JPH1085321A - 医学装置の表面上に糖蛋白質を付着させるための酸化法 - Google Patents
医学装置の表面上に糖蛋白質を付着させるための酸化法Info
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- JPH1085321A JPH1085321A JP9216492A JP21649297A JPH1085321A JP H1085321 A JPH1085321 A JP H1085321A JP 9216492 A JP9216492 A JP 9216492A JP 21649297 A JP21649297 A JP 21649297A JP H1085321 A JPH1085321 A JP H1085321A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 基表面上に固定化した糖蛋白質を有する医学
装置の製造方法を提供する。 【解決手段】 以下の工程： （ａ）過ヨウ素酸塩を、１，２ジヒドロキシモイエティ
を有する物質と化合してアルデヒド官能物質を形成し； （ｂ）アルデヒド官能物質を、第一アミンモイエティを
有する物質と化合してイミンモイエティを通して両物質
を結合させ；そして （ｃ）イミンモイエティを還元剤と反応させて、第二ア
ミン結合を通して医学装置基体表面上に固定化糖蛋白質
を形成する；ことからなる、基体表面上に固定化された
糖蛋白質を有する医学装置の製造方法が提供される。
装置の製造方法を提供する。 【解決手段】 以下の工程： （ａ）過ヨウ素酸塩を、１，２ジヒドロキシモイエティ
を有する物質と化合してアルデヒド官能物質を形成し； （ｂ）アルデヒド官能物質を、第一アミンモイエティを
有する物質と化合してイミンモイエティを通して両物質
を結合させ；そして （ｃ）イミンモイエティを還元剤と反応させて、第二ア
ミン結合を通して医学装置基体表面上に固定化糖蛋白質
を形成する；ことからなる、基体表面上に固定化された
糖蛋白質を有する医学装置の製造方法が提供される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、医学装置の表面に
糖蛋白質を付着させるための酸化法に関する。
糖蛋白質を付着させるための酸化法に関する。
【０００２】
【従来の技術】長年にわたり、生きているヒトまたは動
物の体組織または体液に接触する多くの医学装置（例え
ば、ペースメーカー、血管移植片、ステント、心臓弁
等）が開発され、製造され、そして臨床において使用さ
れてきた。このような装置の大きな問題は、それらの表
面が組織および体液、例えば涙、尿、リンパ液、血液、
血液生成物および血液由来のその他の液体および固体か
らの蛋白質層に吸着しやすいことである。この吸着蛋白
質層の組成および組織は、管理されているのでないとす
れば、さらなる生物反応に影響すると考えられる。副作
用、例えば血栓症および炎症が、多くの装置の使用寿命
を減じうる。
物の体組織または体液に接触する多くの医学装置（例え
ば、ペースメーカー、血管移植片、ステント、心臓弁
等）が開発され、製造され、そして臨床において使用さ
れてきた。このような装置の大きな問題は、それらの表
面が組織および体液、例えば涙、尿、リンパ液、血液、
血液生成物および血液由来のその他の液体および固体か
らの蛋白質層に吸着しやすいことである。この吸着蛋白
質層の組成および組織は、管理されているのでないとす
れば、さらなる生物反応に影響すると考えられる。副作
用、例えば血栓症および炎症が、多くの装置の使用寿命
を減じうる。
【０００３】移植可能な医学装置も多くのバクテリア種
による体への感染の場所として機能しやすい。装置に関
連したこれらの感染は、これらの生物が装置表面に接着
してコロニーを形成する傾向により促進される。その結
果、内科医および医学工業における大きな興味は、典型
的に装置の移植と同時に起こる副作用を促進する傾向の
少ないバイオ分子の表面を開発することである。
による体への感染の場所として機能しやすい。装置に関
連したこれらの感染は、これらの生物が装置表面に接着
してコロニーを形成する傾向により促進される。その結
果、内科医および医学工業における大きな興味は、典型
的に装置の移植と同時に起こる副作用を促進する傾向の
少ないバイオ分子の表面を開発することである。
【０００４】医学装置に関連した不所望な副作用を最小
にするためのひとつのアプローチは、さまざまなバイオ
分子を、体が受容する細胞層の付着および成長のための
表面に付着させることである。例えば成長因子、細胞付
着蛋白質および細胞付着ペプチド等のバイオ分子がこの
目的に使用されてきた。さらに、抗血栓症剤、抗血小
板、抗炎症剤、抗微生物剤等のバイオ分子もバイオ材料
関連の副作用の軽減に使用されてきた。
にするためのひとつのアプローチは、さまざまなバイオ
分子を、体が受容する細胞層の付着および成長のための
表面に付着させることである。例えば成長因子、細胞付
着蛋白質および細胞付着ペプチド等のバイオ分子がこの
目的に使用されてきた。さらに、抗血栓症剤、抗血小
板、抗炎症剤、抗微生物剤等のバイオ分子もバイオ材料
関連の副作用の軽減に使用されてきた。
【０００５】多くのアプローチからは、そのようなバイ
オ分子を付着させることが示唆された。これらのアプロ
ーチは、典型的には、カップリング剤、例えばグルタル
アルデヒド、臭化シアン、ｐ−ベンゾキノン、無水琥珀
酸、カルボジイミド、ジイソシアネート、クロロ蟻酸エ
チル、ジピリジルジスルフィド、エピクロロフィドリ
ン、アジド、とりわけ、基体表面へのバイオ分子のカッ
プリングのための付着ビヒクル（vehicles）として機能
するものの使用を必要とする。例えば、水溶性カルボジ
イミドを用いたバイオ分子の共有結合は、ホフマン（Ho
ffman）ら（「不活性ポリマー表面上の放射線移植され
たヒドロゲルへのバイオ分子の共有結合（Covalent Bin
ding of Biomolecules to Radiation-Grafted Hydrogel
s on InertPolymer Surfaces）」、Trans．Am．Soc．Ar
tif．Intern．Organs.，18，10-18（1972））、および
イトー（Ito）ら（「細胞接着ペプチドの固定化による
細胞吸着増強のための物質（Materials for Enhancing
Cell Adhesion by Immobilization of Cell-Adhesive P
eptide）」、J．Biomed．Mat．Res.，25，1325-1337（1
991））に記載されている。
オ分子を付着させることが示唆された。これらのアプロ
ーチは、典型的には、カップリング剤、例えばグルタル
アルデヒド、臭化シアン、ｐ−ベンゾキノン、無水琥珀
酸、カルボジイミド、ジイソシアネート、クロロ蟻酸エ
チル、ジピリジルジスルフィド、エピクロロフィドリ
ン、アジド、とりわけ、基体表面へのバイオ分子のカッ
プリングのための付着ビヒクル（vehicles）として機能
するものの使用を必要とする。例えば、水溶性カルボジ
イミドを用いたバイオ分子の共有結合は、ホフマン（Ho
ffman）ら（「不活性ポリマー表面上の放射線移植され
たヒドロゲルへのバイオ分子の共有結合（Covalent Bin
ding of Biomolecules to Radiation-Grafted Hydrogel
s on InertPolymer Surfaces）」、Trans．Am．Soc．Ar
tif．Intern．Organs.，18，10-18（1972））、および
イトー（Ito）ら（「細胞接着ペプチドの固定化による
細胞吸着増強のための物質（Materials for Enhancing
Cell Adhesion by Immobilization of Cell-Adhesive P
eptide）」、J．Biomed．Mat．Res.，25，1325-1337（1
991））に記載されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】カップリング分子によ
りしばしばバイオ物質表面をカップリングするバイオ分
子の一つは、蛋白質である。蛋白質は、アミノ酸残基よ
りなるポリペプチドである。一般的に、確立されたカッ
プリング法は末端アミノ基を含む蛋白質のリジンアミノ
酸残基を通して基質表面に蛋白質をカップリングする。
この結合方法は、幾つかの固有の問題を有する。例え
ば、多くのリジン残基が蛋白質表面上に存在するなら
ば、複数の付着が生じうる。複数の付着部位は、バイオ
物質表面上の蛋白質の複数のコンフォメーションに至り
うる。カップリング特異性の欠如は、カップリングされ
る蛋白質の生物活性を崩壊または破壊しうる。さらに、
カップリング分子がバイオ物質表面に不安定性を付与し
て、カップリング層中に付着した蛋白質の埋没の可能性
を増加させうる。カップリング分子も、蛋白質分子間に
不所望な架橋結合を作ることにより蛋白質の生物特性を
破壊するか、または表面の機能部位間に架橋結合を作
り、付着を阻害しうる。カップリング分子の使用もバイ
オ物質表面への蛋白質の付着の特異性を低下させる傾向
があり、それにより付着工程にわたってコンフォメーシ
ョンの制御を損失する。
りしばしばバイオ物質表面をカップリングするバイオ分
子の一つは、蛋白質である。蛋白質は、アミノ酸残基よ
りなるポリペプチドである。一般的に、確立されたカッ
プリング法は末端アミノ基を含む蛋白質のリジンアミノ
酸残基を通して基質表面に蛋白質をカップリングする。
この結合方法は、幾つかの固有の問題を有する。例え
ば、多くのリジン残基が蛋白質表面上に存在するなら
ば、複数の付着が生じうる。複数の付着部位は、バイオ
物質表面上の蛋白質の複数のコンフォメーションに至り
うる。カップリング特異性の欠如は、カップリングされ
る蛋白質の生物活性を崩壊または破壊しうる。さらに、
カップリング分子がバイオ物質表面に不安定性を付与し
て、カップリング層中に付着した蛋白質の埋没の可能性
を増加させうる。カップリング分子も、蛋白質分子間に
不所望な架橋結合を作ることにより蛋白質の生物特性を
破壊するか、または表面の機能部位間に架橋結合を作
り、付着を阻害しうる。カップリング分子の使用もバイ
オ物質表面への蛋白質の付着の特異性を低下させる傾向
があり、それにより付着工程にわたってコンフォメーシ
ョンの制御を損失する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、基体表面にバ
イオ物質を共有結合させるための改良法を提供する。特
定すれば、本発明は、バイオ物質上に固定された糖蛋白
質を有する医学装置の製造法を提供する。該方法は、以
下の工程：過ヨウ素酸塩と１，２−ジヒドロキシモイエ
ティを含む糖蛋白質とを化合してアルデヒド作用物質を
形成し；該アルデヒド作用物質と第一アミンモイエティ
を含む物質とを化合してイミンモイエティを通して２つ
の物質を結合させ；そして、イミンモイエティを還元剤
と反応させて、第二アミン結合を通して医学装置のバイ
