JPH1094400A - 臓器移植後の慢性拒絶反応の検査方法及び尿中の成分の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】臓器移植後の慢性拒絶反応の早期発見を可能と
する簡便な検査方法を提供すること。 【解決手段】ヒトの尿等の検体中のマトリックスメタロ
プロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）又はその前駆体を検出
することによって、腎移植等の臓器移植後の慢性拒絶反
応を検査する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、体液中のマトリッ
クスメタロプロテアーゼ−２（以下「ＭＭＰ−２」とい
う）又はその前駆体を検出することにより、臓器移植後
の慢性期に出現する拒絶反応（慢性拒絶反応）を検査す
る方法、及び、尿中のＭＭＰ−２又はその前駆体の測定
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】腎移植患者での慢性拒絶反応の診断にお
いては、一般に腎生検が行われている。しかし、定期的
な腎生検は患者に苦痛を与えると同時に腎機能低下をも
たらす可能性がある。さらに、慢性拒絶の進行は緩慢
で、自覚症状に乏しく、苦痛を伴う腎生検は多くの患者
に拒否される。

【０００３】一方において、慢性拒絶反応により腎機能
が低下するため、慢性拒絶反応の進行の指標として腎機
能検査が行われている。この検査においては、糸球体の
異常を反映する「蛋白質透過性亢進の指標」として、尿
蛋白、尿中アルブミン、尿中トランスフェリンなどが、
又、「糸球体濾過値（ＧＦＲ）低下の指標」として、血
中クレアチニン、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、血中β２−
ミクログロブリン、血中α１−ミクログロブリンなどが
測定されている。しかし、慢性拒絶反応の進行によるこ
れらの検査値の変化は緩慢であり、検査値の異常が確認
された時には慢性拒絶反応は末期症状を示している。今
まで、尿や血液中の内因性物質の濃度を測定することに
よって、慢性拒絶反応の早期発見を可能とする様な検査
方法は知られていない。現在、このように簡便な検査方
法がないために、自覚症状に乏しい慢性拒絶反応を呈し
た患者は適切な処置を施されることなく末期症状とな
り、腎機能を喪失する場合が多く見られる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、臓器移植後
の慢性拒絶反応の早期発見を可能とする簡便な検査方法
を提供することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】ＭＭＰ−２は基底膜を構
成するコラーゲンを分解する酵素で、組織の修復や再生
時に働く。また、癌においては、癌細胞の基底膜への浸
潤時にコラーゲンを分解する酵素として働くと考えられ
ている。本発明者らは鋭意検討した結果、ＭＭＰ−２又
はその前駆体は、健常人の尿、慢性拒絶反応を起こして
いない腎移植患者の尿等に漏れださないか、非常に微量
しか漏れ出さないが、慢性拒絶患者では、この尿等の体
液中のＭＭＰ−２又はその前駆体の量が著しく増大する
ことを見い出し、本発明に至った。

