JPH1084980A - ｃａｐｓ遺伝子上の陽性選択ベクターであるｐＣＡＰｓ ベクターとその使用 - Google Patents
ｃａｐｓ遺伝子上の陽性選択ベクターであるｐＣＡＰｓ ベクターとその使用Info
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- JPH1084980A JPH1084980A JP9203381A JP20338197A JPH1084980A JP H1084980 A JPH1084980 A JP H1084980A JP 9203381 A JP9203381 A JP 9203381A JP 20338197 A JP20338197 A JP 20338197A JP H1084980 A JPH1084980 A JP H1084980A
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- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、ベクターで形質転換された宿主細
胞中に、ＤＮＡ配列をクローニングするための陽性選択
可能性を有するベクターを提供する。 【解決手段】 その機能的発現が外来遺伝子の挿入によ
り妨害される選択遺伝子内に適当な制限切断部位を含有
するベクターで形質転換された宿主細胞中に、ＤＮＡ配
列をクローニングするための陽性選択可能性を有するベ
クターであって、その発現がアデニル酸シクラーゼ陽性
宿主細胞にとって致死的である修飾ＤＮＡ結合特異性を
有するＣＡＰタンパク質をコードする選択遺伝子として
修飾ｃａｐ遺伝子を含有することを特徴とするベクタ
ー。
胞中に、ＤＮＡ配列をクローニングするための陽性選択
可能性を有するベクターを提供する。 【解決手段】 その機能的発現が外来遺伝子の挿入によ
り妨害される選択遺伝子内に適当な制限切断部位を含有
するベクターで形質転換された宿主細胞中に、ＤＮＡ配
列をクローニングするための陽性選択可能性を有するベ
クターであって、その発現がアデニル酸シクラーゼ陽性
宿主細胞にとって致死的である修飾ＤＮＡ結合特異性を
有するＣＡＰタンパク質をコードする選択遺伝子として
修飾ｃａｐ遺伝子を含有することを特徴とするベクタ
ー。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、その発現が外来遺
伝子の挿入により妨害される選択遺伝子内に適当な制限
切断部位を含有するベクターで形質転換された宿主細胞
中に、ＤＮＡ配列をクローニングするための陽性選択可
能性を有するベクター、本発明のベクターの生産方法、
並びにＤＮＡ配列をクローニングするための陽性選択ベ
クターとしての該ベクターの使用、および最後に陽性選
択ベクターの選択遺伝子内にＤＮＡ配列を挿入し、続い
て適当な宿主細胞中でベクターを複製することによるＤ
ＮＡ配列のクローニング方法、並びにＤＮＡ配列のクロ
ーニングのためのキットに関する。
伝子の挿入により妨害される選択遺伝子内に適当な制限
切断部位を含有するベクターで形質転換された宿主細胞
中に、ＤＮＡ配列をクローニングするための陽性選択可
能性を有するベクター、本発明のベクターの生産方法、
並びにＤＮＡ配列をクローニングするための陽性選択ベ
クターとしての該ベクターの使用、および最後に陽性選
択ベクターの選択遺伝子内にＤＮＡ配列を挿入し、続い
て適当な宿主細胞中でベクターを複製することによるＤ
ＮＡ配列のクローニング方法、並びにＤＮＡ配列のクロ
ーニングのためのキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】単離されたＤＮＡ断片は、分子生物学で
のいくつかの応用には充分である。転写、突然変異、配
列決定または発現などの応用では、これは、各ＤＮＡ断
片を含有する細菌クローンを得るのに重要である。
のいくつかの応用には充分である。転写、突然変異、配
列決定または発現などの応用では、これは、各ＤＮＡ断
片を含有する細菌クローンを得るのに重要である。
【０００３】ＤＮＡがクローン化される時、クローン化
されるＤＮＡ断片は、典型的にはＤＮＡを適当な制限酵
素で切断することにより生産される。このＤＮＡ断片
は、次に適当な方法で作製されたベクターと連結され、
そしてコンピテントな細胞中で形質転換される。
されるＤＮＡ断片は、典型的にはＤＮＡを適当な制限酵
素で切断することにより生産される。このＤＮＡ断片
は、次に適当な方法で作製されたベクターと連結され、
そしてコンピテントな細胞中で形質転換される。
【０００４】ＤＮＡがＰＣＲによりＤＮＡ増幅される場
合、種々のクローニング方策が適用される。すなわち例
えば、制限エンドヌクレアーゼの認識配列は、各プライ
マー配列の末端に取り込むことができる。すなわち、Ｐ
ＣＲにより生産されるＤＮＡ断片の末端は、対応する制
限配列を有し、ＰＣＲ後に各制限酵素により切断するこ
とができる（Kaufmann and Evans, 1990, BioTechnique
s 9, 304-306）。
合、種々のクローニング方策が適用される。すなわち例
えば、制限エンドヌクレアーゼの認識配列は、各プライ
マー配列の末端に取り込むことができる。すなわち、Ｐ
ＣＲにより生産されるＤＮＡ断片の末端は、対応する制
限配列を有し、ＰＣＲ後に各制限酵素により切断するこ
とができる（Kaufmann and Evans, 1990, BioTechnique
s 9, 304-306）。
【０００５】さらなるクローニング方策は、ＤＮＡポリ
メラーゼのいわゆるエクステンダーゼ（extensase）活
性を利用することである。例えばＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼが使用される時、ＰＣＲ産物の３’末端でＰＣＲ産
物の鋳型依存性伸長が起きる（Clark, 1989, Nucl. Aci
ds Res. 20, 9677-9686）。この過程では、ＰＣＲ産物
のいくつかのＤＮＡの３’末端に、好ましくは単一のデ
オキシアデノシンモノホスフェートが結合する。従って
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（および、３’−５’エキソ
ヌクレアーゼ活性のない他のＤＮＡポリメラーゼ）は、
適当なベクターと連結するために使用することができる
ＤＮＡ末端を有するＰＣＲ産物を生成する（それぞれ
３’末端で１つのチミジンモノホスフェートを有する）
（Mead etal., 1991, Biotechnol. 9, 657-663;ＰＣＴ
出願ＷＯ９２／０６１８９）。
メラーゼのいわゆるエクステンダーゼ（extensase）活
性を利用することである。例えばＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼが使用される時、ＰＣＲ産物の３’末端でＰＣＲ産
物の鋳型依存性伸長が起きる（Clark, 1989, Nucl. Aci
ds Res. 20, 9677-9686）。この過程では、ＰＣＲ産物
のいくつかのＤＮＡの３’末端に、好ましくは単一のデ
オキシアデノシンモノホスフェートが結合する。従って
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（および、３’−５’エキソ
ヌクレアーゼ活性のない他のＤＮＡポリメラーゼ）は、
適当なベクターと連結するために使用することができる
ＤＮＡ末端を有するＰＣＲ産物を生成する（それぞれ
３’末端で１つのチミジンモノホスフェートを有する）
（Mead etal., 1991, Biotechnol. 9, 657-663;ＰＣＴ
出願ＷＯ９２／０６１８９）。
【０００６】さらにＰＣＲ産物は、いわゆる平滑末端連
結により適当なベクターに連結することができる。この
方法は、好ましくは各ＰＣＲ断片が、３’−５’エキソ
ヌクレアーゼ活性を有する（すなわち、エクステンダー
ゼ活性がない；Costa et al., 1994, PCR Meth. and Ap
pl. 3, 338-345; Lohff and Cease, 1991, Nucl. Acids
Res. 20(1), 144 ）ポリメラーゼで増幅されている
時、使用される。
結により適当なベクターに連結することができる。この
方法は、好ましくは各ＰＣＲ断片が、３’−５’エキソ
ヌクレアーゼ活性を有する（すなわち、エクステンダー
ゼ活性がない；Costa et al., 1994, PCR Meth. and Ap
pl. 3, 338-345; Lohff and Cease, 1991, Nucl. Acids
