JPH1084994A - トレハロースの酵素的測定方法およびトレハロース分析用試薬 - Google Patents
トレハロースの酵素的測定方法およびトレハロース分析用試薬Info
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- JPH1084994A JPH1084994A JP24511396A JP24511396A JPH1084994A JP H1084994 A JPH1084994 A JP H1084994A JP 24511396 A JP24511396 A JP 24511396A JP 24511396 A JP24511396 A JP 24511396A JP H1084994 A JPH1084994 A JP H1084994A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 トレハロース含有検体中に混在するグル
コースを、ムタロターゼ、グルコースオキシダーゼおよ
びカタラーゼを使用してトレハロースの酵素的定量反応
に影響を与えないように前処理した後、前記カタラーゼ
の活性をアジ化ナトリウムにより阻害するとともに、検
体中のトレハロースをトレハロースホスホリラーゼによ
り分解し、生成したグルコースをグルコースオキシダー
ゼを用いて定量することを特徴とするトレハロースの酵
素的測定方法。 【効果】 被検液中に存在する、測定ブランクを大きく
し、トレハロースの酵素的測定の妨げとなるグルコース
による影響を消去でき、ブランク測定を行うことなく、
簡便にかつ正確にトレハロースの測定を行うことができ
る。
コースを、ムタロターゼ、グルコースオキシダーゼおよ
びカタラーゼを使用してトレハロースの酵素的定量反応
に影響を与えないように前処理した後、前記カタラーゼ
の活性をアジ化ナトリウムにより阻害するとともに、検
体中のトレハロースをトレハロースホスホリラーゼによ
り分解し、生成したグルコースをグルコースオキシダー
ゼを用いて定量することを特徴とするトレハロースの酵
素的測定方法。 【効果】 被検液中に存在する、測定ブランクを大きく
し、トレハロースの酵素的測定の妨げとなるグルコース
による影響を消去でき、ブランク測定を行うことなく、
簡便にかつ正確にトレハロースの測定を行うことができ
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、被検液中のトレハ
ロースを酵素的に定量する反応系において、該被検液中
に原始的に含まれるグルコースの定量を別個行うことな
く、簡便にかつ正確に測定を行うことのできるトレハロ
ースの酵素的測定方法に関する。
ロースを酵素的に定量する反応系において、該被検液中
に原始的に含まれるグルコースの定量を別個行うことな
く、簡便にかつ正確に測定を行うことのできるトレハロ
ースの酵素的測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来より、トレハロースの定量方法につ
いては幾つかの方法が知られている。その一つは、アン
スロン法等で全糖量を測定するとともに、グルコース等
の還元糖の量をネルソン法などで測定し、その還元糖の
量を全糖量から差引くことで非還元糖たるトレハロース
の測定を行う方法である。しかし、非還元糖はトレハロ
ース以外にもあり（例えば、シュークロース）、全糖量
から還元糖量を差し引いても正確なトレハロースの定量
はできない。また、測定工程が非常に繁雑であり、時間
と労力を要するばかりでなく、誤差も生じやすい。
いては幾つかの方法が知られている。その一つは、アン
スロン法等で全糖量を測定するとともに、グルコース等
の還元糖の量をネルソン法などで測定し、その還元糖の
量を全糖量から差引くことで非還元糖たるトレハロース
の測定を行う方法である。しかし、非還元糖はトレハロ
ース以外にもあり（例えば、シュークロース）、全糖量
から還元糖量を差し引いても正確なトレハロースの定量
はできない。また、測定工程が非常に繁雑であり、時間
と労力を要するばかりでなく、誤差も生じやすい。
【０００３】他の方法として、高速液体クロマトグラフ
ィーによる定量方法が挙げられるが、１検体の測定に長
時間を要し、多数の検体を短時間で測定するのには適さ
ないといった欠点、さらにはトレハロースを含んだ未知
の検体を測定する際に、トレハロースと同じ保持時間を
有する物質が含まれていた場合には、正しい測定値が得
られないといった欠点がある。
ィーによる定量方法が挙げられるが、１検体の測定に長
時間を要し、多数の検体を短時間で測定するのには適さ
ないといった欠点、さらにはトレハロースを含んだ未知
の検体を測定する際に、トレハロースと同じ保持時間を
有する物質が含まれていた場合には、正しい測定値が得
られないといった欠点がある。
【０００４】また別の方法として、トレハラーゼを用い
た酵素的定量方法が知られている。この方法は、トレハ
ロースをトレハラーゼで処理することにより２分子のグ
