変異株を相補
する遺伝子として単離されたＩＲＥ１と同一のものであ
り、ＥＲＮ１破壊株は、至適な生育のためにイノシトー
ル要求性を示す。そこで、６００ｎｍにおける吸光度
（Ａ600 ）が０．１になるように水で希釈した細胞懸濁
液をイノシトールを含まない培地上にスポットして調べ
たところ、ＥＲＮ４破壊株もシノシトール要求性を示す
（図６）。
【００３０】さらに、ＥＲＮ４破壊株で失われたβ−ガ
ラクトシダーゼ誘導活性が本当にＥＲＮ４によるものか
どうか確かめるため、前述のＥＲＮ４をシングルコピー
ベクターに入れたプラスミドＹＣｐ−ＥＲＮ４をＥＲＮ
４破壊株に導入する。野生株（ＥＲＮ+ ）にシングルコ
ピーベクターのみのＹＣｐ−Ｖを導入したものを対照と
すると、ＥＲＮ４破壊株（ｅｒｎ４Δ）にＹＣｐ−Ｖを
導入しても全く変化が見られないが、ＥＲＮ４破壊株に
ＹＣｐ−ＥＲＮ４を導入すると誘導活性は野生株のレベ
ルまで完全に回復する（図７）。ＥＲＮ４破壊株の示す
イノシトール要求性も、ＹＣｐ−ＥＲＮ４により完全に
相補される。よって、ＥＲＮ４の産物（Ｅｒｎ４ｐ）が
ＵＰＲＦを構成する転写調節因子である。また、ＥＲＮ
４破壊株にＥＲＮ１をマルチコピーで導入しても（ＹＥ
ｐ−ＥＲＮ１）、誘導活性もイノシトール要求性も回復
しない（図７）。
ラクトシダーゼ誘導活性が本当にＥＲＮ４によるものか
どうか確かめるため、前述のＥＲＮ４をシングルコピー
ベクターに入れたプラスミドＹＣｐ−ＥＲＮ４をＥＲＮ
４破壊株に導入する。野生株（ＥＲＮ+ ）にシングルコ
ピーベクターのみのＹＣｐ−Ｖを導入したものを対照と
すると、ＥＲＮ４破壊株（ｅｒｎ４Δ）にＹＣｐ−Ｖを
導入しても全く変化が見られないが、ＥＲＮ４破壊株に
ＹＣｐ−ＥＲＮ４を導入すると誘導活性は野生株のレベ
ルまで完全に回復する（図７）。ＥＲＮ４破壊株の示す
イノシトール要求性も、ＹＣｐ−ＥＲＮ４により完全に
相補される。よって、ＥＲＮ４の産物（Ｅｒｎ４ｐ）が
ＵＰＲＦを構成する転写調節因子である。また、ＥＲＮ
４破壊株にＥＲＮ１をマルチコピーで導入しても（ＹＥ
ｐ−ＥＲＮ１）、誘導活性もイノシトール要求性も回復
しない（図７）。
【００３１】一方、ＥＲＮ１破壊株（ｅｒｎｌ△）で失
われた誘導活性は、シングルコピーベクターに入れたＥ
ＲＮ１遺伝子ＹＣｐ−ＥＲＮ１により完全に回復する
（図７）。ＥＲＮ１破壊株にＥＲＮ４をマルチコピーで
導入すると、（ＹＥｐ−ＥＲＮ４）、誘導活性の方は全
く回復されないのに対し（図７）、イノシトール要求性
の方は完全ではないが回復し、イノシトール要求性に関
しては、ＥＲＮ４がＥＲＮ１破壊株のマルチコピーサプ
レッサーとして機能することがわかる。誘導活性の消失
はイノシトール要求性をいつも伴っているが、細かいと
ころでの機構はかなり異なっていると考えられる。
われた誘導活性は、シングルコピーベクターに入れたＥ
ＲＮ１遺伝子ＹＣｐ−ＥＲＮ１により完全に回復する
（図７）。ＥＲＮ１破壊株にＥＲＮ４をマルチコピーで
導入すると、（ＹＥｐ−ＥＲＮ４）、誘導活性の方は全
く回復されないのに対し（図７）、イノシトール要求性
の方は完全ではないが回復し、イノシトール要求性に関
しては、ＥＲＮ４がＥＲＮ１破壊株のマルチコピーサプ
レッサーとして機能することがわかる。誘導活性の消失
はイノシトール要求性をいつも伴っているが、細かいと
ころでの機構はかなり異なっていると考えられる。
【００３２】（３）ＧＡＬ４（ａｄ）−ＥＲＮ４遺伝子
によるアンフォールドタンパク質応答過程の構成的な活
性化 ＳＥＣ+ のＥＲＮ+ 、ｅｒｎ１Δ及びｅｒｎ４Δ株に、
ｐＡＣＴベクターのみまたはＥＲＮ４をＧＡＬ４（ａ
ｄ）にフレームを合わせた遺伝子を含むｐＡＣＴ発現ベ
クターと、種々のＵＡＳ（上流の活性化配列）を挿入し
たｐＳＣＺレポータープラスミドとを共に導入し、得ら
れる形質転換体をストレス処理をせずにＣＹＣ１−ｌａ
ｃＺ遺伝子より発現したβ−ガラクトシダーゼの活性を
測定する（図５）。また、イムノブロッティング法によ
りそれぞれの形質転換体の培養物から抽出した総タンパ
ク質（５０μｇ）中のＫａｒ２ｐ（ＧＲＰ７８）とＰｄ
ｉ１ｐの量を決定する（図５）。ＧＡＬ４（ａｄ）−Ｅ
ＲＮ４遺伝子を発現させることにより、ＵＰＲＥ（Ｙ）
及びＵＰＲＥ（ＵＹ）を上流にもつβ−ガラクトシダー
ゼがストレス非存在下でも活性化され、Ｋａｒ２ｐ（Ｇ
ＲＰ７８）とＰｄｉ１ｐの発現も誘導される。
によるアンフォールドタンパク質応答過程の構成的な活
性化 ＳＥＣ+ のＥＲＮ+ 、ｅｒｎ１Δ及びｅｒｎ４Δ株に、
ｐＡＣＴベクターのみまたはＥＲＮ４をＧＡＬ４（ａ
ｄ）にフレームを合わせた遺伝子を含むｐＡＣＴ発現ベ
クターと、種々のＵＡＳ（上流の活性化配列）を挿入し
たｐＳＣＺレポータープラスミドとを共に導入し、得ら
れる形質転換体をストレス処理をせずにＣＹＣ１−ｌａ
ｃＺ遺伝子より発現したβ−ガラクトシダーゼの活性を
測定する（図５）。また、イムノブロッティング法によ
りそれぞれの形質転換体の培養物から抽出した総タンパ
ク質（５０μｇ）中のＫａｒ２ｐ（ＧＲＰ７８）とＰｄ
ｉ１ｐの量を決定する（図５）。ＧＡＬ４（ａｄ）−Ｅ
ＲＮ４遺伝子を発現させることにより、ＵＰＲＥ（Ｙ）
及びＵＰＲＥ（ＵＹ）を上流にもつβ−ガラクトシダー
ゼがストレス非存在下でも活性化され、Ｋａｒ２ｐ（Ｇ
ＲＰ７８）とＰｄｉ１ｐの発現も誘導される。
【００３３】（４）ＥＲＮ４遺伝子産物の小胞体から核
へのシグナル伝達のための必要性 シングルコピーのＵＰＲＥ（Ｙ）−ＣＹＣ１−ｌａｃＺ
レポーター遺伝子を有するＳＥＣ+ のＥＲＮ+ 株、ｅｒ
ｎ１Δ株及びｅｒｎ４Δ株を、ツニカマイシン（５μｇ
／ｍｌ）の存在下、非存在下で３時間インキュベート
し、β−ガラクトシダーゼ活性を測定する（図６）。培
養物の２μｌをイノシトールを含むまたは含まないＳＣ
（−Ｕｒａ）プレート上にスポットし、２日間３０℃で
インキュベートすると、２つの変異株（ｅｒｎ１Δ及び
ｅｒｎ４Δ株）がイノシトール要求性を示す（図６）。
へのシグナル伝達のための必要性 シングルコピーのＵＰＲＥ（Ｙ）−ＣＹＣ１−ｌａｃＺ
レポーター遺伝子を有するＳＥＣ+ のＥＲＮ+ 株、ｅｒ
ｎ１Δ株及びｅｒｎ４Δ株を、ツニカマイシン（５μｇ
／ｍｌ）の存在下、非存在下で３時間インキュベート
し、β−ガラクトシダーゼ活性を測定する（図６）。培
養物の２μｌをイノシトールを含むまたは含まないＳＣ
（−Ｕｒａ）プレート上にスポットし、２日間３０℃で
インキュベートすると、２つの変異株（ｅｒｎ１Δ及び
ｅｒｎ４Δ株）がイノシトール要求性を示す（図６）。
【００３４】次に、ｓｅｃ５３のＥＲＮ+ 、ｅｒｎ１Δ
及びｅｒｎ４Δ株を２３℃（許容温度）で培養し、対数
増殖期の一部を１時間２３℃（小胞体内のアンフォール
ドタンパク質の蓄積なし（−））または小胞体内にアン
フォールドタンパク質が蓄積（＋）する３０℃（半−非
許容温度）で培養し、全ＲＮＡを抽出する。ＫＡＲ２
（ＧＲＰ７８）、ＳＣＪ１、ＰＤＩ１、ＥＵＧ１、ＦＫ
Ｂ２、ｌａｃＺ及びＡＣＴ１（酵母アクチン）に特異的
なＤＮＡプローブを用いて、ノーザンハイブリダイゼー
ション法により分析する（図８）。ＥＲＮ+ 株では、小
胞体内のアンフォールドタンパク質の蓄積によりＫＡＲ
２（ＧＲＰ７８）、ＳＣＪ１、ＰＤＩ１、ＥＵＧ１及び
ＦＫＢ２のＲＮＡの転写が誘導されたのに比べ、ｅｒｎ
１Δ及びｅｒｎ４Δ株ではこれらのＲＮＡの転写は誘導
されない。
及びｅｒｎ４Δ株を２３℃（許容温度）で培養し、対数
増殖期の一部を１時間２３℃（小胞体内のアンフォール
ドタンパク質の蓄積なし（−））または小胞体内にアン
フォールドタンパク質が蓄積（＋）する３０℃（半−非
許容温度）で培養し、全ＲＮＡを抽出する。ＫＡＲ２
（ＧＲＰ７８）、ＳＣＪ１、ＰＤＩ１、ＥＵＧ１、ＦＫ
Ｂ２、ｌａｃＺ及びＡＣＴ１（酵母アクチン）に特異的
なＤＮＡプローブを用いて、ノーザンハイブリダイゼー
ション法により分析する（図８）。ＥＲＮ+ 株では、小
胞体内のアンフォールドタンパク質の蓄積によりＫＡＲ
２（ＧＲＰ７８）、ＳＣＪ１、ＰＤＩ１、ＥＵＧ１及び
ＦＫＢ２のＲＮＡの転写が誘導されたのに比べ、ｅｒｎ
１Δ及びｅｒｎ４Δ株ではこれらのＲＮＡの転写は誘導
されない。
【００３５】（５）小胞体ストレスに対する防御におけ
るＥＲＮ４遺伝子の欠失の影響 シングルコピーのＵＰＲＥ（Ｙ）−ＣＹＣ１−ｌａｃＺ
レポーター遺伝子及びシングルコピーの（ＹＣｐ）発現
プラスミドを有するｓｅｃ５３のＥＲＮ+ 株、ｅｒｎ１
Δ株及びｅｒｎ４Δ株を、ＳＣ（−Ｕｒａ，Ｌｅｕ）培
地中２３℃で一晩培養し、培養物をＯＤ600 が約０．２
になるように希釈し、さらに３０℃でインキュベートす
る。０〜１０時間の２時間ごとにβ−ガラクトシダーゼ
活性と生存細胞の比率を測定する（図９）。次に、２時
間ごとに採取した試料由来の総タンパク質の１０μｇを
用いて、イムノブロッティング法によりＫａｒ２ｐ及び
Ｐｄｉ１ｐを検出する（図１０）。ｅｒｎ４Δ株では、
外来性のＥｒｎ４ｐを発現させることにより、小胞体ス
トレスから細胞を防御できる。
るＥＲＮ４遺伝子の欠失の影響 シングルコピーのＵＰＲＥ（Ｙ）−ＣＹＣ１−ｌａｃＺ
レポーター遺伝子及びシングルコピーの（ＹＣｐ）発現
プラスミドを有するｓｅｃ５３のＥＲＮ+ 株、ｅｒｎ１
Δ株及びｅｒｎ４Δ株を、ＳＣ（−Ｕｒａ，Ｌｅｕ）培
地中２３℃で一晩培養し、培養物をＯＤ600 が約０．２
になるように希釈し、さらに３０℃でインキュベートす
る。０〜１０時間の２時間ごとにβ−ガラクトシダーゼ
活性と生存細胞の比率を測定する（図９）。次に、２時
間ごとに採取した試料由来の総タンパク質の１０μｇを
用いて、イムノブロッティング法によりＫａｒ２ｐ及び
Ｐｄｉ１ｐを検出する（図１０）。ｅｒｎ４Δ株では、
外来性のＥｒｎ４ｐを発現させることにより、小胞体ス
トレスから細胞を防御できる。
【００３６】（６）Ｅｒｎ４ｐ−融合タンパク質の発
現、精製及びＵＰＲＥへの特異的結合 ＥＲＮ４の０．８ｋｂのＳｐｅＩ−ＨｉｎｄIII 断片(
アミノ酸配列１０−２３０に相当）を、プラスミドｐＧ
ＥＸ−２ＴＫ（ファルマシア社製）上のグルタチオンＳ
−トランスフェラーゼをコードする塩基配列、又はプラ
スミドｐＭＡＬ−ｃ２（ニューイングランドバイオラブ
ズ社製）上のマルトース結合タンパク質をコードする塩
基配列の３' 末端にフレームを合わせて融合させ、それ
ぞれＧＳＴ−Ｅｒｎ４ｐ、ＭＢＰ−Ｅｒｎ４ｐを発現さ
せる。両融合タンパク質は、１ｍＭのイソプロピルβ−
Ｄ−チオガラクトピラノシドで誘導させると、大腸菌で
効率よく発現し、アフィニティークロマトグラフィーに
より精製する。
現、精製及びＵＰＲＥへの特異的結合 ＥＲＮ４の０．８ｋｂのＳｐｅＩ−ＨｉｎｄIII 断片(
アミノ酸配列１０−２３０に相当）を、プラスミドｐＧ
ＥＸ−２ＴＫ（ファルマシア社製）上のグルタチオンＳ
−トランスフェラーゼをコードする塩基配列、又はプラ
スミドｐＭＡＬ−ｃ２（ニューイングランドバイオラブ
ズ社製）上のマルトース結合タンパク質をコードする塩
基配列の３' 末端にフレームを合わせて融合させ、それ
ぞれＧＳＴ−Ｅｒｎ４ｐ、ＭＢＰ−Ｅｒｎ４ｐを発現さ
せる。両融合タンパク質は、１ｍＭのイソプロピルβ−
Ｄ−チオガラクトピラノシドで誘導させると、大腸菌で
効率よく発現し、アフィニティークロマトグラフィーに
より精製する。
【００３７】ＵＰＲＥ（Ｙ，Ｔｖ１０，ＵＹ及びＴｖ２
３４（ＵＰＲＥの２〜４番目の三重変異体））並びにＣ
ＲＥをコードする二本鎖の合成オリゴヌクレオチドの５
' 及び３' 両末端を、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎ
ｏｗ断片と[ α−32Ｐ] ｄＡＴＰを用いて放射標識し、
８％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動により精製す
る。０．２５〜０．３ｎｇの放射標識プローブ（８，０
００〜１０，０００ｃｐｍ）、１μｇのポリ（ｄＩ−ｄ
Ｃ）：ポリ（ｄＩ−ｄＣ）（ファルマシア社製）及び１
μｇの変性サケ精子ＤＮＡを含む結合緩衝液中に精製し
たＭＢＰ−Ｅｒｎ４ｐ（０．１μｇ）又はＧＳＴ−Ｅｒ
ｎ４ｐ（０．５μｇ）を添加することにより、結合反応
を開始する。５倍量のＧＳＴ−Ｅｒｎ４ｐを用いたの
は、ＧＳＴ−Ｅｒｎ４ｐが凝集してゲルの上部に留まる
傾向があるからである。２０μｌの最終容量で４℃で１
０分間インキュベーション後、試料を０．５％のフィコ
ールを含む５％ ポリアクリルアミドゲルで非変性条件
