JPH1094A - 核酸分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 長い２本鎖ＤＮＡ試料の検査を可能とするフ
ィンガープリント法を提供する。 【解決手段】 試料４０を複数種の制限酵素で切断し断
片を得て、断片両末端に複数種のオリゴヌクレオチドを
結合し、断片を含む液を複数の容器に分画し、オリゴヌ
クレオチドの塩基配列、及びオリゴヌクレオチドの塩基
配列に続く、制限酵素が認識する塩基配列の一部又は全
部と相補な塩基配列と、３’末端に１〜４塩基の選択配
列をもつ、標識されたプライマーの複数からなるＤＮＡ
プライマーセットの複数セット４９’、４９”の、各々
のセットからのプライマーの組合わせからなるプライマ
ーを、各組合わせに対応させて各容器５５に添加して、
２種の制限酵素が認識する塩基配列に挟まれた、断片の
領域の相補鎖合成反応を、各容器で行ない、各容器での
反応生成物を電気泳動分離して、多数の断片から、フィ
ンガープリントパターンを得る。 【効果】 多数のＤＮＡ断片を含む試料の分析が可能に
なる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は核酸を用いた診断、
核酸の特性評価法、分析方法、及びこれに用いるＤＮＡ
プライマーセットに関する。

【０００２】

【従来の技術】ＤＮＡを病気の診断等に用いることが盛
んになりつつある。この診断では、目的とするＤＮＡと
相補的な塩基配列をもつＤＮＡプローブを作り、このＤ
ＮＡプローブが目的とするＤＮＡとハイブリダイズする
か否かをみるプローブ検査を行なったり、目的とするＤ
ＮＡの塩基配列の特定の領域を選び、２つのＤＮＡプロ
ーブ（プライマー）を用いてＰＣＲ増幅により生成した
ＤＮＡ断片の塩基配列情報を得て診断等に用いている。
これらの方法は１種類〜数種類のＤＮＡを調べるのには
良いが、非常に多数のＤＮＡ断片を含むＤＮＡの検査や
長いＤＮＡの評価には適していない。しかし、生体内で
のＤＮＡ又は遺伝子は相互に関連しながら働いており、
染色体又は含まれる全てのＤＮＡを総合して把握し評価
したいという要求が強い。例えば、ゲノム解析プロジェ
クトの中で注目されているｃ−ＤＮＡプロジェクトで
は、ＤＮＡが生体中で機能する場合、ＤＮＡ情報はまず
ｍ−ＲＮＡに転写され、蛋白が合成され生体が機能する
事に注目し、ｍ−ＲＮＡからその相補鎖であるｃ−ＤＮ
Ａを作り、ｃ−ＤＮＡの種類と量の情報から生体を総合
的に理解しようとする試みがなされている。

【０００３】細胞中で機能しているｍ−ＲＮＡに対応す
るｃ−ＤＮＡを分離し個々のｃ−ＤＮＡの塩基配列を決
め、ｃ−ＤＮＡの塩基配列が１つの組織に現われる頻度
を調べている。このためにまず、ｍ−ＲＮＡからｃ−Ｄ
ＮＡを作り（種々のｃ−ＤＮＡが混合した状態）目的と
するｃ−ＤＮＡをクローニングする。ｃ−ＤＮＡを含ん
だ大腸菌を寒天培地に撒き、培養しコロニーを得る。各
コロニーには目的とするｃ−ＤＮＡのうち何れか１種類
が入っているので、目的とするｃ−ＤＮＡを取り出し塩
基配列を決定し、ｃ−ＤＮＡの種類を同定する。次々に
各コロニーに関してｃ−ＤＮＡの種類を同定していく
と、同一種類のｃ−ＤＮＡが出現する。１つの組織中に
ある特定のｃ−ＤＮＡに注目した時、その量が多いほど
その組織で強く発現している遺伝子に相当するので、コ
ロニー中での出現頻度も高い。そこでｃ−ＤＮＡの塩基
配列解析を多数のコロニーで行ない、どのｃ−ＤＮＡが
何回出現するかの頻度を求めている（文献：Ｋ．Ｍｕｒ
ａｋａｗａ ｅｔ．ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２３、
ｐ３７９−ｐ３８９（１９９４））。

【０００４】一方、ゲノム（全ての染色体中ＤＮＡ）又
は特定の染色体全体に注目し、ＤＮＡ診断を行なう試み
も行なわれている。Ｇｅｎｅ Ｓｃａｎ法（制限酵素ラ
ンドマークゲノムスキャニング法）と呼ばれる分析法が
ある（文献：Ｙ．Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ ｅｔ．ａ
ｌ．、「ＤＮＡ多型（ＤＮＡ ＰＯＬＹＭＯＲＰＨＩＳ
Ｍ）」、ｖｏｌ．３、ｐ１０−ｐ１５（１９９５）（東
洋書店））。この方法では、まずＤＮＡを第１の制限酵
素（例えば、ＮｏｔＩ等の８塩基認識酵素（平均６４ｋ
塩基に１回の頻度で切断される）を用いる）で切断し、
切断部にラジオアイソトープ又は蛍光標識をしたヌクレ
オチドを結合し、アガロースゲルを用いて第１の方向に
電気泳動する。泳動分離後、第２の制限酵素（例えば、
４塩基認識酵素（平均２５６塩基に１回の頻度で切断さ
れる）を用いる）により、アガロースゲル中で泳動分離
したＤＮＡ断片をさらに切断した後、第１の方向と直交
する第２の方向に電気泳動し、２次元泳動パターンを得
る。この２次元泳動パターンをフィンガープリントとし
て利用して、ＤＮＡ全体の検査を行なう。正常細胞中の
ＤＮＡとガン等の異常のある細胞のＤＮＡとでは、２次
元泳動パターンが異なることを利用して、診断に用いる
等の試みがなされている。しかし、大きなＤＮＡのどこ
に異常があるかを調べるには良い方法がないのが現状で
ある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】以上説明したように、
長塩基長のＤＮＡを調べたり、複数種類のＤＮＡが含ま
れる試料の全体像を把握し、検査することは、病気の早
期発見、ＤＮＡが細胞中で果している機能の理解の上で
重要であるが、従来技術では良い方法がないのが現状で
ある。ｃ−ＤＮＡ解析に関する従来技術では、非常に多
くのクローンに含まれる試料の塩基配列を決定する必要
があり、手間と時間がかかるため種々の試料に適用する
には現実的ではないという問題があった。また、従来の
ＤＮＡプローブを用いる方法では、せいぜい数種類〜十
種類のＤＮＡを一度に分析できるだけで、数百〜数万種
類にも及ぶｃ−ＤＮＡやＤＮＡ断片の検査には不向きで
あり、更に、どこに異常があるか不明な長いＤＮＡの検
査にも適用できないという問題があった。

【０００６】一方、従来技術のＧｅｎｅ Ｓｃａｎ法で
は長塩基長のＤＮＡの検査ができるが、サンプルＤＮＡ
の量を多く必要とすること、第１方向に泳動分離された
ＤＮＡ断片を切断するために使用される第２の制限酵素
の量が厖大であること、２次元泳動パターンの各ＤＮＡ
断片の位置が２つの電気泳動方向で常に定量的に得られ
ず、２次元電気泳動分離された各ＤＮＡ断片の長さが正
確に決定できないため、フィンガープリントとしてデー
タベース化しにくい等の問題があった。本発明の目的
は、これら従来技術の問題点を克服する新しいフィンガ
ープリント法、ＤＮＡ検査法を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明では、まず２本鎖
の試料ＤＮＡを２種類以上の制限酵素により切断し、複
数種類の長さをもつ試料ＤＮＡに固有な２本鎖ＤＮＡ断
片群を生成する。２本鎖ＤＮＡ断片の両側の３’末端
に、既知塩基配列をもつオリゴヌクレオチドを結合し、
ＤＮＡプライマーの一部がハイブリダイズできる領域を
設ける。この領域と使用した制限酵素が認識する塩基配
列及びそれに続く数塩基の位置にハイブリダイズするＤ
ＮＡプライマーセットを複数種用意する。ＤＮＡプライ
マーセットのプライマーの３’末端の１〜３塩基は、実
質全ての塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）の組合わせからなる、
ＤＮＡ断片の制限酵素の認識配列に続く１〜３塩基の配
列を識別（分類）するための選択塩基配列である。使用
する制限酵素の数と用意するＤＮＡプライマーセットの
数は同一である。各ＤＮＡプライマーセットのプライマ
ーの組合わせの数に、２本鎖ＤＮＡ断片群を分画して、
各分画に異なるプライマーの組合わせを添加して、ハイ
ブリダイズさせ相補鎖合成反応を行なう。各ＤＮＡプラ
イマーセットのプライマーは蛍光体等で標識しておく。
各分画で得た相補鎖合成反応生成物を別々の泳動路でゲ
ル電気泳動分離し、各ＤＮＡ断片の長さを測定してフィ
ンガープリントを得る。

