JPH1087503A - 神経系腫瘍細胞のアポトーシス剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 神経系腫瘍の治療剤を提供する。 【解決手段】 単純ヘルペスウイルスの遺伝子からγ₁
３４．５遺伝子を除去したベクターを含有する神経系腫
瘍細胞のアポトーシス剤。 【効果】 本発明のベクターは神経系腫瘍細胞に感染し
てアポトーシスを引き起こすことができ、またチミジン
キナーゼ感受性を高めた誘導体を作製して遺伝子治療薬
として利用する途を拓く。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は中枢神経の腫瘍であるグ
リオブラストーマ（膠芽腫）などの治療剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】グリオブラストーマは従来の治療法では
治癒困難である。アポトーシスと言う自然な細胞死は、
炎症を伴うネクローシスと比較して、細胞が核の凝縮や
細胞質の縮退などを経て消失するために、クリーンな自
然死とみなされている。生体でアポトーシスの現象は多
面的に起きている。正常な細胞交代、発生過程での細胞
死、キラーＴ細胞やナチュラルキラー細胞など細胞性免
疫に伴う細胞死、生理活性物質が関与する細胞死など
が、典型的なアポトーシスである。例えば、脳神経系で
はそのシナプス形成時に神経細胞死が重要な役割を果た
し、神経細胞の２０〜８０％が脱落して自然細胞死（ア
ポトーシス）する。また例えば、交換神経節細胞（ＳＣ
Ｇ細胞）、知覚神経細胞や運動神経細胞では、神経成長
因子（ＮＧＦ）や神経栄養因子などを除去することで神
経細胞死を生じる。神経栄養因子を除去することによつ
ても、遺伝子シグナルがｃ−ｊｕｎからｃ−ｆｏｓ、ｊ
ｕｎＢ、ｒｈｌ、ｃ−ｍｙｂ、ＮＧＦ１−Ａ、を経てア
ポトーシスを引き起こすが明らかにされている。

【０００３】この様な神経細胞のアポトーシスは、遺伝
子制御のもとに行われることが確認されており、アポト
ーシスを防ぐためにｆｏｓファミリーやｃ−ｊｕｎなど
の抗体を細胞に微少注入すると、アポトーシスは有意に
抑制される。また、ｂｃｌ−２はその発現ベクターを細
胞内に注入することで、アポトーシスを阻止することが
知られている。一方、サイトカインを除いた条件下でＢ
細胞にｂｃｌ−２オンコジーンを導入すると、Ｂ細胞は
アポトーシスを起こす代わりに長期に生存する［Ｖａｕ
ｘ Ｄ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ．３３５：４
４０，（１９８８）］。

【０００４】神経系の疾患では、神経細胞の退行性変化
や神経細胞死に由来するものがあり、ハンチントン病、
アルツハイマー病などが代表的な疾患である。これらの
疾患はアポトーシスによることが示唆され、その特徴で
あるＤＮＡの断片化を起こした神経細胞が検出されてい
る［Ｄｒａｇｕｎｏｗ，Ｍ．ｅｔ ａｌ，：Ｎｅｕｒｏ
ｒｅｐｏｒｔ，６：１０５３−１０５７，１９９５］。
そこで、アポトーシスに関連する遺伝子やその発現物質
を利用し、アポトーシスを制御するための新しい治療法
や予防法の開発が期待されている。細胞死の抑制物質や
促進物質は、種々の疾患の治療薬剤になり得る。

【０００５】脳の病の遺伝子治療は人類の夢であるが、
ヒト遺伝子治療としてアデノシンデアミナーゼ欠損症や
家族性コレステロール血症など多くの臨床応用が進めら
れているにもかかわらず、神経疾患への遺伝子治療は複
雑な問題を抱えている（Ｓｕｈｒ，Ｓ．Ｔ．＆ Ｇａｇ
ｅ，Ｆ．Ｈ．；Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５０：１２
５２−１２６８，１９９３）。例えば、神経系のコンパ
ートメントや神経細胞の相互作用、血液−脳関門など
が、中枢神経系の遺伝子治療を困難にしている。