オ物質表面上に固定化糖蛋白質を形成することからな
る。
イオ物質を共有結合させるための改良法を提供する。特
定すれば、本発明は、バイオ物質上に固定された糖蛋白
質を有する医学装置の製造法を提供する。該方法は、以
下の工程：過ヨウ素酸塩と１，２−ジヒドロキシモイエ
ティを含む糖蛋白質とを化合してアルデヒド作用物質を
形成し；該アルデヒド作用物質と第一アミンモイエティ
を含む物質とを化合してイミンモイエティを通して２つ
の物質を結合させ；そして、イミンモイエティを還元剤
と反応させて、第二アミン結合を通して医学装置のバイ
オ物質表面上に固定化糖蛋白質を形成することからな
る。
【０００８】好ましくは、上記方法は、以下の工程：過
ヨウ素酸塩と１，２−ジヒドロキシモイエティを含む物
質とを化合し、ｐＨ約４−９の約０−５０℃の温度の水
溶液中でアルデヒド作用物質を形成し；該アルデヒド作
用物質と第一アミンモイエティ含有バイオ物質とを化合
して、イミンモイエティを通して基体表面上に糖蛋白質
を固定化し；そして、イミンモイエティを還元剤と反応
させて、第二アミン結合を通して医学装置の基体表面上
に固定化糖蛋白質を形成することからなる。
ヨウ素酸塩と１，２−ジヒドロキシモイエティを含む物
質とを化合し、ｐＨ約４−９の約０−５０℃の温度の水
溶液中でアルデヒド作用物質を形成し；該アルデヒド作
用物質と第一アミンモイエティ含有バイオ物質とを化合
して、イミンモイエティを通して基体表面上に糖蛋白質
を固定化し；そして、イミンモイエティを還元剤と反応
させて、第二アミン結合を通して医学装置の基体表面上
に固定化糖蛋白質を形成することからなる。
【０００９】本発明の方法は、１，２−ジヒドロキシモ
イエティおよび第一アミンモイエティの両者を含む糖蛋
白質を架橋結合するためにも使用されうる。該方法は、
以下の工程：過ヨウ素酸塩と糖蛋白質を化合して１，２
−ジヒドロキシモイエティを酸化してアルデヒドモイエ
ティを形成し；該アルデヒドモイエティとイミンモイエ
ティを形成する第一アミンモイエティと化合し；そし
て、イミンモイエティを還元剤と反応させて、第二アミ
ンおよび架橋された物質を形成することからなる。この
架橋された物質は、カップリングバイオ分子のための基
質として使用されうる。例えば、アルデヒド含有バイオ
分子を架橋物質の表面上の遊離アミンモイエティに付着
するか、またはアミン含有バイオ分子を架橋物質の表面
上の遊離アルデヒドモイエティに付着することができ
る。
イエティおよび第一アミンモイエティの両者を含む糖蛋
白質を架橋結合するためにも使用されうる。該方法は、
以下の工程：過ヨウ素酸塩と糖蛋白質を化合して１，２
−ジヒドロキシモイエティを酸化してアルデヒドモイエ
ティを形成し；該アルデヒドモイエティとイミンモイエ
ティを形成する第一アミンモイエティと化合し；そし
て、イミンモイエティを還元剤と反応させて、第二アミ
ンおよび架橋された物質を形成することからなる。この
架橋された物質は、カップリングバイオ分子のための基
質として使用されうる。例えば、アルデヒド含有バイオ
分子を架橋物質の表面上の遊離アミンモイエティに付着
するか、またはアミン含有バイオ分子を架橋物質の表面
上の遊離アルデヒドモイエティに付着することができ
る。
【００１０】「糖蛋白質」は、糖質（carbohydrate）基
を含む配合蛋白質（conjugated protein）として定義さ
れる。典型的な糖蛋白質は、N-グリコシド結合によりア
スパラギンアミノ酸残基に結合しているかまたはO-グリ
コシド結合によりスレオニンアミノ酸残基に結合してい
るひとつ以上のオリゴサッカライドユニットを含む。ア
スパラギンに直接結合したサッカライドユニットは典型
的にはN-アセチルグルコサミンであるが、N-アセチルグ
ルコサミンはセリンまたはスレオニン残基に結合したサ
ッカライドユニットになる傾向がある。糖蛋白質に結合
したオリゴサッカライドはさまざまな糖質ユニットを含
みうる。また、蛋白質の生物学上の活性部位から離れた
部位に位置する傾向がある。即ち、糖蛋白質のオリゴサ
ッカライドモイエティは、典型的には蛋白質の生物学上
の特性に対してほとんど又は全く作用を示さないように
修飾される。本発明に使用されるのに適切な糖蛋白質は
１，２ジヒドロキシモイエティを含む少なくとも一つの
糖質を含む。
を含む配合蛋白質（conjugated protein）として定義さ
れる。典型的な糖蛋白質は、N-グリコシド結合によりア
スパラギンアミノ酸残基に結合しているかまたはO-グリ
コシド結合によりスレオニンアミノ酸残基に結合してい
るひとつ以上のオリゴサッカライドユニットを含む。ア
スパラギンに直接結合したサッカライドユニットは典型
的にはN-アセチルグルコサミンであるが、N-アセチルグ
ルコサミンはセリンまたはスレオニン残基に結合したサ
ッカライドユニットになる傾向がある。糖蛋白質に結合
したオリゴサッカライドはさまざまな糖質ユニットを含
みうる。また、蛋白質の生物学上の活性部位から離れた
部位に位置する傾向がある。即ち、糖蛋白質のオリゴサ
ッカライドモイエティは、典型的には蛋白質の生物学上
の特性に対してほとんど又は全く作用を示さないように
修飾される。本発明に使用されるのに適切な糖蛋白質は
１，２ジヒドロキシモイエティを含む少なくとも一つの
糖質を含む。
【００１１】「バイオ物質」は、体内または体の上にお
かれるかまたは体液に接触するようにデザインおよび構
築された物質として定義される。理想的には、バイオ物
質は、体に不所望な反応、例えば血液凝固（clottin
g）、組織死、腫瘍形成、アレルギー反応、異物反応
（拒絶）または炎症反応を誘導せず、意図する目的の為
に作用するのに必要な物理特性を有し、容易に精製、製
作および滅菌でき、体に移植または接触している間、物
理特性および作用を実質的に維持する。本発明に使用す
るのに適切なバイオ物質はアミンモイエティを含む。
かれるかまたは体液に接触するようにデザインおよび構
築された物質として定義される。理想的には、バイオ物
質は、体に不所望な反応、例えば血液凝固（clottin
g）、組織死、腫瘍形成、アレルギー反応、異物反応
（拒絶）または炎症反応を誘導せず、意図する目的の為
に作用するのに必要な物理特性を有し、容易に精製、製
作および滅菌でき、体に移植または接触している間、物
理特性および作用を実質的に維持する。本発明に使用す
るのに適切なバイオ物質はアミンモイエティを含む。
【００１２】「医学装置」は、操作の間、組織、血液、
または他の体液に接触する表面を有する装置として定義
され、体液は続いて患者に使用される。例えば、血液に
接触してその血液が次に患者に戻されるような外科手術
用体外装置、例えば血液酸素供給器、血液ポンプ、血液
センサー、輸血用チューブ等を含みうる。また、これは
ヒトまたは動物の体に接触して血液に移植された体内人
工器官、例えば血管移植片、ステント、ペースメーカー
導線、心臓弁等の血管または心臓に移植されるものも含
みうる。また、一時的な血管の用途のための装置、例え
ばカテーテル、ガイドワイヤ等の監視または修復の目的
で血管または心臓におかれるものも含みうる。
または他の体液に接触する表面を有する装置として定義
され、体液は続いて患者に使用される。例えば、血液に
接触してその血液が次に患者に戻されるような外科手術
用体外装置、例えば血液酸素供給器、血液ポンプ、血液
センサー、輸血用チューブ等を含みうる。また、これは
ヒトまたは動物の体に接触して血液に移植された体内人
工器官、例えば血管移植片、ステント、ペースメーカー
導線、心臓弁等の血管または心臓に移植されるものも含
みうる。また、一時的な血管の用途のための装置、例え
ばカテーテル、ガイドワイヤ等の監視または修復の目的
で血管または心臓におかれるものも含みうる。
【００１３】本発明は、医学装置に関連する多くの問題
を解決することを目的とする。本発明は、基体表面例え
ば、医学装置に使用するためのバイオ物質の表面に糖蛋
白質を共有結合させるための酸化法を含む。本発明は、
架橋された物質を生産するための酸化法も提供する。
を解決することを目的とする。本発明は、基体表面例え
ば、医学装置に使用するためのバイオ物質の表面に糖蛋
白質を共有結合させるための酸化法を含む。本発明は、
架橋された物質を生産するための酸化法も提供する。
【００１４】１，２ジヒドロキシモイエティを有する糖
質を有する蛋白質は過ヨウ素酸塩を用いて酸化されうる
が、過ヨウ素酸塩は過ヨウ素酸またはその塩、例えば過
ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム、または他の
過ヨウ素酸のアルカリ金属塩として提供されうる。典型
的には、理論量の過ヨウ素酸塩を用いて１，２ジヒドロ
キシモイエティを酸化するが、過剰量を用いてもよい。
そのような糖蛋白質の酸化は、糖蛋白質内に反応性アル
デヒドモイエティを形成する。
質を有する蛋白質は過ヨウ素酸塩を用いて酸化されうる
が、過ヨウ素酸塩は過ヨウ素酸またはその塩、例えば過
ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム、または他の
過ヨウ素酸のアルカリ金属塩として提供されうる。典型
的には、理論量の過ヨウ素酸塩を用いて１，２ジヒドロ
キシモイエティを酸化するが、過剰量を用いてもよい。
そのような糖蛋白質の酸化は、糖蛋白質内に反応性アル
デヒドモイエティを形成する。
【００１５】酸化は、水溶液中で、好ましくは水性バッ
ファー溶液中で、糖蛋白質の生物特性を破壊しない温度
において実施される。一般には、約４−９のｐＨを有す
るバッファーを、特定のｐＨ感受性糖蛋白質に所望な約
６−８のｐＨにおいて使用できる。一般に、酸化は、約
０−５０℃の温度、好ましくは約４−３７℃の温度で実
施される。糖蛋白質に依存して、酸化反応は短くて数分
長くて数日実施されうる。一般には、酸化は２４時間以
内で完了する。長時間の酸化反応は過酸化を防ぐために
「暗黒下」で実施することが好ましい。
ファー溶液中で、糖蛋白質の生物特性を破壊しない温度
において実施される。一般には、約４−９のｐＨを有す
るバッファーを、特定のｐＨ感受性糖蛋白質に所望な約
６−８のｐＨにおいて使用できる。一般に、酸化は、約
０−５０℃の温度、好ましくは約４−３７℃の温度で実
施される。糖蛋白質に依存して、酸化反応は短くて数分
長くて数日実施されうる。一般には、酸化は２４時間以
内で完了する。長時間の酸化反応は過酸化を防ぐために
「暗黒下」で実施することが好ましい。
【００１６】酸化工程の処理時間および温度は逆の関係
になる傾向がある。即ち、処理温度が高いほど相対的な
処理時間は短くなる。時間および温度の制限は、糖蛋白
質の生物学上の安定性に対する処理効果により支配され
る。上記範囲外の処理条件も本発明の範囲である。特定
の系のための正確な条件を決定する広い範囲があり、そ
してこれらの条件は本明細書に記載される情報を読んだ
当業者により日常の実験にて容易に決定されうる。
になる傾向がある。即ち、処理温度が高いほど相対的な
処理時間は短くなる。時間および温度の制限は、糖蛋白
質の生物学上の安定性に対する処理効果により支配され