【０００６】即ち、本発明は、（１）体液中のＭＭＰ−
２又はその前駆体を検出することを特徴とする臓器移植
後の慢性拒絶反応の検査方法、（２）体液がヒトの尿又
は血液である上記（１）記載の検査方法、（３）尿検体
中のＭＭＰ−２又はその前駆体を検出することを特徴と
する上記（１）記載の検査方法、（４）臓器移植が腎移
植である上記（１）、（２）又は（３）記載の検査方
法、（５）尿検体中のＭＭＰ−２前駆体濃度として０．
１から１０．０ｎｇ／ｍｌの範囲の間に、腎移植慢性拒
絶反応の有無を判定するためのカットオフ値を設定する
上記（３）記載の検査方法、（６）カットオフ値を０．
５から５．０ｎｇ／ｍｌの範囲の間に設定する上記
（５）記載の検査方法、（７）尿検体中のＭＭＰ−２前
駆体濃度およびクレアチニン濃度を測定し、クレアチニ
ン濃度で補正することにより得られるインデックスが、
０．１から２０．０μｇ／ｇ・クレアチニンの範囲の間
に、腎移植慢性拒絶反応の有無を判定するためのカット
オフ値を設定する上記（３）記載の検査方法、（８）カ
ットオフ値を０．５から１０．０μｇ／ｇ・クレアチニ
ンの範囲の間に設定する上記（７）記載の検査方法、
（９）検出が免疫測定法による検出である上記（１）〜
（８）のいずれかに記載の検査方法、（１０）免疫測定
法が酵素免疫測定法である上記（９）記載の検査方法、
（１１）免疫測定法がサンドイッチ法である上記（９）
又は（１０）記載の検査方法、（１２）尿中のＭＭＰ−
２又はその前駆体を免疫測定法で測定する尿中ＭＭＰ−
２又はその前駆体の測定方法、に関する。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
体液（検体）としては、例えば尿や、血清、血漿等の血
液等のヒト等の体液が挙げられる。尿検体としては、Ｍ
ＭＰ−２又はその前駆体が安定に保てるように採尿、ま
たは、採尿後保存されたもので有れば何であってもよ
く、また、採尿の時期と方法も、ＭＭＰ−２又はその前
駆体の臨床的意義を損なわない範囲で有れば、特に制限
されることはなく、通常の方法で採尿されたもの又は保
存されたものは、いずれも使用できる。例えば、蓄尿時
の安定性を保つために抗菌剤等を添加した容器で採尿す
ることがあるが、添加した抗菌剤等が測定に干渉を及ぼ
さない限り、この様な検体も使用できる。また、臓器移
植としては、腎移植、肝移植、心移植、膵移植等が挙げ
られ特に限定されないが、腎移植の場合が特に好まし
い。ＭＭＰ−２は、その前駆体であるプロＭＭＰ−２
（ｐｒｏＭＭＰ−２）として細胞外に放出され、細胞外
でＭＭＰ−２に変換される。本発明において、ＭＭＰ−
２の前駆体とは、それが分解されることによりＭＭＰ−
２となりうるものを言い、具体的にはプロＭＭＰ−２を
意味する。このプロＭＭＰ−２は、ＴＩＭＰ（Ｔｉｓｓ
ｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒ
ｏｔｅｉｎａｓｅ）−２、ＴＩＭＰ−１等のインヒビタ
ーと複合体を形成していてもよく、本発明における前駆
体には、複合体の形で存在するプロＭＭＰ−２も含ま
れ、プロＭＭＰ−２の存在様式は特に限定されない。

【０００８】検体中のＭＭＰ−２又はその前駆体を検出
（定量等）する方法は公知であり、本発明におけるＭＭ
Ｐ−２又はその前駆体の検出（定量等）も公知の方法に
従って行なうことができる。例えば、ＭＭＰ−２又はそ
の前駆体に特異的な系でＭＭＰ−２又はその前駆体を測
定し、「蛋白質濃度」または「酵素活性値」等としてＭ
ＭＰ−２又はその前駆体の濃度等を求めることにより実
施することがでる。ＭＭＰ−２又はその前駆体の濃度等
を求める場合、ＭＭＰ−２又はその前駆体に特異的な方
法であれば、どの様な方法を用いてもよく、特に限定さ
れないが、簡便かつ高感度で、再現性のよい方法が好ま
しい。

【０００９】より具体的に示すと、「蛋白質濃度」を求
める方法としては、ＭＭＰ−２又はその前駆体に特異性
を有する抗体を用いて免疫学的に測定する方法がある。
また、「酵素活性値」を求める方法としては、ＭＭＰ−
２に特異性の高い基質を用いて、生化学的に測定する方
法がある。

【００１０】生化学的に酵素活性を測定する方法におい
て、ＭＭＰ−２に選択性の高い基質としては検体中に存
在するＭＭＰ−２以外の酵素、例えば、セリンプロテア
ーゼ、ペプチダーゼ、エステラーゼなどの酵素類で加水
分解され難く、ＭＭＰ−２で容易に加水分解される基
質、例えば、ゼラチン、コラーゲン、またはこれらの特
徴的構造部分を有する合成基質が挙げられるが、好まし
い基質としては、（７−メトキシクマリン−４−イル）
アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシル−グリシル−Ｌ
−ロイシル−Ｌ−〔Ｎ−（２，４−ジニトロフェニル）
−Ｌ−２，３−ジアミノプロピオニトリル〕−Ｌ−アラ
ニル−Ｌ−アルギニンアミド（ＭＣＡ）又は、Ｎ−アセ
チル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシル−グリシル−Ｌ−ロ
イシル−Ｌ−ロイシル−グリシルエチルエステルなどが
挙げられる。