【０００６】現在、中枢神経系への遺伝子治療のアプロ
ーチとしては、ウイルスを遺伝子キャリヤーとして用い
て神経系の細胞に直接に遺伝子を導入する方法や、培養
細胞に遺伝子を導入して標的部位に移植する方法が試み
られている。

【０００７】アポトーシスの現象としては神経系の他
に、抗癌剤刺激による癌細胞死もアポトーシスを起こし
ていることが明らかにされている。作用機序の異なる多
くの薬剤が、癌細胞に類似のアポトーシスを起こすため
に、癌細胞の死にも細胞の遺伝子制御のプロセスが関与
していると考えられる［Ｂｏｒｎｅｒ，Ｍ．Ｍ．ｅｔａ
ｌ，：Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓ．，５５：２１２２−２１
２８，１９９５］。癌化学療法ではトポイソメラーゼ阻
害剤、アルキル化阻害剤などがアポトーシスを誘発する
ことが明らかにされている。

【０００８】細胞のアポトーシスの遺伝子制御にプロセ
スの異常が生じた細胞は、アポトーシス耐性細胞にな
り、この様な薬剤耐性の癌細胞にアポトーシスを抑制す
るｂｃｌ−２やｂｃｌ−ＸＬが多量単離されている。ま
た、ウイルスが細胞に感染すると、感染細胞にアポトー
シスを誘発したり、アポトーシスへの感受性を高めるこ
とが知られており、ＨＩＶ感染によるＴ細胞のアポトー
シスもその一例である。しかし、ＨＳＶ、ＥＢＶ、アデ
ノウイルス、バキュロウイルスなどのウイルス種は宿主
のアポトーシスを阻害する遺伝子を導入することが確認
されている。これらの事実は、アポトーシスを利用した
癌及び腫瘍の治療薬の開発が可能であることを示唆して
いる。

【０００９】中枢神経系に特徴的な腫瘍はグリオブラス
トーマとして知られ、ヒト脳に最も共通した腫瘍であ
り、通常致命的な腫瘍である［Ｌｅｖｉｎｅ Ａ．ｅｔ
ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ
Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２：１
５５７，（１９８９）］。米国では、毎年大人の脳腫瘍
患者が約５，０００人に発生するが、悪性のグリオブラ
ストーマはそれの３０％以上であり、現在、この様な脳
腫瘍に適した治療法は全く知られていない。グリオブラ
ストーマが脳の頭蓋骨スペースで、約１００ｇに達する
と、致命的になる［Ｓｈａｐｉｒｏ ＷＲ，Ｓｅｍｉｎ
ａｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，７１：３８，（１９
８６）］。

【００１０】この様な脳腫瘍の治療のために、安全な方
法による神経系細胞内への抗腫瘍遺伝子や抗腫瘍物資の
発現及び運搬は、臨床学的に利点をもたらし、これまで
に治癒困難とされていた疾患の治療方法を与えると期待
される。

【００１１】最近、遺伝子工学の技術を利用して患者の
脳細胞に遺伝物資を移入することで、ヒトの脳腫瘍の治
療が試みられている。例えば、抗脳腫瘍剤で体内に投与
された後に、活性化されて有効な薬剤となり腫瘍細胞の
増殖抑制を発揮させる方法がある。ヒトに存在しない代
謝酵素の遺伝子を導入することにより、ヒト本来の代謝
酵素と反応せずに、標的細胞のみで薬理効果を発揮し、
非導入細胞では代謝できずに毒性を示さない。この様
に、遺伝子の導入にウイルスベクターを用いる場合をＶ
ＤＥＰＴ（ｖｉｒａｌｌｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｎｚ
ｙｍｅ ｐｒｏｄｒｕｇ ｔｈｅｒａｐｙ）［Ｇｕｔｉ
ｅｒｒｅｚ，Ａ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｌａｎ
ｃｅｔ，３３９：７１５，（１９９２）］と呼んでい
る。

