JPH11100395A - 新規二糖、甘味剤、該二糖の製法および酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ショ糖よりすっきりとした甘味を有し、後味
が残らないという特徴を有し、ノンカロリーであるかカ
ロリーがほとんどゼロに近い新規な果糖のホモビオー
ス、およびその酵素的製法および用途、および該酵素の
提供。 【解決手段】 １−Ｏ−α−Ｄ−フラクトフラノシル−
Ｄ−フラクトース（以下、αＦＦという）、αＦＦを有
効成分として含有する甘味剤、ジ−α−Ｄ−フラクトフ
ラノース１，２´：２，１´ジアンヒドリド（以下、α
−ＤＦＡという）に、α−ＤＦＡの一方のα１，２フラ
クトフラノシド結合を加水分解する酵素を作用させるこ
とを特徴とするαＦＦの製造方法、果糖に、果糖を縮合
してαＦＦを生成する酵素を作用させることを特徴とす
るαＦＦの製造方法、α−ＤＦＡの一方のα１，２フラ
クトフラノシド結合を加水分解する酵素、およびαＦＦ
のα−フラクトフラノシド結合を加水分解して果糖を生
成し、また果糖を縮合してαＦＦを生成する酵素。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、特に食品分野およ
び薬品分野において利用し得る、特定糖質、それを含有
する甘味剤、該特定糖質の製法、およびその製造に使用
する酵素に関する。

【０００２】

【従来の技術】果糖を構成単位として含有するヘテロビ
オースとしては非還元性のショ糖（１−α−Ｄ−グルコ
ピラノシド−２−β−Ｄ−フルクトフラノシド）等、還
元性のマルツロース（Ｇｌｃα１→４Ｆｒｕｆ）、ラク
ツロース（Ｇａｌβ１→４Ｆｒｕｆ）等が知られてい
る。果糖を構成単位として含有するホモビオースとして
は還元性のイヌロビオース（１−Ｏ−β−Ｄ−フラクト
フラノシル−Ｄ−フラクトース）等が知られている。果
糖を構成単位として含有する二糖の味質については、シ
ョ糖、イヌロビオースが甘味を有することが知られてい
る。

【０００３】また、近年、食物に対する嗜好の多様化に
より様々な味質が求められている。色々なオリゴ糖が開
発されているが、その中でも、芳醇なコク味を謳ったニ
ゲロオリゴ糖など、味質に特性を置いたものがある。オ
リゴ糖の多くはまろやかで、コクがあるが、ショ糖より
すっきりした味質のオリゴ糖は知られていない。

【０００４】また、現在知られているノンカロリーの糖
質としては糖アルコールの一種であるエリスリトールだ
けである。この糖質はそのほとんどすべてが体内に吸収
された後、代謝されずにそのまま尿中に排泄されるた
め、ノンカロリーとされている。しかし、エリスリトー
ルは溶解するとき高い吸熱作用を示すので、食した際に
口の中で冷涼感を感じる。このため、冷涼感が好ましく
ない製品には使用し難い場合があった。また、エリスリ
トールは四炭糖の単糖であるため、氷菓に使用する際、
氷点降下が大きすぎる問題もあった。マルチトールなど
の２糖類の糖アルコールは消化酵素で分解されないが、
腸内細菌により有機酸に変換され、体内に吸収されると
して、２ｋｃａｌ／ｇ扱いとなっており、２糖類以上の
ノンカロリー糖質は現在知られていない。

