JPH1087510A - ナイトロジェンマスタード系抗癌剤と組合わせて使用するための骨髄腫治療剤 - Google Patents
ナイトロジェンマスタード系抗癌剤と組合わせて使用するための骨髄腫治療剤Info
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- JPH1087510A JPH1087510A JP9172483A JP17248397A JPH1087510A JP H1087510 A JPH1087510 A JP H1087510A JP 9172483 A JP9172483 A JP 9172483A JP 17248397 A JP17248397 A JP 17248397A JP H1087510 A JPH1087510 A JP H1087510A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 新規な骨髄腫治療剤の提供。
【解決手段】 ナイトロジエンマスタード系抗癌剤と抗
ＩＬ−６受容体抗体との併用による、骨髄腫治療剤。す
なわち、ナイトロジエンマスタード系抗癌剤と組合わせ
て使用するための、抗ＩＬ−６受容体抗体を含んで成る
骨髄腫治療剤；抗ＩＬ−６受容体抗体と組合わせて使用
するための、ナイトロジエンマスタード系抗癌剤を含ん
で成る骨髄腫治療剤；並びにナイトロジエンマスタード
系抗癌剤と抗ＩＬ−６受容体抗体とを含んで成る骨髄腫
治療剤。
ＩＬ−６受容体抗体との併用による、骨髄腫治療剤。す
なわち、ナイトロジエンマスタード系抗癌剤と組合わせ
て使用するための、抗ＩＬ−６受容体抗体を含んで成る
骨髄腫治療剤；抗ＩＬ−６受容体抗体と組合わせて使用
するための、ナイトロジエンマスタード系抗癌剤を含ん
で成る骨髄腫治療剤；並びにナイトロジエンマスタード
系抗癌剤と抗ＩＬ−６受容体抗体とを含んで成る骨髄腫
治療剤。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、骨髄腫の治療のた
めの、ナイトロジェンマスタード系抗癌剤と抗ＩＬ−６
受容体抗体との組合せ使用のための医薬組成物に関す
る。
めの、ナイトロジェンマスタード系抗癌剤と抗ＩＬ−６
受容体抗体との組合せ使用のための医薬組成物に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】ヒト腫瘍の化学療法には、これまでアル
キル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生剤、白金化合物等が
用いられてきた。これらの抗腫瘍剤を単独で用いても顕
著な治療効果が認められない場合、複数の抗腫瘍剤を併
用する治療法が考えられてきた（Frei, E. III, Cancer
Res. （１９９２) ３２，２５９３−２６０７) 。アル
キル化剤に属する抗癌剤としてナイトロジェンマスター
ド系抗癌剤が挙げられ、これはナイトロジェンマスター
ドと称する部分構造を有する抗癌剤の総称であり、この
内メルファラン等は抗癌剤として実用されている。
キル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生剤、白金化合物等が
用いられてきた。これらの抗腫瘍剤を単独で用いても顕
著な治療効果が認められない場合、複数の抗腫瘍剤を併
用する治療法が考えられてきた（Frei, E. III, Cancer
Res. （１９９２) ３２，２５９３−２６０７) 。アル
キル化剤に属する抗癌剤としてナイトロジェンマスター
ド系抗癌剤が挙げられ、これはナイトロジェンマスター
ドと称する部分構造を有する抗癌剤の総称であり、この
内メルファラン等は抗癌剤として実用されている。
【０００３】ＩＬ−６はＢ細胞刺激因子２あるいはイン
ターフェロンβ２とも呼称された、多機能サイトカイン
である。ＩＬ−６はＢリンパ球系細胞の活性化に関与す
る分化因子として発見され（Hirano, T.ら、Ｎａｔｕｒ
ｅ（１９８６）３２４，７３−７６）、その後、種々の
細胞の機能に影響を及ぼす多機能サイトカインであるこ
とが明らかとなった (Akira, S. ら、Ａｄｖ．ｉｎ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９３) ５４，１−７８）。Ｉ
Ｌ−６は、細胞上で二種のタンパク質を介してその生物
学的活性を伝達する。
ターフェロンβ２とも呼称された、多機能サイトカイン
である。ＩＬ−６はＢリンパ球系細胞の活性化に関与す
る分化因子として発見され（Hirano, T.ら、Ｎａｔｕｒ
ｅ（１９８６）３２４，７３−７６）、その後、種々の
細胞の機能に影響を及ぼす多機能サイトカインであるこ
とが明らかとなった (Akira, S. ら、Ａｄｖ．ｉｎ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９３) ５４，１−７８）。Ｉ
Ｌ−６は、細胞上で二種のタンパク質を介してその生物
学的活性を伝達する。
【０００４】一つは、ＩＬ−６が結合する分子量約８０
KDのリガンド結合性タンパク質、ＩＬ−６受容体であ
る。ＩＬ−６受容体は、細胞膜を貫通して細胞膜上に発
現する膜結合型の他に、主にその細胞外領域からなる可
溶性ＩＬ−６受容体としても存在する。もう一つは非リ
ガンド結合性のシグナル伝達に係わる分子量約１３０KD
のｇｐ１３０である。ＩＬ−６とＩＬ−６受容体はＩＬ
−６／ＩＬ−６受容体複合体を形成し、次いでもう一つ
の膜タンパク質ｇｐ１３０と結合することにより、ＩＬ
−６の生物学的活性が細胞に伝達される（Tagaら、Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８７）１６６，９６７）。
KDのリガンド結合性タンパク質、ＩＬ−６受容体であ
る。ＩＬ−６受容体は、細胞膜を貫通して細胞膜上に発
現する膜結合型の他に、主にその細胞外領域からなる可
溶性ＩＬ−６受容体としても存在する。もう一つは非リ
ガンド結合性のシグナル伝達に係わる分子量約１３０KD
のｇｐ１３０である。ＩＬ−６とＩＬ−６受容体はＩＬ
−６／ＩＬ−６受容体複合体を形成し、次いでもう一つ
の膜タンパク質ｇｐ１３０と結合することにより、ＩＬ
−６の生物学的活性が細胞に伝達される（Tagaら、Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８７）１６６，９６７）。
【０００５】ＩＬ−６受容体に対する抗体 (抗ＩＬ−６
受容体抗体) は知られており（Novick, D.ら、Hybridom
a 10, 137-146, 1991 、Huang, Y.W. ら、Hybridoma 1
2, 621-630, 1993 、国際特許出願公開番号ＷＯ９５−
０９８７３、フランス特許出願公開番号ＦＲ２６９４７
６７、米国特許番号ＵＳ５２１６１２８）、その１つと
してマウス由来のＰＭ−１が知られており（Hirataら、
J.Immunology 143, 2900-2906, 1989)、さらにこのマウ
ス抗体の相補性決定領域（complementarity determinin
g reglon；ＣＤＲ）をヒト抗体のＣＤＲと置換すること
により得られる再構成ヒト抗体も知られている。しかし
ながら、ナイトロジェンマスタード系抗癌剤と抗ＩＬ−
６受容体抗体とを組合せて骨髄腫治療剤として使用する
ことは知られていない。
受容体抗体) は知られており（Novick, D.ら、Hybridom
a 10, 137-146, 1991 、Huang, Y.W. ら、Hybridoma 1
2, 621-630, 1993 、国際特許出願公開番号ＷＯ９５−
０９８７３、フランス特許出願公開番号ＦＲ２６９４７
６７、米国特許番号ＵＳ５２１６１２８）、その１つと
してマウス由来のＰＭ−１が知られており（Hirataら、
J.Immunology 143, 2900-2906, 1989)、さらにこのマウ
ス抗体の相補性決定領域（complementarity determinin
g reglon；ＣＤＲ）をヒト抗体のＣＤＲと置換すること
により得られる再構成ヒト抗体も知られている。しかし
ながら、ナイトロジェンマスタード系抗癌剤と抗ＩＬ−
６受容体抗体とを組合せて骨髄腫治療剤として使用する
ことは知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来知られ
ている骨髄腫治療剤よりも効果的な新しいタイプの骨髄
腫治療剤を提供しようとするものである。
ている骨髄腫治療剤よりも効果的な新しいタイプの骨髄
腫治療剤を提供しようとするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するため種々検討した結果、従来から抗癌剤と
して使われているナイトロジェンマスタード系抗癌剤
と、抗ＩＬ−６受容体抗体とを併用することにより、ナ
イトロジェンマスタード系抗癌剤を単独で使用した場合
及び抗ヒトＩＬ−６受容体抗体を単独で使用した場合に
比べて骨髄腫治療効果が高いこと、すなわち相乗作用が
あることを見出し、本発明を完成した。
題を解決するため種々検討した結果、従来から抗癌剤と
して使われているナイトロジェンマスタード系抗癌剤
と、抗ＩＬ−６受容体抗体とを併用することにより、ナ
イトロジェンマスタード系抗癌剤を単独で使用した場合
及び抗ヒトＩＬ−６受容体抗体を単独で使用した場合に
比べて骨髄腫治療効果が高いこと、すなわち相乗作用が
あることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】従って本発明は、ナイトロジェンマスター
ド系抗癌剤と組合わせて使用するための、抗ＩＬ−６受
容体抗体を含んで成る骨髄腫治療剤を提供する。本発明
はまた、ナイトロジェンマスタード系抗癌剤と組合わせ
て使用するための、抗ＩＬ−６受容体モノクローナル抗
体を含んで成る骨髄腫治療剤を提供する。本発明はま
た、ナイトロジェンマスタード系抗癌剤と組合わせて使
用するための、ＰＭ−１抗体を含んで成る骨髄腫治療剤
を提供する。本発明はまた、ナイトロジェンマスタード
系抗癌剤と組合わせて使用するための、再構成ヒトＰＭ
−１抗体を含んで成る骨髄腫治療剤を提供する。本発明
はまた、メクロレタミン、ナイトロジェンマスタードＮ
−オキシド、メルファラン、ウラムスチン、イホスファ
ミド、クロラムブシル又はシクロホスファミドと組合わ
せて使用するための、抗ＩＬ−６受容体抗体を含んで成
る骨髄腫治療剤を提供する。
ド系抗癌剤と組合わせて使用するための、抗ＩＬ−６受
容体抗体を含んで成る骨髄腫治療剤を提供する。本発明
はまた、ナイトロジェンマスタード系抗癌剤と組合わせ
て使用するための、抗ＩＬ−６受容体モノクローナル抗
体を含んで成る骨髄腫治療剤を提供する。本発明はま
た、ナイトロジェンマスタード系抗癌剤と組合わせて使
用するための、ＰＭ−１抗体を含んで成る骨髄腫治療剤
を提供する。本発明はまた、ナイトロジェンマスタード
系抗癌剤と組合わせて使用するための、再構成ヒトＰＭ
−１抗体を含んで成る骨髄腫治療剤を提供する。本発明
はまた、メクロレタミン、ナイトロジェンマスタードＮ
−オキシド、メルファラン、ウラムスチン、イホスファ
ミド、クロラムブシル又はシクロホスファミドと組合わ
せて使用するための、抗ＩＬ−６受容体抗体を含んで成
る骨髄腫治療剤を提供する。
【０００９】本発明はまた、メルファランと組合わせて
使用するための、再構成ヒトＰＭ−１抗体を含んで成る
骨髄腫治療剤を提供する。本発明はまた、抗ＩＬ−６受
容体抗体と組合わせて使用するための、ナイトロジェン
マスタード系抗癌剤を含んで成る骨髄腫治療剤を提供す
る。本発明はまた、抗ＩＬ−６受容体モノクローナル抗
体と組合わせて使用するための、ナイトロジェンマスタ
ード系抗癌剤を含んで成る骨髄腫治療剤を提供する。本
発明はまた、ＰＭ−１抗体と組合わせて使用するため
の、ナイトロジェンマスタード系抗癌剤を含んで成る骨
髄腫治療剤を提供する。本発明はまた、再構成ヒトＰＭ
−１抗体と組合わせて使用するための、ナイトロジェン
マスタード系抗癌剤を含んで成る骨髄腫治療剤を提供す
る。
使用するための、再構成ヒトＰＭ−１抗体を含んで成る
骨髄腫治療剤を提供する。本発明はまた、抗ＩＬ−６受
容体抗体と組合わせて使用するための、ナイトロジェン
マスタード系抗癌剤を含んで成る骨髄腫治療剤を提供す
る。本発明はまた、抗ＩＬ−６受容体モノクローナル抗
体と組合わせて使用するための、ナイトロジェンマスタ
ード系抗癌剤を含んで成る骨髄腫治療剤を提供する。本
発明はまた、ＰＭ−１抗体と組合わせて使用するため
の、ナイトロジェンマスタード系抗癌剤を含んで成る骨
髄腫治療剤を提供する。本発明はまた、再構成ヒトＰＭ
−１抗体と組合わせて使用するための、ナイトロジェン
マスタード系抗癌剤を含んで成る骨髄腫治療剤を提供す
る。
【００１０】本発明はまた、抗ＩＬ−６受容体抗体と組
合わせて使用するための、メクロレタミン、ナイトロジ
ェンマスタードＮ−オキシド、メルファラン、ウラムス
チン、イホスファミド、クロラムブシル又はシクロホス
ファミドを含んで成る骨髄腫治療剤を提供する。本発明
はまた、再構成ヒトＰＭ−１抗体と組合わせて使用する
ための、メルファランを含んで成る骨髄腫治療剤を提供
する。本発明はまた、ナイトロジェンマスタード系抗癌
剤と抗ＩＬ−６受容体抗体とを含んで成る骨髄腫治療剤
を提供する。本発明はまた、ナイトロジェンマスタード
系抗癌剤と抗ＩＬ−６受容体モノクローナル抗体とを含
んで成る骨髄腫治療剤を提供する。
合わせて使用するための、メクロレタミン、ナイトロジ
ェンマスタードＮ−オキシド、メルファラン、ウラムス
チン、イホスファミド、クロラムブシル又はシクロホス
ファミドを含んで成る骨髄腫治療剤を提供する。本発明
はまた、再構成ヒトＰＭ−１抗体と組合わせて使用する
ための、メルファランを含んで成る骨髄腫治療剤を提供
する。本発明はまた、ナイトロジェンマスタード系抗癌
剤と抗ＩＬ−６受容体抗体とを含んで成る骨髄腫治療剤
を提供する。本発明はまた、ナイトロジェンマスタード
系抗癌剤と抗ＩＬ−６受容体モノクローナル抗体とを含
んで成る骨髄腫治療剤を提供する。
【００１１】本発明はまた、ナイトロジェンマスタード
系抗癌剤とＰＭ−１抗体とを含んで成る骨髄腫治療剤を
提供する。本発明はまた、ナイトロジェンマスタード系
抗癌剤と再構成ヒトＰＭ−１抗体とを含んで成る骨髄腫
治療剤を提供する。本発明はまた、メクロレタミン、ナ
イトロジェンマスタードＮ−オキシド、メルファラン、
ウラムスチン、イホスファミド、クロラムブシル又はシ
クロホスファミドと抗ヒトＩＬ−６受容体抗体とを含ん
で成る骨髄腫治療剤を提供する。本発明はまた、メルフ
ァランと再構成ヒトＰＭ−１抗体とを含んで成る骨髄腫
治療剤を提供する。
系抗癌剤とＰＭ−１抗体とを含んで成る骨髄腫治療剤を
提供する。本発明はまた、ナイトロジェンマスタード系
抗癌剤と再構成ヒトＰＭ−１抗体とを含んで成る骨髄腫
治療剤を提供する。本発明はまた、メクロレタミン、ナ
イトロジェンマスタードＮ−オキシド、メルファラン、
ウラムスチン、イホスファミド、クロラムブシル又はシ
クロホスファミドと抗ヒトＩＬ−６受容体抗体とを含ん
で成る骨髄腫治療剤を提供する。本発明はまた、メルフ
ァランと再構成ヒトＰＭ−１抗体とを含んで成る骨髄腫
治療剤を提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明において使用するナイトロ
ジェンマスタード系抗癌剤とは、次の構造：
ジェンマスタード系抗癌剤とは、次の構造：
【００１３】
【化１】
【００１４】を有するナイトロジェンマスタードと称す
る部分構造を有する抗癌剤の総称であって、これには例
えば、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎ
ｅ）、ナイトロジェンマスタードＮ−オキシド（ｎｉｔ
ｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄＮ−ｏｘｉｄｅ）（メチル
−ビス（β−クロロエチル）アミンＮ−オキシド塩酸
塩；ｍｅｔｈｙｌ−ｂｉｓ（β−ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙ
ｌ）ａｍｉｎｅ Ｎ−ｏｘｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏ
ｒｉｄｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）（ｐ
−〔ビス（２−クロロエチル）アミノ〕−Ｌ−フェニル
アラニン；ｐ−〔ｂｉｓ（２−ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙ
ｌ）ａｍｉｎｏ〕−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎ
ｅ）、
る部分構造を有する抗癌剤の総称であって、これには例
えば、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎ
ｅ）、ナイトロジェンマスタードＮ−オキシド（ｎｉｔ
ｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄＮ−ｏｘｉｄｅ）（メチル
−ビス（β−クロロエチル）アミンＮ−オキシド塩酸
塩；ｍｅｔｈｙｌ−ｂｉｓ（β−ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙ
ｌ）ａｍｉｎｅ Ｎ−ｏｘｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏ
ｒｉｄｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）（ｐ
−〔ビス（２−クロロエチル）アミノ〕−Ｌ−フェニル
アラニン；ｐ−〔ｂｉｓ（２−ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙ
ｌ）ａｍｉｎｏ〕−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎ
ｅ）、
【００１５】クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉ
ｌ）（ｐ−ビス（２−クロロエチル）アミノ−フェニル
酪酸；ｐ−ｈｉｓ（２−ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌ）ａｍ
ｉｎｏ−ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、ウ
ラムスチン（ｕｒａｍｕｓｔｉｎ）（５−ビス（２−ク
ロロエチル）アミノウラシル；５−ｂｉｓ（２−ｃｈｌ
ｏｒｏｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｕｒａｃｉｌ）、イホス
ファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）（Ｎ，Ｎ′−ビス
（２−クロロエチル）−Ｎ′，Ｏ−プロピレンリン酸エ
ステルジアミド；Ｎ，Ｎ′−ｂｉｓ（２−ｃｈｌｏｒｏ
ｅｔｈｙｌ）−Ｎ′，Ｏ−ｐｒｏｐｙｌｅｎｅｐｈｏｓ
ｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒ ｄｉａｍｉｄ
ｅ）、
ｌ）（ｐ−ビス（２−クロロエチル）アミノ−フェニル
酪酸；ｐ−ｈｉｓ（２−ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌ）ａｍ
ｉｎｏ−ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、ウ
ラムスチン（ｕｒａｍｕｓｔｉｎ）（５−ビス（２−ク
ロロエチル）アミノウラシル；５−ｂｉｓ（２−ｃｈｌ
ｏｒｏｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｕｒａｃｉｌ）、イホス
ファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）（Ｎ，Ｎ′−ビス
（２−クロロエチル）−Ｎ′，Ｏ−プロピレンリン酸エ
ステルジアミド；Ｎ，Ｎ′−ｂｉｓ（２−ｃｈｌｏｒｏ
ｅｔｈｙｌ）−Ｎ′，Ｏ−ｐｒｏｐｙｌｅｎｅｐｈｏｓ
ｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒ ｄｉａｍｉｄ
ｅ）、
【００１６】シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓ
ｐｈａｍｉｄｅ）（Ｎ，Ｎ−ビス（β−クロロエチル）
−Ｎ′，Ｏ−プロピレンリン酸エステルジアミド；Ｎ，
Ｎ−ｂｉｓ（β−ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌ）−Ｎ′，Ｏ
−ｐｒｏｐｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ
ｅｓｔｅｒ ｄｉａｍｉｄｅ）等が含まれる。本発明
において、これらのナイトロジェンマスタード系抗癌剤
は、一種類あるいはそれら自身複数の組み合わせで使用
することができる。この内、メルファランは、サルコリ
シン（ｓａｒｃｏｌｙｓｉｎｅ）又はフェニルアラニン
マスタード（Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ｍｕｓ
ｔａｒｄ）とも称され、次の構造を有する。
ｐｈａｍｉｄｅ）（Ｎ，Ｎ−ビス（β−クロロエチル）
−Ｎ′，Ｏ−プロピレンリン酸エステルジアミド；Ｎ，
Ｎ−ｂｉｓ（β−ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌ）−Ｎ′，Ｏ
−ｐｒｏｐｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ
ｅｓｔｅｒ ｄｉａｍｉｄｅ）等が含まれる。本発明
において、これらのナイトロジェンマスタード系抗癌剤
は、一種類あるいはそれら自身複数の組み合わせで使用
することができる。この内、メルファランは、サルコリ
シン（ｓａｒｃｏｌｙｓｉｎｅ）又はフェニルアラニン
マスタード（Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ｍｕｓ
ｔａｒｄ）とも称され、次の構造を有する。
【００１７】
【化２】
【００１８】メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａ
ｍｉｎｅ）は公知の方法、例えばＡｂｒａｍｓ ｅｔ
ａｌ., Ｊ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｄ．（Ｌｏｎｄｏ
ｎ）（１９４９）６８，２８０に記載の方法により得る
ことができる。ナイトロジェンマスタードＮ−オキシド
（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄＮ−ｏｘｉｄｅ）
は公知の方法、例えばＡｉｋｏ ｅｔ ａｌ., Ｊ．Ｐ
ｈａｒｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ（１９５２）７２，１２
９７により得ることができる。メルファラン（ｍｅｌｐ
ｈａｌａｎ）は公知の方法、例えばＢｅｒｇｅｌ，Ｆ．
ｅｔ ａｌ., Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９５４）２
４０９に記載の方法により得ることができる。
ｍｉｎｅ）は公知の方法、例えばＡｂｒａｍｓ ｅｔ
ａｌ., Ｊ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｄ．（Ｌｏｎｄｏ
ｎ）（１９４９）６８，２８０に記載の方法により得る
ことができる。ナイトロジェンマスタードＮ−オキシド
（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄＮ−ｏｘｉｄｅ）
は公知の方法、例えばＡｉｋｏ ｅｔ ａｌ., Ｊ．Ｐ
ｈａｒｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ（１９５２）７２，１２
９７により得ることができる。メルファラン（ｍｅｌｐ
ｈａｌａｎ）は公知の方法、例えばＢｅｒｇｅｌ，Ｆ．
ｅｔ ａｌ., Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９５４）２
４０９に記載の方法により得ることができる。
【００１９】クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉ
ｌ）は公知の方法、例えばＢａｌａｚｓ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ
ａｌ., Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（１９７０）５
９，５６３に記載の方法で得ることができる。ウラムス
チン（ｕｒａｍｕｓｔｉｎ）は公知の方法、例えばＬｙ
ｔｔｌｅ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒｉｎｇ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｓｏｃ．（１９５８）８０，６４５９に記載の方
法で得ることができる。
ｌ）は公知の方法、例えばＢａｌａｚｓ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ
ａｌ., Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（１９７０）５
９，５６３に記載の方法で得ることができる。ウラムス
チン（ｕｒａｍｕｓｔｉｎ）は公知の方法、例えばＬｙ