【００１２】特に、遺伝子治療によく試みられている酵
素遺伝子には単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ
（ＨＳＶ−ｔｋ）、大腸菌由来のシトシンデアミナーゼ
（ＣＤ）、水痘ウイルスチミジンキナーゼ（ＶＺＶ−ｔ
ｋ）などがある。これらの酵素遺伝子を発現できるウイ
ルスを投与感染させるか、ウイルスを産生する細胞を腫
瘍部に移植することにより、腫瘍細胞に特異的に代謝酵
素活性を発現させるとか、酵素遺伝子を直接に局所に注
入することも試みられている。酵素遺伝子の導入によ
り、その遺伝子産物や反応物が腫瘍細胞の増殖を阻害す
る。

【００１３】単純ヘルペスウイルス−１（ＨＳＶ−１）
は、末梢及び中枢神経系の細胞内に外来遺伝子を導入す
るベクターとして利用可能であり［Ｆｒｉｅｄｍａｎ．
Ｔ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２７５，（１９８
９）］、かつ単純ヘルペスウイルス自体が遺伝子移入体
となり得る。ＨＳＶ−１は、二本鎖ＤＮＡウイルスであ
り、非分裂ニューロン細胞で潜伏状態を保つことができ
る［Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｊ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．，７０：３１，（１９７５）］。単純ヘルペ
スウイルス−２（ＨＳＶ−２）は生殖器官へ感染するた
めに、生殖器官の細胞内への外来遺伝子のベクターとし
て利用可能である。

【００１４】ＨＳＶ−１の大きな特徴は、末梢神経に摂
取または感染して、シナプス経由で知覚・運動ニューロ
ンから、脊髄、脳幹、小脳および大脳などへの移動が可
能なことである［Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ，Ｈ．，Ｉｎ：Ｐ
ｅｒｓｉｓｔｅｎｔ Ｖｉｒｕｓｅｓ，ｐｐ−６９１，
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９７８）］。
そのために、ＨＳＶ−１ベクターは標的細胞に直接注入
する他に、血管注入など対象組織から離れた部位からの
投与法が可能であり、遺伝子治療薬及びその調製剤とし
て有効と言える。

【００１５】ＨＳＶ−１ベクターは、適切な宿主細胞内
でウイルスとして増殖できる。同時に、ＨＳＶ−１の使
用はそれ自体が宿主動物を害し易く、ヒトに脳炎を引き
起こすために、それの遺伝子治療薬としての利用にかな
りの制限を伴う。

【００１６】カルバー（Ｃｕｌｖｅｒ）等は繊維芽細胞
を用い［Ｃｕｌｖｅｒ ＫＷ ｅｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２５６：１５５０，（１９９２）］、この細胞に単
純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）のチミジンキナーゼ
遺伝子（ＴＫ）を組み込んだレトロウイルスベクターを
トランスフェクトすることで、得られた形質転換細胞は
ＨＳＶ−ＴＫ産生細胞であり、この様な細胞をパッケー
ジング細胞と名づけている。パッケージング細胞は公知
技術に従って容易に作製できる。

【００１７】脳にグリオブラストーマを発生させたラッ
トに、パッケージング細胞であるＨＳＶ−ＴＫ産生細胞
を注入すると、ＴＫ遺伝子を組み込んだこのベクター
は、活発に分裂する脳腫瘍細胞でのみに溶解感染を引き
起こす。分裂腫瘍細胞はＴＫ遺伝子を取り込み、アシク
ロビル製剤やガンシクロビル製剤（ＧＣＶ）による治療
に感受生を示し破壊される。ラットでの動物試験では、
約８０％に脳腫瘍の縮退が見られる［Ｃｕｌｖｅｒ Ｋ
Ｗ．，第２回日本脳腫瘍カンファランス抄録集、ｐｐ．
４１，（１９９３）、Ｚｖｉ Ｒａｍ ｅｔ ａｌ，Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．５３：８３，（１９９
３）］。ＨＳＶ−ｔｋとＧＣＶを用いたＶＤＥＰＴが、
ラットの脳腫瘍の治癒効果を高めた要因は、レトロウイ
ルスが分裂する腫瘍細胞で増殖し、非分裂の正常な神経
細胞に感染しないことである。しかし、この様なＶＤＥ
ＰＴではＨＳＶ−ｔｋを導入されてない周辺細胞でも致
死効果が見られ、バイスタンダー効果として知られてい
る。