【００１１】ＭＭＰ−２の酵素活性を測定する方法とし
ては、ＭＭＰ−２による基質の水解産物を直接測定して
もよいが、該水解産物の何れかを高感度かつ特異的に検
出できる系と組み合わせて、間接的に測定してもよい。
この方法によるＭＭＰ−２前駆体の検出（定量等）は、
公知の方法（例えばトリプシン又は４−アミノフェニル
水銀酢酸（ＡＰＭＡ）による処理）によりＭＭＰ−２前
駆体を分解してＭＭＰ−２を生成させ、生成したＭＭＰ
−２の酵素活性を測定することにより行うことが出来
る。

【００１２】免疫測定法としては公知のあらゆる方法が
使用できる。固相を用いる一般的な免疫測定法としては
サンドイッチ測定法、競合法や抑制法（ｂｉｎｄｉｎｇ
ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）が使用できる。
特殊な方法としては、酵素一基質の結合性を利用し、抗
体の代わりに基質を固相に固定して用いる測定系や、標
識抗体を使用せずに、固相化抗体へのＭＭＰ−２又はそ
の前駆体の結合を表面プラズモン（ＳＰＲ）で直接検出
する方法などがある。具体的には特開昭６０−２１８７
号公報、特公平７−３４０１４号公報、特開平６−２１
３８８８号公報、特開平７−１５９４０２号公報などに
開示されている。また、ラテックスや血球を用いた凝集
反応や比濁法、あるいはウエスタンブロット法での測定
もあげられる。これらの方法はその測定原理において相
違はあるが、いずれの方法でも測定できる。一般的には
不溶性担体に固定した抗体と標識抗体によるサンドイッ
チ測定法が好適である。免疫測定法に使用する抗体はポ
リクロナール抗体であってもモノクローナル抗体であっ
てもよい。抗体の由来する動物種も問わない。サンドイ
ッチ測定法の様に２種の抗体を使用する場合、固相化抗
体と標識抗体によってサンドイッチ複合体が形成される
組み合わせであれば、固相化抗体と標識抗体に同種の抗
体を使用しても、異種の抗体の組み合わせであってもよ
い。抗体に標識する物質としては放射性物質、酵素、蛍
光物質等やビオチンなどが使用できる。

【００１３】慢性拒絶反応の検査方法では、ＭＭＰ−２
又はその前駆体の測定値（「蛋白質濃度」や「酵素活性
値」等）自体又はその上昇の度合いを、直接、慢性拒絶
の判定に用いてもよいが、他のマーカーとの比を求めて
変化を強調し、ＭＭＰ−２又はその前駆体とのインデッ
クスとして判定に用いてもよい。例えば、尿を検体とし
た場合、尿中のクレアチニン濃度で補正する方法（尿中
のＭＭＰ−２又はその前駆体の濃度を尿中のクレアチニ
ン濃度で除する方法）等が挙げられる。本発明の検査方
法を実施するにあたり、ほぼ正常な臓器機能を有する臓
器移植患者の少なくとも９０％以上が正常と判断される
範囲にカットオフ値を設定し検査するのが好ましい。ま
た、臓器移植患者のＭＭＰ−２又はその前駆体を定期的
に測定し、測定値あるいはインデックスの上昇の度合い
から慢性拒絶反応の発症を判断することも可能である。

【００１４】又、本発明は、検体中のＭＭＰ−２又はそ
の前駆体を定量せずに、以下の実施例に示したように、
例えば、ゼラチン等の基質を含むポリアクリルアミドゲ
ル中で電気泳動を行ないゼラチン等の基質の分解による
バンドが生じるか否かをみることによる方法等の方法に
よっても行うことができる。