【０００８】２本鎖ＤＮＡ断片群が多数のＤＮＡ断片を
含み、長さが識別しにくい場合でも、ほとんどの場合、
各ＤＮＡ断片は制限酵素切断部に続く塩基配列が異な
る。そこでＤＮＡ断片の制限酵素切断部に続く塩基配列
の違いを利用してＤＮＡ断片の分類を行なう。ＤＮＡ断
片を分類するには、３’末端の１塩基〜３塩基が全ての
組合わせの塩基配列をもつ、４種類〜６４種類のＤＮＡ
プライマーを用いて相補鎖合成反応を行なう。ＤＮＡプ
ライマーの末端２塩基〜３塩基がＤＮＡ断片に完全にハ
イブリダイズしている時は、相補鎖合成反応が進行する
が、そうではないときは反応は進行しない。

【０００９】ｍ−ＲＮＡから２本鎖ｃ−ＤＮＡを作製す
る場合には、ビオチン化オリゴｄＴを含むプライマーを
用いて、ｍ−ＲＮＡの３’末端側に相補鎖結合させて、
ＤＮＡポリメラーゼにより２本鎖ｃ−ＤＮＡを調製す
る。なお、キャップ構造を利用してｍ−ＲＮＡの５’末
端側に相当するｃ−ＤＮＡ末端にビオチンを入れて同様
の操作により２本鎖ｃ−ＤＮＡを調製してもよい。この
２本鎖ｃ−ＤＮＡを２つの分画に分け、各分画に第１及
び第２の制限酵素を添加して２本鎖ｃ−ＤＮＡを切断す
る。ビオチンが結合した断片以外を除去し、切断された
ＤＮＡ末端にそれぞれ第１及び第２のオリゴヌクレオチ
ドを結合させる。

【００１０】次いで、第１の制限酵素を添加した分画に
第２の制限酵素を添加し、第２の制限酵素を添加した分
画に第１の制限酵素を添加して再切断を行ない、切断部
にそれぞれ第１及び第２のオリゴヌクレオチドを結合さ
せる。ビオチンが結合した断片を除去すると、第１及び
第２の制限酵素により両末端が切断され、第１及び第２
のオリゴヌクレオチドにより挟まれたＤＮＡ断片が生じ
る。即ち、両末端が異なる制限酵素により切断された断
片が生じる。各制限酵素の認識配列の一部又は全部に相
補結合する各ＤＮＡプライマーセットのプライマー（標
識されている）の組合わせを用いて相補鎖合成を行なう
と、両末端が異なる制限酵素により切断されたＤＮＡ断
片のうち、プライマーの末端塩基がハイブリダイズした
ＤＮＡ断片のみで反応が進行する。

【００１１】相補鎖合成されたＤＮＡ鎖は元のＤＮＡ断
片鎖と実質的に同じ長さであるので、ゲル電気泳動分離
等によりＤＮＡ鎖の長さを計測できる。１度の相補鎖合
成反応では合成されるＤＮＡ断片が検出感度に満たない
場合には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて複数回の
相補鎖合成反応を行ない、合成されるＤＮＡ断片の量を
増幅できる。この場合、プライマーの末端塩基配列を変
化させ、相補鎖合成するか否かをコントロールできる。
この３’末端の塩基配列を選択配列と呼ぶが、選択配列
をもち第１及び第２のオリゴヌクレオチドに相補的なプ
ライマーを用いて、特定のＤＮＡ断片だけを選択的に増
幅できる。例えば、選択配列として２塩基を用いると、
ＤＮＡ断片を４²×４²＝２５６の種類に分類して得るこ
とができる。

【００１２】この２５６の種類に分類されたＤＮＡ断片
を、種類毎とに異なる泳動路で電気泳動してフィンガー
プリントパターンを得る。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下、本発明による長い核酸の検
査を可能とするフィンガープリント法を提供する核酸分
析方法を図を用いて詳細に説明する。

【００１４】（第１の実施例）図１は、複数種類の制限
酵素を用いて、試料ＤＮＡからＤＮＡ断片混合物の作成
し、第１、第２のＤＮＡプライマーセットを用いた相補
鎖合成反応により、制限酵素の認識配列の全部又は認識
配列の３’末端側の一部に相補な塩基配列に続く所定の
２塩基の塩基配列を５’末端側にもつＤＮＡ断片を得る
手順を説明する図である。第１の実施例では、試料ＤＮ
Ａとして、大腸菌ゲノムＤＮＡ１（〜５Ｍｂ）を用い
る。ＮｏｔＩ（８塩基認識制限酵素であり、塩基配列Ｇ
ＣＧＧＣＣＧＣを認識する）の認識配列は平均６４ｋｂ
に１回出現するので、大腸菌ゲノムＤＮＡ１をＮｏｔＩ
により切断すると、約１００本の２本鎖ＤＮＡ断片２−
１、２−２、２−３、……が生じる。生じた２本鎖ＤＮ
Ａ断片２の両末端（即ち、ＮｏｔＩによる切断部位）
に、２本鎖のビオチン化オリゴヌクレオチド（既知塩基
配列をもつ）１００を結合してＤＮＡ断片３−１、３−
２、……を得る（以下、各図ではビオチンを簡単のため
にｂで表わす）。２本鎖のビオチン化オリゴヌクレオチ
ド（第１のオリゴヌクレオチド）１００は、５’末端が
ビオチン化された１本鎖オリゴヌクレオチド（塩基長は
１０〜３０が望ましい）１０と、オリゴヌクレオチド１
０に相補な塩基配列１０１とＮｏｔＩの認識する塩基配
列に相補な塩基配列（ＣＧＣＣＧＧＣＧ）１０２の全て
又は一部とを５’末端にもつ１本鎖オリゴヌクレオチド
１１からなる。

【００１５】次いで、制限酵素ＮｌａＩＩＩ（４塩基認
識酵素であり、塩基配列ＣＡＴＧを認識する）により、
ＤＮＡ断片３−１、３−２、……をさらに切断する。Ｎ
ｌａＩＩＩの認識配列は平均２５６塩基に１回出現する
ので、各ＤＮＡ断片３−１、３−２、……は両末端近傍
で切断される。制限酵素ＮｌａＩＩＩにより断片化され
たＤＮＡ断片４−１、４−２、……、４−ｎ、４’−
１、４’−２、……、４’−ｍの両末端（即ち、Ｎｌａ
ＩＩＩによる切断部位）に、２本鎖の第２のオリゴヌク
レオチド１１０を結合する。２本鎖の第２のオリゴヌク
レオチド（既知塩基配列をもつ）１１０は、１本鎖オリ
ゴヌクレオチド１２（塩基長は１０〜３０が望ましい）
と、オリゴヌクレオチド１２に相補な塩基配列１１１と
ＮｌａＩＩＩの認識する塩基配列に相補な塩基配列（Ｇ
ＴＡＣ）１１２の全部又は一部とを５’末端にもつ１本
鎖オリゴヌクレオチド１３からなる。この結果、両末端
に第２のヌクレオチド１１０をもつＤＮＡ断片４”−
１、４”−２、……と、一方の末端に第１のオリゴヌク
レオチド１００をもち、他方の末端に第２のオリゴヌク
レオチド１１０をもつＤＮＡ断片５−１、５−ｎ、……
が生成される。

【００１６】これら生成物から、ビーズ１４に結合した
アビジン１５を用いて、一方の末端に第１のオリゴヌク
レオチド１００をもち、他方の末端に第２のオリゴヌク
レオチド１１０をもつＤＮＡ断片５−１、５−ｎ、……
を捕捉する。以上のようにして得られる断片の総数は、
ＮｏｔＩにより切断された１つの断片の両末端近傍が切
断され２つの断片を得るので約２００となる。

【００１７】次いで、捕捉された断片を昇温変性又はア
ルカリ変性させてビオチンｂを含まない相補鎖（ＤＮＡ
断片）６（６−１、６−２、６−３、……）を遊離させ
る。このようにして得た相補鎖６は、３’末端側に、オ
リゴヌクレオチド１０に相補な塩基配列１０１とＮｏｔ
Ｉの認識する塩基配列に相補な塩基配列（ＣＧＣＣＧＧ
ＣＧ）１０２を５’末端にもつ１本鎖オリゴヌクレオチ
ド１１をもち、５’末端側に、オリゴヌクレオチド１２
に相補な塩基配列１１１とＮｌａＩＩＩの認識する塩基
配列に相補な塩基配列（ＧＴＡＣ）１１２を５’末端に
もつ１本鎖オリゴヌクレオチド１３をもつ断片である。

【００１８】ＮｏｔＩの認識配列全て又はＮｏｔＩの認
識配列の３’末端側の一部からなる、塩基配列１６−１
と、この塩基配列１６−１に続く２塩基からなる選択配
列１６−２をもつ第１のＤＮＡプライマーセットのプラ
イマー１６−、１６−、……を用意する（図１では
１６−のみを示す）。この第１のＤＮＡプライマーセ
ット１６は、３’末端の２塩基の選択配列の塩基配列が
異なる１６種類のプライマーから構成されている。即
ち、３’末端の２塩基の選択配列の塩基配列は、Ａ、
Ｔ、Ｇ、Ｃからの２塩基の全ての組合わせに対応した４
×４＝１６通りある。同様にして、ＮｌａＩＩＩの認識
配列全て又はＮｌａＩＩＩの認識配列の３’末端側の一
部からなる、塩基配列１７−１と、この塩基配列１７−
１に続く２塩基からなる選択配列１７−２をもつ第２の
ＤＮＡプライマーセットのプライマー１７−、１７−
、……を用意する（図１では１７−のみを示す）。
第２のＤＮＡプライマーセット１７も第１のＤＮＡプラ
イマーセット１６と同様に、３’末端の２塩基の選択配
列の塩基配列が異なる１６種類のプライマーから構成さ
れている。なお、第１のＤＮＡプライマーセット１６の
各プライマーは５’末端を蛍光標識（蛍光標識を＊で示
す）しておく。