【０００５】また、α−Ｄ−フラクトフラノースβ−Ｄ
−フラクトフラノース１，２´：２，１´ジアンヒドリ
ド（ＤＦＡＩ）およびα−Ｄ−フラクトフラノースβ−
Ｄ−フラクトフラノース１，２´：２，３´ジアンヒド
リド（ＤＦＡＩＩＩ）については、そのα結合を加水分
解してイヌロビオースを生成する酵素が知られている
（澱粉科学 第３５巻 第２号 ｐ１１３〜ｐ１２０
（１９８８））。しかしながら、ジ−α−Ｄ−フラクト
フラノースジアンヒドリドの一方のα−フラクトフラノ
シド結合を加水分解する酵素や単結合のα−フラクトフ
ラノシド結合を加水分解する酵素は知られていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ショ糖より
すっきりした甘味を有し、後味が残らないという特徴を
有し、中程度の甘味度を示し、ノンカロリーであるかカ
ロリーがほとんどゼロに近い新規二糖およびそれを含有
する甘味剤、該二糖の製法、およびその製造に使用する
酵素を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、ショ糖よりす
っきりした甘味を有し、後味が残らず、ノンカロリーで
あるかカロリーがほとんどゼロに近い新規二糖として
の、以下の化学式で表される１−Ｏ−α−Ｄ−フラクト
フラノシル−Ｄ−フラクトース（以下、αＦＦという）
に関する。

【０００８】

【化１】

【０００９】本発明はまた、αＦＦを有効成分として含
有する甘味剤に関する。本発明はさらに、ジ−α−Ｄ−
フラクトフラノース１，２´：２，１´ジアンヒドリド
（以下、α−ＤＦＡという）（構造を後記する）に、α
−ＤＦＡの一方のα１，２フラクトフラノシド結合を加
水分解する酵素を作用させることを特徴とするαＦＦの
製造方法、果糖に、果糖を縮合してαＦＦを生成する酵
素を作用させることを特徴とするαＦＦの製造方法、α
−ＤＦＡの一方のα１，２フラクトフラノシド結合を加
水分解する酵素、およびαＦＦのα−フラクトフラノシ
ド結合を加水分解して果糖を生成し、また果糖を縮合し
てαＦＦを生成する酵素に関する。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下に、本発明を詳細に説明す
る。本発明のαＦＦの製造方法については後述する。α
ＦＦは水に良く溶ける甘味物質である。αＦＦの比旋光
度は［α］ ＋１０．０である。αＦＦのＣ−ＮＭＲス
ペクトルを図１に示す。αＦＦの甘味度を他の二糖と比
較して表１に示す。甘味度は５ｗ／ｖ％または１０ｗ／
ｖ％のショ糖溶液を標準として、２０℃で１０人のパネ
ラーで測定した。測定方法は澱粉糖技術研究会報、第１
４号、ｐ４４（１９５６）に準じた。

【００１１】

【表１】

【００１２】また、αＦＦの味質は次のようにして評価
した。すなわち、５ｗ／ｖ％ショ糖、１０ｗ／ｖ％αＦ
Ｆ、１２．５ｗ／ｖ％マルトースおよび４ｗ／ｖ％果糖
をそれぞれ調製し、これらの２０℃における甘味度が一
致していることを確認した上で、１２人のパネラーによ
り下記表２の各項目についてショ糖と同程度であれば
０、やや強ければ＋１、強ければ＋２、やや弱ければ＋
１、弱ければ＋２で評価し、平均点を算出した。その結
果、表２に示したように、αＦＦは「すっきりしてい
る」、「あっさりしている」および「後味が残らない」
の項目について明らかに高い評価が得られた。

【００１３】

【表２】

【００１４】以上より、αＦＦはショ糖、さらには果糖
よりすっきりとし、後味が残らないという今までに無い
特徴を持ったオリゴ糖であることが理解される。

【００１５】αＦＦはこれまで知られていない、果糖の
α結合体であるので、各種消化酵素による消化性につい
て調べたところ、まったく分解されなかった（実施例
５）。また、大腸における腸内細菌による資化性につい
て調べた結果、どの菌にも資化されなかった（実施例
６）。通常、難消化性糖質であるマルチトールなどは腸
内細菌で発酵を受け有機酸を生じ、これが体内に吸収さ
れてカロリーとなる。しかし、αＦＦは消化酵素でも分
解されず、腸内細菌にも資化されないので、通常の難消
化性糖質とは異なり、ノンカロリーであるかカロリーが
ほとんどゼロに近い糖質であると理解される。この性質
はα−フラクトフラノシド結合のみで結合した、αＦＦ
以外の果糖の重合体（すなわちオリゴ糖および多糖）も
共通して有する性質であると考えられる。したがって、
例えばαＦＦ以外のα−Ｄ−フラクトフラノシル−Ｄ−
フラクトースもノンカロリー糖質であると考えられる。

