JPH1084977A - ヒトマクロスカベンジャー受容体 - Google Patents

ヒトマクロスカベンジャー受容体

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JPH1084977A
JPH1084977A JP9170866A JP17086697A JPH1084977A JP H1084977 A JPH1084977 A JP H1084977A JP 9170866 A JP9170866 A JP 9170866A JP 17086697 A JP17086697 A JP 17086697A JP H1084977 A JPH1084977 A JP H1084977A
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marco
gly
dna
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JP9170866A
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Nabil Abd Elsalam Elshourbagy
ナビル・アブド・エルサラム・エルショーアバギー
Edward Adamou John
ジョン・エドワード・アダモー
Mitchell Stuart Gross
ミッチェル・スチュアート・グロス
George Lysko Paul
ポール・ジョージ・リスコ
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SmithKline Beecham Corp
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 心血管系傷害の一つである、アテローム性動
脈硬化症などの治療に有用な物質の開発が望まれてい
る。 【解決手段】 本発明は、種々の心血管系障害、四肢の
壊疽および機能障害の治療に有用なヒトマルコスカベン
ジャー受容体ポリペプチド（ＨマルコＳＲ）およびその
産生方法を開示するものである。さらにはＨマルコＳＲ
をコードするポリヌクレオチドの変異の検出、および宿
主中の該ポリペプチドのレベルの変化を検出のための診
断検定をも開示する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は一つの態様において
新規に同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ド；ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの変異型およ
び誘導体；ポリヌクレオチドおよびポリペプチド並びに
その変異型および誘導体の製造方法；ポリペプチドのア
ゴニストおよびアンタゴニスト；ポリヌクレオチド、ポ
リペプチド、変異型、誘導体アゴニストおよびアンタゴ
ニストに関する。これらのおよびその他の点に関して、
本発明はとりわけ、本明細書で「ＨマルコＳＲポリペプ
チド」または簡単に「ＨマルコＳＲ」と称する、ヒトマ
ルコスカベンジャー受容体のポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】心臓
血管系疾患は米国における主要な死亡原因であり、年間
100万人以上ものヒトが死亡している。心臓血管系異常
の一つであるアテローム性動脈硬化症は米国、ヨーロッ
パおよび日本の全死亡率の５０％を占める。アテローム
性動脈硬化症は心臓発作、心筋および脳の梗塞、アンギ
ナ、器官不全、発作、並びに四肢の壊疽および機能喪失
の主要な原因である。
【０００３】アテローム性動脈硬化症の一因となる多く
の危険因子には：高血圧、全血清コレステロールの上
昇、高レベルの低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレス
テロール、低レベルの高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）
コレステロール、糖尿病、重篤な肥満症および喫煙等が
あるということは、広く支持されている。しかしなが
ら、アテローム性動脈硬化症の進行における非脂質因子
の役割に焦点を当てている研究はまだ少なく、改変脂質
が処置および研究の主要な焦点となっている。これはア
テローム性動脈硬化症の病変に優越性を示すのが困難な
ためであり、従って、アテローム性動脈硬化症の処置
は、上昇したコレステロール値の直接的な処置に偏狭的
に焦点が当てられている。包括的なＭＲＦＩＴ研究では
冠動脈性心臓疾患による死亡の４０％は、全コレステロ
ールが２２０ｍｇ／ｄｌ未満のヒトに起こるので、脂質
低下があまりにも強調されすぎているのは明らかであ
る。実際に、アテローム性動脈硬化症の患者の３０％し
か脂質が上昇しておらず、その他の病因が関与している
ことが明確に示されている。
【０００４】アテローム性動脈硬化症の有効な予防およ
び処置はまだ達成されていないので、アテローム性動脈
硬化症の病因および可能な処置並びにそれの結果を明ら
かにすることに相当な努力が為されている。この努力に
かかわらず、いつ、どのようにアテローム性動脈硬化症
の病変が命を脅かすようになるのか、介在の最良点、お
よび病変の進行の検出および監視の方法等、多くの未解
決の問題が残されている。マクロファージは正常および
病理学的過程における宿主防御系で重要な役割を果た
し、アテローム性動脈硬化症等の幾つかの疾患の進行お
よび病因にも関与する。マクロファージスカベンジャー
受容体は、動脈壁の改変低密度リポタンパク質（ＬＤ
Ｌ）の摂取を媒介することによりアテローム発生におい
て、および細菌性内毒素、細菌および原生動物に結合す
ることにより宿主防御において重要な役割を果たす。
【０００５】動脈壁でのＬＤＬの改変および続いてスカ
ベンジャー受容体媒介によるそれのマクロファージ中へ
の摂取は、アテローム性動脈硬化症の形成中のリポタン
パク質コレステロールの沈着に重要な役割を果たすとい
うことが提示されている。マクロファージおよび平滑筋
細胞（ＳＭＣ）由来の脂質堆積泡沫細胞の蓄積は、進行
中のアテローム性動脈硬化症のプラークの動脈内膜にお
ける特徴的な初期変化の一つである。マクロファージお
よびＳＭＣの泡沫細胞への転換を先導する過程は、スカ
ベンジャー受容体が関与していると思われる。多くのイ
ンビトロおよびインビボ研究はこのアテローム発生のモ
デルを支持している。例えば、改変ＬＤＬをインビトロ
でインキュベーションした後、ウシスカベンジャー受容
体を発現するＣＨＯ細胞は、プラーク中のマクロファー
ジに類似した脂質堆積細胞に変換し得る。また、スカベ
ンジャー受容体ｍＲＮＡおよびタンパク質並びに改変Ｌ
ＤＬはアテローム性動脈硬化症のプラーク中に検出され
る。（アテローム性動脈硬化症の症状におけるスカベン
ジャー受容体の重要性に関する記載については、Kriege
rら、The Journal of Biological Chemistry，268(7):4
569-4572（1993）およびそこに引用されている参考文献
を参照されたい。）アテローム性動脈硬化症およびその
合併症の研究および実際的な処置にはスカベンジャー受
容体が重要な手段であることは明らかである。
【０００６】培養中の細胞へのＯｘ−ＬＤＬ（酸化ＬＤ
Ｌ）およびＡｃ−ＬＤＬ（アセチル化ＬＤＬ）の結合に
関する研究により、単一のスカベンジャー受容体型が全
ての観察された相互作用および摂取特性の原因となるわ
けではないということが示されている。極最近、マルコ
スカベンジャー受容体（ＭマルコＳＲ）と称するスカベ
ンジャー受容体ファミリーの新規な一つが、マウスマク
ロファージｃＤＮＡライブラリーからクローン化された
（Elomaら、Cell，80:603-609（1995））。マルコスカ
ベンジャー受容体は酵母ではなくグラム陽性および陰性
の細菌の結合にも関係している。マルコおよびスカベン
ジャー受容体のＣ末端領域ＶおよびＶＩは、各々類似の
間隔で6個のシステイン残基を含有する高度の相同性を
示す。このスカベンジャー受容体のシステインに富むモ
チーフは、多くのその他のタンパク質で見出されてい
る。これらのタンパク質は免疫系および宿主防御機能
（Ｔセル、Ｂセルおよびマクロファージ）に関与する細
胞の表面に発現するか、または分泌され、宿主防御に関
与していることが知られているか、またはそのに対する
感受性がある。
【０００７】マルコの細菌への結合および特定のマクロ
ファージサブ集団におけるこのタンパク質の発現は、こ
れが免疫学的反応において役割を担っていることが示し
ている。マルコが高度に発現する脾臓の辺縁部分のマク
ロファージは、多くの点で非常に特異な集団を形成す
る。大きなマクロファージは、血液流が小動脈を離れ、
いわゆるオープ静脈系へ入る、脾臓の解剖学的区画に戦
略的に存在する。ここでは、食作用系は最初に血液由来
の病原物質と接触し、高度な食作用を示す辺縁部分のマ
クロファージと接触する。結合特性および細菌抗原性多
糖類の摂取に関与するマクロファージのサブ集団におけ
る発現の制限は、マルコが宿主防御系および生体のホメ
オスターシスに重要な役割を果たすことを示している。
本発明のポリペプチドは既知ネズミマルコスカベンジャ
ー受容体（ＭマクロＳＲ）に相同なアミノ酸配列を有す
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】上記およびその他の課題
に対し、本発明の目的は、ポリペプチドとりわけ配列番
号：２および６（図１および４）に示す配列で新規Ｈマ
ルコＳＲと同定したポリペプチドを提供することであ
る。本明細書で使用するＨマルコＳＲは、配列番号：２
および４の両方のアミノ酸配列を意味し；さらに配列番
号：２のアミノ酸配列は配列番号：６の部分的な配列で
ある。さらに本発明の目的は、配列番号：２および６の
ＨマルコＳＲをコードするポリヌクレオチドを提供する
ことである。一つの好ましい態様において、ポリヌクレ
オチドは配列番号１および５に示す配列を含む。一つの
好ましい態様において、ポリヌクレオチドは配列番号：
１の５１から１５３４のヌクレオチド配列を含む。
【０００９】本発明の態様に準じて、１９９６年3月21
日に寄託した、ＡＴＣＣ寄託番号９８０１５に含まれる
ヒトｃＤＮＡにより発現する成熟ポリペプチドをコード
する単離核酸分子を提供する。本発明のこの態様に準じ
てＨマルコＳＲを、本発明のさらなる態様において、生
物学的、診断学的、臨床的または治療的に有用なそれら
の変異型、類似体もしくは誘導体、または変異型、類似
体および誘導体の断片等の断片をコードする、ｍＲＮ
Ａ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ等の単離核酸分子を提供す
る。本発明のとりわけ好ましい態様は、ＨマルコＳＲの
天然発生のアレル変異型である。
【００１０】例えばアテローム性動脈硬化症、高血圧、
心筋および脳の梗塞、アンギナ、器官不全、発作、およ
び四肢の壊疽、機能喪失等の種々心臓血管系疾患を処置
するために治療目的で用いることができる、ＨマルコＳ
Ｒを提供することも、本発明の目的である。本発明の更
なる目的は、敗血症発作、膵炎、複数の器官不全、グラ
ム陰性および陽性細菌による内毒素血症および感染の処
置または診断のためにＨマルコＳＲのを使用することで
ある。さらに、本発明のＨマルコＳＲポリペプチドは種
々のマクロファージおよびその他の免疫細胞関与の宿主
防御障害の処置または診断に用いることができる。なお
さらに、本発明のＨマルコＳＲポリペプチドは哺乳動物
の宿主防御を増強するために用いることができる。
【００１１】本発明のこの態様に準じて、本明細書でＨ
マルコＳＲと称するヒト由来の新規ポリペプチド、およ
び生物学的、診断学的、または治療的に有用なそれらの
断片、変異型および誘導体、断片の変異型および誘導
体、並びに前記の類似体を提供する。本発明のその他の
態様に準じて、本発明の受容体ポリペプチドに結合し、
本発明の受容体ポリペプチドの活性化または活性を阻害
する化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００１２】本発明の別の目的は、前述のポリペプチ
ド、ポリペプチド断片、変異型および誘導体、変異型お
よび誘導体の断片並びに前記の類似体の産生方法を提供
する。本発明の好ましい態様は、宿主中にＨマルコＳＲ
を発現する条件下で、外因性のＨマルコＳＲコードポリ
ヌクレオチドを中に発現可能なように挿入した宿主細胞
の培養を含む、前述のＨマルコＳＲポリペプチドの産生
方法を提供する。
【００１３】本発明の他の目的に準じて、前述のポリペ
プチドおよびポリヌクレオチドをとりわけ研究、生物学
的、臨床的および治療的目的で利用する産生物、組成
物、工程および方法を提供する。
【００１４】本発明のある好ましい態様に準じて、産生
物、組成物および方法とりわけ：ＨマルコＳＲポリペプ
チドまたはＨマルコＳＲコードｍＲＮＡの測定による細
胞中のＨマルコＳＲの発現の評価；アテローム性動脈硬
化症、高血圧、心筋および脳の梗塞、アンギナ、器官不
全、発作、並びに四肢の壊疽および機能喪失等の種々心
臓血管系疾患の処置；種々のマクロファージおよびその
他の免疫細胞関与の宿主防御障害の処置または診断；敗
血症発作、膵炎、複数の器官不全、グラム陰性および陽
性細菌による内毒素血症および感染の処置または診断；
細胞を本明細書に開示するＨマルコＳＲポリペプチドま
たはポリヌクレオチドに曝露することによるインビト
ロ、エクソビボまたはインビボでの哺乳動物の宿主防御
の増強；ＨマルコＳＲ遺伝子における、欠損等の遺伝的
変異型および異常の検定；並びにＨマルコＳＲ機能の増
強またはＨマルコＳＲ機能不全の治療のための、Ｈマル
コＳＲポリペプチドまたはポリヌクレオチドの生体への
投与を提供する。
【００１５】本発明の他の態様に準じて、ＨマルコＳＲ
の過少発現に関与する状態を処置するための本発明の受
容体ポリペプチドを刺激するこのような活性化化合物の
使用方法を提供する。本発明の他の態様に準じて、Ｈマ
ルコＳＲの過剰発現に関与する状態を処置するためのこ
のような阻害化合物の使用方法を提供する。本発明のさ
らに他の態様に準じて、受容体がＨマルコＳＲリガンド
に結合できる、またはＨマルコＳＲリガンド結合を定量
的にまたは定性的に制御をもできるような、本発明のＨ
マルコＳＲの少なくとも一つの膜通過領域の断片、コン
センサス断片および／または保存アミノ酸置換体を有す
る配列である、非天然発生の合成、単離および／または
組換えＨマルコＳＲポリペプチドを提供する。
【００１６】本発明のさらに他の態様に準じて、診断、
治療および／または研究に適用して用いることができ
る、予期される生物学的特性のために、リガンドに結合
またはリガンド結合を制御することにより、ＨマルコＳ
Ｒ機能の強力な制御物質として有用である、合成または
組換えＨマルコＳＲポリペプチド、それらの保存置換体
および誘導体、抗体、抗イディオタイプ抗体、組成物お
よび方法を提供する。本発明のまた別の目的は、種々の
ＨマルコＳＲまたはそれらの断片を、受容体型およびサ
ブタイプとして、阻害または擬似するように設計した、
合成、単離または組換えポリペプチドを提供することで
ある。本発明のこれらのある好ましい態様に準じて、Ｈ
マルコＳＲにハイブリダイズするプローブを提供する。
【００１７】本発明のあるさらに好ましい態様に準じ
て、ＨマルコＳＲポリペプチドに抗する抗体を提供す
る。この点に関するとりわけ好ましい態様において、抗
体はＨマルコＳＲに高度に選択的である。本発明の他の
態様に準じて、ＨマルコＳＲアゴニストを提供する。な
かでも好ましいアゴニストはＨマルコＳＲに擬似し、Ｈ
マルコＳＲ結合分子または受容体分子に結合し、Ｈマル
コＳＲ誘起反応を引き出すまたは増強する分子である。
また、なかでも好ましいアゴニストはＨマルコＳＲポリ
ペプチドと、またはＨマルコＳＲ作用のその他の制御物
質と相互作用する分子であり、それにより、ＨマルコＳ
Ｒの一つの効果またはＨマルコＳＲの一つ以上の効果を
強めるまたは高める分子である。
【００１８】本発明のまた別の態様に準じて、Ｈマルコ
ＳＲアンタゴニストを提供する。なかでも好ましいアン
タゴニストは、ＨマルコＳＲ受容体または結合分子に結
合してＨマルコＳＲに擬似するが、ＨマルコＳＲ誘起反
応またはＨマルコＳＲ誘起反応以上の反応を引き起こさ
ないものである。また、なかでも好ましいアンタゴニス
トはＨマルコＳＲに結合もしくはそれらと相互作用し、
一つのまたは一つ以上のＨマルコＳＲの効果を阻害する
か、またはＨマルコＳＲの発現を阻止する分子である。
【００１９】本発明のさらなる態様において、Ｈマルコ
ＳＲポリヌクレオチドまたはＨマルコＳＲポリペプチド
を含む、細胞にインビトロで、細胞にエクソビボでおよ
び細胞にインビボで、または多細胞生物に投与するため
の組成物を提供する。本発明のとりわけ好ましい態様に
おいて、組成物は、疾患の処置のために宿主生物にＨマ
ルコＳＲポリペプチドを発現させるためのＨマルコＳＲ
ポリヌクレオチドを含む。この点に関するとりわけ好ま
しい態様は、ＨマルコＳＲの異常な内因性活性に関与す
る機能不全の処置のために、ヒト患者に発現することで
ある。
【００２０】本発明のその他の目的、様相、優越点およ
び態様は以下の記載より当業者に明らかになろう。しか
しながら、以下の記載および具体的な実施例は、本発明
の好ましい態様を示すものであり、説明のためにのみ提
示するものである。開示した発明の意図および範囲内の
種々の変更および改変は、以下の記載および本明細書の
その他の部分の知識より当業者に容易に明らかとなろ
う。
【００２１】定義 以下の説明は、本明細書、とりわけ実施例において汎用
される幾つかの用語の理解を容易にするために示すもの
である。説明は便宜上示すものであり、本発明を限定す
るものではない。「ＤＮＡ消化」とは、ＤＮＡの特定の
配列でのみ作用する制限酵素による、ＤＮＡの触媒的切
断を意味する。本明細書における種々の制限酵素は、市
販により入手可能であり、反応条件、コファクターおよ
びそのたの使用に必要なものは、当業者に周知であり、
通常的に用いられるものである。
【００２２】分析の目的では、典型的なものではプラス
ミドまたはＤＮＡ断片１μｇを、反応緩衝液約２０ｍｌ
中酵素約２単位で消化する。プラスミド構築用に、ＤＮ
Ａ断片を単離する目的では、典型的なものではＤＮＡ５
〜５０μｇを、酵素約２０〜２５０単位で、相対的に高
容量中で消化する。特定の制限酵素のための適当な緩衝
液および基質量は、以下に引用するような標準的な実験
マニュアルに記載されており、それらは商業的供給者に
より規定されている。３７℃で約１時間のインキュベー
ション時間は、通常用いられるものであるが、標準的な
方法、供給者の指示書および反応の特色に応じて変更で
きる。消化後、当業者に通常的な周知の方法により反応
物を分析し、寒天またはポリアクリルアミドゲルの電気
泳動により、断片を精製できる。
【００２３】「遺伝的要素」とは、一般的にポリペプチ
ドをコードする領域もしくは転写もしくは翻訳、もしく
は宿主細胞においてポリペプチドを発現するのに重要な
その他の過程を制御する領域を含むポリヌクレオチド、
またはポリペプチドをコードする領域、およびそれらに
機能的に連結した発現を制御する領域の両方を含むポリ
ヌクレオチドを意味する。遺伝的要素は、エピソーム要
素即ち宿主細胞ゲノムと物理的に独立した分子として複
製するベクター内に含まれる得る。これらは真核細胞に
おけるメソトレキセート選別によりトランスフェクトし
たＤＮＡの増幅中に現れるようなミニ染色体の中に含ま
れ得る。遺伝的要素はまた、天然の状態ではなく、むし
ろ単離、クローニングおよび宿主細胞への導入のような
操作の後に、精製ＤＮＡの形態で宿主細胞ゲノム内また
はとりわけベクター内にも含まれ得る。
【００２４】「単離」とは、「人工的に」天然の状態か
ら変化させられた、すなわち、それが天然に存在する場
合、元来の環境から変化させるもしくは取り除く、また
はその両方を行ったことを意味する。例えば天然発生の
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、天然の状態で
生存動物に存在する場合は、「単離」されていないが、
同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、天然に
共存する物質から分離されている場合は、本明細書に用
いる用語である、「単離」がなされている。例えば、ポ
リヌクレオチドに関して単離されているとは、ポリヌク
レオチドが中で天然に生じている染色体および細胞か
ら、ポリヌクレオチドが分離されていることを意味す
る。単離の一部として、または単離に引き続いて、この
ようなポリヌクレオチドは、ＤＮＡの様なその他のポリ
ヌクレオチドに結合して突然変異を誘発し、融合タンパ
ク質を形成し、例えば宿主中で伸長または発現すること
ができる。単離ポリヌクレオチドは単独で、またはベク
ターの様なその他のポリヌクレオチドと結合して、培養
中または全生物体中の、宿主細胞に導入できる。培養中
または生体個体中の、宿主細胞に導入されたＤＮＡも本
明細書に用いる用語である、単離をしたといえる。とい
うのはこれらは天然発生の形態または環境にはないから
である。同様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド
は、培地製剤例えば細胞にポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドを導入するための、溶液、化学的または酵素的
反応のための組成物または溶液等の組成物にも生じるこ
とができ、これらは天然には生じない組成物であり、本
明細書に用いる用語の単離されたポリヌクレオチドまた
はポリペプチドの範疇である。
【００２５】「ライゲーション」とは、最も多くは２本
鎖ＤＮＡである、２個またはそれ以上のポリヌクレオチ
ド間のホスホジエステル結合を形成する工程を意味す
る。ライゲーション技術は当業界に周知であり、ライゲ
ーションプロトコールは標準的な実験マニュアルおよび
参考文献、例えばSambrookら、Molecular Cloning，A L
aboratory Manual、第２版；コールドスプリングハーバ
ー・ラボラトリープレス、コールドスプリングハーバ
ー、ニューヨーク（1989）およびManiastisら、（以下
に引用）146頁に記載されている。
【００２６】「（複数の）オリゴヌクレオチド」とは、
比較的短いポリヌクレオチドを意味する。この用語はし
ばしば一本鎖デオキシリボヌクレオチドを意味するが、
同様に一本鎖、または二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮ
Ａ：ＤＮＡハイブリッドおよびとりわけ二本鎖ＤＮＡを
意味することができる。オリゴヌクレオチド、例えば一
本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドは、しばしば自
動オリゴヌクレオチド合成器にかける等の化学的方法に
より合成される。しかしながら、オリゴヌクレオチドは
インビトロ組換えＤＮＡ媒介法および細胞および生体に
おけるＤＮＡの発現によるなどの種々のその他の方法に
より作ることができる。最初、化学合成したＤＮＡは、
典型的なものでは５’リン酸塩なしで得られる。このよ
うなオリゴヌクレオチドの５’末端は、組換えＤＮＡ分
子を形成するのに通常使用されるＤＮＡリガーゼを用い
るライゲーション反応による、ホスホジエステル結合形
成のための基質ではない。このようなオリゴヌクレオチ
ドのライゲーションが望まれる場合、キナーゼおよびＡ
ＴＰを用いるような標準法により、リン酸塩を添加でき
る。化学合成したオリゴヌクレオチドの３’末端は、通
常遊離の水酸基を有し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガー
ゼの存在下、容易に別のオリゴヌクレオチドのような別
のポリヌクレオチドの５’リン酸塩とホスホジエステル
結合を形成する。周知のように、この反応は、望む場
合、ライゲーションの前にその他の（複数の）ポリヌク
レオチドの5'リン酸塩を除去することにより、選択的に
防御できる。
【００２７】「プラスミド」は、本明細書では通常前に
小文字のｐを付し、および／または続いて大文字および
／または数字で示し、当業者に周知の標準命名法に準じ
る。本明細書に開示する出発プラスミドは、制約を受け
ずに市販により、公に入手可能であるかまたは、周知の
確立された技法を通常的に適用することにより、入手可
能なプラスミドから構築することができる。本発明に準
じて使用できる多くのプラスミド並びにその他のクロー
ニングおよび発現ベクターは、周知であり、当業者に容
易に入手できる。さらに、当業者は本発明の使用に適し
たその他のプラスミドをいくらでも容易に構築すること
ができる。本発明におけるこのようなプラスミドおよび
その他のベクターの特性、構築および使用は、本明細書
より当業者に容易に理解され得る。
【００２８】「（複数の）ポリヌクレオチド」とは、通
常改変されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、または改変
されたＲＮＡもしくはＤＮＡになり得る任意のポリリボ
ヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを意
味する。従って、例えば本明細書で用いるポリヌクレオ
チドは、とりわけ一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖お
よび二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二
本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖および二本鎖領域の混合物で
あるＲＮＡ、一本鎖もしくはより通常的には二本鎖、ま
たは一本鎖および二本鎖領域の混合物でよいＤＮＡおよ
びＲＮＡを含むハイブリッド分子を意味する。さらに、
本明細書で用いいるポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしく
はＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域
を意味する。そのような領域における鎖は同一の分子ま
たは異なる分子からのものでよい。この領域は一つまた
はそれ以上の分子の全てを含み得るが、より典型的には
分子の一部の領域のみを含む。三重らせんの分子の一つ
は、しばしばオリゴヌクレオチドである。本明細書で用
いるポリヌクレオチドなる用語には、一つまたはそれ以
上の改変した塩基を含有する、上述のＤＮＡまたはＲＮ
Ａ等が含まれる。このように、安定性またはその他の理
由で改変した骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本明
細書で意図する用語である「ポリヌクレオチド」であ
る。さらに、イノシン等の通常的でない塩基、またはト
リチル化塩基等の改変塩基を含む（複数の）ＤＮＡまた
は（複数の）ＲＮＡは（二つの例だけ示す）、本明細書
で用いられる用語である、ポリヌクレオチドである。当
業者に既知の多くの有用な目的を提供するＤＮＡおよび
ＲＮＡに、非常に多くの改変がなされていることは、明
らかであろう。本明細書で用いられるポリヌクレオチド
なる用語は、ポリヌクレオチドのこのような化学的、酵
素的または代謝的に改変した形態およびとりわけウイル
スおよび単細胞および複合細胞等の細胞に特徴的なＤＮ
ＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。
【００２９】本明細書で用いる「ポリペプチド」には、
以下に記載する全てのポリペプチドを包含する。ポリペ
プチドの基本的な構造は周知であり、非常に多くの参考
書およびその他の当業界の発行物に記載されている。こ
れに鑑み、本明細書で用いるこの用語は、ペプチド結合
により直鎖で互いに結合している2個またはそれ以上の
アミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を意味
する。本明細書で用いるこの用語は、当業界で通常例え
ばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマー、とも称
する両方の短鎖、および多くの型がある当業界で一般的
にタンパク質と称する長鎖を意味する。ポリペプチドは
しばしば通常20個の天然発生アミノ酸と称される20個の
アミノ酸以外のアミノ酸を含有し、末端アミノ酸を含む
多くのアミノ酸は、プロセッシングおよびその他の翻訳
後改変のような天然の工程によるのみならず、また当業
者に周知の化学的改変技術によっても、上記のポリペプ
チドを改変できることは理解されよう。ポリペプチドに
天然に起こる通常的な改変は余りにも多いので、余すと
ころなく掲示することはできないが、基礎的な参考書お
よびさらに詳細な論文並びに多数の研究文献にも詳しく
記載されており、これらは当業者に周知である。
【００３０】本発明のポリペプチドに施すことができる
既知の改変には、説明のために幾つか示すと、アセチル
化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビ
ンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまた
はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導
体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、
交差架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、ジメチル
化、交差架橋共有結合形成、シスチン形成、ピログルタ
メート形成、ホルミル化、ガンマー−カルボキシル化、
グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素
化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質加水
分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ
化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなトラ
ンスファーＲＮＡ媒介のタンパク質へのアミノ酸の添
加、およびユビキチネーション（ubiquitination）など
がある。このような改変は当業者に周知であり、科学文
献に非常に詳細に記載されている。幾つかのとりわけ通
常的な改変、例えばグリコシル化、脂質結合、硫酸化、
グルタミン酸残基のガンマーカルボキシル化、水酸化お
よびＡＤＰリボシル化等が最も基礎的な参考書、例えば
Proteins-Structure and Molecular Properties、第2
版、T.E.Creighton、W.H.Freeman and Company、ニュー
ヨーク（1993）に記載されている。多くの詳細な論文例
えば、Posttranslational Covalent Modification of P
roteins、B.C.Johnson編、アカデミックプレス、ニュー
ヨーク（1983）のWold,F.,Posttranslational Protein
Modifications ：Perspective andProspects、1〜12
頁；Seifterら、Analysis for Protein Modifications
and nonprotein cofactors、Meth.Enzymol.182:626-646
（1990）およびRattanら、Protein Synthesis：Posttra
nslational Modifications and Aging，Ann.N.Y.Acad.S
ci.663:48-62（1992）の記載が、本主題に利用できる。
【００３１】ポリペプチドはいつも完全に直鎖であると
は限らないということは周知であり、上述の通りである
と理解されよう。例えばポリペプチドはユビキチネーシ
ョンの結果分岐でき、一般的には、天然のプロセッシン
グなどの翻訳後の事象および天然では起こり得ない人為
的操作によりもたらされる事象の結果、分岐のある、ま
たは分岐のない環状にできる。環状、分岐および分岐し
た環状ポリペプチドは、非翻訳天然の工程により、およ
び同様に全く合成的な方法で、合成できる。改変はペプ
チド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシ
ル末端など、ポリペプチドの至る所で起こりうる。実
際、共有結合の改変による、ポリペプチドのアミノまた
はカルボキシル基またはその両方の遮断は、天然に起こ
り、合成ポリペプチドおよびこのような改変は同様に本
発明のポリペプチドに存在し得る。例えば、大腸菌（E.