【００１５】

【実施例】実施例によって、本発明を具体的に説明する
が、本発明がこれらの実施例のみに限定されるものでは
ない。

【００１６】試験例１（ザイモグラム；生化学的なＭＭ
Ｐ−２活性の検出） 尿検体に、等量の８％ＳＤＳ、４０％グリセロールを含
む０．５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ６．８）を加え、よく混
合する。１ｍｇ／ｍｌゼラチンを含む８％ポリアクリル
アミドゲルを作製後、上記混合物をポリアクリルアミド
ゲル中で電気泳動する。泳動終了後、ゲルを２．５％ト
ライトンＸ−１００を含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
８．０）で、室温で３０分２回振盪しながら洗う。次い
で、０．５ｍＭ塩化カルシウム、１０μＭ塩化亜鉛を含
む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に交換し、３７
℃で１６時間インキュベートする。ゲルを１％クマジー
ブルー Ｒ−２５０、５％酢酸、１０％メタノールで３
０分間染色後、５％酢酸、１０％メタノールで脱色し
た。ゼラチン分解酵素（ＭＭＰ−２）の存在する場所に
一致して、青いバックグラウンドの中に透明なバンドが
見える。

【００１７】実施例１ 腎生検及び血清クレアチニン値（２．０ｍｇ／ｄｌ以
上）により慢性拒絶と診断された、１年以上前に腎移植
を受けた患者、血清クレアチニン値が１．５ｍｇ／ｄｌ
以下で、腎移植後１年以内の、腎生検等により慢性拒絶
を起こしていないと診断されたほぼ正常な腎機能の患者
（対照群）の尿を検体として、試験例１の方法でＭＭＰ
−２活性を検出した。その結果、慢性拒絶患者の尿検体
で１０例中８例で分子量７０ｋＤのＭＭＰ−２が検出さ
れたのに対し、対照群の患者で検出されたのは１４例中
１例であった。ＭＭＰ−２の濃度の上昇が、慢性拒絶の
有効なマーカーとなっていることを示している。

【００１８】試験例２ 免疫測定法による尿中のＭＭＰ
−２前駆体濃度の測定 ＭＭＰ−２前駆体分子上の異なる部位を認識する２種の
モノクローナル抗体を用いた、血清を対象とする富士薬
品工業社製のＭＭＰ−２測定キット（ｐｒｏＭＭＰ−２
及びこれとＴＩＭＰ−２との複合体を検出し、ＭＭＰ−
２は検出されない。）を用いた。しかし、血清中に比べ
て尿中のＭＭＰ−２前駆体濃度が低いため、その操作条
件を変更して測定した。すなわち試験管に尿あるいはキ
ット添付の標準液を１５０μｌとり１％牛血清アルブミ
ンと１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む３０ｍＭリン酸生理食塩
水ｐＨ７．０を加えてよく混合した後、抗体結合ビーズ
を入れて、室温で２時間反応させた。反応液をアスピレ
ーターで吸引除去し、キット添付の標識抗体液を３００
μｌ加えて、室温で１時間反応した。再び反応液をアス
ピレーターで吸引除去し、ビーズを別の試験管に移し、
キット添付の発色液を３００μｌ加えて室温で３０分間
反応した。キット添付の停止液１５００μｌを加えて、
反応を停止した。精製水を対照にして、反応液の波長４
９２ｎｍの吸光度を測定し、標準液から得られた吸光度
をもとに作成した検量線より、尿検体中のＭＭＰ−２前
駆体濃度を求めた。また、同時に尿中のクレアチニン濃
度を常法により測定し、クレアチニンで補正した尿中の
ＭＭＰ−２前駆体濃度を算出した。