【００１６】かかるαＦＦの性質を利用して、本発明は
また、αＦＦを有効成分として含有する甘味剤に関す
る。この甘味剤はαＦＦのみからなっていても良く、補
助成分または他の活性成分、例えば他の甘味成分と混合
された形態にあっても良い。

【００１７】補助成分としては、水、常用される賦形剤
・結合剤等を用いることができる。賦形剤としては甘味
成分としても用いられるショ糖、乳糖、果糖、ソルビト
ール、マルチトール等の他、可溶性デンプン、デキスト
リン、ガム質マンナン、ペクチン、アルギン酸等の多糖
類、ゼラチン、低分子量ポリペプチド等のタンパク質、
炭酸カルシウム、リン酸カルシウム等の塩、クエン酸、
リンゴ酸、フマル酸等の酸等から適宜選択して用いるこ
とができる。結合剤としてはグアーガム、アラビアガ
ム、デキストリン等を必要に応じ適宜選択して用いるこ
とができる。その他、フレーバー、エッセンス、ビタミ
ン、調味料等を必要に応じ適宜選択して用いることがで
きる。他の甘味成分としては甘味付与に使用されるブド
ウ糖、果糖、ショ糖等の糖類、イソマルトオリゴ糖等の
オリゴ糖類、ソルビトール、マルチトール等の糖アルコ
ール、アスパルテーム、ステビオサイド、サッカリン等
を用いることができる。また、他の呈味成分として酸
味、塩から味、渋味、旨味、苦味などを与える成分が挙
げられる。

【００１８】本発明の甘味剤は、種々の形状で、例えば
粉末、顆粒、シロップ等として用いることができる。

【００１９】本甘味剤は、人および他の動物によって摂
取あるいは投与される飲食品または薬品の甘味付与およ
び／または糖含量上昇のために広く使用することができ
る。該飲食品類の例としては、各種調味料（例えば、醤
油、味噌、マヨネーズ、ドレッシング、天つゆ、ケチャ
ップ、焼肉のタレ、カレールー、シチューの素、スープ
の素、ダシの素等）、各種和菓子（例えば、煎餅、あら
れ、餅類、饅頭、ういろう、羊羮、ゼリー、カステラ、
飴玉等）、各種洋菓子（例えば、ビスケット、クラッカ
ー、クッキー、パイ、プリン、シュークリーム、スポン
ジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム
等）、パン類、氷菓子（例えば、アイスクリーム、シャ
ーベット等）、シロップ類（例えば、果実のシロップ漬
等）、ペースト類（例えば、フルーツペースト、ピーナ
ツペースト等）、ジャム、マーマレード、漬物類（例え
ば、福神漬、千枚漬、らっきょう漬等）、畜肉練り製品
（例えば、ハム、ソーセージ等）、魚肉練り製品（例え
ば、かまぼこ、竹輪等）、各種珍味類、佃煮類、アルコ
ール飲料、コーヒー、ココア、ジュース、炭酸飲料、ス
タミナドリンク、乳酸飲料、乳酸菌飲料、インスタント
飲食品（例えば、インスタントジュース、インスタント
コーヒー等）等が挙げられる。また、該薬品の例として
は、散剤、錠剤、水剤、シロップ剤などのほか、歯磨
剤、含嗽剤等が挙げられる。