Res. 20(1), 144 ）ポリメラーゼで増幅されている
時、使用される。
【０００７】大腸菌へのＤＮＡのクローニングのため
に、多くの異なるベクターが利用できる。これらのクロ
ーニングベクターのサブグループ（いわゆる陽性選択ベ
クター）は、各ベクター中で挿入体としてＤＮＡ断片を
有するクローンの直接選択を可能にする。この過程で
は、各ＤＮＡ断片は、クローニングにより（例えば）致
死遺伝子内に挿入される。その致死遺伝子がＤＮＡ断片
の挿入により不活性化されていないベクターを有する細
菌クローンは、この致死遺伝子を発現し、従って生存し
続けることができない。こうして目的のＤＮＡ断片を有
するクローンが選択される。このような性質を有するベ
クターは、自殺ベクターと呼ばれる。従って陽性選択の
ために自殺ベクターを使用することは、目的のＤＮＡ挿
入体を持たない非組換えクローン（および、偽陽性クロ
ーン）の好ましくないバックグラウンドを抑制するため
の効率的な方策である。
に、多くの異なるベクターが利用できる。これらのクロ
ーニングベクターのサブグループ（いわゆる陽性選択ベ
クター）は、各ベクター中で挿入体としてＤＮＡ断片を
有するクローンの直接選択を可能にする。この過程で
は、各ＤＮＡ断片は、クローニングにより（例えば）致
死遺伝子内に挿入される。その致死遺伝子がＤＮＡ断片
の挿入により不活性化されていないベクターを有する細
菌クローンは、この致死遺伝子を発現し、従って生存し
続けることができない。こうして目的のＤＮＡ断片を有
するクローンが選択される。このような性質を有するベ
クターは、自殺ベクターと呼ばれる。従って陽性選択の
ために自殺ベクターを使用することは、目的のＤＮＡ挿
入体を持たない非組換えクローン（および、偽陽性クロ
ーン）の好ましくないバックグラウンドを抑制するため
の効率的な方策である。
【０００８】いくつかの陽性選択ベクターは、選択性遺
伝子にクローン化されるＤＮＡ断片の挿入による、選択
性遺伝子の不活性化に基づく。この場合、これらの遺伝
子は致死遺伝子であってよい（Henrich & Plapp, 1986,
Gene 42, 345-349; Henrich& Schmidtberger, 1995, G
ene 154, 51-54; Bernard et al., 1994, Gene 148,71-
74, ＰＣＴ出願ＷＯ９４／０３６１６）。記載されてい
るさらなる原理は、代謝物に対する特定の感度の除去
（Kast, 1994, Gene 138, 109-114）、ＤＮＡ分解性ま
たはＲＮＡ分解性酵素による選択（Yaznin et al., 199
6, Gene 169, 131-132; Ahrenholtz et al., 1994, App
l. Environ. Microbiol. 60(10), 3746-3751）、並びに
不安定な長いパリンドロームＤＮＡ配列による選択（Al
tenbuchner et al., 1992, Methods. Enzymol. 216, 45
7-466）である。
伝子にクローン化されるＤＮＡ断片の挿入による、選択
性遺伝子の不活性化に基づく。この場合、これらの遺伝
子は致死遺伝子であってよい（Henrich & Plapp, 1986,
Gene 42, 345-349; Henrich& Schmidtberger, 1995, G
ene 154, 51-54; Bernard et al., 1994, Gene 148,71-
74, ＰＣＴ出願ＷＯ９４／０３６１６）。記載されてい
るさらなる原理は、代謝物に対する特定の感度の除去
（Kast, 1994, Gene 138, 109-114）、ＤＮＡ分解性ま
たはＲＮＡ分解性酵素による選択（Yaznin et al., 199
6, Gene 169, 131-132; Ahrenholtz et al., 1994, App
l. Environ. Microbiol. 60(10), 3746-3751）、並びに
不安定な長いパリンドロームＤＮＡ配列による選択（Al
tenbuchner et al., 1992, Methods. Enzymol. 216, 45
7-466）である。
【０００９】ベクターＤＮＡおよび／またはＤＮＡ断片
を切断するのに制限エンドヌクレアーゼを使用する時、
この方法ではクローン化されるＤＮＡの配列内で好まし
くない切断が起きることがあるという限界がある。従っ
て各ＤＮＡ断片中に存在しない制限切断部位のみがプラ
イマー内に取り込まれる。さらに、この追加のプライマ
ー配列の合成は高価である。さらに、プライマーの末端
に位置するこれらの制限切断部位の切断効率は、ＤＮＡ
セクション内に位置する切断部位の効率より悪い（Jung
et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18(20), 6156）。さ
らに前もっておよび後でＤＮＡを精製することが必要な
ことがある。
を切断するのに制限エンドヌクレアーゼを使用する時、
この方法ではクローン化されるＤＮＡの配列内で好まし
くない切断が起きることがあるという限界がある。従っ
て各ＤＮＡ断片中に存在しない制限切断部位のみがプラ
イマー内に取り込まれる。さらに、この追加のプライマ
ー配列の合成は高価である。さらに、プライマーの末端
に位置するこれらの制限切断部位の切断効率は、ＤＮＡ
セクション内に位置する切断部位の効率より悪い（Jung
et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18(20), 6156）。さ
らに前もっておよび後でＤＮＡを精製することが必要な
ことがある。
【００１０】チミジンモノホスフェートオーバーハング
を有するベクター（Ｔベクター）を用いる時は、３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性（いわゆるプルーフリーデ
ィング活性）を有するＤＮＡポリメラーゼは、デオキシ
アデノシンモノホスフェートの３’オーバーハングを有
するＰＣＲ産物を生成しないという制限がある。これら
のポリメラーゼは、ＰＣＲ産物の３’末端に平滑末端を
生成する（Hu. 1993,DNA Cell Biol. 12(8), 763-77
0)。これらのＰＣＲ産物は、Ｔベクターでクローン化す
ることができない。このようなポリメラーゼには例え
ば、ピロコッカス・ウーセイ（Pyrococcus woesei）の
ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｗｏポリメラーゼ）またはピロ
コッカス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）のＤＮ
Ａポリメラーゼ（Ｐｆｕポリメラーゼ）がある。従っ
て、このようなポリメラーゼは、Ｔベクターとともに使
用することはできない。さらに３’−５’活性を有する
少なくとも１つのポリメラーゼおよび有さない１つのポ
リメラーゼから構成されるポリメラーゼの混合物を用い
る時にも制限がある。これらの場合は、低いクローニン
グ効率が観察される。さらにＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（鋳型配列に依存して）は、デオキシアデノシンモノホ
スフェートとして他のヌクレオチドをＰＣＲ産物の３’
末端に結合することもできる（Hu, 1993, DNA Cell. Bi
ol. 12(8), 763-770）。このようなＤＮＡ断片は、Ｔベ
クターでクローニングするのに適さない。
を有するベクター（Ｔベクター）を用いる時は、３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性（いわゆるプルーフリーデ
ィング活性）を有するＤＮＡポリメラーゼは、デオキシ
アデノシンモノホスフェートの３’オーバーハングを有
するＰＣＲ産物を生成しないという制限がある。これら
のポリメラーゼは、ＰＣＲ産物の３’末端に平滑末端を
生成する（Hu. 1993,DNA Cell Biol. 12(8), 763-77
0)。これらのＰＣＲ産物は、Ｔベクターでクローン化す
ることができない。このようなポリメラーゼには例え
ば、ピロコッカス・ウーセイ（Pyrococcus woesei）の
ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｗｏポリメラーゼ）またはピロ
コッカス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）のＤＮ
