JPH1099094A

JPH1099094A - 薬用ニンジンサポニン代謝産物の製造法

Info

Publication number: JPH1099094A
Application number: JP27287196A
Authority: JP
Inventors: Hideo Hasegawa; 秀夫長谷川; Shokan Sei; 鍾煥成; Tomoyuki Matsumiya; 智之松宮; Masamori Uchiyama; 雅守内山
Original assignee: Happy World Inc
Current assignee: Happy World Inc
Priority date: 1996-09-25
Filing date: 1996-09-25
Publication date: 1998-04-21

Abstract

(57)【要約】【目的】バクテロイド(Bacteroidaceae)科プレボテラ
(Prevotella)属Ｓ-１菌株を、薬用ニンジンサポニンを
添加した培地に培養し、培地中にプロトパナキサジオー
ルサポニン代謝産物を生成蓄積させ、これを採取するこ
とによって、プロトパナキサジオールサポニン代謝産物
の効率的選択的製造を可能にする。【構成】プレボテラ属Ｓ-１菌株〔Prevotella sp.S-1
(Bacteroidaceae科),FERM P-15859〕を、薬用ニンジン
サポニンを添加した培地に培養し、培地中にプロトパナ
キサジオールサポニン代謝産物、すなわち、20-O-β-D-
グルコピラノシル-20(S)-プロトパナキサジオール、20-
O-[α-L-アラビノピラノシル(1→6)-β-D-グルコピラノ
シル]-20(S)-プロトパナキサジオール、並びに20-O-[α
-L-アラビノフラノシル(1→6)-β-D-グルコピラノシル]
-20(S)-プロトパナキサジオールを生成蓄積させ、これ
らを採取するプロトパナキサジオールサポニン代謝産物
の製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、バクテロイド(Bactero
idaceae)科プレボテラ(Prevotella)属Ｓ-１菌株（FERM
P-15859）を、薬用ニンジンサポニンを添加した培地に
培養し、培地中にプロトパナキサジオールサポニン代謝
産物を生成蓄積させ、これを採取するプロトパナキサジ
オールサポニン代謝産物を製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】薬用ニンジンは、様々な効能ゆえに、古
来より万能薬として珍重されてきた。しかし、薬用ニン
ジンを治療応用する場合、その薬効成分の一つである配
糖体（サポニン）は腸内菌によって代謝され、しかも腸
内菌叢は体質並びに食生活の影響を受けやすいので、サ
ポニンの代謝に個人差が生じ、治療効果にも影響を与え
ることが懸念される。そこで、本発明者はサポニンの代
謝を研究し、その薬効を検索したところ、サポニンの腸
内菌による代謝産物が腸管からの吸収本体であり、しか
も免疫増強作用、及び非常に強い腫瘍血管新生並びに癌
細胞浸潤抑制作用を示すことが明らかとなり、腸内細菌
叢の差異の影響を受けにくいサポニンの吸収本体という
形での新しいタイプの制癌剤として治療効果を発揮する
道を開発した（特願平7-351259号広報参照）。

【０００３】この有用な薬用ニンジンサポニン代謝産
物、すなわち、化合物Ｋ（compound K）と命名された20
-O-β-D-グルコピラノシル-20(S)-プロトパナキサジオ
ール（20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadi
ol）並びに化合物Ｙ（compoundY）と命名された20-O-
[α-L-アラビノピラノシル(1→6)-β-D-グルコピラノシ
ル]-20(S)-プロトパナキサジオール（20-O-[α-L-arabi
nopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl]-20(S)-proto
panaxadiol）の製造法として、すでに土壌菌、アスペル
ギルス・ニガー、ラットの腸内菌、並びにヒト糞便由来
腸内菌の産生する酵素を用いた方法が報告されている
〔Yoshioka,I.,Chem.Pharm.Bull.,20,2418(1972);神田
ら,薬学雑誌,95,246(1975);滝野ら,薬用人参'89(共立出
版株式会社),267(1989);金岡ら,和漢医薬学雑誌,11,241
(1994)参照〕。また、ジンセノシドＭｃと命名された20
-O-[α-L-アラビノフラノシル(1→6)-β-D-グルコピラ
ノシル]-20(S)-プロトパナキサジオール（20-O-[α-L-a
rabinofuranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl]-20(S)-p
rotopanaxadiol）の製造法は、ヒト糞便由来腸内菌を用
いた方法が本発明の発明者によって報告されている（特
願平7-351259号広報参照）。