る。上記範囲外の処理条件も本発明の範囲である。特定
の系のための正確な条件を決定する広い範囲があり、そ
してこれらの条件は本明細書に記載される情報を読んだ
当業者により日常の実験にて容易に決定されうる。
【００１７】酸化に続き、反応溶液は基体への付着前に
４℃に保存される。典型的には、中性域ｐＨまたは弱酸
性ｐＨにおける反応溶液の貯蔵安定性は１−１４日に、
そして保存が暗黒であればときどき数カ月に及ぶ。
４℃に保存される。典型的には、中性域ｐＨまたは弱酸
性ｐＨにおける反応溶液の貯蔵安定性は１−１４日に、
そして保存が暗黒であればときどき数カ月に及ぶ。
【００１８】その結果得られるアルデヒドモイエティ
は、糖蛋白質の共有結合のための基体表面上の部位と相
互作用する。これらの基体表面付着部位はアミンモイエ
ティを含み、アルデヒドモイエティと反応してイミンを
形成する。バイオ分子がカップリングされる基体表面
は、所望の数の糖蛋白質を付着するための十分な密度の
アミンモイエティを含むべきである。
は、糖蛋白質の共有結合のための基体表面上の部位と相
互作用する。これらの基体表面付着部位はアミンモイエ
ティを含み、アルデヒドモイエティと反応してイミンを
形成する。バイオ分子がカップリングされる基体表面
は、所望の数の糖蛋白質を付着するための十分な密度の
アミンモイエティを含むべきである。
【００１９】表面にアミンを含まない基体は、当業者に
知られている多くの方法により容易にアミン化されう
る。例えば、アミンはアンモニアガスで材料をプラズマ
処理することにより提供可能であり、ホルムズとシュワ
ルツ（Holmes and Schwartz）、「アンモニアプラズマ
を用いた超高強度ポリエチレンのアミン化（Aminationo
f Ultra-high Strength Polyethylene using Ammonia P
lasma）」、CompositesScience and Technology，38，1
-21（1990）に記載されている。別法として、当業者に
はよく知られている方法により、アクリルアミドを基体
表面にグラフトしたのちに化学修飾を用いてアミンを導
入することによりアミンは提供されうる。ポリビニルア
ミンまたはポリアルキルイミンも、米国特許第4,521,56
4号（ソロモネ（Solomone）ら）に教示された方法に従
い、ポリウレタン表面に共有結合されうる。別法として
は、例えば米国特許第5,053,048号（ピンチャック（Pin
chuk））に記載されたようにアミノシランを表面に結合
できるし、米国特許第3,826,678号（ホフマン（Hoffma
n））に記載されたようにグラフト化されたアクリルア
ミド含有ポリマーを照射グラフティングにより結合でき
るし、米国特許第5,344,455号（ケオ（Keogh）ら）に記
載されたようにグラフト化されたN-（3-アミノプロピ
ル）メチルアクリルアミド含有ポリマーをセリウムイオ
ングラフティングにより結合できる。
知られている多くの方法により容易にアミン化されう
る。例えば、アミンはアンモニアガスで材料をプラズマ
処理することにより提供可能であり、ホルムズとシュワ
ルツ（Holmes and Schwartz）、「アンモニアプラズマ
を用いた超高強度ポリエチレンのアミン化（Aminationo
f Ultra-high Strength Polyethylene using Ammonia P
lasma）」、CompositesScience and Technology，38，1
-21（1990）に記載されている。別法として、当業者に
はよく知られている方法により、アクリルアミドを基体
表面にグラフトしたのちに化学修飾を用いてアミンを導
入することによりアミンは提供されうる。ポリビニルア
ミンまたはポリアルキルイミンも、米国特許第4,521,56
4号（ソロモネ（Solomone）ら）に教示された方法に従
い、ポリウレタン表面に共有結合されうる。別法として
は、例えば米国特許第5,053,048号（ピンチャック（Pin
chuk））に記載されたようにアミノシランを表面に結合
できるし、米国特許第3,826,678号（ホフマン（Hoffma
n））に記載されたようにグラフト化されたアクリルア
ミド含有ポリマーを照射グラフティングにより結合でき
るし、米国特許第5,344,455号（ケオ（Keogh）ら）に記
載されたようにグラフト化されたN-（3-アミノプロピ
ル）メチルアクリルアミド含有ポリマーをセリウムイオ
ングラフティングにより結合できる。
【００２０】典型的には、アルデヒドモイエティ（RCH
O）が第一アミンモイエティ（R'NH2）と反応した場合、
相対的には不安定なイミンモイエティ（R'N=CHR）であ
る反応生成物の間に平衡が確立される。このカップリン
グ反応は酸化に関して前記されたのと同じ条件下で実施
でき、損傷から糖蛋白質を保護するようにデザインされ
る。糖蛋白質とバイオ物質表面の間の結合を安定化する
ためには、続くイミンモイエティの還元アルキル化を還
元剤（即ち、安定剤）、例えば硼水素化ナトリウム、シ
アノ硼水素化ナトリウム、およびアミンボランを用いて
第二アミン（R'NH-CH2R）を形成することにより実施す
る。この反応は、酸化に関する前記と同じ条件下で実施
することもできる。典型的には、しかしながら、カップ
リングおよび安定化反応は、中性または弱塩基性溶液中
において約０−５０℃の温度で実施される。好ましく
は、カップリングおよび安定化反応のためのｐＨは約６
−１０、そして温度は約４−３７℃である。これらの反
応（カップリングおよび安定化）は、ほんの数分間また
は何時間もの間、続けさせることができる。普通、反応
は２４時間で完了する（即ち、カップリングされるかま
たは安定化される）。
O）が第一アミンモイエティ（R'NH2）と反応した場合、
相対的には不安定なイミンモイエティ（R'N=CHR）であ
る反応生成物の間に平衡が確立される。このカップリン
グ反応は酸化に関して前記されたのと同じ条件下で実施
でき、損傷から糖蛋白質を保護するようにデザインされ
る。糖蛋白質とバイオ物質表面の間の結合を安定化する
ためには、続くイミンモイエティの還元アルキル化を還
元剤（即ち、安定剤）、例えば硼水素化ナトリウム、シ
アノ硼水素化ナトリウム、およびアミンボランを用いて
第二アミン（R'NH-CH2R）を形成することにより実施す
る。この反応は、酸化に関する前記と同じ条件下で実施
することもできる。典型的には、しかしながら、カップ
リングおよび安定化反応は、中性または弱塩基性溶液中
において約０−５０℃の温度で実施される。好ましく
は、カップリングおよび安定化反応のためのｐＨは約６
−１０、そして温度は約４−３７℃である。これらの反
応（カップリングおよび安定化）は、ほんの数分間また
は何時間もの間、続けさせることができる。普通、反応
は２４時間で完了する（即ち、カップリングされるかま
たは安定化される）。
【００２１】一般に、本発明に用いられる糖蛋白質は、
抗凝血および抗血栓剤；血液凝固蛋白質；血小板製剤；
抗炎症剤；抗体；イムノグロブリン；防御蛋白質；酵
素；ホルモン；成長因子；球状蛋白質；血液蛋白質；制
御蛋白質；輸送蛋白質；繊維状蛋白質；構造蛋白質；膜
蛋白質；細胞接着蛋白質；プロテオグリカン類；毒素
類；およびリガンド類でありうる。糖蛋白質は合成由来
であるかまたは天然発生物でありうる。糖蛋白質が１，
２ジヒドロキシモイエティを含む限り、本発明の方法に
よりアミン化バイオ物質表面に結合されうる。
抗凝血および抗血栓剤；血液凝固蛋白質；血小板製剤；
抗炎症剤；抗体；イムノグロブリン；防御蛋白質；酵
素；ホルモン；成長因子；球状蛋白質；血液蛋白質；制
御蛋白質；輸送蛋白質；繊維状蛋白質；構造蛋白質；膜
蛋白質；細胞接着蛋白質；プロテオグリカン類；毒素
類；およびリガンド類でありうる。糖蛋白質は合成由来
であるかまたは天然発生物でありうる。糖蛋白質が１，
２ジヒドロキシモイエティを含む限り、本発明の方法に
よりアミン化バイオ物質表面に結合されうる。
【００２２】いくつかの糖蛋白質は、疎水性基体表面と
接触するようにさせた場合、コンフォメーションの変化
を受けやすい。これらコンフォメーションの変化は内在
化された非極性基の露出に至り、糖蛋白質と上記表面の
間の疎水性相互作用に通じる。これら疎水性相互作用
は、通常、溶液中で糖蛋白質を取り巻いている水分子の
排出を引き起こしうる。蛋白質と表面の間の水分子の排
出は疎水性相互作用を強化して、蛋白質のさらなるコン
フォメーション変化を引き起こしうる。糖蛋白質が経験
するコンフォメーション変化の程度により、その生物学
的特性を破壊するかまたは破壊しないかもしれない。し
たがって、疎水性相互作用の傾向がある糖蛋白質を結合
させる場合は、基体表面の疎水性を考慮に入れなければ
ならない。これらの場合、バイオ物質表面に疎水性環境
を作り、それにより、バイオ分子の生物学的特性を破壊
しうる糖蛋白質と表面の間のあらゆる不所望な疎水性相
互作用を妨害するすことが好ましい。多くの表面誘導化
技術、例えばグラフティング技術は、疎水性基体表面を
作るためのものとして、当業者にはよく知られている。
例えば、セリウムイオン誘導、オゾン暴露、コロナ放
電、ＵＶ照射およびイオン化照射（60Ｃｏ、Ｘ線、高エ
ネルギー電子、プラズマガス放電）に基づく技術が知ら
れている。
接触するようにさせた場合、コンフォメーションの変化
を受けやすい。これらコンフォメーションの変化は内在
化された非極性基の露出に至り、糖蛋白質と上記表面の
間の疎水性相互作用に通じる。これら疎水性相互作用
は、通常、溶液中で糖蛋白質を取り巻いている水分子の
排出を引き起こしうる。蛋白質と表面の間の水分子の排
出は疎水性相互作用を強化して、蛋白質のさらなるコン
フォメーション変化を引き起こしうる。糖蛋白質が経験
するコンフォメーション変化の程度により、その生物学
的特性を破壊するかまたは破壊しないかもしれない。し
たがって、疎水性相互作用の傾向がある糖蛋白質を結合
させる場合は、基体表面の疎水性を考慮に入れなければ
ならない。これらの場合、バイオ物質表面に疎水性環境
を作り、それにより、バイオ分子の生物学的特性を破壊
しうる糖蛋白質と表面の間のあらゆる不所望な疎水性相
互作用を妨害するすことが好ましい。多くの表面誘導化
技術、例えばグラフティング技術は、疎水性基体表面を
作るためのものとして、当業者にはよく知られている。
例えば、セリウムイオン誘導、オゾン暴露、コロナ放
電、ＵＶ照射およびイオン化照射（60Ｃｏ、Ｘ線、高エ
ネルギー電子、プラズマガス放電）に基づく技術が知ら
れている。
【００２３】本発明の方法により修飾されうる基体は、
チタニウム／チタニウム合金、ＴｉＮｉ（形状記憶／超
弾性）、酸化アルミニウム、プラチナ／プラチナ合金、
ステンレス鋼、ＭＰ３５Ｎ、エルギロイ（elgiloy）、
ハイネス（haynes）２５、ステライト（stellite）、熱
分解炭素、銀またはガラス状炭素；ポリマー、例えばポ
リアミド類、ポリカーボネート類、ポリエーテル類、ポ
リエステル類、ポリエチレン類またはポリプロピレン類
を含むポリオレフィン類、ポリスチレン類、ポリウレタ