ルコースに分解し、生成したグルコースを定量するとい
った原理に基づくものである。しかし、被検体中にトレ
ハロースの他にグルコースが当初から含まれている場合
には、そのグルコースの量だけを別に測定しておき、そ
の分を全グルコース量から差引く必要があり、工程が繁
雑であるとともに誤差要因も多いという欠点がある。
た酵素的定量方法が知られている。この方法は、トレハ
ロースをトレハラーゼで処理することにより２分子のグ
ルコースに分解し、生成したグルコースを定量するとい
った原理に基づくものである。しかし、被検体中にトレ
ハロースの他にグルコースが当初から含まれている場合
には、そのグルコースの量だけを別に測定しておき、そ
の分を全グルコース量から差引く必要があり、工程が繁
雑であるとともに誤差要因も多いという欠点がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、被検
液中のトレハロースを酵素的に定量する方法において、
該被検液中に原始的に含まれるグルコースの定量を別個
行うことなく、簡便かつ正確に複数の検体の同時定量が
可能なトレハロースの酵素的測定方法を提供することで
ある。
液中のトレハロースを酵素的に定量する方法において、
該被検液中に原始的に含まれるグルコースの定量を別個
行うことなく、簡便かつ正確に複数の検体の同時定量が
可能なトレハロースの酵素的測定方法を提供することで
ある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記課題に鑑み鋭意研究
の結果、本発明者らは、被検液中に存在するグルコース
を前もって消去してから、トレハロースホスホリラーゼ
によりトレハロースを分解し、生成したグルコースをグ
ルコースオキシダーゼによって定量すれば、１検体につ
き２回以上の測定を行う必要がなく、簡便かつ正確にト
レハロースの測定を行うことができることを見出し、本
発明を完成した。
の結果、本発明者らは、被検液中に存在するグルコース
を前もって消去してから、トレハロースホスホリラーゼ
によりトレハロースを分解し、生成したグルコースをグ
ルコースオキシダーゼによって定量すれば、１検体につ
き２回以上の測定を行う必要がなく、簡便かつ正確にト
レハロースの測定を行うことができることを見出し、本
発明を完成した。
【０００７】すなわち、本発明は、トレハロース含有検
体中に混在するグルコースを、ムタロターゼ、グルコー
スオキシダーゼおよびカタラーゼを使用してトレハロー
スの酵素的定量反応に影響を与えないように前処理した
後、前記カタラーゼの活性をアジ化ナトリウムにより阻
害するとともに、検体中のトレハロースをトレハロース
ホスホリラーゼにより分解し、生成したグルコースをグ
ルコースオキシダーゼを用いて定量することを特徴とす
るトレハロースの酵素的測定方法である。
体中に混在するグルコースを、ムタロターゼ、グルコー
スオキシダーゼおよびカタラーゼを使用してトレハロー
スの酵素的定量反応に影響を与えないように前処理した
後、前記カタラーゼの活性をアジ化ナトリウムにより阻
害するとともに、検体中のトレハロースをトレハロース
ホスホリラーゼにより分解し、生成したグルコースをグ
ルコースオキシダーゼを用いて定量することを特徴とす
るトレハロースの酵素的測定方法である。
【０００８】また、本発明は、少なくともムタロター
ゼ、グルコースオキシダーゼおよびカタラーゼを含有す
るグルコース消去前処理試薬と、少なくともトレハロー
スホスホリラーゼ、アジ化ナトリウム、ペルオキシダー
ゼ、4-アミノアンチピリンおよび水素供与体を含有する
生成グルコース検出試薬との組み合わせからなる、トレ
ハロース分析用試薬またはトレハロース合成酵素生産微
生物の検索用試薬である。
ゼ、グルコースオキシダーゼおよびカタラーゼを含有す
るグルコース消去前処理試薬と、少なくともトレハロー
スホスホリラーゼ、アジ化ナトリウム、ペルオキシダー
ゼ、4-アミノアンチピリンおよび水素供与体を含有する
生成グルコース検出試薬との組み合わせからなる、トレ
ハロース分析用試薬またはトレハロース合成酵素生産微
生物の検索用試薬である。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において測定対象となり得るトレハロース含有検
体（被検液）としては、トレハロース生産能を有する微
生物のスクリーニングのための反応液や、微生物菌体、
動物組織、植物組織の破砕液などが挙げられるが、これ
らに限定されるものではない。当初から検体中に存在す
るグルコースはトレハロースの酵素的定量反応において
妨害因子となり得るが、本発明における検体は、トレハ
ロースの他にグルコースが含まれることが予想されるも
のであってもよいし、予想されないものであってもよ
い。
本発明において測定対象となり得るトレハロース含有検
体（被検液）としては、トレハロース生産能を有する微
生物のスクリーニングのための反応液や、微生物菌体、
動物組織、植物組織の破砕液などが挙げられるが、これ