【００２０】本甘味剤の使用量については、対象の飲食
品類または薬品類にとって甘味付与のための必要な程度
まで任意に使用することができる。具体的な使用量は飲
食品類または薬品類によって異なるが、通常、本甘味剤
が、本甘味剤による甘味を付与した個々の飲食品または
薬品中において、αＦＦとして約０．５〜約７０ｗ／ｗ
％、さらには約５．０〜約３０ｗ／ｗ％の含量となるよ
うな範囲から選択するのが好ましい。

【００２１】甘味付与および／または糖含量上昇のため
の対象品への本甘味剤の使用方法は通常の甘味剤と同様
に行えば良い。例えば、飲食品類または薬品類の製造時
においてあるいはこれらの摂取時において、混和、混
捏、溶解、浸漬、浸透、散布、噴霧、注入などの適宜の
方法を採用して対象品類に含有せしめることができる。

【００２２】次にαＦＦの製法について説明する。αＦ
Ｆは、（１）α−ＤＦＡに、α−ＤＦＡの一方のα１，
２フラクトフラノシド結合を加水分解する酵素（以下、
α−ＤＦＡ分解酵素という）を作用させるか、または
（２）果糖に、果糖を縮合してαＦＦを生成する酵素
（以下、αＦＦ分解酵素という）を作用させることによ
り製造することができる。

【００２３】まず、（１）の方法について説明する。こ
の方法で使用する酵素は、 （１）作用として、α−ＤＦＡの一方のα１，２フラク
トフラノシド結合を加水分解する作用を有する。

【００２４】上記酵素は詳しくはさらに以下の酵素学的
性質を有する。 （２）基質特異性 α−Ｄ−フラクトフラノースβ−Ｄ−フラクトフラノー
ス１，２´：２，１´ジアンヒドリド（ＤＦＡＩ）およ
びα−Ｄ−フラクトフラノースβ−Ｄ−フラクトフラノ
ース１，２´：２，３´ジアンヒドリド（ＤＦＡＩＩ
Ｉ）には作用しない。イヌロビオースを分子内縮合させ
てＤＦＡＩを生成する。 （３）至適ｐＨ ＭｃＩｌｖａｉｎｅ氏緩衝液（ｐＨ４．５〜８．０）を
用いて反応を行い、相対活性を調べたところ、至適ｐＨ
は６．０〜６．５であった（図２）。 （４）安定ｐＨ範囲 ＭｃＩｌｖａｉｎｅ氏緩衝液（ｐＨ４．５〜８．０）を
用いて４０℃で１時間インキュベートし、残存活性を測
定したところ、本酵素はｐＨ５．０〜７．５で安定であ
った（図２）。

【００２５】（５）至適温度 ２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で各種
温度（３０〜６０℃）で反応を行い、相対活性を調べた
ところ、至適温度は５５℃であった（図３）。 （６）温度安定性 ２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で各種
温度（３０〜６０℃）で１時間インキュベートし、残存
活性を測定したところ、１００％の活性を保持する温度
は５０℃までであった（図３）。

【００２６】（７）分子量 ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐ
ｇ（ファルマシア バイオテク（株））を用いたゲルろ
過クロマトグラフィーにより、各種標準タンパク質との
相対溶出保持時間から分子量を求めた結果、本酵素の分
子量は約２１０，０００であった。また、ＳＤＳゲル電
気泳動により各種標準タンパク質との相対移動度から分
子量を求めた値は約５１，０００であった。上記ゲルろ
過クロマトグラフィーとＳＤＳゲル電気泳動の結果か
ら、本酵素は４量体を形成しているものと考えられる。 （８）等電点 本酵素をＭｕｌｔｉｐｈｏｒＩＩ電気泳動システム（フ
ァルマシア バイオテク（株））で、等電点測定用のゲ
ルとしてＡｍｐｈｏｌｉｎｅ ＰＡＧ ｐｌａｔｅ（フ
ァルマシア バイオテク（株））を用いて等電点電気泳
動を行い、染色すると共に、ゲルを５ｍｍ間隔で切り出
し、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で抽
出し、活性を測定した。活性が検出された位置と染色さ
れた染色バンドの位置は一致し、等電点は５．０と測定
された。