coli.）で作られるポリペプチドのアミノ末端残基は、
タンパク質溶解のプロッセッシングの前にＮ−ホルミル
メチオニンになる。
【００３２】ポリペプチドに起こる改変はしばしばそれ
の作り方に影響される。例えば宿主のクローン遺伝子の
発現により作られるポリペプチドでは、大部分の改変の
特性および程度は宿主細胞の翻訳後改変能力およびポリ
ペプチドのアミノ酸配列に存在する改変信号により決定
される。例えば、周知のように、グリコシル化はしばし
ば大腸菌のような細菌宿主では起こらない。従って、グ
リコシル化が望まれる場合、ポリペプチドはグリコシル
化宿主、一般的には真核細胞に発現すべきである。昆虫
細胞がしばしば哺乳動物細胞と同じ翻訳後グリコシル化
に用いられ、この理由で昆虫細胞発現系が、とりわけグ
リコシル化の本来のパターンを有する哺乳動物タンパク
質を効率よく発現するように改造されている。同様の考
察がその他の改変にも適用される。改変の同一の型は、
上記ポリペプチドの幾つかの部分で同じまたは異なる程
度で存在しうると理解されよう。また、上記ポリペプチ
ドには改変の多くの型が存在できる。一般的に、本明細
書で用いる用語であるポリペプチドは、このような全て
の改変特に宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現す
ることにより合成したポリペプチドに存在する改変を包
含する。
【００３３】本明細書で用いるポリヌクレオチドおよび
ポリペプチドの「（複数の）変異型」なる用語は、参照
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは各々異なるポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドである。この意味で
の変異型は、本明細書の以下およびその他の部分でより
詳細に記載する。 （１） 別の参照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配
列が異なるポリヌクレオチド。一般的に差異はヌクレオ
チドの参照配列および変異型が、全体的に非常に類似し
ており、多くの領域で同等であるように限定される。以
下に記すように、変異型におけるヌクレオチド配列の変
化はサイレントでよい。すなわち、ポリヌクレオチドに
よりコードされるアミノ酸には変化がなくてよい。変化
がこの型のサイレント変化はに限定される場合、変異型
は、参照体と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド
をコードするであろう。また以下に記すように、変異型
のヌクレオチド配列における変化が、参照ポリヌクレオ
チドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を
変化させ得る。このようなヌクレオチドの変化は、以下
に論じるように、参照配列によりコードされるポリペプ
チドにおけるアミノ酸置換、添加、損失、融合およびト
ランケーションを招く。 （２） アミノ酸配列が他、参照ポリペプチドとは異な
るポリペプチド。一般的に差異は、参照体および変異型
の配列が、全体的に非常に類似しており、多くの領域で
同等であるように限定される。変異型および参照ポリペ
プチドは、１またはそれ以上の置換、添加、欠損、融合
およびトランケーションが任意の組み合わせで起こるこ
とにより、アミノ酸配列が変化しうる。
【００３４】「融合タンパク質：ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４
５３３（カナディアンカウンターパート２０４５８６
９）」は免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を
別のヒトタンパク質またはそれらの一部と共に含む、融
合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質
のＦｃ部分は治療および診断に使用するのに非常に優れ
ており、その結果、例えば薬物動態特性を改善する（Ｅ
Ｐ−Ａ ０２３２２６２）。他方、使用によっては、記
載した優れた方法で融合タンパク質を発現し、検出し、
精製した後、Ｆｃ部分を削除できることが望ましい。こ
れはＦｃ部分が治療および診断における使用の妨げにな
ることが判明している場合、例えば融合タンパク質が免
疫化の抗原として用いられる場合である。薬物の発見に
おいて、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための
処理能力の高いスクリーニング検定の目的で、例えばｓ
ｈＩＬ５−αのようなヒトタンパク質をＦｃタンパク質
に融合させる。D.Bennettら、Journal of Molecular Re
cognition，8:52-58（1995）およびK.Johansonら、The
Journal of Biological Chemistry，270(16):9459-9471
（1995）参照。このように、本発明はまたＨマルコＳＲ
またはそれらの部分および種々サブクラスの免疫グロブ
リン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）の重および軽
鎖の定常領域の種々の部分から成る、遺伝子操作した可
溶融合タンパク質にも関する。好ましい免疫グロブリン
はヒトＩｇＧ、とりわけＩｇＧ１の重鎖の定常部分であ
り、この場合融合は蝶番部分で起こる。特定の態様にお
いて、Ｆｃ部分は、これもまた挿入されており、Ｘａ因
子により切断できる切断配列により、簡単な方法で除去
できる。さらに、本発明は遺伝子操作によるこれらの融
合物の調製方法、並びに診断および治療のためのそれら
の使用に関する、
【００３５】本明細書で用いる「受容体分子」とは、Ｈ
マルコＳＲポリペプチドを含むが、これに限定するもの
ではなく、および本発明のＨマルコＳＲポリペプチドと
特異的に結合または相互作用する分子であり、古典的な
受容体（これは好ましい）のみならず本発明のポリペプ
チドと特異的に結合または相互作用するその他の分子
（各々「結合分子」および「相互作用分子」、並びに
「ＨマルコＳＲ結合分子」および「ＨマルコＳＲ相互作
用分子」とも称する）も含まれる。本発明のポリペプチ
ドおよびこのような分子、例えば受容体または結合もし
くは相互作用分子等との結合は、本発明のポリペプチド
に対して独占的にでき、これは非常に好ましいことであ
り、または本発明のポリペプチドに非常に特異的にで
き、これは非常に好ましいことであり、または本発明の
ポリペプチドなどのタンパク質群に非常に特異的にで
き、これは非常に好ましいことであり、または本発明の
ポリペプチドを少なくとも一つ含むタンパク質群の幾つ
かに非常に特異的にできる。受容体、例えば本発明のポ
リペプチドに特異的に結合する抗体および抗体由来物質
もまた非天然発生である。
【００３６】
【発明の実施の形態】本発明はとりわけ以下により詳細
に記載する、新規ＨマルコＳＲポリペプチドおよびポリ
ヌクレオチドに関する。特に、本発明は、ＭマクロＳＲ
ポリペプチドおよびヒトコラーゲンに対してアミノ酸配
列相同性という点で関連している新規ＨマルコＳＲのポ
リペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。本発明は
特に図1および４に示すヌクレオチドおよびアミノ酸配
列を有するＨマルコＳＲ、および本明細書において「寄
託クローン」または「寄託クローンのｃＤＮＡ」と称す
る1996年3月21日寄託のＡＴＣＣ寄託番号９８０１５の
ヒトｃＤＮＡのＨマルコＳＲヌクレオチドおよびアミノ
酸配列に関する。配列番号：１に示すヌクレオチド配列
は、寄託クローンのｃＤＮＡをシークエンシングするこ
とにより入手したことは理解されよう。従って、寄託ク
ローンの配列は、寄託クローンの配列と配列番号：１の
配列間の任意の不一致に関しては、寄託クローンの配列
に従うものとする。
【００３７】ポリヌクレオチド 本発明の一つの態様に準じて、図１および４（配列番
号：２および６）の誘導アミノ酸配列を有するＨマルコ
ＳＲポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを
提供する。本明細書に提供する情報を用いて、配列番
号：１および５に示すポリヌクレオチド配列のようなＨ
マルコＳＲポリペプチドをコードする本発明のポリヌク
レオチドは、出発物質としてヒト肺動脈細胞から、およ
びヒト平滑筋細胞からのｍＲＮＡを用いたｃＤＮＡクロ
ーニング法等の標準的なクローニングおよびスクリーニ
ングの手法を用いて得ることができる。本発明の説明と
して、配列番号：１および５に示すポリヌクレオチド
は、ヒト骨髄およいび肺動脈の細胞に由来するｃＤＮＡ
ライブラリーで見出される。
【００３８】ＨマルコＳＲをコードするｃＤＮＡシーク
エンシングの結果に示されるように、本発明のＨマルコ
ＳＲはスカベンジャー受容体のその他のタンパク質に構
造的に相関する。配列番号：２アミノ酸配列は既知のタ
ンパク質の中でＭマルコＳＲタンパク質に最も相同的で
あり、約７０．１％同等であり、約７８．１％類似して
いる。配列番号：６のアミノ酸配列はヒトマルコ受容体
に約２７％同等であり、約４７％類似している。本発明
のポリヌクレオチドは、クローニングにより得るか、も
しくは化学合成技術により産生するか、またはそれらを
組み合わせて得られた、ｍＲＮＡなどのＲＮＡの形態
で、または例えばｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡなどのＤ
ＮＡの形態でよい。ＤＮＡは二本鎖または一本鎖でよ
い。一本鎖ＤＮＡは有意（センス）鎖として知られてい
るコード鎖でよく、またアンチセンス鎖とも称する非コ
ード鎖でもよい。ポリペプチドをコードするコード配列
は、配列番号：１または５に示すポリヌクレオチドのコ
ード配列に同等にできる。ポリヌクレオチドは、また、
遺伝子コードの冗長性（退化）の結果、配列番号：２ま
たは６のＤＮＡのポリペプチドをコードする異なる配列
を有するポリヌクレオチドでもよい。
【００３９】図１および４のポリペプチドをコードする
本発明のポリヌクレオチドには、限定するものではない
が、単独の成熟ポリペプチドのコード配列；成熟ポリペ
プチドをコードする配列および付加コード配列、例えば
プレ、プロ、プレプロタンパク質配列等のリーダーまた
は分泌配列等をコードするコード配列；限定するもので
はないが、例えば転写、例えばスプライシングおよびポ
リアデニル化信号等のｍＲＮＡプロセッシング、リボソ
ーム結合およびｍＲＮＡの安定性において役割を担う、
転写された非翻訳配列等のイントロン並びに非コード
５’および３’配列等の、付加非コード配列と共に、前
述の付加コード配列を伴うかまたは伴わない成熟ポリペ
プチドのコード配列；付加機能性を付与するような付加
アミノ酸をコードする付加コード配列等がある。このよ
うに、例えばポリペプチドは融合ポリペプチドの精製を
促すマーカー配列例えばペプチドを融合できる。本発明
のある好ましい態様において、マーカー配列はヘキサ−
ヒスチジンペプチド、例えば、とりわけｐＱＥ９ベクタ
ー（キアゲンインコーポレーティッド）に提供されるタ
グであり、多くが市販により入手可能である。例えばGe
ntzら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，86:821-824（1989）
に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは融合タンパ
ク質の精製に便宜的に提供される。ＨＡタグはインフル
エンザヘマググルチニンタンパク質由来のエピトープに
対応し、これについては例えばWilsonら、Cell，37:767
（1984）に記載されている。
【００４０】前述に準じ、本明細書で用いる「ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド」なる用語は、本発
明のポリペプチド、とりわけ図１または４に示すアミノ
酸配列を含むＨマルコＳＲのポリヌクレオチドを包含す
る。この用語はまた、（例えばイントロンに干渉され
る）ポリペプチドをコードする単一の連続領域または不
連続領域を付加領域と共に含み、コードおよび／または
非コード配列をも含有し得るポリヌクレオチドを包含す
る。
【００４１】本発明はさらに、図１および４の誘導アミ
ノ酸配列を有するポリペプチドの断片、類似体および誘
導体をコードする、上述のポリヌクレオチドの変異型に
関する。ポリヌクレオチドの変異型には天然発生アレル
変異型、または天然に発生することが知られていない変
異型でもよい。このような非天然発生のポリヌクレオチ
ドの変異型は、ポリヌクレオチド、細胞または生体等に
突然変異誘発技法を施したりすることにより作ることが
できる。この観点における変異型は、前述のヌクレオチ
ド置換、欠損または付加によるポリヌクレオチドとは異
なる。置換、欠損または付加は１またはそれ以上のヌク
レオチドに起こる。変異型はコードもしくは非コード領
域またはその両方において変化し得る。コード領域にお
ける変化は保存的または非保存的アミノ酸置換、欠損ま
たは付加を産み出す。
【００４２】この点に関する本発明の特に好ましい態様
は、図１および４に示すＨマルコＳＲのアミノ酸配列を
有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；そ
れらの変異型、類似体、誘導体および断片、並びに変異
型、類似体および誘導体の断片である。この点に関する
本発明の特に好ましい態様は、ＨマルコＳＲ変異型、類
似体、誘導体および断片、並びにその断片の変異型、類
似体および誘導体をコードするポリヌクレオチドであ
り、図１および４のＨマルコＳＲのアミノ酸配列を、幾
つか、少しの、５〜１０、１〜５、１〜３、2、１また
は０個のアミノ酸残基を置換、欠損または付加を任意の
組み合わせで施したものを有する。中でもとりわけ好ま
しいものは、サイレント置換、付加および欠損であり、
ＨマルコＳＲの特性および活性を変化しない。また、こ
の点に関してとりわけ好ましいものは、保存置換であ
る。最も好ましいものは、置換を施さない、図１および
４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドである。
【００４３】本発明のさらに好ましい態様は、図１およ
び４に示すアミノ酸配列を有するＨマルコＳＲをコード
するポリヌクレオチド、およびこのようなポリヌクレオ
チドに相補的なポリヌクレオチドに、少なくとも７０％
の同等性を有するポリヌクレオチドである。また別に、
最も好ましいポリヌクレオチドは寄託クローンのヒトｃ
ＤＮＡのＨマルコＳＲポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド、およびそれらに相補的なポリヌクレオチド
に少なくとも８０％の同等性を有する領域を含むポリヌ
クレオチドである。この点に関して、とりわけ好ましい
ポリヌクレオチドは少なくとも９０％の同等性を有する
ものであり、特に好ましいのは少なくとも９５％の同等
性を有するものである。さらに少なくとも９５％の同等
性を有するものの中でも少なくとも９７％であるのがよ
り好ましく、中でも少なくとも９８％および少なくとも
９９％であるのが特に好ましく、さらに少なくとも９９
％であるのがより好ましい。
【００４４】この点に関してとりわけ好ましい態様は、
配列番号：１または５のｃＤＮＡによりコードされる成
熟ポリペプチドと実質的に同一の生物学的機能または活
性を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドである。本発明はさらに本明細書上述の配列にハイブ
リダイズするポリヌクレオチドに関する。この点に関し
て、本発明はとりわけストリンジェント状態で本明細書
上述のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌク
レオチドに関する。本明細書で用いる「ストリンジェン
ト状態」なる用語は、ハイブリダイゼーションが配列間
で少なくとも９５％が、好ましくは９７％が同等である
場合のみに起こることを意味する。本発明のポリヌクレ
オチド検定に関してここでさらに論じるが、例えば上述
の本発明のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ全長およびＨ
マルコＳＲをコードするベノムクローンを単離し、Ｈマ
ルコＳＲ遺伝子に高度に配列の類似性を有するその他の
遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するため
のｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーショ
ンプローブとして用いることができる。このようなプロ
ーブは一般に少なくとも１５塩基を含む。好ましくは、
このようなプローブは、少なくとも３０塩基を有し、少
なくとも５０塩基でよい。とりわけ好ましいプローブ
は、少なくとも３０塩基を有し、５０塩基以下である。
【００４５】例えばＨマルコＳＲ遺伝子コード領域は、
既知ＤＮＡ配列を用いてオリゴヌクレオチドプローブを
合成し、スクリーニングすることにより単離できる。本
発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識オリゴ
ヌクレオチドは、次に、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡま
たはｍＲＮＡのライブラリーのスクリーニングに用い、
プローブがハイブリダイズするライブラリーのメンバー
を決定する。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、ヒト疾患の処置法および診断法の発見のために
研究物質および材料として使用でき、とりわけポリヌク
レオチド検定に関連して本明細書でさらに論じる。ポリ
ヌクレオチドは付加アミノ酸もしくはカルボキシル末端
アミノ酸を加えた成熟タンパク質、または成熟タンパク
質に内在するアミノ酸である（例えば成熟形態が一つ以
上のポリペプチド鎖を有する場合）ポリペプチドをコー
ドできる。このような配列は前駆体から成熟形態へのタ
ンパク質のプロセッシングに役割を担い、タンパク質の
トラフィッキング（trafficking）を促進し、タンパク
質の半減期を延長もしくは短縮し、またはとりわけ検定
もしくは産生のためのタンパク質の操作を容易にするこ
とができる。一般的には本来、付加アミノ酸は、細胞酵
素によりプロセッシングされ、成熟タンパク質から取り
除かれる。
【００４６】１またはそれ以上のプロ配列と融合したポ
リペプチドの成熟形態を有する前駆タンパク質は、ポリ
ペプチドの不活性形態にできる。プロ配列が除去される
と、このような不活性前駆体が通常活性化される。プロ
配列のいくつかまたは全ては、活性化の前に除去でき
る。通常、このような前駆体はプロタンパク質と称され
る。要するに、本発明のポリヌクレオチドは成熟タンパ
ク質、リーダー配列を加えた成熟タンパク質（プレタン
パク質と称することができる）、プレタンパク質のリー
ダー配列ではない１またはそれ以上のプロ配列を有する
成熟タンパク質の前駆体、またはリーダー配列および１
またはそれ以上のプロ配列を有するプロタンパク質の前
駆体であるプレプロタンパク質であり、プロ配列は通常
ポリペプチドの活性および成熟形態を産み出すプロセッ
シング段階で除去される。
【００４７】寄託物 ＨマルコＳＲを含有する寄託物は、上述のアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクションに寄託した。また上
述のとおり、ヒトｃＤＮＡ寄託物は本明細書では「寄託
クローン」または「寄託クローンのｃＤＮＡ」と称す
る。寄託クローンは、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション、１２３０１パークローンドライブ、ロ
ックビル、メリーランド２０８５２，米国に1996年3月2
1日に寄託し、ＡＴＣＣ寄託番号98015を付与された。寄
託物は、ＨマルコＳＲｃＤＮＡの全長を含有するブルー
スクリプトＳＫ（−）プラスミド（ストラッタジーン、
ラジョーラ、カリフォルニア州）であり、寄託物として
「ｐＨＡＰＣＣ４６」と称される。
【００４８】寄託は、特許手続き上の微生物寄託の国際
承認に関するブダペスト条約の条件下で為されている。
株は特許が発行されると何らの制限または条件もなく最
終的には分譲される。寄託は当業者の便宜のためにのみ
提供され、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１２条のもとに要求され
るような、寄託が実施可能要件であることを承認するも
のではない。本明細書の配列に関する任意の記載に矛盾
する事象は、寄託物に含まれるポリヌクレオチド配列お
よびそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配
列に従う。
【００４９】ポリペプチド 本発明はさらに図１および４の誘導アミノ酸配列を有す
るＨマルコＳＲポリペプチドに関する。本発明はまたこ
れらのポリペプチドの断片、類似体および誘導体にも関
する。「断片」、「誘導体」および「類似体」なる用語
が図１および４のポリペプチドを称していう場合、この
ようなポリペプチドと本質的に同一の生物学的機能また
は活性を保持するポリペプチド、すなわちＨマルコＳＲ
として機能し、またはポリペプチドがＨマルコＳＲとし
て機能しないが、リガンドまたは受容体例えば受容体の
可溶形態に結合する能力を保持するポリペプチドを意味
する。従って、類似体にはプロタンパク質部分を切断し
て活性成熟ポリペプチドを産生して活性化できるプロタ
ンパク質等がある。本発明のポリペプチドは組換えポリ
ペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドで
よい。特定の好ましい態様では、これは組換えポリペプ
チドである。
【００５０】図１および４のポリペプチドの断片、誘導
体または類似体は、（ｉ）１またはそれ以上のアミノ酸
残基が保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存
アミノ酸残基）により置換されており、このような置換
アミノ酸残基は遺伝的コードによりコードされたポリペ
プチドか、コードされていないポリペプチド、（ｉｉ）
１またはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むポリペ
プチド、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドがその他の
化合物例えばポリペプチドの半減期を伸ばす化合物（例
えばポリエチレングリコール）と融合したポリペプチ
ド、または（ｉｖ）付加アミノ酸が成熟ポリペプチド、
例えばリーダーもしくは分泌配列、または成熟ポリペプ
チドもしくはプロタンパク質配列の精製に用いられる配
列と融合するポリペプチドでよい。このような断片、誘
導体および類似体は本明細書の教示より当業者の範疇で
あると考えられる。
【００５１】この点に関する本発明のとりわけ好ましい
態様は、図１および４に示すＨマルコＳＲのアミノ酸配
列を有するポリペプチド、それらの変異型、類似体、誘
導体および断片、並びにその断片の変異型、類似体およ
び誘導体である。また別に、この点に関するとりわけ好
ましい本発明の態様は、ＨマルコＳＲのアミノ酸配列を
有するポリペプチド、それらの変異型、類似体、誘導体
および断片、並びにその断片の変異型、類似体および誘
導体である。
【００５２】とりわけ好ましい変異型は、保存アミノ酸
置換体により参照体から変化した変異型である。このよ
うな置換体は、ポリペプチドの上記アミノ酸を特性の類
似した別のアミノ酸で置換したものである。典型的なも
のでは、保存置換でみられるのは脂肪族アミノ酸Ａｌ
ａ、Ｖａｌ，ＬｅｕおよびＩｌｅ間での相互の置き換
え；水酸基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性基Ａｓｐお
よびＧｌｕの取り替え、アミド基ＡｓｎおよびＧｌｎ間
での置換、塩基性基ＬｙｓおよびＡｒｇの取り替えおよ
び芳香性基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ間での置き換えである。
【００５３】この点に関するさらに好ましい態様は、図
１および４のＨマルコＳＲのアミノ酸配列を有し、幾つ
か、少しの、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１または
０個のアミノ酸残基を置換、欠損または付加を任意に組
み合わせて施した変異型、類似体、誘導体および断片、
並びにその断片の変異型、類似体および誘導体である。
これらの中でもとりわけ好ましいのは、ＨマルコＳＲの
特性および活性を変化させないサイレント置換、付加お
よび欠損である。またこの点に関するとりわけ好ましい
態様は、保存置換である。最も好ましいのは、置換して
いない図１および４のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドである。
【００５４】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは単離形態で提供されるのが好ましく、均質になる
まで精製するのが好ましい。本発明のポリヌクレオチド
には、配列番号：６のポリペプチド（とりわけ成熟ポリ
ペプチド）並びに配列番号：６のポリペプチドに少なく
とも８０％の同等性を有し、さらに好ましくは配列番
号：６のポリペプチドに少なくとも９０％の類似性（さ
らに好ましくは少なくとも９０％の同等性）を有するポ
リペプチド、さらに好ましくは配列番号：６のポリペプ
チドに少なくとも９５％の類似性（さらに好ましくは少
なくとも９５％の同等性）を有するポリペプチドであ
り、また通常少なくとも３０個のアミノ酸さらに好まし
くは少なくとも５０個のアミノ酸を含有するポリペプチ
ドのこのような部分を有するこのようなポリペプチドの
部分等がある。
【００５５】当業界に周知であるように、二つのポリペ
プチド間の「類似性」は一つのポリペプチドのアミノ酸
配列およびそれの保存アミノ酸置換体を二つ目のポリペ
プチドの配列と比較して決定する。さらに当業界に周知
であるように、「同等性」はこのような配列の2本鎖の
適合の同等性により決定されるような２個のポリペプチ
ドまたは２個のポリヌクレオチド間の配列の関連性の程
度を意味する。同等性および類似性は共に容易に算出で
きる（Computational Molecular Biology，Lesk,A.M.