Ａポリメラーゼ（Ｐｆｕポリメラーゼ）がある。従っ
て、このようなポリメラーゼは、Ｔベクターとともに使
用することはできない。さらに３’−５’活性を有する
少なくとも１つのポリメラーゼおよび有さない１つのポ
リメラーゼから構成されるポリメラーゼの混合物を用い
る時にも制限がある。これらの場合は、低いクローニン
グ効率が観察される。さらにＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（鋳型配列に依存して）は、デオキシアデノシンモノホ
スフェートとして他のヌクレオチドをＰＣＲ産物の３’
末端に結合することもできる（Hu, 1993, DNA Cell. Bi
ol. 12(8), 763-770）。このようなＤＮＡ断片は、Ｔベ
クターでクローニングするのに適さない。
【００１１】陽性選択ベクターを使用する時に発生する
問題の１つは、偽陽性クローン、すなわち挿入体のない
クローンの数が多いことである（Henrich & Plapp, 198
6; Gene 42, 345-349; Bernard et al., 1994, Gene 14
8, 71-74）。これは、選択遺伝子が突然変異しているク
ローン（いわゆる、復帰突然変異体）の増殖により引き
起こされる。
問題の１つは、偽陽性クローン、すなわち挿入体のない
クローンの数が多いことである（Henrich & Plapp, 198
6; Gene 42, 345-349; Bernard et al., 1994, Gene 14
8, 71-74）。これは、選択遺伝子が突然変異しているク
ローン（いわゆる、復帰突然変異体）の増殖により引き
起こされる。
【００１２】さらに、陽性選択ベクターの使用により、
機能は低下しているが、増殖能力が低下したクローンを
発生させる短いＤＮＡ断片をクローニングする時でも機
能する遺伝子産物が得られ、従ってクローニング実験の
評価が複雑である。
機能は低下しているが、増殖能力が低下したクローンを
発生させる短いＤＮＡ断片をクローニングする時でも機
能する遺伝子産物が得られ、従ってクローニング実験の
評価が複雑である。
【００１３】ＤＮＡ断片の挿入が選択遺伝子の致死性に
決して悪影響を与えない場合も、挿入体のないクローン
が得られる。すなわち、各ＤＮＡ断片をクローニングす
ることは不可能である。これは特に小さなＤＮＡ断片お
よび／またはそのヌクレオチド配列が選択遺伝子と「フ
レーム内」にある断片で発生する。
決して悪影響を与えない場合も、挿入体のないクローン
が得られる。すなわち、各ＤＮＡ断片をクローニングす
ることは不可能である。これは特に小さなＤＮＡ断片お
よび／またはそのヌクレオチド配列が選択遺伝子と「フ
レーム内」にある断片で発生する。
【００１４】応用のさらなる欠点は、選択機構を利用す
るために栄養培地を使用する必要がある場合である（Ka
st, 1994, Gene 138, 109-114）。
るために栄養培地を使用する必要がある場合である（Ka
st, 1994, Gene 138, 109-114）。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的
は、ＤＮＡ配列をクローニングする時に陽性選択を行う
可能性を形成し、現状の技術の欠点を避けることであ
る。
は、ＤＮＡ配列をクローニングする時に陽性選択を行う
可能性を形成し、現状の技術の欠点を避けることであ
る。
【課題を解決するための手段】この目的は、本発明によ
り、その発現が外来遺伝子の挿入により妨害される選択
遺伝子内に適当な制限切断部位を含有するベクターで形
質転換された宿主細胞中に、ＤＮＡ配列をクローニング
するための陽性選択可能性を有するベクターであって、
その発現がアデニル酸シクラーゼ陽性宿主細胞にとって
致死的である修飾ＤＮＡ結合特異性を有するＣＡＰタン
パク質をコードする選択遺伝子として修飾ｃａｐ遺伝子
（＝ｃｒｐ遺伝子、ｃＡＭＰ受容体タンパク質遺伝子）
を含有することを特徴とする、上記ベクターにより達成
される。一般的にすべての大腸菌株は、アデニル酸シク
ラーゼ陽性であり、従って本発明のベクターの応用に適
している。本発明のベクターは、一般的にはＤＮＡ断
片、そして具体的にはＰＣＲ法により生産されるＤＮＡ
断片をクローニングするために使用するのに適してい
る。
り、その発現が外来遺伝子の挿入により妨害される選択
遺伝子内に適当な制限切断部位を含有するベクターで形
質転換された宿主細胞中に、ＤＮＡ配列をクローニング
するための陽性選択可能性を有するベクターであって、
その発現がアデニル酸シクラーゼ陽性宿主細胞にとって
致死的である修飾ＤＮＡ結合特異性を有するＣＡＰタン
パク質をコードする選択遺伝子として修飾ｃａｐ遺伝子
（＝ｃｒｐ遺伝子、ｃＡＭＰ受容体タンパク質遺伝子）
を含有することを特徴とする、上記ベクターにより達成
される。一般的にすべての大腸菌株は、アデニル酸シク
ラーゼ陽性であり、従って本発明のベクターの応用に適
している。本発明のベクターは、一般的にはＤＮＡ断
片、そして具体的にはＰＣＲ法により生産されるＤＮＡ
断片をクローニングするために使用するのに適してい
る。
【００１６】
【発明の実施の形態】本発明のベクターの顕著な特徴
は、修飾された型のカタボライト活性化タンパク質（Ｃ
ＡＰ）をコードする、陽性選択成分として突然変異によ
り修飾されるある型のｃａｐ遺伝子を有することであ
る。ＣＡＰタンパク質は、炭水化物代謝の制御に関与す
る原核細胞性転写因子である。ＣＡＰタンパク質の機能
は、特に大腸菌について詳しく記載されている。ｃＡＭ
Ｐはその機能のために必要である（Zubay et al., 197
0, PNAS 66(1), 104-110）。特に好適な実施態様におい
て、本発明のベクターにより、発現後にタンパク質の１
８１位でアミノ酸置換を含有する突然変異体を与える、
ある部位でのｃａｐ遺伝子の修飾を有する。特に好適な
実施態様において、突然変異体ＣＡＰｓは、１８１位に
グルタミン酸の代わりにグルタミンを含有する。この突
然変異体は、ＤＮＡに対する結合特異性を緩和し、ＤＮ
Ａ結合能を拡大する。本発明のベクターで形質転換され
る細菌クローンに対して、突然変異ｃａｐ遺伝子の発現
は致死的であるため、これらのクローンは生存すること
ができない。修飾ｃａｐ遺伝子は、アデニル酸シクラー
ゼ−陰性株（ｃｙａ- ）でのみクローン化することがで
きる。ｃＡＭＰが存在する時、修飾ＣＡＰタンパク質
は、まだ詳細が不明な配列への結合のため細菌にとって
は致死的であるため、適当な自殺クローニングベクター
のために使用することができる。
は、修飾された型のカタボライト活性化タンパク質（Ｃ
ＡＰ）をコードする、陽性選択成分として突然変異によ
り修飾されるある型のｃａｐ遺伝子を有することであ
る。ＣＡＰタンパク質は、炭水化物代謝の制御に関与す
る原核細胞性転写因子である。ＣＡＰタンパク質の機能
は、特に大腸菌について詳しく記載されている。ｃＡＭ
Ｐはその機能のために必要である（Zubay et al., 197
0, PNAS 66(1), 104-110）。特に好適な実施態様におい
て、本発明のベクターにより、発現後にタンパク質の１
８１位でアミノ酸置換を含有する突然変異体を与える、
ある部位でのｃａｐ遺伝子の修飾を有する。特に好適な
実施態様において、突然変異体ＣＡＰｓは、１８１位に
グルタミン酸の代わりにグルタミンを含有する。この突
然変異体は、ＤＮＡに対する結合特異性を緩和し、ＤＮ
Ａ結合能を拡大する。本発明のベクターで形質転換され
る細菌クローンに対して、突然変異ｃａｐ遺伝子の発現
は致死的であるため、これらのクローンは生存すること
ができない。修飾ｃａｐ遺伝子は、アデニル酸シクラー
ゼ−陰性株（ｃｙａ- ）でのみクローン化することがで
きる。ｃＡＭＰが存在する時、修飾ＣＡＰタンパク質
は、まだ詳細が不明な配列への結合のため細菌にとって
は致死的であるため、適当な自殺クローニングベクター
のために使用することができる。
【００１７】突然変異により修飾されるすべての型のｃ
ａｐ遺伝子は、これらが、修飾ＤＮＡ結合能も有し、従
ってアデニル酸シクラーゼ陽性宿主細胞に対して致死性
を有する修飾ＣＡＰタンパク質をコードするなら、その
ような応用に使用することができる。
ａｐ遺伝子は、これらが、修飾ＤＮＡ結合能も有し、従
ってアデニル酸シクラーゼ陽性宿主細胞に対して致死性
を有する修飾ＣＡＰタンパク質をコードするなら、その
ような応用に使用することができる。
【００１８】本発明のベクター系の利点は、特にクロー
ニング実験で高率に陽性クローン（予測されるＤＮＡ挿
入体を有する）が得られることである。さらに短いＤＮ