【００１８】アシクロビルはウイルスの特異的なチミジ
ンキナーゼにより燐酸化され、活性化型の三燐酸化体に
変換される。さらに、これをウイルスが取り込み、ウイ
ルス由来ポリメラーゼによるＤＮＡ合成が阻害され、Ｄ
ＮＡウイルスの増殖が抑制される。この反応の特徴は、
正常細胞のチミジンキナーゼで触媒されず、単純ヘルペ
スのウイルスチミジンキナーゼに特異的なことである。
同じく、抗ウイルス剤であるグアノシン誘導体のガンシ
クロビル（ＧＣＶ）と呼ばれる９−｛［２−ヒドロキシ
−１−（ヒドロキシメチル）エトキシ］メチル｝グアニ
ンも用いられる。ＧＣＶはヒトのチミジンキナーゼで活
性化されず、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ
で効率良く燐酸化を受け、ＤＮＡ合成の阻害を導く［Ｆ
ｉｅｌｄ，Ａ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：４１３９，（１
９８３）］。

【００１９】ＨＳＶ−ｔｋの酵素の活性が高い程、治療
効果が期待されるために変異型ＨＳＶ−ｔｋの作製が試
られ、野生型のＨＳＶ−ｔｋに比較してＧＣＶの燐酸化
活性の高い変異型ＨＳＶ−ｔｋが得られている［Ｍｕｎ
ｉｒ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：４０１２，（１９９
３）］。

【００２０】ＨＳＶ−１のＴＫ遺伝子の欠損変異体を作
製し、これを投与することで他に薬剤を投与することな
しに、この変異体ウイルスの有するγ₁ ３４．５遺伝子
に由来する神経毒を利用して腫瘍細胞死を誘導すること
が試みられた。［Ｍａｒｔｕｚａ Ｒ．Ｌ．，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：８５４，（１９９
１）］。このＴＫ欠損のＨＳＶ−１は、ＴＫ遺伝子の３
６０塩基対を削除されていることによりＴＫ活性を失
い、それ故、この変異型ウイルスは中枢神経系の非分裂
組織で複製されずに、分裂細胞のみで急速に増殖する。
これらの研究で、ヌードマウスの腫瘍の抑制が認められ
ている。

【００２１】神経毒性をもたらすＨＳＶ−１のγ₁ ３
４．５遺伝子の発見及びその特性の決定は、いくつかの
論文に報告されている［Ｃｈｏｕ ａｎｄ Ｒｏｉｚｍ
ａｎ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５７：６２９，（１９８
６）、Ａｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．，５８：８４３，（１９８６）］。このγ₁ ３４．
５遺伝子は２６３残基のアミノ酸からなる蛋白質をコー
ドしている。このγ₁ ３４．５遺伝子を欠く変異型ウイ
ルスは、非増殖細胞である中枢神経系で増殖する能力を
失っている［Ｃｈｏｕ Ｊ．ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２５０：１２１２，（１９９０）］。

【００２２】ＨＳＶ−１の単離法は知られている［Ｅｊ
ｅｒｃｉｔｏ，Ｐ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．
Ｖｉｒｏｌ．２：３５７，（１９６８）］。ＨＳＶ−１
の組換え体ウイルスであるＲ３６１６およびＨＳＶ−１
（Ｒ）の構築も知られている［Ｃｈｏｕ，Ｊ．ｅｔ ａ
ｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０：１２６２，（１９９
０）］。Ｒ３６１６は、γ₁ ３４．５遺伝子を含有して
いるＤＮＡ配列の１キロ塩基対を除去した変異型ウイル
スで、１キロ塩基対の範囲は制限酵素ＢｓｔＥＩＩでγ
₁ ３４．５遺伝子の２８番目のアミノ酸部位に相当する
位置を切断し遺伝子の３′末端を制限酵素のＳｔｕ Ｉ
で切断している。ＨＳＶ−１（Ｒ）はＲ３６１６にγ₁
３４．５遺伝子を再度組み込んだ再構成ウイルスであ
る。