ン類、ポリビニルクロリド類、ポリビニルピロリドン
類、シリコーンエラストマー類、フルオロポリマー類、
ポリアクリレート類、ポリイソプレン類、ポリテトラフ
ルオロエチレン類、およびゴム；ミネラル類またはセラ
ミックス類、例えばヒドロキシアパタイト；ヒトまたは
動物の蛋白質または組織例えば骨、皮膚、歯、コラーゲ
ン、ラミニン、エラスチンまたはフィブリン；有機物
質、例えば、木、セルロース、または圧縮カーボン；お
よび他の物質例えばガラス、または類似物を含む。これ
らの物質を用いて作られるバイオ物質はコート化または
非コート化、並びに誘導化または非誘導化でありうる。
チタニウム／チタニウム合金、ＴｉＮｉ（形状記憶／超
弾性）、酸化アルミニウム、プラチナ／プラチナ合金、
ステンレス鋼、ＭＰ３５Ｎ、エルギロイ（elgiloy）、
ハイネス（haynes）２５、ステライト（stellite）、熱
分解炭素、銀またはガラス状炭素；ポリマー、例えばポ
リアミド類、ポリカーボネート類、ポリエーテル類、ポ
リエステル類、ポリエチレン類またはポリプロピレン類
を含むポリオレフィン類、ポリスチレン類、ポリウレタ
ン類、ポリビニルクロリド類、ポリビニルピロリドン
類、シリコーンエラストマー類、フルオロポリマー類、
ポリアクリレート類、ポリイソプレン類、ポリテトラフ
ルオロエチレン類、およびゴム；ミネラル類またはセラ
ミックス類、例えばヒドロキシアパタイト；ヒトまたは
動物の蛋白質または組織例えば骨、皮膚、歯、コラーゲ
ン、ラミニン、エラスチンまたはフィブリン；有機物
質、例えば、木、セルロース、または圧縮カーボン；お
よび他の物質例えばガラス、または類似物を含む。これ
らの物質を用いて作られるバイオ物質はコート化または
非コート化、並びに誘導化または非誘導化でありうる。
【００２４】本発明の方法を用いて、管、シート、棒お
よび適切な形態の物品を含むあらゆる形状または形態の
基体を修飾して、多くの医学装置、例えば、血管グラフ
ト、大動脈グラフト、動脈または静脈の血管、血管ステ
ント、透析膜、チューブまたはコネクター、血液酸素供
給器のチューブまたは膜、超透析膜、大動脈内バルー
ン、血液バッグ、カテーテル、縫合糸、ソフトまたはハ
ード組織人工器官、合成人工器官、人工心臓弁、組織接
着剤、心臓ペースメーカー導線、人工臓器、気管内チュ
ーブ、目のためのレンズ例えばコンタクトまたは眼内レ
ンズ、血液取り扱い装置、言語（apheresis）装置、診
断および監視用カテーテルおよびセンサー、バイオセン
サー、歯科装置、薬剤送達システム、またはあらゆる種
類の体内移植片に使用される。
よび適切な形態の物品を含むあらゆる形状または形態の
基体を修飾して、多くの医学装置、例えば、血管グラフ
ト、大動脈グラフト、動脈または静脈の血管、血管ステ
ント、透析膜、チューブまたはコネクター、血液酸素供
給器のチューブまたは膜、超透析膜、大動脈内バルー
ン、血液バッグ、カテーテル、縫合糸、ソフトまたはハ
ード組織人工器官、合成人工器官、人工心臓弁、組織接
着剤、心臓ペースメーカー導線、人工臓器、気管内チュ
ーブ、目のためのレンズ例えばコンタクトまたは眼内レ
ンズ、血液取り扱い装置、言語（apheresis）装置、診
断および監視用カテーテルおよびセンサー、バイオセン
サー、歯科装置、薬剤送達システム、またはあらゆる種
類の体内移植片に使用される。
【００２５】当業者には理解されるとおり、糖蛋白質ま
たは糖蛋白質コーティングは本発明の方法により架橋結
合されうる。即ち、第一アミンモイエティおよび１，２
ジヒドロキシモイエティの両者を含む糖蛋白質または糖
蛋白質コーティングを架橋結合することにより、所望の
物理特性並びに生物特性を提供することができる。アル
デヒド（１，２ジヒドロキシモイエティの酸化の結果と
しての）と、基体または基体コーティングに含まれるア
ミンとの架橋結合により形成されるイミンは、上記のと
おりに還元剤を用いることにより安定化されうる。例え
ば、構造糖蛋白質を架橋結合することにより、基体また
は基体コーティングとして使用されうる物質を形成する
ことができる。また、本明細書に記載される糖蛋白質
は、架橋結合された物質に結合することもできる。ある
いは、糖蛋白質を含むアミンを架橋物質中でアルデヒド
モイエティに付着させうる。
たは糖蛋白質コーティングは本発明の方法により架橋結
合されうる。即ち、第一アミンモイエティおよび１，２
ジヒドロキシモイエティの両者を含む糖蛋白質または糖
蛋白質コーティングを架橋結合することにより、所望の
物理特性並びに生物特性を提供することができる。アル
デヒド（１，２ジヒドロキシモイエティの酸化の結果と
しての）と、基体または基体コーティングに含まれるア
ミンとの架橋結合により形成されるイミンは、上記のと
おりに還元剤を用いることにより安定化されうる。例え
ば、構造糖蛋白質を架橋結合することにより、基体また
は基体コーティングとして使用されうる物質を形成する
ことができる。また、本明細書に記載される糖蛋白質
は、架橋結合された物質に結合することもできる。ある
いは、糖蛋白質を含むアミンを架橋物質中でアルデヒド
モイエティに付着させうる。
【００２６】本発明のすべての側面において使用可能な
物質の例はフィブリノーゲンである。フィブリノーゲン
は構造蛋白質であり、過ヨウ素酸塩源を用いて酸化され
ることによりペンダントアルデヒドモイエティを形成す
ることができるオリゴサッカライドを含む。その結果得
られるアルデヒドモイエティを用いて、アルデヒドとフ
ィブリノーゲンに含まれる近くのリジン残基の間に形成
される結合を通してフィブリノーゲンを架橋結合するこ
とができる。その結果得られるイミン結合は、次に温和
な還元剤例えば、硼水素化ナトリウム、シアノ硼水素化
ナトリウム、またはアミンボランを用いて還元すること
ができる。これらの架橋結合はフィブリノーゲンおよび
／またはフィブリン（トロンビン重合フィブリノーゲ
ン）に所望の生物および／または物理特性、例えば機械
強度、抗免疫原性、生物安定性をカップリング剤の使用
なしに提供しうる。即ち、本発明の方法は、共通に用い
られる細胞毒性カップリング剤であるグルタルアルデヒ
ドを用いる必要性を減じて、フィブリノーゲン分子を架
橋結合することにより、その物理および生物特性を制御
する。
物質の例はフィブリノーゲンである。フィブリノーゲン
は構造蛋白質であり、過ヨウ素酸塩源を用いて酸化され
ることによりペンダントアルデヒドモイエティを形成す
ることができるオリゴサッカライドを含む。その結果得
られるアルデヒドモイエティを用いて、アルデヒドとフ
ィブリノーゲンに含まれる近くのリジン残基の間に形成
される結合を通してフィブリノーゲンを架橋結合するこ
とができる。その結果得られるイミン結合は、次に温和
な還元剤例えば、硼水素化ナトリウム、シアノ硼水素化
ナトリウム、またはアミンボランを用いて還元すること
ができる。これらの架橋結合はフィブリノーゲンおよび
／またはフィブリン（トロンビン重合フィブリノーゲ
ン）に所望の生物および／または物理特性、例えば機械
強度、抗免疫原性、生物安定性をカップリング剤の使用
なしに提供しうる。即ち、本発明の方法は、共通に用い
られる細胞毒性カップリング剤であるグルタルアルデヒ
ドを用いる必要性を減じて、フィブリノーゲン分子を架
橋結合することにより、その物理および生物特性を制御
する。
【００２７】フィブリノーゲン／フィブリンの酸化によ
り形成されるアルデヒドモイエティを使用して、さまざ
まなアミン含有バイオ分子をフィブリノーゲン／フィブ
リン基体にカップリングすることもできる。また、フィ
ブリノーゲン／フィブリン分子に沿ってアルデヒドモイ
エティを作る能力は、アミン含有基体表面への共有結合
を可能にする。そのようなフィブリノーゲン／フィブリ
ンコートされた基体表面は、例えば、細胞散布表面、細
胞結合表面、細胞分離表面、組織固定、フィブリノーゲ
ン／フィブリンコートステントまたはフィブリノーゲン
／フィブリンコート血管グラフトまたはフィブリノーゲ
ン／フィブリン接着剤として用いることができる。
り形成されるアルデヒドモイエティを使用して、さまざ
まなアミン含有バイオ分子をフィブリノーゲン／フィブ
リン基体にカップリングすることもできる。また、フィ
ブリノーゲン／フィブリン分子に沿ってアルデヒドモイ
エティを作る能力は、アミン含有基体表面への共有結合
を可能にする。そのようなフィブリノーゲン／フィブリ
ンコートされた基体表面は、例えば、細胞散布表面、細
胞結合表面、細胞分離表面、組織固定、フィブリノーゲ
ン／フィブリンコートステントまたはフィブリノーゲン
／フィブリンコート血管グラフトまたはフィブリノーゲ
ン／フィブリン接着剤として用いることができる。
【００２８】以下に記載される実施例は基体表面として
のポリマーフィルムまたは組織培養プレートへの処理を
包含するが、本発明を限定することを意図しない。
のポリマーフィルムまたは組織培養プレートへの処理を
包含するが、本発明を限定することを意図しない。
【００２９】
実施例１ ウシフィブリノーゲンの過ヨウ素酸塩による酸化 シグマケミカル社（セントルイス，MO）から得られた糖
蛋白質ウシフィブリノーゲンをメタ過ヨウ素酸ナトリウ
ム（NaIO4、これもシグマケミカル社から得られた）中
でインキュベートした。以下の４つのフィブリノーゲン
溶液を作成して、さまざまな量の過ヨウ素酸塩を用いて
フィブリノーゲンの酸化を調査した：（１）0.03mMフィ
ブリノーゲン、0.2mM NaIO4、0.008M Na2HPO4、0.002M
KH2PO4、0.14M NaCl、pH7.4；（２）0.03mMフィブリノ
ーゲン、0.1mM NaIO4、0.008M Na2HPO4、0.002M KH2P
O4、0.14M NaCl、pH7.4；（３）0.03mMフィブリノーゲ
ン、0.05mM NaIO4、0.008M Na2HPO4、0.002M KH2PO4、
0.14M NaCl、pH7.4；および（４）0.03mMフィブリノー
ゲン、0.008M Na2HPO4、0.002M KH2PO4、0.14M NaCl、p
H7.4。４つのフィブリノーゲン溶液を暗黒下で２時間室
温にて撹拌しながらインキュベートした。その結果得ら
れた溶液各500μlを、0.8ｇのNaOH，0.2ｇの4-アミノ-3
-ヒドラジノ-5-メルカプト-1，2，4-トリアゾル（シグ
マケミカル社（セントルイス、MO）から商標名PURPALD
で市販されている）を20ml脱イオン水中に含有する溶液
２mlに加え、そして室温において15分間激しく撹拌し
た。ディッキンソンとヤコブセン（Dickinson and Jaco
bsen）、Chem．Commun.，1719（1970）は、分光光度計
を用いて550nmにおいて測定されうる、紫からマゼンタ
色の6-メルカプト-5-トリアゾル−(4，3-b)-s-テトラジ
ンを生成するための、アルデヒドとPURPALDとの特異的
且つ過敏な反応を記載した。室温にて15分間の撹拌後、
得られた溶液を550nmにおいて分光分析した。サンプル
４をブランクとして用いた。550nmにおいて得られたサ
ンプルの吸光度は、サンプル１が0.54、サンプル２が0.