【００１９】相補鎖６を含む溶液を２５６個の容器（図
示せず）に分注して、２５６個の容器の各々に、第１の
ＤＮＡプライマーセット１６から選ばれた１種類のプラ
イマーと、第２のＤＮＡプライマーセット１７から選ば
れた１種類のプライマーとを添加する。第１、及び第２
のＤＮＡプライマーセットからのプライマーの種類の選
択は、第１、及び第２のＤＮＡプライマーセットのプラ
イマーの組合わせの合計１６×１６＝２５６通りについ
て行なう。各容器には異なる組合わせにより選択された
２種類のプライマーが添加される。即ち、第１のＤＮＡ
プライマーセット、第２のＤＮＡプライマーセットとと
もに１６種類であるから、プライマーの組合わせは１６
×１６＝２５６通りであり、この２５６通りのプライマ
ーの組合わせで、２５６個の容器内で相補鎖６の相補鎖
合成反応を行なう（図１では簡単のために１つの容器に
ついてのみ図示する）。この相補鎖合成反応では、まず
ＤＮＡ断片６−ｉ（−鎖）に対して、第１のＤＮＡプラ
イマーセット１６のプライマー１６−をプライマーと
して伸長反応が進行し、２本鎖が生成する。この２本鎖
が昇温変性されて１本鎖となった＋鎖に対して、第２の
ＤＮＡプライマーセット１７のプライマー１７−が、
−鎖に対して第１のプライマーセット１６のプライマー
１６−が、それぞれプライマーとして伸長反応が進行
し、２本鎖が生成する。このようにして得た相補鎖合成
反応生成物をゲル電気泳動してスペクトルを測定する。
ゲル電気泳動では変性ポリアクリルアミドを使用して、
２５６個の容器内での相補鎖合成反応生成物は、容器に
対応する２５６個の泳動路で１本鎖の状態で電気泳動分
離される。なお、第１のＤＮＡプライマーセット１６の
各プライマーの５’末端の蛍光標識として、異なる４種
類を使用する場合には、異なる４種類の蛍光標識をもつ
第１のＤＮＡプライマーセット１６のプライマーを使用
する相補鎖合成反応は同一の容器で行なうことができ、
６４個の容器内での相補鎖合成反応生成物は、容器に対
応する６４個の泳動路で１本鎖の状態で電気泳動分離で
きる。

【００２０】図２は、上記の相補鎖合成反応生成物のＤ
ＮＡ断片のゲル電気泳動スペクトルの一部を示す図であ
る。図２において、２１は上記の相補鎖合成反応生成物
の全てのＤＮＡ断片を同時に電気泳動分離した場合のス
ペクトル、２２は上記の容器毎の相補鎖合成反応生成物
のＤＮＡ断片によるスペクトル、１６−２、１７−２は
使用したプライマーの選択塩基部分の塩基配列、２４は
ＤＮＡ断片の塩基長を表わす。また、Ｒ１、Ｒ２はそれ
ぞれ、第１のＤＮＡプライマーセット１６のプライマー
１６−、１６−、……の５’末端側にあるＮｏｔＩ
の認識配列の一部又は全ての塩基配列、第２のＤＮＡプ
ライマーセット１７のプライマー１７−、１７−、
……５’末端側にあるＮｌａＩＩＩの認識配列の一部又
は全ての塩基配列である。全てのＤＮＡ断片の長さを同
一の泳動路で同時に測定すると、スペクトル２１のよう
に多くのピークが重なって各ＤＮＡ断片が分離ができず
分析不可能になる。スペクトル２２は、各々第１、第２
のＤＮＡプライマーセットのプライマーの選択配列（各
ＤＮＡ断片を識別する）２塩基１６−２、１７−２の組
合わせを、変化させて相補鎖合成反応を行ない、ＤＮＡ
断片の両末端の塩基配列により識別を行ない、選択配列
１６−２、１７−２の組合わせ毎に異なる泳動路でＤＮ
Ａ断片をゲル電気泳動分離したスペクトルである。ＤＮ
Ａ断片群を選択配列１６−２、１７−２の組合わせ毎に
分離してスペクトルを得ているので各ピークは分離して
おり、スペクトルに含まれるＤＮＡ断片の長さ（塩基長
２４）を知ることができる。第１の実施例の場合、第
１、第２のＤＮＡプライマーセットの２５６通りのプラ
イマーの組合わせを使用して相補鎖合成反応を行なって
いるので、２５６通りのｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒ
ａｍ（ＤＮＡ断片スペクトル）が得られるが、このＤＮ
Ａ断片のｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍは元のＤＮ
Ａ試料に固有のものであり、試料ＤＮＡが異なると別の
異なるパターンを示すので、ＤＮＡの診断等に広く使用
できる。即ち、第１、第２のＤＮＡプライマーセットの
プライマーによる選択配列の複数通りの組み合せにより
（図２では、一方の選択配列をＡＡと固定して、他方の
選択配列をＡＡ、ＡＣ、ＡＧ、…、ＴＧ、ＴＴからなる
１６通りに変化させた組合わせの例を示す）、試料ＤＮ
Ａをより正確に分析できる。 なお、実施例１におい
て、ＤＮＡ断片４”−１、４”−２、……、ＤＮＡ断片
５−１、５−ｎ、……の生成に引き続いて、制限酵素Ｍ
ｂｏＩ（４塩基認識酵素であり、塩基配列ＧＡＴＣを認
識する）により、ＤＮＡ断片４”−１、４”−２、…
…、ＤＮＡ断片５−１、５−ｎ、……をさらに切断して
もよい。この場合には、制限酵素ＭｂｏＩにより断片化
されたＤＮＡ断片の両末端（即ち、制限酵素ＭｂｏＩに
よる切断部位）に、２本鎖の第３のオリゴヌクレオチド
を結合してもしなくてもよい。このように第３番目の制
限酵素によるＤＮＡ断片の切断を行なう場合、例えば、
第３番目の制限酵素が図１に示す５−１、５−ｎを切断
した場合、図１において相補鎖合成反応を行っても２本
鎖ＤＮＡ断片が得られないので、相補鎖合成反応生成物
の電気泳動パターン（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｏｇｒ
ａｍ）が単純となるので、フインガープリントパターン
の識別が容易となり、試料の分析がより正確となるとい
う効果がある。

【００２１】（第２の実施例）第２の実施例はｍ−ＲＮ
Ａの分析に利用した例である。

【００２２】図３は、本発明の第２の実施例で使用す
る、ｍ−ＲＮＡから２本鎖ｃ−ＤＮＡを合成して試料Ｄ
ＮＡを得る従来技術の反応の手順を説明する図、図４
は、本発明の第２の実施例において、２種類の制限酵素
により試料ＤＮＡを切断し、２種類のＤＮＡプライマー
セットを用いて相補鎖合成反応により、制限酵素の認識
配列に続く所定の１塩基を有する塩基配列を５’末端側
にもつＤＮＡ断片を得る手順を説明する図である。

【００２３】図３は、本発明の第２の実施例で使用す
る、ｍ−ＲＮＡから２本鎖ｃ−ＤＮＡを合成する従来技
術（文献：Ｓ．Ｓｕｇａｎｏ ｅｔ．ａｌ．、「蛋白質
核酸酵素（ＰＲＯＴＥＩＮ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ
ＡＮＤ ＥＮＺＹＭＥ）」、ｖｏｌ．３８、Ｎｏ．
３、ｐ２７６−ｐ２８１（１９９３）（共立出版））の
反応の手順を説明する図である。図３に示すように、細
胞から抽出したｍ−ＲＮＡは、３’末端にポリＡ尾部３
３をもち、５’末端にキャップ塩基３１及びリン酸基３
２をもつ完全長ｍ−ＲＮＡ３４−１と、５’末端にリン
酸基３２をもつ不完全長ｍ−ＲＮＡ３５−１とを含む。
まず、ｍ−ＲＮＡ３４−１、３５−１をバクテリアアル
カリフォスファターゼで処理して、キャップ構造をもた
ない不完全長のｍ−ＲＮＡ３５−１の５’末端のリン酸
基３２を除去し、ｍ−ＲＮＡ３５−１を、水酸基３６を
露出させた構造３５−２に変化させる。