編、オックスフォードユニバーシティープレス、ニュー
ヨーク、1988年；Biocomputing：Informatics and Geno
me Projects，Smith,D.W.編、アカデミックプレス、ニ
ューヨーク、1993年；Computer Analysis of Sequence
Data，パートＩ，Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編、
ヒューマンプレス、ニュージャージー、1994年；Sequen
ce Analysis in Molecular Biology，von Heinje,G.、
アカデミックプレス、1987年；およびSequence Analysi
s Primer，Gribskov,M.およびDevereux,J.編、Ｍストッ
クトンプレス、ニューヨーク、1991年）。二つのポリヌ
クレオチドまたはポリペプチド配列の同等性および類似
性を測定する方法は多くあるが、「同等性」および「類
似性」なる用語は、当業者に周知である（Sequence Ana
lysis in Molecular Biology，von Heinje,G.、アカデ
ミックプレス、1987年；Sequence Analysis Primer，Gr
ibskov,M.およびDevereux,J.編、Ｍストックトンプレ
ス、ニューヨーク、1991年；およびCarillo,H.およびLi
pman,D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073（1988））。
二つの配列間の同等性または類似性を測定するために通
常用いられる方法には、Guide to Huge Computers，Mar
tin J.Bishop編、アカデミックプレス、サンディエゴ、
1994年およびCarillo,H.およびLipman,D.，SIAM J.Appl
ied Math.，48:1073（1988）等に開示されているが、こ
れらに限定するものではない。同等性を測定するための
好ましい方法は、試験する二つの配列間で最も良く適合
するように設計される。同等性および類似性を測定する
方法は、コンピュータープログラムで組み立てられる。
二つの配列間の同等性および類似性を測定する好ましい
コンピュータープログラム法には、ＧＣＧプログラムパ
ッケージ（Devereux,J.ら、Nucleic Acids Research12
(1):387（1984）、BLASTP、BLASTN、FASTA（Atschul,S.
F.ら、J.Molec.Biol.215:403（1990）））等があるが、
これらに限定するものではない。
【００５６】本発明のポリペプチドの断片または部分
は、ペプチド合成により対応するポリペプチド全長を産
生するのに用いることができる；従って、断片はポリペ
プチドの全長を産生するための媒介物質として用いるこ
とができる。本発明のポリヌクレオチドの断片または部
分は本発明のポリヌクレオチド全長を合成するために用
いることができる。
【００５７】断片 また本発明の好ましい態様には、ＨマルコＳＲの断片、
特に図１および４に示すアミノ酸配列有するＨマルコＳ
Ｒの断片、および図1および４のＨマルコＳＲの変異型
および誘導体の断片等がある。この点に関して、断片
は、前述のＨマルコＳＲポリペプチドおよびそれらの変
異型または誘導体のアミノ酸配列が全てではなく一部が
全く同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドであ
る。
【００５８】このような断片は「フリースタンディン
グ」すなわちその他のアミノ酸またはポリペプチドの一
部またはそれに融合したものではなく、一部もしくは領
域を形成するより大きなポリペプチド内に含まれてもよ
い。より大きなポリペプチド内に含まれる場合、本明細
書で論じる断片は単一の連続した領域を形成するのが最
も好ましい。しかしながら、幾つかの断片は、単一の、
より大きなポリペプチド内に含まれ得る。例えば、特定
の好ましい態様は、ＨマルコＳＲ断片のアミノ末端に融
合した異型のプレおよびプロポリペプチド領域、および
断片のカルボキシル末端に融合した付加領域を有する、
宿主中に発現するように設計した前駆体ポリペプチドに
含まれる本発明のＨマルコＳＲの断片に関する。従っ
て、本明細書の意図する一つの態様における断片は、Ｈ
マルコＳＲ由来の融合ポリペプチドまたは融合タンパク
質の一つのまたは複数の部分を意味する。
【００５９】本発明のポリペプチド断片の代表的な例と
して、膜通過領域を欠き、可溶性受容体を形成する、約
６２から約５１１のアミノ酸を有する断片について論じ
る。これに関連して、どちらかの末端または両方の末端
の幾つかの、少しの、５、４、３、２または1個のアミ
ノ酸により特に記載したより大きいまたはより小さい範
囲および複数の範囲を含める。例えば、これに関連し
て、約６２〜９０個のアミノ酸は、６２プラスまたはマ
イナス幾つかの、少しの、５、４、３、２または１個の
アミノ酸、から９０プラスまたはマイナス幾つかの、少
しの、５、４、３、２または1個のアミノ酸残基、すな
わち広くは６２マイナス幾つかのアミノ酸から９０プラ
ス幾つかのアミノ酸、狭くは６２プラス幾つかのアミノ
酸から９０マイナス幾つかのアミノ酸の範囲にできるこ
とを意味する。
【００６０】この点に関して、より好ましくは、どちら
かまたは両方の末端で5個ほどのアミノ酸をプラスまた
はマイナスした上述の範囲である。とりわけ好ましく
は、上述のどちらかまたは両方の末端で３個ほどのアミ
ノ酸をプラスまたはマイナスした上述の範囲である。と
りわけ好ましくは、どちらかまたは両方の末端で１個の
アミノ酸をプラスまたはマイナスした範囲、または付加
または欠損のない上述の範囲である。この点に関して、
とりわけ最も好ましくは、約６２から５１１のアミノ酸
の長さの断片である。本発明のとりわけ好ましい断片
は、ＨマルコＳＲのトランケーション突然変異である。
トランケーション突然変異体には、アミノ末端を含む残
基の一連の連続（すなわち連続領域、部分または部位）
もしくはカルボキシル末端を含む残基の一連の連続の欠
損、または二重トランケーション突然変異のように二つ
の残基の一連の連続（一つはアミノ末端を含み、一つは
カルボキシル末端を含む）の欠損を除いた、図１および
４のアミノ酸配列を有するＨマルコＳＲポリペプチドま
たはそれらの変異型もしくは誘導体などがある。提示し
た大きさの範囲の断片もまたトランケーション断片の好
ましい態様であり、これは通常の断片の中でもとりわけ
好ましい。
【００６１】また本発明の好ましい態様は、ＨマルコＳ
Ｒの構造的または機能的属性により特徴づけられた断片
である。この点に関する本発明の好ましい態様には、Ｈ
マルコＳＲのアルファーヘリックスおよびアルファーヘ
リックス形成領域（「アルファー領域」）、ベータシー
トおよびベータシート形成領域（「ベータ領域」）、タ
ーンおよびターン形成領域（「ターン領域」）、コイル
およびコイル形成領域（「コイル領域」）、親水性領
域、疎水性領域、アルファー両極性領域、ベータ両極性
領域、可変領域、表面形成領域および高抗原性指標領域
を含む断片などがある。
【００６２】この点に関する非常に好ましい断片は、上
述の幾つかの様相のような幾つかの構造的様相をくみあ
わせたＨマルコＳＲの領域を含む断片である。この点に
関して、領域は、図１または４の約１０から約２０、約
４０から約５０、約７０から約９０および約１００から
約１１３の残基により決定され、これらは全てターン領
域、親水性領域、可変領域、表面形成領域および高抗原
性指標領域に非常に特徴的なアミノ酸組成物により特性
化され、特に好ましい領域である。このような領域は、
大きなポリペプチドないに包含され得、単独で上述の本
発明の好ましい断片と成りうる。このパラグラフで用い
る「約」なる用語は、一般に断片に関して用いる上記に
示す意味である。
【００６３】さらに好ましい領域は、ＨマルコＳＲの活
性を媒介する領域である。この点に関して最も好ましく
は、ＨマルコＳＲの化学的、生物学的、またはその他の
活性を有する断片であり、同様の活性もしくは改善され
た活性のある、または望ましくない活性を減じた断片で
ある。この点に関して、特に好ましいものは、関連ポリ
ペプチド、例えばＨマルコＳＲを含む図１または４に示
す関連ポリペプチドの配列、または位置、または配列お
よび活性領域の両方で相同的な領域を含むものである。
この点に関して、なかでもとりわけ好ましい断片は、上
述のトランケーション突然変異体である。本発明はまた
とりわけ前述の断片をコードするポリヌクレオチド、そ
の断片をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズ
するポリヌクレオチド、特にストリンジェント状態でハ
イブリダイズするポリヌクレオチド、およびその断片を
コードするポリヌクレオチドを増幅するＰＣＲプライマ
ーのようなポリヌクレオチドに関する。この点に関し
て、好ましいポリヌクレオチドは、上述の様に、好まし
い断片に対応するポリヌクレオチドである。
【００６４】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた本発明のポリヌクレオチドを含むベクタ
ー、本発明のベクターで遺伝子操作する宿主細胞および
組換え技法による本発明のポリペプチドの産生にも関す
る。宿主細胞は、遺伝子操作して、ポリヌクレオチドを
挿入し、本発明のポリペプチドを発現することができ
る。例えば感染、形質導入、トランスフェクション、ト
ランスベクションおよび形質転換の周知の技法を用い
て、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入できる。ポリヌ
クレオチドは単独でまたは他のポリヌクレオチドと共に
導入できる。このような他のポリヌクレオチドは別個に
導入、同時導入または本発明のポリヌクレオチドに結合
させて導入できる。従って、例えば哺乳動物細胞で同時
トランスフェクションおよび選別するための標準的な技
法を用いて、選別マーカーをコードする別の離れたポリ
ヌクレオチドと共に、本発明のポリヌクレオチドを宿主
細胞にトランスフェクトできる。この場合、ポリヌクレ
オチドは通常遺伝子的に安定して宿主細胞ゲノムに挿入
される。
【００６５】また別に、ポリヌクレオチドは宿主細胞に
おける伸長のための選別マーカーを含有するベクターに
結合できる。ベクター構築は上述の技法により、宿主細
胞に導入できる。一般的に、プラスミドベクターは沈殿
例えばリン酸カルシウム沈殿中、または荷電脂質との複
合体中ＤＮＡとして導入する。ポリヌクレオチドを宿主
に導入するために、電気泳動をも用いることができる。
ベクターがウイルスである場合、インビトロでパッケー
ジングまたはパッケージング細胞に導入でき、パッケー
ジングウイルスを細胞に形質導入できる。本発明の態様
に準じた、ポリヌクレオチドの製造および細胞へのポリ
ヌクレオチドの導入に適した種々の技法は、当業者に周
知であり、日常的に用いられるものである。このような
技法は上述のSambrookらに詳細に報告されており、これ
らの技法を詳細に説明する多くの実験マニュアルの説明
となるものである。本発明のこの態様に準じたベクター
は、例えばプラスミドベクター、一本または二本鎖ファ
ージベクター、一本または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡウ
イルスベクターなどでよい。このようなベクターはポリ
ヌクレオチド、好ましくはＤＮＡとして、ＤＮＡおよび
ＲＮＡの細胞への導入のための周知の技術により細胞に
導入できる。ベクターがファージおよびウイルスベクタ
ーである場合もまた、感染および形質導入のため周知の
技術により、パッケージ化または包膜化したウイルスと
して細胞に導入でき、これは好ましいことである。ウイ
ルスベクターは複製能力があるかまたは複製能力を欠損
していてよい。後者の場合のウイルスの増殖は通常細胞
を完全化した場合にのみ起こる。
【００６６】中でも好ましいベクターは、ある観点で
は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチを発現
するベクターである。一般に、このようなべクターは、
発現させるポリヌクレオチドに機能的に連鎖した宿主に
おける発現に有効なシス作用制御領域を含む。適当なト
ランス作用因子は宿主により供給される、完全化ベクタ
ーにより供給される、または宿主への導入時にベクター
自身により供給されるかのいずれかである。この点に関
するある態様では、ベクターは特異的発現を提供する。
このような特異的発現は、誘導可能な発現もしくは特定
の型の細胞においてのみ発現するか、または誘導可能お
よび細胞特異性の両方でよい。誘導可能なベクターのう
ちとりわけ好ましいベクターは、温度および栄養添加物
など操作が容易である環境因子により発現を誘導できる
ベクターである。本発明のこの態様に適した種々ベクタ
ーには原核および真核宿主で用いられる構成および誘導
可能な発現ベクター等があり、当業者に周知であり、通
常的に用いられている。操作した宿主細胞は、従来の栄
養培地で培養でき、とりわけ活性化プロモーター、選別
形質転換体または増幅遺伝子に適当なように改変でき
る。発現のために選別した宿主で以前に用いた培養条件
例えば温度、ｐＨ等は、当業者に明白であるように、通
常本発明のポリペプチドの発現に適している。
【００６７】非常に多くの種類のベクターが、本発明の
ポリペプチドを発現するために使用できる。このような
ベクターには、染色体、エピソームおよびウイルス由来
のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオフ
ァージ由来、酵母エピソーム由来、酵母染色体要素由
来、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、例えば
ＳＶ４０、ワクシナウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウ
イルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等の
ウイルス由来のベクター、並びにそれらを組み合わせた
物に由来するベクター、例えばプラスミドおよびバクテ
リオファージ遺伝的要素由来のベクター、例えばコスミ
ドおよびファージミド（phagemids）等があり、全て本
発明の態様に準じた発現に用いることができる。通常宿
主中にポリペプチドを発現するためのポリヌクレオチド
を保持、伸長または発現するのに適した任意のベクター
が、この点に関して発現に使用できる。周知のおよび日
常的な種々の任意の技術により、適当なＤＮＡ配列をベ
クターに挿入できる。一般に、１またはそれ以上の制限
エンドヌクレアーゼでＤＮＡ配列および発現ベクターを
切断し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて制限断片を結合す
ることにより、発現のためのＤＮＡ配列を発現ベクター
に結合する。この目標のために用いることができる制限
およびライゲーション方法は、当業者に周知であり、日
常的に用いられているものである。この点に関して、お
よび別法を用いた構築発現ベクターのための適切な方法
はもまた、当業者に周知であり、日常的に用いられてい
るものであり、本明細書に引用したSambrookら、に非常
に詳細に記載されている。
【００６８】発現ベクターのＤＮＡ配列は、適当な（複
数の）発現制御配列、例えばｍＲＮＡ転写を指示するプ
ロモーター等に機能的に連結する。このようなプロモー
ターの代表的なものとしては、幾つか周知のプロモータ
ーの名前を挙げると、ファージラムダＰＬプロモータ
ー、大腸菌（E.coli）ｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロ
モーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター並びに
レトロウイルスＬＴＲのプロモーター等がある。本発明
の態様に用いるのに適した、記載していない多くのプロ
モーターが周知であり、本明細書の記載および実施例に
説明する方法で当業者に容易に用いることができるとい
うことは、理解されよう。一般に、発現構築物は転写開
始および終了部位を含み、転写された領域では翻訳のた
めのリボソーム結合部位を含む。構築物により発現され
る成熟転写物のコード部分には、翻訳されるポリペプチ
ドの末端に適当に位置する開始および終了コドンで翻訳
開始ＡＵＧを含む。さらに構築物は、発現を制御および
引き起こす制御領域を含有してよい。通常、多くの一般
的な慣習的な方法に準じて、このような領域は制御転写
例えばとりわけレプレッサー結合部位およびエンハンサ
ーにより操作される。
【００６９】伸長および発現のためのベクターは通常、
選別可能なマーカーを含有する。このようなマーカーは
また増幅にも適するか、またはベクターがこの目的のた
めに更なるマーカーを含有できる。この点に関して、発
現ベクターは、形質転換した宿主細胞の選別のための表
現型特性を提供する、１またはそれ以上の選別マーカー
を含有する。好ましいマーカーにはジヒドロフォレート
リダクターゼまたは真核細胞培養用ネオマイシン抵抗、
大腸菌およびその他の細菌の培養用テトラサイクリン、
カナマイシン、およびアンピシリン抵抗遺伝子等があ
る。本明細書記載の適当なＤＮＡ配列を含有するベクタ
ー、および適当なプロモーター、およびその他の適当な
制御配列は、望ましいポリペプチドをそこに発現するの
に適した種々の周知の技術を用いて適当な宿主に導入で
きる。適当な宿主の代表的な例としては、細菌細胞例え
ば大腸菌、ストレプトミセス属およびネズミチフス菌
（Salmonella typhimurium）細胞；真菌細胞例えば酵母
細胞；昆虫細胞例えばドロソフィラＳ２（Drosophila S
2）およびスポドプテラＳｆ９（Spodoptera Sf9）細
胞；動物細胞例えばＣＨＯ，ＣＯＳおよびボウズ（Bow
s）黒色腫細胞；並びに植物細胞等がある。非常に多様
な発現構築のための宿主が周知であり、本明細書の開示
により、本発明の態様に準じたポリペプチドを発現する
ための宿主の選択が、当業者に容易になる。
【００７０】さらに、本発明はまた上述の配列を１また
はそれ以上含む、組換え構築物例えば発現構築物をも含
む。構築物には、本発明のこのような配列が挿入されて
いるベクター、例えばプラスミドまたはウイルスプラス
ミド等も含まれる。この配列は正または逆配向で挿入で
きる。この点に関して、ある好ましい態様において、構
築物には、さらにその配列に機能的に連結した制御配列
例えばプロモーター等がある。非常に多くの適当なベク
ターおよびプロモーターが当業者に周知であり、本発明
の使用に適した多くのベクターが市販により入手可能で
ある。
【００７１】市販されている以下のベクターを実施例と
して提供する。細菌中で使用するのに好ましいベクター
には、キアゲンより入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０
およびｐＱＥ−９；ストラッタジーンより入手可能なｐ
ＢＳベクター、ファジェスクリプト（Phagescript）ベ
クター、ブルースクリプト（Bluescript）ベクター、ｐ
ＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ＡおよびｐＮＨ46
Ａ；並びにファルマシアより入手可能なｐｔｃ９９ａ、
ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、
ｐＲＩＴ５等がある。真核細胞ベクターで好ましいもの
は、ストラッタジーンより入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐ
ＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；並
びにファルマシアより入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰ
Ｖ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ等がある。これらのベクタ
ーは単に多くの市販のベクターの説明のために列挙して
おり、本発明の態様に準じた使用のために、当業者に入
手可能なベクターである。宿主内で本発明のポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドを例えば導入、保持、伸長ま
たは発現するのに適した任意のその他のプラスミドまた
はベクターが、本発明のこの態様において使用できるこ
とは理解されよう。
【００７２】プロモーター領域は、プロモーター領域を
欠いたリポーター転写ユニット、例えばクロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ（「ＣＡＴ」）転写
ユニットを、制限部位または志願プロモーター（candid
ate promoter）断片すなわちプロモーターを含みうる断
片を導入する部位の下方に含有するベクターを用いて、
任意の望ましい遺伝子から選別できる。周知の様に、ｃ
ａｔ遺伝子の上方の制限部位でプロモター含有断片をベ
クターに導入すると、標準的なＣＡＴ検定により検出で
きるＣＡＴ活性の産生を引き起こす。この目標に適した
ベクターは周知であり、容易に入手可能である。2個の
このようなベクターはｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７
である。このように本発明のポリヌクレオチドの発現の
ためのプロモーターには、周知で容易に入手できるプロ
モーターのみならず、リポーター遺伝子を用いて前述の
技術により容易に得ることができるプロモーターもあ
る。
【００７３】本発明に準じたポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドの発現に適した、周知のの細菌性プロモータ
ーには、大腸菌ｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、
Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ラ
ムダＰＲ、ＰＬプロモーター並びにｔｒｐプロモーター
等がある。この点に関して適当な周知の真核細胞プロモ
ーターには、ＣＭＶ極初期プロモーター、ＨＳＶチミジ
ンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロ
モーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター、例え
ばラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）のプロモーター並
びにメタロチオネインプロモーター例えばマウスメタロ
チオネイン−Ｉプロモーター等がある。宿主細胞におけ
る発現のための適当なベクターおよびプロモーターの選
別は周知の方法であり、発現ベクター構築、宿主へのベ
クターの導入および宿主中での発現に必要な技術は当業
者に通常的に用いられるものである。
【００７４】本発明はまた上述の構築物を含有する宿主
細胞にも関する。宿主細胞は高等な真核細胞、例えば哺
乳動物細胞、または下等な真核細胞、例えば酵母細胞で
よく、または宿主細胞は原核細胞例えば細菌細胞でもよ
い。構築物の宿主細胞への導入はリン酸カルシウムトラ
ンスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トラン
スフェクション、カチオン脂質媒介トランスフェクショ
ン、電気泳動、形質導入、感染またはその他の方法によ
り影響を受け得る。このような方法は多くの標準的な実
験マニュアル、例えばDavisら、Basic Methods in Mole
cular Biology，（1986）に記載されている。
【００７５】宿主内の構築物は通常の方法で用いて、組
換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生すること
ができる。また別に、本発明のポリペプチドは通常のペ
プチド合成により合成的に産生できる。成熟タンパク質
は哺乳動物細胞、酵母、細菌またはその他の細胞に、適
当なプロモーターの制御下で発現できる。細胞フリーの
翻訳系は本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用い
たこのようなタンパク質の産生にも用いることができ
る。原核および真核細胞宿主での使用に適当なクローニ
ングおよび発現ベクターは、Sambrookら、Molecular Cl
oning ：A Laboratory Manual，第二編、コールドスプ
リングハーバーラボラトリープレス、コールドスプリン
グハーバー、ニューヨーク州（1989）に記載されてい
る。
【００７６】一般的に、組換え発現ベクターは複製源、
下方の構造配列の転写を指示する高度に発現した遺伝子
由来のプロモーターおよびベクターに曝露した後の細胞
を含有するベクターの単離を可能にする選別マーカーな
どを含む。なかでも適切なプロモーターには、グルコー
ス分解酵素例えば、とりわけ３−ホスホグリセレートキ
ナーゼ（「ＰＧＫ」）ａ−因子、酸ホスファターゼおよ
び熱ショックタンパク質等をコードする遺伝子に由来す
るプロモーター等がある。選別マーカーには、大腸菌の
アンピシリン抵抗遺伝子およびビール酵母菌のｔｒｐ１
遺伝子等がある。高等真核細胞による本発明のポリペプ