【００２３】

【発明が解決しようとする課題】現在、ウイルス自体を
含有する神経系腫瘍の安全なアポトーシス剤は知られて
いない。

【００２４】

【課題を解決するための手段】本発明者の研究により、
単純ヘルペスウイルスの変異型（ＨＳＶ−１−ｄ−３
４．５）、すなわちＲ３６１６は神経毒性の弱体化及び
感染細胞の蛋白質合成の停止を示し、加えてアシクロビ
ルに感受性を示し、臨床での使用に薬効的に利点を示す
ことが判明した。

【００２５】本発明は単純ヘルペスの遺伝子からγ₁ ３
４．５遺伝子を除去したベクターを含有してなる神経系
腫瘍細胞のアポトーシス剤に関する。

【００２６】本発明に用いるウイルスベクターである単
純ヘルペスの遺伝子からγ₁ ３４．５遺伝子を除去した
ベクター例えば、Ｒ３６１６は宿主対して非神経毒性で
あり、分裂する脳細胞であるグリオーマ細胞でのみ感染
増殖し、アポトーシスを引き起こす。この様に遺伝子工
学的に変換したウイルス（ＨＳＶ−１−ｄ−３４．５）
は、ヒトのグリオブラストーマ細胞の破壊に利用でき
る。Ｒ３６１６の構築法はＰｅｒｇ等により明らかにさ
れている［Ｐｅｒｇ Ｇ．．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｏ
ｌ．６９：３０３３，（１９９５）］。同様にして他の
単純ヘルペス遺伝子からもγ₁ ３４．５遺伝子を欠失さ
せることができる。

【００２７】脳腫瘍細胞は、一般的に分化した神経細胞
や分化停止のグリア細胞に囲まれている。形態的な研究
用に、腫瘍細胞としてヒトグリオーマ細胞系のＵ−２５
１ＭＧ（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒ
ｍ）とＵ−８７ＭＧ（ａｎａｐｌａｓｔｉｃ ｇｌｉｏ
ｍａ；ＡＴＣＣ）を用い、正常なグリア細胞としてａｔ
ｒｏｃｙｔｅｓ、ｍｉｃｒｏｇｌｉａ、ｃｅｎｔｒａｌ
ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｎｅｕｒｏｎを用
い、光学顕微鏡及び電子顕微鏡で調べた（図−１，
２）。

【００２８】組換え体ウイルス（Ｒ３６１６）の感染の
後にグリオーマ細胞での宿主蛋白質の合成を調べた（図
−３）。グリオーマ細胞及び正常細胞に、Ｒ３６１６及
び野生型ウイルスで２時間感染する。感染の後に、細胞
は³⁵Ｓ−メチオニン（５０ｕＣｉ／ｍｌ）でラベルす
る。感染細胞や非感染細胞を収穫して、可溶化して、Ｓ
ＤＳ−電気泳動にかける。これらの実験から得られる結
果は、組換え体ウイルス（Ｒ３６１６）はグリオーマ細
胞にアポトーシスを誘導できることを示した。これらの
事実は、野生型ウイルスはγ₁ ３４．５遺伝子の存在で
アポトーシスを示さず、変異型ウイルス（ＨＳＶ−１−
ｄ−３４．５）では蛋白質の合成が停止して、顕微鏡的
にもアポトーシスが観察された。