【００２４】次いで、タバコアシッドピロフォスファタ
ーゼで処理して、キャップ構造をもつ完全長ｍ−ＲＮＡ
３４−１の５’末端にだけリン酸基３２を露出させ、ｍ
−ＲＮＡ３４−１を、リン酸基３２を露出させた構造３
４−２に変化させる。次に、ＲＮＡリガーゼを用いて、
ｍ−ＲＮＡ３４−２の５’末端に合成ＲＮＡオリゴヌク
レオチド３７を導入したｍ−ＲＮＡ３４−３を得る。Ｒ
ＮＡリガーゼはリン酸基にＲＮＡオリゴヌクレオチドを
結合し、５’末端の水酸基にはＲＮＡオリゴヌクレオチ
ドを結合しないので、完全長ｍ−ＲＮＡ３４−２にのみ
に合成オリゴヌクレオチドが結合する。

【００２５】以上のようにして完全長のｍ−ＲＮＡ３４
−１にのみ合成オリゴヌクレオチド３７を導入した後
に、オリゴｄＴプライマー、リバーストランスクリプタ
ーゼを用いて、ｍ−ＲＮＡをｃ−ＤＮＡ３８に変換す
る。さらに、ＤＮＡポリメラーゼを用いてｃ−ＤＮＡ３
８の２本鎖を合成して、細胞から抽出した各種のｍ−Ｒ
ＮＡに関してそれぞれ得られた２本鎖ｃ−ＤＮＡ３９の
混合物を２本鎖の試料ＤＮＡ４０として得る。

【００２６】図４は、２種類の制限酵素により２本鎖の
試料ＤＮＡを切断し、２種類のＤＮＡプライマーセット
を用いて相補鎖合成反応により、制限酵素の認識配列に
続く所定の１塩基を有する塩基配列を５’末端側にもつ
ＤＮＡ断片を得る手順を説明する図である。図４に示す
方法は、単一の長い２本鎖ＤＮＡ試料にも適用できるこ
とは言うもない。まず、２本鎖ｃ−ＤＮＡの混合物から
なる２本鎖の試料ＤＮＡ４０を、制限酵素ＮｌａＩＩＩ
とＨｈａＩにより断片化する。制限酵素ＮｌａＩＩＩ、
ＨｈａＩは各々、２本鎖ＤＮＡをＣＡＴＧ↓、ＧＣＧ↓
Ｃのように切断する。切断により生成する各断片の３’
末端は、ＮｌａＩＩＩで切断された場合には、ＣＡＴＧ
（ＮｌａＩＩＩ切断末端）４６、ＨｈａＩで切断された
場合には、ＧＣＧ（ＨｈａＩ切断末端）４７となる。５
０は、各制限酵素の認識配列部位（ＮｌａＩＩＩ切断末
端、ＨｈａＩ切断末端）に続く５’末端側の１塩基であ
り、Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの何れかを表す。各ＤＮＡ断
片４１−１、４１−２、４１−３、……の３’末端に、
ライゲーションによりオリゴヌクレオチドを導入する
か、又はターミナルヌクレオチジルトランスフェラーゼ
を用いポリ鎖（ポリＡ鎖、ポリＣ鎖、ポリＧ鎖、ポリＴ
鎖いずれか１種類）を付加する。以下では、ポリＡ鎖４
２を付加する場合を例にとって説明する。

【００２７】ＤＮＡ断片の３’末端にポリＡ鎖４２を付
加すると、４１’−１、４１’−２に示すように、Ｎｌ
ａＩＩＩで切断された３’末端の塩基配列はＣＡＴＧＡ
Ａ…Ａ３’となり、４１’−３に示すように、ＨｈａＩ
で切断された３’末端の塩基配列はＧＣＧＡＡ…Ａ３’
となる。

【００２８】２組のＤＮＡプローブ（プライマー）セッ
ト４９’、４９”を用意する。ＤＮＡプライマーセット
４９’、４９”の各プライマーは蛍光体等により標識さ
れている。ＮｌａＩＩＩによる切断部位に相補鎖結合可
能なプライマーとして、塩基配列が５’Ｔ…ＴＴＣＡＴ
ＧＸ３’（Ｘ＝ＡｏｒＣｏｒＧｏｒＴ）であるプライマ
ーの４種類からなる第１のＤＮＡプライマーセット（Ｒ
１−Ｘ、Ｒ１＝＊Ｔ…ＴＴＣＡＴＧ、＊は蛍光標識を表
す）を用意する。ＨｈａＩによる切断部位に相補鎖結合
可能なプライマーとして、塩基配列が５’Ｔ…ＴＴＣＧ
ＣＸ３’（Ｘ＝ＡｏｒＣｏｒＧｏｒＴ）であるプライマ
ーの４種類からなる第２のＤＮＡプライマーセット（Ｒ
２−Ｘ、Ｒ２＝＊Ｔ…ＴＴＣＧＣ、＊は蛍光標識を表
す）を用意する。

【００２９】第１のＤＮＡプライマーセットのプライマ
ーの５’末端からＣＡＴＧまでの塩基配列はＮｌａＩＩ
Ｉにより切断されたＤＮＡ断片の全てと相補的であるの
で、ＮｌａＩＩＩにより切断されたＤＮＡ断片の末端に
ハイブリダイズするが、塩基配列Ｘの部分は、塩基Ｘに
相補な塩基をもつ断片にだけハイブリダイズする。例え
ば、Ｘ＝Ａの場合には、塩基Ｘの部分は塩基Ｎの部分５
０が相補な塩基Ｔをもつ断片にだけハイブリダイズす
る。塩基Ｎの部分５０が相補な塩基でない場合には、５
２のように塩基Ｘの部分がハイブリダイズしない。同様
に、第２のＤＮＡプライマーセットのプライマーの５’
末端からＣＧＣまでの塩基配列はＨｈａＩにより切断さ
れたＤＮＡ断片の全てと相補的であるので、ＨｈａＩに
より切断されたＤＮＡ断片の末端にハイブリダイズする
が、塩基配列Ｘの部分は、塩基Ｘに相補な塩基をもつ断
片にだけハイブリダイズする。塩基Ｘが完全にハイブリ
ダイズしたか否かは、ハイブリダイゼーションの安定性
を見るだけでは明確にわからない。それは、ＤＮＡプラ
イマーの殆どの部位がどの断片ともハイブリダイズする
共通部分を有し、末端の数塩基部分だけのハイブリダイ
ゼーションの安定性の差では十分大きな差にならないか
らである。しかし、ＤＮＡポリメラーゼを用いた相補鎖
合成反応を用いることにより、末端数塩基が完全にハイ
ブリダイズしているか否か見分けることができる。

【００３０】２種類の制限酵素により切断されたＤＮＡ
断片の３’末端にポリＡ鎖４２を付加した断片を含む溶
液を１６個のフラクション５５（５５−１、５５−２、
……、５５−１６のうち５５−２、５５−３を図示す
る）に分割する。１６個のフラクション５５−１、５５
−２、……、５５−１６には、第１のＤＮＡプライマー
セット４９’（Ｒ１−Ｘ：Ｘ＝ＡｏｒＣｏｒＧｏｒＴ）
のプライマーと、第２のＤＮＡプライマーセット４９”
（Ｒ２−Ｘ’：Ｘ’＝ＡｏｒＣｏｒＧｏｒＴ）のプライ
マーとの異なる１６種類の組合わせからなる２種類のプ
ライマーを、１６種類の組合わせに対応させて１６個の
フラクションに添加して、相補鎖合成反応を行なう。図
４では、フラクション５５−２に添加する２種類のプラ
イマー（４９−２）（Ｒ１−Ｃ、Ｒ２−Ｔ）と、フラク
ション５５−３に添加する２種類のプライマー（４９−
３）（Ｒ１−Ａ、Ｒ２−Ｔ）とを示す。プライマーはＤ
ＮＡ断片にハイブリダイズするが、両方の３’末端が完
全に５１（塩基Ｎの部分が完全にハイブリダイズした状
態）のようにハイブリダイズしたプライマーだけが、相
補鎖伸長して伸長した相補鎖を形成する。片方の３’末
端だけが５２（塩基Ｎの部分がハイブリダイズしていな
い状態）のようにハイブリダイズしたプライマーは、相
補鎖伸長せず伸長した相補鎖を形成しない。

【００３１】相補鎖合成反応をｎサイクルを行なうこと
によって、ＤＮＡ断片と同じ長さの相補鎖５３は２ｎ倍
に増幅される。プライマーが片方の３’末端だけが完全
にハイブリダイズしている場合（５２）には、相補鎖合
成をｎサイクル行なっても相補鎖はｎ倍に増幅されるだ
けなので、両方の３’末端が完全にハイブリダイズした
場合とは容易に区別できる。プライマーは、例えば、蛍
光標識してあるので、伸長した相補鎖の長さを蛍光式ゲ
ル電気泳動装置を用いて知ることができる。

【００３２】あとは第１の実施例の場合と同様に、各フ
ラクションから得た相補鎖合成反応生成物を別々の泳動
路で電気泳動して、即ちプライマーの組合わせ毎に対応
して別々の泳動路で電気泳動して、ゲル電気泳動スペク
トルを比較することによって、試料ＤＮＡの分析ができ
る。この場合、プライマーの組合わせは４×４＝１６通
りであるので、１６種類のＤＮＡ断片スペクトルが得ら
れる。このＤＮＡ断片のスペクトルは、元のｍ−ＲＮＡ
に固有であるので、分析だけでなくｍ−ＲＮＡの診断等
にも使用できる。なお、第１のＤＮＡプライマーセット
の各プライマーの５’末端の蛍光標識として、異なる４
種類を使用する場合には、異なる４種類の蛍光標識をも
つ第１のＤＮＡプライマーセットのプライマーを使用す
る相補鎖合成反応は同一の容器で行なうことができ、４
個の容器内での相補鎖合成反応生成物は、容器に対応す
る４個の泳動路で１本鎖の状態で電気泳動分離できる。