下で電気泳動を行い、ゲルを乾燥させ、Ｘ線フィルムに
曝す（図１１）。精製したＭＢＰ−Ｅｒｎ４ｐとＧＳＴ
−Ｅｒｎ４ｐは、両方ともＵＰＲＥ（Ｙ）およびＵＰＲ
Ｅ（ＵＹ）に特異的に結合する。
３４（ＵＰＲＥの２〜４番目の三重変異体））並びにＣ
ＲＥをコードする二本鎖の合成オリゴヌクレオチドの５
' 及び３' 両末端を、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎ
ｏｗ断片と[ α−32Ｐ] ｄＡＴＰを用いて放射標識し、
８％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動により精製す
る。０．２５〜０．３ｎｇの放射標識プローブ（８，０
００〜１０，０００ｃｐｍ）、１μｇのポリ（ｄＩ−ｄ
Ｃ）：ポリ（ｄＩ−ｄＣ）（ファルマシア社製）及び１
μｇの変性サケ精子ＤＮＡを含む結合緩衝液中に精製し
たＭＢＰ−Ｅｒｎ４ｐ（０．１μｇ）又はＧＳＴ−Ｅｒ
ｎ４ｐ（０．５μｇ）を添加することにより、結合反応
を開始する。５倍量のＧＳＴ−Ｅｒｎ４ｐを用いたの
は、ＧＳＴ−Ｅｒｎ４ｐが凝集してゲルの上部に留まる
傾向があるからである。２０μｌの最終容量で４℃で１
０分間インキュベーション後、試料を０．５％のフィコ
ールを含む５％ ポリアクリルアミドゲルで非変性条件
下で電気泳動を行い、ゲルを乾燥させ、Ｘ線フィルムに
曝す（図１１）。精製したＭＢＰ−Ｅｒｎ４ｐとＧＳＴ
−Ｅｒｎ４ｐは、両方ともＵＰＲＥ（Ｙ）およびＵＰＲ
Ｅ（ＵＹ）に特異的に結合する。
【００３８】（７）Ｅｒｎ４ｐ発現ベクターで形質転換
することによる酵母小胞体内分子シャペロン及びフォー
ルディング酵素の制御方法 Ｅｒｎ４ｐ又は酵母内で機能する転写調節因子の転写活
性化ドメインとＥｒｎ４ｐとの融合タンパク質を発現す
るように、これらをコードするＤＮＡをＥｒｎ４ｐ遺伝
子自身のプロモーターや他の適当なプロモーターの下流
に連結した発現プラスミドを構築する。酵母宿主用ベク
ターとしては、１コピーで染色体に組み込まれるＹＩｐ
型プラスミド、酵母内でプラスミドとして１コピーで維
持されるＹＣｐ型プラスミド、多コピーで維持されるＹ
Ｅｐ型プラスミドやＹＲｐ型プラスミドが利用できる。
また、プロモーターとしては、ＥＲＮ４遺伝子自身のプ
ロモーターのほかＡＤＨ１、ＥＮＯ１、ＰＧＫ１、ＧＡ
ＰＤＨ、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ７、ＰＨＯ５等
のプロモーターから選択して用いることができる。ＡＤ
Ｈ１、ＥＮＯ１、ＰＧＫ１及びＧＡＰＤＨプロモーター
を用いることにより構成的な発現が、ＧＡＬ１、ＧＡＬ
１０及びＧＡＬ７プロモーターを用いることによりガラ
クトースによる発現の誘導が、またＰＨＯ５プロモータ
ーでは無機リン酸による発現の抑制が可能である。酵
母、好ましくはｅｒｎ４Δ株をこのようなＥｒｎ４ｐ発
現ベクターで形質転換することにより、酵母内Ｅｒｎ４
ｐ量を人為的に調節することができる。このとき発現し
たＥｒｎ４ｐは小胞体ストレスに応答して、小胞体内分
子シャペロン及びフォールディング酵素をコードする遺
伝子の転写を誘導する。一方、他の転写調節因子の転写
活性化ドメインとＥｒｎ４ｐとの融合タンパク質は構成
的に転写活性を有し、該融合タンパク質の発現ベクター
で形質転換された酵母では、発現した該融合タンパク質
の量に依存して小胞体内分子シャペロン及びフォールデ
ィング酵素の遺伝子が転写される。このとき、宿主酵母
としてはｅｒｎ４Δ株である必要性はない。
することによる酵母小胞体内分子シャペロン及びフォー
ルディング酵素の制御方法 Ｅｒｎ４ｐ又は酵母内で機能する転写調節因子の転写活
性化ドメインとＥｒｎ４ｐとの融合タンパク質を発現す
るように、これらをコードするＤＮＡをＥｒｎ４ｐ遺伝
子自身のプロモーターや他の適当なプロモーターの下流
に連結した発現プラスミドを構築する。酵母宿主用ベク
ターとしては、１コピーで染色体に組み込まれるＹＩｐ
型プラスミド、酵母内でプラスミドとして１コピーで維
持されるＹＣｐ型プラスミド、多コピーで維持されるＹ
Ｅｐ型プラスミドやＹＲｐ型プラスミドが利用できる。
また、プロモーターとしては、ＥＲＮ４遺伝子自身のプ
ロモーターのほかＡＤＨ１、ＥＮＯ１、ＰＧＫ１、ＧＡ
ＰＤＨ、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ７、ＰＨＯ５等
のプロモーターから選択して用いることができる。ＡＤ
Ｈ１、ＥＮＯ１、ＰＧＫ１及びＧＡＰＤＨプロモーター
を用いることにより構成的な発現が、ＧＡＬ１、ＧＡＬ
１０及びＧＡＬ７プロモーターを用いることによりガラ
クトースによる発現の誘導が、またＰＨＯ５プロモータ
ーでは無機リン酸による発現の抑制が可能である。酵
母、好ましくはｅｒｎ４Δ株をこのようなＥｒｎ４ｐ発
現ベクターで形質転換することにより、酵母内Ｅｒｎ４
ｐ量を人為的に調節することができる。このとき発現し
たＥｒｎ４ｐは小胞体ストレスに応答して、小胞体内分
子シャペロン及びフォールディング酵素をコードする遺
伝子の転写を誘導する。一方、他の転写調節因子の転写
活性化ドメインとＥｒｎ４ｐとの融合タンパク質は構成
的に転写活性を有し、該融合タンパク質の発現ベクター
で形質転換された酵母では、発現した該融合タンパク質
の量に依存して小胞体内分子シャペロン及びフォールデ
ィング酵素の遺伝子が転写される。このとき、宿主酵母
としてはｅｒｎ４Δ株である必要性はない。
【００３９】（８）Ｅｒｎ４ｐ発現ベクターを用いた外
来タンパク質の発現方法 外来タンパク質発現ベクターは、ＹＩｐ型、ＹＣｐ型、
ＹＥｐ型あるいはＹＲｐ型プラスミドを用い、ＡＤＨ
１、ＥＮＯ１、ＰＧＫ１、ＧＡＰＤＨ、ＧＡＬ１、ＧＡ
Ｌ１０、ＧＡＬ７、ＰＨＯ５等のプロモーターの下流に
目的の外来タンパク質をコードする遺伝子を連結して構
築する。外来タンパク質を分泌発現させるため、ＳＵＣ
２、ＰＨＯ５、ＭＦα１あるいは異種遺伝子由来のシグ
ナルペプチドをＮ末端に付加するように作製した外来タ
ンパク質遺伝子を用いる。このように作製した外来タン
パク質発現ベクターを、Ｅｒｎ４ｐ発現ベクター又は酵
母内で機能する転写調節因子の転写活性化ドメインとＥ
ｒｎ４ｐとの融合タンパク質の発現ベクターともに酵母
に導入し、共形質転換体を得る。次いで、通常行われる
方法により該共形質転換体を培養し、必要に応じて発現
の誘導を行い、外来タンパク質を生産する。
来タンパク質の発現方法 外来タンパク質発現ベクターは、ＹＩｐ型、ＹＣｐ型、
ＹＥｐ型あるいはＹＲｐ型プラスミドを用い、ＡＤＨ
１、ＥＮＯ１、ＰＧＫ１、ＧＡＰＤＨ、ＧＡＬ１、ＧＡ
Ｌ１０、ＧＡＬ７、ＰＨＯ５等のプロモーターの下流に
目的の外来タンパク質をコードする遺伝子を連結して構
築する。外来タンパク質を分泌発現させるため、ＳＵＣ
２、ＰＨＯ５、ＭＦα１あるいは異種遺伝子由来のシグ
ナルペプチドをＮ末端に付加するように作製した外来タ
ンパク質遺伝子を用いる。このように作製した外来タン
パク質発現ベクターを、Ｅｒｎ４ｐ発現ベクター又は酵
母内で機能する転写調節因子の転写活性化ドメインとＥ
ｒｎ４ｐとの融合タンパク質の発現ベクターともに酵母
に導入し、共形質転換体を得る。次いで、通常行われる
方法により該共形質転換体を培養し、必要に応じて発現
の誘導を行い、外来タンパク質を生産する。
【００４０】（９）Ｅｒｎ４ｐ活性化機構の解析 本発明のＥｒｎ４ｐは、配列番号：２に記載の２３０ア
ミノ酸残基からなるポリペプチドであり、該配列中にＵ
ＰＲＥに特異的に結合する領域（塩基性領域、図４参
照）は存在するが、転写調節活性化領域と考えられる領
域は認められない。そこで、Ｅｒｎ４ｐ自身の活性化機
構を解析する。
ミノ酸残基からなるポリペプチドであり、該配列中にＵ
ＰＲＥに特異的に結合する領域（塩基性領域、図４参
照）は存在するが、転写調節活性化領域と考えられる領
域は認められない。そこで、Ｅｒｎ４ｐ自身の活性化機
構を解析する。
【００４１】第１に、ノーザンブロッティング法によ
り、ＥＲＮ４遺伝子転写産物の解析を行う。ツニカマイ
シン処理したサッカロミセス セレビシエの細胞株か
ら、一定時間毎に全ＲＮＡを抽出し、電気泳動に付した
後、ニトロセルロースメンブレン上にブロッティング
し、ＥＲＮ４、ＫＡＲ２及びＰＤＩ１に特異的なプロー
ブを用いてハイブリダイズすることにより、ＥＲＮ４遺
伝子転写産物の検出を行う。なお、内部標準として、Ａ
ＣＴ１（酵母アクチン）に特異的なプローブを用いる。
ツニカマイシン処理前の定常的に見られる１．４ｋｂの
バンドは、ツニカマイシン処理後、速やかに減少し、新
たに２つの短いバンド（１．２ｋｂ及び０．７ｋｂ）が
生じる（図１２）。さらに、この現象は、ＫＡＲ２及び
ＰＤＩ１遺伝子の発現誘導前に始まる（図１３）ことや
ｅｒｎ１Δ株では見られない（図１２）ことから、スト
レス特異的なＥＲＮ４遺伝子の転写後における調節機構
の存在が示唆される。
り、ＥＲＮ４遺伝子転写産物の解析を行う。ツニカマイ
シン処理したサッカロミセス セレビシエの細胞株か
ら、一定時間毎に全ＲＮＡを抽出し、電気泳動に付した
後、ニトロセルロースメンブレン上にブロッティング
し、ＥＲＮ４、ＫＡＲ２及びＰＤＩ１に特異的なプロー
ブを用いてハイブリダイズすることにより、ＥＲＮ４遺
伝子転写産物の検出を行う。なお、内部標準として、Ａ
ＣＴ１（酵母アクチン）に特異的なプローブを用いる。
ツニカマイシン処理前の定常的に見られる１．４ｋｂの
バンドは、ツニカマイシン処理後、速やかに減少し、新
たに２つの短いバンド（１．２ｋｂ及び０．７ｋｂ）が
生じる（図１２）。さらに、この現象は、ＫＡＲ２及び
ＰＤＩ１遺伝子の発現誘導前に始まる（図１３）ことや
ｅｒｎ１Δ株では見られない（図１２）ことから、スト
レス特異的なＥＲＮ４遺伝子の転写後における調節機構
の存在が示唆される。
【００４２】第２に、ＲＴ−ＰＣＲ法により、短鎖転写
産物の解析を行う。前記全ＲＮＡより、オリゴ−ｄＴプ
ライマーを用いて合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ＥＲＮ
４遺伝子内部の領域から、種々のプライマーを設計し
（図１４）、ＲＴ−ＰＣＲを行う（図１５）。５' 非翻
訳領域のプライマーと３' 非翻訳領域のプライマーを用
いた場合、ツニカマイシン処理したｃＤＮＡ由来のＰＣ
Ｒ増幅産物中にのみ、予想される長さのバンドに加え、
それより約２５０ｂｐ短いバンドが見られる。この長さ
の差は、前記ノーザンブロッティングによる解析結果の
１．４ｋｂから１．２ｋｂへの変化に由来するものと考
えられる。該バンドをクローニングし、塩基配列を決定
する。その結果、図１４のプライマーｆとプライマーｏ
の間に欠失が見出され、サッカロミセス セレビシエで
は頻度が少ないが、スプライシングにより、該欠失が生
じていることが示唆される。スプライシングの結果、新
しいオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が現れ、
前記２３０アミノ酸残基からなるＥｒｎ４ｐとは２２１
位以降のアミノ酸配列が異なる、２３８アミノ酸残基か
らなるポリペプチド（配列番号：３）が生じる（図１
６）。
産物の解析を行う。前記全ＲＮＡより、オリゴ−ｄＴプ
ライマーを用いて合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ＥＲＮ
４遺伝子内部の領域から、種々のプライマーを設計し
（図１４）、ＲＴ−ＰＣＲを行う（図１５）。５' 非翻
訳領域のプライマーと３' 非翻訳領域のプライマーを用
いた場合、ツニカマイシン処理したｃＤＮＡ由来のＰＣ
Ｒ増幅産物中にのみ、予想される長さのバンドに加え、
それより約２５０ｂｐ短いバンドが見られる。この長さ
の差は、前記ノーザンブロッティングによる解析結果の
１．４ｋｂから１．２ｋｂへの変化に由来するものと考
えられる。該バンドをクローニングし、塩基配列を決定
する。その結果、図１４のプライマーｆとプライマーｏ
の間に欠失が見出され、サッカロミセス セレビシエで
は頻度が少ないが、スプライシングにより、該欠失が生
じていることが示唆される。スプライシングの結果、新
しいオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が現れ、
前記２３０アミノ酸残基からなるＥｒｎ４ｐとは２２１