【００２９】中枢神経において、ウイルスを複製し、増
殖する能力はγ₁ ３４．５遺伝子の機能に基づく。この
遺伝子を欠損しているヘルペスウイルスの変異型例えば
Ｒ３６１６は、正常な中枢神経系で増殖できず、非毒性
である［Ｃｈｏｕ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ．２５０：１２１２，（１９８０）］。それ故、中枢
神経系において腫瘍を標的とする能力を与えれば、本発
明のアポトーシス剤はこれまで治療不可能であったグリ
オブラストーマに対する強力な治療剤になり得る。変異
体ウイルスのＲ３６１６を公知の適切な安定化剤で、例
えばヒト血清アルブミンや無機塩類、アミノ酸類を附加
して調製剤として使用できる。

【００３０】本発明のベクターを含有する調製剤の投与
法としては、標的細胞・組織に直接的に投与可能であ
り、また、単純ヘルペスウイルスベクターの特徴を活か
して、標的部位から離れている部位に注入可能であり、
静脈投与もできる。また、Ｒ３６１６を公知の細胞に、
例えば繊維芽細胞など、トランスフェクトした変換細胞
を腫瘍部に移植する投与法もできる。好ましい投与量は
腫瘍細胞１個当りベクター１０個以上である。

【００３１】Ｒ３６１６の特徴であるアポトーシス誘導
性に加えて、チミジンキナーゼに感受性を高めたウイル
ス変異体の誘導体（ＴＫ−ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ−ＨＳ
Ｖ−１−ｄ−３４．５）を作製し、これを含有する調製
剤が、さらに単純ヘルペスウイルスベクターの遺伝子治
療薬としての利用性を高める。この様なウイルス誘導体
は、本来のアポプトーシスを引き起こす性質に加えて、
外部からの抗ウイルス剤の投与が可能であるために、臨
床的に極めて有利に用いられる。

【００３２】

【実施例】

実施例１ 中枢神経系への変異型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−
１−ｄ−３４．５）であるＲ３６１６の使用可能性に関
して、動物への毒性効果を評価した。投与法として直接
的にゲージ針で大脳内に、野生型のＫＯＳ株（２ｕｌ）
と変異型ウイルスのＲ３６１６及びコントロールとして
培地溶液をそれぞれ注入した。ラットの生存及び挙動を
二週間にわたり毎日観察した。ラットは、各群で１０匹
用いた。投与量は２００，０００プラーク形成単位（Ｐ
ＦＵ）のウイルスを投与し、その調製はイーグルの塩類
及び１０％の牛血清、ペニシリンを含む最小必須培地に
て希釈した。結果を表１に示す。 表１ ウイルスの脳内注入後におけるラットの生存数とＬＤ５０ 摂取ウイルス（遺伝子型） ３日 １４日 ＰＦＵ／ＬＤ５０ ＨＳＶ−１（野生型） 10／10 １／10 400 Ｒ３６１６（γ₁ 34.5の欠失） 10／10 ９／10 ＞1,000,000 コントロール 10／10 ９／10 野生型のＨＳＶ−１と変異型Ｒ３６１６をラット脳に投
与してＬＤ５０値を比較すると、２，０００倍以上もＲ
３６１６の毒性が低く、正常組織・細胞に対しては著し
く安全性の高いウイルスベクターである。

【００３３】実施例２ 変異型ウイルスのＲ３６１６株によるヒトグリオーマ細
胞のアポトーシスを検討した。株化したグリオーマ細胞
であるＵ−８７ＭＧあるいはＵ−２５１ＭＧ細胞をそれ
ぞれ１０％ウシ胎児血清を含む培地（ＤＭＥＭ、大日本
製薬）中に１×１０⁵の濃度に懸濁して６ｃｍペトリ皿
に播種した。これを４〜６日間、３７℃炭酸ガス孵卵器
中で培養した。細胞がペトリ皿に低部全面に生育してい
ることを確認した後に培地を吸引除去し、燐酸緩衝化食
塩水で洗浄した。燐酸緩衝化食塩水に希釈した単純ヘル
ペスウイルス変異株（Ｒ３６１６）、ＨＳＶ−１のγ₁
３４．５遺伝子を再度挿入して再構成した株ＨＳＶ−１
（Ｒ）並びに野生株（ＨＳＶ−１）を細胞一個あたり１
０個の比率で感染させ、１０時間後に顕微鏡観察した。
細胞のアポトーシスは、特徴的な形態的な変化である細
胞の収縮やクロマチンの濃縮を伴う。感染の時間経過
で、変異型ウイルスＲ３６１６の感染細胞のみが、アポ
トーシスに特徴的な形態変化を示した。コントロールの
非感染細胞では、何等形態変化は観察されなかった。Ｒ
３６１６株はアポトーシスを誘導した（図１）。Ｒ３６
１６株の感染細胞の透過型電子顕微鏡による観察では、
アポトーシスによる核内の電子密度の部分的増加（クロ
マチン部分の増加）も観察された（図２）。