ｔｔｌｅ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒｉｎｇ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｓｏｃ．（１９５８）８０，６４５９に記載の方
法で得ることができる。
【００２０】イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）
は公知の方法、例えばＡｒｎｏｌｄＨ．ｅｔ ａｌ.,
Ｕ．Ｓ．ｐａｔ．（１９７３ｔｏ Ａｓｔａ）３，７３
２，３４０またはＢｒａｓｓｆｉｅｌｄ，Ｈ．Ａ．ｅｔ
ａｌ., Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９７５）
９７，４１４３に記載の方法により得ることができる。
また、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａ
ｍｉｄｅ）は公知の方法、例えばＡｒｎｏｌｄ，Ｈ．ｅ
ｔ ａｌ., Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．（１９５８）７
０，５３９に先の方法により得ることができる。
は公知の方法、例えばＡｒｎｏｌｄＨ．ｅｔ ａｌ.,
Ｕ．Ｓ．ｐａｔ．（１９７３ｔｏ Ａｓｔａ）３，７３
２，３４０またはＢｒａｓｓｆｉｅｌｄ，Ｈ．Ａ．ｅｔ
ａｌ., Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９７５）
９７，４１４３に記載の方法により得ることができる。
また、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａ
ｍｉｄｅ）は公知の方法、例えばＡｒｎｏｌｄ，Ｈ．ｅ
ｔ ａｌ., Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．（１９５８）７
０，５３９に先の方法により得ることができる。
【００２１】１．抗ＩＬ−６受容体抗体 本発明で使用される抗ＩＬ−６受容体抗体は、ナイトロ
ジェンマスタード系抗癌剤と併用されることにより、抗
ＩＬ−６受容体抗体単独で使用される場合及びナイトロ
ジェンマスタード系抗癌剤単独で使用される場合に比べ
て高い骨髄腫治療効果を有するものであれば、その由
来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）および形
状を問わない。
ジェンマスタード系抗癌剤と併用されることにより、抗
ＩＬ−６受容体抗体単独で使用される場合及びナイトロ
ジェンマスタード系抗癌剤単独で使用される場合に比べ
て高い骨髄腫治療効果を有するものであれば、その由
来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）および形
状を問わない。
【００２２】本発明で使用される抗ＩＬ−６受容体抗体
は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクロ
ーナル抗体として得ることができる。本発明で使用され
る抗ＩＬ−６受容体抗体として、特に哺乳動物由来のモ
ノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクロ
ーナル抗体としては、ハイブリドーマに産生される抗
体、および、抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換
した宿主に産生される組換え型抗体がある。本発明で使
用される抗ＩＬ−６受容体抗体はＩＬ−６受容体と結合
することにより、ＩＬ−６のＩＬ−６受容体への結合を
阻害してＩＬ−６のシグナル伝達を遮断し、ＩＬ−６の
生物学的活性を阻害する抗体である。
は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクロ
ーナル抗体として得ることができる。本発明で使用され
る抗ＩＬ−６受容体抗体として、特に哺乳動物由来のモ
ノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクロ
ーナル抗体としては、ハイブリドーマに産生される抗
体、および、抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換
した宿主に産生される組換え型抗体がある。本発明で使
用される抗ＩＬ−６受容体抗体はＩＬ−６受容体と結合
することにより、ＩＬ−６のＩＬ−６受容体への結合を
阻害してＩＬ−６のシグナル伝達を遮断し、ＩＬ−６の
生物学的活性を阻害する抗体である。
【００２３】このような抗体としては、ＰＭ−１抗体
（Ｈｉｒａｔａ，ｅｔ ａｌ., Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ（１９８９）１４３，２９００−２９０６）あるい
はＡＵＫ１２−２０抗体、ＡＵＫ６４−７抗体またはＡ
ＵＫ１４６−１５抗体（国際特許出願公開番号ＷＯ９２
−１９７５９）等が挙げられる。これらのうちで、特に
好ましい抗体としてＰＭ−１抗体が挙げられる。なお、
ＰＭ−１抗体産生ハイブリドーマ細胞株は、ＰＭ−１と
して、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つく
ば市東１丁目１番３号）に、平成２年７月１０日に、Ｆ
ＥＲＭＢＰ−２９９８としてブダペスト条約に基づき国
際寄託されている。
（Ｈｉｒａｔａ，ｅｔ ａｌ., Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ（１９８９）１４３，２９００−２９０６）あるい
はＡＵＫ１２−２０抗体、ＡＵＫ６４−７抗体またはＡ
ＵＫ１４６−１５抗体（国際特許出願公開番号ＷＯ９２
−１９７５９）等が挙げられる。これらのうちで、特に
好ましい抗体としてＰＭ−１抗体が挙げられる。なお、
ＰＭ−１抗体産生ハイブリドーマ細胞株は、ＰＭ−１と
して、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つく
ば市東１丁目１番３号）に、平成２年７月１０日に、Ｆ
ＥＲＭＢＰ−２９９８としてブダペスト条約に基づき国
際寄託されている。
【００２４】２．ハイブリドーマに産生される抗体 モノクローナル抗体は、基本的には公知技術を使用し、
以下のようにしてハイブリドーマを作製して得ることが
できる。すなわち、ＩＬ−６受容体を感作抗原として使
用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得
られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細
胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノク
ローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによ
って作製できる。具体的には、モノクローナル抗体を作
製するには次のようにすればよい。
以下のようにしてハイブリドーマを作製して得ることが
できる。すなわち、ＩＬ−６受容体を感作抗原として使
用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得
られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細
胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノク
ローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによ
って作製できる。具体的には、モノクローナル抗体を作
製するには次のようにすればよい。
【００２５】例えば、抗体取得の感作抗原として使用さ
れるＩＬ−６受容体は、由来となる動物種に制限されな
いがヒト由来のＩＬ−６受容体が特に好ましい。ヒトＩ
Ｌ−６受容体は、欧州特許出願公開番号ＥＰ３２５４７
４号に開示された遺伝子配列を用いてＩＬ−６受容体蛋
白質を得ることができる。ＩＬ−６受容体は、細胞膜上
に発現しているＩＬ−６受容体と細胞膜から離脱してい
るＩＬ−６受容体（可溶性ＩＬ−６受容体；Ｙａｓｕｋ
ａｗａ ｅｔ ａｌ., Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９
０），１０８，６７３−６７６）の二種類がある。
れるＩＬ−６受容体は、由来となる動物種に制限されな
いがヒト由来のＩＬ−６受容体が特に好ましい。ヒトＩ
Ｌ−６受容体は、欧州特許出願公開番号ＥＰ３２５４７
４号に開示された遺伝子配列を用いてＩＬ−６受容体蛋
白質を得ることができる。ＩＬ−６受容体は、細胞膜上
に発現しているＩＬ−６受容体と細胞膜から離脱してい
るＩＬ−６受容体（可溶性ＩＬ−６受容体；Ｙａｓｕｋ
ａｗａ ｅｔ ａｌ., Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９
０），１０８，６７３−６７６）の二種類がある。
【００２６】可溶性ＩＬ−６受容体は細胞膜に結合して
いるＩＬ−６受容体の主に細胞外領域から構成されてお
り、細胞膜貫通領域あるいは細胞膜貫通領域および細胞
内領域が欠損している点で膜結合型ＩＬ−６受容体と異
なっている。本発明において、感作抗原として使用され
るＩＬ−６受容体はこれら細胞膜上に結合しているＩＬ
−６受容体および可溶性ＩＬ−６受容体のいずれでもよ
い。また、それらの変異体であってもよい。ＩＬ−６受
容体をコードする遺伝子を公知の発現ベクター系に挿入
して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞
中または、培養上清中から目的のＩＬ−６受容体蛋白質
を公知の方法で精製し、この精製ＩＬ−６受容体蛋白質
を感作抗原として用いればよい。また、ＩＬ−６受容体
蛋白質を発現する細胞を感作抗原として使用してもよ
い。
いるＩＬ−６受容体の主に細胞外領域から構成されてお
り、細胞膜貫通領域あるいは細胞膜貫通領域および細胞
内領域が欠損している点で膜結合型ＩＬ−６受容体と異
なっている。本発明において、感作抗原として使用され
るＩＬ−６受容体はこれら細胞膜上に結合しているＩＬ
−６受容体および可溶性ＩＬ−６受容体のいずれでもよ
い。また、それらの変異体であってもよい。ＩＬ−６受
容体をコードする遺伝子を公知の発現ベクター系に挿入
して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞
中または、培養上清中から目的のＩＬ−６受容体蛋白質
を公知の方法で精製し、この精製ＩＬ−６受容体蛋白質
を感作抗原として用いればよい。また、ＩＬ−６受容体
蛋白質を発現する細胞を感作抗原として使用してもよ
い。
【００２７】感作抗原で免疫される哺乳動物としては、
特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親
細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般
的にはげっ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が使用され
る。げっ歯目の動物としては、例えば、マウス、ラッ
ト、ハムスター等が使用される。ウサギ目の動物として
は、例えば、ウサギが使用される。霊長目の動物として
は、例えばサルが使用される。サルとしては、狭鼻下目
のサル（旧世界ザル）、例えば、カニクイザル、アカゲ
ザル、マントヒヒ、チンパンジー等が使用される。
特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親
細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般
的にはげっ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が使用され
る。げっ歯目の動物としては、例えば、マウス、ラッ
ト、ハムスター等が使用される。ウサギ目の動物として
は、例えば、ウサギが使用される。霊長目の動物として
は、例えばサルが使用される。サルとしては、狭鼻下目
のサル（旧世界ザル）、例えば、カニクイザル、アカゲ
ザル、マントヒヒ、チンパンジー等が使用される。
【００２８】感作抗原を動物に免疫するには、公知の方
法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、
感作抗原を哺乳動物の腹腔内または、皮下に注射するこ
とにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐ
ｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）
や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望に
より通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジ
ュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４−２１日
毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時
に適当な担体を使用することができる。このように免疫
し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを常法によ
り確認した後に、哺乳動物から免疫細胞が取り出され、
細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特
に脾細胞が挙げられる。
法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、
感作抗原を哺乳動物の腹腔内または、皮下に注射するこ
とにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐ
ｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）
や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望に
より通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジ
ュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４−２１日
毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時
に適当な担体を使用することができる。このように免疫
し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを常法によ
り確認した後に、哺乳動物から免疫細胞が取り出され、
細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特
に脾細胞が挙げられる。
【００２９】前記免疫細胞と融合される他方の親細胞と
しての哺乳動物のミエローマ細胞としては、既に公知の
種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５
３）（Ｋｅａｒｎｅｙ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ., Ｊ．Ｉ
ｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８−１５５
０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．Ｕ１（Ｙｅｌｔｏｎ，Ｄ．
Ｅ．ｅｔ ａｌ., Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉ
ｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ（１９７８）８１，１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈ
ｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ., Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，５１１−５
１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｄ．Ｈ．
ｅｔ ａｌ., Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５−４１
５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ.,
Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９−２７
０）、ＦＯ（ｄｅ Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ａｎｄ
Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ，Ｄ., Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１−２１）、Ｓ
１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ., Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，３１３−３２３）、
Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ ａｌ., Ｎａｔｕ
ｒｅ（１９７９）２７７，１３１−１３３）等が好適に
使用される。
しての哺乳動物のミエローマ細胞としては、既に公知の
種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５
３）（Ｋｅａｒｎｅｙ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ., Ｊ．Ｉ
ｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８−１５５
０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．Ｕ１（Ｙｅｌｔｏｎ，Ｄ．
Ｅ．ｅｔ ａｌ., Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉ
ｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ（１９７８）８１，１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈ
ｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ., Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，５１１−５
１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｄ．Ｈ．
ｅｔ ａｌ., Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５−４１
５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ.,
Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９−２７
０）、ＦＯ（ｄｅ Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ａｎｄ
Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ，Ｄ., Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１−２１）、Ｓ
１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ., Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，３１３−３２３）、
Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ ａｌ., Ｎａｔｕ
ｒｅ（１９７９）２７７，１３１−１３３）等が好適に
使用される。
【００３０】前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合
は基本的には公知の方法、例えば、ミルステインらの方
法（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，
Ｃ.,Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７
３，３−４６）等に準じて行うことができる。より具体
的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在
下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤とし
ては例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、セン
ダイウィルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により
融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助
剤を添加使用することもできる。
は基本的には公知の方法、例えば、ミルステインらの方
法（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，
Ｃ.,Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７
３，３−４６）等に準じて行うことができる。より具体
的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在
下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤とし
ては例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、セン
ダイウィルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により
融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助
剤を添加使用することもできる。
【００３１】免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合
は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１−１
０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液
としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適
なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、こ
の種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能で
あり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併
用することもできる。
は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１−１
０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液
としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適
なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、こ
の種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能で
あり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併
用することもできる。
【００３２】細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細
胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、３７
℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１０
００−６０００程度のＰＥＧ溶液を通常、３０−６０％
（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的
とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続い
て、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去す
る操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好
ましくない細胞融合剤等を除去できる。
胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、３７
℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１０
００−６０００程度のＰＥＧ溶液を通常、３０−６０％