位以降のアミノ酸配列が異なる、２３８アミノ酸残基か
らなるポリペプチド（配列番号：３）が生じる（図１
６）。
【００４３】第３に、前記欠失が見出された領域（イン
トロンに相当）又は欠失していない領域（エキソンに相
当）に特異的にハイブリダイズする５種類のオリゴヌク
レオチドプローブを合成し（図１６）、ノーザンブロッ
ティング解析を行う（図１７）。イントロンの領域とハ
イブリダイズするプローブは、ツニカマイシン処理によ
るストレスにより誘導される１．２ｋｂのバンドとはハ
イブリダイズしないことから、１．４ｋｂから１．２ｋ
ｂへのバンドの変化は、実際に約２５０塩基がスプライ
シングにより取り除かれた結果生じる現象であると結論
される。図１６の３' 側のプローブとハイブリダイズし
ない０．７ｋｂのバンドは、５' 側エキソンと予想され
る。
トロンに相当）又は欠失していない領域（エキソンに相
当）に特異的にハイブリダイズする５種類のオリゴヌク
レオチドプローブを合成し（図１６）、ノーザンブロッ
ティング解析を行う（図１７）。イントロンの領域とハ
イブリダイズするプローブは、ツニカマイシン処理によ
るストレスにより誘導される１．２ｋｂのバンドとはハ
イブリダイズしないことから、１．４ｋｂから１．２ｋ
ｂへのバンドの変化は、実際に約２５０塩基がスプライ
シングにより取り除かれた結果生じる現象であると結論
される。図１６の３' 側のプローブとハイブリダイズし
ない０．７ｋｂのバンドは、５' 側エキソンと予想され
る。
【００４４】第４に、新規ＯＲＦ由来のポリペプチド
（配列番号：３）の転写調節活性能を調べる。ＥＲＮ４
遺伝子本来のプロモーターを用い、イントロンを除いた
新規ＯＲＦ由来のポリペプチドが発現するように、前記
シングルコピーベクター上にＤＮＡを構築し、レポータ
ー遺伝子（ＵＰＲＥ（Ｙ）−ＣＹＣ１−ｌａｃＺ）とと
もに、ｅｒｎ４Δ株に導入して、前記のように、β−ガ
ラクトシダーゼ誘導活性を調べる（図１８）。新規ＯＲ
Ｆ由来のポリペプチドは、ストレスのない状態でもβ−
ガラクトシダーゼ誘導活性があることから、このポリペ
プチドこそが、転写調節活性化能を有するＥｒｎ４ｐで
あり、以下活性型Ｅｒｎ４ｐと称する。Ｅｒｎ４ｐの活
性は、ストレス特異的なスプライシングにより調節を受
けていることが示唆される。
（配列番号：３）の転写調節活性能を調べる。ＥＲＮ４
遺伝子本来のプロモーターを用い、イントロンを除いた
新規ＯＲＦ由来のポリペプチドが発現するように、前記
シングルコピーベクター上にＤＮＡを構築し、レポータ
ー遺伝子（ＵＰＲＥ（Ｙ）−ＣＹＣ１−ｌａｃＺ）とと
もに、ｅｒｎ４Δ株に導入して、前記のように、β−ガ
ラクトシダーゼ誘導活性を調べる（図１８）。新規ＯＲ
Ｆ由来のポリペプチドは、ストレスのない状態でもβ−
ガラクトシダーゼ誘導活性があることから、このポリペ
プチドこそが、転写調節活性化能を有するＥｒｎ４ｐで
あり、以下活性型Ｅｒｎ４ｐと称する。Ｅｒｎ４ｐの活
性は、ストレス特異的なスプライシングにより調節を受
けていることが示唆される。
【００４５】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定
されるものではない。
明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定
されるものではない。
【００４６】菌株及び微生物学的技法 本明細書で用いたサッカロミセス セレビシエの菌株
は、以下の通りである：ＫＭＹ１００５（ＭＡＴα ｌ
ｅｕ２−３，１１２ ｕｒａ３−５２ ｈｉｓ３−Δ２
００ ｔｒｐ１−Δ９０１ ｌｙｓ２−８０１）；ＫＭ
Ｙ１０１５（ＫＭＹ１００５ ｅｒｎ１Δ：：ＴＲＰ
１）；ＫＭＹ１０４５（ＫＭＹ１００５ ｅｒｎ４
Δ：：ＴＲＰ１）；ＫＭＹ２００５（ＭＡＴα ｌｅｕ
２−３，１１２ｕｒａ３−５２ ｈｉｓ３−Δ２００
ｔｒｐ１−Δ９０１ ｌｙｓ２−８０１ｓｅｃ５３−
６）；ＫＭＹ２０１５（ＫＭＹ２００５ ｅｒｎ１
Δ：：ＴＲＰ１）；ＫＭＹ２０４５（ＫＭＹ２００５
ｅｒｎ４Δ：：ＴＲＰ１）。遺伝学的手法並びにリッチ
ブロス培地（ＹＰＤ）及び、ＳＣ（−Ｕｒａ）又はＳＣ
（−Ｕｒａ，Ｌｅｕ）のような形質転換体の選択培地の
組成は、シェルマンら（Sherman,F.et al.) の「Method
s in Yeast Genetics,1986 Cold Spring Harbor Labora
tory Press」に記載の方法に従った。イノシトール無添
加培地は、クルベルトソンとヘンリー（Culbertson,M.
R.and Henry,S.A.)の「Genetics 80,23-40(1975) 」に
記載の方法により調製した。酵母菌の形質転換は、酢酸
リチウム法により行った（Ito,H.et al.,J.Bacteriol.1
53,163-168(1983)) 。
は、以下の通りである：ＫＭＹ１００５（ＭＡＴα ｌ
ｅｕ２−３，１１２ ｕｒａ３−５２ ｈｉｓ３−Δ２
００ ｔｒｐ１−Δ９０１ ｌｙｓ２−８０１）；ＫＭ
Ｙ１０１５（ＫＭＹ１００５ ｅｒｎ１Δ：：ＴＲＰ
１）；ＫＭＹ１０４５（ＫＭＹ１００５ ｅｒｎ４
Δ：：ＴＲＰ１）；ＫＭＹ２００５（ＭＡＴα ｌｅｕ
２−３，１１２ｕｒａ３−５２ ｈｉｓ３−Δ２００
ｔｒｐ１−Δ９０１ ｌｙｓ２−８０１ｓｅｃ５３−
６）；ＫＭＹ２０１５（ＫＭＹ２００５ ｅｒｎ１
Δ：：ＴＲＰ１）；ＫＭＹ２０４５（ＫＭＹ２００５
ｅｒｎ４Δ：：ＴＲＰ１）。遺伝学的手法並びにリッチ
ブロス培地（ＹＰＤ）及び、ＳＣ（−Ｕｒａ）又はＳＣ
（−Ｕｒａ，Ｌｅｕ）のような形質転換体の選択培地の
組成は、シェルマンら（Sherman,F.et al.) の「Method
s in Yeast Genetics,1986 Cold Spring Harbor Labora
tory Press」に記載の方法に従った。イノシトール無添
加培地は、クルベルトソンとヘンリー（Culbertson,M.
R.and Henry,S.A.)の「Genetics 80,23-40(1975) 」に
記載の方法により調製した。酵母菌の形質転換は、酢酸
リチウム法により行った（Ito,H.et al.,J.Bacteriol.1
53,163-168(1983)) 。
【００４７】レポータープラスミドの構築 組換えＤＮＡ技法は、サンブルックら(Sambrook,J.et a
l.) の「Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第２
版,1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press 」に記
載の方法で行った。レポータープラスミドｐＭＣＺ２
（ＵＲＡ３選択マーカーを含む２μｍＤＮＡベースのマ
ルチコピープラスミド）及びｐＳＣＺ２（ＵＲＡ３選択
マーカーを含むＣＥＮ４−ＡＲＳ１ベースのシングルコ
ピープラスミド）の構築は、別に報告している（Mori,
K.et al. 、投稿中）。ｐＭＣＺ２及びｐＳＣＺ２は両
方ともＵＰＲＥのクローニングのためにＣＹＣ１プロモ
ーターの上流に位置するＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ部位を
持つＣＹＣ１−ｌａｃＺ融合遺伝子を含む。ＥｃｏＲＩ
及びＸｈｏＩ切断により生じる突出末端にそれぞれ５'
及び３' 末端が相補的な種々の二本鎖、合成オリゴヌク
レオチドを、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ部位間に挿入し
た。
l.) の「Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第２
版,1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press 」に記
載の方法で行った。レポータープラスミドｐＭＣＺ２
（ＵＲＡ３選択マーカーを含む２μｍＤＮＡベースのマ
ルチコピープラスミド）及びｐＳＣＺ２（ＵＲＡ３選択
マーカーを含むＣＥＮ４−ＡＲＳ１ベースのシングルコ
ピープラスミド）の構築は、別に報告している（Mori,
K.et al. 、投稿中）。ｐＭＣＺ２及びｐＳＣＺ２は両
方ともＵＰＲＥのクローニングのためにＣＹＣ１プロモ
ーターの上流に位置するＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ部位を
持つＣＹＣ１−ｌａｃＺ融合遺伝子を含む。ＥｃｏＲＩ
及びＸｈｏＩ切断により生じる突出末端にそれぞれ５'
及び３' 末端が相補的な種々の二本鎖、合成オリゴヌク
レオチドを、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ部位間に挿入し
た。
【００４８】アッセイ、プローブ及び抗体 酵母細胞抽出物中のβ−ガラクトシダーゼ活性のアッセ
イ及び酵母ＲＮＡのノーザンハイブリダイゼーションア
ッセイは、既報に従って行った（Mori,K. et al.,Cell
74,743-756(1993)) 。酵母ＰＤＩ１のプローブ（中央の
１．４７ｋｂのＸｈｏＩ−ＳａｌＩ断片）は、ｐＭＴＹ
１７（Tachikawa,H. et al.,J.Biochem.110,306-313(19
91))より単離した。酵母ＳＣＪ１及びＦＫＢ２遺伝子の
プローブは、ＰＣＲ法により調製した。イムノブロッテ
ィングは、基本的には既報に従って行った（Kohno,K. e
t al.,Mol.Cell.Biol.13,877-890(1993)) 。プラスミド
ｐＭＴＹ１７及びＰｄｉ１ｐ特異的ウサギポリクローナ
ル抗体はタチカワ博士(Tachikawa,H. 、東京農工大学）
より供与された。
イ及び酵母ＲＮＡのノーザンハイブリダイゼーションア
ッセイは、既報に従って行った（Mori,K. et al.,Cell
74,743-756(1993)) 。酵母ＰＤＩ１のプローブ（中央の
１．４７ｋｂのＸｈｏＩ−ＳａｌＩ断片）は、ｐＭＴＹ
１７（Tachikawa,H. et al.,J.Biochem.110,306-313(19
91))より単離した。酵母ＳＣＪ１及びＦＫＢ２遺伝子の
プローブは、ＰＣＲ法により調製した。イムノブロッテ
ィングは、基本的には既報に従って行った（Kohno,K. e
t al.,Mol.Cell.Biol.13,877-890(1993)) 。プラスミド
ｐＭＴＹ１７及びＰｄｉ１ｐ特異的ウサギポリクローナ
ル抗体はタチカワ博士(Tachikawa,H. 、東京農工大学）
より供与された。
【００４９】実施例１シス配列ＵＰＲＥの解析 前記レポータープラスミドｐＭＣＺ２のＣＹＣ１プロモ
ーターの上流に位置するＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ部位に
野生型のＵＰＲＥ（Ｙと命名）又は図１の横軸に示した
位置（１〜１９番目）に１塩基置換した点変異体（Ｇ，
Ａ，Ｔ，ＣをそれぞれＴ，Ｃ，Ｇ，Ａに置換、Ｔｖ１〜
１９と命名）を挿入し、それを酵母の野生株ＫＭＹ１０
０５に形質転換し、得られたＵｒａ+ 形質転換体をＳＣ
（−Ｕｒａ）培地中、３０℃で培養し、対数増殖期の菌
体を３時間、ツニカマイシン（ＴＭ、５μｇ／ｍｌ）存
在下又は非存在下インキュベートし、ＣＹＣ１−ｌａｃ
Ｚ融合遺伝子より発現したβ−ガラクトシダーゼ活性を
測定した（図１）。野生型のＵＰＲＥの場合は、ＴＭ処
理により約５０倍β−ガラクトシダーゼ活性が上昇し
た。１０〜１２番目のＣＡＧ及び１４〜１６番目のＧＴ
Ｇの点変異体の場合は、ＴＭ処理をしてもβ−ガラクト
シダーゼ活性がほとんど上がらず、ＵＰＲＥの活性がほ
とんど失われていることが明らかになった。また、２〜
４番目のＧＡＡの点変異体もβ−ガラクトシダーゼ活性
が低下した。次に、ＣＡＧとＧＴＧの間の１３番目のＣ
の重要性を調べるために、１３番目のＣを他の塩基Ｇ、
Ａ又はＴに置換したり、１３番目のＣを除去したり（ス
ペーシング０）、逆にＣを１〜４個挿入した（スペーシ
ング２〜５）変異体を作製し、同様にβ−ガラクトシダ
ーゼ活性を測定した（図２）。スペーシングを０にする
と、その活性は、野生型の７％程度になり、スペーシン
グを２以上にすると、活性がほとんど消失した。従っ
て、ＣＡＧとＧＴＧの間にＣが１個だけ存在することが
ＵＰＲＥの活性に極めて重要であることが示された。ま
た、ＣＡＧ−ＧＴＧを含む領域は、部分的にパリンドロ