【００２７】なお、本発明のα−ＤＦＡ分解酵素はα−
ＤＦＡのα１，２フラクトフラノシド結合のみならず、
他のα結合を有するジフラクトースジアンヒドリド（以
下、ＤＦＡという）のαフラクトフラノシド結合をも加
水分解する可能性がある。

【００２８】なお、上記酵素学的性質の決定に当り、本
発明のα−ＤＦＡ分解酵素の活性は以下のようにして測
定した。１ｗ／ｖ％α−ＤＦＡ（２０ｍＭリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．０）中）０．５ｍｌと酵素液０．５
ｍｌとを混合し、４０℃で３０分反応させた後、沸騰水
浴中で３分処理して反応を停止した。この溶液をＨＰＬ
Ｃで分析してα−ＤＦＡの分解量を測定した。酵素１単
位は１分間に１μｍｏｌのα−ＤＦＡを加水分解する酵
素量とした。ＨＰＬＣ条件を以下に示す。 （ＨＰＬＣ条件） カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＱ（４．６×２
５０ｍｍ）（（株）ワイエムシイ製） 移動相：蒸留水 流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ 検出：ＲＩ。

【００２９】本発明のα−ＤＦＡ分解酵素は、α−ＤＦ
Ａ分解酵素産生能を有するバチルス属細菌を栄養培地に
培養し、培養物から生成したα−ＤＦＡ分解酵素を採取
することにより製造することができる。

【００３０】製造に使用される微生物としてはバチルス
属に属し、α−ＤＦＡ分解酵素産生能を有する微生物で
あればいずれの微生物でもよい。具体的には本発明者ら
が土壌より分離したＡ１株が挙げられる。この菌株の菌
学的性質は表３に示す通りである。これらの性質によ
り、「ザ・ジーナス・バチルス」（１９７３）Ｕ．Ｓ．
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ
に基づき、Ａ１株をバチルス・ブレビス（）Ａ１と命名
した。Ａ１株は、通産省工業技術院生命工学工業技術研
究所に、ＦＥＲＭ Ｐ−１６３４２として寄託されてい
る。本発明で使用する微生物は野生株に限らず、野生株
例えば上記野生株を紫外線、エックス線、放射線、薬品
［ＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ´−ニトロ−Ｎ−ニトロソグ
アニジン）、ＥＭＳ（エチル メタンスルホネート）
等］等を用いる既知の人工的変異手段で変異した変異株
も、α−ＤＦＡ分解酵素遺伝子を導入した微生物も、α
−ＤＦＡ分解酵素産生能を有する限り使用できる。

【００３１】

【表３】

【００３２】α−ＤＦＡ分解酵素産生能を有する微生物
を培養するための栄養培地としては、炭素源、窒素源、
無機物、および必要に応じ使用菌株の必要とする微量栄
養素を程よく含有するものであれば、天然培地、合成培
地のいずれでもよい。炭素源としてはマルトース、グル
コース、フラクトース、乳糖、デンプン、デキストリ
ン、グリセリン等の炭水化物等が用いられる。なお、本
酵素は誘導酵素であるため、炭素源の一部として培地に
０．０１〜０．５ｗ／ｖ％となるようにα−ＤＦＡを加
えることが好ましい。窒素源としては塩化アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸
ナトリウム、グルタミン酸などのアミノ酸、尿酸などの
無機有機窒素化合物が用いられる。窒素源としてはペプ
トン、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンス
チープリカー、大豆粉、大豆粕、乾燥酵母、カザミノ
酸、ソリュブルベジタブルプロテイン等の窒素含有天然
物も使用できる。無機物としてはリン酸二水素カリウ
ム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第
一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、塩化ナトリウム、塩化
カリウム、塩化カルシウム等が用いられる。その他にビ
オチン、チアミン等の微量栄養素を必要に応じ使用す
る。