53、そしてサンプル３が0.51であったことから、すべて
のサンプルに関してフィブリノーゲンが首尾よく酸化さ
れてアルデヒド基を形成したことが示される。
蛋白質ウシフィブリノーゲンをメタ過ヨウ素酸ナトリウ
ム（NaIO4、これもシグマケミカル社から得られた）中
でインキュベートした。以下の４つのフィブリノーゲン
溶液を作成して、さまざまな量の過ヨウ素酸塩を用いて
フィブリノーゲンの酸化を調査した：（１）0.03mMフィ
ブリノーゲン、0.2mM NaIO4、0.008M Na2HPO4、0.002M
KH2PO4、0.14M NaCl、pH7.4；（２）0.03mMフィブリノ
ーゲン、0.1mM NaIO4、0.008M Na2HPO4、0.002M KH2P
O4、0.14M NaCl、pH7.4；（３）0.03mMフィブリノーゲ
ン、0.05mM NaIO4、0.008M Na2HPO4、0.002M KH2PO4、
0.14M NaCl、pH7.4；および（４）0.03mMフィブリノー
ゲン、0.008M Na2HPO4、0.002M KH2PO4、0.14M NaCl、p
H7.4。４つのフィブリノーゲン溶液を暗黒下で２時間室
温にて撹拌しながらインキュベートした。その結果得ら
れた溶液各500μlを、0.8ｇのNaOH，0.2ｇの4-アミノ-3
-ヒドラジノ-5-メルカプト-1，2，4-トリアゾル（シグ
マケミカル社（セントルイス、MO）から商標名PURPALD
で市販されている）を20ml脱イオン水中に含有する溶液
２mlに加え、そして室温において15分間激しく撹拌し
た。ディッキンソンとヤコブセン（Dickinson and Jaco
bsen）、Chem．Commun.，1719（1970）は、分光光度計
を用いて550nmにおいて測定されうる、紫からマゼンタ
色の6-メルカプト-5-トリアゾル−(4，3-b)-s-テトラジ
ンを生成するための、アルデヒドとPURPALDとの特異的
且つ過敏な反応を記載した。室温にて15分間の撹拌後、
得られた溶液を550nmにおいて分光分析した。サンプル
４をブランクとして用いた。550nmにおいて得られたサ
ンプルの吸光度は、サンプル１が0.54、サンプル２が0.
53、そしてサンプル３が0.51であったことから、すべて
のサンプルに関してフィブリノーゲンが首尾よく酸化さ
れてアルデヒド基を形成したことが示される。
【００３０】実施例２ ウシビトロネクチンの過ヨウ素酸塩による酸化 シグマケミカル社（セントルイス，MO）から得られた糖
蛋白質ウシビトロネクチンをメタ過ヨウ素酸ナトリウム
（NaIO4、これもシグマケミカル社から得られた）中で
インキュベートした。以下の２つのビトロネクチン溶液
を作成した：（１）0.001mMビトロネクチン、0.05M NaI
O4および（４）0.001mMビトロネクチン。２つのビトロ
ネクチン溶液を暗黒下で２時間室温にて撹拌しながらイ
ンキュベートした。その結果得られた溶液各100μlを、
実施例１で記載された２mlのPURPALD溶液に加えて、室
温において30分間激しく撹拌した。室温にて30分間の撹
拌後、得られた溶液を550nmにおいて分光分析した。PUR
PALD溶液をブランクとして用いた。550nmにおいて得ら
れたサンプルの吸光度は、サンプル１が0.09そしてサン
プル２が0.04であったことから、ビトロネクチンが首尾
よく酸化されてアルデヒド基を形成したことが示され
る。
蛋白質ウシビトロネクチンをメタ過ヨウ素酸ナトリウム
（NaIO4、これもシグマケミカル社から得られた）中で
インキュベートした。以下の２つのビトロネクチン溶液
を作成した：（１）0.001mMビトロネクチン、0.05M NaI
O4および（４）0.001mMビトロネクチン。２つのビトロ
ネクチン溶液を暗黒下で２時間室温にて撹拌しながらイ
ンキュベートした。その結果得られた溶液各100μlを、
実施例１で記載された２mlのPURPALD溶液に加えて、室
温において30分間激しく撹拌した。室温にて30分間の撹
拌後、得られた溶液を550nmにおいて分光分析した。PUR
PALD溶液をブランクとして用いた。550nmにおいて得ら
れたサンプルの吸光度は、サンプル１が0.09そしてサン
プル２が0.04であったことから、ビトロネクチンが首尾
よく酸化されてアルデヒド基を形成したことが示され
る。
【００３１】実施例３ ウシフィブロネクチンの過ヨウ素酸塩による酸化 シグマケミカル社（セントルイス，MO）から得られた糖
蛋白質ウシフィブロネクチンをメタ過ヨウ素酸ナトリウ
ム（NaIO4、これもシグマケミカル社から得られた）中
でインキュベートした。以下の２つのフィブロネクチン
溶液を作成した：（１）0.002mMフィブロネクチン、0.0
5M NaIO4、0.5M NaCl、0.05 M Tris，pH7.5；および
（２）0.002mMフィブロネクチン、0.5M NaCl、0.05 M T
ris，pH7.5。両溶液を暗黒下で２時間室温にて撹拌しな
がらインキュベートした。その結果得られた溶液各100
μlを、実施例１で記載されたPURPALD溶液２mlに加え
て、室温において30分間激しく撹拌した。室温にて30分
間の撹拌後、得られた溶液を550nmにおいて分光分析し
た。PURPALD溶液をブランクとして用いた。550nmにおい
て得られたサンプルの吸光度は、サンプル１が0.81、そ
してサンプル２が0.0であったことから、サンプル１の
フィブロネクチンは首尾よく酸化されてアルデヒド基を
形成したことが示される。
蛋白質ウシフィブロネクチンをメタ過ヨウ素酸ナトリウ
ム（NaIO4、これもシグマケミカル社から得られた）中
でインキュベートした。以下の２つのフィブロネクチン
溶液を作成した：（１）0.002mMフィブロネクチン、0.0
5M NaIO4、0.5M NaCl、0.05 M Tris，pH7.5；および
（２）0.002mMフィブロネクチン、0.5M NaCl、0.05 M T
ris，pH7.5。両溶液を暗黒下で２時間室温にて撹拌しな
がらインキュベートした。その結果得られた溶液各100
μlを、実施例１で記載されたPURPALD溶液２mlに加え
て、室温において30分間激しく撹拌した。室温にて30分
間の撹拌後、得られた溶液を550nmにおいて分光分析し
た。PURPALD溶液をブランクとして用いた。550nmにおい
て得られたサンプルの吸光度は、サンプル１が0.81、そ
してサンプル２が0.0であったことから、サンプル１の
フィブロネクチンは首尾よく酸化されてアルデヒド基を
形成したことが示される。
【００３２】実施例４ フィブロネクチンのアミン化基体への付着 フィブロネクチンを基質表面に共有結合させた。結合技
術は、セリウムイオン（CeIV）を用いて、オゾン処理さ
れたポリスチレン組織培養プレート上への、アクリルア
ミド（AAm）およびN-（3-アミノプロピル）メタクリル
アミド（APMA）モノマーのグラフト共重合により開始す
る。CeIVイオンは、オゾン処理されたシリコーンおよび
ポリスチレン表面およびアクリルアミドのグラフト共重
合を誘導する非処理ポリウレタン上にフリーラジカルを
作る。基体表面上に生じる表面アミネーション（APMAと
AAmのグラフト共重合）の量は、陰性電荷染料分子であ
るポンソーで染色することにより測定された。グラフト
後、フィブロネクチンを、アミン含有誘導化基体表面と
カップリングさせた。フィブロネクチンを最初にメタ過
ヨウ素酸ナトリウム（NaIO4）で酸化して、反応性アル
デヒドモイエティを形成する。次に、これらのアルデヒ
ドモイエティを使用して、基体表面上に存在する第一ア
ミノモイエティにフィブロネクチンを共有結合させた。
次に、シアノ硼水素化ナトリウム（NaCNBH3）を用いて
イミン結合を安定化した。これら各工程に必要な特定の
方法は以下に記載される。
術は、セリウムイオン（CeIV）を用いて、オゾン処理さ
れたポリスチレン組織培養プレート上への、アクリルア
ミド（AAm）およびN-（3-アミノプロピル）メタクリル
アミド（APMA）モノマーのグラフト共重合により開始す
る。CeIVイオンは、オゾン処理されたシリコーンおよび
ポリスチレン表面およびアクリルアミドのグラフト共重
合を誘導する非処理ポリウレタン上にフリーラジカルを
作る。基体表面上に生じる表面アミネーション（APMAと
AAmのグラフト共重合）の量は、陰性電荷染料分子であ
るポンソーで染色することにより測定された。グラフト
後、フィブロネクチンを、アミン含有誘導化基体表面と
カップリングさせた。フィブロネクチンを最初にメタ過
ヨウ素酸ナトリウム（NaIO4）で酸化して、反応性アル
デヒドモイエティを形成する。次に、これらのアルデヒ
ドモイエティを使用して、基体表面上に存在する第一ア
ミノモイエティにフィブロネクチンを共有結合させた。
次に、シアノ硼水素化ナトリウム（NaCNBH3）を用いて
イミン結合を安定化した。これら各工程に必要な特定の
方法は以下に記載される。
【００３３】ポリスチレン製の24ウエルの組織培養プレ
ートを30分間オゾン反応容器中に置いて、オゾン含有酸
素1.3cm3／分の速度で流すことによりオゾン処理した。
オゾン含有酸素はコロナ放電装置を通して酸素を流すこ
とにより作り、流れる酸素を8000Ｖ電気ポテンシャルに
暴露した。オゾン処理後、窒素パージした脱イオン水中
にプレートを30分間室温で浸した。窒素パージした脱イ
オン水中に30分間浸した後、プレートは、硝酸アンモニ
ウムセリウム（IV）（アルドリッチケミカル社（Aldric
h Chemical Co.）、ミルウオーキー、WI）を用いて、ア
クリルアミド（AAm）およびN-（3-アミノプロピル）メ
タクリルアミド（APMA）モノマー（イーストマンコダッ
ク社（Eastman Kodak Co.）、ロチェスター、NY）でグ
ラフトした。グラフト溶液は、11.2Ｍ AAm，1.1Ｍ APM