ーム構造になっている。表１に示すように、野生型Ｙで
は４ｂｐからなるパリンドロームであり、前述のように
ストレスによりβ−ガラクトシダーゼ活性は、約５０倍
増加した。１２番目のＧをＣに置換（１２Ｃ）したり、
１９番目のＧをＣに置換（１９Ｃ）した場合、ストレス
存在下、非存在下とも野生型Ｙに比べてβ−ガラクトシ
ダーゼ活性が上昇した。さらに、両方置換して７ｂｐか
らなる完全なパリンドローム構造にする（ＵＹ）と、野
生型Ｙに比べてストレスを加える前は約４倍、ストレス
を加えた後は約２倍に活性が上昇した。従って、酵母Ｕ
ＰＲＦは、パリンドローム構造を認識することが示され
た。
ーターの上流に位置するＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ部位に
野生型のＵＰＲＥ（Ｙと命名）又は図１の横軸に示した
位置（１〜１９番目）に１塩基置換した点変異体（Ｇ，
Ａ，Ｔ，ＣをそれぞれＴ，Ｃ，Ｇ，Ａに置換、Ｔｖ１〜
１９と命名）を挿入し、それを酵母の野生株ＫＭＹ１０
０５に形質転換し、得られたＵｒａ+ 形質転換体をＳＣ
（−Ｕｒａ）培地中、３０℃で培養し、対数増殖期の菌
体を３時間、ツニカマイシン（ＴＭ、５μｇ／ｍｌ）存
在下又は非存在下インキュベートし、ＣＹＣ１−ｌａｃ
Ｚ融合遺伝子より発現したβ−ガラクトシダーゼ活性を
測定した（図１）。野生型のＵＰＲＥの場合は、ＴＭ処
理により約５０倍β−ガラクトシダーゼ活性が上昇し
た。１０〜１２番目のＣＡＧ及び１４〜１６番目のＧＴ
Ｇの点変異体の場合は、ＴＭ処理をしてもβ−ガラクト
シダーゼ活性がほとんど上がらず、ＵＰＲＥの活性がほ
とんど失われていることが明らかになった。また、２〜
４番目のＧＡＡの点変異体もβ−ガラクトシダーゼ活性
が低下した。次に、ＣＡＧとＧＴＧの間の１３番目のＣ
の重要性を調べるために、１３番目のＣを他の塩基Ｇ、
Ａ又はＴに置換したり、１３番目のＣを除去したり（ス
ペーシング０）、逆にＣを１〜４個挿入した（スペーシ
ング２〜５）変異体を作製し、同様にβ−ガラクトシダ
ーゼ活性を測定した（図２）。スペーシングを０にする
と、その活性は、野生型の７％程度になり、スペーシン
グを２以上にすると、活性がほとんど消失した。従っ
て、ＣＡＧとＧＴＧの間にＣが１個だけ存在することが
ＵＰＲＥの活性に極めて重要であることが示された。ま
た、ＣＡＧ−ＧＴＧを含む領域は、部分的にパリンドロ
ーム構造になっている。表１に示すように、野生型Ｙで
は４ｂｐからなるパリンドロームであり、前述のように
ストレスによりβ−ガラクトシダーゼ活性は、約５０倍
増加した。１２番目のＧをＣに置換（１２Ｃ）したり、
１９番目のＧをＣに置換（１９Ｃ）した場合、ストレス
存在下、非存在下とも野生型Ｙに比べてβ−ガラクトシ
ダーゼ活性が上昇した。さらに、両方置換して７ｂｐか
らなる完全なパリンドローム構造にする（ＵＹ）と、野
生型Ｙに比べてストレスを加える前は約４倍、ストレス
を加えた後は約２倍に活性が上昇した。従って、酵母Ｕ
ＰＲＦは、パリンドローム構造を認識することが示され
た。
【００５０】
【表１】
【００５１】実施例２ＵＰＲＦのワン−ハイブリッド（ｏｎｅ−ｈｙｂｒｉ
ｄ）スクリーニング法 ｐＵＣ１１９（宝酒造社製）にクローニングされた酵母
ＨＩＳ３遺伝子の翻訳開始部位のすぐ上流にＳａｌＩ部
位を作製した。２個のＴＡＴＡＡボックスを含む０．３
ｋｂのＤｒａＩ−ＳａｌＩ断片を、ＥＲＮ１遺伝子（Mo
ri,K.et al.,Cell 74,743-756(1993))のプロモーター領
域から単離し、ｐＳＺＷＴ（Mori,K.etal.,EMBO J. 11,
2583-2593(1992)) 由来のｌａｃＺをコードする領域ま
たはＨＩＳ３遺伝子の上流に挿入した。ＥＲＮ１プロモ
ーターは、従来使用された最小のＧＡＬ１プロモーター
（Wang,M.M. and Reed,R.R.,Nature 364,121-126(199
3);Chong,J.A. et al.,Cell 80,949-957(1995)) のよう
に非常に低い基礎転写活性を有するという理由で使用さ
れた。変異体ＵＰＲＥ（Ｔｖ１０及びＵＹ）をそれぞ
れ、ｌａｃＺ及びＨＩＳ３の発現を制御するＥＲＮ１プ
ロモーター（ＰERN1）の上流に挿入した。ＵＰＲＥ（Ｔ
ｖ１０）−ＰERN1−ｌａｃＺ構築物をＵＰＲＥ（ＵＹ）
−ＰERN1−ＨＩＳ３遺伝子を有するプラスミドと融合さ
せた。酵母ＵＲＡ３遺伝子をさらに挿入し、ｐＲＣＥ４
を作成した（図３）。ｐＲＣＥ４をＮｃｏＩで消化し、
ｅｒｎ１Δ株（ＫＭＹ１０１５）の形質転換に用いた。
ｅｒｎ１Δ細胞を宿主として使用したのは、前述の理由
による。染色体上のＧＡＬ４とＧＡＬ８０遺伝子は、ス
クリーニングを妨害しなかった。サザン（Ｓｏｕｔｈｅ
ｒｎ) 分析法でスクリーニング後、ｕｒａ３−５２遺伝
子座に組み込まれたｐＲＣＥ４を１コピー有するＹＨＣ
Ｅ４株を得た。ＹＨＣＥ４株は、非常に低レベルのβ−
ガラクトシダーゼを発現し、ヒスチジンを含まないプレ
ート上では成育しなかった。酵母ｃＤＮＡライブラリー
は、エレッジ博士（Elledge,S.、ベイラー医科大学）よ
りハヤシ博士（Hayashi,N.、九州大学）を通じて供与さ
れた。図４のｐＡＣＴベクター（Durfee,T.et al.,Gene
s Dev.7,555-569(1993))のＧａｌ４ｐ（ａｄ）をコード
するＤＮＡの下流のＸｈｏＩ部位に該ｃＤＮＡを挿入し
たプラスミドを構築した。ＹＨＣＥ４細胞を１００μｇ
の該プラスミドで形質転換し、Ｈｉｓ+ のコロニーを選
択した。約５×１０6 の形質転換体からの１００個のＨ
ｉｓ+のコロニーの内、２３クローンはβ−ガラクトシ
ダーゼのレベルが有意に上昇（２倍以上）していたので
廃棄した。７７候補のうち４７クローンは、１ｍＭの３
−アミノトリアゾールの存在下で成育することができ
た。これは、ＵＰＲＥ依存性のＨＩＳ３の転写が強力に
活性化したことを示した。
ｄ）スクリーニング法 ｐＵＣ１１９（宝酒造社製）にクローニングされた酵母
ＨＩＳ３遺伝子の翻訳開始部位のすぐ上流にＳａｌＩ部
位を作製した。２個のＴＡＴＡＡボックスを含む０．３
ｋｂのＤｒａＩ−ＳａｌＩ断片を、ＥＲＮ１遺伝子（Mo
ri,K.et al.,Cell 74,743-756(1993))のプロモーター領
域から単離し、ｐＳＺＷＴ（Mori,K.etal.,EMBO J. 11,
2583-2593(1992)) 由来のｌａｃＺをコードする領域ま
たはＨＩＳ３遺伝子の上流に挿入した。ＥＲＮ１プロモ
ーターは、従来使用された最小のＧＡＬ１プロモーター
（Wang,M.M. and Reed,R.R.,Nature 364,121-126(199
3);Chong,J.A. et al.,Cell 80,949-957(1995)) のよう
に非常に低い基礎転写活性を有するという理由で使用さ
れた。変異体ＵＰＲＥ（Ｔｖ１０及びＵＹ）をそれぞ
れ、ｌａｃＺ及びＨＩＳ３の発現を制御するＥＲＮ１プ
ロモーター（ＰERN1）の上流に挿入した。ＵＰＲＥ（Ｔ
ｖ１０）−ＰERN1−ｌａｃＺ構築物をＵＰＲＥ（ＵＹ）
−ＰERN1−ＨＩＳ３遺伝子を有するプラスミドと融合さ
せた。酵母ＵＲＡ３遺伝子をさらに挿入し、ｐＲＣＥ４
を作成した（図３）。ｐＲＣＥ４をＮｃｏＩで消化し、
ｅｒｎ１Δ株（ＫＭＹ１０１５）の形質転換に用いた。
ｅｒｎ１Δ細胞を宿主として使用したのは、前述の理由
による。染色体上のＧＡＬ４とＧＡＬ８０遺伝子は、ス
クリーニングを妨害しなかった。サザン（Ｓｏｕｔｈｅ
ｒｎ) 分析法でスクリーニング後、ｕｒａ３−５２遺伝
子座に組み込まれたｐＲＣＥ４を１コピー有するＹＨＣ
Ｅ４株を得た。ＹＨＣＥ４株は、非常に低レベルのβ−
ガラクトシダーゼを発現し、ヒスチジンを含まないプレ
ート上では成育しなかった。酵母ｃＤＮＡライブラリー
は、エレッジ博士（Elledge,S.、ベイラー医科大学）よ
りハヤシ博士（Hayashi,N.、九州大学）を通じて供与さ
れた。図４のｐＡＣＴベクター（Durfee,T.et al.,Gene
s Dev.7,555-569(1993))のＧａｌ４ｐ（ａｄ）をコード
するＤＮＡの下流のＸｈｏＩ部位に該ｃＤＮＡを挿入し
たプラスミドを構築した。ＹＨＣＥ４細胞を１００μｇ
の該プラスミドで形質転換し、Ｈｉｓ+ のコロニーを選
択した。約５×１０6 の形質転換体からの１００個のＨ
ｉｓ+のコロニーの内、２３クローンはβ−ガラクトシ
ダーゼのレベルが有意に上昇（２倍以上）していたので
廃棄した。７７候補のうち４７クローンは、１ｍＭの３
−アミノトリアゾールの存在下で成育することができ
た。これは、ＵＰＲＥ依存性のＨＩＳ３の転写が強力に
活性化したことを示した。
【００５２】これらのコロニーからライブラリー由来の
プラスミドを回収して塩基配列を調べると、インサート
の始まる位置は異なっているもののいずれも１つの遺伝
子に由来することがわかった。
プラスミドを回収して塩基配列を調べると、インサート
の始まる位置は異なっているもののいずれも１つの遺伝
子に由来することがわかった。
【００５３】実施例３ＥＲＮ４遺伝子発現のためのプラスミドの構築 ｐＡＣＴライブラリーから単離したＥＲＮ４ｃＤＮＡを
使用して、マルチコピー酵母ベクターであるＹＥｐ１３
上に構築された酵母のゲノムライブラリー（ＡＴＣＣ３
７３２３；Nasmyth,K.A. and Reed,S.I.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 77,2119-2123(1980)）をスクリーニングする
ことによりＥＲＮ４ゲノムＤＮＡを得た。得られた１ク
ローンがフランキング領域を持つ全遺伝子を含み、アプ
ライドバイオシステムズ社製のＤＮＡシークエンサーで
合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、タンパ
ク質をコードする領域の配列を決定した。得られた塩基
配列は、既報の配列とは異なっていた（Nojima,H.et a
l.,Nucleic Acids Res.22,5279-5288(1994);Murakami,
Y.et al.,Nature Genet.10,261-268(1995)) 。全ＥＲＮ
４遺伝子を含む２．５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＮＩ断
片をＹＣｐ−Ｌ２に接続し、ＹＣｐ−ＥＲＮ４を作製し
た。ＹＣｐ−Ｌ２は、ＬＥＵ２選択マーカーを含むＣＥ
Ｎ４−ＡＲＳ１ベースのシングルコピーの酵母ベクター
であり、ｐＳＢ３２（Rose,M.D.and Broach,J.R.,Meth.
Enzymol.194,195-230(1991)) の０．５３ｋｂのＨｉｎ
ｄIII −ＳｐｈＩ断片をｐＵＣ１１９のマルチクローニ
ング部位に置換することにより構築した。ＹＣｐ−ＥＲ
Ｎ１は、公知のｐＥＲＮ１ＢＣと同一である（Mori,K.e
t al.,Cell 74,743-756(1993))。
使用して、マルチコピー酵母ベクターであるＹＥｐ１３
上に構築された酵母のゲノムライブラリー（ＡＴＣＣ３
７３２３；Nasmyth,K.A. and Reed,S.I.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 77,2119-2123(1980)）をスクリーニングする
ことによりＥＲＮ４ゲノムＤＮＡを得た。得られた１ク
ローンがフランキング領域を持つ全遺伝子を含み、アプ
ライドバイオシステムズ社製のＤＮＡシークエンサーで
合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、タンパ
ク質をコードする領域の配列を決定した。得られた塩基
配列は、既報の配列とは異なっていた（Nojima,H.et a
l.,Nucleic Acids Res.22,5279-5288(1994);Murakami,
Y.et al.,Nature Genet.10,261-268(1995)) 。全ＥＲＮ
４遺伝子を含む２．５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＮＩ断
片をＹＣｐ−Ｌ２に接続し、ＹＣｐ−ＥＲＮ４を作製し
た。ＹＣｐ−Ｌ２は、ＬＥＵ２選択マーカーを含むＣＥ
Ｎ４−ＡＲＳ１ベースのシングルコピーの酵母ベクター
であり、ｐＳＢ３２（Rose,M.D.and Broach,J.R.,Meth.