Ａ断片および選択遺伝子と「フレーム内」に存在するＤ
ＮＡ断片をクローニングする時、修飾ｃａｐ遺伝子の致
死性は除去され、すなわち、そのようなＤＮＡ断片は修
飾ＣＡＰ系を用いる時クローン化することができる。さ
らに突然変異ＣＡＰ系を用いる時は、例えばプライマー
設計、誘導（温度移動、ＩＰＴＧ）のような特殊な実験
法、または特殊な培地組成（Ｘ−Ｇａｌ、複合栄養培
地）は必要ではない。本発明のベクターは、オーバーハ
ング末端および平滑末端を介して連結することによりＤ
ＮＡ断片をクローニング（粘着末端および平滑末端連
結）するのに適している。本発明で特に好適なベクター
ｐＣＡＰｓは、特にこれに適している。
ニング実験で高率に陽性クローン（予測されるＤＮＡ挿
入体を有する）が得られることである。さらに短いＤＮ
Ａ断片および選択遺伝子と「フレーム内」に存在するＤ
ＮＡ断片をクローニングする時、修飾ｃａｐ遺伝子の致
死性は除去され、すなわち、そのようなＤＮＡ断片は修
飾ＣＡＰ系を用いる時クローン化することができる。さ
らに突然変異ＣＡＰ系を用いる時は、例えばプライマー
設計、誘導（温度移動、ＩＰＴＧ）のような特殊な実験
法、または特殊な培地組成（Ｘ−Ｇａｌ、複合栄養培
地）は必要ではない。本発明のベクターは、オーバーハ
ング末端および平滑末端を介して連結することによりＤ
ＮＡ断片をクローニング（粘着末端および平滑末端連
結）するのに適している。本発明で特に好適なベクター
ｐＣＡＰｓは、特にこれに適している。
【００１９】本発明のさらなる主題は、本発明のベクタ
ーの生産方法であって、適切に修飾されたｃａｐ遺伝子
を有する本発明のベクターが生成されるように、ｃａｐ
遺伝子を含有するベクターがｃａｐ遺伝子内で修飾され
るか、またはすでに修飾されているｃａｐ遺伝子が適当
なベクターに挿入され、得られるベクターがアデニル酸
シクラーゼ陰性宿主細胞中で得られるかまたはクローン
化される、上記方法を提供する。
ーの生産方法であって、適切に修飾されたｃａｐ遺伝子
を有する本発明のベクターが生成されるように、ｃａｐ
遺伝子を含有するベクターがｃａｐ遺伝子内で修飾され
るか、またはすでに修飾されているｃａｐ遺伝子が適当
なベクターに挿入され、得られるベクターがアデニル酸
シクラーゼ陰性宿主細胞中で得られるかまたはクローン
化される、上記方法を提供する。
【００２０】本発明の方法において、ｃａｐ遺伝子は、
好ましくはＣＡＰタンパク質のアミノ酸１８１のアミノ
酸置換を引き起こす部位で修飾される。特に好適な実施
態様において、この方法でグルタミン酸はグルタミンで
置換される。さらに、ｃａｐ遺伝子の前に強いプロモー
ターを挿入することが特に好ましい。
好ましくはＣＡＰタンパク質のアミノ酸１８１のアミノ
酸置換を引き起こす部位で修飾される。特に好適な実施
態様において、この方法でグルタミン酸はグルタミンで
置換される。さらに、ｃａｐ遺伝子の前に強いプロモー
ターを挿入することが特に好ましい。
【００２１】本発明のさらなる主題は、ＤＮＡ配列は修
飾ｃａｐ遺伝子内のベクターに挿入され、アデニル酸シ
クラーゼ陽性宿主細胞はクローニングのために使用され
る、ＤＮＡ配列のクローニングのための陽性選択ベクタ
ーとしての本発明のベクターの使用である。
飾ｃａｐ遺伝子内のベクターに挿入され、アデニル酸シ
クラーゼ陽性宿主細胞はクローニングのために使用され
る、ＤＮＡ配列のクローニングのための陽性選択ベクタ
ーとしての本発明のベクターの使用である。
【００２２】陽性選択ベクターの選択遺伝子内へＤＮＡ
配列を挿入し、引き続き適当な宿主細胞内でベクターを
複製することによるＤＮＡ配列のクローニング方法もま
た本発明の主題である。この場合、選択ベクターとして
本発明のベクターを使用して、修飾ｃａｐ遺伝子内の適
当な制限切断部位内に、クローン化されるＤＮＡ配列を
挿入し、アデニル酸シクラーゼ陽性宿主細胞中でクロー
ニングを行う。修飾ｃａｐ遺伝子へのＤＮＡ配列の挿入
は、修飾ＣＡＰタンパク質の生成を妨害する。しかし、
修飾ｃａｐ遺伝子は、宿主細胞に致死的作用を及ぼし、
アデニル酸シクラーゼ陽性宿主細胞中のクローニングを
妨害するため、従ってこれらは死滅する。しかし、ＤＮ
Ａ配列の挿入のため、ＣＡＰタンパク質は機能性のある
型では発現されず、これがアデニル酸シクラーゼ陽性宿
主細胞中でクローニングが起きる理由である。従って本
発明では、偽陽性クローンが宿主細胞を死滅させるた
め、偽陽性クローンの生成が避けられる。
配列を挿入し、引き続き適当な宿主細胞内でベクターを
複製することによるＤＮＡ配列のクローニング方法もま
た本発明の主題である。この場合、選択ベクターとして
本発明のベクターを使用して、修飾ｃａｐ遺伝子内の適
当な制限切断部位内に、クローン化されるＤＮＡ配列を
挿入し、アデニル酸シクラーゼ陽性宿主細胞中でクロー
ニングを行う。修飾ｃａｐ遺伝子へのＤＮＡ配列の挿入
は、修飾ＣＡＰタンパク質の生成を妨害する。しかし、
修飾ｃａｐ遺伝子は、宿主細胞に致死的作用を及ぼし、
アデニル酸シクラーゼ陽性宿主細胞中のクローニングを
妨害するため、従ってこれらは死滅する。しかし、ＤＮ
Ａ配列の挿入のため、ＣＡＰタンパク質は機能性のある
型では発現されず、これがアデニル酸シクラーゼ陽性宿
主細胞中でクローニングが起きる理由である。従って本
発明では、偽陽性クローンが宿主細胞を死滅させるた
め、偽陽性クローンの生成が避けられる。
【００２３】本発明の方法は、ＰＣＲ法で製造されるＤ
ＮＡ配列について特に好適に使用される。クローンは好
ましくは、目的のＤＮＡ配列を含有する本発明の方法に
より得られる。さらに、本発明のベクター系およびその
使用についてすでに前述した利点がある。
ＮＡ配列について特に好適に使用される。クローンは好
ましくは、目的のＤＮＡ配列を含有する本発明の方法に
より得られる。さらに、本発明のベクター系およびその
使用についてすでに前述した利点がある。
【００２４】本発明のさらなる主題は、 ａ）本発明のベクター、および ｂ）アデニル酸シクラーゼ陽性宿主細胞、 を含有する、ＤＮＡ配列の選択的クローニングのための
キットである。本発明の試薬キットは、本発明の系と方
法を利用してＤＮＡ配列をクローン化することを可能に
する。この方法においてＰＣＲにより得られるＤＮＡ配
列は、特に好適にクローン化される。
キットである。本発明の試薬キットは、本発明の系と方
法を利用してＤＮＡ配列をクローン化することを可能に
する。この方法においてＰＣＲにより得られるＤＮＡ配
列は、特に好適にクローン化される。
【００２５】本発明の特に好適な実施態様において、試
薬キットは、本発明のベクターの選択遺伝子内にＤＮＡ
配列を挿入するための適当な制限エンドヌクレアーゼを
さらに含有する。
薬キットは、本発明のベクターの選択遺伝子内にＤＮＡ
配列を挿入するための適当な制限エンドヌクレアーゼを
さらに含有する。
【００２６】以下の実施例は、図面とともに本発明をさ
らに詳細に説明する。
らに詳細に説明する。
【００２７】
実施例１ ベクター構築 ｃａｐ遺伝子を、ＥｃｏＲＶ／ＨｉｎｄIIIを用いてベ
クターｐＨＡ７から切断（Aiba et al., 1982, Nucl. A
cids Res. 10, 1345）し、次にベクターｐＥＥ４／Ｓｔ
ｕＩ／ＨｉｎｄIII内にクローン化した。ｃａｐ遺伝子
を、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIIIを用いてこのベクターｐ
ＥＥ４−ＣＡＰから切断し、ｐＵＣ１９／ＥｃｏＲＶＨ
ｉｎｄIII内にクローン化した。次にｃａｐ遺伝子を、
ベクターｐＷＢ１００の合成プロモーターの後ろにクロ
ーン化した（Lehming et al., 1987, EMBO J. 6, 3345-
3353）。このためにｐＵＣ１９−ＣＡＰをＨｉｎｄIII
で直鎖状化し、オーバーハング５’１本鎖末端をＤＮＡ
ポリメラーゼＩのクレノウ断片で充填し、ＣｆｒＩで消
化し、断片を精製し、そしてＣｆｒＩ／ＥｃｏＲＶで切
断したベクターｐＷＢ１００内にクローン化した。こう
してベクターｐＢＧ１が得られる。このベクターを、ｐ
ｉＷｉＴ１０プロモーターから得られる強いプロモータ
ー配列中でクローニングすることによりさらに修飾し
た。得られたベクターはｐＣＡＰである。ベクターｐＣ
ＡＰｓは、アミノ酸１８１位で（グルタミン酸をグルタ
ミンに）ｃａｐ遺伝子を突然変異させることにより得ら
れた
クターｐＨＡ７から切断（Aiba et al., 1982, Nucl. A
cids Res. 10, 1345）し、次にベクターｐＥＥ４／Ｓｔ
ｕＩ／ＨｉｎｄIII内にクローン化した。ｃａｐ遺伝子