A，400mM 硝酸、および40mM 硝酸アンモニウムセリウム
（IV）脱イオン水溶液からなった。プレートは、３時間
65℃の窒素パージオーブン中でグラフトさせた。グラフ
ト後、プレートを脱イオン水で激しく洗浄した。グラフ
トされたプレートは、次にポンソーＳ染料を用いて試験
された。染色後、１％ドデシル硫酸ナトリウムを用いて
ポンソーＳ染料を表面から除き、分光光度計で520nmに
おいて定量した。520nmにおいて得られたサンプルの吸
光度は非誘導化プレートに関して0.00であり、表面−誘
導化プレートに関しては1.44であった。結果が示すとお
り、表面誘導化プレートは表面上に第一アミンを含む。
ートを30分間オゾン反応容器中に置いて、オゾン含有酸
素1.3cm3／分の速度で流すことによりオゾン処理した。
オゾン含有酸素はコロナ放電装置を通して酸素を流すこ
とにより作り、流れる酸素を8000Ｖ電気ポテンシャルに
暴露した。オゾン処理後、窒素パージした脱イオン水中
にプレートを30分間室温で浸した。窒素パージした脱イ
オン水中に30分間浸した後、プレートは、硝酸アンモニ
ウムセリウム（IV）（アルドリッチケミカル社（Aldric
h Chemical Co.）、ミルウオーキー、WI）を用いて、ア
クリルアミド（AAm）およびN-（3-アミノプロピル）メ
タクリルアミド（APMA）モノマー（イーストマンコダッ
ク社（Eastman Kodak Co.）、ロチェスター、NY）でグ
ラフトした。グラフト溶液は、11.2Ｍ AAm，1.1Ｍ APM
A，400mM 硝酸、および40mM 硝酸アンモニウムセリウム
（IV）脱イオン水溶液からなった。プレートは、３時間
65℃の窒素パージオーブン中でグラフトさせた。グラフ
ト後、プレートを脱イオン水で激しく洗浄した。グラフ
トされたプレートは、次にポンソーＳ染料を用いて試験
された。染色後、１％ドデシル硫酸ナトリウムを用いて
ポンソーＳ染料を表面から除き、分光光度計で520nmに
おいて定量した。520nmにおいて得られたサンプルの吸
光度は非誘導化プレートに関して0.00であり、表面−誘
導化プレートに関しては1.44であった。結果が示すとお
り、表面誘導化プレートは表面上に第一アミンを含む。
【００３４】シグマケミカル社（セントルイス，MO）か
ら得られた糖蛋白質ウシフィブリノーゲンをメタ過ヨウ
素酸ナトリウム（NaIO4、これもシグマケミカル社から
得られた）中でインキュベートした。以下のフィブロネ
クチン溶液：0.002mM フィブロネクチン、0.05M NaI
O4、0.5M NaCl、0.05M Tris，pH7.5を作成した。該溶液
を暗黒下で２時間室温にて撹拌しながらインキュベート
した。その結果得られた溶液を、すぐにアミン含有表面
誘導化組織培養プレート各々に加えた（約１ml溶液／ウ
エル）。フィブロネクチン溶液を、該誘導化組織培養プ
レートウエル中で一晩室温にてインキュベートした。イ
ンキュベート後、ウエルをリン酸バッファー塩（PBS）
溶液で激しく洗浄した。アミン含有表面誘導化組織培養
プレート表面へのフィブロネクチンの付着は、陽性荷電
染料分子であるトルイジンブルー染料を用いて評価され
た。この染料は、基質表面上の陰性荷電にイオン結合す
る。したがって、トルイジンブルーのフィブロネクチン
誘導化表面への結合はフィブロネクチンの陰性荷電によ
る。各プレートのウエルを１％トルイジンブルー脱イオ
ン水溶液で満たした。室温にて５分間インキュベート
後、染料溶液を除去し、ウエルを徹底的にPBSで洗浄し
た。各ウエル中の染料を結合した表面は、次に１％SDS
脱イオン水溶液中でプレートを機械的に激しく震盪する
ことにより溶出した。ウエルから溶出した染料の量は63
0nmにおいて分光光度計で測定した。630nmにおいて得ら
れた非誘導化サンプルプレートに関しての吸光は0.05で
あり、AAm/APMA誘導化サンプルプレートに関しては0.54
であり、そしてフィブロネクチン誘導化サンプルにプレ
ートに関しては1.83であったことから、フィブロネクチ
ンが首尾よく酸化されて基質表面に共有結合したことが
示される。
ら得られた糖蛋白質ウシフィブリノーゲンをメタ過ヨウ
素酸ナトリウム（NaIO4、これもシグマケミカル社から
得られた）中でインキュベートした。以下のフィブロネ
クチン溶液：0.002mM フィブロネクチン、0.05M NaI
O4、0.5M NaCl、0.05M Tris，pH7.5を作成した。該溶液
を暗黒下で２時間室温にて撹拌しながらインキュベート
した。その結果得られた溶液を、すぐにアミン含有表面
誘導化組織培養プレート各々に加えた（約１ml溶液／ウ
エル）。フィブロネクチン溶液を、該誘導化組織培養プ
レートウエル中で一晩室温にてインキュベートした。イ
ンキュベート後、ウエルをリン酸バッファー塩（PBS）
溶液で激しく洗浄した。アミン含有表面誘導化組織培養
プレート表面へのフィブロネクチンの付着は、陽性荷電
染料分子であるトルイジンブルー染料を用いて評価され
た。この染料は、基質表面上の陰性荷電にイオン結合す
る。したがって、トルイジンブルーのフィブロネクチン
誘導化表面への結合はフィブロネクチンの陰性荷電によ
る。各プレートのウエルを１％トルイジンブルー脱イオ
ン水溶液で満たした。室温にて５分間インキュベート
後、染料溶液を除去し、ウエルを徹底的にPBSで洗浄し
た。各ウエル中の染料を結合した表面は、次に１％SDS
脱イオン水溶液中でプレートを機械的に激しく震盪する
ことにより溶出した。ウエルから溶出した染料の量は63
0nmにおいて分光光度計で測定した。630nmにおいて得ら
れた非誘導化サンプルプレートに関しての吸光は0.05で
あり、AAm/APMA誘導化サンプルプレートに関しては0.54
であり、そしてフィブロネクチン誘導化サンプルにプレ
ートに関しては1.83であったことから、フィブロネクチ
ンが首尾よく酸化されて基質表面に共有結合したことが
示される。
【００３５】実施例５ ＥＬＩＳＡおよびフィブロネクチン結合表面への細胞接
着 ペレタン（Pellethane）2363-55Dの形態のポリウレタン
をダウケミカル社（Dow Chemical Co.）、（ミッドラン
ド、MI））から得て、フィルムに伸ばした。このフィル
ムを１cm2のサンプルディスクに切り出した。次にサン
プルディスクをエタノールで洗浄してCeIVイオンを用い
て、AAmおよびAPMAモノマーで表面グラフトした。グラ
フト溶液は、11.2M AAm，1.1M APMA，400mM 硝酸および
40mM 硝酸アンモニウムセリウム（IV）脱イオン水溶液
からなった。サンプルディスクをグラフト溶液中に入
れ、１時間室温でグラフトさせた。グラフト後、サンプ
ルディスクを徹底的に脱イオン水で洗浄した。次に、そ
の結果得られたAPMA/AAm表面誘導化サンプルディスク
に、２つの方法を用いてフィブロネクチンをカップリン
グさせた。
着 ペレタン（Pellethane）2363-55Dの形態のポリウレタン
をダウケミカル社（Dow Chemical Co.）、（ミッドラン
ド、MI））から得て、フィルムに伸ばした。このフィル
ムを１cm2のサンプルディスクに切り出した。次にサン
プルディスクをエタノールで洗浄してCeIVイオンを用い
て、AAmおよびAPMAモノマーで表面グラフトした。グラ
フト溶液は、11.2M AAm，1.1M APMA，400mM 硝酸および
40mM 硝酸アンモニウムセリウム（IV）脱イオン水溶液
からなった。サンプルディスクをグラフト溶液中に入
れ、１時間室温でグラフトさせた。グラフト後、サンプ
ルディスクを徹底的に脱イオン水で洗浄した。次に、そ
の結果得られたAPMA/AAm表面誘導化サンプルディスク
に、２つの方法を用いてフィブロネクチンをカップリン
グさせた。
【００３６】第一の方法または過酸化法は、メタ過ヨウ
素酸ナトリウムによりフィブロネクチンを酸化すること
を含んだ。フィブロネクチン（0.1mg/ml）を暗黒中で１
μg/mlのメタ過ヨウ素酸ナトリウム脱イオン水溶液に３
時間室温で暴露した。次に、APMA/AAm表面誘導化サンプ
ルディスクを酸化フィブロネクチン溶液に入れて、24時
間室温においた。次に、サンプルディスクを脱イオン水
で徹底的に洗浄した。次に、サンプルを24時間室温にお
いて３mg/mlシアノ硼水素化ナトリウム脱イオン水溶液
中でインキュベートした。次に、サンプルディスクを脱
イオン水で徹底的に洗浄した。
素酸ナトリウムによりフィブロネクチンを酸化すること
を含んだ。フィブロネクチン（0.1mg/ml）を暗黒中で１
μg/mlのメタ過ヨウ素酸ナトリウム脱イオン水溶液に３
時間室温で暴露した。次に、APMA/AAm表面誘導化サンプ
ルディスクを酸化フィブロネクチン溶液に入れて、24時
間室温においた。次に、サンプルディスクを脱イオン水
で徹底的に洗浄した。次に、サンプルを24時間室温にお
いて３mg/mlシアノ硼水素化ナトリウム脱イオン水溶液
中でインキュベートした。次に、サンプルディスクを脱
イオン水で徹底的に洗浄した。
【００３７】第二の方法はグルタルアルデヒドをカップ
リング剤として用いた。この方法は、APMA/AAm誘導化サ
ンプルディスクを２％グルタルアルデヒド脱イオン水溶
液中に２時間室温で浸すことを含んだ。次に、サンプル
ディスクを脱イオン水で徹底的に洗浄した。洗浄後、次
に、サンプルディスクを0.1mg/mlフィブロネクチン脱イ
オン水溶液中で24時間室温においてインキュベートし
た。次に、サンプルディスクを３mg/mlシアノ硼水素化
ナトリウム脱イオン水溶液中で24時間室温においてイン
キュベートした。次に、サンプルディスクを脱イオン水
で徹底的に洗浄した。
リング剤として用いた。この方法は、APMA/AAm誘導化サ
ンプルディスクを２％グルタルアルデヒド脱イオン水溶
液中に２時間室温で浸すことを含んだ。次に、サンプル
ディスクを脱イオン水で徹底的に洗浄した。洗浄後、次