【０００４】

【解決しようとする課題】土壌菌による方法は、化合物
Ｋの生成に２週間以上の培養を要し、また、アスペルギ
ルス・ニガーの産生するβ-グルコシダーゼの一種であ
る粗ヘスペリジナーゼによる酵素処理では、ニンジンサ
ポニンの代謝経路が腸内菌の産生する酵素と異なるた
め、化合物Ｋは生成できるが、ジンセノシドＦ₂が生成
するために化合物Ｙ並びにジンセノシドＭｃはほとんど
製造できない。さらに、糞便由来腸内菌による処理で
は、代謝産物生成が化合物Ｙ並びにジンセノシドＭｃに
留まらずに化合物Ｋにまで進行し、代謝産物生成の選択
性が低い難点がある。このように従来の製造法は、生産
効率が悪い上に、β-グルコシダーゼ以外の糖分解酵素
も産生するために選択生産能も低く、本発明の目的とす
る代謝産物、化合物Ｋ、化合物Ｙ、及びジンセノシドＭ
ｃを効率よく製造する方法としては適さない。

【０００５】そこで、本発明の発明者は、ニンジンサポ
ニンの代謝産物を効率良く選択生産的に製造するため
に、酵素誘導法により、ヒト腸内菌叢をジンセノシドＲ
ｂ₁を含む培地で継代培養することによって、β-グルコ
シダーゼを産生する菌の生育を促進させ、継代培養菌叢
からβ-グルコシダーゼを強く産生する菌株Ｓ-１（FERM
P-15859）を単離することに成功した。この菌株Ｓ-１
の形態学的並びに生化学的性状を調べ、文献〔Holdema
n,L.V.,Bergey's Manual of Systematic Bacteriology,
Williams and Wilkins,Vol.1,616-617(1984);Shar,H.
N.,Int.J.Syst.Bacteriol.40,205-208(1990)〕記載の性
状と比較した結果、バクテロイド(Bacteroidaceae)科プ
レボテラ(Prevotella)属に属する菌株であり、プレボテ
ラ・オリス（Prevotella oris）に最も近かった。そこ
で、Ｓ-１菌株並びにプレボテラ・オリス標準菌株ＪＣ
Ｍ８５４０（理化学研究所微生物系統保存施設より分
譲）を用いてニンジンサポニンの代謝産物生成を調べた
結果、標準菌株には代謝活性はなかったが、Ｓ-１菌株
はプロトパナキサジオールサポニンを化合物Ｋ、化合物
Ｙ、及びジンセノシドＭｃに効率良くしかも選択生産的
に代謝変換した。かくして、Ｓ-１菌株を用いる方法
が、代謝産物製造に優れていることが明らかにされたの
で、この発明を完成するに至った。