【００１９】実施例２ 腎生検及び血清クレアチニン値により慢性拒絶と診断さ
れた、１年以上前に腎移植を受けた患者８例（発症
群）、血清クレアチニン値が１．５ｍｇ／ｄｌ以下で、
腎移植後１年以内の、腎生検等により慢性拒絶を起こし
ていないと診断されたほぼ正常な腎機能の患者３６例
（対照群）の尿を検体として、試験例２の方法でＭＭＰ
−２前駆体濃度を測定した。クレアチニン補正しない場
合と、した場合のヒストグラムを図１及び図２に示す。
クレアチニン補正をしない場合にカットオフ値を１μｇ
／ｍｌとすると対照群の９２％は陰性に判定され、腎移
植慢性拒絶と診断された患者は１００％陽性と判定され
た。クレアチニン補正をした場合、カットオフ値を５μ
ｇ／ｇ・クレアチニンとすると対照群の９５％は陰性に
なり、腎移植慢性拒絶と診断された患者は１００％陽性
と判定された。また、カットオフ値を１μｇ／ｇ・クレ
アチニンにしても対照群の８９％は陰性に判定された。

【００２０】実施例３ ２例の腎移植患者について腎移植慢性拒絶の発症前及び
発症後の尿を検体として、試験例２の方法でＭＭＰ−２
前駆体濃度（クレアチニン補正値）を測定した。結果を
表１に示す。ＭＭＰ−２前駆体濃度は発症後大きく上昇
しており、ＭＭＰ−２前駆体の濃度の上昇が、腎移植慢
性拒絶の発症を判定するのに役立つことを示している。

【００２１】

【表１】 ──────────────────────────────────── 発症前 発症後 （μｇ／ｇ・クレアチニン） （μｇ／ｇ・クレアチニン） ──────────────────────────────────── 患者１ １．３ １４．６ 患者２ ０．６ ２９．４ ────────────────────────────────────

【００２２】

【発明の効果】本発明の検査方法を実施することによ
り、尿等の検体中のＭＭＰ−２又はその前駆体の濃度の
上昇等から、慢性拒絶反応の早期発見が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】腎移植患者の尿中ＭＭＰ−２前駆体濃度のヒス
トグラム

【図２】腎移植患者の尿中ＭＭＰ−２前駆体濃度をクレ
アチニン濃度により補正した場合のヒストグラム

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】体液中のマトリックスメタロプロテアーゼ
   （ＭＭＰ）−２又はその前駆体を検出することを特徴と
   する臓器移植後の慢性拒絶反応の検査方法。
2. 【請求項２】体液がヒトの尿又は血液である請求項１記
   載の検査方法。
3. 【請求項３】尿検体中のＭＭＰ−２又はその前駆体を検
   出することを特徴とする請求項１記載の検査方法。
4. 【請求項４】臓器移植が腎移植である請求項１、２又は
   ３記載の検査方法。
5. 【請求項５】尿検体中のＭＭＰ−２前駆体濃度として
   ０．１から１０．０ｎｇ／ｍｌの範囲の間に腎移植慢性
   拒絶反応の有無を判定するためのカットオフ値を設定す
   る請求項３記載の検査方法。
6. 【請求項６】カットオフ値を０．５から５．０ｎｇ／ｍ
   ｌの範囲の間に設定する請求項５記載の検査方法。
7. 【請求項７】尿検体中のＭＭＰ−２前駆体濃度およびク
   レアチニン濃度を測定し、クレアチニン濃度で補正する
   ことにより得られるインデックスが、０．１から２０．
   ０μｇ／ｇ・クレアチニンの範囲の間に、腎移植慢性拒
   絶反応の有無を判定するためのカットオフ値を設定する
   請求項３記載の検査方法。
8. 【請求項８】カットオフ値を０．５から１０．０μｇ／
   ｇ・クレアチニンの範囲の間に設定する請求項７記載の
   検査方法。
9. 【請求項９】検出が免疫測定法による検出である請求項
   １〜８のいずれかに記載の検査方法。
10. 【請求項１０】免疫測定法が酵素免疫測定法である請求
    項９記載の検査方法。
11. 【請求項１１】免疫測定法がサンドイッチ法である請求
    項９又は１０記載の検査方法。
12. 【請求項１２】尿中のＭＭＰ−２又はその前駆体を免疫
    測定法で測定する尿中ＭＭＰ−２又はその前駆体の測定
    方法。