らに限定されるものではない。当初から検体中に存在す
るグルコースはトレハロースの酵素的定量反応において
妨害因子となり得るが、本発明における検体は、トレハ
ロースの他にグルコースが含まれることが予想されるも
のであってもよいし、予想されないものであってもよ
い。
【００１０】本発明では、まずトレハロース含有検体中
に混在するグルコースを、ムタロターゼ、グルコースオ
キシダーゼおよびカタラーゼを使用して前処理し、トレ
ハロースの酵素的定量反応に影響を与えないように該グ
ルコースを消去する。この前処理における反応過程の一
例を図１(a) に示す。
に混在するグルコースを、ムタロターゼ、グルコースオ
キシダーゼおよびカタラーゼを使用して前処理し、トレ
ハロースの酵素的定量反応に影響を与えないように該グ
ルコースを消去する。この前処理における反応過程の一
例を図１(a) に示す。
【００１１】検体中にα−Ｄ−グルコースが存在する場
合、そのα−Ｄ−グルコースはムタロターゼによりβ−
Ｄ−グルコースに変換される。変換されたβ−Ｄ−グル
コース（検体中にβ−Ｄ−グルコースが当初より存在す
る場合には、さらにそのβ−Ｄ−グルコース）は、グル
コースオキシダーゼにより酸素および水と反応し、β−
Ｄ−グルコノ−δ−ラクトンと過酸化水素を生成する。
ここで生成した過酸化水素もトレハロースの酵素的定量
反応に影響を与えるため、カタラーゼにより水と酸素に
変換される。
合、そのα−Ｄ−グルコースはムタロターゼによりβ−
Ｄ−グルコースに変換される。変換されたβ−Ｄ−グル
コース（検体中にβ−Ｄ−グルコースが当初より存在す
る場合には、さらにそのβ−Ｄ−グルコース）は、グル
コースオキシダーゼにより酸素および水と反応し、β−
Ｄ−グルコノ−δ−ラクトンと過酸化水素を生成する。
ここで生成した過酸化水素もトレハロースの酵素的定量
反応に影響を与えるため、カタラーゼにより水と酸素に
変換される。
【００１２】このような前処理を行うことにより、被検
液中に原始的に存在するグルコースは、トレハロースホ
スホリラーゼを用いたトレハロースの酵素的測定方法に
関与しなくなるため、本発明では目的物質であるトレハ
ロースを高感度に直接測定することができる。
液中に原始的に存在するグルコースは、トレハロースホ
スホリラーゼを用いたトレハロースの酵素的測定方法に
関与しなくなるため、本発明では目的物質であるトレハ
ロースを高感度に直接測定することができる。
【００１３】この前処理では、ムタロターゼ、グルコー
スオキシダーゼおよびカタラーゼをそれぞれ順次使用し
てもよいし、ムタロターゼ、グルコースオキシダーゼお
よびカタラーゼを含有する試薬（グルコース消去前処理
試薬）を使用してもよい。このグルコース消去前処理試
薬は、少なくともムタロターゼ、グルコースオキシダー
ゼおよびカタラーゼを含有するものであり、溶媒として
リン酸緩衝液等を使用することができる。また、これら
以外にも、酵素の安定化・賦活化等のためにウシ血清ア
ルブミンや、界面活性剤などを含んでいてもよい。
スオキシダーゼおよびカタラーゼをそれぞれ順次使用し
てもよいし、ムタロターゼ、グルコースオキシダーゼお
よびカタラーゼを含有する試薬（グルコース消去前処理
試薬）を使用してもよい。このグルコース消去前処理試
薬は、少なくともムタロターゼ、グルコースオキシダー
ゼおよびカタラーゼを含有するものであり、溶媒として
リン酸緩衝液等を使用することができる。また、これら
以外にも、酵素の安定化・賦活化等のためにウシ血清ア
ルブミンや、界面活性剤などを含んでいてもよい。
【００１４】グルコース消去前処理試薬におけるムタロ
ターゼ、グルコースオキシダーゼおよびカタラーゼの含
有量は、それぞれ２〜40単位／ml、 100〜500 単位／ml
および2000〜5000単位／mlであるのが好ましい。
ターゼ、グルコースオキシダーゼおよびカタラーゼの含
有量は、それぞれ２〜40単位／ml、 100〜500 単位／ml
および2000〜5000単位／mlであるのが好ましい。
【００１５】本発明では、次にトレハロースの酵素的定
量反応を行うが、上記前処理で使用したカタラーゼは、
グルコースの定量に利用される過酸化水素を分解してし
まうため、その酵素活性を阻害する必要がある。カタラ
ーゼの活性を阻害するには、アジ化ナトリウムを用いる
ことができる。アジ化ナトリウムの使用量は、カタラー
ゼ1000単位／mlに対して 0.1〜0.5 重量％であるのが好
ましく、特に 0.1重量％程度であるのが好ましい。
量反応を行うが、上記前処理で使用したカタラーゼは、
グルコースの定量に利用される過酸化水素を分解してし
まうため、その酵素活性を阻害する必要がある。カタラ
ーゼの活性を阻害するには、アジ化ナトリウムを用いる
ことができる。アジ化ナトリウムの使用量は、カタラー
ゼ1000単位／mlに対して 0.1〜0.5 重量％であるのが好
ましく、特に 0.1重量％程度であるのが好ましい。
【００１６】トレハロースの酵素的定量反応では、検体
中のトレハロースをトレハロースホスホリラーゼにより