【０００６】

【課題を解決するための手段】すなわち、この発明は、
プレボテラ属Ｓ-１菌株を用いて、化合物Ｋ、化合物
Ｙ、及びジンセノシドＭｃを製造する方法を提供するも
のであり、この菌株は次のような特徴を有する。 1) 偏性嫌気性無芽胞グラム陰性桿菌である。 2) 運動能、硝酸塩還元能並びにインドール生産能はな
い。 3) ブドウ糖から主にコハク酸を産生する。ガスは産生
されない。 4) ２０％胆汁を含むペプトン・酵母エキス培地で生育
が抑制される。 5) 血液寒天培地培養で、色素を産生しない。 6) デンプン及びエスクリンを加水分解する。 7) Ｌ-アラビノース、Ｄーキシロース、Ｄーグルコー
ス、Ｄーマンノース、Ｄーフルクトース、マルトース、シ
ュークロース、ラクトース、並びにデンプンから酸を産
生するが、トレハロース、Ｄーソルビトール、Ｄーマンニ
トール、イノシトール、並びにＬーラムノースから酸を
産生しない。 8) ジンセノシドＲｂ₁及びＲｄを加水分解し、主要産
物は化合物Ｋである。また、ジンセノシドＲｂ₂及びＲ
ｃからの主要加水分解産物は、それぞれ化合物Ｙ及びジ
ンセノシドＭｃである。しかし、ジンセノシドＲｅある
いはＲｇ₁はほとんど分解されない。

【０００７】さらに、本発明の製造法には、酵素誘導に
よってジンセノシドＲｂ₁代謝菌を調製する方法も含ま
れる。すなわち、ヒト糞便由来腸内菌叢を０．１％程度
のジンセノシドＲｂ₁を含む培地で継代培養することに
よって、その糖鎖末端グルコースを選択的に加水分解す
るβ-グルコシダーゼの産生を増強することができる。
そして、この継代培養菌叢をゲンタマイシン、ネオマイ
シン、カナマイシン等のアミノグリコシド系抗生物質で
処理することによって、ジンセノシドＲｂ₁代謝菌がこ
れらの薬剤に耐性であることを利用して、プレボテラ属
Ｓ-１菌株を単離することができる。また、この菌株
は、ラット、マウス等の動物の腸内菌からも単離するこ
とができる。

【０００８】そして、本発明における薬用ニンジンサポ
ニン代謝産物は、以下の方法で製造される。薬用ニンジ
ン特にオタネニンジン〔パナックス・ジンセング，シー
・エー・メイヤー（Panax ginseng C.A.Meyer）〕の地
上部及び地下部並びにその組織培養物から公知の方法に
よって得られるプロトパナキサジオールサポニンを添加
した液体培地に、プレボテラ属Ｓ-１菌液を加え、約３
７℃にて２日ないし４日間嫌気培養することによって、
各サポニンの3位と20位の水酸基に結合している結合糖
のうち末端グルコースを選択的に酵素加水分解反応で除
去することができる。この反応培養液を水飽和n-ブタノ
ールで抽出し、n-ブタノール部を水洗後、活性炭により
脱色、脱臭処理し、減圧で濃縮する。これを酢酸エチル
に溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ〔例えば
メルク社製シリカゲル,60〜230メッシュ;溶出溶媒:酢酸
エチル並びにクロロホルム-酢酸エチル-エタノール（6
0:35:10,下層）、及びメルク社製シリカゲルRP-8;溶出
溶媒:80-85％メタノール〕に付して精製することによっ
て、化合物Ｋ、化合物Ｙ、及びジンセノシドＭｃが得ら
れる。

【０００９】また、薬用ニンジンサポニン代謝産物は、
上記のオタネニンジンの他に、三七ニンジン〔パナック
ス・プセウドジンセング，ワーリッヒ（Panax pseudo-g
inseng Wall.）またはパナックス・ノトジンセング，バ
ーキル（Panax notoginsengBurk.）〕及びアメリカニン
ジン〔パナックス・キンキユホリウム，リンネ（Panax
quinquefolium L.）〕、竹節ニンジン〔パナックス・ジ
ャポニカス，シー・エー・メイヤー（Panax japonicus
C.A.Meyer）〕、ヒマラヤニンジン〔パナックス・プセ
ウドジンセング，ワーリッヒ亜種ヒマライカスハ
ラ（Panax pseudo-ginseng Wall. subsp. Himalaicus H
ara）〕、及びベトナムニンジン〔パナックス・ベトナ
メンシス，ハエトグラシュブ（Panax vietnamensis
Ha etGrushv.）〕などのパナックス属植物を原料とし
て前記の方法によって得ることができる。また、20(S)-
プロトパナキサジオール核を骨格とし、類似した糖配位
を有するサポニンを含有する他の植物｛例えばウリ科の
アマチャズル〔ギノステムマ・ペンタフィルルム，マキ
ノ（Gynostemma pentaphyllum Makino）及びその類縁植
物〕｝からも前記の方法で得ることができる。