チドをコードするＤＮＡ転写は、エンハンサー配列をベ
クターに挿入することにより増強させることができる。
エンハンサーは、与えられた宿主細胞型におけるプロモ
ーターの転写活性を増強するように作用する、通常約１
０〜３００塩基対（bp）のＤＮＡのシス作用要素であ
る。エンハンサーの例としては、１００〜２７０塩基対
での複製起源の後位置に位置するＳＶ４０エンハンサ
ー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサ
ー、複製起源の後位置のポリオーマエンハンサー、およ
びアデノウイルスエンハンサー等がある。
【００７７】本発明のポリペプチドの異型の構造配列を
コードする本発明のポリヌクレオチドは、通常標準法を
用いてベクターに挿入し、発現用プロモーターに機能的
に連結する。ポリヌクレオチドは、転写開始部位がリボ
ソーム結合部位の５’に適当に存在するように位置決定
する。リボソーム結合部位は発現すべきポリペプチドの
翻訳を開始するＡＵＧの５’である。通常、開始コド
ン、通常ＡＵＧで始まるオープンリーディングフレーム
は他になく、リボソーム結合部位および開始ＡＵＧの間
にある。また通常、ポリペプチドの末端に翻訳停止コド
ンがあり、転写された領域の３’末端に適当に配置され
たポリアデニル化信号および転写終了信号がある。
【００７８】翻訳タンパク質を、小胞体内腔、ペリプラ
スミックスペースまたは細胞外環境へ分泌するために、
適当な分泌信号を発現したポリペプチドに挿入すること
ができる。信号はポリペプチドに対して内因性でよく、
または異型性の信号でもよい。ポリペプチドは改変した
形態、例えば融合タンパク質の形態で発現でき、分泌信
号のみならず付加的な異型性機能的領域をも含み得る。
このように、例えば付加アミノ酸とりわけ荷電アミノ酸
領域は、ポリペプチドのＮ−末端に付加し、精製中また
はそれに続く操作および保存中の、宿主細胞内での安定
性および持続性を改善する。また、その領域はポリペプ
チドに付加して精製を容易にできる。このような領域は
ポリペプチドの最終的な調製の前に除去できる。ペプチ
ド部分をポリペプチドに付加し、とりわけ、分泌または
排泄を引き起こし、安定性を改善し、および精製を容易
にするのは、当業界でよくあることであり、通常的な技
術である。
【００７９】本発明に準じたポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドの伸長、保持または発現に適した原核細胞宿
主には、大腸菌（Escherichia coli），枯草菌（Bacill
us subtilis）およびネズミチフス菌（Salmonella typh
imurium）等がある。シュードモナス属、ストレプトミ
セス属、およびブドウ球菌属は、この点に関して、適切
な宿主である。さらに、多くのその他の宿主も当業者に
周知であり、使用できる。細菌使用のための有用な発現
ベクターの代表的なものとして、周知のクローニングベ
クターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝的要
素を含む市販されているプラスミド由来の選別マーカー
およびの細菌の複製起源等があるが、これに限定するも
のではない。このような市販されているベクターには、
例えばｐＫＫ２２３３（ファルマシアファインケミカル
ズ、ウプサラ、スゥエーデン）およびＧＥＭ１（プロメ
ガバイオテック、メディソン、ウイスコンシン州、米
国）等がある。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分は適
当なプロモーターおよび構造配列と結合して発現され
る。
【００８０】適当な宿主株の形質転換および適当な細胞
密度までの宿主株の成長に続いて、選択したプロモータ
ーが誘導可能な場合、適当な手段（例えば温度シフトま
たは化学適インデューサーへの曝露）によりそのプロモ
ーターを誘導し、細胞は更なる期間培養する。通常、次
に細胞を遠心により収穫し、物理学的または化学的手段
により分解し、得られた粗抽出物をさらなる精製用に保
持する。タンパク質の発現に用いた微生物細胞は、凍結
−融解サイクル、ソニケーション、機械的分解または細
胞溶解物質の使用等の、任意の通常的な方法により分解
でき、このような方法は当業者に周知である。
【００８１】種々の哺乳動物細胞系も同様に発現に用い
ることができる。哺乳動物発現系の例としては、サル腎
繊維芽細胞ＣＯＳ−７ライン等があり、Gluzmanら、Cel
l，23:175（1981）に記載されている。適合するベクタ
ーを発現できるその他のセルラインには、例えばＣ１２
７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ヒト腎２９３およびＢ
ＨＫセルライン等がある。哺乳動物発現ベクターには、
複製起源、適当なプロモーターおよびエンハンサー等が
あり、また発現に必要な、任意の必須リボソーム結合部
位、ポリアデニル化部位、スプライス供与部位および受
容部位、転写終止配列および５’フランキング非転写配
列などもある。この点に関する好ましい態様において、
ＳＶ４０スプライス部位およびＳＶ４０ポリアデニル化
部位由来のＤＮＡ配列はこれらの型の獲得非転写遺伝要
素に用いられる。
【００８２】ＨマルコＳＲポリペプチドは硫酸アンモニ
ウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽
イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロ
マトグラフィー、疎水性干渉クロマトグラフィー（hydr
ophobic interaction chromatography）、親和性クロマ
トグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ
ーおよびレクチンクロマトグラフィー等の周知の方法に
より、組換え細胞培養物から回収および精製できる。最
も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬ
Ｃ」）を精製に用いる。ポリペプチドが単離および／ま
たは精製中に変性した場合、再び活性な立体配座にする
ために再折り畳みタンパク質のための周知の技術を用い
ることができる。
【００８３】本発明のポリペプチドには、天然に精製さ
れた産物、化学合成法の産物および組換え法により原核
または真核宿主、例えば細菌、酵母、高等植物、昆虫お
よび哺乳動物細胞から産生した産物等がある。組換え産
生法において用いる宿主に応じて、本発明のポリペプチ
ドはグリコシル化または非グリコシル化してよい。さら
に、本発明のポリペプチドはまた、ある場合は宿主媒介
工程の結果として、開始改変メチオニン残基をも含有で
きる。
【００８４】ＨマルコＳＲポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドは本発明に準じて、種々の適用、とりわけＨマ
ルコＳＲの化学的および生物学的特性を利用する適用に
準じて使用できる。さらに、細胞、組織および生体の診
断および処置に関連して適用する。本発明の態様はさら
に以下に記載して説明する。ＨマルコＳＲポリペプチド
およびポリヌクレオチドは本発明に準じて、種々の適
用、とりわけスカベンジャー受容体の化学的および生物
学的特性を利用する適用に準じて使用できる。とりわ
け、（１）アンタゴニスト／アゴニスト受容体のスクリ
ーニング；（２）このようなポリペプチドに抗した抗体
の提供；（３）治療目的で、例えばアテローム性動脈硬
化症、高血圧、心筋および脳の梗塞、アンギナ、器官不
全、発作、および四肢の壊疽、機能喪失等の種々心臓血
管系疾患並びに種々マクロファージ関与の宿主防御障害
の処置または診断のための、アゴニスト／アンタゴニス
トを同定および分配する方法の提供；診断または処置で
きるその他の疾患は、敗血症発作、膵炎、複数の器官不
全、グラム陰性および陽性細菌による内毒素血症および
感染である；（４）受容体サブタイプの単離；並びに
（５）生物学的に活性で、診断学的にまたは治療的に有
用な、それらの断片、類似体および誘導体の単離におけ
る適用である。さらに細胞、組織および生体の障害の診
断および処置に関して適用される。これらの本発明の態
様は、さらに以下の記載により説明する。
【００８５】ポリヌクレオチド検定 本発明はまた、例えば診断用試薬として相補的ポリヌク
レオチドを検出するためのＨマルコＳＲポリヌクレオチ
ドの使用に関する。機能不全に関与するＨマルコＳＲの
突然変異型の検出は、ＨマルコＳＲの過少発現、過剰発
現または変化した発現の結果起こる疾患または疾患のに
対する感受性を付け加えられる、または明確にできる診
断方法を提供する。ＨマルコＳＲ遺伝子の突然変異を担
うものは種々の技術によりＤＮＡレベルで検出できる。
診断用の核酸は患者の細胞例えば血液、尿、唾液、組織
生検および剖検材料より得ることができる。ゲノムＤＮ
Ａは直接的に検出するのに使用できるか、または分析の
前にＰＣＲを用いることにより酵素的に増幅できる。Ｐ
ＣＲ（Saikiら、Nature，324:163-166（1986））。ＲＮ
ＡまたはｃＤＮＡもまた同じ方法で用いることができ
る。例としては、ＨマルコＳＲをコードする核酸に相補
的なＰＣＲプライマーはＨマルコＳＲ発現および突然変
異型の同定および分析に用いることができる。例えば、
欠損および挿入は正常の遺伝子型に比較して増幅産物の
大きさの変化により検出できる。点突然変異は、増幅Ｄ
ＮＡを放射性標識化ＨマルコＳＲ ＲＮＡに、また別に
放射性標識化ＨマルコＳＲアンチセンスＤＮＡ配列にハ
イブリダイズすることにより同定できる。完全にマッチ
した配列はＲＮアーゼ消化により、または融解温度の差
により、ミスマッチ二重らせんから区別できる。
【００８６】参照遺伝子および突然変異を有する遺伝子
の配列の違いはまた、直接的なＤＮＡシークエンシング
により表すこともできる。さらに、クローン化ＤＮＡ部
分は特異的ＤＮＡ部分を検出するためのプローブとして
用いることができる。このような方法の感度はＰＣＲを
適当に使用することにより、または別の増幅方法により
非常に増強させることができる。例えば、シークエンシ
ングプライマーは二本鎖ＰＣＲ産物または改変ＰＣＲに
より生じる一本鎖鋳型分子と共に用いられる。配列決定
は、放射性標識化ヌクレオチドを用いる通常の方法によ
り、または蛍光タグを用いる自動シークエンシング法に
より行うことができる。ＤＮＡ配列の差に基づく遺伝的
試験は、変性物質を伴うまたは伴わないゲル中のＤＮＡ
断片の電気泳動の可動性の変化を検出することにより達
成できる。小さな配列の欠損および挿入は高分析能ゲル
電気泳動により可視化できる。異なる配列のＤＮＡ断片
は、異なるＤＮＡ断片の可動性がゲル中特異的融解また
は部分的融解温度に準じて異なる位置で遅延する、変性
ホルムアミドグラジエントゲル上で区別できる（例えば
Meyersら、Science，230:1242（1985）参照）。
【００８７】特異的な位置での配列の変化はまた、ヌク
レアーゼ保護検定例えばＲＮアーゼおよびＳ１保護また
は化学的切断法によっても表すことができる（例えばCo
ttonら、Proc.Natl.Acad.Sci.,米国，85:4397-4401（19
85））。このように、特異的ＤＮＡ配列の検出は、ハイ
ブリダイゼーション、ＲＮアーゼ保護、化学的切断、直
接的ＤＮＡシークエンシングまたは制限酵素の使用（例
えば制限断片長多形性（「ＲＦＬＰ」））およびゲノム
ＤＮＡのサザンブロッティングにより達成できる。通常
のゲル電気泳動およびＤＮＡシークエンシングに加え
て、突然変異もまた従来の分析により検出できる。
【００８８】本発明のさらなる態様に準じて、アテロー
ム性動脈硬化症、高血圧、心筋および脳の梗塞、アンギ
ナ、器官不全、発作、および四肢の壊疽、機能喪失等の
種々心臓血管系疾患並びに種々マクロファージ関与の宿
主防御障害に対する感受性を決定する方法を提供する。
感受性を決定できるその他の疾患には、敗血症発作、膵
炎、複数の器官不全、グラム陰性および陽性細菌による
内毒素血症および感染がある。このように、ＨマルコＳ
Ｒにおける突然変異は、前述の障害および疾患の感受性
を示し、上述の核酸配列はこのような感受性の確認のた
めの検定に用いることができる。このように、例えば、
この検定は本明細書に記載するようなＨマルコＳＲタン
パク質の、前述の障害および疾患に対する感受性を示す
ような突然変異、例えば欠損、トランケーション、挿
入、フレームシフト等を決定するために用いることがで
きる。
【００８９】突然変異は例えばＤＮＡシークエンシング
検定により確認できる。限定するものではないが、血液
等の組織試料は、ヒト患者から得る。試料を当業界で周
知の方法により、ＲＮＡ捕獲するための処理を行う。ｃ
ＤＮＡの最初の鎖はｍＲＮＡ上に存在するポリアデノシ
ンの配列にハイブリダイズするポリチミジン残基から成
るオリゴヌクレオチドプライマーを加えることにより、
ＲＮＡ試料から合成する。逆転写酵素およびデオキシヌ
クレオチドを加えてｃＤＮＡの最初鎖を合成する。プラ
イマー配列は、本発明のＤＮＡ修復タンパク質のＤＮＡ
配列に基づいて合成する。プライマー配列は通常少なく
とも１５の連続的な塩基から成り、少なくとも３０また
は５０もの連続的な塩基を含有できる。
【００９０】本発明の遺伝子に突然変異をもたらすもの
はまた、種々の技術により、ＤＮＡレベルで検出でき
る。診断用の核酸は患者の細胞例えば、限定するもので
はないが、血液、尿、唾液、組織生検および剖検材料よ
り得ることができる。ゲノムＤＮＡは直接的に検出する
のに使用できるか、または分析の前にＰＣＲを用いるこ
とにより酵素的に増幅できる（Saikiら、Nature，324:1
63-166（1986））。ＲＴ−ＰＣＲもまた突然変異を検出
するために用いることができる。ＲＴ−ＰＣＲは自動検
出系例えばジーンスキャンと組み合わせて用いるのがと
りわけ好ましい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同じ目
的、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲで用いることができる。
例を挙げると、ＨマルコＳＲをコードする核酸に相補的
なＰＣＲプライマーは、突然変異を同定および分析する
のに用いることができる。例えば、欠損および挿入は正
常の遺伝子型に比較して増幅産物の大きさの変化により
検出できる。点突然変異は、増幅ＤＮＡを放射性標識化
ＲＮＡに、また別に放射性標識化アンチセンスＤＮＡ配
列にハイブリダイズすることにより同定できる。完全に
マッチした配列はＲＮアーゼＡ消化により、または融解
温度の差により、ミスマッチ二重らせんから区別でき
る。
【００９１】プライマーは患者由来の試料から単離した
ＨマルコＳＲｃＤＮＡを増幅するために用いることがで
きる。本発明はまた５’および／または３’末端から除
去した１、２、３または４個のヌクレオチドを有するプ
ライマー１を提供する。このプライマーは、患者から単
離した遺伝子を増幅するために用いることができ、その
遺伝子をＤＮＡ配列を明示するための種々技術に供する
ことができる。このようにして、ＤＮＡ配列における突
然変異は診断できる。本明細書で用いるプライマーは、
当業者に明白である。参照遺伝子および突然変異を有す
る遺伝子の配列の違いはまた、直接的なＤＮＡシークエ
ンシングにより表すこともできる。さらに、クローン化
ＤＮＡ部分は特異的ＤＮＡ部分を検出するためのプロー
ブとして用いることができる。この方法の感度はＰＣＲ
を組み合わせた場合に非常に増強される。例えば、シー
クエンシングプライマーは二本鎖ＰＣＲ産物または改変
ＰＣＲにより生じる一本鎖鋳型分子と共に用いられる。
配列決定は、放射性標識化ヌクレオチドを用いる通常の
方法により、または蛍光タグを用いる自動シークエンシ
ング法により行うことができる。
【００９２】ＤＮＡ配列の差に基づく遺伝的試験は、変
性物質を伴うまたは伴わないゲル中のＤＮＡ断片の電気
泳動の可動性の変化を検出することにより達成できる。
小さな配列の欠損および挿入は高分析能ゲル電気泳動に
より可視化できる。異なる配列のＤＮＡ断片は、異なる
ＤＮＡ断片の可動性がゲル中特異的融解または部分的融
解温度に準じて異なる位置で遅延する、変性ホルムアミ
ドグラジエントゲル上で区別できる（例えばMeyersら、
Science，230:1242（1985）参照）。特異的な位置での
配列の変化はまた、ヌクレアーゼ保護検定例えばＲＮア
ーゼおよびＳ１保護または化学的切断法によっても表す
ことができる（例えばCottonら、PNAS,米国，85:4397-4
401（1985））。
【００９３】このように、特異的ＤＮＡ配列の検出およ
び／または配列レベルの定量は、ハイブリダイゼーショ
ン、ＲＮアーゼ保護、化学的切断、直接的ＤＮＡシーク
エンシングまたは制限酵素の使用、例えば制限断片長多
形性（「ＲＦＬＰ」）およびゲノムＤＮＡのサザンブロ
ッティングにより達成できる。本発明は、患者由来の試
料より、配列番号：５の配列を有するポリヌクレオチド
を発現レベルの低下を測定することを含む、アテローム
性動脈硬化症、高血圧、心筋および脳の梗塞、アンギ
ナ、器官不全、発作、および四肢の壊疽、機能喪失等の
種々心臓血管系疾患；並びにマクロファージおよびその
他の免疫細胞関与の宿主防御障害、敗血症発作、膵炎、
複数の器官不全、グラム陰性および陽性細菌による内毒
素血症および感染等の診断方法を提供する。ポリヌクレ
オチドの発現レベルの低下は、ポリヌクレオチドの定量
のための当業者に周知の方法、例えばＰＣＲ、ＲＴ−Ｐ
ＣＲ、ＲＮアーゼ、ノーザンブロッティングおよびその
他のハイブリダイゼーション法等の任意の方法を用いて
測定することができる。より通常的なゲル電気泳動およ
びＤＮＡシークエンシングに加えて、突然変異もまた従
来の分析により検出できる。ｃＤＮＡクローンの分裂中
期染色体分散に対する従来の蛍光ハイブリダイゼーショ
ン（ＦＩＳＨ）は、正確な染色体位置を提供するために
用いることができる。
【００９４】これを実施する方法の例を挙げると、Ｈマ
ルコＳＲ ＤＮＡはＱＩＡＥＸ ＩＩＤＮＡ精製キット
（キアゲンインコーポレーティッド、チャッツウォー
ス、カリフォルニア州）で消化および精製し、スーパー
Ｃｏｓ１コスミドベクター（ストラッタジーン、ラジョ
ーラ、カリフォルニア州）にライゲートする。ＤＮＡを
キアゲンプラスミド精製キット（キアゲンインコーポレ
ーティッド、チャッツウォース、カリフォルニア州）を
用いて精製し、１ｍｇをバイオニックラベリングキット
（ギブコＢＲＬ、ライフテクノロジーズインコーポレー
ティッド、ガイザースベルグ、メリーランド州）を用い
て、ビオチン−ｄＡＴＰの存在下、ニック翻訳により標
識する。ビオチニル化はジーン−テクト検出系（クロン
テックラボラトリーズインコーポレーティッド、パロア
ルト、カリフォルニア州）で検出する。従来のハイブリ
ダイゼーションはオンコールライトハイブリダイゼーシ
ョンキット（オンコール、ガイザースベルグ、メリーラ
ンド州）を用いて、スライド上で、染色体分裂中期の単
一の複製配列を検出するために実施する。正常供与体の
末梢血は２０％ＦＣＳ、３％ＰＨＡおよびペニシリン／
ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０中3日
間培養し、１０-7Ｍメソトレキサートで17時間同調化
し、補充していないＲＰＭＩで２回洗浄する。細胞を１
０-3Ｍチミジンと７時間インキュベートする。コルセミ
ド（０.５ｍｇ／ｍｌ）と２０分間、続いて７５ｍＭ Ｋ
Ｃｌ中の低張リジンと１５分間３７℃でインキュベート
した後、分裂中期の細胞を捕捉する。細胞ペレットを次
いで回転させ、カルノイ固定液（３：１ メタノール／
酢酸）中固定する。
【００９５】懸濁液を１滴スライド上に加え、空気乾燥
して、分裂中期分散を調製する。遮断ヒト胎盤ＤＮＡ１
ｍｇ／ｍｌを含むハイブリダイゼーション混合物（５０
％ホルムアミド、２ｘＳＳＣ、１％硫酸デキストラン）
１０ｍｌにプローブ１００ｎｇを加えて、ハイブリダイ
ゼーションを実施する。プローブ混合物を７０℃温浴中
１０分間変性し、３７℃で１時間インキュベートし、そ
れから予め加温（３７℃）したスライドに載せるが、こ
れは予め７０％ホルムアミド／２ｘＳＳＣ中７０℃で変
成し、エタノールシリーズで脱水し４℃に冷却する。ス
ライドを３７℃で１６時間加湿器中でインキュベートす
る。スライドを５０％ホルムアミド／２ｘＳＳＣ中４１
℃で１０分間、および２ｘＳＳＣ中３７℃で７分間洗浄
する。製造プロトコールに準じて、スライドをＦＩＴＣ
−アビデン（オンコール、ガイザースベルグ、メリーラ
ンド州）と共にインキュベートすることにより、ハイブ
リダイゼーションプローブを検出する。染色体をマウン
トした培地に懸濁したプロプリジウムヨウ素で対比染色
する。レイツオルソプラン ２−エピ蛍光顕微鏡を用い
てスライドを可視化し、イメージネティックスコンピュ
ーターおよびマッキントシュプリンターを用いて5個の
コンピューター画像を得る。
【００９６】一度配列を正確な染色体位置にマッピング
すると、染色体上の物理的な位置は、遺伝子地図で補正
できる。このようなデータは例えばコンピューターを介
する公開されているＶ.McKusick，Mendelian Inheritan
ce in Manに見出される。同一の染色体領域にマッピン
グされた遺伝子と疾患の関係は、連鎖分析（Co-Inherit
ance of Physically Adjacent Genes）により同定され
る。他に記載しない場合、形質転換はGraham,F.およびV
an der Eb,A.，Virology，52:456-457（1973）に記載さ
れる方法で実施する。
【００９７】染色体検定 本発明の配列はまた染色体同定にも有用である。この配
列は個々のヒト染色体上の特定の位置を特異的に標的化
し、ハイブリダイズできる。さらに、染色体上の特定の
部位を同定する必要性が現在ある。今のところ染色体位
置をマークできる、実際の配列データー（繰り返し多形
性）に基づく染色体マーキング試薬は少ししか無い。本
発明に準じた染色体に対するＤＮＡのマッピングは、こ
れらの配列を疾患に関与する遺伝子と関連付けるのに重
要な最初の段階である。
【００９８】この点に関する好ましい態様において、本
明細書に開示するｃＤＮＡは、ＨマルコＳＲ遺伝子のゲ
ノムＤＮＡをクローンするのに用いられる。これは種々
の周知の技術および通常市販されているライブラリーを
用いて達成できる。次にゲノムＤＮＡを、この目的のた
めの周知の技術を用いて、従来の染色体マッピングに使
用する。通常染色体マッピングのための通常的な方法に
準じて、従来の良好なハイブリダイゼーション信号を提
供するゲノムプローブを同定するためには幾つかの試行
錯誤が必要である。
【００９９】さらに、ｃＤＮＡからのＰＣＲプライマー
（好ましくは１５〜２５塩基対）を調製することにより
配列が染色体にマッピングされ得る場合もある。遺伝子
の３’非翻訳領域のコンピューター分析は、増幅法を複
雑化する、ゲノムＤＮＡにおいて1以上のエクソンを延
ばさないプライマーを速やかに選別するために使用す
る。これらのプライマーは次に個々のヒト染色体を含有
する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用
される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含有するこ
れらのハイブリッドのみが増幅断片を生じる。
【０１００】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定のＤＮＡを特定の染色体に割り当てるための迅
速な方法である。同一のオリゴヌクレオチドプライマー
を用いる本発明を使用して、類似の方法で特異的染色体
または大きなゲノムクローンのプールからの、断片のパ
ネルで亜局在化（sublocalize）できる。その染色体に
マッピングするために使用できるその他のマッピング方
法には、従来のハブリダイゼーション、標識化流動分類
染色体でのプレスクリーニングおよび構築染色体特異的
ｃＤＮＡライブラリーに対するハイブリダイズによるプ
レ選別等がある。
【０１０１】分裂中期染色体分散に対する、ｃＤＮＡク
ローンの従来の蛍光ハイブリダイゼーション（「ＦＩＳ
Ｈ」）は、１段階における正確な染色体位置を提供する
ために使用できる。この技術は５０または６０ほどの短
いｃＤＮＡで用いることができる。この技術に関する文
献に関しては、Vermaら、Human Chromosomes：A Manual
of Basic Techniques、ペルガモンプレス、ニューヨー
ク（1988）を参照されたい。一度配列を正確な染色体位
置にマッピングすると、染色体上の配列の物理学的な位
置が遺伝子地図データーで補正できる。このようなデー
ターは例えば、ジョーンズホプキンス大学、ウェルチメ
ディカルライブラリーを介したオンラインで利用できる
V,.McKusick，Mendelian Inheritance in Manに見出す
ことができる。同一の染色体領域にマッピングされた遺
伝子および疾患との関係は、次いで連鎖分析（物理的に
近接した遺伝子の共同遺伝（coinheritance））により
同定される。
【０１０２】次に、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ配列に
おける影響を受けた個体および受けていない個体との差
を決定する必要がある。影響を受けた個体の幾つかまた
は全てで突然変異が観察されるが、任意の正常の個体で
は突然変異が観察されない場合、突然変異は疾患の原因