【００３３】第２の実施例において、３種類の制限酵素
により２本鎖の試料ＤＮＡを切断し、３種類のＤＮＡプ
ライマーセットを用いて相補鎖合成反応により、制限酵
素の認識配列に続く所定の１塩基を有する塩基配列を
５’末端側にもつＤＮＡ断片を得ることもできる。この
場合、第１、第２のＤＮＡプライマーセット（Ｒ１−
Ｘ、Ｒ２−Ｘ：Ｘ＝ＡｏｒＴｏｒＧｏｒＣ）に加えて、
第３のＤＮＡプライマーセット（Ｒ３−Ｘ：Ｘ＝Ａｏｒ
ＴｏｒＧｏｒＣ）を使用する。３種類の制限酵素により
切断されたＤＮＡ断片の３’末端にポリＡ鎖４２を付加
した断片を含む溶液を、蛍光標識された第１、第２、第
３のＤＮＡプライマーセット（Ｒ１−Ｘ、Ｒ２−Ｘ、Ｒ
３−Ｘ、：Ｘ＝ＡｏｒＴｏｒＧｏｒＣ）の各プライマー
の組合わせ、即ちＲ１−ＸとＲ２−Ｘに組合わせ１６通
り、Ｒ１−ＸとＲ３−Ｘに組合わせ１６通り、Ｒ２−Ｘ
とＲ３−Ｘに組合わせ１６通りの合計４８通りに対応す
る４８個のフラクションに分割した後に、上記と同様の
処理を行ない、各フラクションから得た相補鎖合成反応
生成物を別々の４８の泳動路で電気泳動して、即ちプラ
イマーの組合わせ毎に対応して別々の泳動路で電気泳動
して、ゲル電気泳動スペクトルを比較することによっ
て、試料ＤＮＡの分析ができる。この場合、プライマー
の組合わせは４８通りであるので、４８種類のＤＮＡ断
片スペクトルが得られる。このＤＮＡ断片のスペクトル
は、より詳細なｍ−ＲＮＡの分析だけでなくｍ−ＲＮＡ
の診断等に使用できる。

【００３４】図４で説明した第１、第２のＤＮＡプライ
マーセット（Ｒ１−Ｘ、Ｒ２−Ｘ：Ｘ＝ＡｏｒＴｏｒＧ
ｏｒＣ）の代わりに、それぞれＲ１−ＸＹ、Ｒ２−ＺＷ
（Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｗは、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃに何れかである）
の塩基配列をもつプライマーから構成される第１、第２
のＤＮＡプライマーセットを用いてもよい。このような
第１、第２のＤＮＡプライマーセットは、第１の実施例
で説明したように、塩基Ｘ及びＹの組合わせの１６種
類、塩基Ｚ及びＷＹの組合わせの１６種類からなり、プ
ライマーの組合わせは１６×１６＝２５６通りである。
従って、２種類の制限酵素により切断されたＤＮＡ断片
の３’末端にポリＡ鎖４２を付加した断片を含む溶液を
２５６個のフラクションに分割した後に、上記と同様の
処理を行なう。このような処理を行ない、２５６の泳動
路で電気泳動を行なった結果、図２に示したのと全く同
様の結果を得ることができる。なお、第１のＤＮＡプラ
イマーセットの各プライマーの５’末端の蛍光標識とし
て、異なる４種類を使用する場合には、異なる４種類の
蛍光標識をもつ第１のＤＮＡプライマーセットのプライ
マーを使用する相補鎖合成反応は同一の容器で行なうこ
とができ、６４個の容器内での相補鎖合成反応生成物
は、容器に対応する６４個の泳動路で１本鎖の状態で電
気泳動分離できる。

【００３５】以上のように、複数種類の制限酵素により
試料ＤＮＡを切断し、複数種類のＤＮＡプライマーセッ
トを用いて相補鎖合成反応により、制限酵素の認識配列
全て又は認識配列の３’末端側の一部に相補な塩基配列
に続く所定の塩基配列を５’末端側にもつＤＮＡ断片を
分離して得ることができ、試料ＤＮＡから得る複数種類
のＤＮＡ断片スペクトルが得られる。このＤＮＡ断片の
スペクトルは、より詳細な試料ＤＮＡの分析だけでなく
診断等に使用できる。

【００３６】（第３の実施例）第３の実施例は、細胞か
らポリＡ尾部を利用して抽出したｍ−ＲＮＡの分析に本
発明を利用した例を示す。

【００３７】図５は、本発明の第３の実施例であり、ｍ
−ＲＮＡから調整した２本鎖ｃ−ＤＮＡ混合物を２種類
の制限酵素により切断し、相補鎖合成反応により、制限
酵素の認識配列に続く所定の塩基配列を５’末端側にも
つＤＮＡ断片を得る手順を説明する図である。従来技術
（文献：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ．ａｌ．、ＭＯｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｏｎｇ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、７．１〜
７．３６（１９８７）（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ））に従っ
て、培養細胞を１％ＳＤＳを含むバッファーで処理して
細胞膜を破壊した後、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫで処理
し、遠心分離を行なって細胞中の核酸を抽出する。オリ
ゴｄＴカラムを用いて核酸成分からポリＡ尾部をもつ成
分、即ちｍ−ＲＮＡ６０（混合物）を得る。ｍ−ＲＮＡ
６０からリバーストランスクリプターゼ、ビオチン化オ
リゴｄＴプライマー７０、ＤＮＡポリメラーゼを用い
て、２本鎖ｃ−ＤＮＡ６１（混合物）を調整する。得ら
れた２本鎖ｃ−ＤＮＡ６１（混合物）を分画Ａ（６
２）、分画Ｂ（６３）に分ける。分画Ａ（６２）の２本
鎖ｃ−ＤＮＡを制限酵素ＮｌａＩＩＩで切断し、分画Ｂ
（６３）の２本鎖ｃ−ＤＮＡを制限酵素ＨｈａＩで切断
する。

【００３８】切断生成物のうち、ビオチンｂを含む２本
鎖ｃ−ＤＮＡのＮｌａＩＩＩによる切断断片６４、ビオ
チンｂを含む２本鎖ｃ−ＤＮＡのＨｈａＩによる切断断
片６５をビーズに結合したアビジン７１を用いて捕捉
し、ビオチンｂを含まない２本鎖ｃ−ＤＮＡのＮｌａＩ
ＩＩによる切断断片６６、ビオチンｂを含まない２本鎖
ｃ−ＤＮＡのＨｈａＩによる切断断片６７を除去する。
各分画中の２本鎖ｃ−ＤＮＡの末端に各制限酵素の切断
部位に相補結合する既知塩基配列をもつ２本鎖オリゴヌ
クレオチド７２（ＮｌａＩＩＩ切断部位に相補結合す
る）、７３（ＨｈａＩ切断部位に相補結合する）を結合
させる。

【００３９】分画Ａ（６２）の２本鎖ｃ−ＤＮＡを制限
酵素ＨｈａＩで切断し、分画Ｂ（６３）の２本鎖ｃ−Ｄ
ＮＡを制限酵素ＮｌａＩＩＩで切断する。各分画からビ
ーズを除去して、ビーズに結合したアビジン７１とビオ
チンｂとの結合により、ビーズに捕捉された２本鎖ｃ−
ＤＮＡを各分画から除いて、ビーズに捕捉されていない
ＨｈａＩによる切断断片６８、ビーズに捕捉されていな
いＮｌａＩＩＩによる切断断片６９を各分画に残す。各
制限酵素の切断部位に相補結合する既知塩基配列をもつ
２本鎖オリゴヌクレオチド７２、７３を結合させた、２
本鎖ｃ−ＤＮＡ断片８１、８１’を得る。

【００４０】制限酵素認識部位が、３’末端側からＮｌ
ａＩＩＩ、ＨｈａＩの順に存在する２本鎖ｃ−ＤＮＡで
は、分画Ｂにおいて２種類の制限酵素部位で切断された
２本鎖ｃ−ＤＮＡ断片８１が得られ、逆に、ＨｈａＩ、
ＮｌａＩＩＩの順に存在する２本鎖ｃ−ＤＮＡでは、分
画Ａにおいて２種類の制限酵素部位で切断された２本鎖
ｃ−ＤＮＡ断片８１’が得られる。なお、両末端とも同
一の制限酵素で切断された２本鎖ｃ−ＤＮＡ断片８０が
生じることもあるが、このような断片は、以下で行なう
相補鎖合成反応で区別できる。