（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的
とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続い
て、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去す
る操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好
ましくない細胞融合剤等を除去できる。
【００３３】当該ハイブリドーマは、通常の選択培養
液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテ
リンおよびチミジンを含む培養液）で培養することによ
り選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とす
るハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅する
のに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、
通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生する
ハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニン
グが行われる。
液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテ
リンおよびチミジンを含む培養液）で培養することによ
り選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とす
るハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅する
のに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、
通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生する
ハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニン
グが行われる。
【００３４】また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上
記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ ｖ
ｉｔｒｏでＩＬ−６受容体蛋白質またはＩＬ−６受容体
蛋白質発現細胞により感作し、感作リンパ球をヒト由来
の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばＵ２６６
と融合させ、ＩＬ−６受容体への結合活性および中和活
性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを
得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。さら
に、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジ
ェニック動物に抗原となるＩＬ−６受容体またはＩＬ−
６受容体発現細胞を免疫して抗ＩＬ−６受容体抗体産生
細胞を取得し、これをミエローマ細胞と融合させたハイ
ブリドーマを用いてＩＬ−６受容体に対するヒト抗体を
取得してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ９２−０３
９１８、ＷＯ９３−１２２２７、ＷＯ９４−０２６０
２、ＷＯ９４−２５５８５、ＷＯ９６−３３７３５およ
びＷＯ９６−３４０９６参照）。
記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ ｖ
ｉｔｒｏでＩＬ−６受容体蛋白質またはＩＬ−６受容体
蛋白質発現細胞により感作し、感作リンパ球をヒト由来
の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばＵ２６６
と融合させ、ＩＬ−６受容体への結合活性および中和活
性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを
得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。さら
に、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジ
ェニック動物に抗原となるＩＬ−６受容体またはＩＬ−
６受容体発現細胞を免疫して抗ＩＬ−６受容体抗体産生
細胞を取得し、これをミエローマ細胞と融合させたハイ
ブリドーマを用いてＩＬ−６受容体に対するヒト抗体を
取得してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ９２−０３
９１８、ＷＯ９３−１２２２７、ＷＯ９４−０２６０
２、ＷＯ９４−２５５８５、ＷＯ９６−３３７３５およ
びＷＯ９６−３４０９６参照）。
【００３５】このようにして作製されるモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継
代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期
保存することが可能である。当該ハイブリドーマからモ
ノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマ
を通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得
る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある
哺乳動物に移植して増殖させ、その腹水として得る方法
などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得る
のに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産
に適している。ハイブリドーマを用いて抗体を産生する
以外に、抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞を癌
遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）により不死化させた細胞を
用いてもよい。
抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継
代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期
保存することが可能である。当該ハイブリドーマからモ
ノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマ
を通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得
る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある
哺乳動物に移植して増殖させ、その腹水として得る方法
などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得る
のに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産
に適している。ハイブリドーマを用いて抗体を産生する
以外に、抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞を癌
遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）により不死化させた細胞を
用いてもよい。
【００３６】３．組換え型抗体 モノクローナル抗体はまた、遺伝子組換え技術を用いて
産生させた組換え型抗体として得ることができる。例え
ば、組換え型抗体は、抗体遺伝子をハイブリドーマまた
は抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞からクロー
ニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に
導入し産生させる。本発明には、この組換え型抗体を用
いることができる（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，
Ｃ．Ａ．Ｋ．ａｎｄ Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ., ＴＨ
ＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩ
ＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕ
ｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ ｂｙ ＭＡＣＭＩＬＬＡ
Ｎ ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳＬＴＤ，１９９０参照）。
産生させた組換え型抗体として得ることができる。例え
ば、組換え型抗体は、抗体遺伝子をハイブリドーマまた
は抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞からクロー
ニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に
導入し産生させる。本発明には、この組換え型抗体を用
いることができる（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，
Ｃ．Ａ．Ｋ．ａｎｄ Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ., ＴＨ
ＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩ
ＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕ
ｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ ｂｙ ＭＡＣＭＩＬＬＡ
Ｎ ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳＬＴＤ，１９９０参照）。
【００３７】具体的には、抗ＩＬ−６受容体抗体を産生
するハイブリドーマから、抗ＩＬ−６受容体抗体の可変
領域（Ｖ領域）をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲ
ＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心
法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ., Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２
９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ａ
ｎｄ Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ., Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により全
ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等を使用して全ＲＮＡ
からｍＲＮＡを精製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ
ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製
することもできる。
するハイブリドーマから、抗ＩＬ−６受容体抗体の可変
領域（Ｖ領域）をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲ
ＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心
法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ., Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２
９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ａ
ｎｄ Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ., Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により全
ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等を使用して全ＲＮＡ
からｍＲＮＡを精製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ
ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製
することもできる。
【００３８】得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて
抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、
ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ
Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ Ｋｉｔ（生化学工業）等を用いて行うこともで
きる。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには５′
−Ａｍｐｌｉ ＦＩＮＤＥＲ ＲＡＣＥ Ｋｉｔ（Ｃｌ
ｏｎｔｅｃｈ）およびポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣ
Ｒ）を用いた５′−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．
Ａ．ｅｔ ａｌ.,Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，８９９８−９００
２；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ ａｌ., Ｎｕｃｌ
ｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１
９−２９３２）を使用することができる。
抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、
ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ
Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ Ｋｉｔ（生化学工業）等を用いて行うこともで
きる。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには５′
−Ａｍｐｌｉ ＦＩＮＤＥＲ ＲＡＣＥ Ｋｉｔ（Ｃｌ
ｏｎｔｅｃｈ）およびポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣ
Ｒ）を用いた５′−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．
Ａ．ｅｔ ａｌ.,Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，８９９８−９００
２；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ ａｌ., Ｎｕｃｌ
ｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１
９−２９３２）を使用することができる。
【００３９】得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ
断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、こ
れより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコ
ロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目
的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデ
オキシヌクレオチドチェインターミネーション法により
確認する。目的とする抗ＩＬ−６受容体抗体のＶ領域を
コードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常
領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発
現ベクターへ組み込む。または、抗体のＶ領域をコード
するＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを既に含む発現ベク
ターに組み込んでもよい。抗体Ｃ領域としては、Ｖ領域
と同じ動物種由来の抗体Ｃ領域を用いてもよいし、Ｖ領
域と異なる動物種由来の抗体Ｃ領域を用いてもよい。
断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、こ
れより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコ
ロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目
的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデ
オキシヌクレオチドチェインターミネーション法により
確認する。目的とする抗ＩＬ−６受容体抗体のＶ領域を
コードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常
領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発
現ベクターへ組み込む。または、抗体のＶ領域をコード
するＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを既に含む発現ベク
ターに組み込んでもよい。抗体Ｃ領域としては、Ｖ領域
と同じ動物種由来の抗体Ｃ領域を用いてもよいし、Ｖ領
域と異なる動物種由来の抗体Ｃ領域を用いてもよい。
【００４０】本発明で使用される抗ＩＬ−６受容体抗体
を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、
エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよ
う発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターに
より宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。抗体遺
伝子の発現は、抗体の重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）
をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで
宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖
およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに
組み込んで、宿主細胞を形質転換させてもよい（国際特
許出願公開番号ＷＯ９４−１１５２３参照）。
を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、
エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよ
う発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターに
より宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。抗体遺
伝子の発現は、抗体の重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）
をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで
宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖
およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに
組み込んで、宿主細胞を形質転換させてもよい（国際特
許出願公開番号ＷＯ９４−１１５２３参照）。
【００４１】４．改変抗体 本発明で使用される組換え型抗体は、ヒトに対する異種
抗原性を低下させること等を目的として遺伝子工学的手
法を用いて作製した改変抗体を使用することができる。
改変抗体はヒト抗体Ｃ領域を有し、例えば、キメラ（Ｃ
ｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅ
ｄ）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方
法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、前記
のようにして得た、ヒト抗体以外の抗体Ｖ領域をコード
するＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結
し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生
させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ
１２５０２３、国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７
５９参照）。この既知の方法を用いて、本発明に有用な
キメラ抗体を得ることができる。
抗原性を低下させること等を目的として遺伝子工学的手
法を用いて作製した改変抗体を使用することができる。
改変抗体はヒト抗体Ｃ領域を有し、例えば、キメラ（Ｃ
ｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅ
ｄ）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方
法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、前記
のようにして得た、ヒト抗体以外の抗体Ｖ領域をコード
するＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結
し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生
させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ
１２５０２３、国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７
５９参照）。この既知の方法を用いて、本発明に有用な
キメラ抗体を得ることができる。
【００４２】例えば、ＰＭ−１抗体のＬ鎖Ｖ領域または
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドは各々、ｐＰＭ−ｋ３およ
びｐＰＭ−ｈ１と命名され、このプラスミドを有する大
腸菌は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ
ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂ
ａｃｔｅｒｉａ Ｌｉｍｉｔｅｄに、１９９１年２月１
１日に各々ＮＣＩＭＢ４０３６６およびＮＣＩＭＢ４０
３６２としてブダペスト条約に基づき国際寄託されてい
る。ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト
抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗
体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体の相補性決定
領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え
手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ１２５
０２３、国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９参
照）。
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドは各々、ｐＰＭ−ｋ３およ
びｐＰＭ−ｈ１と命名され、このプラスミドを有する大
腸菌は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ
ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂ
ａｃｔｅｒｉａ Ｌｉｍｉｔｅｄに、１９９１年２月１
１日に各々ＮＣＩＭＢ４０３６６およびＮＣＩＭＢ４０
３６２としてブダペスト条約に基づき国際寄託されてい
る。ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト
抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗
体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体の相補性決定
領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え
手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ１２５
０２３、国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９参
照）。
【００４３】具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗
体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇ
ｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列
を、末端部で互いにオーバーラップする部分を有する数
本のオリゴヌクレオチドに分割して合成し、ＰＣＲ法に
より一本に統合したＤＮＡに合成する。得られたＤＮＡ
をヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで
発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生さ
せることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ２
３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５
９参照）。
体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇ
ｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列
を、末端部で互いにオーバーラップする部分を有する数
本のオリゴヌクレオチドに分割して合成し、ＰＣＲ法に
より一本に統合したＤＮＡに合成する。得られたＤＮＡ
をヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで
発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生さ
せることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ２
３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５
９参照）。
【００４４】ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲ
は、ＣＤＲが良好な抗原結合部位を形成するものが選択
される。必要に応じ、ヒト型化抗体のＣＤＲが適切な抗
原結合部位を形成するように抗体のＶ領域のＦＲのアミ
ノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ.,
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８
５６）。本発明に使用されるヒト型化抗体の好ましい具
体例としては、ヒト型化ＰＭ−１抗体が挙げられる（国
際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９参照）。ヒト
型化ＰＭ−１抗体は、マウス由来のＰＭ−１抗体のＣＤ
Ｒを、Ｌ鎖についてはヒト抗体ＲＥＩのＦＲと、Ｈ鎖に
ついてはヒト抗体ＮＥＷのＦＲと連結し、抗原結合活性
を有するようにＦＲのアミノ酸残基を一部置換したもの
である。
は、ＣＤＲが良好な抗原結合部位を形成するものが選択
される。必要に応じ、ヒト型化抗体のＣＤＲが適切な抗
原結合部位を形成するように抗体のＶ領域のＦＲのアミ
ノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ.,
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８
５６）。本発明に使用されるヒト型化抗体の好ましい具
体例としては、ヒト型化ＰＭ−１抗体が挙げられる（国
際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９参照）。ヒト
型化ＰＭ−１抗体は、マウス由来のＰＭ−１抗体のＣＤ
Ｒを、Ｌ鎖についてはヒト抗体ＲＥＩのＦＲと、Ｈ鎖に
ついてはヒト抗体ＮＥＷのＦＲと連結し、抗原結合活性
を有するようにＦＲのアミノ酸残基を一部置換したもの
である。
【００４５】本発明で使用される抗ＩＬ−６受容体抗体
を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、
エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよ
う発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターに
より宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。抗体遺
伝子の発現は、抗体の重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）
をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで
宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖
およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに
組み込んで、宿主細胞を形質転換させてもよい（国際特
許出願公開番号ＷＯ９４−１１５２３参照）。
を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、
エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよ
う発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターに
より宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。抗体遺
伝子の発現は、抗体の重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）
をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで
宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖
およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに
組み込んで、宿主細胞を形質転換させてもよい（国際特
許出願公開番号ＷＯ９４−１１５２３参照）。
【００４６】キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物抗体由来
のＶ領域とヒト抗体由来のＣ領域からなり、ヒト型化抗
体はヒト以外の哺乳動物抗体由来のＣＤＲとヒト抗体由
来のＦＲおよびＣ領域からなり、ヒト以外の哺乳動物に
由来するアミノ酸配列が最小限度に減少しているため、
ヒト体内における抗原性が低下し、本発明の治療剤の有
効成分として有用である。使用されるヒト抗体Ｃ領域と
しては、例えば、Ｃγ１，Ｃγ２，Ｃγ３，Ｃγ４を使
用することができる。また、抗体またはその産生の安定
性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよ
い。
のＶ領域とヒト抗体由来のＣ領域からなり、ヒト型化抗
体はヒト以外の哺乳動物抗体由来のＣＤＲとヒト抗体由
来のＦＲおよびＣ領域からなり、ヒト以外の哺乳動物に
由来するアミノ酸配列が最小限度に減少しているため、
ヒト体内における抗原性が低下し、本発明の治療剤の有
効成分として有用である。使用されるヒト抗体Ｃ領域と
しては、例えば、Ｃγ１，Ｃγ２，Ｃγ３，Ｃγ４を使
用することができる。また、抗体またはその産生の安定
性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよ
い。
【００４７】５．抗体断片および抗体修飾物 本発明で使用される抗体は、ＩＬ−６受容体に結合する
ことにより、ＩＬ−６とＩＬ−６受容体の結合を阻害し
てＩＬ−６のシグナル伝達を遮断し、ＩＬ−６の生物学
的活性を阻害するかぎり、その抗体断片や抗体修飾物で
あってよい。これらは、ナイトロジェンマスタード系抗
癌剤と併用されることにより、抗ＩＬ−６受容体抗体単
独で使用される場合及びナイトロジェンマスタード系抗
癌剤単独で使用される場合に比べて、高い骨髄腫治療効
果を有する抗体断片や抗体修飾物である。
ことにより、ＩＬ−６とＩＬ−６受容体の結合を阻害し
てＩＬ−６のシグナル伝達を遮断し、ＩＬ−６の生物学
的活性を阻害するかぎり、その抗体断片や抗体修飾物で
あってよい。これらは、ナイトロジェンマスタード系抗
癌剤と併用されることにより、抗ＩＬ−６受容体抗体単
独で使用される場合及びナイトロジェンマスタード系抗
癌剤単独で使用される場合に比べて、高い骨髄腫治療効
果を有する抗体断片や抗体修飾物である。
【００４８】例えば、抗体断片としては、Ｆａｂ，Ｆ
（ａｂ′）２、ＦｖまたはＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリ
ンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）
が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えば、パパ
イン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、また
は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これ
を発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現さ
せる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ., Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７
６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．
Ｈ., Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）
１７８，４７６−４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａ
ｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，Ａ., Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７−５１５；Ｌａｍ
ｏｙｉ，Ｅ., Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１
９８６）１２１，６５２−６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕ
ｘ，Ｊ．ｅｔ ａｌ., Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．（１９８６）１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，
Ｒ．Ｅ．ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ., Ｔｒｅｎｄ
ｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２−１
３７参照）。
（ａｂ′）２、ＦｖまたはＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリ
ンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）
が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えば、パパ
イン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、また
は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これ
を発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現さ
せる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ., Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７
６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．
Ｈ., Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）
１７８，４７６−４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａ
ｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，Ａ., Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７−５１５；Ｌａｍ
ｏｙｉ，Ｅ., Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１
９８６）１２１，６５２−６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕ
ｘ，Ｊ．ｅｔ ａｌ., Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．（１９８６）１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，
Ｒ．Ｅ．ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ., Ｔｒｅｎｄ
ｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２−１
３７参照）。
【００４９】ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領
域を連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおい
て、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域はリンカー、好ましくは、
ペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，
Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ., Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９
−５８８３）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖
Ｖ領域は、上記抗体として記載されたもののいずれの由
来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカー
としては、例えばアミノ酸１２−１９残基からなる任意
の一本鎖ペプチドが用いられる。
域を連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおい
て、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域はリンカー、好ましくは、
ペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，
Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ., Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９
−５８８３）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖
Ｖ領域は、上記抗体として記載されたもののいずれの由
来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカー
としては、例えばアミノ酸１２−１９残基からなる任意
の一本鎖ペプチドが用いられる。
【００５０】ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体
のＨ鎖または、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、および
Ｌ鎖または、Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを鋳型と
し、それらの配列のうちの所望のアミノ酸配列をコード
するＤＮＡ部分を、その両端を規定するプライマー対を
用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチド
リンカー部分をコードするＤＮＡおよびその両端を各々
Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を
組み合わせて増幅することにより得られる。一旦ｓｃＦ
ｖをコードするＤＮＡが作製されれば、それらを含有す
る発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換
された宿主を常法に従って得ることができ、また、その
宿主を用いて常法に従って、ｓｃＦｖを得ることができ
る。
のＨ鎖または、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、および
Ｌ鎖または、Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを鋳型と
し、それらの配列のうちの所望のアミノ酸配列をコード
するＤＮＡ部分を、その両端を規定するプライマー対を
用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチド
リンカー部分をコードするＤＮＡおよびその両端を各々
Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を
組み合わせて増幅することにより得られる。一旦ｓｃＦ
ｖをコードするＤＮＡが作製されれば、それらを含有す
る発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換
された宿主を常法に従って得ることができ、また、その
宿主を用いて常法に従って、ｓｃＦｖを得ることができ
る。
【００５１】また、抗体断片は、一部の配列が変異、置
換、欠失または挿入を受けた抗体断片であってよい。こ
れら抗体断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し
発現させ、宿主により産生させることができる。本願特
許請求の範囲でいう「抗体」にはこれらの抗体断片も包
含される。抗体修飾物として、ポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗ＩＬ−６受容体抗
体を使用することもできる。本願特許請求の範囲でいう
「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このよ
うな抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修
飾を施すことによって得ることができる。これらの方法
はこの分野において既に確立されている。
換、欠失または挿入を受けた抗体断片であってよい。こ
れら抗体断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し
発現させ、宿主により産生させることができる。本願特
許請求の範囲でいう「抗体」にはこれらの抗体断片も包
含される。抗体修飾物として、ポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗ＩＬ−６受容体抗
体を使用することもできる。本願特許請求の範囲でいう
「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このよ
うな抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修
飾を施すことによって得ることができる。これらの方法
はこの分野において既に確立されている。
【００５２】６．組換え型抗体、改変抗体、または抗体
断片の発現および産生 前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により
発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、
常用される有用なプロモーター／エンハンサー、発現さ
せる抗体遺伝子、その３′側下流にポリＡシグナルを機
能的に結合させたＤＮＡを含む発現ベクターにて発現さ
せることができる。例えばプロモーター／エンハンサー
としては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター
／エンハンサー（ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖ
ｉｒｕｓ ｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏ
ｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）を挙げることができる。
断片の発現および産生 前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により
発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、
常用される有用なプロモーター／エンハンサー、発現さ
せる抗体遺伝子、その３′側下流にポリＡシグナルを機
能的に結合させたＤＮＡを含む発現ベクターにて発現さ
せることができる。例えばプロモーター／エンハンサー
としては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター
／エンハンサー（ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖ
ｉｒｕｓ ｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏ
ｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）を挙げることができる。
【００５３】また、その他に本発明で使用される抗体発
現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レ
トロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、
シミアンウィルス４０（ＳＶ ４０）等のウィルスプロ
モーター／エンハンサーやヒトエロンゲーションファク
ター１α（ＨＥＦ１α）などの哺乳類細胞由来のプロモ
ーター／エンハンサーを用いればよい。例えば、ＳＶ
４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合、Ｍｕ
ｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．らの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９
７９）２７７，１０８−１１４）、また、ＨＥＦ１αプ
ロモーター／エンハンサーを使用する場合、Ｍｉｚｕｓ
ｈｉｍａ，Ｓ．らの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）に従えば容易
に実施することができる。
現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レ
トロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、
シミアンウィルス４０（ＳＶ ４０）等のウィルスプロ
モーター／エンハンサーやヒトエロンゲーションファク
ター１α（ＨＥＦ１α）などの哺乳類細胞由来のプロモ
ーター／エンハンサーを用いればよい。例えば、ＳＶ
４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合、Ｍｕ
ｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．らの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９