物質になり得る。物理的マッピングおよび遺伝的マッピ
ング技術の現在の解析により、疾患に関与する染色体領
域に正確に位置するｃＤＮＡは５０〜５００の強力な原
因遺伝子のｇＤＮＡであろう。（これは１メガ塩基マッ
ピング解析および２０キロ塩基あたり１遺伝子とみな
す）。
【０１０３】ポリペプチド検定 本発明はまたポリペプチドの正常および異常レベルの決
定を含む、細胞および組織中のＨマルコＳＲタンパク質
のレベルの検出のための定量、診断、検定等の診断検定
にも関する。このように、例えば本発明に準じた、正常
対照組織試料と比較したＨマルコＳＲの過剰発現を検出
する診断検定は、例えば腫瘍の存在を検出するために用
いることができる。宿主由来の試料中のタンパク質例え
ば本発明のＨマルコＳＲタンパク質のレベルを測定する
ために用いることができる検定技術は当業者に周知であ
る。このような検定方法にはラジオイムノアッセイ、競
合結合検定、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡ
検定等がある。このうちＥＬＩＳＡが頻繁に好ましく用
いられる。ＥＬＩＳＡ検定ではまず、ＨマルコＳＲに特
異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製す
る。さらにモノクローナル抗体に結合するリポーター抗
体を通常調製する。リポーター抗体は放射性、蛍光また
は酵素試薬、この例においては西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ等の検出可能な試薬に結合する。
【０１０４】ＥＬＩＳＡを実施するために、試料を宿主
から取り出し、試料中のタンパク質と結合する固体支持
体例えばポリスチレン皿上でインキュベートする。皿上
の任意のフリーのタンパク質結合部位をウシ血清アルブ
ミンのような非特異的タンパク質とインキュベートする
ことにより被覆する。次に、モノクローナル抗体がポリ
スチレン皿に付着した任意のＨマルコＳＲタンパク質に
付着する時間、モノクローナル抗体をインキュベートす
る。非結合モノクローナル抗体は緩衝液で洗い出す。西
洋ワサビペルオキシダーゼに連結したリポーター抗体は
皿に載せ、リポーター抗体をＨマルコＳＲに結合した任
意のモノクローナル抗体に結合させる。非付着リポータ
ー抗体を次いで洗い出す。比色基質等のペルオキシダー
ゼ活性のための試薬を次いで皿に加える。１次および２
次抗体により、ＨマルコＳＲに連結した固定化ペルオキ
シダーゼは呈色した反応産物を産生する。規定の時間内
に増加した色の量は試料中に存在するＨマルコＳＲタン
パク質の量を示す。一般に定量結果は標準曲線との比較
により得られる。競合検定を用いることができ、この検
定では、ＨマルコＳＲ特異的抗体を固体支持体および標
識化ＨマルコＳＲに付着させ、宿主由来の試料を固体支
持体を通過させ、固体支持体に付着した検出される標識
量は、試料中のＨマルコＳＲ量に相関する。
【０１０５】抗体 ポリペプチド、それらの断片もしくはその他の誘導体、
またはそれらの類似体、またはそれらを発現する細胞
は、それらの抗体を産生する免疫原として用いることが
できる。これらの抗体は例えばポリクローナルまたはモ
ノクローナル抗体でよい。本発明はまたキメラ、一本鎖
およびヒト化抗体、およびＦａｂ断片またはＦａｂ発現
ライブラリーの産物等を含む。当業界に周知の種々の方
法は、このような抗体および断片の産生に使用できる。
本発明の配列に対応するポリペプチドに抗して生じる抗
体は、ポリペプチドを好ましくはヒトはでない動物に直
接注射するかまたは動物にポリペプチドを投与すること
により得ることができる。このようにして得られた抗体
は次いでポリペプチド自身に結合する。この方法でポリ
ペプチドの断片のみをコードする配列さえももとの全ポ
リペプチドに結合する抗体の産生に用いることができ
る。このような抗体はポリペプチドをポリペプチドを発
現する組織から単離するのに用いることができる。
【０１０６】モノクローナル抗体の調製のために、連続
的なセルライン培養により産生される抗体を提供する任
意の技術を用いることができる。実例としては、ハイブ
リドーマ法（Kohler，G.およびMilstein,C.，Nature，2
56:495-497（1975））、トリオーマ法、ヒトＢセルハイ
ブリドーマ法（Kozborら、Immunology Today，4:72（19
83））およびヒトモノクローナル抗体を産生するための
ＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Coleら、Monoclonal Antib
odies and Cancer Therapy，アランＲリスインコーポレ
ーティッド、77-96頁（1985））等がある。一本鎖抗体
の産生のために記載された技術（米国特許第４９４６７
７８号）は本発明の免疫原ポリペプチド産物に対する一
本鎖抗体を産生するのに適用できる。また、トランスジ
ェニックマウスまたはその他の生物例えばその他の哺乳
動物は、例えば本発明の免疫原ポリペプチド産物に抗す
るヒト化抗体等の抗体を発現するのに用いることができ
る。
【０１０７】上述の抗体は、親和クロマトグラフィーで
抗体を単離および／または精製用固体支持体に付着させ
ることにより、ポリペプチドを発現するクローンの単離
もしくは同定、または本発明のポリペプチドの精製に用
いることができる。このように、とりわけＨマルコＳＲ
に抗する抗体は、アテローム性動脈硬化症、高血圧、心
筋および脳の梗塞、アンギナ、器官不全、発作、および
四肢の壊疽、機能喪失等の種々心臓血管系疾患並びにマ
クロファージおよびその他の免疫細胞関与の宿主防御障
害の阻止に用いることができる。その他の阻止できる疾
患には、敗血症発作、膵炎、複数の器官不全、グラム陰
性および陽性細菌による内毒素血症および感染等があ
る。
【０１０８】ＨマルコＳＲはまた、アテローム性動脈硬
化症、高血圧、心筋および脳の梗塞、アンギナ、器官不
全、発作、および四肢の壊疽、機能喪失等の種々心臓血
管系疾患並びにマクロファージおよびその他の免疫細胞
関与の宿主防御障害の処置にも用いることができる。そ
の他のＨマルコＳＲにより処置できる疾患には、敗血症
発作、膵炎、複数の器官不全、グラム陰性および陽性細
菌による内毒素血症および感染等がある。
【０１０９】ＨマルコＳＲ結合分子および検定 本発明はまた、ＨマルコＳＲに結合する受容体分子のよ
うな分子の同定方法をも提供する。ＨマルコＳＲに結合
するタンパク質例えば受容体タンパク質をコードする遺
伝子は当業者に周知の多くの方法、例えばリガンドパニ
ングおよびＦＡＣＳ分類により同定できる。このような
方法は多くの実験マニュアル、例えばColiganら、Curre
nt Protocols in Immunology、1(2):第5章（1991）に記
載されている。例えば、発現クローニングはこの目的で
行うことができる。この目標のためにポリアデニル化Ｒ
ＮＡをＨマルコＳＲに反応する細胞から調製し、ｃＤＮ
ＡライブラリーはこのＲＮＡから作り、このライブラリ
ーはプールに分割し、プールをＨマルコＳＲに反応しな
い細胞に個々にトランスフェクトする。次いでトランス
フェクトした細胞を標識化ＨマルコＳＲに曝露する。
（ＨマルコＳＲは放射性ヨウ素化または部位特異性タン
パク質キナーゼの認識部位の封入の標準法等の、種々の
周知の技術により標識化できる。）曝露した後、細胞を
固定し、ＨマルコＳＲの結合を測定する。これらの方法
は便宜的にガラススライド上で実施する。
【０１１０】プールはＨマルコＳＲ結合細胞を産生する
ｃＤＮＡを同定する。サブプールは上述のように宿主細
胞にトランスフェクトし、スクリーニングしたこれらの
陽性物質から調製する。サブプール化および再スクリー
ニング工程を繰り返し、推定される結合分子例えば受容
体分子をコードする１またはそれ以上の単一のクローン
を単離できる。また別に、標識化リガンドは細胞抽出物
例えばリガンドが結合する分子例えば受容体分子を発現
する細胞から調製した膜または膜抽出物に連結した光親
和物にできる。交差架橋物質はポリアクリルアミドゲル
電気泳動（「ＰＡＧＥ」）により解析し、Ｘ腺フィルム
に曝露する。リガンド受容体を含有する標識化複合体は
切り取り、ペプチド断片を分解し、タンパク質のマイク
ロシークエンシングに供することができる。マイクロシ
ークエンシングにより得られたアミノ酸配列は、推定さ
れる受容体分子をコードする遺伝子を同定するｃＤＮＡ
ライブラリーをスクリーニングする、独特なまたは同義
性オリゴヌクレオチドプローブの設計に用いることがで
きる。本発明のポリペプチドはまた、細胞中のまたは細
胞不含調製物中の、ＨマルコＳＲ結合分子、例えば受容
体分子のＨマルコＳＲ結合能力を評価するために用いる
ことができる。
【０１１１】本発明のＨマルコＳＲは、本発明の受容体
ポリペプチドを活性化（アゴニスト）または活性を阻害
（アンタゴニスト）化合物のスクリーニング法に用いる
ことができる。一般に、このようなスクリーニング法で
は、本発明の受容体ポリペプチドを表面に発現する適当
な細胞を提供する。このような細胞には哺乳動物、酵
母、ドロソフィラまたは大腸菌等がある。とりわけ、本
発明の受容体をコードするポリヌクレオチドはＨマルコ
ＳＲを発現する細胞をトランスフェクトするために用い
ることができる。発現した受容体は次いで試験化合物と
接触させ、機能的反応の結合、刺激または阻害を観察す
る。このようなスクリーニング法では、本発明のＨマル
コＳＲを発現するようにトランスフェクトした黒色素胞
を用いることがある。このようなスクリーニング技術は
1992年2月6日発行ＰＣＴ ＷＯ９２／０１８１０に記載
されている。
【０１１２】従って、例えば、このような検定は、受容
体をコードする黒色素胞細胞を受容体リガンドおよびス
クリーニングする化合物の両方と接触させることによ
り、本発明の受容体ポリペプチドの活性化を阻害する化
合物をスクリーニングするために用いることができる。
リガンドにより生じる信号の阻害は、化合物が受容体の
強力なアンタゴニストである、すなわち受容体の活性化
を阻害することを示している。スクリーニングは、この
ような細胞を、スクリーニングし、このような化合物が
信号を生じるかどうか、すなわち受容体を活性化するか
どうかを決定する化合物と接触させ、受容体を活性化す
る化合物を決定するために用いることができる。
【０１１３】その他のスクリーニング法には、受容体の
活性化により引き起こされる細胞外ｐＨ変化を測定する
系における、ＨマルコＳＲ発現細胞（例えばトランスフ
ェクトしたＣＨＯ細胞）の使用等があり、例えばScienc
e，246:181-296（1989年10月）に記載されている。例え
ば、化合物は本発明の受容体ポリペプチドを発現する細
胞と接触させ、２次メッセンジャー反応、例えば信号形
質導入またはｐＨ変化等を、化合物が受容体を強力に活
性化するか、または阻害するかを決定するために測定で
きる。その他のこのようなスクリーニング法では、Ｈマ
ルコＳＲをコードするＲＮＡをXenopus卵母細胞へ導入
し、一過的に受容体を発現させることがある。受容体卵
母細胞は次いで受容体リガンドおよびスクリーニングす
る化合物と接触させ、次いでカルシウム、プロトン等受
容体の活性化を阻害すると考えられる化合物をスクリー
ニングするための信号の阻害または活性化を検出する。
【０１１４】その他のスクリーニング法には、受容体が
ホスホリパーゼＣもしくはＤに、場合しだいではその他
のタンパク質に連結した、ＨマルコＳＲの発現等があ
る。このような細胞の代表的な例としては、前述の内皮
細胞、平滑筋細胞、腎胚細胞等がある。スクリーニング
は上述のように、例えばホスホリパーゼまたはその他の
活性化／発現タンパク質のための２次信号から受容体の
活性化または受容体の活性化の阻害を検出することによ
り達成できる。その他の方法では、表面に受容体を有す
る細胞に対する標識化リガンドの結合の阻害を決定する
ことにより、本発明のアンタゴニストの受容体ポリペプ
チドの活性化を阻害する化合物をスクリーニングする方
法等がある。このような方法では、細胞がその表面に受
容体を発現するようにＨマルコＳＲをコードするＤＮＡ
で真核細胞をトランスフェクトし、既知のリガンドの標
識化形態の存在下で細胞を化合物と接触させる。リガン
ドは、例えば放射活性により標識化できる。受容体に結
合する標識リガンドの量は、例えば受容体の放射活性を
測定することにより測定できる。化合物の受容体に対す
る結合が、受容体に結合する標識リガンドの減少により
測定されるような結合である場合、受容体に対する標識
リガンドの結合は阻害されている。
【０１１５】ＨマルコＳＲは哺乳動物宿主中に見出さ
れ、多くの病態等の多くの生物学的機能に関与する。従
って、一方でＨマルコＳＲを刺激し、他方でＨマルコＳ
Ｒの機能を阻害できる化合物および薬物を見出すことが
望まれる。例えば、ＨマルコＳＲを活性化する化合物
は、治療目的で例えばアテローム性動脈硬化症、高血
圧、心筋および脳の梗塞、アンギナ、器官不全、発作、
および四肢の壊疽、機能喪失等の種々心臓血管系疾患並
びにマクロファージ関与の宿主防御障害の処置に用いる
ことができる。処置できるその他の疾患は、敗血症発
作、膵炎、複数の器官不全、グラム陰性および陽性細菌
による内毒素血症および感染である。
【０１１６】一般に、ＨマルコＳＲの活性化を阻害する
化合物は、種々の治療目的で、例えばアテローム性動脈
硬化症、高血圧、心筋および脳の梗塞、アンギナ、器官
不全、発作、および四肢の壊疽、機能喪失等の種々心臓
血管系疾患並びにマクロファージ関与の宿主防御障害の
処置に用いることができる。ＨマルコＳＲを阻害する化
合物により処置できるその他の疾患は、とりわけ、敗血
症発作、膵炎、複数の器官不全、グラム陰性および陽性
細菌による内毒素血症および感染である。ＨマルコＳＲ
を阻害する化合物はまた例えばアテローム性動脈硬化
症、高血圧、心筋および脳の梗塞、アンギナ、器官不
全、発作、および四肢の壊疽、機能喪失等の種々心臓血
管系疾患並びにマクロファージ関与の宿主防御障害の逆
転にも有用である。ＨマルコＳＲを阻害する化合物によ
り逆転できるその他の疾患は、敗血症発作、膵炎、複数
の器官不全、グラム陰性および陽性細菌による内毒素血
症および感染である。
【０１１７】抗体は、本発明のＨマルコＳＲをアンタゴ
ナイズするか、またはある場合、ＨマルコＳＲに結合す
るが、ＨマルコＳＲの活性を防御するような２次メッセ
ンジャー反応を引き出さないオリゴペプチドである場合
もある。抗体には、通常抗体の抗原結合部位に関与する
独特の決定基を認識する抗イディオタイプ抗体等があ
る。強力なアンタゴニスト化合物には、ＨマルコＳＲの
リガンド、すなわち生物学的機能を喪失し、ＨマルコＳ
Ｒに結合した時に、反応を引き出さないリガンドの断片
に正確に関連するタンパク質も含まれる。
【０１１８】アンチセンス技術を用いることにより調製
したアンチセンス構築物は、三重らせん形成またはアン
チセンスＤＮＡもしくはＲＮＡによる遺伝子発現の制御
に用いることができるが、これらの方法は共にＤＮＡま
たはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づくもので
ある。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド配列の５’コード部分は、約１０から
４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオ
チドを設計するために用いられる。ＤＮＡオリゴヌクレ
オチドは転写に関与する遺伝子の領域に相補的に設計し
（三重らせん−Leeら、Nucl.Acids Res.，6:3073（197
9）；Cooneyら、Science，241:456（1988）；およびDer
vanら、Science，251:1360（1991）参照）、これにより
ＨマルコＳＲの転写および産生を防御する。アンチセン
スＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハ
イブリダイズし、ｍＲＮＡ分子のＨマルコＳＲへの翻訳
を阻止する（アンチセンス−Okano,J.Neurochem.，56:5
60（1991）；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inh
ibitor of Gene Expression，ＣＲＣプレス、ボッカラ
ートン、フロリダ州（1988））。上述のオリゴヌクレオ
チドはまた細胞に運搬でき、アンチセンスＲＮＡまたは
ＤＮＡがインビボでＨマルコＳＲの産生を阻害するよう
に発現できる。
【０１１９】ＨアｍルコＤＲに結合し、リガンドへの到
達をはばむ小さな分子、例えば小さなペプチドまたはペ
プチド様分子は正常の生物学的活性を防御するので、本
発明の受容体ポリペプチドの活性化阻害に用いることが
できる。ＨマルコＳＲの可溶形態、例えば受容体の断片
は、本発明のポリペプチドのリガンドに結合し、リガン
ドが膜結合ＨマルコＳＲと相互作用するのを防ぐことに
より、受容体の活性化を阻害するために用いることがで
きる。本発明はさらに、ＨマルコＳＲに対するリガンド
の結合を阻止し、または2次信号を阻害することにより
活性化を阻害し、それより異常な状態を軽減するするの
に有効な量を、上述の化合物を医薬的に許容できる担体
と共に対象に投与することを含む、過剰なＨマルコＳＲ
活性に関連する異常な状態を処置する方法をも提供す
る。
【０１２０】本発明はまた、異常な状態を軽減するため
に、上述の本発明の受容体ポリペプチドを活性化する化
合物の治療的有効量を、医薬的に許容できる担体と組み
合わせて対象に投与することを含む、ＨマルコＳＲ活性
の過少発現に関連する異常な状態を処置する方法をも提
供する。ＨマルコＳＲの可溶形態、およびこのような受
容体を活性化または阻害する化合物は、適当な医薬的担
体と組み合わせて用いることができる。このような組成
物はポリペプチドまたは化合物を治療的有効量、および
医薬的に許容できる担体または賦形剤を含む。このよう
な担体には、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキスト
ロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれら
を組み合わせたもの等があるが、これらに限定するもの
ではない。製剤は投与方法に適したものであるべきであ
る。
【０１２１】アゴニストおよびアンタゴニスト−検定お
よび分子 本発明はまた、細胞上のＨマルコＳＲの作用、例えば受
容体等のＨマルコＳＲ結合分子とＨマルコＳＲとの相互
作用を増強または阻止する化合物を同定するための、化
合物のスクリーニング方法をも提供する。アゴニストは
ＨマルコＳＲの天然の生物学的機能、またはＨマルコＳ
Ｒに類似した機能を増強する化合物であり、一方アンタ
ゴニストはこのような機能を低下または排除する化合物
である。例えば、細胞の区画例えば膜またはそれらの調
製物例えば膜調製物は、ＨマルコＳＲに結合する分子、
例えばＨマルコＳＲにより調節される信号化または制御
経路の分子を発現する細胞から調製できる。その調製物
を、ＨマルコＳＲアゴニストまたはアンタゴニストに成
り得る候補分子の存在下または不在下で、標識化Ｈマル
コＳＲと共にインキュベートする。候補分子が結合分子
に結合する能力は、標識化リガンドの結合の低下の影響
を受ける。結合して影響を及ぼさない分子、すなわちＨ
マルコＳＲ結合分子の結合にＨマルコＳＲの影響を誘起
しない分子は、最も良好なアンタゴニストに成るであろ
う。結合性が良好で、ＨマルコＳＲと同一のまたは非常
に関連した効果を引き出す分子は、アゴニストである。
【０１２２】強力なアゴニストおよびアンタゴニストの
ＨマルコＳＲ様効果は、例えば候補分子と細胞または適
当な細胞調製物との相互作用に続く２次メッセンジャー
システムの活性を決定し、効果をＨマルコＳＲの効果ま
たはＨマルコＳＲと同一の効果を引き出す分子の効果と
比較することにより測定できる。この点に関して有用に
成り得る２次メッセンジャーシステムには、ＡＭＰグア
ニレートサイクラーゼ、イオンチャネル、またはホスホ
イノシタイド加水分解２次メッセンジャーシステム、等
が有用であるが、これらに限定するものではない。Ｈマ
ルコＳＲアンタゴニストの検定の他の例は競合検定であ
り、競合阻害検定に適当な条件下で、ＨマルコＳＲおよ
び強力なアンタゴニストを、膜結合ＨマルコＳＲ受容体
分子または組換えＨマルコＳＲ受容体分子を組み合わせ
る。ＨマルコＳＲを例えば放射活性により標識化し、受
容体分子に結合するＨマルコＳＲ分子の数を正確に決定
して強力なアンタゴニストの効果を評価できる。
【０１２３】強力なアンタゴニストには、本発明のポリ
ペプチドに結合し、それによりその活性を阻害または消
失させる小さい有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよ
び抗体等がある。強力なアンタゴニストにはまた、結合
分子例えば受容体分子の同一の部位で結合する、Ｈマル
コＳＲ誘起活性を誘起せず、それによりＨマルコＳＲを
結合から排除することによりＨマルコＳＲの作用を防御
する小さい有機分子、ペプチド、ポリペプチド、例えば
非常に相関したタンパク質または抗体等がある。強力な
アンタゴニストには、ポリペプチドの結合部位に結合
し、結合部位を占領し、それにより細胞結合分子例えば
受容体分子への結合を防御し、正常の生物学的活性を防
御する、小さい分子等がある。小さい分子の例として
は、小さい有機分子、ペプチドまたはペプチド様分子な
どがあるが、これらに限定するものではない。
【０１２４】その他の強力なアンタゴニストにはアンチ
センス分子等がある。アンチセンス技術はアンチセンス
ＤＮＡまたはＲＮＡをによる、または三重らせん形成に
よる制御遺伝子発現に用いることができる。アンチセン
ス技術については、例えばOkano,J.，Neurochem.56:560
（1991）；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhib
itors of Gene Expression，ＣＲＣプレス、ボッカラー
トン、フロリダ州（1988）に記載されている。三重らせ
ん形成については例えばLeeら、Nucleic AcidsResearch
6:3073（1979）；Cooneyら、Science241:456（1988）；
およびDervanら、Science251:1360（1991）に記載され
ている。この方法は、ポリヌクレオチドの相補的ＤＮＡ
またはＲＮＡへの結合に基づいている。例えば本発明の
成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’
コード部分は、約１０から４０塩基対の長さのアンチセ
ンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するのに用いるこ
とができる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ＨマルコＳ
Ｒの転写および産生を防御する転写に係わる遺伝子領域
に相補的になるように設計される。アンチセンスＲＮＡ
オリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリダ
イズし、ｍＲＮＡ分子のＨマルコＳＲポリペプチドへの
翻訳を阻止する。上述のオリゴヌクレオチドはまた、ア
ンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがインビボで発現し、Ｈ
マルコＳＲの産生を阻害するように細胞に運ぶこともで
きる。
【０１２５】このアゴニストまたはアンタゴニストは、
例えば本明細書の以下に記載するような、医薬的に許容
できる担体と共に組成物として用いることができる。こ
のアンタゴニストまたはアゴニストは、例えばアテロー
ム性動脈硬化症、高血圧、心筋および脳の梗塞、アンギ
ナ、器官不全、発作、および四肢の壊疽、機能喪失等の
種々心臓血管系疾患並びにマクロファージ関与の宿主防
御障害の阻止のために用いることができる。その他の阻
止できる疾患には、敗血症発作、膵炎、複数の器官不
全、グラム陰性および陽性細菌による内毒素血症および
感染等がある。
【０１２６】組成物 本発明はまた上述のポリヌクレオチドもしくはポリペプ
チド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを含む
組成物にも関する。従って、本発明のポリペプチドは非
無菌もしくは無菌担体と、または細胞、組織もしくは生
物に用いられる担体、例えば対象への投与に適した医薬
的担体と組み合わせて用いることができる。このような
組成物には例えば溶媒添加物または本発明のポリペプチ
ドの治療的有効量、および医薬的に許容できる担体また
は賦形剤を含む。このような担体には生理食塩水、デキ
ストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれ
らの組み合わせ等でよいが、これらに限定するものでは
ない。製剤は投与法に適した物にすべきである。
【０１２７】キット 本発明はさらに、本発明の前述の組成物成分を1または
それ以上を充填した１またはそれ以上の容器を含む医薬
的パックおよびキットにも関する。このような（複数
の）容器に関連して、医薬または生物学的産物の製造、
使用または販売を統制する政府機関の命令形態の、ヒト
への投与用の産物の製造、使用または販売に関する該政
府機関の承認を示す注意書きが添付されることがある。
【０１２８】投与 本発明のポリペプチドおよびその他の化合物は、単独で
または治療用化合物等のその他の化合物と組み合わせて