【００４１】後は、分画Ａ、分画Ｂから得られた２本鎖
ｃ−ＤＮＡ断片を混合あわせ、第１、又は第２の実施例
と同様に、第１のＤＮＡプライマーセット（制限酵素Ｎ
ｌａＩＩＩの認識配列に相補な塩基配列部分をもつ）、
第２のＤＮＡプライマーセット（制限酵素ＨｈａＩの認
識配列に相補な塩基配列部分をもつ）を用いて相補鎖合
成反応を行ない、第１、第２のＤＮＡプライマーセット
のプライマーの組合わせに対応して、相補鎖合成反応生
成物を別々の泳動路で電気泳動分離して泳動スペクトル
を測定して、ＤＮＡの分析等に使用する。第１の実施例
で説明した１６種類からなるＤＮＡプライマーセットを
用いる場合には、得られる泳動スペクトルは１６×１６
＝２５６通りとなり、第２の実施例に示した４種類から
なるＤＮＡプライマーセットを用いる場合には、得られ
る泳動スペクトルは４×４＝１６通りとなる。また、選
択配列を１塩基として第１のＤＮＡプライマーセットを
４種類からなるプライマーから構成し、選択配列を２塩
基として第２のＤＮＡプライマーセットを１６種類から
なるプライマーから構成する場合には、第１、第２のＤ
ＮＡプライマーセットのプライマーの組合わせは４×１
６＝６４通りになるので、得られるＤＮＡ断片の電気泳
動スペクトルは６４通りとなる。

【００４２】以上説明したように、従来技術のＤＮＡプ
ライマーを用いるＤＮＡ診断方法では、せいぜい数種類
〜十種類のＤＮＡ断片を一度に調べられるだけで、数百
〜数千種類にも及ぶｃ−ＤＮＡやＤＮＡ断片の検査には
不向きであり、どこに異常があるか不明な長いＤＮＡの
検査には適用できなかったが、本発明では、ＤＮＡ断片
の３’末端に結合したオリゴヌクレオチドと、制限酵素
が認識する塩基配列の全部又は一部とにハイブリダイズ
し、３’末端に目的とするＤＮＡ断片とハイブリダイズ
するか否かを判別する１〜４塩基からなる塩基配列（選
択配列）をもつＤＮＡプライマーセットを複数種類用い
て、選択的にＤＮＡ断片を識別して相補鎖合成を行ない
増幅し、複数種類のＤＮＡプライマーセットのプライマ
ーの組合わせに対応させて、別々の泳動路でゲル電気泳
動で分離して、合成された相補鎖の長さを表わす泳動パ
ターンからフィンガープリントを得ることができ、従来
技術の問題点を克服する新しいフィンガープリント法、
ＤＮＡ検査法を可能とする。このように複数のＤＮＡプ
ライマーセットを用いて、簡便に試料ＤＮＡの分類が可
能になり、多数のＤＮＡ断片を含む試料の分析が可能に
なる。

【００４３】本発明で使用する制限酵素は、３’突出末
端、３’平滑末端、５’突出末端の何れかを与える。
３’平滑末端を与える制限酵素によるＤＮＡ断片の末端
に結合させるオリゴヌクレオチドとして、ポリ鎖（ポリ
Ａ鎖、ポリＣ鎖、ポリＧ鎖、ポリＴ鎖いずれか１種類）
を付加するのが簡便である。

【００４４】また、以上で説明した各実施例において、
電気泳動分離による泳動分離パターン（フインガープリ
ントパターン）が非常に複雑である場合には、上記各実
施例において使用する各ＤＮＡプライマーセットの各Ｄ
ＮＡプライマーにビオチン付加しておき、最終的に合成
された相補鎖だけを捕捉し、捕捉されたＤＮＡ断片を新
たな試料と見なして、上記各実施例において使用する制
限酵素の種類を変更して、再び各実施例における処理を
行う。この結果得られる電気泳動分離による泳動分離パ
ターン（フインガープリントパターン）がより識別しや
すくなり、試料の分析がより正確にできる。即ち、本発
明では、多数のＤＮＡ断片の長さ情報をそのままフィン
ガープリントとして利用するのではなく、複数の制限酵
素を用いて試料ＤＮＡを切断して、制限酵素の切断部に
続く末端塩基配列によりＤＮＡ断片のグループ分けをし
て、各グループ毎に断片長を計測しフィンガープリント
とするので、同じ断片長でも重ならず高いＤＮＡ断片の
識別能が得られる利点や、制限酵素の組合わせを変化さ
せて、識別能の調節ができる利点がある。

【００４５】以上説明した本発明を要約して説明する
と、本発明の核酸分析方法は、 １）核酸試料を２種類以上の制限酵素で試料ＤＮＡを切
断してＤＮＡ断片を得る工程と、 ２）ＤＮＡ断片の両末端にデオキシヌクレオチド又はそ
のアナログを含むオリゴヌクレオチドを結合する工程
と、 ３）結合したオリゴヌクレオチドの塩基配列、及び結合
したオリゴヌクレオチドの塩基配列に続く制限酵素が認
識する塩基配列の一部又は全部と相補な塩基配列と、
３’末端に１塩基〜３塩基からなる選択塩基配列をも
ち、かつ標識されたＤＮＡプライマーセット（選択塩基
配列が１塩基の時は４種類、２塩基の時は１６種類、３
塩基の時は６４種類の標識されたＤＮＡプライマーから
なる）の、少なくとも２セット以上をプライマーとし
て、異なる制限酵素が認識する塩基配列に挟まれた領域
の相補鎖合成反応を行なう工程と、 ４）相補鎖合成生成物を電気泳動分離してＤＮＡ断片を
検出する工程とを含むことに特徴を有し、さらに以下の
特徴がある。

【００４６】イ）核酸試料がＲＮＡであり、ＲＮＡをリ
バーストランスクリプターゼを用いてＤＮＡ鎖に変換す
ること。

【００４７】ロ）ＤＮＡプライマーの３’末端の１塩基
〜３塩基の塩基配列は、実質全ての塩基種の組合わせか
らなり、ＤＮＡプライマーは、放射性同位体、ビオチ
ン、蛍光体等の何れかで標識されていること。

【００４８】ハ）３’末端１基〜３塩基が全ての可能な
塩基配列をもつＤＮＡプライマーセットを同時に複数種
用いて、２種類の制限酵素が認識する塩基配列に挟まれ
る領域を相補鎖合成により生成した標識されたＤＮＡ断
片であること。

【００４９】ニ）制限酵素は、３’突出末端、３’平滑
末端、５’突出末端の何れかを与えること。

【００５０】また、本発明の核酸分析方法において用い
るＤＮＡプライマーセットの各ＤＮＡプライマーは、
５’Ｎ₁Ｎ₂…Ｎ_nＸ₁Ｘ₂…Ｘ_mＺ₁Ｚ₂…Ｚ_hＹ₁Ｙ₂…Ｙ
_k３’の構造を有し、Ｎ₁Ｎ₂…Ｎ_n（５≦ｎ≦２７）はＤ
ＮＡ断片の末端に結合したオリゴヌクレオチドと実質相
補な塩基配列であり、Ｘ₁Ｘ₂…Ｘ_m（１≦ｍ≦６）は制
限酵素が認識する塩基配列の一部と相補な塩基配列であ
り、Ｚ₁Ｚ₂…Ｚ_h（０≦ｈ≦３）は複数種のヌクレオチ
ドとハイブリダイズし得るヌクレオチドアナログであ
り、Ｙ₁Ｙ₂…Ｙ_k（１≦ｋ≦４）はＡ、Ｃ、Ｇ及びＴの
組合わせ（４のｋ乗）の種類からなり、Ｎ₁Ｎ₂…Ｎ_nを
構成する何れかのヌクレオチドが標識されていることに
特徴がある

【００５１】

【発明の効果】以上説明したように本発明によれば、試
料ＤＮＡを２種類以上の制限酵素で切断し、所定のＤＮ
Ａプライマーセットを用いて相補鎖合成反応を行ない、
ＤＮＡ断片を増幅し、多数のＤＮＡ断片をグループに区
分けし、各グループのＤＮＡ断片数を減らし、各グルー
プのＤＮＡ断片数の電気泳動分離スペクトルパターンの
比較から試料ＤＮＡの構成を知ることができる。試料Ｄ
ＮＡを２種類の制限酵素で切断して、ＤＮＡ断片の両端
部の塩基配列を明確に特定し、断片長を確定するととも
に、ＤＮＡ断片をグループの区分けの数を多くできる。
ＤＮＡ断片末端の配列を識別するためのプライマーの選
択塩基配列の数を、例えば、３塩基とすると、４³＝６
４通りにＤＮＡ断片をグループに区分けできる。この６
４通りの選択塩基配列をもつプライマーからなるＤＮＡ
プライマーセットを２組用いると、６４×６４＝４０９
６通りにＤＮＡ断片をグループに区分けできる。ゲル電
気泳動の分解能では、各区分当たり１００種類以上のＤ
ＮＡ断片を分離して識別できるので、４０９６区分では
合計４０９６×１００≒４０００００種類以上ものＤＮ
Ａ断片を区別できる。本発明では、長い核酸から制限酵
素により得られる多数のＤＮＡ断片から、長い核酸の検
査を可能とするフィンガープリントパターンを得ること
ができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の第１の実施例であり、試料ＤＮＡから
ＤＮＡ断片混合物の作成し、相補鎖合成反応によりＤＮ
Ａ断片を得る手順を説明する図。