７９）２７７，１０８−１１４）、また、ＨＥＦ１αプ
ロモーター／エンハンサーを使用する場合、Ｍｉｚｕｓ
ｈｉｍａ，Ｓ．らの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）に従えば容易
に実施することができる。
【００５４】大腸菌の場合、常用される有用なプロモー
ター、抗体分泌のためのシグナル配列、発現させる抗体
遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。
例えばプロモーターとしては、ｌａｃＺプロモーター、
ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃＺ
プロモーターを使用する場合、Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．らの
方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４
６；ＦＡＳＥＢ Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４
２７）に、またａｒａＢプロモーターを使用する場合、
Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．らの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８
８）２４０，１０４１−１０４３）に従えばよい。
ター、抗体分泌のためのシグナル配列、発現させる抗体
遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。
例えばプロモーターとしては、ｌａｃＺプロモーター、
ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃＺ
プロモーターを使用する場合、Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．らの
方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４
６；ＦＡＳＥＢ Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４
２７）に、またａｒａＢプロモーターを使用する場合、
Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．らの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８
８）２４０，１０４１−１０４３）に従えばよい。
【００５５】抗体分泌のためのシグナル配列としては、
大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグ
ナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ ａｌ., Ｊ．Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９−４３８
３）を使用すればよい。ペリプラズムに産生された抗体
を分離した後、抗体の構造を適切に組み直して（ｒｅｆ
ｏｌｄ）使用する（例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ
９６−３０３９４参照）。
大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグ
ナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ ａｌ., Ｊ．Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９−４３８
３）を使用すればよい。ペリプラズムに産生された抗体
を分離した後、抗体の構造を適切に組み直して（ｒｅｆ
ｏｌｄ）使用する（例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ
９６−３０３９４参照）。
【００５６】複製起源としては、ＳＶ ４０、ポリオー
マウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス
（ＢＰＶ）等の由来の複製起源を用いることができ、さ
らに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベ
クターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトラン
スフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（Ｔ
Ｋ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシル
トランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ
葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができ
る。本発明で使用される抗体の製造のために、任意の産
生系を使用することができ、抗体製造のための産生系
は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの産生系が
ある。ｉｎ ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を
使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられ
る。
マウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス
（ＢＰＶ）等の由来の複製起源を用いることができ、さ
らに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベ
クターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトラン
スフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（Ｔ
Ｋ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシル
トランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ
葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができ
る。本発明で使用される抗体の製造のために、任意の産
生系を使用することができ、抗体製造のための産生系
は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの産生系が
ある。ｉｎ ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を
使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられ
る。
【００５７】真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物
細胞、真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞として
は、（１）哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ，ＣＯＳ、ミエ
ローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅ
ｙ），ＨｅＬａ，Ｖｅｒｏ、（２）両生類細胞、例え
ば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは（３）昆虫
細胞、例えば、ｓｆ９，ｓｆ２１，Ｔｎ５が知られてい
る、植物細胞としては、例えば、ニコティアナ（Ｎｉｃ
ｏｔｉａｎａ）属、詳しくは、ニコティアナ タバカム
（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が
知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞
としては、（１）酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、詳しくは、サッカロミセ
ス セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）、あるいは（２）糸状菌、例えば、ア
スペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、詳しく
は、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｇｅｒ）が知られている。原核細胞を使用する場
合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞として
は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯
草菌が知られている。
細胞、真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞として
は、（１）哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ，ＣＯＳ、ミエ
ローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅ
ｙ），ＨｅＬａ，Ｖｅｒｏ、（２）両生類細胞、例え
ば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは（３）昆虫
細胞、例えば、ｓｆ９，ｓｆ２１，Ｔｎ５が知られてい
る、植物細胞としては、例えば、ニコティアナ（Ｎｉｃ
ｏｔｉａｎａ）属、詳しくは、ニコティアナ タバカム
（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が
知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞
としては、（１）酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、詳しくは、サッカロミセ
ス セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）、あるいは（２）糸状菌、例えば、ア
スペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、詳しく
は、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｇｅｒ）が知られている。原核細胞を使用する場
合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞として
は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯
草菌が知られている。
【００５８】これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を
形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ ｖ
ｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。培養
は、公知の方法に従い行う。例えば、哺乳類細胞用の培
養液として、ＤＭＥＭ，ＭＥＭ，ＲＰＭＩ１６４０，Ｉ
ＭＤＭ等を使用することができる。その際、牛胎児血清
（ＦＣＳ）等の血清補液を併用したり、無血清培養もで
きる。また、抗体遺伝子を導入した細胞を動物の腹腔等
へ移植することにより、ｉｎ ｖｉｖｏにて抗体を産生
してもよい。
形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ ｖ
ｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。培養
は、公知の方法に従い行う。例えば、哺乳類細胞用の培
養液として、ＤＭＥＭ，ＭＥＭ，ＲＰＭＩ１６４０，Ｉ
ＭＤＭ等を使用することができる。その際、牛胎児血清
（ＦＣＳ）等の血清補液を併用したり、無血清培養もで
きる。また、抗体遺伝子を導入した細胞を動物の腹腔等
へ移植することにより、ｉｎ ｖｉｖｏにて抗体を産生
してもよい。
【００５９】ｉｎ ｖｉｖｏの産生系としては、動物を
使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系
がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マ
ウス、ウシを用いることができる（Ｇｌａｓｅｒ，Ｖ.,
ＳＰＥＣＴＲＵＭ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａ
ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。
使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系
がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マ
ウス、ウシを用いることができる（Ｇｌａｓｅｒ，Ｖ.,
ＳＰＥＣＴＲＵＭ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａ
ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。
【００６０】哺乳類を用いる場合、トランスジェニック
動物を用いることができる。例えば、抗体遺伝子をヤギ
βカゼインのような乳汁中に固有に産生される蛋白質を
コードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調
製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入す
る。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニック
ヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得
る。トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体
を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトラ
ンスジェニックヤギに使用してもよい。（Ｅｂｅｒｔ，
Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ., Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
（１９９４）１２，６９９−７０２）。
動物を用いることができる。例えば、抗体遺伝子をヤギ
βカゼインのような乳汁中に固有に産生される蛋白質を
コードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調
製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入す
る。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニック
ヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得
る。トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体
を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトラ
ンスジェニックヤギに使用してもよい。（Ｅｂｅｒｔ，
Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ., Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
（１９９４）１２，６９９−７０２）。
【００６１】また、昆虫としては、カイコを用いること
ができる。カイコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を挿
入したバキュロウィルスをカイコに感染させ、このカイ
コの体液より所望の抗体を得る（Ｍａｅｄａ，Ｓ．ｅｔ
ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−
５９４）。さらに、植物を使用する場合、例えばタバコ
を用いることができる。タバコを用いる場合、目的の抗
体遺伝子を植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ５３０
に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム チュー
メファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアに導入する。こ
のバクテリアをタバコ、例えばニコティアナ タバカム
（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）に感染させ、
本タバコの葉より所望の抗体を得る（Ｍａ，Ｊ．Ｋ．ｅ
ｔ ａｌ., Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９
４）２４，１３１−１３８）。
ができる。カイコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を挿
入したバキュロウィルスをカイコに感染させ、このカイ
コの体液より所望の抗体を得る（Ｍａｅｄａ，Ｓ．ｅｔ
ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−
５９４）。さらに、植物を使用する場合、例えばタバコ
を用いることができる。タバコを用いる場合、目的の抗
体遺伝子を植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ５３０
に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム チュー
メファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアに導入する。こ
のバクテリアをタバコ、例えばニコティアナ タバカム
（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）に感染させ、
本タバコの葉より所望の抗体を得る（Ｍａ，Ｊ．Ｋ．ｅ
ｔ ａｌ., Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９
４）２４，１３１−１３８）。
【００６２】これらの動物または植物に上記のように抗
体遺伝子を導入し、動物または植物の体内で抗体を産生
させ、回収する。上述のようにｉｎ ｖｉｔｒｏまたは
ｉｎ ｖｉｖｏの産生系にて抗体を産生する場合、抗体
Ｈ鎖またはＬ鎖をコードするＤＮＡを別々に発現ベクタ
ーに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよい。ある
いはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベ
クターに組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国
際特許出願公開番号ＷＯ９４−１１５２３参照）。
体遺伝子を導入し、動物または植物の体内で抗体を産生
させ、回収する。上述のようにｉｎ ｖｉｔｒｏまたは
ｉｎ ｖｉｖｏの産生系にて抗体を産生する場合、抗体
Ｈ鎖またはＬ鎖をコードするＤＮＡを別々に発現ベクタ
ーに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよい。ある
いはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベ
クターに組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国
際特許出願公開番号ＷＯ９４−１１５２３参照）。
【００６３】７．抗体の分離、精製 前記のように発現、産生された抗体は、細胞内外、宿主
から分離し均一にまで精製することができる。本発明で
使用される抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用
されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定
されるものではない。例えば、アフィニティークロマト
グラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルタ
ー、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせれ
ば、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ：Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．Ｅ
ｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ，１９８８）。
から分離し均一にまで精製することができる。本発明で
使用される抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用
されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定
されるものではない。例えば、アフィニティークロマト
グラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルタ
ー、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせれ
ば、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ：Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．Ｅ
ｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ，１９８８）。
【００６４】アフィニティークロマトグラフィーに用い
るカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧ
カラムが挙げられる。例えば、プロテインＡカラムを用
いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等が
挙げられる。アフィニティークロマトグラフィー以外の
クロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロ
マトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾
過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー
等が挙げられる。（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃ
ｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ ＣｏｕｒｓｅＭａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｄａｎｉｅ
ｌ Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ., Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーは
ＨＰＬＣ，ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用い
て行うことができる。
るカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧ
カラムが挙げられる。例えば、プロテインＡカラムを用
いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等が
挙げられる。アフィニティークロマトグラフィー以外の
クロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロ
マトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾
過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー
等が挙げられる。（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃ
ｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ ＣｏｕｒｓｅＭａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｄａｎｉｅ
ｌ Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ., Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーは
ＨＰＬＣ，ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用い
て行うことができる。
【００６５】８．抗体の濃度測定 上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定または酵
素結合免疫吸着検定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ
ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳ
Ａ）等により行うことができる。すなわち、吸光度の測
定による場合には、得られた抗体をＰＢＳで適当に希釈
した後、２８０ｎｍの吸光度を測定し、種およびサブク
ラスにより吸光係数は異なるが、ヒト抗体の場合１ｍｇ
／ｍｌを１．４ＯＤとして算出する。
素結合免疫吸着検定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ
ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳ
Ａ）等により行うことができる。すなわち、吸光度の測
定による場合には、得られた抗体をＰＢＳで適当に希釈
した後、２８０ｎｍの吸光度を測定し、種およびサブク
ラスにより吸光係数は異なるが、ヒト抗体の場合１ｍｇ
／ｍｌを１．４ＯＤとして算出する。
【００６６】また、ＥＬＩＳＡによる場合は以下のよう
に測定することができる。すなわち、０．１Ｍ重炭酸緩
衝液（ｐＨ９．６）で１μｇ／ｍｌに希釈したヤギ抗ヒ
トＩｇＧ抗体１００μｌを９６穴プレート（Ｎｕｎｃ）
に加え、４℃で一晩インキュベーションし、抗体を固相
化する。ブロッキングの後、適宜希釈した本発明で使用
される抗体または抗体を含むサンプル、あるいは濃度標
準品として既知の濃度のヒトＩｇＧ１００μｌを添加
し、室温にて１時間インキュベーションする。
に測定することができる。すなわち、０．１Ｍ重炭酸緩
衝液（ｐＨ９．６）で１μｇ／ｍｌに希釈したヤギ抗ヒ
トＩｇＧ抗体１００μｌを９６穴プレート（Ｎｕｎｃ）
に加え、４℃で一晩インキュベーションし、抗体を固相
化する。ブロッキングの後、適宜希釈した本発明で使用
される抗体または抗体を含むサンプル、あるいは濃度標
準品として既知の濃度のヒトＩｇＧ１００μｌを添加
し、室温にて１時間インキュベーションする。
【００６７】洗浄後、５０００倍希釈したアルカリフォ
スファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体１００μｌを加え、
室温にて１時間インキュベートする。洗浄後、基質溶液
を加えインキュベーションの後、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ
ＲＥＡＤＥＲ Ｍｏｄｅｌ３５５０（Ｂｉｏ−Ｒａ
ｄ）を用いて４０５ｎｍでの吸光度を測定し、目的の抗
体の濃度を濃度標準ヒトＩｇＧの吸光度より算出する。
また、抗体の濃度測定には、ＢｌＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）を使用することができる。
スファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体１００μｌを加え、
室温にて１時間インキュベートする。洗浄後、基質溶液
を加えインキュベーションの後、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ
ＲＥＡＤＥＲ Ｍｏｄｅｌ３５５０（Ｂｉｏ−Ｒａ
ｄ）を用いて４０５ｎｍでの吸光度を測定し、目的の抗
体の濃度を濃度標準ヒトＩｇＧの吸光度より算出する。
また、抗体の濃度測定には、ＢｌＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）を使用することができる。
【００６８】９．抗体の活性の確認 本発明で使用される抗ＩＬ−６受容体抗体の活性の評価
は、通常知られた方法を使用することができる。ＩＬ−
６反応性細胞例えば、ＭＨ６０．ＢＳＦ２を培養したプ
レートにＩＬ−６を添加する。ついで抗ＩＬ−６受容体
抗体を共存させることにより、ＩＬ−６依存性細胞の 3
Ｈ標識チミジン取り込みを指標として評価すればよい。
は、通常知られた方法を使用することができる。ＩＬ−
６反応性細胞例えば、ＭＨ６０．ＢＳＦ２を培養したプ
レートにＩＬ−６を添加する。ついで抗ＩＬ−６受容体
抗体を共存させることにより、ＩＬ−６依存性細胞の 3
Ｈ標識チミジン取り込みを指標として評価すればよい。
【００６９】また、ＩＬ−６受容体発現細胞例えば、Ｕ
２６６を培養したプレートに、 125Ｉ標識ＩＬ−６と抗
ＩＬ−６受容体抗体を加える。そして、ＩＬ−６受容体
発現細胞に結合した 125Ｉ標識ＩＬ−６を測定すること
により、評価すればよい（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌ
ｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９
８８）。また、本発明で使用される抗ＩＬ−６受容体抗
体の抗原結合活性を測定する方法として、ＥＬＩＳＡ，
ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）
あるいは蛍光抗体法を用いることができる。
２６６を培養したプレートに、 125Ｉ標識ＩＬ−６と抗
ＩＬ−６受容体抗体を加える。そして、ＩＬ−６受容体
発現細胞に結合した 125Ｉ標識ＩＬ−６を測定すること
により、評価すればよい（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌ
ｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９
８８）。また、本発明で使用される抗ＩＬ−６受容体抗
体の抗原結合活性を測定する方法として、ＥＬＩＳＡ，
ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）
あるいは蛍光抗体法を用いることができる。
【００７０】例えば、ＥＬＩＳＡを用いる場合、ＩＬ−
６受容体に対する抗体を固相化した９６穴プレートにＩ
Ｌ−６受容体を添加し、次いで目的の抗ＩＬ−６受容体
抗体を含む試料、例えば、抗ＩＬ−６受容体抗体産生細
胞の培養上清や精製抗体を加える。アルカリフォスファ
ターゼ等の酵素で標識した、目的の抗ＩＬ−６受容体抗
体を認識する二次抗体を添加し、プレートをインキュベ
ーション、洗浄した後、ｐ−ニトロフェニル燐酸などの
酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性
を評価することができる。ＩＬ−６受容体として可溶性
ＩＬ−６受容体を使用してもよい。本発明で使用される
抗ＩＬ−６受容体抗体のリガンドレセプター結合阻害活
性を測定する方法としては、通常のＣｅｌｌ ＥＬＩＳ
Ａ、あるいは、リガンドレセプター結合アッセイを用い
ることができる。
６受容体に対する抗体を固相化した９６穴プレートにＩ
Ｌ−６受容体を添加し、次いで目的の抗ＩＬ−６受容体
抗体を含む試料、例えば、抗ＩＬ−６受容体抗体産生細
胞の培養上清や精製抗体を加える。アルカリフォスファ
ターゼ等の酵素で標識した、目的の抗ＩＬ−６受容体抗
体を認識する二次抗体を添加し、プレートをインキュベ
ーション、洗浄した後、ｐ−ニトロフェニル燐酸などの
酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性
を評価することができる。ＩＬ−６受容体として可溶性
ＩＬ−６受容体を使用してもよい。本発明で使用される
抗ＩＬ−６受容体抗体のリガンドレセプター結合阻害活
性を測定する方法としては、通常のＣｅｌｌ ＥＬＩＳ
Ａ、あるいは、リガンドレセプター結合アッセイを用い
ることができる。
【００７１】例えば、Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ法の場合、
ＩＬ−６受容体を発現する細胞を９６穴プレートで培養
して接着させ、パラホルムアルデヒドなどで固定化す
る。あるいは、ＩＬ−６受容体を発現する細胞の膜分画
を調製して固相化した９６穴プレートを作製する。これ
に、目的の抗ＩＬ−６受容体抗体を含む試料、例えば、
抗ＩＬ−６受容体抗体産生細胞の培養上清や精製抗体
と、放射性同位元素、例えば、 125Ｉ等で標識したＩＬ
−６を添加し、プレートをインキュベーション、洗浄し
た後、放射活性を測定することでＩＬ−６受容体に結合
したＩＬ−６量を測定でき、抗ＩＬ−６受容体抗体のリ
ガンドレセプター結合阻害活性を評価することができ
る。
ＩＬ−６受容体を発現する細胞を９６穴プレートで培養
して接着させ、パラホルムアルデヒドなどで固定化す
る。あるいは、ＩＬ−６受容体を発現する細胞の膜分画
を調製して固相化した９６穴プレートを作製する。これ
に、目的の抗ＩＬ−６受容体抗体を含む試料、例えば、
抗ＩＬ−６受容体抗体産生細胞の培養上清や精製抗体
と、放射性同位元素、例えば、 125Ｉ等で標識したＩＬ
−６を添加し、プレートをインキュベーション、洗浄し
た後、放射活性を測定することでＩＬ−６受容体に結合
したＩＬ−６量を測定でき、抗ＩＬ−６受容体抗体のリ
ガンドレセプター結合阻害活性を評価することができ
る。
【００７２】例えば、細胞上のＩＬ−６受容体に対する
ＩＬ−６の結合阻害アッセイには、ＩＬ−６受容体を発
現する細胞を遠心分離等の手段で分離した後、細胞懸濁
液として調製する。放射性同位元素、例えば、 125Ｉ等
で標識したＩＬ−６の溶液、あるいは非標識のＩＬ−６
と標識ＩＬ−６の混合溶液と、濃度調製した抗ＩＬ−６
受容体抗体を含む溶液を細胞懸濁液に添加する。一定時
間の後、細胞を分離し、細胞上に結合した標識ＩＬ−６
の放射活性を測定すればよい。上記抗体の活性評価に
は、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用する
ことができる。
ＩＬ−６の結合阻害アッセイには、ＩＬ−６受容体を発
現する細胞を遠心分離等の手段で分離した後、細胞懸濁
液として調製する。放射性同位元素、例えば、 125Ｉ等
で標識したＩＬ−６の溶液、あるいは非標識のＩＬ−６
と標識ＩＬ−６の混合溶液と、濃度調製した抗ＩＬ−６
受容体抗体を含む溶液を細胞懸濁液に添加する。一定時
間の後、細胞を分離し、細胞上に結合した標識ＩＬ−６
の放射活性を測定すればよい。上記抗体の活性評価に
は、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用する
ことができる。
【００７３】１０．投与方法および製剤 本発明によれば、ナイトロジェンマスタード系抗癌剤と
抗ＩＬ−６受容体抗体とを組合わせて使用する。「組合
わせて使用する」とは、それぞれの医薬組成物を異る時
間に投与する場合、それぞれの医薬組成物を同時に投与
する場合、及びナイトロジェンマスタード系抗癌剤及び
抗ＩＬ−６受容体抗体の両者を含んで成る１種類の医薬
組成物を投与する場合、を意味する。前二者の場合、ナ
イトロジェンマスタード系抗癌剤を含んで成る医薬組成
物と抗ＩＬ−６受容体抗体を含んで成る医薬組成物とを
同一の投与経路で投与してもよく、又は別の投与経路で
投与してもよい。これらの医薬組成物は各々、病気に既
に悩まされる患者に、病気の症状を治癒するか、あるい
は少なくとも部分的に阻止するために十分な量で投与さ
れる。また、投与期間は患者の年齢、症状により適宜選
択することができる。
抗ＩＬ−６受容体抗体とを組合わせて使用する。「組合
わせて使用する」とは、それぞれの医薬組成物を異る時
間に投与する場合、それぞれの医薬組成物を同時に投与
する場合、及びナイトロジェンマスタード系抗癌剤及び
抗ＩＬ−６受容体抗体の両者を含んで成る１種類の医薬
組成物を投与する場合、を意味する。前二者の場合、ナ
イトロジェンマスタード系抗癌剤を含んで成る医薬組成
物と抗ＩＬ−６受容体抗体を含んで成る医薬組成物とを
同一の投与経路で投与してもよく、又は別の投与経路で
投与してもよい。これらの医薬組成物は各々、病気に既
に悩まされる患者に、病気の症状を治癒するか、あるい
は少なくとも部分的に阻止するために十分な量で投与さ
れる。また、投与期間は患者の年齢、症状により適宜選
択することができる。
【００７４】抗ＩＬ−６受容体抗体を含んで成る医薬組
成物は、好ましくは、非経口的に、たとえば、静脈内注
射あるいは点滴、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等
により全身あるいは局部的に投与することができる。局
所投与形態として外用剤、局所注射剤などが好適に実施
し得る。外用剤としては、軟膏、ゲル、クリーム、乳
液、液剤などの塗布剤、テープ剤、パッチ剤などの貼付
剤、あるいはスプレー剤、粉剤などの噴霧剤から選択さ
れる。
成物は、好ましくは、非経口的に、たとえば、静脈内注
射あるいは点滴、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等
により全身あるいは局部的に投与することができる。局
所投与形態として外用剤、局所注射剤などが好適に実施
し得る。外用剤としては、軟膏、ゲル、クリーム、乳
液、液剤などの塗布剤、テープ剤、パッチ剤などの貼付
剤、あるいはスプレー剤、粉剤などの噴霧剤から選択さ
れる。
【００７５】抗ＩＬ−６受容体抗体の有効投与量として
は、１日につき体重１kg当たり０．００１mgから１００
０mgの範囲で選ばれる。好適には体重１kg当たり０．０
１mgから５０mgの範囲で選ばれる。前述の投与量は症状
によっても異なり、これらの値に限定されるものでは勿
論ない。投与回数としては通常１日１ないし２回、２な
いし数日に１回、もしくは１週ないし４週に１回の範囲
で選ばれるが、これに限定されるものではない。ナイト
ロジェンマスタード系抗癌剤を含んでなる医薬組成物
は、経口的に投与することが好ましいが、有効成分の性
質、患者の状態、などにより非経口的に投与することも
できる。たとえば、静脈内注射あるいは点滴、動脈内注
射、筋肉内注射、腫瘍内注射、胸腔あるいは腹腔内注射
にて全身あるいは局所に投与することができる。
は、１日につき体重１kg当たり０．００１mgから１００
０mgの範囲で選ばれる。好適には体重１kg当たり０．０
１mgから５０mgの範囲で選ばれる。前述の投与量は症状
によっても異なり、これらの値に限定されるものでは勿
論ない。投与回数としては通常１日１ないし２回、２な
いし数日に１回、もしくは１週ないし４週に１回の範囲
で選ばれるが、これに限定されるものではない。ナイト
ロジェンマスタード系抗癌剤を含んでなる医薬組成物
は、経口的に投与することが好ましいが、有効成分の性
質、患者の状態、などにより非経口的に投与することも
できる。たとえば、静脈内注射あるいは点滴、動脈内注
射、筋肉内注射、腫瘍内注射、胸腔あるいは腹腔内注射
にて全身あるいは局所に投与することができる。
【００７６】ナイトロジェンマスタード系抗癌剤の有効
投与量は、有効成分の種類により異なるが、たとえばメ
ルファランでは、１日あたり１〜２０mgを連日あるいは
週に１〜６回経口投与、または大量静注療法として２０
〜２００mg／ｍ2 を単回ないし複数回投与する。また、
シクロホスファミドでは、１回５０〜２０００mgを経口
あるいは静脈内にて、通常週１〜５回、もしくは２週な
いし月に１回投与する。なお、投与回数ないし投与スケ
ジュールは、ここにあげた例に限定されるものではな
い。また、ナイトロジェンマスタード系抗癌剤は、単独
で投与されるのみならずビンクリスチン、アドリアマイ
シン、プレドニソロンなどと適宜併用することができ
る。
投与量は、有効成分の種類により異なるが、たとえばメ
ルファランでは、１日あたり１〜２０mgを連日あるいは
週に１〜６回経口投与、または大量静注療法として２０
〜２００mg／ｍ2 を単回ないし複数回投与する。また、
シクロホスファミドでは、１回５０〜２０００mgを経口
あるいは静脈内にて、通常週１〜５回、もしくは２週な
いし月に１回投与する。なお、投与回数ないし投与スケ
ジュールは、ここにあげた例に限定されるものではな
い。また、ナイトロジェンマスタード系抗癌剤は、単独
で投与されるのみならずビンクリスチン、アドリアマイ
シン、プレドニソロンなどと適宜併用することができ
る。
【００７７】ナイトロジェンマスタード系抗癌剤を含ん
でなる医薬組成物と抗ヒトＩＬ−６受容体抗体とを同時
に投与する場合、その比率は、患者の状態、投与スケジ
ュールなどにより異なるが、たとえば、メルファラン連
日経口投与と組み合わせた場合、メルファランの投与量
に対し０．０１〜１０００倍（重量比）の範囲で選ばれ
る。また、両者を一定の割合で含んでなる医薬組成物を
投与することもできる。ただし、前述のとおり、患者の
病状などにより異なり、ここにあげた投与比率に限定さ
れるものではない。
でなる医薬組成物と抗ヒトＩＬ−６受容体抗体とを同時
に投与する場合、その比率は、患者の状態、投与スケジ
ュールなどにより異なるが、たとえば、メルファラン連
日経口投与と組み合わせた場合、メルファランの投与量
に対し０．０１〜１０００倍（重量比）の範囲で選ばれ
る。また、両者を一定の割合で含んでなる医薬組成物を
投与することもできる。ただし、前述のとおり、患者の
病状などにより異なり、ここにあげた投与比率に限定さ
れるものではない。
【００７８】ナイトロジェンマスタード系抗癌剤を含ん
でなる医薬組成物と抗ＩＬ−６受容体抗体とを別々の時
点で投与するスケジュールを組むこともできる。たとえ
ば、ナイトロジェンマスタード系抗癌剤あるいは同剤を
構成要素とする併用療法を施すことにより、寛解を導入
した患者に対し、寛解維持を目的として抗ＩＬ−６受容
体抗体を投与することができる。また、ナイトロジェン
マスタード系抗癌剤あるいは同剤を構成要素とする併用
療法と抗ＩＬ−６受容体抗体投与とを１〜４週間ごとに
繰り返すことができる。ナイトロジェンマスタード系抗
癌剤と抗ＩＬ−６受容体抗体では、前者を先に投与する
スケジュールが好ましいが、患者の状態などにより後者
を先に投与することもできる。
でなる医薬組成物と抗ＩＬ−６受容体抗体とを別々の時
点で投与するスケジュールを組むこともできる。たとえ
ば、ナイトロジェンマスタード系抗癌剤あるいは同剤を
構成要素とする併用療法を施すことにより、寛解を導入
した患者に対し、寛解維持を目的として抗ＩＬ−６受容
体抗体を投与することができる。また、ナイトロジェン
マスタード系抗癌剤あるいは同剤を構成要素とする併用
療法と抗ＩＬ−６受容体抗体投与とを１〜４週間ごとに
繰り返すことができる。ナイトロジェンマスタード系抗
癌剤と抗ＩＬ−６受容体抗体では、前者を先に投与する
スケジュールが好ましいが、患者の状態などにより後者
を先に投与することもできる。
【００７９】本発明の、ナイトロジェンマスタード系抗
癌剤を含んで成る医薬組成物、抗ＩＬ−６受容体抗体を
含んで成る医薬組成物、並びにナイトロジェンマスター
ド系抗癌剤と抗ＩＬ−６受容体抗体とを含んで成る医薬
組成物は、投与経路により異るが、医薬的に許容される
担体や添加物を共に含むものであってもよい。
癌剤を含んで成る医薬組成物、抗ＩＬ−６受容体抗体を
含んで成る医薬組成物、並びにナイトロジェンマスター
ド系抗癌剤と抗ＩＬ−６受容体抗体とを含んで成る医薬
組成物は、投与経路により異るが、医薬的に許容される
担体や添加物を共に含むものであってもよい。
【００８０】このような担体及び医薬添加物の例とし
て、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポ
リビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキ
シビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリ
ウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウ
ム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナ
トリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロ
ース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラ
チン、寒天、ジグリセリン、グリセリン、プロピレング
リコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフ
ィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清
アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、
ラクトース、医薬添加物として許容され得る界面活性剤
などがあげられる。
て、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポ
リビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキ
シビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリ
ウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウ
ム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナ
トリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロ
ース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラ
チン、寒天、ジグリセリン、グリセリン、プロピレング
リコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフ
ィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清
アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、
ラクトース、医薬添加物として許容され得る界面活性剤
などがあげられる。
【００８１】実際の添加物は本発明治療剤の剤型に応じ
て上記の中から適宜あるいは組み合わせて選ばれるが、
もちろんこれらに限定するものではない。本発明はま
た、本発明の薬剤と他の薬剤、生物学的製剤や合成医薬
製剤などとの、同時もしくは逐次的併用投与をも包含す
る。他の薬剤としては、抗炎症薬や抗アレルギー薬、抗
血小板薬、他の抗腫瘍薬あるいは本発明の目的である活
性を増強もしくは補助するような薬剤の中から選ばれ
る。
て上記の中から適宜あるいは組み合わせて選ばれるが、
もちろんこれらに限定するものではない。本発明はま
た、本発明の薬剤と他の薬剤、生物学的製剤や合成医薬
製剤などとの、同時もしくは逐次的併用投与をも包含す
る。他の薬剤としては、抗炎症薬や抗アレルギー薬、抗
血小板薬、他の抗腫瘍薬あるいは本発明の目的である活
性を増強もしくは補助するような薬剤の中から選ばれ
る。
【００８２】
【実施例】以下、参考例、実験例および実施例により本
発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定され
るものではない。参考例１ ．抗ヒトＩＬ−６受容体抗体ＰＭ−１の調製 Hirataらの方法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９）１
４３，２９００−２９０６）により作成した抗ＩＬ−６
受容体抗体ＭＴ１８をＣＮＢｒにより活性化させたセフ
ァロース４Ｂ（Pharmacia Fine Chemicals製、Ｐｉｓｃ
ａｔａｗａｙ，ＮＪ）と添付の処方にしたがって結合さ
せ、ＩＬ−６受容体（Yamasakiら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
４１：８２５−８２８，１９８８）を精製した。
発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定され
るものではない。参考例１ ．抗ヒトＩＬ−６受容体抗体ＰＭ−１の調製 Hirataらの方法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９）１
４３，２９００−２９０６）により作成した抗ＩＬ−６
受容体抗体ＭＴ１８をＣＮＢｒにより活性化させたセフ
ァロース４Ｂ（Pharmacia Fine Chemicals製、Ｐｉｓｃ
ａｔａｗａｙ，ＮＪ）と添付の処方にしたがって結合さ
せ、ＩＬ−６受容体（Yamasakiら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
４１：８２５−８２８，１９８８）を精製した。
【００８３】すなわち、ヒトミエローマ細胞株Ｕ２６６
を１％ジギトニン（Wako chemicals製) 、１０mMトリエ
タノールアミン（pH７．８）および０．１５Ｍ ＮａＣ
ｌを含む１mM ｐ−パラアミノフェニルメタンスルフォ
ニルフルオライドハイドロクロリド（Wako Chemicals
製）（ジギトニン緩衝液）で可溶化し、セファロース４
Ｂビーズと結合させたＭＴ１８抗体と混合した。その
後、ビーズをジギトニン緩衝液で６回洗浄し、免疫に用
いる部分精製ＩＬ−６受容体とした。
を１％ジギトニン（Wako chemicals製) 、１０mMトリエ
タノールアミン（pH７．８）および０．１５Ｍ ＮａＣ
ｌを含む１mM ｐ−パラアミノフェニルメタンスルフォ
ニルフルオライドハイドロクロリド（Wako Chemicals
製）（ジギトニン緩衝液）で可溶化し、セファロース４
Ｂビーズと結合させたＭＴ１８抗体と混合した。その
後、ビーズをジギトニン緩衝液で６回洗浄し、免疫に用
いる部分精製ＩＬ−６受容体とした。