用いることができる。医薬組成物は任意の有効な、利便
的な方法例えば、とりわけ局所、経口、経膣、静脈内、
腹膜腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、関節内または皮膚内
の経路で投与できる。医薬組成物は、通常具体的な適応
症または複数の適応症の処置または予防に有効量投与す
る。一般に、この組成物は少なくとも約１０μｇ／ｋｇ
体重の量で投与する。たいての場合、1日あたり約８ｍ
ｇ／ｋｇ体重を越えない量で投与する。好ましくは、た
いての場合、投与量は1日あたり約１０μｇ／ｋｇから
約１ｍｇ／ｋｇ体重である。至適投与量は、適応、その
重篤度、投与経路、合併症の状態等を考慮に入れて、各
々の処置様式および適応のための標準法により決定され
ることは理解されよう。
【０１２９】遺伝子治療 ＨマルコＳＲポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリペ
プチドであるアゴニストおよびアンタゴニストは、本発
明に準じて、インビボでこのようなポリペプチドを発現
することにより、しばしば「遺伝子治療」と称せられる
治療様式に用いることができる。従って、例えば患者の
細胞をエクソビボでポリペプチドをコードするＤＮＡま
たはＲＮＡのようなポリヌクレオチドで操作でき、次い
で操作した細胞をポリペプチドで処置すべき患者に提供
できる。例えば、本発明のポリペプチドをコードするＲ
ＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクターを使
用することにより細胞をエクソビボで操作できる。この
ような方法は当業界で周知であり、本発明における使用
は、本明細書の教示より明白である。
【０１３０】同様に、細胞を当業界に周知の方法により
インビボで操作し、インビボでポリペプチドを発現させ
ることができる。例えば本発明のポリヌクレオチドは上
述のように複製不能レトロウイルスベクター中に発現す
るように操作できる。レトロウイルス発現構築物を、次
いで単離し、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡ
を含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質導
入されたパッケージング細胞に導入し、パッケージング
細胞が目的遺伝子を含有する感染性のウイルス粒子を産
生するようにすることができる。これらの産生細胞は患
者に投与し、インビボで細胞操作し、インビボでポリペ
プチドを発現することができるためにできる。このよう
な方法で本発明のポリペプチドを患者に投与するための
これらのまたはその他の方法は、本明細書の教示から当
業者に明らかであるはずである。上述のレトロウイルス
プラスミドベクターの、モロニーネズミ白血病ウイル
ス、脾臓壊死ウイルス、レトロウイルス例えばラウス肉
腫ウイルス、ハーヴェイ肉腫ウイルス、鳥白血症ウイル
ス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイル
ス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルスおよび哺
乳動物腫瘍ウイルス等に由来するが、これらに限定する
ものではない。一つの態様では、レトロウイルスプラス
ミドベクターはモロニーネズミ白血病ウイルスに由来す
る。
【０１３１】このようなベクターは、ポリペプチド発現
のためのプロモーターを１またはそれ以上含む。用いる
ことができる適当なプロモーターには、レトロウイルス
ＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびヒトサイトメガ
ロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（Millerら、Biotec
hniques7:980-990（1989）に記載されている）、または
その他の任意のプロモーター（例えばヒストン、ＲＮＡ
ポリメラーゼＩＩＩおよびβ−アクチンプロモーター等
の真核細胞プロモーターのような細胞性プロモーターな
どがあるが、これらに限定するものではない）等がある
が、それらに限定するものではない。用いることができ
るその他のウイルス性プロモーターには、アデノウイル
スプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモータ
ー、およびＢ１９パルボウイルスプロモーター等がある
が、これらに限定するものではない。適当なプロモータ
ーの選別は、本明細書の教示より、当業者に明白であろ
う。本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は適当
なプロモーターの制御下に置かれる。用いることができ
る適当なプロモーターには、アデノウイルスプロモータ
ー、例えばアデノウイルス主要後期プロモーター；また
は異型性プロモーター例えばサイトメガロウイルス（Ｃ
ＭＶ）プロモーター；ＲＳウイルス（respiratory cyni
cytial virus：ＲＳＶ）プロモーター；誘導プロモータ
ー例えばＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモ
ーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモー
ター；アポＡＩプロモーター；ヒトグロブリンプロモー
ター；ウイルス性チミジンキナーゼプロモーター例えば
単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウ
イルスＬＴＲ（上述の改変レトロウイルスＬＴＲを含
む）；β−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホル
モンプロモーター等があるが、これらに限定するもので
はない。プロモーターはまたポリペプチドをコードする
遺伝子を制御する天然プロモーターでもよい。
【０１３２】レトロウイルスプラスミドベクターはパッ
ケージングセルラインに形質導入し、産生セルラインを
形成するのに用いることができる。トランスフェクトさ
れ得るパッケージング細胞の例としては、ＰＥ５０１、
ＰＡ３１７、Ｙ−２、Ｙ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１
４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＹＣＲＥ、ＹＣＲＩ
Ｐ、ＧＰ+Ｅ−８６、ＧＰ+ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ
セルライン（Miller,A.，Human Gene Therapy1:5-14（1
990）に記載されている）等があるが、これらに限定す
るものではない。ベクターは当業界で周知の任意の方法
により、パッケージング細胞に形質導入できる。このよ
うな方法には、電気泳動、リポソームの使用、およびＣ
ａＰＯ4沈殿などがあるが、これらに限定するものでは
ない。また別に、レトロウイルスプラスミドベクターは
リポソームでカプセル化するか、または脂質と結合さ
せ、次いで宿主に投与することができる。産生セルライ
ンは感染性レトロウイルスベクター粒子を生じ、これは
ポリペプチドをコードする（複数の）核酸配列を含む。
このようなレトロウイルスベクター粒子は次いでインビ
トロまたはインビボのどちらかで真核細胞に形質導入す
るのに用いることができる。形質導入した真核細胞は、
ポリペプチドをコードする（複数の）核酸配列を発現す
る。形質導入された真核細胞はには、胚幹細胞、胚癌細
胞およびヘモポイエチン幹細胞、肝細胞、繊維芽細胞、
筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞および気管支上皮
細胞等があるが、これらに限定するものではない。
【０１３３】
【実施例】本発明は以下の実施例によりさらに記載す
る。この実施例は単に本発明を説明のために具体的な態
様の参考に提供するものである。これらの例示は本発明
の特定の具体的な態様を説明するものであるが、開示す
る発明の範囲の限定または制限を表すものではない。本
明細書で用いる特定の用語は、前述の用語集で説明す
る。全ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、
標準的な技術を用いて実施でき、これは当業者に周知で
通常的である。以下の実施例の通常的な分子生物学的技
術は、標準的な実験マニュアル、例えば本明細書で「Sa
mbrook」と称する、Sambrookら、Molecular Cloning：A
Laboratory Manual、第2編；コールドスプリングハー
バーラボラトリープレス、コールドスプリングハーバ
ー、ニューヨーク州（1989）に記載されるように実施で
きる。以下の実施例で示す全ての部分または量は、他に
規定しない場合、重量で表す。
【０１３４】以下の実施例における断片のサイズ分離に
ついて、Sambrookおよび多くのその他の参考文献例えば
Goeddelら、Nucleic Acids Res.8:4057（1980）に記載
される、寒天およびポリアクリルアミドゲル電気泳動
（「ＰＡＧＥ」）の標準技法を用いて実施する。他に記
載しない場合、ライゲーションは標準的な緩衝液、イン
キュベーション温度および時間、ライゲートすべきＤＮ
Ａ断片の約等モル濃度の量で、ＤＮＡ0.５μｇあたり約
10単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）を用いて
行う。
【０１３５】実施例１ 細菌を用いた配列番号：１のＨマルコＳＲの発現および
精製 寄託ポリペプチドのＨマルコＳＲをコードするＤＮＡ配
列は、ＨマルコＳＲのアミノ酸カルボキシル末端配列、
および遺伝子のベクター３’配列に特異的なＰＣＲオリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。さらに、
クローニングを容易にする制限部位を含有するヌクレオ
チドを５’および３’配列の各々に加える。５’オリゴ
ヌクレオチドプライマーは、ＥｃｏＲＩ制限部位（下線
部）を含む配列５’ＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣＧＧＣＡ
ＣＧＡＧＣＴＣＴＴＧＡＧＴ３’（配列番号：３）を有
し、配列番号：１に示すＨマルコＳＲ５’コード配列の
１７ヌクレオチドがこれに続く。３’プライマーは、配
列番号：１に示すＨマルコＳＲの３’非コード領域の核
酸配列に相補的な２８ヌクレオチド内に埋め込まれた、
遺伝子操作したＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（下線部）を含
む配列、５’ＣＣＴＣＧＧＧＡＧＣＡＧＡＧＡＡＧＴＧ
ＡＡＡＡＧＣＴＴＴＣＣ３’（配列番号：４）を有する
が、停止コドンは含まない。
【０１３６】制限部位は、これらの実施例の細菌発現に
用いられる細菌発現ベクターｐＱＥ−９の制限酵素部位
に都合がよい。（キアゲンインコーポレーティッド、チ
ャッツウォース、カリフォルニア州）ｐＱＥ−９はアン
ピシリン抗生物質抵抗性（「Ａｍｐｒ」）をコードし、
細菌の複製起源（「ｏｒｉ」）、ＩＰＴＧ誘起プロモー
ター、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、６−Ｈｉｓ
タグおよび制限酵素部位を含む。増幅したＨマルコＳＲ
ＤＮＡおよびベクターｐＱＥ−９は共にＥｃｏＲＩお
よびＨｉｎｄＩＩＩに消化され、消化されたＤＮＡは次
いで一緒にライゲートされる。ベクターのＩＰＴＧ−誘
導プロモーターおよびＨマルコＳＲの翻訳に適した位置
にある開始ＡＵＧのインフレームの下方の、およびこれ
に機能的に連結したＨマルコＳＲコード領域にＨマルコ
ＳＲ ＤＮＡの制限ベクターを挿入する。
【０１３７】ライゲーション混合物は標準法を用いて大
腸菌の能力細胞へ形質転換する。このような方法はSamb
rookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第
2編；コールドスプリングハーバーラボラトリープレ
ス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（198
9）に記載されている。大腸菌Ｍ１５／ｒｅｐ４株はｌ
ａｃレプレッサーを発現し、カナマイシン抵抗性（「Ｋ
ａｎr「）を賦与するプラスミドｐＲＥＰ４の多重コピ
ーを含有し、本明細書に説明として記載する実施例を実
行するために用いる。この株はＨマルコＳＲを発現する
のに適した多くの株のなか唯一つの株であり、キアゲン
より市販されている。形質転換物は、アンピシリンの存
在下のＬＢプレート上での成長能力により同定する。プ
ラスミドＤＮＡは抵抗性クローンより単離され、クロー
ン化したＤＮＡの同一性は制限分析により確認する。望
ましい構築物を含有するクローンは、アンピシリン（１
００μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（２５μｇ／ｍ
ｌ）の両方を補充したＬＢ培地で一晩（「Ｏ／Ｎ」）液
体培養して成長させる。
【０１３８】Ｏ／Ｎ培養物は、約１：１００から１：２
５０に希釈して大きな培養物に接種するために用いる。
細胞を６００ｎｍでの光学密度（「ＯＤ600」）が０.４
および０.６の間になるように成長させる。次にイソプ
ロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴ
Ｇ」）を最終濃度１ｍＭになるように加え、ｌａｃＩレ
プレッサーを不活化することによりｌａｃレプレッサー
感受性プロモーターからの転写を誘起する。細胞を引き
続いてさらに３から４時間インキュベートする。次いで
標準法により、細胞を遠心により収穫し、分解する。細
胞封入体を通常の回収法を用いて、分解した細胞から精
製し、タンパク質を細胞封入体から８Ｍ尿素に可溶化す
る。可溶化タンパク質を含有する８Ｍ尿素溶液を、２Ｘ
リン酸塩緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）中ＰＤ−１０カ
ラムに通し、これにより尿素を除去し、緩衝液を交換
し、タンパク質を再折り畳みする。タンパク質をクロマ
トグラフィーのさらなる段階で精製し、内毒素を除去す
る。次いで無菌的にろ過する。無菌的にろ過したタンパ
ク質調製物は９５μｇ／ｍｌの濃度で２Ｘ ＰＢＳ中に
保存する。ポリアクリルアミドゲル電気泳動の標準法に
より調製物を分析し、ＨマルコＳＲが約５９．３ｋＤａ
の予測分子量を有することが示される。
【０１３９】実施例２ バキュロウイルス発現における配列番号：１のＨマルコ
ＳＲのクローニングおよ び発現 系 寄託クローンのＨマルコＳＲタンパク質の全長をコード
するｃＤＮＡ配列は、遺伝子の５’および３’配列に対
応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増
幅する：５’プライマーは、ＥｃｏＲＩ制限酵素部位
（下線部）を含む５’ＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣＧＧＣ
ＡＣＧＡＧＣＴＣＴＴＧＡＧＴ３’（配列番号：３）の
配列を有し、配列番号：１のＨマルコＳＲの配列の１７
塩基がこれに続く。以下に記載するように、発現ベクタ
ーに挿入されると、ＨマルコＳＲをコードする増幅断片
の５’末端が有効な信号ペプチドを提供する。真核細胞
における翻訳開始に有効な信号は、Kozak,M.,J.Mol.Bio
l.,196:947-950（1987）に記載するように、構築物のベ
クター部分に適切に位置する。
【０１４０】３’プライマーは、配列番号：１に示すＨ
マルコＳＲの３’非コード領域の核酸配列に相補的な２
８ヌクレオチド内に埋め込まれたＨｉｎｄＩＩＩ制限部
位（下線部）を含む配列、５’ＣＣＴＣＧＧＧＡＧＣＡ
ＧＡＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＧＣＴＴＴＣＣ３’（配列番
号：４）を有するが、停止コドンは含まない。市販のキ
ット（「ゲネクリーン」ＢＩＯ １０１インコーポレー
ティッド、ラジョーラ、カリフォルニア州）を用いて、
増幅した断片を１％寒天ゲルから単離する。次いで断片
をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、再び１％
寒天ゲル上で精製する。この断片を本明細書ではＦ２と
称する。
【０１４１】標準法、例えばSummersら、A Manual of M
ethods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Cul
ture Procedures，テキサス・アグリカルチュラル・エ
クスペリメンタル・ステーション・ブレチン1555号（19
87）に記載される方法で、ベクターｐＲＧ１を用いてバ
キュロウイルス発現系でＨマルコＳＲタンパク質を発現
する。この発現ベクターにはAutographa californica核
ポリヘドローシスウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポ
リヘドリンプロモーター、続いて利用できる制限部位を
含有する。Ｎ−末端メチオニンを含むＡｃＭＮＰＶｇｐ
６７の信号ペプチドは、ＢａｍＨ１部位のちょうど上方
に位置する。シミアンウイルス４０（「ＳＶ４０」）の
ポリアデニル化部位は、効果的なポリアデニル化に用い
られる。組換えウイルスの選別を容易にするため、大腸
菌からのベーターガラクトシダーゼ遺伝子を、ポリヘド
リンプロモーターと同じ配向で挿入し、ポリヘドリン遺
伝子のポリアデニル化信号がそれに続く。ポリヘドリン
配列は、野生型ウイルスＤＮＡでの細胞媒介の相同的な
組換えのためのウイルス配列により、両側でフランキン
グし、クローン化したポリヌクレオチドを発現する生存
ウイルスを生じる。
【０１４２】多くのその他のバキュロウイルスは、ｐＲ
Ｇ１、例えばｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１およびｐＡｃ
ＩＭ１の代わりに用いることができ、当業者に明らかな
ように、構築物は適切に位置した転写、翻訳、トラフィ
ッキング等の信号、例えばインフレームＡＵＧおよび信
号ペプチドを必要な場合に提供する。このようなベクタ
ーはとりわけ、Luckowら、Virology，170:31-39に記載
されている。プラスミドは制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨ
ｉｎｄＩＩＩで消化し、次に当業界に周知の通常的な方
法を用いて、仔ウシ腸管ホスファターゼを用いて脱ホス
ホリル化する。次にＤＮＡを市販のキット（「ゲネクリ
ーン」ＢＩＯ １０１インコーポレーティッド、ラジョ
ーラ、カリフォルニア州）を用いて１％寒天ゲルから単
離する。このベクターＤＮＡを、本明細書では「Ｖ２」
と称する。断片Ｆ２および脱ホスホリル化プラスミドＶ
２をＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲートする。大腸菌ＨＢ
１０１細胞をライゲーション混合物で形質転換し、培
養プレート上に広げる。ＨマルコＳＲ遺伝子を有するプ
ラスミドを含有する細菌を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ
ＩＩＩを用いた各コロニーからのＤＮＡの消化、および
ゲル電気泳動による消化産生物の分析により同定する。
クローン化した断片の配列は、ＤＮＡシークエンシング
により確認する。このプラスミドは本明細書ではｐＢａ
ｃＨマルコＳＲと称する。
【０１４３】プラスミドｐＢａｃＨマルコＳＲ５μｇを
市販の直線バキュロウイルスＤＮＡ（「バキュロゴール
ドＯバキュロウイルスＤＮＡ」、ファルミンゲン、サン
ディエゴ、カリフォルニア州）１．０μｇで、Felgner
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:7413-7417（1987）に記
載されるリポフェクチン法を用いて同時トランスフェク
トする。１μｇのバキュロゴールドＯウイルスＤＮＡお
よび５μｇのプラスミドｐＢａｃＨマルコＳＲを５０μ
ｌの血清不含グレース培地（ライフテクノロジーズイン
コーポレーティッド、ガイザースバーグ、メリーランド
州）を含有するマイクロタイタープレートの無菌ウェル
中混合する。その後９０μｌグレース培地を加えた１０
μｌリポフェクチンを加え、混合し、室温で15分間イン
キュベートする。次にトランスフェクション混合物をＳ
ｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）に滴加し、
１ｍｌの血清不含グレース培地の入った３５ｍｍ組織培
養プレートに接種する。プレートを前後に揺らし、新し
く加えた溶液を混合させる。このプレートを次いで２７
℃で5時間インキュベートする。5時間後にトランスフェ
クト溶液をプレートから除去し、１０％ウシ胎仔血清を
補充したグレース昆虫培地１ｍｌを加える。プレートを
インキュベーターに戻し、２７℃で4日間培養を続け
る。
【０１４４】４日後、上澄を回収し、上記に引用したSu
mmersおよびSmithに記載するように、プラーク検定を実
施する。「ブルーガル」（ライフテクノロジーズインコ
ーポレーティッド、ガイザースバーグ）を含む寒天ゲル
を用いると、青色に染色されたプラークを産生するガル
発現クローンを容易に同定および単離できる。（この型
の「プラーク検定」の詳細は、ライフテクノロジーズイ
ンコーポレーティッド、ガイザースバーグにより配布さ
れた昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学のユーザー
ズガイド、９−１０頁にも見出すことができる。） 連続希釈の4日後、ウイルスを細胞に加える。適当なイ
ンキュベーションの後、青色に染色されたプラークをエ
ッペンドルフピペットのチップで採る。組換えウイルス
を含有する寒天を次いで２００μｌのグレース培地を入
れたエッペンドルフチューブに再懸濁する。短時間の遠
心により寒天を除去し、組換えバキュロウイルスを含有
する上澄を用いて、３５ｍｍの皿に接種したＳｆ９細胞
を感染させる。4日後、これらの培養皿の上澄を収穫
し、次いで４℃で貯蔵する。適当に挿入したＨマルコＳ
Ｒを含有するクローンを、制限マッピングおよびシーク
エンシング等のＤＮＡ分析により同定する。これは本明
細書ではＶ−ＨマルコＳＲと称する。
【０１４５】Ｓｆ９細胞を１０％熱不活化ＦＢＳを補充
したグレース培地中成長させる。組換えバキュロウイル
スＶ−ＨマルコＳＲで、細胞を約2回の（約１回から約
３回）多数回感染（「ＭＯＩ」）させる。6時間後、培
地を除去し、メチオニンおよびシステインを除いたＳＦ
９００ＩＩ培地（ライフテクノロジーズインコーポレー
ティッド、ガイザースバーグより入手可能）と取り替え
る。４２時間後、５μＣｉの３５Ｓメチオニンおよび５
μＣｉの３５Ｓシステイン（アメルシャムより入手可
能）を加える。細胞をさらに16時間インキュベートし、
次に遠心により収穫し、溶解し、標識化タンパク質をＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより可
視化する。
【０１４６】実施例３ ＣＯＳ細胞における配列番号：１のＨマルコＳＲの発現 ＨマルコＳＲをコードするｃＤＮＡを発現ベクターｐｃ
ＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトローゲン・インコーポレー
ティッドより入手可能）中にクローニングすることによ
り、発現プラスミド、ＨマルコＳＲ ＨＡを作る。発現
ベクターｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐは（１）大腸菌およびそ
の他の原核細胞中の伸長に有効な大腸菌の複製起源；
（２）プラスミド含有原核細胞の選別のためのアンピシ
リン抵抗遺伝子；（３）原核細胞中の伸長のためのＳＶ
４０複製起源；（４）ＣＭＶプロモーター、ポリリンカ
ー、ＳＶ４０イントロンおよびｃＤＮＡがＣＭＶプロモ
ーターの発現制御下に都合よく置かれ、ポリリンカー中
の制限部位によりＳＶ４０イントロンおよびポリアデニ
ル化信号に機能的に連結するように調整したポリアデニ
ル化信号を含む。ＨマルコＳＲ前駆体全てコードするＤ
ＮＡ断片および３’末端にインフレーム融合したＨＡタ
グを、組換えタンパク質発現がＣＭＶプロモーターによ
り指示されるように、ベクターのポリリンカー領域にク
ローン化する。Wilsonら、Cell，37:767（1984）に記載
するように、ＨＡタグはインフルエンザヘマググルチニ
ンタンパク質に由来するエピトープに対応する。ＨＡタ
グの標的タンパク質への融合により、組換えタンパク質
をＨＡエピトープを認識する抗体と共に検出するのが容
易になる。
【０１４７】プラスミドの構築計画は以下のとおりであ
る。寄託クローンのＨマルコＳＲ ｃＤＮＡは、都合よ
い制限部位を含有するプライマーを用いて増幅し、大腸
菌およびS.fugiperdaにおけるＨマルコＳＲの発現ベク
ターの構築に関しては上記に詳細に記載している。発現
ＨマルコＳＲの検出、精製および特性化を容易にするた
めに、プライマーの一つは上述のヘマググルチニンタグ
（「ＨＡタグ」）を含有する。適切なプライマーには以
下の物があり、この実施例で用いる。ＥｃｏＲＩ５’部
位コドン（下線部）を含有する５’プライマー配列は、