Enzymol.194,195-230(1991)) の０．５３ｋｂのＨｉｎ
ｄIII −ＳｐｈＩ断片をｐＵＣ１１９のマルチクローニ
ング部位に置換することにより構築した。ＹＣｐ−ＥＲ
Ｎ１は、公知のｐＥＲＮ１ＢＣと同一である（Mori,K.e
t al.,Cell 74,743-756(1993))。
【００５４】実施例４ＥＲＮ４遺伝子座の破壊 染色体上のＥＲＮ１及びＥＲＮ４遺伝子を公知の方法に
より破壊した（Rothstein,R.,Meth.Enzymol.194,281-30
1(1991))。ＥＲＮ１の中央のＳａｌＩ−ＳａｃＩ断片
（アミノ酸配列１−７４７に相当）又はＥＲＮ４の中央
のＳｐｅＩ−ＭｆｅＩ断片（アミノ酸配列１１−２１５
に相当）を酵母ＴＲＰ１遺伝子に置換することにより、
それぞれｐＫＯＥ１ＴＲＰ又はｐＫＯＥ４ＴＲＰを作製
した。該プラスミドを直鎖状にして、ＳＥＣ+ 及びｓｅ
ｃ５３ハプロイド細胞を形質転換させた。Ｔｒｐ+ の形
質転換体を単離し、適当なプローブを用いてサザン分析
により破壊を確認した。
より破壊した（Rothstein,R.,Meth.Enzymol.194,281-30
1(1991))。ＥＲＮ１の中央のＳａｌＩ−ＳａｃＩ断片
（アミノ酸配列１−７４７に相当）又はＥＲＮ４の中央
のＳｐｅＩ−ＭｆｅＩ断片（アミノ酸配列１１−２１５
に相当）を酵母ＴＲＰ１遺伝子に置換することにより、
それぞれｐＫＯＥ１ＴＲＰ又はｐＫＯＥ４ＴＲＰを作製
した。該プラスミドを直鎖状にして、ＳＥＣ+ 及びｓｅ
ｃ５３ハプロイド細胞を形質転換させた。Ｔｒｐ+ の形
質転換体を単離し、適当なプローブを用いてサザン分析
により破壊を確認した。
【００５５】実施例５ＧＡＬ４（ａｄ）−ＥＲＮ４遺伝子によるアンフォール
ドタンパク質応答過程の構成的な活性化 ＳＥＣ+ のＥＲＮ+ 、ｅｒｎ１Δ及びｅｒｎ４Δ株に、
ｐＡＣＴベクターのみまたはＥＲＮ４をＧＡＬ４（ａ
ｄ）にフレームを合わせた遺伝子を含むｐＡＣＴ発現ベ
クターと、種々のＵＡＳ（上流の活性化配列）を挿入し
たｐＳＣＺレポータープラスミドとを共に導入して形質
転換体を得た。該形質転換体をＳＣ（−Ｕｒａ，Ｌｅ
ｕ）培地中３０℃で培養し、対数増殖期の細胞をストレ
ス処理をせずにＣＹＣ１−ｌａｃＺ遺伝子より発現した
β−ガラクトシダーゼの活性を測定した（図５）。３つ
の別々の形質転換体を２回ずつ測定して値を求めた。ま
た、イムノブロッティング法によりそれぞれの形質転換
体の培養物から抽出した総タンパク質（５０μｇ）中の
Ｋａｒ２ｐ（ＧＲＰ７８）とＰｄｉ１ｐの量を決定した
（図５）。ＧＡＬ４（ａｄ）−ＥＲＮ４遺伝子を発現さ
せることにより、ＵＰＲＥ（Ｙ）及びＵＰＲＥ（ＵＹ）
を上流にもつβ−ガラクトシダーゼがストレス非存在下
でも活性化され、Ｋａｒ２ｐ（ＧＲＰ７８）とＰｄｉ１
ｐの発現も誘導された。
ドタンパク質応答過程の構成的な活性化 ＳＥＣ+ のＥＲＮ+ 、ｅｒｎ１Δ及びｅｒｎ４Δ株に、
ｐＡＣＴベクターのみまたはＥＲＮ４をＧＡＬ４（ａ
ｄ）にフレームを合わせた遺伝子を含むｐＡＣＴ発現ベ
クターと、種々のＵＡＳ（上流の活性化配列）を挿入し
たｐＳＣＺレポータープラスミドとを共に導入して形質
転換体を得た。該形質転換体をＳＣ（−Ｕｒａ，Ｌｅ
ｕ）培地中３０℃で培養し、対数増殖期の細胞をストレ
ス処理をせずにＣＹＣ１−ｌａｃＺ遺伝子より発現した
β−ガラクトシダーゼの活性を測定した（図５）。３つ
の別々の形質転換体を２回ずつ測定して値を求めた。ま
た、イムノブロッティング法によりそれぞれの形質転換
体の培養物から抽出した総タンパク質（５０μｇ）中の
Ｋａｒ２ｐ（ＧＲＰ７８）とＰｄｉ１ｐの量を決定した
（図５）。ＧＡＬ４（ａｄ）−ＥＲＮ４遺伝子を発現さ
せることにより、ＵＰＲＥ（Ｙ）及びＵＰＲＥ（ＵＹ）
を上流にもつβ−ガラクトシダーゼがストレス非存在下
でも活性化され、Ｋａｒ２ｐ（ＧＲＰ７８）とＰｄｉ１
ｐの発現も誘導された。
【００５６】実施例６ＥＲＮ４遺伝子産物の小胞体から核へのシグナル伝達の
ための必要性 シングルコピーのＵＰＲＥ（Ｙ）−ＣＹＣ１−ｌａｃＺ
レポーター遺伝子を有するＳＥＣ+ のＥＲＮ+ 株、ｅｒ
ｎ１Δ株及びｅｒｎ４Δ株をＳＣ（−Ｕｒａ）培地中３
０℃で培養した。対数増殖期の細胞の一部を分取し、ツ
ニカマイシン（５μｇ／ｍｌ）の存在下、非存在下で３
時間インキュベートした。β−ガラクトシダーゼ活性を
２回の平均で表した（図６）。培養物の２μｌをイノシ
トールを含むまたは含まないＳＣ（−Ｕｒａ）プレート
上にスポットし、２日間３０℃でインキュベートし、２
つの変異株（ｅｒｎ１Δ株及びｅｒｎ４Δ株）がイノシ
トール要求性を示した（図６）。
ための必要性 シングルコピーのＵＰＲＥ（Ｙ）−ＣＹＣ１−ｌａｃＺ
レポーター遺伝子を有するＳＥＣ+ のＥＲＮ+ 株、ｅｒ
ｎ１Δ株及びｅｒｎ４Δ株をＳＣ（−Ｕｒａ）培地中３
０℃で培養した。対数増殖期の細胞の一部を分取し、ツ
ニカマイシン（５μｇ／ｍｌ）の存在下、非存在下で３
時間インキュベートした。β−ガラクトシダーゼ活性を
２回の平均で表した（図６）。培養物の２μｌをイノシ
トールを含むまたは含まないＳＣ（−Ｕｒａ）プレート
上にスポットし、２日間３０℃でインキュベートし、２
つの変異株（ｅｒｎ１Δ株及びｅｒｎ４Δ株）がイノシ
トール要求性を示した（図６）。
【００５７】次に、ｓｅｃ５３のＥＲＮ+ 株、ｅｒｎ１
Δ株及びｅｒｎ４Δ株を２３℃（許容温度）で培養し、
対数増殖期の細胞の一部を１時間２３℃（小胞体内のア
ンフォールドタンパク質（−））または小胞体内にアン
フォールドタンパク質が蓄積（＋）する３０℃（半−非
許容温度）で培養した。全ＲＮＡを抽出し、ＫＡＲ２
（ＧＲＰ７８）、ＳＣＪ１、ＰＤＩ１、ＥＵＧ１、ＦＫ
Ｂ２、ｌａｃＺ及びＡＣＴ１（酵母アクチン）に特異的
なＤＮＡプローブを用いて、ノーザンハイブリダイゼー
ション法により分析した（図８）。ＥＲＮ+ 株では、小
胞体内のアンフォールドタンパク質によりＫＡＲ２（Ｇ
ＲＰ７８）、ＳＣＪ１、ＰＤＩ１、ＥＵＧ１及びＦＫＢ
２のＲＮＡの転写が誘導されたのに比べ、ｅｒｎ１Δ株
及びｅｒｎ４Δ株ではこれらのＲＮＡの転写は誘導され
なかった。
Δ株及びｅｒｎ４Δ株を２３℃（許容温度）で培養し、
対数増殖期の細胞の一部を１時間２３℃（小胞体内のア
ンフォールドタンパク質（−））または小胞体内にアン
フォールドタンパク質が蓄積（＋）する３０℃（半−非
許容温度）で培養した。全ＲＮＡを抽出し、ＫＡＲ２
（ＧＲＰ７８）、ＳＣＪ１、ＰＤＩ１、ＥＵＧ１、ＦＫ
Ｂ２、ｌａｃＺ及びＡＣＴ１（酵母アクチン）に特異的
なＤＮＡプローブを用いて、ノーザンハイブリダイゼー
ション法により分析した（図８）。ＥＲＮ+ 株では、小
胞体内のアンフォールドタンパク質によりＫＡＲ２（Ｇ
ＲＰ７８）、ＳＣＪ１、ＰＤＩ１、ＥＵＧ１及びＦＫＢ
２のＲＮＡの転写が誘導されたのに比べ、ｅｒｎ１Δ株
及びｅｒｎ４Δ株ではこれらのＲＮＡの転写は誘導され
なかった。
【００５８】実施例７小胞体ストレスに対する防御におけるＥＲＮ４遺伝子の
欠失の影響 シングルコピーのＵＰＲＥ（Ｙ）−ＣＹＣ１−ｌａｃＺ
レポーター遺伝子及びシングルコピーの（ＹＣｐ）発現
プラスミドを有するｓｅｃ５３のＥＲＮ+ 、ｅｒｎ１Δ
及びｅｒｎ４Δ株を、ＳＣ（−Ｕｒａ，Ｌｅｕ）培地中
２３℃で一晩培養した。培養物をＯＤ600 が約０．２に
なるように希釈し、さらに３０℃でインキュベートし
た。０〜１０時間の２時間ごとにβ−ガラクトシダーゼ
活性と生存細胞の比率を測定した。生存細胞の比率は、
ＹＰＤプレート上に適当に希釈して播くことにより求め
た。値は対照（０時間）の％で表した（図９）。次に、
２時間ごとに採取した試料由来の総タンパク質の１０μ
ｇを用いて、イムノブロッティング法によりＫａｒ２ｐ
及びＰｄｉ１ｐを検出した（図１０）。ｅｒｎ４Δ株で
は、外来性のＥｒｎ４ｐを発現させることにより、小胞
体ストレスから細胞を防御できることがわかった。
欠失の影響 シングルコピーのＵＰＲＥ（Ｙ）−ＣＹＣ１−ｌａｃＺ
レポーター遺伝子及びシングルコピーの（ＹＣｐ）発現
プラスミドを有するｓｅｃ５３のＥＲＮ+ 、ｅｒｎ１Δ
及びｅｒｎ４Δ株を、ＳＣ（−Ｕｒａ，Ｌｅｕ）培地中
２３℃で一晩培養した。培養物をＯＤ600 が約０．２に
なるように希釈し、さらに３０℃でインキュベートし
た。０〜１０時間の２時間ごとにβ−ガラクトシダーゼ
活性と生存細胞の比率を測定した。生存細胞の比率は、
ＹＰＤプレート上に適当に希釈して播くことにより求め
た。値は対照（０時間）の％で表した（図９）。次に、
２時間ごとに採取した試料由来の総タンパク質の１０μ
ｇを用いて、イムノブロッティング法によりＫａｒ２ｐ
及びＰｄｉ１ｐを検出した（図１０）。ｅｒｎ４Δ株で
は、外来性のＥｒｎ４ｐを発現させることにより、小胞
体ストレスから細胞を防御できることがわかった。
【００５９】実施例８Ｅｒｎ４ｐ−融合タンパク質の発現と精製 ＥＲＮ４の０．８ｋｂのＳｐｅＩ−ＨｉｎｄIII 断片(
アミノ酸配列１０−２３０に相当）を、プラスミドｐＧ
ＥＸ−２ＴＫ（ファルマシア社製）上のグルタチオンＳ
−トランスフェラーゼをコードする塩基配列、又はプラ
スミドｐＭＡＬ−ｃ２（ニューイングランドバイオラブ
ズ社製）上のマルトース結合タンパク質をコードする塩
基配列の３' 末端にフレームを合わせて融合させ、それ
ぞれＧＳＴ−Ｅｒｎ４ｐ、ＭＢＰ−Ｅｒｎ４ｐを発現さ
せた。両融合タンパク質は、１ｍＭのイソプロピルβ−
Ｄ−チオガラクトピラノシドで誘導させると、大腸菌で
効率よく発現し、製造者の説明書に従ってアフィニティ
ークロマトグラフィーにより精製した。
アミノ酸配列１０−２３０に相当）を、プラスミドｐＧ
ＥＸ−２ＴＫ（ファルマシア社製）上のグルタチオンＳ
−トランスフェラーゼをコードする塩基配列、又はプラ
スミドｐＭＡＬ−ｃ２（ニューイングランドバイオラブ
ズ社製）上のマルトース結合タンパク質をコードする塩
基配列の３' 末端にフレームを合わせて融合させ、それ
ぞれＧＳＴ−Ｅｒｎ４ｐ、ＭＢＰ−Ｅｒｎ４ｐを発現さ
せた。両融合タンパク質は、１ｍＭのイソプロピルβ−
Ｄ−チオガラクトピラノシドで誘導させると、大腸菌で
効率よく発現し、製造者の説明書に従ってアフィニティ
ークロマトグラフィーにより精製した。
【００６０】実施例９ＥＲＮ４遺伝子産物のＵＰＲＥへの特異的結合 ＵＰＲＥ（Ｙ，Ｔｖ１０，ＵＹ及びＴｖ２３４）並びに
ＣＲＥをコードする二本鎖の合成オリゴヌクレオチドの
５' 及び３' 両末端を、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅ
ｎｏｗ断片と[ α−32Ｐ] ｄＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍ
ｍｏｌ）を用いて放射標識し、８％ポリアクリルアミド
ゲルの電気泳動により精製した。結合用緩衝液の組成
は、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、５０ｍＭ
ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．２５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、０．５ｍＭ ジチオトレイトール、２％ フィコー
ル及び５％ グリセロールであった。０．２５〜０．３
ｎｇの放射標識プローブ（８，０００〜１０，０００ｃ
ｐｍ）、１μｇのポリ（ｄＩ−ｄＣ）：ポリ（ｄＩ−ｄ
Ｃ）（ファルマシア社製）及び１μｇの変性サケ精子Ｄ
ＮＡを含む結合緩衝液中に精製したＭＢＰ−Ｅｒｎ４ｐ
（０．１μｇ）又はＧＳＴ−Ｅｒｎ４ｐ（０．５μｇ）
を添加することにより、結合反応を開始した。５倍量の
ＧＳＴ−Ｅｒｎ４ｐを用いたのは、ＧＳＴ−Ｅｒｎ４ｐ
が凝集してゲルの上部に留まる傾向があるからである。
２０μｌの最終容量で４℃で１０分間インキュベーショ
ン後、試料を０．５％のフィコールを含む５％ ポリア
クリルアミドゲルで非変性条件下で電気泳動を行った
（アクリルアミドとビスアクリルアミドの比は３０：
０．８であった）。ゲルは、２〜３時間プレランし、
０．５ｘＴＢＥ中、４℃、１５０Ｖで３時間試料を泳動
した。それから、ゲルを乾燥させ、Ｘ線フィルムに曝し
た（図１１）。精製したＭＢＰ−Ｅｒｎ４ｐとＧＳＴ−
Ｅｒｎ４ｐは、両方ともＵＰＲＥ（Ｙ）およびＵＰＲＥ
（ＵＹ）に特異的に結合することがわかった。
ＣＲＥをコードする二本鎖の合成オリゴヌクレオチドの
５' 及び３' 両末端を、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅ
ｎｏｗ断片と[ α−32Ｐ] ｄＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍ
ｍｏｌ）を用いて放射標識し、８％ポリアクリルアミド
ゲルの電気泳動により精製した。結合用緩衝液の組成
は、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、５０ｍＭ
ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．２５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、０．５ｍＭ ジチオトレイトール、２％ フィコー
ル及び５％ グリセロールであった。０．２５〜０．３
ｎｇの放射標識プローブ（８，０００〜１０，０００ｃ
ｐｍ）、１μｇのポリ（ｄＩ−ｄＣ）：ポリ（ｄＩ−ｄ
Ｃ）（ファルマシア社製）及び１μｇの変性サケ精子Ｄ
ＮＡを含む結合緩衝液中に精製したＭＢＰ−Ｅｒｎ４ｐ
（０．１μｇ）又はＧＳＴ−Ｅｒｎ４ｐ（０．５μｇ）
を添加することにより、結合反応を開始した。５倍量の
ＧＳＴ−Ｅｒｎ４ｐを用いたのは、ＧＳＴ−Ｅｒｎ４ｐ
が凝集してゲルの上部に留まる傾向があるからである。
２０μｌの最終容量で４℃で１０分間インキュベーショ
ン後、試料を０．５％のフィコールを含む５％ ポリア
クリルアミドゲルで非変性条件下で電気泳動を行った
（アクリルアミドとビスアクリルアミドの比は３０：
０．８であった）。ゲルは、２〜３時間プレランし、
０．５ｘＴＢＥ中、４℃、１５０Ｖで３時間試料を泳動
した。それから、ゲルを乾燥させ、Ｘ線フィルムに曝し
た（図１１）。精製したＭＢＰ−Ｅｒｎ４ｐとＧＳＴ−
Ｅｒｎ４ｐは、両方ともＵＰＲＥ（Ｙ）およびＵＰＲＥ
（ＵＹ）に特異的に結合することがわかった。
【００６１】実施例１０Ｅｒｎ４ｐ活性化機構の解析 １０−１）ノーザンブロッティング法によるＥＲＮ４遺
伝子転写産物の解析 実施例１と同様にツニカマイシン処理したサッカロミセ
ス セレビシエの野生株及びｅｒｎ１Δ株から、一定時
間（０、１０、２０、３０、４５、６０分）毎に全ＲＮ
Ａを抽出し、１．５％アガロースホルムアミドゲルによ
る電気泳動に付した後、ノーザンブロッティング法によ
り、ＥＲＮ４、ＫＡＲ２及びＰＤＩ１に特異的なプロー
ブを用いてＥＲＮ４遺伝子転写産物の検出を行った。な
お、内部標準として、ＡＣＴ１（酵母アクチン）に特異
的なプローブを用いた（図１２）。また、図１２のオー
トラジオグラフィーの各バンドの放射線量をバイオイメ
ージングアナライザーＢＡＳ２０００（富士フィルム社
製）を用いて定量し、グラフ化した（図１３）。図１２