分解し、生成したグルコースを、グルコースオキシダー
ゼを利用して定量する。定量法としては特に限定されな
いが、いわゆるグルコースオキシダーゼ法による比色定
量を行うことができる。当該反応過程の一例を図１(b)
に示す。
中のトレハロースをトレハロースホスホリラーゼにより
分解し、生成したグルコースを、グルコースオキシダー
ゼを利用して定量する。定量法としては特に限定されな
いが、いわゆるグルコースオキシダーゼ法による比色定
量を行うことができる。当該反応過程の一例を図１(b)
に示す。
【００１７】検体中のトレハロースは、まずトレハロー
スホスホリラーゼによってリン酸と反応し、α−Ｄ−グ
ルコースおよびグルコース−１−リン酸を生成する。次
いで、生成したα−Ｄ−グルコースは、ムタロターゼに
よりβ−Ｄ−グルコースに変換される。この遊離、生成
したβ−Ｄ−グルコースはグルコースオキシダーゼによ
り酸素および水と反応し、β−Ｄ−グルコノ−δ−ラク
トンと過酸化水素を生成する。なお、この反応過程にお
けるムタロターゼおよびグルコースオキシダーゼは、前
処理で使用したものをそのまま利用することができる
が、これに限定されるものではない。
スホスホリラーゼによってリン酸と反応し、α−Ｄ−グ
ルコースおよびグルコース−１−リン酸を生成する。次
いで、生成したα−Ｄ−グルコースは、ムタロターゼに
よりβ−Ｄ−グルコースに変換される。この遊離、生成
したβ−Ｄ−グルコースはグルコースオキシダーゼによ
り酸素および水と反応し、β−Ｄ−グルコノ−δ−ラク
トンと過酸化水素を生成する。なお、この反応過程にお
けるムタロターゼおよびグルコースオキシダーゼは、前
処理で使用したものをそのまま利用することができる
が、これに限定されるものではない。
【００１８】生成した過酸化水素は、ペルオキシダーゼ
により、4-アミノアンチピリンおよび水素供与体と反応
して発色するため、この発色した過酸化水素について、
500〜600 nm、望ましくは542 nm付近の吸光度を測定す
ることにより、β−Ｄ−グルコース、ひいてはトレハロ
ースを定量することができる。なお、最大吸収波長は54
2 nmであり、自動生化学分析機で設定可能な波長は546
nmである。
により、4-アミノアンチピリンおよび水素供与体と反応
して発色するため、この発色した過酸化水素について、
500〜600 nm、望ましくは542 nm付近の吸光度を測定す
ることにより、β−Ｄ−グルコース、ひいてはトレハロ
ースを定量することができる。なお、最大吸収波長は54
2 nmであり、自動生化学分析機で設定可能な波長は546
nmである。
【００１９】水素供与体としては、フェノール、Ｎ−エ
チル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−
ｍ−アニシジン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−
ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン
（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）や、それらの
誘導体、例えばＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）−３−メトキシアニリンなどが挙げ
られ、各々単独でまたは適宜組み合わせて使用すること
ができる。
チル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−
ｍ−アニシジン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−
ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン
（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）や、それらの
誘導体、例えばＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）−３−メトキシアニリンなどが挙げ
られ、各々単独でまたは適宜組み合わせて使用すること
ができる。
【００２０】本処理工程では、アジ化ナトリウム、トレ
ハロースホスホリラーゼ、ムタロターゼ、グルコースオ
キシダーゼならびにペルオキシダーゼおよび4-アミノア
ンチピリンおよび水素供与体をそれぞれ順次使用しても
よいし（アジ化ナトリウムについては、グルコースオキ
シダーゼによる処理前であれば、順番は問わない）、ア
ジ化ナトリウム、トレハロースホスホリラーゼ、ムタロ
ターゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、
4-アミノアンチピリンおよび水素供与体を含有する生成
グルコース検出試薬、あるいはアジ化ナトリウム、トレ
ハロースホスホリラーゼ、ペルオキシダーゼ、4-アミノ