５’ＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣＧＧＣＡＣＧＡＧＣＴＣ
ＴＴＧＡＧＴ３’（配列番号：３）である。ＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位（下線部）および２８塩基対の３’非コード配
列を含有する３’プライマーは、５’ＣＣＴＣＧＧＧＡ
ＧＣＡＧＡＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＧＣＴＴＴＣＣ３’
（配列番号：４）である。
【０１４８】ＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片およびベクター
ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐは、消化し、次いでライゲートす
る。ライゲーション混合物は大腸菌ＳＵＲＥ株（ストラ
ッタジーンクローニングシステムズ、１１０９９ノース
トーレイパインズロード、ラジョーラ、カリフォルニア
州９２０３７より入手可能）に形質転換し、形質転換し
た培養物をアンピシリン培地プレートに載せ、次いでこ
れをインキュベートしてアンピシリン抵抗性コロニーを
成長させる。プラスミドＤＮＡを抵抗性コロニーから単
離し、制限分析およびゲルサイジングにより、Ｈマルコ
ＳＲコード断片の存在を試験する。組換えＨマルコＳＲ
を発現するために、例えばSambrookら、Molecular Clon
ing：A Laboratory Manual，コールドスプリングハーバ
ーラボラトリープレス、コールドスプリングハーバー、
ニューヨーク（1989）に記載するように、ＤＥＡＥ−デ
キストランを用いてＣＯＳ細胞を発現ベクターでトラン
スフェクトする。
【０１４９】ベクターによるＨマルコＳＲの発現条件下
で、細胞をインキュベートする。ＨマルコＳＲ ＨＡ融
合タンパク質の発現は、例えばHarlowら、Antibodies:A
Laboratory Manual，第2編；コールドスプリングハーバ
ーラボラトリープレス、コールドスプリングハーバー、
ニューヨーク（1989）に記載する方法を用いて、放射性
標識化および免疫沈殿により検出する。この目標のため
に、トランスフェクションの2日後、35Ｓ−システイン
を含有する培地中8時間インキュベートすることによ
り、細胞を標識化する。細胞および培地を回収し、細胞
を洗浄し、上記に引用するWilsonらに記載されるよう
に、デタージェント含有ＲＩＰＡ緩衝液：１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、０．１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４０、０．５
％ ＤＯＣ、５０ｍＭ ＴＲＩＳ、ｐＨ７．５で溶解す
る。ＨＡ特異性モノクローナル抗体を用いて、タンパク
質を細胞ライゼートおよび培養培地から沈殿させる。沈
殿したタンパク質を次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよび
オートラジオグラフィーにより分析する。予期した大き
さの発現産物が細胞ライゼートに見出され、陰性対照に
は見出されない。同様に、以下のプライマーのセットを
用いて、ＣＯＳ細胞中に配列番号：５のＨマルコＳＲの
発現させることができる： ５’ＣＴＡＴＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＡＡＴＧＡＧＡＡＡ
ＴＡＡＧＡＡＡＡＴＴＣ３’ 配列番号：８ ５’ＣＣＴＣＧＧＧＡＧＣＡＧＡＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡ
ＧＣＴＴＴＣＣ３’ 配列番号：９
【０１５０】実施例４ ＨマルコＳＲの遺伝子治療的な発現 皮膚生検により対象から繊維芽細胞を得た。得られた組
織を組織培養培地に載せ、小片に分割する。組織の小さ
い固まりを組織培養フラスコの湿った表面上に載せ、約
１０片を各フラスコに載せる。フラスコを上下逆に置
き、きっちり締めて一晩室温で放置する。室温で２４時
間後、組織の固まりはフラスコの底に付着して残るよう
にしてフラスコを逆さにし、新鮮な培地を加える（例え
ば１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシン
を加えたＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地）。組織を次いで３７
℃で約1週間インキュベートする。この時、新鮮培地を
加え、続いて数日毎に変える。更なる2週間の培養の
後、繊維芽細胞の単層が生じる。その単層をトリプシン
処理し、大きなフラスコに剥ぎおとす。遺伝子治療のた
めのベクターは、発現させる断片をクローニングするた
めに制限酵素で消化した。消化したベクターを仔ウシ腸
管ホスファターゼで処理し、自身のライゲーションを防
御する。脱リン酸化した直線ベクターは寒天ゲル上で分
画化し、精製する。
【０１５１】活性ＨマルコＳＲを発現する能力のあるＨ
マルコＳＲ ｃＤＮＡを単離する。断片の末端は、必要
な場合、ベクターにクローニングするために改変する。
例えば、５’張り出しはＤＮＡポリメラーゼで処理して
平板な末端にできる。３’張り出しはＳ１ヌクレアーゼ
を用いて除去できる。リンカーはＴ４ＤＮＡリガーゼで
平板末端にライゲートできる。モロニーネズミ白血病ウ
イルスの直線的な骨格およびＨマルコＳＲ断片の等容量
を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合した。ライ
ゲーション混合物は、大腸菌を形質転換するために用
い、細菌を次いでカナマイシン含有寒天上に載せる。カ
ナマイシン表現型および制限分析でベクターが遺伝子を
適切に挿入したことを確認する。１０％仔ウシ血清（Ｃ
Ｓ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン含有デュル
ベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、全面成長する
までパッケージング細胞を組織培養で成長させる。Ｈマ
ルコＳＲ遺伝子を含有するベクターを標準法によりパッ
ケージング細胞に導入する。ＨマルコＳＲ遺伝子を含有
する感染性ウイルス粒子をパッケージング細胞から回収
し、これを産生細胞と称する。
【０１５２】新鮮な培地を産生細胞に加え、適当なイン
キュベーション時間の後、全面成長した産生細胞のプレ
ートから培地を収穫する。感染ウイルス粒子を含有する
培地をミリポアーフィルターを通して濾過し、剥がれた
産生細胞を除去する。濾過した培地を次に繊維芽細胞に
感染させるために使用する。培地を繊維芽細胞のサブ全
面成長プレート（sub-confluent plate）から除去し、
すぐにろ過した培地と入れ替える。ポリブレーン（アル
ドリッヒ）は培地中に含まれ、形質導入を促進できる。
適当なインキュベーションの後、培地を除去し、新鮮な
培地と入れ替える。ウイルスの力価が高い場合、実質的
に全ての繊維芽細胞が感染し、選別の必要はない。力価
が低い場合、ネオまたはヒズのような選別マーカーを有
するレトロウイルスベクターを用いる必要があり、発展
させるための形質導入した細胞を選別する次いで操作し
た繊維芽細胞を、単独でまたはマイクロキャリヤービー
ズ例えばサイトデックス３ビーズに全面成長させた後、
ラットに注入できる。注入した繊維芽細胞はＨマルコＳ
Ｒ産生物を産生し、タンパク質の生物学的作用を宿主に
伝達する。本発明は前述の説明および実施例に特に記載
した以外も、実行できることは明らかである。
【０１５３】実施例５ ＨマルコＳＲ配列番号：２の結合研究 蛍光標識化リポ多糖類（ＦＩＴＣ−ＬＰＳ、大腸菌セロ
タイプＯ２６：Ｂ６、Ｆ７０３７）をシグマケミカルコ
ーポレーション、セントルイス、モンタナ州より入手し
た。ＤｉＩ標識化アセチル化低密度リポタンパク質（Ｄ
ｉＩ−ＡｃＬＤＬ）を、バイオメディカルテクノロジー
ズインコーポレーティッド、ストウトン、マサチューセ
ッツ州より入手した。２４ウェルクローニングプラステ
ィック組織培養プレートのウェルから内容物を取り除
き、２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ加ＥＭＥＭ２５０μｌで置き
換えた。ＤｉＩ−ＡｃＬＤＬおよびＦＩＴＣ−ＬＰＳを
各々容量の５％まで、および１０％まで濃度を挙げて加
えた。プレートを５％ＣＯ2のインキュベーター中３７
℃で4時間インキュベートし、ウェルの内容物をアスピ
レートし、５００μｌのロック溶液で洗浄し、２５０μ
ｌのロック溶液とインキュベートし蛍光を定量した。蛍
光定量は、サイトフルオロ２３５０装置（パーセプティ
ブバイオシステムズ、フラミングハム、マサチュウセッ
ツ州）をＤｉＩ−ＡｃＬＤＬには「Ｂ」フィルターの付
いた、ＦＩＴＣ−ＬＰＳには「Ｃ」フィルターの付いた
２４ウェルエリアマップにセットしたもので実施した。
各エリアマップの結果の平均化および複製ウェルの結果
の平均化により、データを数量化した。各皿の非標識ウ
ェルの細胞ブランクは、蛍光測定値から減じた。
【０１５４】結果 ＦＩＴＣ−ＬＰＳの投与量反応曲線は３つの異なる組み
合わせ投与量反応曲線によく適合した２次のオーダーの
多項式関数である。図２に見られるように、マルコトラ
ンスフェクトＣＯＳ細胞は、非トランスフェクトＣＯＳ
細胞よりも３から４培多くＦＩＴＣ−ＬＰＳに結合し、
たいていの投与量範ｚ囲を超えている。ＤｉＩ−ＡｃＬ
ＤＬの結果は、単一の投与量反応から上述のように算出
した。図３に見られるように、ＣＯＳ細胞結合ＤｉＩ−
ＡｃＬＤＬはＨマルコＳＲでのトランスフェクトとは独
立している。これらの結果は、ＬＰＳ、ＨマルコＳＲリ
ガンドへの結合能力が示すように、ＨマルコＳＲがＣＯ
Ｓ細胞に発現されたことができるを示している。さら
に、ＤｉＩ−ＡｃＬＤＬはトランスフェクト細胞と同様
に同程度に非トランスフェクト細胞にも結合したので、
改変リポタンパク質は、ＨマルコＳＲのリガンドとなら
ないようだ。上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変
および変形が可能であり、従ってそれらも添付の請求の
範囲の範疇である。
【０１５５】実施例６ 配列番号：６のマクロスカベンジャー受容体の全長のク
ローニング ヒューマンゲノムサイエンシズデーターベースの無作為
調査により最初に同定した部分的クローン（ＨＡＰＣＣ
４６）を、ＨＧＳデーターベースのスクリーニングに使
用した。この研究の結果、ヒトマルコスカベンジャー受
容体（ＨＧＳ1471177、ＨＭＳＪＡ８０）のクローンの
全長を同定した。クローンは完全に上述の記載通り配列
決定した。配列分析により、ｃＤＮＡクローンは１７９
４ヌクレオチドの長さであることが示された。ｃＤＮＡ
クローンのコード領域は、ＡＴＧ（ヌクレオチド＃９
５）で始まり、停止コドンＴＧＡ（ヌクレオチド１６５
５）で終わる。コード領域は５２０アミノ酸の長さを含
有する。ＨマルコＳＲをコードするＤＮＡ配列は、Ｈマ
ルコＳＲタンパク質のアミノ酸カルボキシル末端配列、
および遺伝子のベクター３’配列に特異的なＰＣＲオリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。さらに制
限部位を含有するヌクレオチドを、各々の５’および
３’配列に加え、クローニングを容易にする。５’オリ
ゴヌクレオチドプライマーはＥｃｏＲＩ制限部位（下線
部）を含有する配列：５’ＣＴＡＴＡＡＧＡＡＴＴＣＧ
ＣＡＡＴＧＡＧＡＡＡＴＡＡＧＡＡＡＡＴＴＣ配列番
号：８を有し、ＨマルコＳＲ５’コード配列の２２ヌク
レオチドがそれに続く。３’プライマーは、ＨマルコＳ
Ｒ配列の３’非コード領域のヌクレオチド配列に相補的
な２１ヌクレオチド内に埋め込んだ、操作したＨｉｎｄ
ＩＩＩ制限部位（下線部）を含有する配列：５’ＣＣＴ
ＣＧＧＧＡＧＣＡＧＡＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＧＣＴＴＴ
ＣＣ３’ 配列番号：９を有する。
【０１５６】増幅したＨマルコＳＲ ＤＮＡを哺乳動物
発現ベクターｐＣＤＮベクターに、ＥｃｏＲＩおよびＨ
ｉｎｄＩＩＩ部位でサブクローン化し、次いで一緒にラ
イゲートした。ライゲーション混合物を大腸菌能力細胞
に標準法を用いて形質転換する。このような方法は上述
のSambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manu
al，第2編；コールドスプリングハーバーラボラトリー
プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク
（1989）に記載されている。形質転換体はアンピシリン
存在下のＬＢプレート上での成長能力により同定する。
プラスミドＤＮＡは抵抗性コロニーから単離し、クロー
ン化ＤＮＡの同定を、制限分析により確認する。望まし
い構築物を含有するクローンは、両方のアンピシリン
（１００μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢ培地中一晩（「Ｏ
／Ｎ」）液体培養で成長させる。二つのクローンはクロ
ーンのコード領域を確認するために、完全にシークエン
シングした。ｐＣＤＮベクター中のマルコは哺乳動物の
トランスフェクションに用いた。
【０１５７】
【配列表】
（１）一般的情報： （i）出願人：エルサラム，ナビル、アダモー，ジョ
ン、グロス，ミッチェル、リスコ，ポール （ii）発明の名称： ヒトマクロスカベンジャーレセプ
ター （iii）配列の数：９ （iv）連絡先： （Ａ）名称：スミスクライン・ビーチャム・コーポレイ
ション （Ｂ）通り名：スウェードランド・ロード７０９番 （Ｃ）都市名：キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名：ペンシルベニア州 （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：１９４０６ （v）コンピューター読取り可能な形態： （Ａ）媒体形態：ディスケット （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：Ｗindows Ｖersion ２.０用のＦa
stＳＥＱ （vi）現出願データ： （Ａ）出願番号：不明 （Ｂ）出願日：１９９７年２月４日 （Ｃ）分類： （vii）先の出願データ （Ａ）出願番号：ＡＴＧ５０００９Ｐ （Ｂ）出願日：１９９６年５月２２日 （viii）代理人等の情報： （Ａ）氏名：ハン，ウィリアム・テイ （Ｂ）登録番号：３４,３４４ （Ｃ）代理人等における処理番号：ＡＴＧ５０００９ （ix）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０−２７０−５２１９ （Ｂ）テレファックス番号：６１０−２７０−４０２６ （Ｃ）テレックス：
【０１５８】（２） 配列番号：１の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１７０３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （xi）配列の記載：配列番号：１： GGCACGAGCT CTTGAGTGAG ACCCAACAAG CTGCTTTTCA CCAAATTGCA ATGGAGCCTT 60 TCGAAATCAA TGTTCCAAAG CCCAAGAGGA GAAATGGGGT GAACTTCTCC CTAGCTGTGG 120 TGGTCATCTA CCTGATCCTG CTCACCGCTG GCGCTGGGCT GCTGGTGGTC CAAGTTCTGA 180 ATCTGCAGGC GCGGCTCCGG GTCCTGGAGA TGTATTTCCT CAATGACACT CTGGCGGCTG 240 AGGACAGCCC GTCCTTCTCC TTGCTGCAGT CAGCACACCC TGGAGAACAC CTGGCTCAGG 300 GTGCATCGAG GCTGCAAGTC CTGCAGGCCC AACTCACCTG GGTCCGCGTC AGCCATGAGC 360 ACTTGCTGCA GCGGGTAGAC AACTTCACTC AGAACCCAGG GATGTTCAGA ATCAAAGGTG 420 AACAAGGCGC CCCAGGTCTT CAAGGTCACA AGGGGGCCAT GGGCATGCCT GGTGCCCCTG 480 GCCCGCCGGG ACCACCTGCT GAGAAGGGAG CCAAGGGGGC TATGGGACGA GATGGAACAA 540 CAGGCCCCTC GGGACCCCAA GGCCCACCGG GAGTCAAGGG AGAGGCGGGC CTCCAAGGAC 600 CCCAGGGTGC TCCAGGGAAG CAAGGAGCCA CTGGCACCCC AGGACCCCAA GGAGAGAAGG 660 GCAGCAAAGG CGATGGGGGT CTCATTGGCC CAAAAGGGGA AACTGGAACT AAGGGAGAGA 720 AAGGAGACCT GGGTCTCCCA GGAAGCAAAG GGGACAGGGG CATGAAAGGA GATGCAGGGG 780 TCATGGGGCC TCCTGGAGCC CAGGGGAGTA AAGGTGACTT CGGGAGGCCA GGCCCACCAG 840 GTTTGGCTGG TTTTCCTGGA GCTAAAGGAG ATCAAGGACA ACCTGGACTG CAGGGTGTTC 900 CGGGCCCTCC TGGTGCAGTG GGACACCCAG GTGCCAAGGG TGAGCCTGGC AGTGCTGGCT 960 CCCCTGGGCG AGCAGGACTT CCAGGGAGCC CCGGGAGTCC AGGAGCCACA GGCCTGAAAG 1020 GAAGCAAAGG GGACACAGGA CTTCAAGGAC AGCAAGGAAG AAAAGGAGAA TCAGGAGTTC 1080 CAGGCCCTGC AGGTGTGAAG GGAGAACAGG GGAGCCCAGG GCTGGCAGGT CCCAAGGGAG 1140 CCCCTGGACA AGCTGGCCAG AAGGGAGACC AGGGAGTGAA AGGATCTTCT GGGGAGCAAG 1200 GAGTAAAGGG AGAAAAAGGT GAAAGAGGTG AAAACTCAGT GTCCGTCAGG ATTGTCGGCA 1260 GTAGTAACCG AGGCCGGGCT GAAGTTTACT ACAGTGGTAC CTGGGGGACA ATTTGCGATG 1320 ACGAGTGGCA AAATTCTGAT GCCATTGTCT TCTGCCGCAT GCTGGGTACT CCAAAGGAAG 1380 GGCCCTGTAC AAAGTGGGAG CTGGCACTGG GCAGATCTGG CTGGATAATG TTCAGTGTCG 1440 GGGCACGGAG AGTACCCTGT GGAGCTGCAC CAAGAATAGC TGGGGCCATC ATGACTGCAG 1500 CCACGAGGAG GACGCAGGCG TGGAGTGCAG CGTCTGACCC GGAAACCCTT TCACTTCTCT 1560 GCTCCCGAGG TGTCCTCGGG CTCANATGTG GGAAGGCAGA GGATCTCTGA GGAGTTCCCT 1620 GGGGACAACT GAGCAGCCTC TGGAGAGGGG CCATTAATAA AGCTCAACAT CATGAAAAAA 1680 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA 1703
【０１５９】（２） 配列番号：２の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４９５アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ペプチド （xi）配列の記載：配列番号：２： Met Glu Pro Phe Glu Ile Asn Val Pro Lys Pro Lys Arg Arg Asn Gly 1 5 10 15 Val Asn Phe Ser Leu Ala Val Val Val Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Thr 20 25 30 Ala Gly Ala Gly Leu Leu Val Val Gln Val Leu Asn Leu Gln Ala Arg 35 40 45 Leu Arg Val Leu Glu Met Tyr Phe Leu Asn Asp Thr Leu Ala Ala Glu 50 55 60 Asp Ser Pro Ser Phe Ser Leu Leu Gln Ser Ala His Pro Gly Glu His 65 70 75 80 Leu Ala Gln Gly Ala Ser Arg Leu Gln Val Leu Gln Ala Gln Leu Thr 85 90 95 Trp Val Arg Val Ser His Glu His Leu Leu Gln Arg Val Asp Asn Phe 100 105 110 Thr Gln Asn Pro Gly Met Phe Arg Ile Lys Gly Glu Gln Gly Ala Pro 115 120 125 Gly Leu Gln Gly His Lys Gly Ala Met Gly Met Pro Gly Ala Pro Gly 130 135 140 Pro Pro Gly Pro Pro Ala Glu Lys Gly Ala Lys Gly Ala Met Gly Arg 145 150 155 160 Asp Gly Thr Thr Gly Pro Ser Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Val Lys 165 170 175 Gly Glu Ala Gly Leu Gln Gly Pro Gln Gly Ala Pro Gly Lys Gln Gly 180 185 190 Ala Thr Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Glu Lys Gly Ser Lys Gly Asp 195 200 205 Gly Gly Leu Ile Gly Pro Lys Gly Glu Thr Gly Thr Lys Gly Glu Lys 210 215 220 Gly Asp Leu Gly Leu Pro Gly Ser Lys Gly Asp Arg Gly Met Lys Gly 225 230 235 240 Asp Ala Gly Val Met Gly Pro Pro Gly Ala Gln Gly Ser Lys Gly Asp 245 250 255 Phe Gly Arg Pro Gly Pro Pro Gly Leu Ala Gly Phe Pro Gly Ala Lys 260 265 270 Gly Asp Gln Gly Gln Pro Gly Leu Gln Gly Val Pro Gly Pro Pro Gly 275 280 285 Ala Val Gly His Pro Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Ser Ala Gly Ser 290 295 300 Pro Gly Arg Ala Gly Leu Pro Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Ala Thr 305 310 315 320 Gly Leu Lys Gly Ser Lys Gly Asp Thr Gly Leu Gln Gly Gln Gln Gly 325 330 335 Arg Lys Gly Glu Ser Gly Val Pro Gly Pro Ala Gly Val Lys Gly Glu 340 345 350 Gln Gly Ser Pro Gly Leu Ala Gly Pro Lys Gly Ala Pro Gly Gln Ala 355 360 365 Gly Gln Lys Gly Asp Gln Gly Val Lys Gly Ser Ser Gly Glu Gln Gly 370 375 380 Val Lys Gly Glu Lys Gly Glu Arg Gly Glu Asn Ser Val Ser Val Arg 385 390 395 400 Ile Val Gly Ser Ser Asn Arg Gly Arg Ala Glu Val Tyr Tyr Ser Gly 405 410 415 Thr Trp Gly Thr Ile Cys Asp Asp Glu Trp Gln Asn Ser Asp Ala Ile 420 425 430 Val Phe Cys Arg Met Leu Gly Tyr Ser Lys Gly Arg Ala Leu Tyr Lys 435 440 445 Val Gly Ala Gly Thr Gly Gln Ile Trp Leu Asp Asn Val Gln Cys Arg 450 455 460 Gly Thr Glu Ser Thr Leu Trp Ser Cys Thr Lys Asn Ser Trp Gly His 465 470 475 480 His Asp Cys Ser His Glu Glu Asp Ala Gly Val Glu Cys Ser Val 485 490 495