より、ツニカマイシン処理前の定常的に見られる１．４
ｋｂのバンド（レーン１及び３）は、ツニカマイシン処
理後、速やかに減少し、新たに２つの短いバンド（１．
２ｋｂ及び０．７ｋｂ）が生じた（レーン４〜８）。さ
らに、この現象は、ＫＡＲ２及びＰＤＩ１遺伝子の発現
誘導前に始まる（レーン４及び図１３）ことやｅｒｎ１
Δ株では見られない（レーン２）ことから、ストレス特
異的なＥＲＮ４遺伝子の転写後における調節機構の存在
が示唆された。
伝子転写産物の解析 実施例１と同様にツニカマイシン処理したサッカロミセ
ス セレビシエの野生株及びｅｒｎ１Δ株から、一定時
間（０、１０、２０、３０、４５、６０分）毎に全ＲＮ
Ａを抽出し、１．５％アガロースホルムアミドゲルによ
る電気泳動に付した後、ノーザンブロッティング法によ
り、ＥＲＮ４、ＫＡＲ２及びＰＤＩ１に特異的なプロー
ブを用いてＥＲＮ４遺伝子転写産物の検出を行った。な
お、内部標準として、ＡＣＴ１（酵母アクチン）に特異
的なプローブを用いた（図１２）。また、図１２のオー
トラジオグラフィーの各バンドの放射線量をバイオイメ
ージングアナライザーＢＡＳ２０００（富士フィルム社
製）を用いて定量し、グラフ化した（図１３）。図１２
より、ツニカマイシン処理前の定常的に見られる１．４
ｋｂのバンド（レーン１及び３）は、ツニカマイシン処
理後、速やかに減少し、新たに２つの短いバンド（１．
２ｋｂ及び０．７ｋｂ）が生じた（レーン４〜８）。さ
らに、この現象は、ＫＡＲ２及びＰＤＩ１遺伝子の発現
誘導前に始まる（レーン４及び図１３）ことやｅｒｎ１
Δ株では見られない（レーン２）ことから、ストレス特
異的なＥＲＮ４遺伝子の転写後における調節機構の存在
が示唆された。
【００６２】１０−２）ＲＴ−ＰＣＲ法による短鎖転写
産物の解析 前記４５分間ツニカマイシン処理した株の全ＲＮＡよ
り、オリゴ−ｄＴプライマー及び逆転写酵素を用いてｃ
ＤＮＡを合成した。該ｃＤＮＡを鋳型とし、ＥＲＮ４遺
伝子内部の領域から設計した種々のプライマー（図１
４）及び Takara ExTaq (宝酒造社製）を用いて、ＰＣ
Ｒを行った（図１５）。図１５より、５' 非翻訳領域の
プライマーｂ並びに３' 非翻訳領域のプライマーｏ若し
くはｍを用いた場合、ツニカマイシン処理したｃＤＮＡ
由来のＰＣＲ増幅産物中にのみ、予想される長さのバン
ドに加え、それより約２５０ｂｐ短いバンドが見られた
（レーン９、１１）。この長さの差は、前記ノーザンブ
ロッティングによる解析結果の１．４ｋｂから１．２ｋ
ｂへの変化に由来するものと考えられた。
産物の解析 前記４５分間ツニカマイシン処理した株の全ＲＮＡよ
り、オリゴ−ｄＴプライマー及び逆転写酵素を用いてｃ
ＤＮＡを合成した。該ｃＤＮＡを鋳型とし、ＥＲＮ４遺
伝子内部の領域から設計した種々のプライマー（図１
４）及び Takara ExTaq (宝酒造社製）を用いて、ＰＣ
Ｒを行った（図１５）。図１５より、５' 非翻訳領域の
プライマーｂ並びに３' 非翻訳領域のプライマーｏ若し
くはｍを用いた場合、ツニカマイシン処理したｃＤＮＡ
由来のＰＣＲ増幅産物中にのみ、予想される長さのバン
ドに加え、それより約２５０ｂｐ短いバンドが見られた
（レーン９、１１）。この長さの差は、前記ノーザンブ
ロッティングによる解析結果の１．４ｋｂから１．２ｋ
ｂへの変化に由来するものと考えられた。
【００６３】１０−３）ＲＴ−ＰＣＲ法による増幅産物
の塩基配列の決定 実施例３と同様に、前記ＰＣＲ増幅産物の塩基配列を決
定した。その結果、図１４のプライマーｆとプライマー
ｏの間に欠失が見出され、サッカロミセス セレビシエ
では頻度が少ないが、スプライシングにより、該欠失が
生じていることが示唆された。スプライシングの結果、
新しいオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が現
れ、２３０アミノ酸残基からなるＥｒｎ４ｐ（配列番
号：２）とは２２１位以降のアミノ酸配列が異なる、２
３８アミノ酸残基からなるポリペプチド（配列番号：
３）が生じた（図１６）。
の塩基配列の決定 実施例３と同様に、前記ＰＣＲ増幅産物の塩基配列を決
定した。その結果、図１４のプライマーｆとプライマー
ｏの間に欠失が見出され、サッカロミセス セレビシエ
では頻度が少ないが、スプライシングにより、該欠失が
生じていることが示唆された。スプライシングの結果、
新しいオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が現
れ、２３０アミノ酸残基からなるＥｒｎ４ｐ（配列番
号：２）とは２２１位以降のアミノ酸配列が異なる、２
３８アミノ酸残基からなるポリペプチド（配列番号：
３）が生じた（図１６）。
【００６４】１０−４）ノーザンブロッティング法によ
るスプライシングの解析 前記欠失が見出された領域（イントロンに相当）又は欠
失していない領域（エキソンに相当）に特異的にハイブ
リダイズする５種類のオリゴヌクレオチドプローブを合
成し（図１６）、ノーザンブロッティング解析を行った
（図１７）。図１７より、イントロン外の領域とハイブ
リダイズするプローブ（ａｆ、ｊｏ及びｌｍ）は、ツニ
カマイシン処理によるストレスにより誘導される１．２
ｋｂのバンドとハイブリダイズした（レーン２、８及び
１０）。一方、イントロンの領域とハイブリダイズする
プローブ（ｇｄ及びｈｉ）は、ツニカマイシン処理によ
るストレスにより誘導される１．２ｋｂのバンドとはハ
イブリダイズしない（レーン４、６）ことから、１．４
ｋｂから１．２ｋｂへのバンドの変化は、実際に約２５
０塩基がスプライシングにより取り除かれた結果生じる
現象であった。これらの３' 側の領域を認識するプロー
ブとはハイブリダイズしない０．７ｋｂのバンドは、５
' 側エキソンと予想された。
るスプライシングの解析 前記欠失が見出された領域（イントロンに相当）又は欠
失していない領域（エキソンに相当）に特異的にハイブ
リダイズする５種類のオリゴヌクレオチドプローブを合
成し（図１６）、ノーザンブロッティング解析を行った
（図１７）。図１７より、イントロン外の領域とハイブ
リダイズするプローブ（ａｆ、ｊｏ及びｌｍ）は、ツニ
カマイシン処理によるストレスにより誘導される１．２
ｋｂのバンドとハイブリダイズした（レーン２、８及び
１０）。一方、イントロンの領域とハイブリダイズする
プローブ（ｇｄ及びｈｉ）は、ツニカマイシン処理によ
るストレスにより誘導される１．２ｋｂのバンドとはハ
イブリダイズしない（レーン４、６）ことから、１．４
ｋｂから１．２ｋｂへのバンドの変化は、実際に約２５
０塩基がスプライシングにより取り除かれた結果生じる
現象であった。これらの３' 側の領域を認識するプロー
ブとはハイブリダイズしない０．７ｋｂのバンドは、５
' 側エキソンと予想された。
【００６５】１０−５）新規ＯＲＦ由来のポリペプチド
の転写調節活性能の測定 ＥＲＮ４遺伝子本来のプロモーターを用い、イントロン
を除いた新規ＯＲＦ由来のポリペプチドが発現するよう
に、前記シングルコピーベクターＹＣｐ−Ｌ２上にＤＮ
Ａを構築し、レポータープラスミド（ＵＰＲＥ（Ｙ）−
ＣＹＣ１−ｌａｃＺ）とともに、ｅｒｎ４Δ株に導入し
て、前記のように、β−ガラクトシダーゼ誘導活性を測
定した（図１８）。図１８より、新規ＯＲＦ由来のポリ
ペプチドは、ストレスのない状態でもβ−ガラクトシダ
ーゼ誘導活性があることから、このポリペプチドこそ
が、転写調節活性化能を有するＥｒｎ４ｐであることが
わかり、以下、活性型Ｅｒｎ４ｐと称する。Ｅｒｎ４ｐ
の活性は、ストレス特異的なスプライシングにより調節
を受けていることが示唆された。
の転写調節活性能の測定 ＥＲＮ４遺伝子本来のプロモーターを用い、イントロン
を除いた新規ＯＲＦ由来のポリペプチドが発現するよう
に、前記シングルコピーベクターＹＣｐ−Ｌ２上にＤＮ
Ａを構築し、レポータープラスミド（ＵＰＲＥ（Ｙ）−
ＣＹＣ１−ｌａｃＺ）とともに、ｅｒｎ４Δ株に導入し
て、前記のように、β−ガラクトシダーゼ誘導活性を測
定した（図１８）。図１８より、新規ＯＲＦ由来のポリ
ペプチドは、ストレスのない状態でもβ−ガラクトシダ
ーゼ誘導活性があることから、このポリペプチドこそ
が、転写調節活性化能を有するＥｒｎ４ｐであることが
わかり、以下、活性型Ｅｒｎ４ｐと称する。Ｅｒｎ４ｐ
の活性は、ストレス特異的なスプライシングにより調節
を受けていることが示唆された。
【００６６】
【発明の効果】本発明の転写調節因子Ｅｒｎ４ｐあるい
は活性型Ｅｒｎ４ｐを用いて、小胞体ストレスによるＧ
ＲＰ７８の転写誘導機構が解析され、酵母における有用
タンパク質の大量分泌発現が可能となる。
は活性型Ｅｒｎ４ｐを用いて、小胞体ストレスによるＧ
ＲＰ７８の転写誘導機構が解析され、酵母における有用
タンパク質の大量分泌発現が可能となる。
【００６７】
配列番号：１ 配列の長さ：２５３５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ 起源 生物名：サッカロミセス セレビシエ（Saccharomyces
cerevisiae） 株名：ＡＢ３２０ 配列 GGATCCGAGA ATAAGGTCTG CAATGTACGT CGGAGAAGAG CCACTATCAT CGGCGACTCC 60 TGTGATCGTG TTCCACTGTG GAGAGCCATA TCGCACCTTG CCGTCCAGTT CCAGCTCCAA 120 GATCATACAC GGATTCTTCT CTGTGGCCAG CTGCAGATAT TTTTCATAAT TGGAGGAAGT 180 CAATGAGCTT GGGTTCGAAT TCGATGATAT CGGGGAGAGC TTGTTTATGC CAAGTCCCTC 240 TTTCATAGCC TGAGATCCGC CTGCGGTGTT ACTTCTATTG AACATCTGTC TTCCTCTACT 300 GGGCTTATCT ATTCTATCAA ATGAGGCAAG AGAAAGGAAA GGGAAAAAAA AAAAGGGAAA 360 ATGCTTGATG AGTTAGGAAT TCAGTAAAAG CACCCACCAG AACCTCTACA GCAGGCCTTC 420 CAGGAGTGGT TAAGAGGATA GAGAATTCTG TATATATATA TACGTCTATA TCTATACAAA 480 AAACGGCAGA CAATGCAGAA GTTGAAAATG CTGTGATACG AACAACAACT TATTTTTACA 540 ATGAAAAACA ACACCAAGCT GCCAAAAGCT GTATATTAAA GTTAAAGCTC CCTCATTTTT 600 AGTAAGGACG CTTTCTTTTC CCACAAAAGG GACGAGGAAA AAAAGAAAAA CCTGGAAATA 660 TAGTCACGTG ACATGAATAA ACAAGACCTA GGGCAATATG GAAAAAGAAG CTAGGATAAA 720 AATACATTTA TGAGGGTTGT AAGGCAAAGT GGCTCAGCAT TAAGTAGGGC TAAAAAGAGT 780 CGCAAATATA CATCGTACCG AGTGATGAAC GTGGTTTTGA ACACCTTGTT CTCTTTTGTT 840 CTCGCTCCCT ACATTCACTA TATATTAGAA GAAATTTCAC CTCAATGGAC AACTCGAGAA 900 ATGAATACAG AAATATGTTT TTTAGCGAAA TTTTCCTTTC TTCTTGTCTT CTTGTTTTAT 960 TTAAACTTCC AAGGCTTTAA CTCAGTGTCA AACATAACAA CCTCCTCCTC CCCCACCTAC 1020 GACAACAACC GCCACTATGG AAATGACTGA TTTTGAACTA ACTAGTAATT CGCAATCGAA 1080 CTTGGCTATC CCTACCAACT TCAAGTCGAC TCTGCCTCCA AGGAAAAGAG CCAAGACAAA 1140 AGAGGAAAAG GAACAGCGAA GGATCGAGCG TATTTTGAGA AACAGAAGAG CTGCTCACCA 1200 GAGCAGAGAG AAAAAAAGAC TACATCTGCA GTATCTCGAG AGAAAATGTT CTCTTTTGGA 1260 AAATTTACTG AACAGCGTCA ACCTTGAAAA ACTGGCTGAC CACGAAGACG CGTTGACTTG 1320 CAGCCACGAC GCTTTTGTTG CTTCTCTTGA CGAGTACAGG GATTTCCAGA GCACGAGGGG 1380 CGCTTCACTG GACACCAGGG CCAGTTCGCA CTCGTCGTCT GATACGTTCA CACCTTCACC 1440 TCTGAACTGT ACAATGGAGC CTGCGACTTT GTCGCCCAAG AGTATGCGCG ATTCCGCGTC 1500 GGACCAAGAG ACTTCATGGG AGCTGCAGAT GTTTAAGACG GAAAATGTAC CAGAGTCGAC 1560 GACGCTACCT GCCGTAGACA ACAACAATTT GTTTGATGCG GTGGCCTCGC CGTTGGCAGA 1620 CCCACTCTGC GACGATATAG CGGGAAACAG TCTACCCTTT GACAATTCAA TTGATCTTGA 1680 CAATTGGCGT AATCCAGCCG TGATTACGAT GACCAGGAAA CTACAGTGAA CAAGAACACT 1740 AGCCCCAGCT TTTGCTTTCT GCTTTTTTTC TTTTTTTTTT TTTTTAGTCG TGGTTCTCTG 1800 ATGGGGGAGG AGCCGGTTAA AGTACCTTCA AAAGCAGAAT GCAGGGTTAT TGGAAGCTTT 1860 CTTTTTTTCT TTTATGCTAG TTTTTCCTGA ACAAATAGAG CCATTCTTTT CTTATTACTA 1920 AGAAATGGAC GGCTTGCTTG TACTGTCCGA AGCGCAGTCA GGTTTGAATT CATTTGAATT 1980 GAATGATTTC TTCATCACTT CATGAAGACA ATCGCAAGAG GGTATAATTT TTTTTTTCTC 2040 GTTATTATCG CTGTTGGTGG GTTTTTTCTT TTCATATATT TCTTTTTCGC TTAGTGGTTT 2100 CTACTGTTCT GTCTCCGGTT AGTGTGTGCT ACTTCAACCG AAGAAGAAGA GGCTTTTCAA 2160 GAATGCAAAC GTGAGGTTGG CGCGCCCTCC TACAATTATT TGTGGCGACT GGGCAGCGAC 2220 ACTGAACATA GCTCTTGAAC AAGACCCTTT TTTGGCTGCA AGGAGCAAGA CTGGCTGGGG 2280 TTCCACCTCA AAGAGCCACG CTCTGCTTTT TTTCTATCTG TTTGTGTCAT ATCTATCTGT 2340 CTATTTATCT ATATATATAT TTTTTTATAT AAAACTATAA AGAATTCTTG ATGTATGCCC 2400 TTAGGTTGGG CAGCTTTTCA ACCTTAGACT TGATGCTAAC GCCGCTCTGT TCCTTCTCCC 2460 GTGCTCCCGC AAGCGAACAT CTCCCCCTAA CTCCGGGCCA ATGAGTGATA ACTATATCAA 2520 ATACCTTCGA AAGGA 2535