を、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIIIを用いてこのベクターｐ
ＥＥ４−ＣＡＰから切断し、ｐＵＣ１９／ＥｃｏＲＶＨ
ｉｎｄIII内にクローン化した。次にｃａｐ遺伝子を、
ベクターｐＷＢ１００の合成プロモーターの後ろにクロ
ーン化した（Lehming et al., 1987, EMBO J. 6, 3345-
3353）。このためにｐＵＣ１９−ＣＡＰをＨｉｎｄIII
で直鎖状化し、オーバーハング５’１本鎖末端をＤＮＡ
ポリメラーゼＩのクレノウ断片で充填し、ＣｆｒＩで消
化し、断片を精製し、そしてＣｆｒＩ／ＥｃｏＲＶで切
断したベクターｐＷＢ１００内にクローン化した。こう
してベクターｐＢＧ１が得られる。このベクターを、ｐ
ｉＷｉＴ１０プロモーターから得られる強いプロモータ
ー配列中でクローニングすることによりさらに修飾し
た。得られたベクターはｐＣＡＰである。ベクターｐＣ
ＡＰｓは、アミノ酸１８１位で（グルタミン酸をグルタ
ミンに）ｃａｐ遺伝子を突然変異させることにより得ら
れた
【００２８】実施例２ ＤＮＡ断片のクローニング
【００２９】一般的方法：形質転換のためのコンピテン
ト大腸菌細胞（例えば、大腸菌ＪＭ８３、ＸＬ１−Ｂｌ
ｕｅ、ＤＨ５α、ＢＭＨ８１１７）の生産並びに細胞の
形質転換は、標準的方法（Hanahan, 1983, J. Mol. Bio
l. 166, 557-580）に従って行った。大腸菌ＸＬ１−Ｂ
ｌｕｅ ＭＲＦ’ｋａｎ（ストラタジーン（Stratagen
e））のような市販のコンピテント細胞を、クローニン
グに使用した。細胞を、アンピシリン（１００−２００
μg/ml）含有ＬＢ培地に蒔いた。
ト大腸菌細胞（例えば、大腸菌ＪＭ８３、ＸＬ１−Ｂｌ
ｕｅ、ＤＨ５α、ＢＭＨ８１１７）の生産並びに細胞の
形質転換は、標準的方法（Hanahan, 1983, J. Mol. Bio
l. 166, 557-580）に従って行った。大腸菌ＸＬ１−Ｂ
ｌｕｅ ＭＲＦ’ｋａｎ（ストラタジーン（Stratagen
e））のような市販のコンピテント細胞を、クローニン
グに使用した。細胞を、アンピシリン（１００−２００
μg/ml）含有ＬＢ培地に蒔いた。
【００３０】制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡ（ベ
クターまたはＤＮＡ断片）の切断は、各製造業者の説明
書に従って行った。
クターまたはＤＮＡ断片）の切断は、各製造業者の説明
書に従って行った。
【００３１】直鎖状化したベクターおよびＤＮＡ断片の
連結は、標準的方法（Maniatis, etal., 1982, Molecul
ar Cloning. A laboratory manual, コールドスプリン
グハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor L
aboratory Press）、コールドスプリングハーバー（Col
d Spring Harbor）、ニューヨーク）に従って行った。
このために市販のキットも使用した（例えば、迅速連結
キット、ベーリンガーマンハイム（Boehringer-Mannhei
m））。
連結は、標準的方法（Maniatis, etal., 1982, Molecul
ar Cloning. A laboratory manual, コールドスプリン
グハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor L
aboratory Press）、コールドスプリングハーバー（Col
d Spring Harbor）、ニューヨーク）に従って行った。
このために市販のキットも使用した（例えば、迅速連結
キット、ベーリンガーマンハイム（Boehringer-Mannhei
m））。
【００３２】ＰＣＲによるＤＮＡの増幅は、製造業者の
説明書に従って適当なＤＮＡポリメラーゼで行った。
説明書に従って適当なＤＮＡポリメラーゼで行った。
【００３３】平滑末端クローニングの例：ベクターｐＣ
ＡＰｓを、製造業者の説明書に従って制限酵素ＢａｌＩ
で消化して直鎖状化した。この直鎖状化プラスミド（５
ng）を、１０倍モル過剰のベクターｐｉＷｉＴ１０ＷＬ
１（von Wilcken-Bergmann et al., 1986, EMBO J. 5(1
2), 3219-3235）の０．２５kb長の単離したＳｔｕＩ断
片と連結した。次にこれを用いて大腸菌ＤＨ５αのコン
ピテント細胞を形質転換し、ＬＢ培地に蒔き、３７℃で
一晩インキュベートした。各場合に得られたクローンか
ら５mlの培養物をとり、一晩増殖させ、これらのプラス
ミド調製物を調製した。プラスミドを同定するために酵
素ＸｂａＩ／ＳｐｈＩによる制限切断を行った。ここで
記載した例では、１０２個の試験したクローンの解析か
ら、挿入体を有する９２個のクローンが得られた。
ＡＰｓを、製造業者の説明書に従って制限酵素ＢａｌＩ
で消化して直鎖状化した。この直鎖状化プラスミド（５
ng）を、１０倍モル過剰のベクターｐｉＷｉＴ１０ＷＬ
１（von Wilcken-Bergmann et al., 1986, EMBO J. 5(1
2), 3219-3235）の０．２５kb長の単離したＳｔｕＩ断
片と連結した。次にこれを用いて大腸菌ＤＨ５αのコン
ピテント細胞を形質転換し、ＬＢ培地に蒔き、３７℃で
一晩インキュベートした。各場合に得られたクローンか
ら５mlの培養物をとり、一晩増殖させ、これらのプラス
ミド調製物を調製した。プラスミドを同定するために酵
素ＸｂａＩ／ＳｐｈＩによる制限切断を行った。ここで
記載した例では、１０２個の試験したクローンの解析か
ら、挿入体を有する９２個のクローンが得られた。
【００３４】粘着末端クローニングの例：ベクターｐＣ
ＡＰｓを、製造業者の説明書に従って制限酵素ＰｓｔＩ
で消化して直鎖状化する。この直鎖状化プラスミド（５
ng）を、１０倍モル過剰のベクターｐｉＷｉＴ１０ＷＬ
１（von Wilcken-Bergmann et al., 1986, EMBO J. 5(1
2), 3219-3235）の０．２５kb長の単離したＰｓｔＩ断
片と連結する。次にこれを用いて大腸菌ＤＨ５αのコン
ピテント細胞を形質転換し、ＬＢ培地に蒔き、３７℃で
一晩インキュベートする。各場合に得られたクローンか
ら５mlの培養物をとり、一晩増殖させ、これらのプラス
ミド調製物を調製する。プラスミドを同定するために酵
素ＸｂａＩ／ＳｔｕＩによる制限切断を行う。ここで記
載する例では、１０８個の試験したクローンの解析か
ら、挿入体を有する１００個のクローンが得られた。
ＡＰｓを、製造業者の説明書に従って制限酵素ＰｓｔＩ
で消化して直鎖状化する。この直鎖状化プラスミド（５
ng）を、１０倍モル過剰のベクターｐｉＷｉＴ１０ＷＬ
１（von Wilcken-Bergmann et al., 1986, EMBO J. 5(1
2), 3219-3235）の０．２５kb長の単離したＰｓｔＩ断
片と連結する。次にこれを用いて大腸菌ＤＨ５αのコン
ピテント細胞を形質転換し、ＬＢ培地に蒔き、３７℃で
一晩インキュベートする。各場合に得られたクローンか
ら５mlの培養物をとり、一晩増殖させ、これらのプラス
ミド調製物を調製する。プラスミドを同定するために酵
素ＸｂａＩ／ＳｔｕＩによる制限切断を行う。ここで記
載する例では、１０８個の試験したクローンの解析か
ら、挿入体を有する１００個のクローンが得られた。
【００３５】ＰＣＲ産物のクローニングの例：ラムダＤ
ＮＡから０．５kbの断片を増幅してＰＣＲ産物を生産し
た。種々のポリメラーゼおよびその混合物を、増幅のた
めに使用した。この場合、３’−５’エキソヌクレアー
ゼ活性のないポリメラーゼ（ＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼ）、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリ
メラーゼ（ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ）並びにこれらの
２つのポリメラーゼの混合物（拡大高忠実度（Expand H
igh Fidelity）ＰＣＲ系）を使用した。
ＮＡから０．５kbの断片を増幅してＰＣＲ産物を生産し
た。種々のポリメラーゼおよびその混合物を、増幅のた
めに使用した。この場合、３’−５’エキソヌクレアー
ゼ活性のないポリメラーゼ（ＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼ）、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリ
メラーゼ（ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ）並びにこれらの
２つのポリメラーゼの混合物（拡大高忠実度（Expand H
igh Fidelity）ＰＣＲ系）を使用した。
【００３６】ＰＣＲに使用したプロモーターは以下の配
列を有する： 前進プライマー：5'-GAT GAG TTC GTG TCC GTA CAA CT-
3 逆プライマー：5'-GGT TAT CGA AAT CAG CCA CAG CG-3
列を有する： 前進プライマー：5'-GAT GAG TTC GTG TCC GTA CAA CT-
3 逆プライマー：5'-GGT TAT CGA AAT CAG CCA CAG CG-3
【００３７】ＰＣＲ条件は、以下の通りであった： １ngのラムダＤＮＡ ２０μMのプライマー（前進、逆） ０．２mMのｄＮＴＰ １０μlのＰＣＲ緩衝液（おのおのの使用されるポリメ
ラーゼに適したもの）。
ラーゼに適したもの）。
【００３８】各場合に以下のポリメラーゼを使用した： ２．５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ ２．５単位のＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ １．７５単位の拡大高忠実度（Expand High Fidelity）
ＰＣＲ系 再蒸留水で１００μlにした
ＰＣＲ系 再蒸留水で１００μlにした
【００３９】サイクル条件は以下の通りであった： ９５℃で２分：９４℃で１分、５０℃で１分、７２℃で
３分を２５サイクル；７２℃で４分。
３分を２５サイクル；７２℃で４分。
【００４０】ＰＣＲ断片は増幅後精製した（高純度ＰＣ
Ｒ産物精製キット（High Pure PCRProduct Purificatio
n Kit）、ベーリンガーマンハイム（Boehringer-Mannhe
im））。
Ｒ産物精製キット（High Pure PCRProduct Purificatio
n Kit）、ベーリンガーマンハイム（Boehringer-Mannhe
im））。
【００４１】連結には０．１〜１０ngのベクター（Ｂａ
ｌＩで直鎖状化した）、典型的には１ngを使用した。１
０〜５００ngの精製ＰＣＲ断片を使用し、典型的な実験
では１００〜４００ngを使用した。連結はラピッドライ
ゲーションキット（Rapid Ligation Kit）を用いて行っ
た。連結調製物の１／１０量（０．１ngのベクター）を
以後の形質転換に使用した。４０μlのコンピテント細
胞（大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ ｋａｎ）を、製
造業者の説明書に従って使用した（総量４００μl）。
形質転換した細胞１００μlをＬＢプレート（アンピシ
リン、１００μg/ml）に蒔き、３７℃で一晩インキュベ
ートした。得られたクローンをＬＢ培地（アンピシリン
１５０μg/ml）で３７℃で一晩培養した。プラスミドＤ
ＮＡを標準的方法（Maniatis, et al., 1982, Molecula
r Cloning. A laboratory manual,コールドスプリング
ハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Lab
oratory Press）、コールドスプリングハーバー（Cold
Spring Harbor）、ニューヨーク）に従って単離した。
単離したプラスミドを、ＡｃｃＩを用いる制限切断によ
り解析した。典型的な実験の結果を表１に示す：
ｌＩで直鎖状化した）、典型的には１ngを使用した。１
０〜５００ngの精製ＰＣＲ断片を使用し、典型的な実験
では１００〜４００ngを使用した。連結はラピッドライ
ゲーションキット（Rapid Ligation Kit）を用いて行っ
た。連結調製物の１／１０量（０．１ngのベクター）を
以後の形質転換に使用した。４０μlのコンピテント細
胞（大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ ｋａｎ）を、製
造業者の説明書に従って使用した（総量４００μl）。
形質転換した細胞１００μlをＬＢプレート（アンピシ
リン、１００μg/ml）に蒔き、３７℃で一晩インキュベ
ートした。得られたクローンをＬＢ培地（アンピシリン
１５０μg/ml）で３７℃で一晩培養した。プラスミドＤ
ＮＡを標準的方法（Maniatis, et al., 1982, Molecula
r Cloning. A laboratory manual,コールドスプリング
ハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Lab
oratory Press）、コールドスプリングハーバー（Cold
Spring Harbor）、ニューヨーク）に従って単離した。
単離したプラスミドを、ＡｃｃＩを用いる制限切断によ
り解析した。典型的な実験の結果を表１に示す：
【表１】 ──────────────────────────────────── pCAPs ＰＣＲ断片 コロニー/プレート 陽性クローン／ (連結中の (使用した 解析したクローン ベクター） ポリメラーゼ） ──────────────────────────────────── １ ng 400 ng 2 2/2 (Taq DNA pol.) １ ng 100 ng 4 3/4 (Taq DNA pol.) １ ng 400 ng 62 18/18 (Pwo DNA pol.) １ ng 100 ng 193 48/48 (Pwo DNA pol.) １ ng 400 ng 9 9/9 (Expand High Fid.) １ ng 100 ng 10 7/10 (Expand High Fid.) ────────────────────────────────────
【００４２】ベクターｐＣＡＰｓは、得られたクローン
の数が多いことと陽性クローンの比率が高い（示した例
では１００％）ため、ＰＣＲ断片（これは例えばＰｗｏ
ＤＮＡポリメラーゼにより生産される）の平滑末端クロ
ーニングに特に適している。
の数が多いことと陽性クローンの比率が高い（示した例
では１００％）ため、ＰＣＲ断片（これは例えばＰｗｏ
ＤＮＡポリメラーゼにより生産される）の平滑末端クロ
ーニングに特に適している。
【００４３】高率の陽性クローンは、連結反応物中で挿
入体／ベクター比が高いなら、ポリメラーゼの混合物
（拡大高忠実度ＰＣＲ系）を用いて生産されるＰＣＲ断
片がクローン化される時、得られる。
入体／ベクター比が高いなら、ポリメラーゼの混合物
（拡大高忠実度ＰＣＲ系）を用いて生産されるＰＣＲ断
片がクローン化される時、得られる。
【００４４】ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて生産さ
れているＰＣＲ断片をクローニングする時、数は少ない
がいくつかのクローンを得ることもできる。この場合、
ＡオーバーハングのないＴａｑＤＮＡポリメラーゼのＰ
ＣＲ産物が連結される。
れているＰＣＲ断片をクローニングする時、数は少ない
がいくつかのクローンを得ることもできる。この場合、
ＡオーバーハングのないＴａｑＤＮＡポリメラーゼのＰ
ＣＲ産物が連結される。
【００４５】この意味で、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを
用いて生産されているＰＣＲ断片のクローニングの効率
は、以後のいわゆるＰＣＲ産物のポリッシング（plishi
ng）により改良することができることは公知である（ポ
リメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性による
Ａオーバーハングの分解；Costa & Weiner, 1994, Nuc
l. Acids Res. 22(12), 2423）。
用いて生産されているＰＣＲ断片のクローニングの効率
は、以後のいわゆるＰＣＲ産物のポリッシング（plishi
ng）により改良することができることは公知である（ポ
リメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性による
Ａオーバーハングの分解；Costa & Weiner, 1994, Nuc
l. Acids Res. 22(12), 2423）。
【００４６】実施例３ 精製していないＰＣＲ産物のクローニングの例