【００３４】実施例３ 株化したグリオーマ細胞の一細胞当たり１０個ウイルス
の比率で、神経毒性を失っているＲ３６１６株、γ₁ ３
４．５遺伝子を再度挿入したＨＳＶ−１（Ｒ）株並びに
野生株のそれぞれのウイルス溶液を加えて２時間吸着さ
せた。燐酸緩衝化生理食塩液で洗浄したのち、２％ウシ
胎児血清を含むイーグルＭＥＭ（大日本製薬）で培養し
た。１０時間後に、１ｍｌ当たり５０ｕＣｉの³⁵Ｓ−メ
チオニン（アマーシャム）と、１％の蒸留水に対して透
析したウシ胎児血清を含み、組成にメチオニンを含まな
いＭＥＭ（大日本製薬）に交換した。それぞれ２時間、
培養した後に、細胞を洗浄し、０．１％ＳＤＳを含む１
００ｍＭトリス塩酸緩衝液に細胞を融解した。融解液
を、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法により分画し
た。ゲルをアマーシャム（株）製の増感剤液に浸した後
に、乾燥し、Ｘ線フィルムに感光させた（図３）。結果
として、変異ウイルスのＲ３６１６株を感染させたグリ
オーマ細胞では³⁵Ｓ−メチオニンの取り込みが微少であ
り、蛋白合成の顕著な阻害が認められた。

【００３５】

【発明の効果】本発明により従来治療困難であった神経
系腫瘍、例えば神経膠芽腫瘍の治療剤が提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２における野生型ウイルス（ＨＳＶ−
１）、変異型ウイルスＲ３６１６（ＨＳＶ−１−ｄ−３
４．５）及び再構成ＨＳＶ−１（Ｒ）を、ヒトグリオー
マ細胞系のＵ−８７ＭＧ（ａｎａｐｌａｓｔｉｃ ｇｌ
ｉｏｍａ；ＡＴＣＣ）にそれぞれ感染させて、１０時間
後の光学顕微鏡写真である。 Ａ；ウイルス非感染細胞、Ｂ；変異体ウイルスＲ３６１
６の感染細胞、 Ｃ；再構成ウイルスＨＳＶ−１（Ｒ）の感染細胞、 Ｄ；野生型ウイルスＨＳＶ−１の感染細胞

【図２】実施例２における透過型電子顕微鏡写真であ
る。 Ａ；ウイルス非感染細胞、Ｂ；変異型ウイルスＲ３６１
６の感染細胞

【図３】実施例３におけるＳＤＳ電気泳動のゲルをＸ線
フィルムに感光させた写真である。 １；ウイルス非感染細胞、２；変異体ウイルスＲ３６１
６の感染細胞、 ３；再構成ウイルスＨＳＶ−１（Ｒ）の感染細胞、 ４；野生型ウイルスＨＳＶ−１の感染細胞

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 単純ヘルペスウイルスの遺伝子からγ₁
   ３４．５遺伝子を除去したベクターを含有してなる神経
   系腫瘍細胞のアポトーシス剤。
2. 【請求項２】 神経系腫瘍が膠芽腫瘍である請求項１記
   載のアポトーシス剤。
3. 【請求項３】 単純ヘルペスウイルスが１型または２型
   である請求項１記載のアポトーシス剤。
4. 【請求項４】 注射剤の形態である請求項１記載のアポ
   トーシス剤。