【００１０】次に、本発明におけるプロボテラ属Ｓ-１
菌株を用いたニンジンサポニン代謝産物の製造法を具体
的に説明するために以下の例が提供されるが、それによ
って制約を受けると解釈すべきではない。

【００１１】

【参考例】健康成人男性の糞便１ｇを嫌気性菌用一般培
地（例えばＧＡＭ液体培地,30mL）に懸濁し、一晩約３
７℃で嫌気培養した。この糞便由来腸内菌をジンセノシ
ドＲｂ₁（0.1%）を含むＧＡＭ液体培地で２日から３日
おきに継代培養した。１０ヶ月後、継代培養液の希釈液
をゲンタマイシン（100μg/ml）を添加したＧＡＭ寒天
培地に塗布し、２日間約３７℃で嫌気培養した。成長し
た菌集落を形態学上の種類別にすべて白金耳で採り、そ
の中からジンセノシドＲｂ₁代謝菌としてプロボテラ属
Ｓ-１菌株を単離した。

【００１２】

【実施例】

実施例１ジンセノシドＲｂ₁（0.2%）を添加したミュラー・ヒン
トン液体培地（3L）に、あらかじめＧＡＭ液体培地（10
0mL）で一夜間培養したプロボテラ属Ｓ-１菌液を加え、
約３７℃で２日間窒素気流下で嫌気培養を行った。反応
培養液を水飽和n-ブタノール（1L）で２回抽出し、n-ブ
タノール部を水洗（1L）後、活性炭により脱色、脱臭処
理後、減圧で濃縮した。これを酢酸エチル（500mL）に
溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（メルク社
製シリカゲル,60〜230メッシュ,150g）に乗せ、酢酸エ
チル（1L）で洗浄したのち、溶出溶媒（クロロホルム-
酢酸エチル-エタノール,60:35:10,下層,500mL）で溶出
し、減圧で溶媒を留去して粗代謝生成物（2.1g）を得
た。これをさらに逆相シリカゲルカラムクロマトグラフ
ィ（メルク社製シリカゲルRP-8,250g;溶出溶媒:85％メ
タノール）に付して分離精製し、化合物Ｋ（1.5g）を得
た。

【００１３】実施例２ジンセノシドＲｂ₂（0.2%）を添加したミュラー・ヒン
トン液体培地（3L）に、あらかじめＧＡＭ液体培地（10
0mL）で一夜間培養したプロボテラ属Ｓ-１菌液を加え、
約３７℃で２日間窒素気流下で嫌気培養を行った。反応
培養液を水飽和n-ブタノール（1L）で２回抽出し、n-ブ
タノール部を水洗（1L）後、活性炭により脱色、脱臭処
理後、減圧で濃縮した。これを酢酸エチル（500mL）に
溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（メルク社
製シリカゲル,60〜230メッシュ,150g）に乗せ、酢酸エ
チル（1L）で洗浄したのち、溶出溶媒（クロロホルム-
酢酸エチル-エタノール,60:35:10,下層,500mL）で溶出
し、減圧で溶媒を留去して粗代謝生成物（3.6g）を得
た。これをさらに逆相シリカゲルカラムクロマトグラフ
ィ（メルク社製シリカゲルRP-8,250g;溶出溶媒:80％メ
タノール）に付して分離精製し、化合物Ｙ（3.1g）を得
た。