アンチピリンおよび水素供与体を含有する生成グルコー
ス検出試薬を使用してもよい。好ましくは、アジ化ナト
リウム、トレハロースホスホリラーゼ、ペルオキシダー
ゼ、4-アミノアンチピリンおよび水素供与体を含有する
生成グルコース検出試薬を使用する。
ハロースホスホリラーゼ、ムタロターゼ、グルコースオ
キシダーゼならびにペルオキシダーゼおよび4-アミノア
ンチピリンおよび水素供与体をそれぞれ順次使用しても
よいし（アジ化ナトリウムについては、グルコースオキ
シダーゼによる処理前であれば、順番は問わない）、ア
ジ化ナトリウム、トレハロースホスホリラーゼ、ムタロ
ターゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、
4-アミノアンチピリンおよび水素供与体を含有する生成
グルコース検出試薬、あるいはアジ化ナトリウム、トレ
ハロースホスホリラーゼ、ペルオキシダーゼ、4-アミノ
アンチピリンおよび水素供与体を含有する生成グルコー
ス検出試薬を使用してもよい。好ましくは、アジ化ナト
リウム、トレハロースホスホリラーゼ、ペルオキシダー
ゼ、4-アミノアンチピリンおよび水素供与体を含有する
生成グルコース検出試薬を使用する。
【００２１】これら生成グルコース検出試薬は、溶媒と
してリン酸緩衝液等を含有することができ、そのリン酸
は、トレハロースホスホリラーゼによるトレハロースと
の反応に供与することができる。また、リン酸緩衝液以
外にも、トレハロースホスホリラーゼの安定化のために
エチレンジアミン四酢酸；酵素、特にトレハロースホス
ホリラーゼの賦活化のために界面活性剤；酵素の安定化
のためにウシ血清アルブミン；及び検体の濁りを軽減す
るために界面活性剤、例えばニッコーケミカル社製のＯ
Ｐ１０、ニッコーケミカル社製のＢＴ７などを含んでい
てもよい。
してリン酸緩衝液等を含有することができ、そのリン酸
は、トレハロースホスホリラーゼによるトレハロースと
の反応に供与することができる。また、リン酸緩衝液以
外にも、トレハロースホスホリラーゼの安定化のために
エチレンジアミン四酢酸；酵素、特にトレハロースホス
ホリラーゼの賦活化のために界面活性剤；酵素の安定化
のためにウシ血清アルブミン；及び検体の濁りを軽減す
るために界面活性剤、例えばニッコーケミカル社製のＯ
Ｐ１０、ニッコーケミカル社製のＢＴ７などを含んでい
てもよい。
【００２２】生成グルコース検出試薬におけるアジ化ナ
トリウム、トレハロースホスホリラーゼ、ペルオキシダ
ーゼ、4-アミノアンチピリンおよび水素供与体の含有量
は、それぞれ 0.1〜0.5 重量％、 0.055〜0.11単位／m
l、10〜100 単位／ml、 0.5〜５mMおよび 0.5〜５mMで
あるのが好ましい。
トリウム、トレハロースホスホリラーゼ、ペルオキシダ
ーゼ、4-アミノアンチピリンおよび水素供与体の含有量
は、それぞれ 0.1〜0.5 重量％、 0.055〜0.11単位／m
l、10〜100 単位／ml、 0.5〜５mMおよび 0.5〜５mMで
あるのが好ましい。
【００２３】上記グルコース消去前処理試薬と、生成グ
ルコース検出試薬とを組み合わせたものは、トレハロー
ス分析用試薬またはトレハロース合成酵素生産微生物の
検索用試薬として有用である。上記グルコース消去前処
理試薬および生成グルコース検出試薬を用いたトレハロ
ースの酵素的測定は、例えば、以下のようにして行うこ
とができる。
ルコース検出試薬とを組み合わせたものは、トレハロー
ス分析用試薬またはトレハロース合成酵素生産微生物の
検索用試薬として有用である。上記グルコース消去前処
理試薬および生成グルコース検出試薬を用いたトレハロ
ースの酵素的測定は、例えば、以下のようにして行うこ
とができる。
【００２４】まず、被検液とグルコース消去前処理試薬
とを混合し、一定温度、例えば37℃で、一定時間、例え
ば20分間又はそれ以上の時間インキュベートし、被検液
中のグルコースを消去する。このようにして前処理を行
った被検液と、生成グルコース検出試薬とを混合し、一
定温度、例えば37℃で、一定時間、例えば５分間又はそ
れ以上の時間インキュベートし、発色反応の結果を 542
nm付近における吸光度により測定する。
とを混合し、一定温度、例えば37℃で、一定時間、例え
ば20分間又はそれ以上の時間インキュベートし、被検液
中のグルコースを消去する。このようにして前処理を行
った被検液と、生成グルコース検出試薬とを混合し、一
定温度、例えば37℃で、一定時間、例えば５分間又はそ
れ以上の時間インキュベートし、発色反応の結果を 542
nm付近における吸光度により測定する。
【００２５】この測定は、一般的に用手法またはオート
法により行うことができる。用手法とは、測定者が、定
められた時間毎に定められた量の試薬をピペット等を用
いて入れ、一定時間後に測定する方法であり、オート法
とは、一般に臨床検査に用いられる生化学自動分析機
（オートアナライザー）を用いて測定する方法である。
本発明による測定は操作が簡便であり、自動分析（オー