【図２】本発明の第１の実施例における相補鎖合成反応
生成物のＤＮＡ断片のゲル電気泳動スペクトルの一部を
示す図。

【図３】本発明の第２の実施例で使用する、ｍ−ＲＮＡ
から２本鎖ｃ−ＤＮＡを合成して試料ＤＮＡを得る従来
技術の反応の手順を説明する図。

【図４】本発明の第２の実施例において、２種類の制限
酵素を用いて２本鎖ｃ−ＤＮＡ混合物を切断し、相補鎖
合成反応によりＤＮＡ断片を得る手順を示す図。

【図５】本発明の第３の実施例であり、ｍ−ＲＮＡから
調整した２本鎖ｃ−ＤＮＡ混合物を２種類の制限酵素を
用いて切断し、相補鎖合成反応によりＤＮＡ断片を得る
手順を説明する図。

【符号の説明】

１…大腸菌ゲノムＤＮＡ、２−１、２−２、〜…２本鎖
ＤＮＡ切断断片、３−１、３−２、〜…両末端に第１の
ヌクレオチドが結合したＤＮＡ断片、４−１、４−２、
〜、４’−１、４’−２、〜…ＮｌａＩＩＩにより切断
されたＤＮＡ断片、４”−１、４”−２、〜…両末端に
第２のヌクレオチドをもつＤＮＡ断片、５−１、５−
２、〜…一方の末端に第１のヌクレオチド、他方の末端
に第２のヌクレオチドが結合したＤＮＡ断片、６（６−
１、６−２、〜）…ビオチンを含まない相補鎖、１０…
ＮｏｔＩ認識配列に対合する１本鎖のビオチン化ヌクレ
オチド、１０１…オリゴヌクレオチド１０に相補な塩基
配列、１０２…ＮｏｔＩの認識する塩基配列に相補な塩
基配列、１１…塩基配列１０１と塩基配列１０２の全て
又は一部とを５’末端にもつ１本鎖オリゴヌクレオチ
ド、１００…２本鎖のビオチン化オリゴヌクレオチド、
１２…１本鎖オリゴヌクレオチド、１１１…オリゴヌク
レオチド１２に相補な塩基配列、１１２…ＮｌａＩＩＩ
の認識する塩基配列に相補な塩基配列、１３…塩基配列
１１１と塩基配列１１２の全部又は一部とを５’末端に
もつ１本鎖オリゴヌクレオチド、１１０…２本鎖の第２
のオリゴヌクレオチド、１４…ビーズ、１５…アビジ
ン、１６−１…ＮｏｔＩの認識配列全て又はＮｏｔＩの
認識配列の３’末端側の一部からなる塩基配列、１６−
２…２塩基からなる選択配列、１６（１６−、１６−
、〜）…蛍光標識した第１のＤＮＡプライマーセット
のプライマー、１７−１…ＮｌａＩＩＩの認識配列全て
又はＮｌａＩＩＩの認識配列の３’末端側の一部からな
る塩基配列、１７−２…２塩基からなる選択配列、１７
（１７−、１７−、〜）…第２のＤＮＡプライマー
セットのプライマー、２１…全てのＤＮＡ断片を区分け
しないで同時に測定した場合のスペクトル、２２…区分
けされたＤＮＡ断片によるスペクトル、２４…塩基長、
３１…キャップ塩基、３２…リン酸基、３３…ポリＡ尾
部、３４−１…完全長ｍ−ＲＮＡ、３５−１…不完全長
ｍ−ＲＮＡ、３４−２…ｍ−ＲＮＡ３４−１のリン酸基
３２を露出させた構造、３７…合成ＲＮＡオリゴヌクレ
オチド、３４−３…合成ＲＮＡオリゴヌクレオチド３７
を導入したｍ−ＲＮＡ、３６…水酸基、３５−２…ｍ−
ＲＮＡ３５−１の水酸基３６を露出させた構造、３８…
ｃ−ＤＮＡ、３９…２本鎖ｃ−ＤＮＡ、４０…２本鎖の
試料ＤＮＡ、４１−１、４１−２、〜…ｃ−ＤＮＡ断
片、４２…ポリＡ鎖、４１’−１、４１’−２、〜…ポ
リＡ鎖４２を３’末端に付加したＤＮＡ断片、４６…Ｎ
ｌａＩＩＩ切断末端、４７…ＨｈａＩ切断末端、４
９’、４９”…ＤＮＡプライマーセット ４９−１、４９−２、４９−３、〜…フラクションに添
加する２種類のプライマー、５０…Ｎ部分、５１…Ｎ部
分が完全にハイブリダイズした状態、５２…Ｎ部分がハ
イブリダイズしていない状態、５３…伸長した相補鎖、
５５（５５−１、５５−２、〜）…フラクション、６０
…ｍ−ＲＮＡ混合物、６１…２本鎖ｃ−ＤＮＡ混合物、
６２…分画Ａ、６３…分画Ｂ、６４…ビオチンを含むｃ
−ＤＮＡのＮｌａＩＩＩ切断断片、６５…ビオチンを含
むｃ−ＤＮＡのＨｈａＩ切断断片、６６…ビオチンを含
まないｃ−ＤＮＡのＮｌａＩＩＩ切断断片、６７…ビオ
チンを含まないｃ−ＤＮＡのＨｈａＩ切断断片、６８…
ビーズに捕捉されていないＨｈａＩ切断断片、６９…ビ
ーズに捕捉されていないＮｌａＩＩＩ切断断片、７０…
ビオチン化オリゴｄＴプライマー、７１…ビーズに結合
したアビジン、７２…ＮｌａＩＩＩ切断部位に対応する
オリゴヌクレオチド、７３…ＨｈａＩ切断部位に対応す
るオリゴヌクレオチド、８０…両末端とも同一の制限酵
素で切断されたｃ−ＤＮＡ断片、８１、８１’…２種類
の制限酵素で切断され各々の切断部位にオリゴヌクレオ
チドを結合したｃ−ＤＮＡ断片。