【００４７】精製したＰＣＲ産物のクローニング以外
に、精製していないＰＣＲ産物もクローン化した。すな
わち、ＰＣＲ混合物のアリコートを直接連結反応に使用
した。このためにラムダＤＮＡからの０．５kb断片を増
幅することによりＰｗｏＤＮＡポリメラーゼを用いて平
滑末端ＰＣＲ産物を生産した。
に、精製していないＰＣＲ産物もクローン化した。すな
わち、ＰＣＲ混合物のアリコートを直接連結反応に使用
した。このためにラムダＤＮＡからの０．５kb断片を増
幅することによりＰｗｏＤＮＡポリメラーゼを用いて平
滑末端ＰＣＲ産物を生産した。
【００４８】ＰＣＲに使用したプロモーターは以下の配
列を有する： 前進プライマー：5'-GAT GAG TTC GTG TCC GTA CAA CT-
3 逆プライマー：5'-GGT TAT CGA AAT CAG CCA CAG CG-3
列を有する： 前進プライマー：5'-GAT GAG TTC GTG TCC GTA CAA CT-
3 逆プライマー：5'-GGT TAT CGA AAT CAG CCA CAG CG-3
【００４９】ＰＣＲ条件は、以下の通りであった： １ngのラムダＤＮＡ ２０μMのプライマー（前進、逆） ０．２mMのｄＮＴＰ １０μlのＰＣＲ緩衝液（おのおのの使用されるポリメ
ラーゼに適したもの） ２．５単位のＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ。 再蒸留水で１００μlにした
ラーゼに適したもの） ２．５単位のＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ。 再蒸留水で１００μlにした
【００５０】サイクル条件は以下の通りであった： ９５℃で２分：９４℃で１分、５０℃で１分、７２℃で
３分を２５サイクル；７２℃で４分。
３分を２５サイクル；７２℃で４分。
【００５１】以後の連結はラピッドライゲーションキッ
ト（Rapid Ligation Kit）（ベーリンガーマンハイム
（Boehringer-Mannheim）、注文番号１６３５−３７
９）のプロトコールに従って行った。連結には０．１〜
１０ngのベクター（Ｍｌｕ ＮＩで直鎖状化した）、そ
して典型的には１ngを使用した。増幅後の連結には、Ｐ
ＣＲ断片を精製しないで使用した。連結には１〜５μl
のＰＣＲ混合物を使用した（典型的には１μl）。連結
調製物の１／１０量（０．１ngのベクター）を以後の形
質転換に使用した。４０μlのコンピテント細胞（大腸
菌ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’ｋａｎ、ストラタジーン
（Stratagene））を、製造業者の説明書に従って使用し
た（総量４００μl）。形質転換した細胞１００μlをＬ
Ｂプレート（アンピシリン、１００μg/ml）に蒔き、３
７℃で一晩インキュベートした。得られたクローンをＬ
Ｂ培地（アンピシリン１５０μg/ml）で３７℃で一晩培
養した。プラスミドＤＮＡを標準的方法（Maniatis, et
al., 1982, Molecular Cloning. A laboratory manua
l, コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（C
old Spring Harbor Laboratory Press）、コールドスプ
リングハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨー
ク）に従って単離した。単離したプラスミドを、Ａｃｃ
Ｉを用いる制限切断と次のアガロースゲル電気泳動によ
り解析した。この場合、解析したクローンの＞９５％
（９６のうち９２）は、挿入体として０．５kbのＰＣＲ
断片を示した。
ト（Rapid Ligation Kit）（ベーリンガーマンハイム
（Boehringer-Mannheim）、注文番号１６３５−３７
９）のプロトコールに従って行った。連結には０．１〜
１０ngのベクター（Ｍｌｕ ＮＩで直鎖状化した）、そ
して典型的には１ngを使用した。増幅後の連結には、Ｐ
ＣＲ断片を精製しないで使用した。連結には１〜５μl
のＰＣＲ混合物を使用した（典型的には１μl）。連結
調製物の１／１０量（０．１ngのベクター）を以後の形
質転換に使用した。４０μlのコンピテント細胞（大腸
菌ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’ｋａｎ、ストラタジーン
（Stratagene））を、製造業者の説明書に従って使用し
た（総量４００μl）。形質転換した細胞１００μlをＬ
Ｂプレート（アンピシリン、１００μg/ml）に蒔き、３
７℃で一晩インキュベートした。得られたクローンをＬ
Ｂ培地（アンピシリン１５０μg/ml）で３７℃で一晩培
養した。プラスミドＤＮＡを標準的方法（Maniatis, et
al., 1982, Molecular Cloning. A laboratory manua
l, コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（C
old Spring Harbor Laboratory Press）、コールドスプ
リングハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨー
ク）に従って単離した。単離したプラスミドを、Ａｃｃ
Ｉを用いる制限切断と次のアガロースゲル電気泳動によ
り解析した。この場合、解析したクローンの＞９５％
（９６のうち９２）は、挿入体として０．５kbのＰＣＲ
断片を示した。
【発明の効果】本発明により、その機能的発現が外来遺
伝子の挿入により妨害される選択遺伝子内に適当な制限
切断部位を含有するベクターで形質転換された宿主細胞
中に、ＤＮＡ配列をクローニングするための陽性選択可
能性を有するベクターが提供される。
伝子の挿入により妨害される選択遺伝子内に適当な制限
切断部位を含有するベクターで形質転換された宿主細胞
中に、ＤＮＡ配列をクローニングするための陽性選択可
能性を有するベクターが提供される。
【図１】突然変異されたｃａｐ遺伝子のＤＮＡ配列とア
ミノ酸配列を示す図である。
ミノ酸配列を示す図である。
【図２】ベクターｐＣＡＰｓの図である。
【図３】ｐＣＡＰｓのプロモーター配列を示す図であ
る。
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 マンフレッド シュミット ドイツ連邦共和国 ディー−82377 ペン ツバーグ ヴァクセンスタイナーシュトラ ーセ 27 (72)発明者 ブリジット フォン ヴィルケン−バーグ マン ドイツ連邦共和国 ディー−50733 ケル ン， マウエンハイマー シュトラーセ 70 (72)発明者 ベノ ミューラー−ヒル ドイツ連邦共和国 ディー−50674 ケル ン， ヘンデルシュトラーセ 53
Claims (14)
- 【請求項１】 その機能的発現が外来遺伝子の挿入によ
り妨害される選択遺伝子内に適当な制限切断部位を含有
するベクターで形質転換された宿主細胞中に、ＤＮＡ配
列をクローニングするための陽性選択可能性を有するベ
クターであって、その発現がアデニル酸シクラーゼ陽性
宿主細胞にとって致死的である修飾ＤＮＡ結合特異性を
有するＣＡＰタンパク質をコードする選択遺伝子として
修飾ｃａｐ遺伝子を含有する、上記ベクター。 - 【請求項２】 ＣＡＰ遺伝子の修飾により、ＣＡＰタン
パク質のアミノ酸１８１のアミノ酸置換が起きる、請求
項１記載のベクター。 - 【請求項３】 ＣＡＰタンパク質は、アミノ酸１８１と
してグルタミンを含有する、請求項２記載のベクター。 - 【請求項４】 選択遺伝子の前に転写の方向にプロモー
ターを含有する、請求項１〜３までのいずれか１項に記
載のベクター。 - 【請求項５】 ベクターｐＣＡＰｓ。
- 【請求項６】 請求項１〜５までのいずれか１項に記載
のベクターの生産方法であって、ｃａｐ遺伝子を含有す
るベクターがｃａｐ遺伝子内で修飾されるか、またはす
でに修飾されているｃａｐ遺伝子が適当なベクターに挿
入され、そしてベクターがアデニル酸シクラーゼ陰性宿
主細胞中で複製または発現される、上記方法。 - 【請求項７】 ｃａｐ遺伝子が、ＣＡＰタンパク質のア
ミノ酸１８１のアミノ酸置換が起きる位置で修飾され
る、請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 グルタミン酸がグルタミンで置換され
る、請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 ｃａｐ遺伝子の前に強いプロモーターが