ト法）にも極めて適している。
法により行うことができる。用手法とは、測定者が、定
められた時間毎に定められた量の試薬をピペット等を用
いて入れ、一定時間後に測定する方法であり、オート法
とは、一般に臨床検査に用いられる生化学自動分析機
（オートアナライザー）を用いて測定する方法である。
本発明による測定は操作が簡便であり、自動分析（オー
ト法）にも極めて適している。
【００２６】以上説明した本発明によれば、被検液中の
グルコースをあらかじめ消去した後、そのまま引き続い
てトレハロースホスホリラーゼを用いたトレハロースの
酵素的定量測定を行うことができるため、従来、検体ブ
ランクをとるために１検体で２回以上の測定を要したの
に比べ、操作が簡単であり、しかも精度が高い。したが
って、本発明のトレハロースの酵素的測定方法および試
薬は、特にトレハロース検出のスクリーニングに極めて
適している。
グルコースをあらかじめ消去した後、そのまま引き続い
てトレハロースホスホリラーゼを用いたトレハロースの
酵素的定量測定を行うことができるため、従来、検体ブ
ランクをとるために１検体で２回以上の測定を要したの
に比べ、操作が簡単であり、しかも精度が高い。したが
って、本発明のトレハロースの酵素的測定方法および試
薬は、特にトレハロース検出のスクリーニングに極めて
適している。
【００２７】
【実施例】以下、実施例によって本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるも
のではない。 （実施例１）トレハロースの定量：用手法 下記の組成を有する試薬を調製した。
説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるも
のではない。 （実施例１）トレハロースの定量：用手法 下記の組成を有する試薬を調製した。
【００２８】 グルコース消去前処理試薬（Ｒ１） リン酸緩衝液（pH 6.9） ２００ｍＭ ムタロターゼ １０単位／ｍｌ グルコースオキシダーゼ １００単位／ｍｌ カタラーゼ ２０００単位／ｍｌ ウシ血清アルブミン ０．０２重量％ 生成グルコース検出試薬（Ｒ２） リン酸緩衝液（pH 6.9） ２００ｍＭ アジ化ナトリウム ０．２重量％ エチレンジアミン四酢酸 ２ｍＭ ４−アミノアンチピリン ２ｍＭ Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３− スルホプロピル）−３−メトキシアニリン ２ｍＭ Ｔｗｅｅｎ２０ ０．１重量％ ペルオキシダーゼ １０単位／ｍｌ トレハロースホスホリラーゼ ０．０５５単位／ｍｌ ウシ血清アルブミン ０．０２重量％
【００２９】被検液としては、３g/l のグルコースを含
むトレハロース水溶液（トレハロース濃度：０g/l,１g/
l,２g/l,３g/l,４g/l,５g/l,６g/l,７g/l,８g/l,９g/l,
10g/l ）を使用した。この被検液50μl に、50μl のＲ
１を加え、37℃で20分間インキュベートした後、500 μ
l のＲ２を加え、37℃で正確に20分間インキュベートし
た。この発色反応について、542 nmの吸光度を測定し
た。結果を図２のグラフに示す。図２に示されるよう
に、本発明（用手法）によれば、１〜10g/l（約2.6 〜2
6mM）の濃度のトレハロースの定量を行うことができ
る。
むトレハロース水溶液（トレハロース濃度：０g/l,１g/
l,２g/l,３g/l,４g/l,５g/l,６g/l,７g/l,８g/l,９g/l,
10g/l ）を使用した。この被検液50μl に、50μl のＲ
１を加え、37℃で20分間インキュベートした後、500 μ
l のＲ２を加え、37℃で正確に20分間インキュベートし
た。この発色反応について、542 nmの吸光度を測定し
た。結果を図２のグラフに示す。図２に示されるよう
に、本発明（用手法）によれば、１〜10g/l（約2.6 〜2
6mM）の濃度のトレハロースの定量を行うことができ
る。
【００３０】（実施例２）トレハロースの定量：オート
法 トレハロースホスホリラーゼの濃度を0.11単位／mlとす
る以外、実施例１同様の試薬を調製した。被検液として
は、１g/l のグルコースを含むトレハロース水溶液（ト
レハロース濃度：０g/l,１g/l,２g/l,３g/l,４g/l,５g/
l,６g/l,７g/l,８g/l,９g/l,10g/l ）を使用した。この
被検液20μl に、200 μl のＲ１を加え、37℃で５分間
インキュベートした後、200 μl のＲ２を加え、37℃で
５分間インキュベートした。この発色反応について、54
6 nmの吸光度を測定した。結果を図３のグラフに示す。
図３に示されるように、本発明（オート法）によれば、
１〜10g/l（約2.6 〜26mM）の濃度のトレハロースの定
量を行うことができる。
法 トレハロースホスホリラーゼの濃度を0.11単位／mlとす
る以外、実施例１同様の試薬を調製した。被検液として
は、１g/l のグルコースを含むトレハロース水溶液（ト