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】１）２本鎖ＤＮＡ試料を複数の制限酵素に
   より切断して２本鎖ＤＮＡ断片を得る工程と、 ２）前記２本鎖ＤＮＡ断片の両３’末端の塩基配列の違
   いを少なくとも２種類のＤＮＡプライマーの３’末端の
   １塩基〜４塩基の塩基配列により識別して、前記２本鎖
   ＤＮＡ断片の両３’末端の塩基配列が所定の塩基配列を
   もつ前記２本鎖ＤＮＡ断片を、前記２種類のＤＮＡプラ
   イマーを用いた相補鎖合成反応を用いて、選択的に分離
   する工程と、 ３）前記相補鎖合成反応の生成物の長さを計測する工程
   とを有し、前記複数の制限酵素によるＤＮＡ断片長の分
   布のパターンを検出することを特徴とする核酸分析方
   法。
2. 【請求項２】１）２本鎖ＤＮＡ試料を複数の制限酵素に
   より切断して２本鎖ＤＮＡ断片を得る工程と、 ２）前記２本鎖ＤＮＡ断片の両末端にオリゴヌクレオチ
   ドを結合する工程と、 ３）前記オリゴヌクレオチドの塩基配列、及び前記オリ
   ゴヌクレオチドの塩基配列に続く、前記制限酵素が認識
   する塩基配列の一部又は全部と相補な塩基配列と、３’
   末端に１塩基〜４塩基からなる選択塩基配列をもつ、標
   識されたＤＮＡプライマーの複数からなるＤＮＡプライ
   マーセットの複数セットを用いて、異なる前記制限酵素
   が認識する塩基配列に挟まれた、前記２本鎖ＤＮＡ断片
   の領域の相補鎖合成反応を行なう工程と、 ４）前記相補鎖合成反応の生成物を電気泳動分離する工
   程とを有し、前記２本鎖ＤＮＡ試料の分析を行なうこと
   を特徴とする核酸分析方法。
3. 【請求項３】クレーム２の核酸分析方法において、ＲＮ
   Ａ試料をリバーストランスクリプターゼを用いて、前記
   ２本鎖ＤＮＡ試料を得る工程を有することを特徴とする
   核酸分析方法。
4. 【請求項４】クレーム２の核酸分析方法において、前記
   選択塩基配列は、実質全ての塩基種の組合わせからなる
   ことを特徴とする核酸分析方法。
5. 【請求項５】１）２本鎖ＤＮＡ試料を第１の制限酵素に
   より切断して２本鎖ＤＮＡ断片を得る工程と、 ２）前記２本鎖ＤＮＡ断片の両末端に第１のオリゴヌク
   レオチドを結合する工程と、３）工程２）の生成物を第
   ２の制限酵素により切断して２本鎖ＤＮＡ断片を得る工
   程と、 ４）工程３）で得た前記２本鎖ＤＮＡ断片の末端に第２
   のオリゴヌクレオチドを結合する工程と、 ５）前記第１、第２のオリゴヌクレオチドをそれぞれ両
   末端に有する前記２本鎖ＤＮＡ断片を捕捉する工程と、 ６）工程５）で捕捉された前記２本鎖ＤＮＡ断片を１本
   鎖ＤＮＡ断片にした後、前記１本鎖ＤＮＡ断片を含む液
   を複数の容器に分画する工程と、 ７）前記第１のオリゴヌクレオチドの塩基配列、及び前
   記第１のオリゴヌクレオチドの塩基配列に続く、前記第
   １の制限酵素が認識する塩基配列の一部又は全部と相補
   な塩基配列と、３’末端に１塩基〜４塩基からなる第１
   の選択塩基配列をもつ、標識された第１のＤＮＡプライ
   マーの複数からなる第１のＤＮＡプライマーセットと、
   前記第２のオリゴヌクレオチドの塩基配列、及び前記第
   ２のオリゴヌクレオチドの塩基配列に続く、前記第２の
   制限酵素が認識する塩基配列の一部又は全部と相補な塩
   基配列と、３’末端に１塩基〜４塩基からなる第２の選
   択塩基配列をもつ、標識された第２のＤＮＡプライマー
   の複数からなる第２のＤＮＡプライマーセットとから、
   前記第１のＤＮＡプライマーと前記第２のＤＮＡプライ
   マーとの組合わせからなるＤＮＡプライマーを、前記各
   組合わせに対応させて前記各容器に添加して、前記第
   １、第２の制限酵素が認識する塩基配列に挟まれた、前
   記２本鎖ＤＮＡ断片の領域の相補鎖合成反応を、前記各
   容器で行なう工程と、 ８）前記各容器での前記相補鎖合成反応の生成物を電気
   泳動分離する工程とを有し、前記２本鎖ＤＮＡ試料の分
   析を行なうことを特徴とする核酸分析方法。
6. 【請求項６】クレーム５の核酸分析方法において、工程
   ８）において前記各容器での前記相補鎖合成反応の生成
   物を、それぞれ異なる泳動路で電気泳動分離することを
   特徴とする核酸分析方法。
7. 【請求項７】クレーム５の核酸分析方法において、工程
   ５）に続いて、工程５）の生成物を第３の制限酵素によ
   り切断して２本鎖ＤＮＡ断片を得る工程を有することを
   特徴とする核酸分析方法。
8. 【請求項８】１ａ）２本鎖ＤＮＡ試料を第１の制限酵素
   により切断して２本鎖ＤＮＡ断片を担体に保持する工程
   と、 ２ａ）前記２本鎖ＤＮＡ断片の末端に第１のオリゴヌク
   レオチドを結合する工程と、 ３ａ）工程２ａ）の生成物を第２の制限酵素により切断
   して２本鎖ＤＮＡ断片を得る工程と、 ４ａ）工程３ａ）で得た前記２本鎖ＤＮＡ断片の末端に
   第２のオリゴヌクレオチドを結合する工程と、 １ｂ）前記２本鎖ＤＮＡ試料を前記第２の制限酵素によ
   り切断して２本鎖ＤＮＡ断片を担体に保持する工程と、 ２ｂ）工程１ｂ）で得た前記２本鎖ＤＮＡ断片の末端に
   前記第２のオリゴヌクレオチドを結合する工程と、 ３ｂ）工程２ｂ）の生成物を前記第１の制限酵素により
   切断して２本鎖ＤＮＡ断片を得る工程と、 ４ｂ）工程３ｂ）で得た前記２本鎖ＤＮＡ断片の末端に
   前記第１のオリゴヌクレオチドを結合する工程と、 ５）工程４ａ）及び工程４ｂ）の生成物を混合して、前
   記担体に保持された２本鎖ＤＮＡ断片を除去した後に、
   前記２本鎖ＤＮＡ断片を１本鎖ＤＮＡ断片にした後、前
   記１本鎖ＤＮＡ断片を含む液を複数の容器に分画する工
   程と、 ６）前記第１のオリゴヌクレオチドの塩基配列、及び前
   記第１のオリゴヌクレオチドの塩基配列に続く、前記第
   １の制限酵素が認識する塩基配列の一部又は全部と相補
   な塩基配列と、３’末端に１塩基〜４塩基からなる第１
   の選択塩基配列をもつ、標識された第１のＤＮＡプライ
   マーの複数からなる第１のＤＮＡプライマーセットと、
   前記第２のオリゴヌクレオチドの塩基配列、及び前記第
   ２のオリゴヌクレオチドの塩基配列に続く、前記第２の
   制限酵素が認識する塩基配列の一部又は全部と相補な塩
   基配列と、３’末端に１塩基〜４塩基からなる第２の選
   択塩基配列をもつ、標識された第２のＤＮＡプライマー
   の複数からなる第２のＤＮＡプライマーセットとから、
   前記第１のＤＮＡプライマーと前記第２のＤＮＡプライ
   マーとの組合わせからなるＤＮＡプライマーを、前記各
   組合わせに対応させて前記各容器に添加して、前記第
   １、第２の制限酵素が認識する塩基配列に挟まれた、前
   記２本鎖ＤＮＡ断片の領域の相補鎖合成反応を、前記各
   容器で行なう工程と、 ７）前記各容器での前記相補鎖合成反応の生成物を電気
   泳動分離する工程とを有し、前記２本鎖ＤＮＡ試料の分
   析を行なうことを特徴とする核酸分析方法。
9. 【請求項９】クレーム８の核酸分析方法において、工程
   ７）において前記各容器での前記相補鎖合成反応の生成
   物を、それぞれ異なる泳動路で電気泳動分離することを
   特徴とする核酸分析方法。
10. 【請求項１０】１）２本鎖ＤＮＡ試料を複数種類の制限
    酵素により切断して２本鎖ＤＮＡ断片を得る工程と、 ２）前記２本鎖ＤＮＡ断片の両末端に複数種類のオリゴ
    ヌクレオチドを結合する工程と、 ３）前記２本鎖ＤＮＡ断片を含む液を複数の容器に分画
    する工程と、 ４）前記オリゴヌクレオチドの塩基配列、及び前記オリ
    ゴヌクレオチドの塩基配列に続く、前記制限酵素が認識
    する塩基配列の一部又は全部と相補な塩基配列と、３’
    末端に１塩基〜４塩基からなる選択塩基配列をもつ、標
    識された第ＤＮＡプライマーの複数からなるＤＮＡプラ
    イマーセットの複数セットの、それぞれのセットからの
    前記ＤＮＡプライマーの組合わせからなるＤＮＡプライ
    マーを、前記各組合わせに対応させて前記各容器に添加
    して、２種類の前記制限酵素が認識する塩基配列に挟ま
    れた、前記２本鎖ＤＮＡ断片の領域の相補鎖合成反応
    を、前記各容器で行なう工程と、 ５）前記各容器での前記相補鎖合成反応の生成物を電気
    泳動分離する工程とを有し、前記２本鎖ＤＮＡ試料の分
    析を行なうことを特徴とする核酸分析方法。
11. 【請求項１１】クレーム１０の核酸分析方法において、
    工程５）において前記各容器での前記相補鎖合成反応の
    生成物を、それぞれ異なる泳動路で電気泳動分離するこ
    とを特徴とする核酸分析方法。
12. 【請求項１２】クレーム１０の核酸分析方法において、
    工程１）において前記２本鎖ＤＮＡ試料を２種類の制限
    酵素により切断することを特徴とする核酸分析方法。
13. 【請求項１３】クレーム１０の核酸分析方法において、
    工程１）において前記２本鎖ＤＮＡ試料を３種類の制限
    酵素により切断することを特徴とする核酸分析方法。
14. 【請求項１４】クレーム１０の核酸分析方法において、
    前記オリゴヌクレオチドが、ポリＮ（Ｎ＝ＡｏｒＴｏｒ
    ＧｏｒＣ）鎖からなることを特徴とする核酸分析方法。
15. 【請求項１５】クレーム２、５、８、１０の核酸分析方
    法に用いるＤＮＡプライマーセットであり、ＤＮＡプラ
    イマーセットは複数のＤＮＡプライマーからなり、各Ｄ
    ＮＡプライマーは、５’Ｎ₁Ｎ₂…Ｎ_nＸ₁Ｘ₂…Ｘ_mＺ₁Ｚ₂
    …Ｚ_hＹ₁Ｙ₂…Ｙ_k３’の構造を有し、Ｎ₁Ｎ₂…Ｎ_n（５
    ≦ｎ≦２７）は、２本鎖ＤＮＡ断片の末端に結合したオ
    リゴヌクレオチドと実質相補な塩基配列であり、Ｎ₁Ｎ₂
    …Ｎ_nを構成する何れかのヌクレオチドが標識されてお
    り、Ｘ₁Ｘ₂…Ｘ_m（１≦ｍ≦６）は、制限酵素が認識す
    る塩基配列の一部又は全部と相補な塩基配列であり、Ｚ
    ₁Ｚ₂…Ｚ_h（０≦ｈ≦３）は、複数種類のヌクレオチド
    とハイブリダイズし得るヌクレオチドアナログであり、
    Ｙ₁Ｙ₂…Ｙ_k（１≦ｋ≦４）は、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴの組
    合わせの（４のｋ乗）の種類からなることを特徴とする
    ＤＮＡプライマーセット。