cerevisiae） 株名：ＡＢ３２０ 配列 GGATCCGAGA ATAAGGTCTG CAATGTACGT CGGAGAAGAG CCACTATCAT CGGCGACTCC 60 TGTGATCGTG TTCCACTGTG GAGAGCCATA TCGCACCTTG CCGTCCAGTT CCAGCTCCAA 120 GATCATACAC GGATTCTTCT CTGTGGCCAG CTGCAGATAT TTTTCATAAT TGGAGGAAGT 180 CAATGAGCTT GGGTTCGAAT TCGATGATAT CGGGGAGAGC TTGTTTATGC CAAGTCCCTC 240 TTTCATAGCC TGAGATCCGC CTGCGGTGTT ACTTCTATTG AACATCTGTC TTCCTCTACT 300 GGGCTTATCT ATTCTATCAA ATGAGGCAAG AGAAAGGAAA GGGAAAAAAA AAAAGGGAAA 360 ATGCTTGATG AGTTAGGAAT TCAGTAAAAG CACCCACCAG AACCTCTACA GCAGGCCTTC 420 CAGGAGTGGT TAAGAGGATA GAGAATTCTG TATATATATA TACGTCTATA TCTATACAAA 480 AAACGGCAGA CAATGCAGAA GTTGAAAATG CTGTGATACG AACAACAACT TATTTTTACA 540 ATGAAAAACA ACACCAAGCT GCCAAAAGCT GTATATTAAA GTTAAAGCTC CCTCATTTTT 600 AGTAAGGACG CTTTCTTTTC CCACAAAAGG GACGAGGAAA AAAAGAAAAA CCTGGAAATA 660 TAGTCACGTG ACATGAATAA ACAAGACCTA GGGCAATATG GAAAAAGAAG CTAGGATAAA 720 AATACATTTA TGAGGGTTGT AAGGCAAAGT GGCTCAGCAT TAAGTAGGGC TAAAAAGAGT 780 CGCAAATATA CATCGTACCG AGTGATGAAC GTGGTTTTGA ACACCTTGTT CTCTTTTGTT 840 CTCGCTCCCT ACATTCACTA TATATTAGAA GAAATTTCAC CTCAATGGAC AACTCGAGAA 900 ATGAATACAG AAATATGTTT TTTAGCGAAA TTTTCCTTTC TTCTTGTCTT CTTGTTTTAT 960 TTAAACTTCC AAGGCTTTAA CTCAGTGTCA AACATAACAA CCTCCTCCTC CCCCACCTAC 1020 GACAACAACC GCCACTATGG AAATGACTGA TTTTGAACTA ACTAGTAATT CGCAATCGAA 1080 CTTGGCTATC CCTACCAACT TCAAGTCGAC TCTGCCTCCA AGGAAAAGAG CCAAGACAAA 1140 AGAGGAAAAG GAACAGCGAA GGATCGAGCG TATTTTGAGA AACAGAAGAG CTGCTCACCA 1200 GAGCAGAGAG AAAAAAAGAC TACATCTGCA GTATCTCGAG AGAAAATGTT CTCTTTTGGA 1260 AAATTTACTG AACAGCGTCA ACCTTGAAAA ACTGGCTGAC CACGAAGACG CGTTGACTTG 1320 CAGCCACGAC GCTTTTGTTG CTTCTCTTGA CGAGTACAGG GATTTCCAGA GCACGAGGGG 1380 CGCTTCACTG GACACCAGGG CCAGTTCGCA CTCGTCGTCT GATACGTTCA CACCTTCACC 1440 TCTGAACTGT ACAATGGAGC CTGCGACTTT GTCGCCCAAG AGTATGCGCG ATTCCGCGTC 1500 GGACCAAGAG ACTTCATGGG AGCTGCAGAT GTTTAAGACG GAAAATGTAC CAGAGTCGAC 1560 GACGCTACCT GCCGTAGACA ACAACAATTT GTTTGATGCG GTGGCCTCGC CGTTGGCAGA 1620 CCCACTCTGC GACGATATAG CGGGAAACAG TCTACCCTTT GACAATTCAA TTGATCTTGA 1680 CAATTGGCGT AATCCAGCCG TGATTACGAT GACCAGGAAA CTACAGTGAA CAAGAACACT 1740 AGCCCCAGCT TTTGCTTTCT GCTTTTTTTC TTTTTTTTTT TTTTTAGTCG TGGTTCTCTG 1800 ATGGGGGAGG AGCCGGTTAA AGTACCTTCA AAAGCAGAAT GCAGGGTTAT TGGAAGCTTT 1860 CTTTTTTTCT TTTATGCTAG TTTTTCCTGA ACAAATAGAG CCATTCTTTT CTTATTACTA 1920 AGAAATGGAC GGCTTGCTTG TACTGTCCGA AGCGCAGTCA GGTTTGAATT CATTTGAATT 1980 GAATGATTTC TTCATCACTT CATGAAGACA ATCGCAAGAG GGTATAATTT TTTTTTTCTC 2040 GTTATTATCG CTGTTGGTGG GTTTTTTCTT TTCATATATT TCTTTTTCGC TTAGTGGTTT 2100 CTACTGTTCT GTCTCCGGTT AGTGTGTGCT ACTTCAACCG AAGAAGAAGA GGCTTTTCAA 2160 GAATGCAAAC GTGAGGTTGG CGCGCCCTCC TACAATTATT TGTGGCGACT GGGCAGCGAC 2220 ACTGAACATA GCTCTTGAAC AAGACCCTTT TTTGGCTGCA AGGAGCAAGA CTGGCTGGGG 2280 TTCCACCTCA AAGAGCCACG CTCTGCTTTT TTTCTATCTG TTTGTGTCAT ATCTATCTGT 2340 CTATTTATCT ATATATATAT TTTTTTATAT AAAACTATAA AGAATTCTTG ATGTATGCCC 2400 TTAGGTTGGG CAGCTTTTCA ACCTTAGACT TGATGCTAAC GCCGCTCTGT TCCTTCTCCC 2460 GTGCTCCCGC AAGCGAACAT CTCCCCCTAA CTCCGGGCCA ATGAGTGATA ACTATATCAA 2520 ATACCTTCGA AAGGA 2535
【００６８】配列番号：２ 配列の長さ：２３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Glu Met Thr Asp Phe Glu Leu Thr Ser Asn Ser Gln Ser Asn Leu 1 5 10 15 Ala Ile Pro Thr Asn Phe Lys Ser Thr Leu Pro Pro Arg Lys Arg Ala 20 25 30 Lys Thr Lys Glu Glu Lys Glu Gln Arg Arg Ile Glu Arg Ile Leu Arg 35 40 45 Asn Arg Arg Ala Ala His Gln Ser Arg Glu Lys Lys Arg Leu His Leu 50 55 60 Gln Tyr Leu Glu Arg Lys Cys Ser Leu Leu Glu Asn Leu Leu Asn Ser 65 70 75 80 Val Asn Leu Glu Lys Leu Ala Asp His Glu Asp Ala Leu Thr Cys Ser 85 90 95 His Asp Ala Phe Val Ala Ser Leu Asp Glu Tyr Arg Asp Phe Gln Ser 100 105 110 Thr Arg Gly Ala Ser Leu Asp Thr Arg Ala Ser Ser His Ser Ser Ser 115 120 125 Asp Thr Phe Thr Pro Ser Pro Leu Asn Cys Thr Met Glu Pro Ala Thr 130 135 140 Leu Ser Pro Lys Ser Met Arg Asp Ser Ala Ser Asp Gln Glu Thr Ser 145 150 155 160 Trp Glu Leu Gln Met Phe Lys Thr Glu Asn Val Pro Glu Ser Thr Thr 165 170 175 Leu Pro Ala Val Asp Asn Asn Asn Leu Phe Asp Ala Val Ala Ser Pro 180 185 190 Leu Ala Asp Pro Leu Cys Asp Asp Ile Ala Gly Asn Ser Leu Pro Phe 195 200 205 Asp Asn Ser Ile Asp Leu Asp Asn Trp Arg Asn Pro Ala Val Ile Thr 210 215 220 Met Thr Arg Lys Leu Gln 225 230
【００６９】配列番号：３ 配列の長さ：２３８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Glu Met Thr Asp Phe Glu Leu Thr Ser Asn Ser Gln Ser Asn Leu 1 5 10 15 Ala Ile Pro Thr Asn Phe Lys Ser Thr Leu Pro Pro Arg Lys Arg Ala 20 25 30 Lys Thr Lys Glu Glu Lys Glu Gln Arg Arg Ile Glu Arg Ile Leu Arg 35 40 45 Asn Arg Arg Ala Ala His Gln Ser Arg Glu Lys Lys Arg Leu His Leu 50 55 60 Gln Tyr Leu Glu Arg Lys Cys Ser Leu Leu Glu Asn Leu Leu Asn Ser 65 70 75 80 Val Asn Leu Glu Lys Leu Ala Asp His Glu Asp Ala Leu Thr Cys Ser 85 90 95 His Asp Ala Phe Val Ala Ser Leu Asp Glu Tyr Arg Asp Phe Gln Ser 100 105 110 Thr Arg Gly Ala Ser Leu Asp Thr Arg Ala Ser Ser His Ser Ser Ser 115 120 125 Asp Thr Phe Thr Pro Ser Pro Leu Asn Cys Thr Met Glu Pro Ala Thr 130 135 140 Leu Ser Pro Lys Ser Met Arg Asp Ser Ala Ser Asp Gln Glu Thr Ser 145 150 155 160 Trp Glu Leu Gln Met Phe Lys Thr Glu Asn Val Pro Glu Ser Thr Thr 165 170 175 Leu Pro Ala Val Asp Asn Asn Asn Leu Phe Asp Ala Val Ala Ser Pro 180 185 190 Leu Ala Asp Pro Leu Cys Asp Asp Ile Ala Gly Asn Ser Leu Pro Phe 195 200 205 Asp Asn Ser Ile Asp Leu Asp Asn Trp Arg Asn Pro Glu Ala Gln Ser 210 215 220 Gly Leu Asn Ser Phe Glu Leu Asn Asp Phe Phe Ile Thr Ser 225 230 235
【図１】図１は、酵母野生株ＫＭＹ１００５を１〜１９
番目のＵＰＲＥ配列の点変異を含むレポータープラスミ
ドで形質転換し、ツニカマイシン（ＴＭ）で処理したと
きのβ−ガラクトシダーゼ活性を示す図である。図中、
Ｙは親のＵＰＲＥの配列を示す。
番目のＵＰＲＥ配列の点変異を含むレポータープラスミ
ドで形質転換し、ツニカマイシン（ＴＭ）で処理したと
きのβ−ガラクトシダーゼ活性を示す図である。図中、
Ｙは親のＵＰＲＥの配列を示す。
【図２】図２は、ＵＰＲＥの１３番目のＣを置換、欠失
または挿入し、図１と同様の方法で形質転換したときの
β−ガラクトシダーゼ活性を示す図である。
または挿入し、図１と同様の方法で形質転換したときの
β−ガラクトシダーゼ活性を示す図である。
【図３】図３は、レポータープラスミドｐＲＣＥ４の概
略図である。
略図である。
【図４】図４は、プラスミドベクターｐＡＣＴの概略図
である。ＧＡＬ４（ａｄ）の下流にｃＤＮＡ（ＥＲＮ
４）を挿入する。ＥＲＮ４からコードされるタンパク質
の構造を下方に示す。
である。ＧＡＬ４（ａｄ）の下流にｃＤＮＡ（ＥＲＮ
４）を挿入する。ＥＲＮ４からコードされるタンパク質
の構造を下方に示す。
【図５】図５は、ＳＥＣ+ のＥＲＮ+ 株、ｅｒｎ１Δ株
及びｅｒｎ４Δ株を、Ｇａｌ４ｐ（ａｄ）−Ｅｒｎ４ｐ
の融合タンパク質を発現させるベクターとレポータープ
ラスミドで形質転換し、ストレス処理をしないでβ−ガ
ラクトシダーゼを測定した結果を示す図である。図中の
挿入部分は、イムノブロッティング法による各形質転換
体より抽出したタンパク質（５０μｇ）中のＫａｒ２ｐ
とＰｄｉ１ｐの量を示す図である。
及びｅｒｎ４Δ株を、Ｇａｌ４ｐ（ａｄ）−Ｅｒｎ４ｐ
の融合タンパク質を発現させるベクターとレポータープ
ラスミドで形質転換し、ストレス処理をしないでβ−ガ
ラクトシダーゼを測定した結果を示す図である。図中の
挿入部分は、イムノブロッティング法による各形質転換
体より抽出したタンパク質（５０μｇ）中のＫａｒ２ｐ
とＰｄｉ１ｐの量を示す図である。
【図６】図６は、シングルコピーのＵＰＲＥ（Ｙ）−Ｃ
ＹＣ１−ｌａｃＺレポーター遺伝子を有するＳＥＣ+ の
ＥＲＮ+ 株、ｅｒｎ１Δ株及びｅｒｎ４Δ株を、ツニカ
マイシン（ＴＭ）で無処理または処理したときのβ−ガ
ラクトシダーゼ活性を示す図である。図中の挿入部分
は、前述の培養株の一部（２μｌ）をイノシトールを含
む（＋）または含まない（−）ＳＣ（−Ｕｒａ）プレー