レハロース濃度：０g/l,１g/l,２g/l,３g/l,４g/l,５g/
l,６g/l,７g/l,８g/l,９g/l,10g/l ）を使用した。この
被検液20μl に、200 μl のＲ１を加え、37℃で５分間
インキュベートした後、200 μl のＲ２を加え、37℃で
５分間インキュベートした。この発色反応について、54
6 nmの吸光度を測定した。結果を図３のグラフに示す。
図３に示されるように、本発明（オート法）によれば、
１〜10g/l（約2.6 〜26mM）の濃度のトレハロースの定
量を行うことができる。
【００３１】（実施例３）グルコースの影響の測定：用
手法 被検液として、０g/l,0.5 g/l,１g/l,1.5 g/l,２g/l,2.
5 g/l,３g/l,４g/l,５g/l のグルコースを含むトレハロ
ース水溶液（トレハロース濃度：５g/l ）を使用する以
外、実施例１と同様の測定を行った。結果を図４のグラ
フに示す。図４に示されるように、本発明（用手法）に
よれば、被検液中にグルコースが存在する場合であって
も、少なくとも５g/l のグルコースを処理してその影響
を消去することができ、トレハロースの定量を正確に行
うことができる。
手法 被検液として、０g/l,0.5 g/l,１g/l,1.5 g/l,２g/l,2.
5 g/l,３g/l,４g/l,５g/l のグルコースを含むトレハロ
ース水溶液（トレハロース濃度：５g/l ）を使用する以
外、実施例１と同様の測定を行った。結果を図４のグラ
フに示す。図４に示されるように、本発明（用手法）に
よれば、被検液中にグルコースが存在する場合であって
も、少なくとも５g/l のグルコースを処理してその影響
を消去することができ、トレハロースの定量を正確に行
うことができる。
【００３２】（実施例４）グルコースの影響の測定：オ
ート法 被検液として、０g/l,0.5 g/l,１g/l,1.5 g/l,２g/l,2.
5 g/l,３g/l のグルコースを含むトレハロース水溶液
（トレハロース濃度：５g/l ）を使用する以外、実施例
２と同様の測定を行った。結果を図５のグラフに示す。
図４に示されるように、本発明（オート法）によれば、
被検液中にグルコースが存在する場合であっても、グル
コースの濃度が１g/l 以下であれば、その影響を消去し
てトレハロースの定量を正確に行うことができる。
ート法 被検液として、０g/l,0.5 g/l,１g/l,1.5 g/l,２g/l,2.
5 g/l,３g/l のグルコースを含むトレハロース水溶液
（トレハロース濃度：５g/l ）を使用する以外、実施例
２と同様の測定を行った。結果を図５のグラフに示す。
図４に示されるように、本発明（オート法）によれば、
被検液中にグルコースが存在する場合であっても、グル
コースの濃度が１g/l 以下であれば、その影響を消去し
てトレハロースの定量を正確に行うことができる。
【００３３】
【発明の効果】本発明によれば、被検液中に存在する、
測定ブランクを大きくし、トレハロースの酵素的測定の
妨げとなるグルコースによる影響を消去でき、ブランク
測定を行うことなく、簡便にかつ正確にトレハロースの
測定を行うことができる。
測定ブランクを大きくし、トレハロースの酵素的測定の
妨げとなるグルコースによる影響を消去でき、ブランク
測定を行うことなく、簡便にかつ正確にトレハロースの
測定を行うことができる。
【図１】本発明における反応過程の一例を示す図であ
る。(a) は前処理における反応過程を示すものであり、
(b) はトレハロースの酵素的定量反応過程を示すもので
ある。
る。(a) は前処理における反応過程を示すものであり、
(b) はトレハロースの酵素的定量反応過程を示すもので
ある。
【図２】実施例１におけるトレハロースの定量結果（用
手法）を示すグラフである。
手法）を示すグラフである。
【図３】実施例２におけるトレハロースの定量結果（オ
ート法）を示すグラフである。
ート法）を示すグラフである。
【図４】実施例３における被検液中のグルコースの影響
を測定した結果（用手法）を示すグラフである。
を測定した結果（用手法）を示すグラフである。
【図５】実施例４における被検液中のグルコースの影響
を測定した結果（オート法）を示すグラフである。
を測定した結果（オート法）を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山岸 政昭 静岡県焼津市西小川５丁目17番地−12 (72)発明者 戸塚 好之 静岡県静岡市下川原２丁目14−２ (72)発明者 窪田 悟夫 静岡県静岡市池田1004番地 (72)発明者 大口 真央 静岡県静岡市登呂４丁目25番８号 (72)発明者 和田 正 静岡県静岡市聖一色25−１ ディアス川口 Ｂ201 (72)発明者 佐野 孝文 静岡県庵原郡富士川町南松野1759−４
Claims (6)
- 【請求項１】 トレハロース含有検体中に混在するグル
コースを、ムタロターゼ、グルコースオキシダーゼおよ
びカタラーゼを使用してトレハロースの酵素的定量反応