に、サンプルディスクを0.1mg/mlフィブロネクチン脱イ
オン水溶液中で24時間室温においてインキュベートし
た。次に、サンプルディスクを３mg/mlシアノ硼水素化
ナトリウム脱イオン水溶液中で24時間室温においてイン
キュベートした。次に、サンプルディスクを脱イオン水
で徹底的に洗浄した。
【００３８】次に、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELIS
A）を実施して、抗体がサンプル表面にカップリングし
たフィブロネクチンを認識する可能性を測定した。サン
プルディスクは、10mM Tris，0.15M NaClおよび0.05％
ツイーンからなる洗浄バッファー（pH7.4）で20分間室
温において洗浄した。次に、サンプルディスクを、10mM
Tris，0.15M NaCl，0.05％ツイーンおよび0.05％ゼラチ
ンからなるブロッキングバッファー（pH7.4）で30分間3
7℃において洗浄し、洗浄バッファーで３回10分間洗浄
した。次に、サンプルディスクを、10mM Tris，0.15M N
aClおよび２μg/mlマウスモノクローナル抗フィブロネ
クチン抗体（シグマケミカル社、セントルイス、MO）か
らなる一次抗体溶液（pH7.4）中で37℃１時間インキュ
ベートした。次に、サンプルディスクを洗浄バッファー
で３回洗浄した（洗浄あたり10分間）。次に、サンプル
ディスクを、１時間、10mM Tris，0.15M NaClおよび0.5
ng/ml抗マウスIgGペルオキシダーゼ抗体配合物（シグマ
ケミカル、セントルイス、MO）かならるペルオキシダー
ゼ標識二次抗体溶液（pH7.4）中でインキュベートし
た。次に、サンプルディスクを洗浄バッファーで３回洗
浄した（洗浄あたり10分間）。次に、サンプルディスク
を、0.4mg/ml ｏ−フェニルジアミンジヒドロクロリド
および0.2μl/ml 30％過酸化水素を含むリン酸-クエン
酸バッファー（pH5.0）中で15分間室温においてインキ
ュベートした。リン酸−クエン酸バッファーは、脱イオ
ン水中の50mM リン酸二塩基ナトリウムおよび25mM クエ
ン酸からなった。15分間のインキュベートの後、過酸化
反応を３Ｍ HClで停止して、得られた溶液の吸光を492n
mにおいて分光測定した。次に、APMA/AAm誘導化サンプ
ルディスクをこの実験の対照として用いた。分光分析か
ら得られたサンプルの吸光は、グルタルアルデヒドでカ
ップリングされたフィブロネクチンを含んだAPMA/AAm誘
導化サンプルに関しては0.016±0.038であり、過ヨウ素
酸塩で酸化されたフィブロネクチンを含んだAPMA/AAm誘
導化サンプルに関しては0.204±0.068であった。これら
の結果から、過ヨウ素酸塩酸化法がサンプル表面へのフ
ィブロネクチンの付着においてよりうまくいったことを
示す。
A）を実施して、抗体がサンプル表面にカップリングし
たフィブロネクチンを認識する可能性を測定した。サン
プルディスクは、10mM Tris，0.15M NaClおよび0.05％
ツイーンからなる洗浄バッファー（pH7.4）で20分間室
温において洗浄した。次に、サンプルディスクを、10mM
Tris，0.15M NaCl，0.05％ツイーンおよび0.05％ゼラチ
ンからなるブロッキングバッファー（pH7.4）で30分間3
7℃において洗浄し、洗浄バッファーで３回10分間洗浄
した。次に、サンプルディスクを、10mM Tris，0.15M N
aClおよび２μg/mlマウスモノクローナル抗フィブロネ
クチン抗体（シグマケミカル社、セントルイス、MO）か
らなる一次抗体溶液（pH7.4）中で37℃１時間インキュ
ベートした。次に、サンプルディスクを洗浄バッファー
で３回洗浄した（洗浄あたり10分間）。次に、サンプル
ディスクを、１時間、10mM Tris，0.15M NaClおよび0.5
ng/ml抗マウスIgGペルオキシダーゼ抗体配合物（シグマ
ケミカル、セントルイス、MO）かならるペルオキシダー
ゼ標識二次抗体溶液（pH7.4）中でインキュベートし
た。次に、サンプルディスクを洗浄バッファーで３回洗
浄した（洗浄あたり10分間）。次に、サンプルディスク
を、0.4mg/ml ｏ−フェニルジアミンジヒドロクロリド
および0.2μl/ml 30％過酸化水素を含むリン酸-クエン
酸バッファー（pH5.0）中で15分間室温においてインキ
ュベートした。リン酸−クエン酸バッファーは、脱イオ
ン水中の50mM リン酸二塩基ナトリウムおよび25mM クエ
ン酸からなった。15分間のインキュベートの後、過酸化
反応を３Ｍ HClで停止して、得られた溶液の吸光を492n
mにおいて分光測定した。次に、APMA/AAm誘導化サンプ
ルディスクをこの実験の対照として用いた。分光分析か
ら得られたサンプルの吸光は、グルタルアルデヒドでカ
ップリングされたフィブロネクチンを含んだAPMA/AAm誘
導化サンプルに関しては0.016±0.038であり、過ヨウ素
酸塩で酸化されたフィブロネクチンを含んだAPMA/AAm誘
導化サンプルに関しては0.204±0.068であった。これら
の結果から、過ヨウ素酸塩酸化法がサンプル表面へのフ
ィブロネクチンの付着においてよりうまくいったことを
示す。
【００３９】細胞接着アッセイも実施して、フィブロネ
クチン誘導化サンプル表面への細胞接着の可能性につい
て測定した。サンプルディスクは、リン酸バッファー塩
（PBS）（pH7.4）中に２mg/mlオバルブミンを含むブロ
ッキングバッファー中で１時間37℃においてインキュベ
ートした。アメリカンタイプカルチャーコレクション
（ロックビル、MD）から得られてダルベッコを修飾した
10％ウシ胎児血清含有イーグル培地（DMEM）中に維持さ
れたマウス繊維芽細胞（C3T3）をトリプシン：EDTAを用
いて回収して２mg/mlのオバルブミンを含む血清不含DME
M中に懸濁した。次に、この細胞を、２回洗浄して、計
数してから２mg/mlオバルブミン含有血清不含DMEM中に
５×104細胞/mlの密度になるように懸濁した。次に、サ
ンプルディスクを細胞懸濁液中に１時間37℃でインキュ
ベートした。非吸着細胞をPBS洗浄により除去した。次
に、サンプルディスクを３％パラホルムアルデヒド溶液
中で30分間固定した。次に、吸着細胞を、１％トルイジ
ンブルー染料および３％パラホルムアルデヒドを含むPB
S中で染色した。染色後、サンプル表面を光学顕微鏡で
細胞吸着に関して試験した。試験において、APMA/AAm誘
導化サンプルおよびグルタルアルデヒドカップリングフ
ィブロネクチンを含んだAPMA/AAm誘導化サンプルは細胞
を吸着しなかったことがわかった。対照的に、過ヨウ素
酸塩で酸化されたフィブロネクチンを含んだAPMA/AAm誘
導化サンプルには、細胞は吸着しなかったことがわかっ
た。
クチン誘導化サンプル表面への細胞接着の可能性につい
て測定した。サンプルディスクは、リン酸バッファー塩
（PBS）（pH7.4）中に２mg/mlオバルブミンを含むブロ
ッキングバッファー中で１時間37℃においてインキュベ
ートした。アメリカンタイプカルチャーコレクション
（ロックビル、MD）から得られてダルベッコを修飾した
10％ウシ胎児血清含有イーグル培地（DMEM）中に維持さ
れたマウス繊維芽細胞（C3T3）をトリプシン：EDTAを用
いて回収して２mg/mlのオバルブミンを含む血清不含DME
M中に懸濁した。次に、この細胞を、２回洗浄して、計
数してから２mg/mlオバルブミン含有血清不含DMEM中に
５×104細胞/mlの密度になるように懸濁した。次に、サ
ンプルディスクを細胞懸濁液中に１時間37℃でインキュ
ベートした。非吸着細胞をPBS洗浄により除去した。次
に、サンプルディスクを３％パラホルムアルデヒド溶液
中で30分間固定した。次に、吸着細胞を、１％トルイジ
ンブルー染料および３％パラホルムアルデヒドを含むPB
S中で染色した。染色後、サンプル表面を光学顕微鏡で
細胞吸着に関して試験した。試験において、APMA/AAm誘
導化サンプルおよびグルタルアルデヒドカップリングフ
ィブロネクチンを含んだAPMA/AAm誘導化サンプルは細胞
を吸着しなかったことがわかった。対照的に、過ヨウ素
酸塩で酸化されたフィブロネクチンを含んだAPMA/AAm誘
導化サンプルには、細胞は吸着しなかったことがわかっ
た。
【００４０】実施例６ フィブリノーゲンの吸着 シグマケミカル社（セントルイス、MO）から得られたブ
タフィブリノーゲンをこれもシグマケミカル社から得ら
れたメタ過ヨウ素酸ナトリウム（NaIO4）ならびにアル
ドリッチケミカル社（ミルウオーキー、WI）から得られ
たシアノ硼水素化ナトリウム（NaCNBH3）中でインキュ
ベートした。以下のフィブリノーゲン溶液：0.03mMフィ
ブリノーゲン、0.02M NaIO4、0.02M NaCNBH3，0.008M N
a2HPO4、0.002M KH2PO4、0.14M NaCl、pH7.4を作成し
た。該溶液を激しく撹拌して24ウエルの組織培養プレー
ト中においた（約１mlのフィブリノーゲン溶液／ウエ
ル）。次に、プレートを暗黒下で２時間室温にて撹拌し
ながらインキュベートした。２時間後、溶液は濁り、極
めて粘性が高くなったことが観察されたため、フィブリ
ノーゲンが架橋結合されたことが示された。次に、サン
プルをさらに22時間暗黒下で撹拌した。インキュベート
後、架橋されたフィブリノーゲンは、実施例１に記載さ
れたPURPALD溶液を用いて残余のアルデヒドに関して試
験された。PURPALDアッセイの結果から、わずかに残っ
たアルデヒドが存在したため、アルデヒドと、フィブリ
ノーゲン分子と共に存在するアミンとの間の共有架橋の
形成が示唆された。
タフィブリノーゲンをこれもシグマケミカル社から得ら
れたメタ過ヨウ素酸ナトリウム（NaIO4）ならびにアル
ドリッチケミカル社（ミルウオーキー、WI）から得られ