【００１４】実施例３ジンセノシドＲｃ（0.2%）を添加したミュラー・ヒント
ン液体培地（3L）に、あらかじめＧＡＭ液体培地（100m
L）で一夜間培養したプロボテラ属Ｓ-１菌液を加え、約
３７℃で２日間窒素気流下で嫌気培養を行った。反応培
養液を水飽和n-ブタノール（1L）で２回抽出し、n-ブタ
ノール部を水洗（1L）後、活性炭により脱色、脱臭処理
後、減圧で濃縮した。これを酢酸エチル（500mL）に溶
解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（メルク社製
シリカゲル,60〜230メッシュ,150g）に乗せ、酢酸エチ
ル（1L）で洗浄したのち、溶出溶媒（クロロホルム-酢
酸エチル-エタノール,60:35:10,下層,500mL）で溶出
し、減圧で溶媒を留去して粗代謝生成物（3.8g）を得
た。これをさらに逆相シリカゲルカラムクロマトグラフ
ィ（メルク社製シリカゲルRP-8,250g;溶出溶媒:80％メ
タノール）に付して分離精製し、ジンセノシドＭｃ（3.
6g）を得た。

【００１５】実施例４プロトパナキサジオールサポニン（0.3%）を添加したＧ
ＡＭ液体培地（1L）に、あらかじめＧＡＭ液体培地（30
mL）で一夜間培養したプロボテラ属Ｓ-１菌液を加え、
約３７℃で２日間窒素気流下で嫌気培養を行った。反応
培養液を水飽和n-ブタノール（300mL）で２回抽出し、n
-ブタノール部を水洗（300mL）後、活性炭により脱色、
脱臭処理後、減圧で濃縮した。これを酢酸エチル（200m
L）に溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（メ
ルク社製シリカゲル,60〜230メッシュ,50g）に乗せ、酢
酸エチル（300mL）で洗浄したのち、溶出溶媒（クロロ
ホルム-酢酸エチル-エタノール,60:35:10,下層,200mL）
で溶出し、減圧で溶媒を留去して粗代謝生成物（1.1g）
を得た。これをさらに逆相シリカゲルカラムクロマトグ
ラフィ（メルク社製シリカゲルRP-8,250g;溶出溶媒:80
％メタノール）に付して分離精製し、化合物Ｋ（0.6
g）、化合物Ｙ（0.1g）及びジンセノシドＭｃ（0.2g）
を得た。

【００１６】

【発明の効果】これらの例からも分かるように、プロボ
テラ属Ｓ-１菌株を用いた製造法は、プロトパナキサジ
オールサポニン代謝産物、すなわち化合物Ｋ、化合物
Ｙ、並びにジンセノシドＭｃを効率良くしかも選択生産
的に製造できることが明らかであり、ニンジンサポニン
の代謝産物の製造法として極めて有用なものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者松宮智之東京都府中市白糸台３丁目13番地の８株式会社ハッピーワールド一都生命科学研究所内 (72)発明者内山雅守東京都府中市白糸台３丁目13番地の８株式会社ハッピーワールド一都生命科学研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】プレボテラ属Ｓ-１菌株〔Prevotella s
p.S-1(Bacteroidaceae科),FERM P-15859〕を、薬用ニン
ジンサポニンを添加した培地に培養し、培地中にプロト
パナキサジオールサポニン代謝産物、すなわち、20-O-
β-D-グルコピラノシル-20(S)-プロトパナキサジオー
ル、20-O-[α-L-アラビノピラノシル(1→6)-β-D-グル
コピラノシル]-20(S)-プロトパナキサジオール、並びに
20-O-[α-L-アラビノフラノシル(1→6)-β-D-グルコピ
ラノシル]-20(S)-プロトパナキサジオールを生成蓄積さ
せ、これらを採取するプロトパナキサジオールサポニン
代謝産物の製造法。