に影響を与えないように前処理した後、前記カタラーゼ
の活性をアジ化ナトリウムにより阻害するとともに、検
体中のトレハロースをトレハロースホスホリラーゼによ
り分解し、生成したグルコースをグルコースオキシダー
ゼを用いて定量することを特徴とするトレハロースの酵
素的測定方法。 - 【請求項２】 トレハロース含有検体中に混在するグル
コースを前処理するために、少なくともムタロターゼ、
グルコースオキシダーゼおよびカタラーゼを含有するグ
ルコース消去前処理試薬を使用することを特徴とする、
請求項１記載のトレハロースの酵素的測定方法。 - 【請求項３】 検体中のトレハロースの分解により生成
したグルコースを定量する場合に、少なくともトレハロ
ースホスホリラーゼ、アジ化ナトリウム、ペルオキシダ
ーゼ、4-アミノアンチピリンおよび水素供与体を含有す
る生成グルコース検出試薬を使用し、過酸化水素の発色
反応によってグルコースを比色定量することを特徴とす
る、請求項１記載のトレハロースの酵素的測定方法。 - 【請求項４】 水素供与体が、フェノール、Ｎ−エチル
−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−
アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−
スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリンおよ
びそれらの誘導体からなる群から選ばれた少なくとも１
種であることを特徴とする、請求項３記載のトレハロー
スの酵素的測定方法。 - 【請求項５】 少なくともムタロターゼ、グルコースオ
キシダーゼおよびカタラーゼを含有するグルコース消去
前処理試薬と、少なくともトレハロースホスホリラー
ゼ、アジ化ナトリウム、ペルオキシダーゼ、4-アミノア
ンチピリンおよび水素供与体を含有する生成グルコース
検出試薬との組み合わせからなる、トレハロース分析用
試薬。 - 【請求項６】 少なくともムタロターゼ、グルコースオ
キシダーゼおよびカタラーゼを含有するグルコース消去
前処理試薬と、少なくともトレハロースホスホリラー
ゼ、アジ化ナトリウム、ペルオキシダーゼ、4-アミノア
ンチピリンおよび水素供与体を含有する生成グルコース
検出試薬との組み合わせからなる、トレハロース合成酵
素生産微生物の検索用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24511396A JPH1084994A (ja) | 1996-09-17 | 1996-09-17 | トレハロースの酵素的測定方法およびトレハロース分析用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24511396A JPH1084994A (ja) | 1996-09-17 | 1996-09-17 | トレハロースの酵素的測定方法およびトレハロース分析用試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1084994A true JPH1084994A (ja) | 1998-04-07 |
Family
ID=17128823
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24511396A Pending JPH1084994A (ja) | 1996-09-17 | 1996-09-17 | トレハロースの酵素的測定方法およびトレハロース分析用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1084994A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109596550A (zh) * | 2018-12-24 | 2019-04-09 | 苏州科铭生物技术有限公司 | 一种基于分光光度法的海藻糖含量测定试剂盒及其方法 |
| CN113325139A (zh) * | 2021-06-04 | 2021-08-31 | 通辽梅花生物科技有限公司 | 一种氨基酸发酵液中海藻糖含量的检测方法 |
-
1996
- 1996-09-17 JP JP24511396A patent/JPH1084994A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109596550A (zh) * | 2018-12-24 | 2019-04-09 | 苏州科铭生物技术有限公司 | 一种基于分光光度法的海藻糖含量测定试剂盒及其方法 |
| CN113325139A (zh) * | 2021-06-04 | 2021-08-31 | 通辽梅花生物科技有限公司 | 一种氨基酸发酵液中海藻糖含量的检测方法 |
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