ト上で培養した結果を表す図である。
ＹＣ１−ｌａｃＺレポーター遺伝子を有するＳＥＣ+ の
ＥＲＮ+ 株、ｅｒｎ１Δ株及びｅｒｎ４Δ株を、ツニカ
マイシン（ＴＭ）で無処理または処理したときのβ−ガ
ラクトシダーゼ活性を示す図である。図中の挿入部分
は、前述の培養株の一部（２μｌ）をイノシトールを含
む（＋）または含まない（−）ＳＣ（−Ｕｒａ）プレー
ト上で培養した結果を表す図である。
【図７】図７は、シングルコピーのＵＰＲＥ（Ｙ）−Ｃ
ＹＣ１−ｌａｃＺレポーター遺伝子を有するＥＲＮ
+ 株、ｅｒｎ１Δ株及びｅｒｎ４Δ株に、シングルコピ
ー（ＹＣｐ）もしくはマルチコピー（ＹＥｐ）のＥＲＮ
１発現プラスミドまたはシングルコピー（ＹＣｐ）もし
くはマルチコピー（ＹＥｐ）のＥＲＮ４発現プラスミド
を導入したときのβ−ガラクトシダーゼ活性を示す図で
ある。
ＹＣ１−ｌａｃＺレポーター遺伝子を有するＥＲＮ
+ 株、ｅｒｎ１Δ株及びｅｒｎ４Δ株に、シングルコピ
ー（ＹＣｐ）もしくはマルチコピー（ＹＥｐ）のＥＲＮ
１発現プラスミドまたはシングルコピー（ＹＣｐ）もし
くはマルチコピー（ＹＥｐ）のＥＲＮ４発現プラスミド
を導入したときのβ−ガラクトシダーゼ活性を示す図で
ある。
【図８】図８は、シングルコピーのＵＰＲＥ（Ｙ）−Ｃ
ＹＣ１−ｌａｃＺレポーター遺伝子を有するｓｅｃ５３
のＥＲＮ+ 株、ｅｒｎ１Δ株及びｅｒｎ４Δ株を、２３
℃（小胞体内のアンフォールドタンパク質（−））また
は３０℃（小胞体内のアンフォールドタンパク質
（＋））で培養後、抽出した全ＲＮＡをノーザンハイブ
リダイゼーション法により解析したオートラジオグラフ
ィーの結果を示す電気泳動の写真である。
ＹＣ１−ｌａｃＺレポーター遺伝子を有するｓｅｃ５３
のＥＲＮ+ 株、ｅｒｎ１Δ株及びｅｒｎ４Δ株を、２３
℃（小胞体内のアンフォールドタンパク質（−））また
は３０℃（小胞体内のアンフォールドタンパク質
（＋））で培養後、抽出した全ＲＮＡをノーザンハイブ
リダイゼーション法により解析したオートラジオグラフ
ィーの結果を示す電気泳動の写真である。
【図９】図９は、シングルコピーのＵＰＲＥ（Ｙ）−Ｃ
ＹＣ１−ｌａｃＺレポーター遺伝子とシングルコピーの
（ＹＣｐ）発現プラスミドを有するｓｅｃ５３のＥＲＮ
+ 株、ｅｒｎ１Δ株及びｅｒｎ４Δ株を、２３℃で一晩
培養後、希釈してさらに３０℃で培養し、各時点でのβ
−ガラクトシダーゼ活性と細胞の生存率を示す図であ
る。図中の記号は、図１０のパネルの上部に示す記号と
同じ内容を示す。
ＹＣ１−ｌａｃＺレポーター遺伝子とシングルコピーの
（ＹＣｐ）発現プラスミドを有するｓｅｃ５３のＥＲＮ
+ 株、ｅｒｎ１Δ株及びｅｒｎ４Δ株を、２３℃で一晩
培養後、希釈してさらに３０℃で培養し、各時点でのβ
−ガラクトシダーゼ活性と細胞の生存率を示す図であ
る。図中の記号は、図１０のパネルの上部に示す記号と
同じ内容を示す。
【図１０】図１０は、３０℃で培養した図９の各株から
２時間毎に総タンパク質を調製し、その１０μｇを用い
るイムノブロッティング法により検出されたＫａｒ２ｐ
とＰｄｉ１ｐの量を示す電気泳動の写真である。
２時間毎に総タンパク質を調製し、その１０μｇを用い
るイムノブロッティング法により検出されたＫａｒ２ｐ
とＰｄｉ１ｐの量を示す電気泳動の写真である。
【図１１】図１１は、精製したＥｒｎ４ｐ融合タンパク
質と32Ｐ標識合成二本鎖オリゴヌクレオチドを用いるゲ
ルシフトアッセイのオートラジオグラフィーの結果を示
す電気泳動の写真である。
質と32Ｐ標識合成二本鎖オリゴヌクレオチドを用いるゲ
ルシフトアッセイのオートラジオグラフィーの結果を示
す電気泳動の写真である。
【図１２】図１２は、ツニカマイシン処理したサッカロ
ミセス セレビシエの野生株及びｅｒｎ１Δ株から、一
定時間毎に全ＲＮＡを抽出し、ノーザンブロッティング
法により、ＥＲＮ４、ＫＡＲ２、ＰＤＩ１及びＡＣＴ１
（内部標準）のｍＲＮＡの検出を行ったオートラジオグ
ラフィーの結果を示す電気泳動の写真である。レーン
１、２は、ｅｒｎ１Δ株のツニカマイシン処理後、それ
ぞれ、０、６０分のＲＮＡ、レーン３〜８は、野生株の
ツニカマイシン処理後、それぞれ、０、１０、２０、３
０、４５、６０分のＲＮＡを表す。
ミセス セレビシエの野生株及びｅｒｎ１Δ株から、一
定時間毎に全ＲＮＡを抽出し、ノーザンブロッティング
法により、ＥＲＮ４、ＫＡＲ２、ＰＤＩ１及びＡＣＴ１
（内部標準）のｍＲＮＡの検出を行ったオートラジオグ
ラフィーの結果を示す電気泳動の写真である。レーン
１、２は、ｅｒｎ１Δ株のツニカマイシン処理後、それ
ぞれ、０、６０分のＲＮＡ、レーン３〜８は、野生株の
ツニカマイシン処理後、それぞれ、０、１０、２０、３
０、４５、６０分のＲＮＡを表す。
【図１３】図１３は、図１２のレーン３〜８のオートラ
ジオグラフィーの各バンドの放射線量を、バイオイメー
ジングアナライザーＢＡＳ２０００（富士フィルム社
製）を用いて定量し、グラフ化した図である。
ジオグラフィーの各バンドの放射線量を、バイオイメー
ジングアナライザーＢＡＳ２０００（富士フィルム社
製）を用いて定量し、グラフ化した図である。
【図１４】図１４は、ＥＲＮ４遺伝子とプライマーの位
置を示す模式図である。
置を示す模式図である。
【図１５】図１５は、４５分間ツニカマイシン処理した
野生株の全ＲＮＡより、図１４の種々のプライマーを用
いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った電気泳動の写真である。レ
ーン１、１２は、分子量マーカーを示す。レーン２、３
は、プライマーｂとプライマーｆ、レーン４、５は、プ
ライマーｂとプライマーｄ、レーン６、７は、プライマ
ーｂとプライマーｉ、レーン８、９は、プライマーｂと
プライマーｏ、レーン１０、１１は、プライマーｂとプ
ライマーｍを用いた結果を表し、それぞれ、偶数番号
は、ツニカマイシン処理なし、奇数番号は、ツニカマイ
シン処理ありを示す。
野生株の全ＲＮＡより、図１４の種々のプライマーを用
いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った電気泳動の写真である。レ
ーン１、１２は、分子量マーカーを示す。レーン２、３
は、プライマーｂとプライマーｆ、レーン４、５は、プ
ライマーｂとプライマーｄ、レーン６、７は、プライマ
ーｂとプライマーｉ、レーン８、９は、プライマーｂと
プライマーｏ、レーン１０、１１は、プライマーｂとプ
ライマーｍを用いた結果を表し、それぞれ、偶数番号
は、ツニカマイシン処理なし、奇数番号は、ツニカマイ
シン処理ありを示す。
【図１６】図１６は、新規ＯＲＦの配置と図１７のノー
ザンブロッティング法に用いるプローブの位置を示す模
式図である。
ザンブロッティング法に用いるプローブの位置を示す模
式図である。
【図１７】図１７は、図１６のプローブを用いたノーザ
ンブロッティング法による電気泳動の写真である。レー
ン１、２は、プローブａｆ、レーン３、４は、プローブ
ｇｄ、レーン５、６は、プローブｈｉ、レーン７、８
は、プローブｊｏ、レーン９、１０は、プローブｌｍを
用いた結果を表し、それぞれ、奇数番号は、ツニカマイ
シン処理なし、偶数番号は、ツニカマイシン処理ありを
示す。
ンブロッティング法による電気泳動の写真である。レー
ン１、２は、プローブａｆ、レーン３、４は、プローブ
ｇｄ、レーン５、６は、プローブｈｉ、レーン７、８
は、プローブｊｏ、レーン９、１０は、プローブｌｍを
用いた結果を表し、それぞれ、奇数番号は、ツニカマイ
シン処理なし、偶数番号は、ツニカマイシン処理ありを
示す。
【図１８】図１８は、イントロンを除いた新規ＯＲＦ由
来のポリペプチドの発現によるβ−ガラクトシダーゼ誘
導活性を示す図である。
来のポリペプチドの発現によるβ−ガラクトシダーゼ誘
導活性を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865）
Claims (19)
- 【請求項１】 配列表の配列番号：２に記載のアミノ酸
配列、又はその一部であって、かつ、転写調節活性を有
するポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤＮ
Ａ。 - 【請求項２】 配列表の配列番号：３に記載のアミノ酸
配列、又はその一部であって、かつ、転写調節活性を有
するポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤＮ
Ａ。 - 【請求項３】 配列表の配列番号：１に記載の塩基配
列、又はその一部であって、かつ、転写調節活性を有す
るポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する請求項１
又は２記載のＤＮＡ。 - 【請求項４】 配列表の配列番号：２に記載のアミノ酸
配列、又はその一部からなるアミノ酸配列において、１
又は２以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換
の少なくとも１つを生じさせ、かつ、転写調節活性を有
するポリペプチドをコードするＤＮＡ。 - 【請求項５】 配列表の配列番号：３に記載のアミノ酸
配列、又はその一部からなるアミノ酸配列において、１
又は２以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換
の少なくとも１つを生じさせ、かつ、転写調節活性を有
するポリペプチドをコードするＤＮＡ。 - 【請求項６】 請求項１〜５いずれか記載のＤＮＡにハ
イブリダイズ可能なＤＮＡであって、かつ、転写調節活
性又はその機能的に同等の活性を有するポリペプチドを
コードするＤＮＡ。 - 【請求項７】 ＤＮＡがサッカロミセス セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）の転写調節因子遺伝子Ｅ
ＲＮ４、又はその変異遺伝子である請求項１〜６いずれ
か記載のＤＮＡ。 - 【請求項８】 請求項１〜７いずれか記載のＤＮＡによ
りコードされるポリペプチド。 - 【請求項９】 酵母内で機能する転写調節因子の転写活
性化ドメインと請求項８記載のポリペプチドとの融合タ
ンパク質。 - 【請求項１０】 転写活性化ドメインがサッカロミセス
セレビシエの転写調節因子Ｇａｌ４ｐの転写活性化ド
メインＧａｌ４ｐ（ａｄ）である請求項９記載の融合タ
ンパク質。 - 【請求項１１】 請求項９又は１０記載の融合タンパク
質をコードするＤＮＡ。 - 【請求項１２】 請求項１〜７又は１１いずれか記載の
ＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ。 - 【請求項１３】 請求項１２記載の組換えＤＮＡを含有
する発現ベクター。 - 【請求項１４】 請求項８記載のポリペプチド又は請求
項９もしくは１０記載の融合タンパク質と特異的に結合
する抗体又はその断片。 - 【請求項１５】 ＥＲＮ４遺伝子を破壊したサッカロミ
セス セレビシエ変異株であるｅｒｎ４Δ。 - 【請求項１６】 請求項１３記載の発現ベクターで酵母
を形質転換することを特徴とする酵母小胞体内腔の分子
シャペロン及びフォールディング酵素を制御する方法。 - 【請求項１７】 酵母がＥＲＮ４遺伝子を破壊した変異
株ｅｒｎ４Δである請求項１６記載の制御方法。 - 【請求項１８】 請求項１３記載の発現ベクターと外来
タンパク質発現ベクターで酵母を形質転換することを特
徴とする外来タンパク質の発現方法。 - 【請求項１９】 酵母がＥＲＮ４遺伝子を破壊した変異
株ｅｒｎ４Δである請求項１８記載の外来タンパク質の
発現方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8307085A JPH1084970A (ja) | 1996-07-23 | 1996-10-31 | 新規転写調節因子 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8-213180 | 1996-07-23 | ||
| JP21318096 | 1996-07-23 | ||
| JP8307085A JPH1084970A (ja) | 1996-07-23 | 1996-10-31 | 新規転写調節因子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1084970A true JPH1084970A (ja) | 1998-04-07 |
Family
ID=26519650
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8307085A Pending JPH1084970A (ja) | 1996-07-23 | 1996-10-31 | 新規転写調節因子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1084970A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001072783A3 (en) * | 2000-03-24 | 2002-07-18 | Genencor Int | Production of secreted proteins by recombinant eukaryotic cells |
| CN1111602C (zh) * | 1998-05-15 | 2003-06-18 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 一种使用分子伴侣促进蛋白质分泌的方法 |
| CN113999870A (zh) * | 2020-02-26 | 2022-02-01 | 森瑞斯生物科技(深圳)有限公司 | 一种表达cbdas的重组酿酒酵母及其构建方法和应用 |
-
1996
- 1996-10-31 JP JP8307085A patent/JPH1084970A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1111602C (zh) * | 1998-05-15 | 2003-06-18 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 一种使用分子伴侣促进蛋白质分泌的方法 |
| WO2001072783A3 (en) * | 2000-03-24 | 2002-07-18 | Genencor Int | Production of secreted proteins by recombinant eukaryotic cells |
| CN113999870A (zh) * | 2020-02-26 | 2022-02-01 | 森瑞斯生物科技(深圳)有限公司 | 一种表达cbdas的重组酿酒酵母及其构建方法和应用 |
| CN113999870B (zh) * | 2020-02-26 | 2024-02-20 | 森瑞斯生物科技(深圳)有限公司 | 一种表达cbdas的重组酿酒酵母及其构建方法和应用 |
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