挿入される、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項１０】 ＤＮＡ配列のクローニングのための陽
性選択ベクターとしての請求項１〜５までのいずれか１
項に記載のベクターの使用であって、ＤＮＡ配列は修飾
ｃａｐ遺伝子内のベクターに挿入され、アデニル酸シク
ラーゼ陽性宿主細胞はクローニングのために使用され
る、上記使用。 - 【請求項１１】 陽性選択ベクターの選択遺伝子内への
ＤＮＡ配列の挿入と、引き続く適当な宿主細胞内でのベ
クターの複製とによるＤＮＡ配列のクローニング方法で
あって、請求項１〜５のいずれか１項に記載のベクター
を選択ベクターとして使用し、修飾ｃａｐ遺伝子内の適
当な制限切断部位内にＤＮＡ配列を挿入し、アデニル酸
シクラーゼ陽性宿主細胞中でクローニングを行うことを
特徴とする上記方法。 - 【請求項１２】 ＤＮＡ配列はＰＣＲにより生産され
る、請求項１２記載の方法。 - 【請求項１３】 ａ）請求項１〜５までのいずれか１項
に記載のベクター、 ｂ）アデニル酸シクラーゼ陽性宿主細胞、 を含有する、ＤＮＡ配列、特に、ＰＣＲにより得られる
ＤＮＡ配列の選択的クローニングのためのキット。 - 【請求項１４】 ベクターの選択遺伝子内にＤＮＡ配列
を挿入するための適当な制限エンドヌクレアーゼをさら
に含有する、請求項１３記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19630617A DE19630617A1 (de) | 1996-07-29 | 1996-07-29 | Positiver Selektionsvektor auf Basis des caps-Gens, pCAPs-Vektor und seine Verwendung |
| DE19630617:5 | 1996-07-29 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1084980A true JPH1084980A (ja) | 1998-04-07 |
Family
ID=7801206
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9203381A Pending JPH1084980A (ja) | 1996-07-29 | 1997-07-29 | ｃａｐｓ遺伝子上の陽性選択ベクターであるｐＣＡＰｓ ベクターとその使用 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5891687A (ja) |
| EP (1) | EP0822258A3 (ja) |
| JP (1) | JPH1084980A (ja) |
| DE (1) | DE19630617A1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021509574A (ja) * | 2018-11-29 | 2021-04-01 | シージェイ チェイルジェダン コーポレーションＣｊ Ｃｈｅｉｌｊｅｄａｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | Ｃａｍｐ受容タンパク質変異体及びそれを用いたｌ−アミノ酸の製造方法 |
| JP2021509573A (ja) * | 2018-11-29 | 2021-04-01 | シージェイ チェイルジェダン コーポレーションＣｊ Ｃｈｅｉｌｊｅｄａｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | Ｃａｍｐ受容タンパク質変異体及びそれを用いたｌ−アミノ酸の製造方法 |
| US11697673B2 (en) | 2018-11-29 | 2023-07-11 | Cj Cheiljedang Corporation | Camp receptor protein variant and method of producing L-amino acid using the same |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6589738B1 (en) * | 1999-11-09 | 2003-07-08 | Elitra Pharmaceuticals, Inc. | Genes essential for microbial proliferation and antisense thereto |
| US6544782B1 (en) * | 2000-11-13 | 2003-04-08 | Synthegen Systems | pREM: a positive selection vector system for direct PCR cloning |
| US6566067B2 (en) * | 2001-02-14 | 2003-05-20 | Synthegen Systems, Inc. | High fidelity PCR cloning |
| KR100812110B1 (ko) * | 2006-10-24 | 2008-03-12 | 한국과학기술원 | 징크 핑거 단백질과 원핵 생물의 전사 인자를 포함하는인공 전사 인자의 제조 및 이의 이용 |
-
1996
- 1996-07-29 DE DE19630617A patent/DE19630617A1/de not_active Withdrawn
-
1997
- 1997-07-14 US US08/892,272 patent/US5891687A/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-07-28 EP EP97112965A patent/EP0822258A3/de not_active Withdrawn
- 1997-07-29 JP JP9203381A patent/JPH1084980A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021509574A (ja) * | 2018-11-29 | 2021-04-01 | シージェイ チェイルジェダン コーポレーションＣｊ Ｃｈｅｉｌｊｅｄａｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | Ｃａｍｐ受容タンパク質変異体及びそれを用いたｌ−アミノ酸の製造方法 |
| JP2021509573A (ja) * | 2018-11-29 | 2021-04-01 | シージェイ チェイルジェダン コーポレーションＣｊ Ｃｈｅｉｌｊｅｄａｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | Ｃａｍｐ受容タンパク質変異体及びそれを用いたｌ−アミノ酸の製造方法 |
| US11473113B2 (en) | 2018-11-29 | 2022-10-18 | Cj Cheiljedang Corporation | cAMP receptor protein variant, coding sequence and method of producing L-amino acid using the same |
| US11512331B2 (en) | 2018-11-29 | 2022-11-29 | Cj Cheiljedang Corporation | cAMP receptor protein variant and method of producing L-amino acid using the same |
| US11697673B2 (en) | 2018-11-29 | 2023-07-11 | Cj Cheiljedang Corporation | Camp receptor protein variant and method of producing L-amino acid using the same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5891687A (en) | 1999-04-06 |
| EP0822258A3 (de) | 2002-01-02 |
| EP0822258A2 (de) | 1998-02-04 |
| DE19630617A1 (de) | 1998-02-05 |
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