【００８４】ＢＡＬＢ／ｃマウスを３×１０9 個のＵ２
６６細胞から得た上記部分精製ＩＬ−６受容体で１０日
おきに４回免疫し、その後常法によりハイブリドーマを
作成した。成長陽性ウェルからのハイブリドーマ培養上
清を下記の方法にてＩＬ−６受容体への結合活性を調べ
た。５×１０7 個のＵ２６６細胞を35Ｓ−メチオニン
（２．５ｍＣｉ）で標識し、上記ジギトニン緩衝液で可
溶化した。可溶化したＵ２６６細胞を０．０４ml容量の
セファロース４Ｂビーズと結合させたＭＴ１８抗体と混
合し、その後、ジギトニン緩衝液で６回洗浄し、０．２
５mlのジギトニン緩衝液（pH３．４）により35Ｓ−メチ
オニン標識ＩＬ−６受容体を流出させ、０．０２５mlの
１Ｍ Ｔｒｉｓ（pH７．４）で中和した。０．０５mlの
ハイブリドーマ培養上清を０．０１mlのＰｒｏｔｅｉｎ
Ｇセファロース（Pharmacia 製) と混合した。
６６細胞から得た上記部分精製ＩＬ−６受容体で１０日
おきに４回免疫し、その後常法によりハイブリドーマを
作成した。成長陽性ウェルからのハイブリドーマ培養上
清を下記の方法にてＩＬ−６受容体への結合活性を調べ
た。５×１０7 個のＵ２６６細胞を35Ｓ−メチオニン
（２．５ｍＣｉ）で標識し、上記ジギトニン緩衝液で可
溶化した。可溶化したＵ２６６細胞を０．０４ml容量の
セファロース４Ｂビーズと結合させたＭＴ１８抗体と混
合し、その後、ジギトニン緩衝液で６回洗浄し、０．２
５mlのジギトニン緩衝液（pH３．４）により35Ｓ−メチ
オニン標識ＩＬ−６受容体を流出させ、０．０２５mlの
１Ｍ Ｔｒｉｓ（pH７．４）で中和した。０．０５mlの
ハイブリドーマ培養上清を０．０１mlのＰｒｏｔｅｉｎ
Ｇセファロース（Pharmacia 製) と混合した。
【００８５】洗浄した後、セファロースを上記で調製し
た０．００５mlの35Ｓ−標識ＩＬ−６受容体溶液ととも
にインキュベートした。免疫沈降物質をＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅで分析し、ＩＬ−６受容体と反応するハイブリドーマ
培養上清を調べた。その結果、反応陽性ハイブリドーマ
クローンＰＭ−１を樹立した。ハイブリドーマＰＭ−１
から産生される抗ＩＬ−６受容体抗体ＰＭ−１は、Ｉｇ
Ｇｌκ型のサブタイプを有する。
た０．００５mlの35Ｓ−標識ＩＬ−６受容体溶液ととも
にインキュベートした。免疫沈降物質をＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅで分析し、ＩＬ−６受容体と反応するハイブリドーマ
培養上清を調べた。その結果、反応陽性ハイブリドーマ
クローンＰＭ−１を樹立した。ハイブリドーマＰＭ−１
から産生される抗ＩＬ−６受容体抗体ＰＭ−１は、Ｉｇ
Ｇｌκ型のサブタイプを有する。
【００８６】ハイブリドーマＰＭ−１が産生する抗体の
ヒトＩＬ−６受容体に対するＩＬ−６の結合阻害活性を
ヒトミエローマ細胞株Ｕ２６６を用いて調べた。ヒト組
換型ＩＬ−６を大腸菌より調製し（Hiranoら、Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９８８）１７，４１）、ボルト
ン−ハンター試薬（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌ
ｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）により 125Ｉ標識した
（Tagaら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８７）１６６，
９６７）。
ヒトＩＬ−６受容体に対するＩＬ−６の結合阻害活性を
ヒトミエローマ細胞株Ｕ２６６を用いて調べた。ヒト組
換型ＩＬ−６を大腸菌より調製し（Hiranoら、Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９８８）１７，４１）、ボルト
ン−ハンター試薬（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌ
ｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）により 125Ｉ標識した
（Tagaら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８７）１６６，
９６７）。
【００８７】４×１０5 個のＵ２６６細胞を、１００倍
量の過剰な非標識ＩＬ−６の存在下で室温にて、１時
間、７０％（ｖ／ｖ）のハイブリドーマＰＭ−１の培養
上清及び１４０００CPM の 125Ｉ標識ＩＬ−６とともに
培養した。７０μｌのサンプルを４００μｌのマイクロ
フユージポリエチレンチューブに入れた３００μｌのＦ
ＣＳ上に重層し、遠心の後、細胞上の放射活性を測定し
た。その結果、ハイブリドーマＰＭ−１が産生する抗体
は、ＩＬ−６のＩＬ−６受容体に対する結合を阻害する
ことが明らかとなった。
量の過剰な非標識ＩＬ−６の存在下で室温にて、１時
間、７０％（ｖ／ｖ）のハイブリドーマＰＭ−１の培養
上清及び１４０００CPM の 125Ｉ標識ＩＬ−６とともに
培養した。７０μｌのサンプルを４００μｌのマイクロ
フユージポリエチレンチューブに入れた３００μｌのＦ
ＣＳ上に重層し、遠心の後、細胞上の放射活性を測定し
た。その結果、ハイブリドーマＰＭ−１が産生する抗体
は、ＩＬ−６のＩＬ−６受容体に対する結合を阻害する
ことが明らかとなった。
【００８８】参考例２．再構成ヒトＰＭ−１抗体の作成 再構成ヒトＰＭ−１抗体を国際特許出願公開番号ＷＯ９
２−１９７５９に記載の方法により得た。参考例１で作
成されたハイブリドーマＰＭ−１から常法で全ＲＮＡを
調製し、これより一本鎖ｃＤＮＡの合成を行った。ポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によりマウスＰＭ−１の
Ｖ領域のＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ法に使用するプライ
マーは S. T. Jonesら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ，９，８８，１９９１に記載されたものを用いた。
２−１９７５９に記載の方法により得た。参考例１で作
成されたハイブリドーマＰＭ−１から常法で全ＲＮＡを
調製し、これより一本鎖ｃＤＮＡの合成を行った。ポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によりマウスＰＭ−１の
Ｖ領域のＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ法に使用するプライ
マーは S. T. Jonesら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ，９，８８，１９９１に記載されたものを用いた。
【００８９】ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を精製
し、マウスカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含
むＤＮＡ断片、及びマウスガンマ型Ｈ鎖Ｖ領域をコード
する遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。これらのＤＮＡ断
片をプラスミドｐＵＣ１９に連結し、大腸菌ＤＨ５αの
コンピテント細胞に導入して大腸菌形質転換体を得た。
この形質転換体から上記プラスミドを得、プラスミド中
のＶ領域コード領域の塩基配列を、常法にしたがい決定
し、さらに各Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）を決定
した。
し、マウスカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含
むＤＮＡ断片、及びマウスガンマ型Ｈ鎖Ｖ領域をコード
する遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。これらのＤＮＡ断
片をプラスミドｐＵＣ１９に連結し、大腸菌ＤＨ５αの
コンピテント細胞に導入して大腸菌形質転換体を得た。
この形質転換体から上記プラスミドを得、プラスミド中
のＶ領域コード領域の塩基配列を、常法にしたがい決定
し、さらに各Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）を決定
した。
【００９０】キメラＰＭ−１抗体を発現するベクターを
作製するため、それぞれマウスＰＭ−１κＬ鎖及びＨ鎖
のＶ領域をコードするｃＤＮＡをＨＣＭＶ発現ベクター
に挿入した。再構成ヒトＰＭ−１抗体を作製するため
に、ＣＤＲ移植法によりマウスＰＭ−１のＶ領域ＣＤＲ
をヒト抗体へ移植した。ヒト型化抗体のＣＤＲが適切な
抗原結合部位を形成するように抗体のＶ領域のフレーム
ワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸を置換した。
作製するため、それぞれマウスＰＭ−１κＬ鎖及びＨ鎖
のＶ領域をコードするｃＤＮＡをＨＣＭＶ発現ベクター
に挿入した。再構成ヒトＰＭ−１抗体を作製するため
に、ＣＤＲ移植法によりマウスＰＭ−１のＶ領域ＣＤＲ
をヒト抗体へ移植した。ヒト型化抗体のＣＤＲが適切な
抗原結合部位を形成するように抗体のＶ領域のフレーム
ワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸を置換した。
【００９１】このようにして作製した再構成ヒトＰＭ−
１抗体のＬ鎖およびＨ鎖の遺伝子を哺乳類細胞中で発現
させるために、ヒトエロンゲーションファクター１α
（ＨＥＦ−１α）プロモーターを含有するベクターに各
々導入し、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖およびＨ鎖を発
現するベクターを作製した。これら二つの発現ベクター
をＣＨＯ細胞に同時に遺伝子導入することにより、再構
成ヒトＰＭ−１（ｈＰＭ−１）抗体を産生する細胞株を
樹立した。得られたｈＰＭ−１のヒトＩＬ−６受容体へ
の結合能はＥＬＩＳＡにて確認した。さらに、ｈＰＭ−
１はマウス抗体およびキメラ抗体と同様に、ヒトＩＬ−
６のヒトＩＬ−６受容体への結合を阻害した。
１抗体のＬ鎖およびＨ鎖の遺伝子を哺乳類細胞中で発現
させるために、ヒトエロンゲーションファクター１α
（ＨＥＦ−１α）プロモーターを含有するベクターに各
々導入し、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖およびＨ鎖を発
現するベクターを作製した。これら二つの発現ベクター
をＣＨＯ細胞に同時に遺伝子導入することにより、再構
成ヒトＰＭ−１（ｈＰＭ−１）抗体を産生する細胞株を
樹立した。得られたｈＰＭ−１のヒトＩＬ−６受容体へ
の結合能はＥＬＩＳＡにて確認した。さらに、ｈＰＭ−
１はマウス抗体およびキメラ抗体と同様に、ヒトＩＬ−
６のヒトＩＬ−６受容体への結合を阻害した。
【００９２】実施例１．ヒト骨髄腫細胞の増殖に関する
抗ヒトＩＬ−６受容体抗体と化学療法剤の併用効果 骨髄腫の治療に用いられている化学療法剤であるアドリ
アマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ，ＡＤＲ，協和発酵
製）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ，ＶＣ
Ｒ，Sigma Chemical Co.製) 、メルファラン（ｍｅｌｐ
ｈａｌａｎ，Ｌ−ＰＡＭ，Sigma Chemical Co.製) に対
するＫＰＭＭ２細胞の感受性に関する抗ヒトＩＬ−６受
容体抗体の影響を調べた。
抗ヒトＩＬ−６受容体抗体と化学療法剤の併用効果 骨髄腫の治療に用いられている化学療法剤であるアドリ
アマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ，ＡＤＲ，協和発酵
製）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ，ＶＣ
Ｒ，Sigma Chemical Co.製) 、メルファラン（ｍｅｌｐ
ｈａｌａｎ，Ｌ−ＰＡＭ，Sigma Chemical Co.製) に対
するＫＰＭＭ２細胞の感受性に関する抗ヒトＩＬ−６受
容体抗体の影響を調べた。
【００９３】ＫＰＭＭ２は、ヒト骨髄腫患者腹水に由来
する多発性骨髄腫細胞株である（特開平７−２３６４７
５参照）。本骨髄腫患者は、ＭＣＮＵ（ｒａｎｉｍｕｓ
ｔｉｎｅ）およびＭＰ（ｍｅｌｐｈａｌａｎ，ｐｒｅｄ
ｎｉｓｏｌｏｎｅ）療法により寛解を維持していたが再
発し、ＶＡＤ（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ，ａｄｒｉａｍ
ｙｃｉｎ，ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）療法を施行し
たが無効であった症例である。ＫＰＭＭ２細胞の増殖
は、ＩＬ−６により促進されるとともに、抗ＩＬ−６抗
体あるいは抗ＩＬ−６受容体抗体により著名に阻害され
る（臨床血液（１９９４）３５，１３６１−１３６
５）。なお、細胞の増殖活性は、 3Ｈ標識チミジン（Am
ersham製）の細胞内取り込み量により評価した。
する多発性骨髄腫細胞株である（特開平７−２３６４７
５参照）。本骨髄腫患者は、ＭＣＮＵ（ｒａｎｉｍｕｓ
ｔｉｎｅ）およびＭＰ（ｍｅｌｐｈａｌａｎ，ｐｒｅｄ
ｎｉｓｏｌｏｎｅ）療法により寛解を維持していたが再
発し、ＶＡＤ（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ，ａｄｒｉａｍ
ｙｃｉｎ，ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）療法を施行し
たが無効であった症例である。ＫＰＭＭ２細胞の増殖
は、ＩＬ−６により促進されるとともに、抗ＩＬ−６抗
体あるいは抗ＩＬ−６受容体抗体により著名に阻害され
る（臨床血液（１９９４）３５，１３６１−１３６
５）。なお、細胞の増殖活性は、 3Ｈ標識チミジン（Am
ersham製）の細胞内取り込み量により評価した。
【００９４】継代していたＫＰＭＭ２細胞を新鮮培地
（２０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０）にてよく洗浄後
４×１０5 ／mlとし、これを９６ウェル平底面マイクロ
タイタープレート（Falcon製) に５０μｌずつ分注し
た。さらに、組換型ヒトＩＬ−６（Asagoe, Y.ら、 Bio
／Technology (1988) 6, 806-809) 、抗ヒトＩＬ−６受
容体抗体ｈＰＭ−１（前記参考例および国際特許出願公
開番号ＷＯ９２−１５７５９参照）および上記化学療法
剤を含む培地あるいはコントロールとして新鮮培地を添
加し、各ウェル２００μｌとした。
（２０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０）にてよく洗浄後
４×１０5 ／mlとし、これを９６ウェル平底面マイクロ
タイタープレート（Falcon製) に５０μｌずつ分注し
た。さらに、組換型ヒトＩＬ−６（Asagoe, Y.ら、 Bio
／Technology (1988) 6, 806-809) 、抗ヒトＩＬ−６受
容体抗体ｈＰＭ−１（前記参考例および国際特許出願公
開番号ＷＯ９２−１５７５９参照）および上記化学療法
剤を含む培地あるいはコントロールとして新鮮培地を添
加し、各ウェル２００μｌとした。
【００９５】このプレートを３７℃、５％ＣＯ2 存在加
湿下において４日間培養した。培養終了４時間前に 3Ｈ
標識チミジン溶液（１００μＣｉ／ml）を各ウェル１０
μｌずつ添加して、引き続き４時間培養した。培養終了
後、ハーベスター（Ｍｉｃｒｏ ９６ Ｈａｒｖｅｓｔ
ｅｒ，SKATRON instruments 製）により細胞をグラスフ
ィルター（Ｐｒｉｎｔｅｄ Ｆｉｌｔｅｒｍａｔ Ａ，
WALLAC 製）上に回収し、これをマイクロベータ（１４
５０ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ，WALLAC製) にて測定した。
湿下において４日間培養した。培養終了４時間前に 3Ｈ
標識チミジン溶液（１００μＣｉ／ml）を各ウェル１０
μｌずつ添加して、引き続き４時間培養した。培養終了
後、ハーベスター（Ｍｉｃｒｏ ９６ Ｈａｒｖｅｓｔ
ｅｒ，SKATRON instruments 製）により細胞をグラスフ
ィルター（Ｐｒｉｎｔｅｄ Ｆｉｌｔｅｒｍａｔ Ａ，
WALLAC 製）上に回収し、これをマイクロベータ（１４
５０ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ，WALLAC製) にて測定した。
【００９６】ＫＰＭＭ２の増殖に対する抑制作用は、化
学療法剤単独での効果をコントロールとして表記した。
すなわち、各濃度の化学療法剤を添加した実験群での細
胞内3Ｈ標識チミジン取り込み量を１００とし、抗ヒト
ＩＬ−６受容体抗体を同時に添加した実験群での細胞内
3Ｈ標識チミジン取り込み量を指数で比較した。
学療法剤単独での効果をコントロールとして表記した。
すなわち、各濃度の化学療法剤を添加した実験群での細
胞内3Ｈ標識チミジン取り込み量を１００とし、抗ヒト
ＩＬ−６受容体抗体を同時に添加した実験群での細胞内
3Ｈ標識チミジン取り込み量を指数で比較した。
【００９７】その結果、同じ濃度の抗ヒトＩＬ−６受容
体抗体存在下で、化学療法剤の濃度との関係を比較する
と、アドリアマイシンとビンクリスチンはその濃度によ
らずほぼ一定であった（図３〜図６）のに対し、メルフ
ァランは濃度を高くするに伴って増殖指数が低下した
（図１及び図２）。ＩＬ−６が１ng／ml存在する条件で
は、１０μｇ／mlの抗ＩＬ−６受容体抗体単独での増殖
指数は３３．９であったが、１μｇ／mlのメルファラン
が共存すると１５．５にまで低下した。ＩＬ−６が０．
１ng／mlの条件においても同様であり、抗体単独での指
数が２８．４、１μｇ／mlのメルファラン共存下が１
５．９であった。したがって、抗ＩＬ−６受容体抗体と
メルファランとの併用は相乗的効果が認められた。
体抗体存在下で、化学療法剤の濃度との関係を比較する
と、アドリアマイシンとビンクリスチンはその濃度によ
らずほぼ一定であった（図３〜図６）のに対し、メルフ
ァランは濃度を高くするに伴って増殖指数が低下した
（図１及び図２）。ＩＬ−６が１ng／ml存在する条件で
は、１０μｇ／mlの抗ＩＬ−６受容体抗体単独での増殖
指数は３３．９であったが、１μｇ／mlのメルファラン
が共存すると１５．５にまで低下した。ＩＬ−６が０．
１ng／mlの条件においても同様であり、抗体単独での指
数が２８．４、１μｇ／mlのメルファラン共存下が１
５．９であった。したがって、抗ＩＬ−６受容体抗体と
メルファランとの併用は相乗的効果が認められた。
【００９８】実施例２．ヒト骨髄腫細胞のＳＣＩＤマウ
ス移植系における抗ヒトＩＬ−６受容体抗体と化学療法
剤の併用効果 実施例１により、抗ヒトＩＬ−６受容体抗体は化学療法
剤の抗腫瘍効果を増強することが示された。その中で
も、相乗的に作用することが明らかになったメルファラ
ン（Sigma Chemical Co.製) を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏ
での併用効果を調べた。
ス移植系における抗ヒトＩＬ−６受容体抗体と化学療法
剤の併用効果 実施例１により、抗ヒトＩＬ−６受容体抗体は化学療法
剤の抗腫瘍効果を増強することが示された。その中で
も、相乗的に作用することが明らかになったメルファラ
ン（Sigma Chemical Co.製) を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏ
での併用効果を調べた。
【００９９】抗腫瘍活性の評価には、Ｘｅｎｏｇｒａｆ
ｔモデル動物を用いた。すなわち、多発性骨髄腫患者の
腹水に由来するヒト骨髄腫細胞株ＫＰＭＭ２を、雄ＳＣ
ＩＤマウス（ＦＯＸ ＣＨＡＳＥ Ｃ．Ｂ１７／Ｉｃｒ
−Ｓｃｉｄ Ｊｃｌ、日本クレアから購入）に尾静脈か
ら移植した。このとき腫瘍細胞は、骨髄にて増殖し、末
梢血中にｍｙｅｌｏｍａタンパク（Ｍタンパク）を産生
するようになる。さらに、本モデル系は骨障害・血中カ
ルシウムの上昇など、ヒトの多発性骨髄腫の主要な症状
を示すことから、きわめて臨床に近いモデルである。
ｔモデル動物を用いた。すなわち、多発性骨髄腫患者の
腹水に由来するヒト骨髄腫細胞株ＫＰＭＭ２を、雄ＳＣ
ＩＤマウス（ＦＯＸ ＣＨＡＳＥ Ｃ．Ｂ１７／Ｉｃｒ
−Ｓｃｉｄ Ｊｃｌ、日本クレアから購入）に尾静脈か
ら移植した。このとき腫瘍細胞は、骨髄にて増殖し、末
梢血中にｍｙｅｌｏｍａタンパク（Ｍタンパク）を産生
するようになる。さらに、本モデル系は骨障害・血中カ
ルシウムの上昇など、ヒトの多発性骨髄腫の主要な症状
を示すことから、きわめて臨床に近いモデルである。
【０１００】移植する骨髄腫細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ継
代していたＫＰＭＭ２細胞を細切後、メッシュに通して
単細胞懸濁液としたものを用いた。細胞密度は３×１０
7 ／mlに調製し、マウス１匹あたり０．２mlずつ尾静脈
より移植した（マウス１匹あたり６×１０6 個）。な
お、この細胞移植日をｄａｙ０とした。抗ヒトＩＬ−６
受容体抗体ｈＰＭ−１は、１２．１mg／mlにて保存して
いた原液を滅菌リン酸緩衝液にて希釈し、５mg／mlとし
た。これをマウス１匹あたり０．２mlずつ尾静脈よりｄ
ａｙ８に投与した（マウス１匹あたり１mg）。対照群に
は、抗体を含まない滅菌リン酸緩衝液を同様に投与し
た。
代していたＫＰＭＭ２細胞を細切後、メッシュに通して
単細胞懸濁液としたものを用いた。細胞密度は３×１０
7 ／mlに調製し、マウス１匹あたり０．２mlずつ尾静脈
より移植した（マウス１匹あたり６×１０6 個）。な
お、この細胞移植日をｄａｙ０とした。抗ヒトＩＬ−６
受容体抗体ｈＰＭ−１は、１２．１mg／mlにて保存して
いた原液を滅菌リン酸緩衝液にて希釈し、５mg／mlとし
た。これをマウス１匹あたり０．２mlずつ尾静脈よりｄ
ａｙ８に投与した（マウス１匹あたり１mg）。対照群に
は、抗体を含まない滅菌リン酸緩衝液を同様に投与し
た。
【０１０１】メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ，Ｌ−
ＰＡＭ，Sigma Chemical Co.製) は、０．２％ＣＭＣ
（カルボキシメチルセルロース）水溶液に懸濁して０．
３あるいは０．１mg／mlとして用いた。これをマウス体
重１０ｇあたり０．１ml（３あるいは１mg／kg weight
）ずつｄａｙ１から５日間連日経口投与した。対照群
には、メルファランを含まない０．２％ＣＭＣ水溶液を
同様に投与した。
ＰＡＭ，Sigma Chemical Co.製) は、０．２％ＣＭＣ
（カルボキシメチルセルロース）水溶液に懸濁して０．
３あるいは０．１mg／mlとして用いた。これをマウス体
重１０ｇあたり０．１ml（３あるいは１mg／kg weight
）ずつｄａｙ１から５日間連日経口投与した。対照群
には、メルファランを含まない０．２％ＣＭＣ水溶液を
同様に投与した。
【０１０２】実験は、以下の６群にておこなった。
（１）メルファランおよび抗体非投与群、（２）メルフ
ァラン１mg／kg単独投与群、（３）メルファラン３mg／
kg単独投与群、（４）抗体単独投与群、（５）メルファ
ラン１mg／kgおよび抗体併用群、（６）メルファラン３
mg／kgおよび抗体併用群。第１群は、一群９匹とし、そ
れ以外の群は７匹とした。また、同一系統、同一購入日
のマウスを腫瘍移植せずに飼育し、Ｍタンパク検出にお
ける陰性コントロールとしている。
（１）メルファランおよび抗体非投与群、（２）メルフ
ァラン１mg／kg単独投与群、（３）メルファラン３mg／
kg単独投与群、（４）抗体単独投与群、（５）メルファ
ラン１mg／kgおよび抗体併用群、（６）メルファラン３
mg／kgおよび抗体併用群。第１群は、一群９匹とし、そ
れ以外の群は７匹とした。また、同一系統、同一購入日
のマウスを腫瘍移植せずに飼育し、Ｍタンパク検出にお
ける陰性コントロールとしている。
【０１０３】薬効の指標として、生存期間およびｄａｙ
１２０での無病生存率、ｄａｙ３０での血清Ｍタンパク
量を用いた。生存曲線を用いた検定には一般化Ｗｉｌｃ
ｏｘｓｏｎ法（ＳＰＳＳ ｆｏｒ ｗｉｎｄｏｗｓ ｖ
ｅｒ．６，SPSS inc. ）を用いた。危険率５％以下をも
って有意と判断した。血清ＭタンパクはヒトＩｇＧとし
てＥＬＩＳＡ法にて検出した。まず、マウス血清をあら
かじめ抗ヒトＩｇＧ抗血清をコートした９６穴マイクロ
プレートに分注し、放置した。次にアルカリフォスファ
ターゼ結合抗ヒトＩｇＧ抗体を結合させ、ＳＩＧＭＡ１
０４フォスファターゼ基質を添加して発色させた、マイ
クロプレートリーダーにて吸光度を測定した。なお、標
準ヒトＩｇＧから得られた検量線から血清Ｍタンパク量
を算定した。
１２０での無病生存率、ｄａｙ３０での血清Ｍタンパク
量を用いた。生存曲線を用いた検定には一般化Ｗｉｌｃ
ｏｘｓｏｎ法（ＳＰＳＳ ｆｏｒ ｗｉｎｄｏｗｓ ｖ
ｅｒ．６，SPSS inc. ）を用いた。危険率５％以下をも
って有意と判断した。血清ＭタンパクはヒトＩｇＧとし
てＥＬＩＳＡ法にて検出した。まず、マウス血清をあら
かじめ抗ヒトＩｇＧ抗血清をコートした９６穴マイクロ
プレートに分注し、放置した。次にアルカリフォスファ
ターゼ結合抗ヒトＩｇＧ抗体を結合させ、ＳＩＧＭＡ１
０４フォスファターゼ基質を添加して発色させた、マイ
クロプレートリーダーにて吸光度を測定した。なお、標
準ヒトＩｇＧから得られた検量線から血清Ｍタンパク量