たシアノ硼水素化ナトリウム（NaCNBH3）中でインキュ
ベートした。以下のフィブリノーゲン溶液：0.03mMフィ
ブリノーゲン、0.02M NaIO4、0.02M NaCNBH3，0.008M N
a2HPO4、0.002M KH2PO4、0.14M NaCl、pH7.4を作成し
た。該溶液を激しく撹拌して24ウエルの組織培養プレー
ト中においた（約１mlのフィブリノーゲン溶液／ウエ
ル）。次に、プレートを暗黒下で２時間室温にて撹拌し
ながらインキュベートした。２時間後、溶液は濁り、極
めて粘性が高くなったことが観察されたため、フィブリ
ノーゲンが架橋結合されたことが示された。次に、サン
プルをさらに22時間暗黒下で撹拌した。インキュベート
後、架橋されたフィブリノーゲンは、実施例１に記載さ
れたPURPALD溶液を用いて残余のアルデヒドに関して試
験された。PURPALDアッセイの結果から、わずかに残っ
たアルデヒドが存在したため、アルデヒドと、フィブリ
ノーゲン分子と共に存在するアミンとの間の共有架橋の
形成が示唆された。
【００４１】以下のウシフィブリノーゲン（シグマケミ
カル社、セントルイス，MO）溶液：0.02mMフィブリノー
ゲン、0.008M Na2HPO4、0.002M KH2PO4、0.14M NaCl、p
H7.4を作成した。作成後、溶液を４分割した。次に、メ
タ過ヨウ素酸ナトリウム（0.05mM）をサンプル３および
４に加えた。全部で４つのフィブリノーゲン溶液を次に
２時間震盪しながら室温においてインキュベートした。
次に、0.02mMのNaCNBH3をサンプル２および４に加え
た。再び、４つのフィブリノーゲン溶液を２時間室温に
おいて反応させた。各50μlのサンプルを、次に、62.5m
M Tris-HCl，５％b-メルカプトエタノール、10％グリセ
ロールおよび2.3％ SDSからなるSDS-PAGEバッファー溶
液450μl中に入れた。サンプルを３分間ボイルした。各
10μlのサンプルを、次に、４−15％グラジエントゲル
にのせてO'Farrell「蛋白質の高解像二次元電気泳
動」、J．Biol．Chem．250，4007-4021（1974）に記載
された方法に従い、SDS-PAGEを実施した。電気泳動後、
ゲルをクマジーブリリアントブルーで染色して、ゲル上
に含ませた分子量標準を参照して溶出蛋白質の特徴を決
定した。SDS-PAGEの結果から、サンプル４中のフィブリ
ノーゲン分子は安定な共有架橋結合を形成したことが示
された。対照的に、NaIO4を含まなかったサンプル中の
フィブリノーゲン分子は架橋結合を形成しなかったこと
が示された。
カル社、セントルイス，MO）溶液：0.02mMフィブリノー
ゲン、0.008M Na2HPO4、0.002M KH2PO4、0.14M NaCl、p
H7.4を作成した。作成後、溶液を４分割した。次に、メ
タ過ヨウ素酸ナトリウム（0.05mM）をサンプル３および
４に加えた。全部で４つのフィブリノーゲン溶液を次に
２時間震盪しながら室温においてインキュベートした。
次に、0.02mMのNaCNBH3をサンプル２および４に加え
た。再び、４つのフィブリノーゲン溶液を２時間室温に
おいて反応させた。各50μlのサンプルを、次に、62.5m
M Tris-HCl，５％b-メルカプトエタノール、10％グリセ
ロールおよび2.3％ SDSからなるSDS-PAGEバッファー溶
液450μl中に入れた。サンプルを３分間ボイルした。各
10μlのサンプルを、次に、４−15％グラジエントゲル
にのせてO'Farrell「蛋白質の高解像二次元電気泳
動」、J．Biol．Chem．250，4007-4021（1974）に記載
された方法に従い、SDS-PAGEを実施した。電気泳動後、
ゲルをクマジーブリリアントブルーで染色して、ゲル上
に含ませた分子量標準を参照して溶出蛋白質の特徴を決
定した。SDS-PAGEの結果から、サンプル４中のフィブリ
ノーゲン分子は安定な共有架橋結合を形成したことが示
された。対照的に、NaIO4を含まなかったサンプル中の
フィブリノーゲン分子は架橋結合を形成しなかったこと
が示された。
【００４２】本発明は特定の態様および実施例に関連し
て記載されてきたが、本発明はそれらに限定される必要
はないこと、および莫大な他の態様、実施例、用途、修
飾およびそれら態様、実施例および用途からの変更は特
許請求の範囲に包含されることは、当業者には認識され
る。本明細書において引用された各々の特許および刊行
物の全開示は引用により本明細書の一部をなす。
て記載されてきたが、本発明はそれらに限定される必要
はないこと、および莫大な他の態様、実施例、用途、修
飾およびそれら態様、実施例および用途からの変更は特
許請求の範囲に包含されることは、当業者には認識され
る。本明細書において引用された各々の特許および刊行
物の全開示は引用により本明細書の一部をなす。
Claims (24)
- 【請求項１】 以下の工程： （ａ）過ヨウ素酸塩を、１，２ジヒドロキシモイエティ
を有する物質と化合してアルデヒド官能物質を形成し； （ｂ）アルデヒド官能物質を、第一アミンモイエティを
有する物質と化合してイミンモイエティを通して両物質
を結合させ；そして （ｃ）イミンモイエティを還元剤と反応させて、第二ア
ミン結合を通して医学装置基体表面上に固定化糖蛋白質
を形成する；ことからなる、基体表面上に固定化された
糖蛋白質を有する医学装置の製造方法。 - 【請求項２】 １，２ジヒドロキシモイエティを有する
物質が糖蛋白質を含む、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 糖蛋白質が、抗凝血剤；抗血栓剤；血液
凝固蛋白質；血小板製剤；抗炎症剤；抗体；イムノグロ
ブリン；防御蛋白質；酵素；ホルモン；成長因子；球状
蛋白質；血液蛋白質；制御蛋白質；輸送蛋白質；繊維状
蛋白質；構造蛋白質；膜蛋白質；細胞接着蛋白質；プロ
テオグリカン；毒素；およびリガンドからなる群から選
択される、請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 糖蛋白質が合成に由来する、請求項３記
載の方法。 - 【請求項５】 第一アミンモイエティを有する物質が糖
蛋白質の付着する基体表面を有する、請求項１記載の方
法。 - 【請求項６】 基体が金属、ポリマー、セラミックまた
はガラスである、請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 過ヨウ素酸塩が過ヨウ素酸、過ヨウ素酸
ナトリウムまたは過ヨウ素カリウムである、請求項１記
載の方法。 - 【請求項８】 還元剤が硼水素化ナトリウム、シアノ硼
水素化ナトリウムまたはアミンボランである、請求項１
記載の方法。 - 【請求項９】 ｐＨ約４−９の水溶液中で過ヨウ素酸塩
を１，２ジヒドロキシモイエティ含有物質と化合する、
請求項１記載の方法。 - 【請求項１０】 約０−５０℃の温度を有する水溶液中
で過ヨウ素酸塩を１，２ジヒドロキシモイエティ含有物
質と化合する、請求項１記載の方法。 - 【請求項１１】 ｐＨ約６−１０の水溶液中でアルデヒ
ド官能物質とアミノ官能物質を化合する、請求項１記載
の方法。 - 【請求項１２】 約０−５０℃の温度を有する水溶液中
でアルデヒド官能物質とアミノ官能物質を化合する、請
求項１記載の方法。 - 【請求項１３】 ｐＨ約６−１０の水溶液中で還元剤と
イミンモイエティ含有物質を化合する、請求項１記載の
方法。 - 【請求項１４】 約０−５０℃の温度を有する水溶液中
で還元剤とイミンモイエティ含有物質を化合する、請求
項１記載の方法。 - 【請求項１５】 １，２ジヒドロキシモイエティおよび
第一アミンモイエティからなる物質を架橋結合する方法
であって、該方法は以下の工程： （ａ）過ヨウ素酸塩を該物質と化合して１，２ジヒドロ
キシモイエティを酸化することによりアルデヒドモイエ
ティを形成し； （ｂ）アルデヒドモイエティを、イミンモイエティを形
成するアミンモイエティと化合させ；そして （ｃ）アミンモイエティを還元剤と反応させて、第二ア
ミンおよび架橋結合した物質を形成すること；からな
る。 - 【請求項１６】 １，２ジヒドロキシモイエティおよび
第一アミンモイエティからなる物質が糖蛋白質である、
請求項１５記載の方法。 - 【請求項１７】 糖蛋白質が、抗凝血蛋白質；抗血栓蛋
白質；血液凝固蛋白質；血小板蛋白質；抗炎症蛋白質；
抗体；イムノグロブリン；防御蛋白質；酵素；ホルモ
ン；成長因子；球状蛋白質；血液蛋白質；制御蛋白質；
輸送蛋白質；繊維状蛋白質；構造蛋白質；膜蛋白質；細
胞接着蛋白質；プロテオグリカン；毒素；およびリガン
ドからなる群から選択される、請求項１６記載の方法。 - 【請求項１８】 糖蛋白質が合成に由来する、請求項３
記載の方法。 - 【請求項１９】 過ヨウ素酸塩が過ヨウ素酸、過ヨウ素
酸ナトリウムまたは過ヨウ素カリウムである、請求項１
５記載の方法。 - 【請求項２０】 還元剤が硼水素化ナトリウム、シアノ
硼水素化ナトリウムまたはアミンボランである、請求項
１５記載の方法。 - 【請求項２１】 ｐＨ約４−９の水溶液中で、過ヨウ素
酸塩を、１，２ジヒドロキシモイエティおよび第一アミ
ンモイエティを含有する物質と化合する、請求項１５記
載の方法。 - 【請求項２２】 約０−５０℃の温度を有する水溶液中
で、過ヨウ素酸塩を、１，２ジヒドロキシモイエティお
よび第一アミンモイエティを含有する物質と化合する、
請求項１５記載の方法。 - 【請求項２３】 ｐＨ約６−１０の水溶液中で還元剤と
イミンモイエティ含有物質を化合する、請求項１５記載
の方法。 - 【請求項２４】 約０−５０℃の温度を有する水溶液中
で還元剤とイミンモイエティ含有物質を化合する、請求
項１５記載の方法。
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