【０１６０】（２） 配列番号：３の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２９ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （xi）配列の記載：配列番号：３： CTGCAGGAAT TCGGCACGAG CTCTTGAGT 29
【０１６１】（２） 配列番号：４の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （xi）配列の記載：配列番号：４： CCTCGGGAGC AGAGAAGTGA AAAGCTTTCC 30
【０１６２】（２） 配列番号：５の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１５６０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （xi）配列の記載：配列番号：５： ATGAGAAATA AGAAAATTCT CAAGGAGGAC GAGCTCTTGA GTGAGACCCA ACAAGCTGCT 60 TTTCACCAAA TTGCAATGGA GCCTTTCGAA ATCAATGTTC CAAAGCCCAA GAGGAGAAAT 120 GGGGTGAACT TCTCCCTAGC TGTGGTGGTC ATCTACCTGA TCCTGCTCAC CGCTGGCGCT 180 GGGCTGCTGG TGGTCCAAGT TCTGAATCTG CAGGCGCGGC TCCGGGTCCT GGAGATGTAT 240 TTCCTCAATG ACACTCTGGC GGCTGAGGAC AGCCCGTCCT TCTCCTTGCT GCAGTCAGCA 300 CACCCTGGAG AACACCTGGC TCAGGGTGCA TCGAGGCTGC AAGTCCTGCA GGCCCAACTC 360 ACCTGGGTCC GCGTCAGCCA TGAGCACTTG CTGCAGCGGG TAGACAACTT CACTCAGAAC 420 CCAGGGATGT TCAGAATCAA AGGTGAACAA GGCGCCCCAG GTCTTCAAGG TCACAAGGGG 480 GCCATGGGCA TGCCTGGTGC CCCTGGCCCG CCGGGACCAC CTGCTGAGAA GGGAGCCAAG 540 GGGGCTATGG GACGAGATGG AGCAACAGGC CCCTCGGGAC CCCAAGGCCC ACCGGGAGTC 600 AAGGGAGAGG CGGGCCTCCA AGGACCCCAG GGTGCTCCAG GGAAGCAAGG AGCCACTGGC 660 ACCCCAGGAC CCCAAGGAGA GAAGGGCAGC AAAGGCGATG GGGGTCTCAT TGGCCCAAAA 720 GGGGAAACTG GAACTAAGGG AGAGAAAGGA GACCTGGGTC TCCCAGGAAG CAAAGGGGAC 780 AGGGGCATGA AAGGAGATGC AGGGGTCATG GGGCCTCCTG GAGCCCAGGG GAGTAAAGGT 840 GACTTCGGGA GGCCAGGCCC ACCAGGTTTG GCTGGTTTTC CTGGAGCTAA AGGAGATCAA 900 GGACAACCTG GACTGCAGGG TGTTCCGGGC CCTCCTGGTG CAGTGGGACA CCCAGGTGCC 960 AAGGGTGAGC CTGGCAGTGC TGGCTCCCCT GGGCGAGCAG GACTTCCAGG GAGCCCCGGG 1020 AGTCCAGGAG CCACAGGCCT GAAAGGAAGC AAAGGGGACA CAGGACTTCA AGGACAGCAA 1080 GGAAGAAAAG GAGAATCAGG AGTTCCAGGC CCTGCAGGTG TGAAGGGAGA ACAGGGGAGC 1140 CCAGGGCTGG CAGGTCCCAA GGGAGCCCCT GGACAAGCTG GCCAGAAGGG AGACCAGGGA 1200 GTGAAAGGAT CTTCTGGGGA GCAAGGAGTA AAGGGAGAAA AAGGTGAAAG AGGTGAAAAC 1260 TCAGTGTCCG TCAGGATTGT CGGCAGTAGT AACCGAGGCC GGGCTGAAGT TTACTACAGT 1320 GGTACCTGGG GGACAATTTG CGATGACGAG TGGCAAAATT CTGATGCCAT TGTCTTCTGC 1380 CGCATGCTGG GTTACTCCAA AGGAAGGGCC CTGTACAAAG TGGGAGCTGG CACTGGGCAG 1440 ATCTGGCTGG ATAATGTTCA GTGTCGGGGC ACGGAGAGTA CCCTGTGGAG CTGCACCAAG 1500 AATAGCTGGG GCCATCATGA CTGCAGCCAC GAGGAGGACG CAGGCGTGGA GTGCAGCGTC 1560
【０１６３】（２） 配列番号：６の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：５２０アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ペプチド （xi）配列の記載：配列番号：６： Met Arg Asn Lys Lys Ile Leu Lys Glu Asp Glu Leu Leu Ser Glu Thr 1 5 10 15 Gln Gln Ala Ala Phe His Gln Ile Ala Met Glu Pro Phe Glu Ile Asn 20 25 30 Val Pro Lys Pro Lys Arg Arg Asn Gly Val Asn Phe Ser Leu Ala Val 35 40 45 Val Val Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Thr Ala Gly Ala Gly Leu Leu Val 50 55 60 Val Gln Val Leu Asn Leu Gln Ala Arg Leu Arg Val Leu Glu Met Tyr 65 70 75 80 Phe Leu Asn Asp Thr Leu Ala Ala Glu Asp Ser Pro Ser Phe Ser Leu 85 90 95 Leu Gln Ser Ala His Pro Gly Glu His Leu Ala Gln Gly Ala Ser Arg 100 105 110 Leu Gln Val Leu Gln Ala Gln Leu Thr Trp Val Arg Val Ser His Glu 115 120 125 His Leu Leu Gln Arg Val Asp Asn Phe Thr Gln Asn Pro Gly Met Phe 130 135 140 Arg Ile Lys Gly Glu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly His Lys Gly 145 150 155 160 Ala Met Gly Met Pro Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Ala Glu 165 170 175 Lys Gly Ala Lys Gly Ala Met Gly Arg Asp Gly Ala Thr Gly Pro Ser 180 185 190 Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Val Lys Gly Glu Ala Gly Leu Gln Gly 195 200 205 Pro Gln Gly Ala Pro Gly Lys Gln Gly Ala Thr Gly Thr Pro Gly Pro 210 215 220 Gln Gly Glu Lys Gly Ser Lys Gly Asp Gly Gly Leu Ile Gly Pro Lys 225 230 235 240 Gly Glu Thr Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Asp Leu Gly Leu Pro Gly 245 250 255 Ser Lys Gly Asp Arg Gly Met Lys Gly Asp Ala Gly Val Met Gly Pro 260 265 270 Pro Gly Ala Gln Gly Ser Lys Gly Asp Phe Gly Arg Pro Gly Pro Pro 275 280 285 Gly Leu Ala Gly Phe Pro Gly Ala Lys Gly Asp Gln Gly Gln Pro Gly 290 295 300 Leu Gln Gly Val Pro Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly His Pro Gly Ala 305 310 315 320 Lys Gly Glu Pro Gly Ser Ala Gly Ser Pro Gly Arg Ala Gly Leu Pro 325 330 335 Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Ala Thr Gly Leu Lys Gly Ser Lys Gly 340 345 350 Asp Thr Gly Leu Gln Gly Gln Gln Gly Arg Lys Gly Glu Ser Gly Val 355 360 365 Pro Gly Pro Ala Gly Val Lys Gly Glu Gln Gly Ser Pro Gly Leu Ala 370 375 380 Gly Pro Lys Gly Ala Pro Gly Gln Ala Gly Gln Lys Gly Asp Gln Gly 385 390 395 400 Val Lys Gly Ser Ser Gly Glu Gln Gly Val Lys Gly Glu Lys Gly Glu 405 410 415 Arg Gly Glu Asn Ser Val Ser Val Arg Ile Val Gly Ser Ser Asn Arg 420 425 430 Gly Arg Ala Glu Val Tyr Tyr Ser Gly Thr Trp Gly Thr Ile Cys Asp 435 440 445 Asp Glu Trp Gln Asn Ser Asp Ala Ile Val Phe Cys Arg Met Leu Gly 450 455 460 Tyr Ser Lys Gly Arg Ala Leu Tyr Lys Val Gly Ala Gly Thr Gly Gln 465 470 475 480 Ile Trp Leu Asp Asn Val Gln Cys Arg Gly Thr Glu Ser Thr Leu Trp 485 490 495 Ser Cys Thr Lys Asn Ser Trp Gly His His Asp Cys Ser His Glu Glu 500 505 510 Asp Ala Gly Val Glu Cys Ser Val 515 520
【０１６４】（２） 配列番号：７の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４８９アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：タンパク質 （xi）配列の記載：配列番号：７： Met Glu Thr Phe Glu Ile Asn Asp Pro Val Pro Lys Lys Arg Asn Gly 1 5 10 15 Gly Thr Phe Cys Met Ala Val Met Ala Ile His Leu Ile Leu Leu Thr 20 25 30 Ala Gly Thr Ala Leu Leu Leu Ile Gln Val Leu Asn Leu Gln Glu Gln 35 40 45 Leu Gln Met Leu Glu Met Cys Cys Gly Asn Gly Ser Leu Ala Ile Glu 50 55 60 Asp Lys Pro Phe Phe Ser Leu Gln Trp Ala Pro Lys Thr His Leu Val 65 70 75 80 Pro Arg Ala Gln Gly Leu Gln Ala Leu Gln Ala Gln Leu Ser Trp Val 85 90 95 His Thr Ser Gln Glu Gln Leu Arg Gln Gln Phe Asn Asn Leu Thr Gln 100 105 110 Asn Pro Glu Leu Phe Gln Ile Lys Gly Glu Arg Gly Ser Pro Gly Pro 115 120 125 Lys Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ile Pro Gly Leu Pro Gly Pro Ala 130 135 140 Ala Glu Lys Gly Glu Lys Gly Ala Ala Gly Arg Asp Gly Thr Pro Gly 145 150 155 160 Val Gln Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Ser Lys Gly Glu Ala Gly Leu 165 170 175 Gln Gly Leu Thr Gly Ala Pro Gly Lys Gln Gly Ala Thr Gly Ala Pro 180 185 190 Gly Pro Arg Gly Glu Lys Gly Ser Lys Gly Asp Ile Gly Leu Thr Gly 195 200 205 Pro Lys Gly Glu His Gly Thr Lys Gly Asp Lys Gly Asp Leu Gly Leu 210 215 220 Pro Gly Asn Lys Gly Asp Met Gly Met Lys Gly Asp Thr Gly Pro Met 225 230 235 240 Gly Ser Pro Gly Ala Gln Gly Gly Lys Gly Asp Ala Gly Lys Pro Gly 245 250 255 Leu Pro Gly Leu Ala Gly Ser Pro Gly Val Lys Gly Asp Gln Gly Lys 260 265 270 Pro Gly Val Gln Gly Val Pro Gly Pro Gln Gly Ala Pro Gly Leu Ser 275 280 285 Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Arg Thr Gly Leu Pro Gly Pro Ala Gly 290 295 300 Pro Pro Gly Ile Ala Gly Asn Pro Gly Ile Ala Gly Val Lys Gly Ser 305 310 315 320 Lys Gly Asp Thr Gly Ile Gln Gly Gln Lys Gly Thr Lys Gly Glu Ser 325 330 335 Gly Val Pro Gly Leu Val Gly Arg Lys Gly Asp Thr Gly Ser Pro Gly 340 345 350 Leu Ala Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly Arg Val Gly Gln Lys Gly Asp 355 360 365 Pro Gly Met Lys Gly Ser Ser Gly Gln Gln Gly Gln Lys Gly Glu Lys 370 375 380 Gly Gln Lys Gly Glu Ser Phe Gln Arg Val Arg Ile Met Gly Gly Thr 385 390 395 400 Asn Arg Gly Arg Ala Glu Val Tyr Tyr Asn Asn Glu Trp Gly Thr Ile 405 410 415 Cys Asp Asp Asp Trp Asp Asn Asn Asp Ala Thr Val Phe Cys Arg Met 420 425 430 Leu Gly Tyr Ser Arg Gly Arg Ala Leu Ser Ser Tyr Gly Gly Gly Ser 435 440 445 Gly Asn Ile Trp Leu Asp Asn Val Asn Cys Arg Gly Thr Glu Asn Ser 450 455 460 Leu Trp Asp Cys Ser Lys Asn Ser Trp Gly Asn His Asn Cys Val His 465 470 475 480 Asn Glu Asp Ala Gly Val Glu Cys Ser 485
【０１６５】（２） 配列番号：８の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （xi）配列の記載：配列番号：８： CTATAAGAAT TCGCAATGAG AAATAAGAAA ATTC 34
【０１６６】（２） 配列番号：９の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （xi）配列の記載：配列番号：９： CCTCGGGAGC AGAGAAGTGA AAAGCTTTCC 30
【図面の簡単な説明】
【図１】 配列番号：２のＨマルコＳＲのアミノ酸配列
および配列番号：７のＭマルコＳＲ（ネズミマルコＳ
Ｒ）のポリペプチドの類似の領域を示す。
【図２】 ＦＩＴＣ−ＬＰＳの、配列番号：２のＨマル
コＳＲへの結合結果を示す。
【図３】 ＤｉＩ−ＡｃＬＤＬの、配列番号：２のＨマ
ルコＳＲへの結合結果を示す。
【図４】 配列番号：６のＨマルコＳＲ（全配列）を示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 16/28 16/28 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 33/566 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ナビル・アブド・エルサラム・エルショー アバギー アメリカ合衆国19380ペンシルベニア州ウ エスト・チェスター、バウ・トゥリー・ド ライブ1648番 (72)発明者 ジョン・エドワード・アダモー アメリカ合衆国20876メリーランド州ジャ ーマンタウン、グレイト・パーク・サーク ル12518番 アパートメント204 (72)発明者 ミッチェル・スチュアート・グロス アメリカ合衆国19087ペンシルベニア州ウ ェイン、ピュフ・ロード667番 (72)発明者 ポール・ジョージ・リスコ アメリカ合衆国19335ペンシルベニア州ダ ウニングタウン、オークランド・ドライブ 44番

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）配列番号：６のアミノ酸を含むポリ
    ペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも７
    ０％の同等性を有するポリヌクレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレ
    オチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なく
    とも15塩基を有してなるポリヌクレオチド；からなる群
    から選択される構成因子を含有してなる単離ポリヌクレ
    オチド。
  2. 【請求項２】 ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項
    １記載のポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項
    １記載のポリヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 配列番号：５に示すヌクレオチドを含有
    してなる請求項２記載のポリヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 配列番号：６のアミノ酸を含有してなる
    ポリペプチドをコードする請求項２記載のポリヌクレオ
    チド。
  6. 【請求項６】（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号９８０１５に含ま
    れるヒトｃＤＮＡにより発現する同一の成熟ポリペプチ
    ドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも７０％の
    同等性を有するポリヌクレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレ
    オチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なく
    とも15塩基を有してなるポリヌクレオチド；からなる群
    から選択される構成因子を含有してなる単離ポリヌクレ
    オチド。
  7. 【請求項７】 請求項２に記載のＤＮＡを含有してなる
    ベクター。
  8. 【請求項８】 請求項７に記載のベクターを含有してな
    る宿主細胞。
  9. 【請求項９】 請求項８に記載の宿主細胞から、該ＤＮ
    Ａによりコードされるポリペプチドを発現させることか
    らなるポリペプチドの産生方法。
  10. 【請求項１０】 細胞がベクターに含まれるヒトｃＤＮ
    Ａによりコードされるポリヌクレオチドを発現するよう
    に、請求項９に記載のベクターで細胞を形質転換または
    トランスフェクションすることからなる、ポリペプチド
    を発現する細胞の産生方法。
  11. 【請求項１１】 配列番号：６のアミノ酸に対して少な
    くとも７０％同等であるアミノ酸配列を含有してなるポ
    リペプチド。
  12. 【請求項１２】 配列番号：６に示すアミノ酸配列を含
    むポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 請求項１１または１２に記載のポリペ
    プチドのアゴニスト。
  14. 【請求項１４】 請求項１１または１２に記載のポリペ
    プチドに対する抗体。
  15. 【請求項１５】 請求項１１または１２記載のポリペプ
    チドの活性を阻害するアンタゴニスト。
  16. 【請求項１６】 請求項１１または１２に記載のポリペ
    プチドを治療上有効量、患者に投与することからなるＨ
    マルコＳＲを必要とする患者の治療方法。
  17. 【請求項１７】 治療上有効量のポリペプチドを、in v
    ivoで該ポリペプチドをコードし、そのポリペプチドを
    発現するＤＮＡを患者に提供することにより投与する請
    求項１６記載の方法。
  18. 【請求項１８】 治療上有効量の請求項１５に記載のア
    ンタゴニストを患者に投与することからなるＨマルコＳ
    Ｒポリペプチドを阻害する必要のある患者の治療方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１１および１２のポリペプチド
    の発現に関連する疾患または該疾患に対する感受性の診
    断方法であって、該ポリペプチドをコードする核酸配列
    における変異を測定することからなる方法。
  20. 【請求項２０】 宿主由来の試料中の請求項１１または
    １２に記載のポリペプチドの存在について分析すること
    からなる診断方法。
  21. 【請求項２１】 請求項１１または１２に記載のポリペ
    プチドについての受容体に結合し、活性化または阻害す
    る化合物の同定方法であって、 ポリペプチドについての受容体（化合物の受容体への結
    合に応答して検出可能な信号を付与しうる第二の成分と
    結合する）をその表面にて発現する細胞を、該受容体へ
    の結合を可能とする条件下で、スクリーニングされるべ
    き化合物と接触させ；および該化合物と該受容体の相互
    作用から生じる信号の存在または不在を検出することに
    より、化合物が受容体と結合し、受容体を活性化または
    阻害するかどうかを測定することからなる同定方法。
JP9170866A 1996-05-23 1997-05-23 ヒトマクロスカベンジャー受容体 Withdrawn JPH1084977A (ja)

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US60/017699 1997-02-04
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