を算定した。
【０１０４】抗ＩＬ−６受容体抗体単独投与群あるいは
メルファラン１mg／kg投与群においては、非投与群に対
し延命効果は認められなかったが、両者を併用すること
により、非投与群、両単独投与群に対し有意に延命した
（図７）。さらに、血清中Ｍタンパク量を移植後３０日
目に測定した結果においても、両者を併用することによ
りＭタンパク量が低下していた（図８）。メルファラン
３mg／kgの場合、メルファラン単独投与で非投与群に対
し有意に延命効果を示すが、抗体を併用することによ
り、単独投与に対しても有意に延命することができた
（図９）。また、ｄａｙ １２０における無病生存率
は、３mg／kgのメルファラン単独投与群では２／７であ
ったが、抗体併用群は４／７に改善された（表１）。メ
ルファランを投与することによりマウスに対し毒性を示
し、体重の増加が抑制された（図１０）。メルファラン
と抗１Ｌ−６受容体抗体を併用した場合、抗腫瘍効果は
増強したが、毒性（体重抑制）を拡大することはなかっ
た。
メルファラン１mg／kg投与群においては、非投与群に対
し延命効果は認められなかったが、両者を併用すること
により、非投与群、両単独投与群に対し有意に延命した
（図７）。さらに、血清中Ｍタンパク量を移植後３０日
目に測定した結果においても、両者を併用することによ
りＭタンパク量が低下していた（図８）。メルファラン
３mg／kgの場合、メルファラン単独投与で非投与群に対
し有意に延命効果を示すが、抗体を併用することによ
り、単独投与に対しても有意に延命することができた
（図９）。また、ｄａｙ １２０における無病生存率
は、３mg／kgのメルファラン単独投与群では２／７であ
ったが、抗体併用群は４／７に改善された（表１）。メ
ルファランを投与することによりマウスに対し毒性を示
し、体重の増加が抑制された（図１０）。メルファラン
と抗１Ｌ−６受容体抗体を併用した場合、抗腫瘍効果は
増強したが、毒性（体重抑制）を拡大することはなかっ
た。
【０１０５】
【表１】
【０１０６】抗ＩＬ−６受容体抗体とメルファランを併
用することにより、ＭＰおよびＶＡＤ療法に対し耐性と
なった患者由来細胞株であるＫＰＭＭ２に対し、有意に
延命効果を増強することが示された。
用することにより、ＭＰおよびＶＡＤ療法に対し耐性と
なった患者由来細胞株であるＫＰＭＭ２に対し、有意に
延命効果を増強することが示された。
【０１０７】実施例３．ヒト骨髄腫細胞のＳＣＩＤマウ
ス移植系における抗ヒトＩＬ−６受容体抗体と化学療法
剤の併用効果−抗体のｉｎ ｖｉｖｏ用量依存性に関す
る検討 実施例２により、抗ヒトＩＬ−６受容体抗体はメルファ
ランの抗腫瘍効果を増強することが示された。そこで抗
ヒトＩＬ−６受容体抗体とメルファランの併用投与にお
ける、抗ヒトＩＬ−６受容体抗体の用量依存性を調べ
た。
ス移植系における抗ヒトＩＬ−６受容体抗体と化学療法
剤の併用効果−抗体のｉｎ ｖｉｖｏ用量依存性に関す
る検討 実施例２により、抗ヒトＩＬ−６受容体抗体はメルファ
ランの抗腫瘍効果を増強することが示された。そこで抗
ヒトＩＬ−６受容体抗体とメルファランの併用投与にお
ける、抗ヒトＩＬ−６受容体抗体の用量依存性を調べ
た。
【０１０８】抗腫瘍活性の評価には、実施例２と同じく
ＫＰＭＭ２細胞を尾静脈より移植することで作成したＸ
ｅｎｏｇｒａｆｔモデル動物を用いた。すなわち、ｉｎ
ｖｉｖｏにて継代していたＫＰＭＭ２細胞を細切後、
メッシュに通して単細胞懸濁液としたものを細胞密度３
×１０7 ／ｍｌに調製し、マウス１匹あたり０．２ｍｌ
ずつ尾静脈より移植した（マウス１匹あたり６×１０6
個）。なお、この細胞移植日をｄａｙ０とした。抗ヒト
ＩＬ−６受容体抗体ｈＰＭ−１は、６．５７ｍｇ／ｍｌ
の濃度でリン酸ナトリウム緩衝液中に保存していた原液
を用いて、５，１，０．２，０．０４ｍｇ／ｍｌの各溶
液を作成した。これらをｄａｙ１４にマウス体重１０ｇ
あたり０．１ｍｌずつ尾静脈より投与することにより５
０，１０，２，０．４ｍｇ／ｋｇｗｅｉｇｈｔ投与群を
作成した。対照群には、抗体を含まない同溶液を同様に
投与した。
ＫＰＭＭ２細胞を尾静脈より移植することで作成したＸ
ｅｎｏｇｒａｆｔモデル動物を用いた。すなわち、ｉｎ
ｖｉｖｏにて継代していたＫＰＭＭ２細胞を細切後、
メッシュに通して単細胞懸濁液としたものを細胞密度３
×１０7 ／ｍｌに調製し、マウス１匹あたり０．２ｍｌ
ずつ尾静脈より移植した（マウス１匹あたり６×１０6
個）。なお、この細胞移植日をｄａｙ０とした。抗ヒト
ＩＬ−６受容体抗体ｈＰＭ−１は、６．５７ｍｇ／ｍｌ
の濃度でリン酸ナトリウム緩衝液中に保存していた原液
を用いて、５，１，０．２，０．０４ｍｇ／ｍｌの各溶
液を作成した。これらをｄａｙ１４にマウス体重１０ｇ
あたり０．１ｍｌずつ尾静脈より投与することにより５
０，１０，２，０．４ｍｇ／ｋｇｗｅｉｇｈｔ投与群を
作成した。対照群には、抗体を含まない同溶液を同様に
投与した。
【０１０９】メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ，Ｌ−
ＰＡＭ，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．製）
は、０．２％ＣＭＣ水溶液に懸濁して０．１ｍｇ／ｍｌ
として用いた。これをｄａｙ７から５日間連日マウス体
重１０ｇあたり０．１ｍｌずつ経口投与し、１ｍｇ／ｋ
ｇ ｗｅｉｇｈｔとした。対照群には、メルファランを
含まない０．２％ＣＭＣ水溶液を同様に投与した。
ＰＡＭ，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．製）
は、０．２％ＣＭＣ水溶液に懸濁して０．１ｍｇ／ｍｌ
として用いた。これをｄａｙ７から５日間連日マウス体
重１０ｇあたり０．１ｍｌずつ経口投与し、１ｍｇ／ｋ
ｇ ｗｅｉｇｈｔとした。対照群には、メルファランを
含まない０．２％ＣＭＣ水溶液を同様に投与した。
【０１１０】実験は、以下の１０群にておこなった。
（Ａ）メルファラン非投与および抗体非投与群、（Ｂ）
メルファラン単独投与群、（Ｃ）抗体各用量単独投与４
群（５０，１０，２，０．４ｍｇ／ｋｇ ｗｅｉｇｈ
ｔ）、（Ｄ）メルファランおよび抗体各用量併用４群
（５０，１０，２，０．４ｍｇ／ｋｇ ｗｅｉｇｈ
ｔ）。非投与群は、一群１２匹、メルファラン単独投与
群は、一群６匹、それ以外の群は７匹とした。また、同
一系統、同一購入日のマウスを腫瘍移植せずに飼育し、
Ｍタンパク検出における陰性コントロールとした。Ｍタ
ンパク量の算定は、実施例２に記載の方法でおこなっ
た。
（Ａ）メルファラン非投与および抗体非投与群、（Ｂ）
メルファラン単独投与群、（Ｃ）抗体各用量単独投与４
群（５０，１０，２，０．４ｍｇ／ｋｇ ｗｅｉｇｈ
ｔ）、（Ｄ）メルファランおよび抗体各用量併用４群
（５０，１０，２，０．４ｍｇ／ｋｇ ｗｅｉｇｈ
ｔ）。非投与群は、一群１２匹、メルファラン単独投与
群は、一群６匹、それ以外の群は７匹とした。また、同
一系統、同一購入日のマウスを腫瘍移植せずに飼育し、
Ｍタンパク検出における陰性コントロールとした。Ｍタ
ンパク量の算定は、実施例２に記載の方法でおこなっ
た。
【０１１１】薬効の指標として、生存期間、ｄａｙ３
０，ｄａｙ３５，ｄａｙ４２での血清Ｍタンパク量を用
いた。生存期間の検定には生存曲線を用いた一般化Ｗｉ
ｌｃｏｘｓｏｎ法（ＳＰＳＳ ｆｏｒ ｗｉｎｄｏｗｓ
ｖｅｒ．６，ＳＰＳＳ ｉｎｃ．）を用い、危険率５
％以下をもって有意と判断した。血清Ｍタンパク量の検
定には、最初に、ＡＮＯＶＡ法（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏ
ｆ ｖａｒｉａｎｃｅ，ＳＰＳＳ ｆｏｒ ｗｉｎｄｏ
ｗｓ ｖｅｒ．６，ＳＰＳＳ ｉｎｃ．）をおこない、
有意性を確認した後Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法（ＳＰＳＳ
ｆｏｒ ｗｉｎｄｏｗｓ ｖｅｒ．６，ＳＰＳＳ ｉ
ｎｃ．）を用い、危険率５％以下をもって有意と判断し
た。
０，ｄａｙ３５，ｄａｙ４２での血清Ｍタンパク量を用
いた。生存期間の検定には生存曲線を用いた一般化Ｗｉ
ｌｃｏｘｓｏｎ法（ＳＰＳＳ ｆｏｒ ｗｉｎｄｏｗｓ
ｖｅｒ．６，ＳＰＳＳ ｉｎｃ．）を用い、危険率５
％以下をもって有意と判断した。血清Ｍタンパク量の検
定には、最初に、ＡＮＯＶＡ法（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏ
ｆ ｖａｒｉａｎｃｅ，ＳＰＳＳ ｆｏｒ ｗｉｎｄｏ
ｗｓ ｖｅｒ．６，ＳＰＳＳ ｉｎｃ．）をおこない、
有意性を確認した後Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法（ＳＰＳＳ
ｆｏｒ ｗｉｎｄｏｗｓ ｖｅｒ．６，ＳＰＳＳ ｉ
ｎｃ．）を用い、危険率５％以下をもって有意と判断し
た。
【０１１２】非投与群および抗体各用量単独投与群で
は、ｄａｙ３５の時点で死亡例が出現したため、ｄａｙ
３０の血清Ｍタンパク量で比較した。一方、メルファラ
ン単独投与群、メルファランおよび抗体併用群はｄａｙ
３０での血清Ｍタンパク量が非常に低く、投与した抗ヒ
トＩＬ−６受容体抗体がＭタンパクとして検出され、ア
ッセイに影響することから、ｄａｙ３５とｄａｙ４２の
データについて比較した。
は、ｄａｙ３５の時点で死亡例が出現したため、ｄａｙ
３０の血清Ｍタンパク量で比較した。一方、メルファラ
ン単独投与群、メルファランおよび抗体併用群はｄａｙ
３０での血清Ｍタンパク量が非常に低く、投与した抗ヒ
トＩＬ−６受容体抗体がＭタンパクとして検出され、ア
ッセイに影響することから、ｄａｙ３５とｄａｙ４２の
データについて比較した。
【０１１３】まず、ｄａｙ３０において、抗体単独投与
群は、いずれの投与量においてもＭタンパク量を有意に
抑制することはできなかったが、メルファランは単独投
与で有意にこれを抑制した（図１１）。次に、ｄａｙ３
５，ｄａｙ４２において、メルファラン単独投与に対す
る抗体投与による併用効果を検討した。その結果、１０
ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇの抗ＩＬ
−６受容体抗体を併用することにより、有意なＭタンパ
ク量の減少が認められた（図１２，１３）。
群は、いずれの投与量においてもＭタンパク量を有意に
抑制することはできなかったが、メルファランは単独投
与で有意にこれを抑制した（図１１）。次に、ｄａｙ３
５，ｄａｙ４２において、メルファラン単独投与に対す
る抗体投与による併用効果を検討した。その結果、１０
ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇの抗ＩＬ
−６受容体抗体を併用することにより、有意なＭタンパ
ク量の減少が認められた（図１２，１３）。
【０１１４】生存期間については、抗体単独投与群はい
ずれの投与量においても有意な延命効果を認めなかっ
た。また、メルファランは単独で有意な延命効果を示し
たが、抗体と併用することによりさらにその効果は増強
された（表２）。いずれの投与量においても延命効果の
増加傾向を示していた。また、一般化Ｗｉｌｃｏｘｓｏ
ｎ法によりメルファラン単独投与群に対し、有意性が認
められたのは、０．４ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇ
投与群であった（図１４）。
ずれの投与量においても有意な延命効果を認めなかっ
た。また、メルファランは単独で有意な延命効果を示し
たが、抗体と併用することによりさらにその効果は増強
された（表２）。いずれの投与量においても延命効果の
増加傾向を示していた。また、一般化Ｗｉｌｃｏｘｓｏ
ｎ法によりメルファラン単独投与群に対し、有意性が認
められたのは、０．４ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇ
投与群であった（図１４）。
【０１１５】
【表２】
【０１１６】以上より、抗ＩＬ−６受容体抗体をメルフ
ァランと併用した場合、０．４ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／
ｋｇのいずれの用量においても、抗腫瘍効果を示した。
メルファランを投与することにより、マウスに対し毒性
を示し体重の増加が抑制された。メルファランと抗ヒト
ＩＬ−６受容体抗体を用いた場合、抗腫瘍効果は増強し
たが、毒性（体重抑制）を拡大することはなかった。し
たがって、骨髄腫治療においてメルファラン投与時の効
果増強ならびに投与量の低減、メルファラン耐性の克服
などに有用である可能性が示唆された。
ァランと併用した場合、０．４ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／
ｋｇのいずれの用量においても、抗腫瘍効果を示した。
メルファランを投与することにより、マウスに対し毒性
を示し体重の増加が抑制された。メルファランと抗ヒト
ＩＬ−６受容体抗体を用いた場合、抗腫瘍効果は増強し
たが、毒性（体重抑制）を拡大することはなかった。し
たがって、骨髄腫治療においてメルファラン投与時の効
果増強ならびに投与量の低減、メルファラン耐性の克服
などに有用である可能性が示唆された。
【図１】図１は、０．１ng／mlのＩＬ−６の存在下で
の、抗ヒトＩＬ−６受容体抗体の濃度及びメルファラン
の濃度と、ヒト骨髄腫細胞株の増殖（ 3Ｈ標識チミジン
の取込み）との関係を示すグラフである。
の、抗ヒトＩＬ−６受容体抗体の濃度及びメルファラン
の濃度と、ヒト骨髄腫細胞株の増殖（ 3Ｈ標識チミジン
の取込み）との関係を示すグラフである。
【図２】図２は、１ng／mlのＩＬ−６の存在下での、抗
ヒトＩＬ−６受容体抗体の濃度及びメルファランの濃度
と、ヒト骨髄腫細胞株の増殖（ 3Ｈ標識チミジンの取込
み）との関係を示すグラフである。
ヒトＩＬ−６受容体抗体の濃度及びメルファランの濃度
と、ヒト骨髄腫細胞株の増殖（ 3Ｈ標識チミジンの取込
み）との関係を示すグラフである。
【図３】図３は、０．１ng／mlのＩＬ−６の存在下で
の、抗ヒトＩＬ−６受容体抗体の濃度及びアドリアマイ
シンの濃度と、ヒト骨髄腫細胞株の増殖（ 3Ｈ標識チミ
ジンの取込み）との関係を示すグラフである。
の、抗ヒトＩＬ−６受容体抗体の濃度及びアドリアマイ
シンの濃度と、ヒト骨髄腫細胞株の増殖（ 3Ｈ標識チミ
ジンの取込み）との関係を示すグラフである。
【図４】図４は、１ng／mlのＩＬ−６の存在下での、抗
ヒトＩＬ−６受容体抗体の濃度及びアドリアマイシンの
濃度と、ヒト骨髄腫細胞株の増殖（ 3Ｈ標識チミジンの
取込み）との関係を示すグラフである。
ヒトＩＬ−６受容体抗体の濃度及びアドリアマイシンの
濃度と、ヒト骨髄腫細胞株の増殖（ 3Ｈ標識チミジンの
取込み）との関係を示すグラフである。
【図５】図５は、０．１ng／mlのＩＬ−６の存在下で
の、抗ヒトＩＬ−６受容体抗体の濃度及びビンクリスチ
ンの濃度と、ヒト骨髄腫細胞株の増殖（ 3Ｈ標識チミジ
ンの取込み）との関係を示すグラフである。
の、抗ヒトＩＬ−６受容体抗体の濃度及びビンクリスチ
ンの濃度と、ヒト骨髄腫細胞株の増殖（ 3Ｈ標識チミジ
ンの取込み）との関係を示すグラフである。
【図６】図６は、１ng／mlのＩＬ−６の存在下での、抗
ヒトＩＬ−６受容体抗体の濃度及びビンクリスチンの濃
度と、ヒト骨髄腫細胞株の増殖（ 3Ｈ標識チミジンの取
込み）との関係を示すグラフである。
ヒトＩＬ−６受容体抗体の濃度及びビンクリスチンの濃
度と、ヒト骨髄腫細胞株の増殖（ 3Ｈ標識チミジンの取
込み）との関係を示すグラフである。
【図７】図７は、ヒト骨髄腫細胞を移植したマウスにお
ける、抗ヒトＩＬ−６受容体抗体（ｈＰＭ−１）及びメ
ルファラン（１mg／kg）の単独投与又は併用の場合の生
存日数を示すグラフである。
ける、抗ヒトＩＬ−６受容体抗体（ｈＰＭ−１）及びメ
ルファラン（１mg／kg）の単独投与又は併用の場合の生
存日数を示すグラフである。
【図８】図８は、ヒト骨髄腫細胞を移植したマウスにお
ける、抗ヒトＩＬ−６受容体抗体（ｈＰＭ−１）及びメ
ルファラン（１mg／kg）の単独投与又は併用の場合のＭ
タンパク量を示すグラフである。
ける、抗ヒトＩＬ−６受容体抗体（ｈＰＭ−１）及びメ
ルファラン（１mg／kg）の単独投与又は併用の場合のＭ
タンパク量を示すグラフである。
【図９】図９は、ヒト骨髄腫細胞が移植したマウスにお
ける、抗ヒトＩＬ−６受容体抗体（ｈＰＭ−１）及びメ
ルファラン（３mg／kg）の単独投与又は併用の場合の動
物の生存期間を示すグラフであり、併用による相乗効果
を示している。
ける、抗ヒトＩＬ−６受容体抗体（ｈＰＭ−１）及びメ
ルファラン（３mg／kg）の単独投与又は併用の場合の動
物の生存期間を示すグラフであり、併用による相乗効果
を示している。
【図１０】図１０は、ヒト骨髄腫細胞を移植したマウス
における、抗ヒトＩＬ−６受容体抗体（ｈＰＭ−１）及
びメルファランの単独投与及び併用の場合の動物の体重
の経過を示すグラフである。
における、抗ヒトＩＬ−６受容体抗体（ｈＰＭ−１）及
びメルファランの単独投与及び併用の場合の動物の体重
の経過を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ヒト骨髄腫細胞を移植したマウス
における、抗ヒトＩＬ−６受容体抗体（ｈＰＭ１）単独
およびメルファラン単独投与群における、腫瘍移植後３
０日目での血清Ｍタンパク量を示すグラフである。
における、抗ヒトＩＬ−６受容体抗体（ｈＰＭ１）単独
およびメルファラン単独投与群における、腫瘍移植後３
０日目での血清Ｍタンパク量を示すグラフである。
【図１２】図１２は、ヒト骨髄腫細胞を移植したマウス
における、メルファラン単独および抗ヒトＩＬ−６受容
体抗体（ｈＰＭ１）併用投与群における、腫瘍移植後３
５日目での血清Ｍタンパク量を示すグラフである。
における、メルファラン単独および抗ヒトＩＬ−６受容
体抗体（ｈＰＭ１）併用投与群における、腫瘍移植後３
５日目での血清Ｍタンパク量を示すグラフである。
【図１３】図１３は、ヒト骨髄腫細胞を移植したマウス
における、メルファラン単独および抗ヒトＩＬ−６受容
体抗体（ｈＰＭ１）併用投与群における、腫瘍移植後４
２日目での血清Ｍタンパク量を示すグラフである。
における、メルファラン単独および抗ヒトＩＬ−６受容
体抗体（ｈＰＭ１）併用投与群における、腫瘍移植後４
２日目での血清Ｍタンパク量を示すグラフである。
【図１４】図１４は、ヒト骨髄腫細胞を移植したマウス
における、メルファラン単独および抗ヒトＩＬ−６受容
体抗体（ｈＰＭ１）併用投与群における、生存期間を生
存曲線により示すグラフであり、併用による効果増強を
示している。
における、メルファラン単独および抗ヒトＩＬ−６受容
体抗体（ｈＰＭ１）併用投与群における、生存期間を生
存曲線により示すグラフであり、併用による効果増強を
示している。
【図１５】図１５は、ヒト骨髄腫細胞を移植したマウス
における、抗ヒトＩＬ−６受容体抗体（ｈＰＭ１）単独
投与群における、動物の体重の経過を示すグラフであ
る。
における、抗ヒトＩＬ−６受容体抗体（ｈＰＭ１）単独
投与群における、動物の体重の経過を示すグラフであ
る。
【図１６】図１６は、ヒト骨髄腫細胞を移植したマウス
における、メルファラン単独および抗ヒトＩＬ−６受容
体抗体（ｈＰＭ１）併用投与群における、動物の体重の
経過を示すグラフである。
における、メルファラン単独および抗ヒトＩＬ−６受容
体抗体（ｈＰＭ１）併用投与群における、動物の体重の
経過を示すグラフである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/505 Ａ６１Ｋ 31/505 31/675 31/675 Ｃ０７Ｃ 229/42 Ｃ０７Ｃ 229/42 Ｃ０７Ｄ 239/54 Ｃ０７Ｆ 9/6584 Ｃ０７Ｆ 9/6584 Ｃ０７Ｃ 291/04 Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ０７Ｋ 16/28 // Ｃ０７Ｃ 291/04 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ０７Ｄ 239/54 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ａ６１Ｋ 31/13 39:395） (Ａ６１Ｋ 31/19 39:395） (Ａ６１Ｋ 31/195 39:395） (Ａ６１Ｋ 31/505 39:395） (Ａ６１Ｋ 31/675 39:395）
Claims (18)
- 【請求項１】 ナイトロジェンマスタード系抗癌剤と組
合わせて使用するための、抗ＩＬ−６受容体抗体を含ん
で成る骨髄腫治療剤。 - 【請求項２】 抗ＩＬ−６受容体抗体がモノクローナル
抗体である請求項１に記載の骨髄腫治療剤。 - 【請求項３】 前記モノクローナル抗体がＰＭ−１抗体
である請求項２に記載の骨髄腫治療剤。 - 【請求項４】 前記ＰＭ−１抗体が再構成ヒトＰＭ−１
抗体である請求項３に記載の骨髄腫治療剤。 - 【請求項５】 前記ナイトロジェンマスタード系抗癌剤
がメクロレタミン、ナイトロジェンマスタードＮ−オキ
シド、メルファラン、ウラムスチン、イホスファミド、
クロラムブシル又はシクロホスファミドである、請求項
１〜４のいずれか１項に記載の骨髄腫治療剤。 - 【請求項６】 前記ナイトロジェンマスタード系抗癌剤
がメルファランであり、そして前記抗ＩＬ−６受容体抗
体が再構成ヒトＰＭ−１抗体である、請求項１〜５のい
ずれか１項に記載の骨髄腫治療剤。 - 【請求項７】 抗ＩＬ−６受容体抗体と組合わせて使用
するための、ナイトロジェンマスタード系抗癌剤を含ん
で成る骨髄腫治療剤。 - 【請求項８】 抗ＩＬ−６受容体抗体がモノクローナル
抗体である請求項７に記載の骨髄腫治療剤。 - 【請求項９】 前記モノクローナル抗体がＰＭ−１抗体
である請求項８に記載の骨髄腫治療剤。 - 【請求項１０】 前記ＰＭ−１抗体が再構成ヒトＰＭ−
１抗体である請求項９に記載の骨髄腫治療剤。 - 【請求項１１】 前記ナイトロジェンマスタード系抗癌
剤がメクロレタミン、ナイトロジェンマスタードＮ−オ
キシド、メルファラン、ウラムスチン、イホスファミ
ド、クロラムブシル又はシクロホスファミドである、請
求項７〜１０のいずれか１項に記載の骨髄腫治療剤。 - 【請求項１２】 前記ナイトロジェンマスタード系抗癌
剤がメルファランであり、そして前記抗ＩＬ−６受容体
抗体が再構成ヒトＰＭ−１抗体である、請求項７〜１１
のいずれか１項に記載の骨髄腫治療剤。 - 【請求項１３】 ナイトロジェンマスタード系抗癌剤と
抗ＩＬ−６受容体抗体とを含んで成る骨髄腫治療剤。 - 【請求項１４】 抗ＩＬ−６受容体抗体がモノクローナ
ル抗体である請求項１３に記載の骨髄腫治療剤。 - 【請求項１５】 前記モノクローナル抗体がＰＭ−１抗
体である請求項１４に記載の骨髄腫治療剤。 - 【請求項１６】 前記ＰＭ−１抗体が再構成ヒトＰＭ−
１抗体である請求項１５に記載の骨髄腫治療剤。 - 【請求項１７】 前記ナイトロジェンマスタード系抗癌
剤がメクロレタミン、ナイトロジェンマスタードＮ−オ
キシド、メルファラン、ウラムスチン、イホスファミ
ド、クロラムブシル又はシクロホスファミドである、請
求項１３〜１６のいずれか１項に記載の骨髄腫治療剤。 - 【請求項１８】 前記ナイトロジェンマスタード系抗癌
剤がメルファランであり、そして前記抗ＩＬ−６受容体
抗体が再構成ヒトＰＭ−１抗体である、請求項１３〜１
７のいずれか１項に記載の骨髄腫治療剤。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP17248397A JP3471195B2 (ja) | 1996-06-27 | 1997-06-27 | ナイトロジェンマスタード系抗癌剤と組合わせて使用するための骨髄腫治療剤 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16732596 | 1996-06-27 | ||
| JP8-167325 | 1996-06-27 | ||
| JP17248397A JP3471195B2 (ja) | 1996-06-27 | 1997-06-27 | ナイトロジェンマスタード系抗癌剤と組合わせて使用するための骨髄腫治療剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1087510A true JPH1087510A (ja) | 1998-04-07 |
| JP3471195B2 JP3471195B2 (ja) | 2003-11-25 |
Family
ID=15847661
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17248397A Expired - Fee Related JP3471195B2 (ja) | 1996-06-27 | 1997-06-27 | ナイトロジェンマスタード系抗癌剤と組合わせて使用するための骨髄腫治療剤 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6692742B1 (ja) |
| EP (1) | EP0923941B1 (ja) |
| JP (1) | JP3471195B2 (ja) |
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| AU (1) | AU3276297A (ja) |
| DE (1) | DE69735888T2 (ja) |
| DK (1) | DK0923941T3 (ja) |
| ES (1) | ES2263178T3 (ja) |
| PT (1) | PT923941E (ja) |
| WO (1) | WO1997049428A1 (ja) |
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