【００３３】培養法としては液体培養法（振盪培養法も
しくは通気攪拌培養法）が良く、工業的には通気攪拌培
養法がもっとも適している。培養温度は２０〜４０℃の
範囲で行うことができる。ｐＨは６．５〜７．５が好適
である。培養時間は培養条件によって変ってくるが、通
常１５〜４８時間程度であり、α−ＤＦＡ分解酵素の生
成が確認されたとき、好ましくは生成が最大に達したと
きに培養を停止する。

【００３４】このようにして得られた培養物から本発明
のα−ＤＦＡ分解酵素を採取するには、まず遠心分離法
やろ過法などにより培養物を培養液画分と菌体画分に分
ける。α−ＤＦＡ分解酵素は前述の両画分に検出される
が、主に菌体画分から得られるので、菌体を超音波破
砕、ガラスビーズ破砕、フレンチプレスなどの物理的処
理やリゾチームなどの酵素処理により破壊し、菌体抽出
液を得て、これをさらに、限外ろ過、塩析、透析、溶媒
沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマト
グラフィー、ゲルクロマトグラフィー、吸着クロマトグ
ラフィー、等電点クロマトグラフィー等の周知の単離・
精製方法の単独或いは組合せに付すことにより、α−Ｄ
ＦＡ分解酵素の濃縮或いは精製標品を得ることができ
る。本発明のα−ＤＦＡ分解酵素の単離・精製の具体例
を実施例１に示す。

【００３５】α−ＤＦＡに、上記α−ＤＦＡ分解酵素を
作用させることによりαＦＦを製造することができる。
さらに詳しくは、α−ＤＦＡに、上記α−ＤＦＡ分解酵
素を、水性媒体中で、３０〜５０℃、ｐＨ５．０〜７．
５で作用させることによりαＦＦを製造することができ
る。

【００３６】このαＦＦの製造に利用する該α−ＤＦＡ
分解酵素としては、精製酵素であっても、αＦＦの製造
に悪影響を及ぼさない他の酵素を含有している粗酵素で
あっても良い。粗酵素としては上記培養液画分等のα−
ＤＦＡ分解酵素含有画分から塩析または溶媒沈殿により
沈殿させた粗酵素、またはこれをさらに前記のような精
製手段で精製した精製途中段階の粗酵素が挙げられる。
さらにこれらの酵素を常法により担体に固定化した固定
化酵素を用いることも可能である。

【００３７】α−ＤＦＡは化学名はジ−α−Ｄ−フラク
トフラノース１，２´：２，１´ジアンヒドリドであ
り、下記の式で示される。

【００３８】

【化２】

【００３９】α−ＤＦＡは、７０〜９０重量％の高濃度
果糖水溶液をｐＨ２．５〜３．５、１１０〜１５０℃好
ましくは１３０〜１４０℃、大気圧下で１〜１８０分好
ましくは２０〜６０分保持することにより、ＤＦＡ類が
その約５０％を占める縮合物を生成させ、ついで該処理
液をｐＨ２に調整した後沸騰水浴中で３０〜６０分保持
してＤＦＡ類以外の縮合物を果糖に分解し、ついで該処
理液をＮａ型陽イオン交換樹脂カラムに通してＤＦＡ類
の画分と果糖の画分とを得、ついで、ＤＦＡ類の画分を
ＯＤＳカラムに通して各ピークを分離して、その中の１
つのピーク画分としてα−ＤＦＡの画分を得ることによ
り製造することができる。α−ＤＦＡのさらに具体的な
製造例を参考例１に示す。

【００４０】なお、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ，１７４（１９８８），３２３−３２９に、
得られたシロップ状の物質９がα，α−ｄｉｆｒｕｃｔ
ｏｆｕｒａｎｏｓｅ ｄｉａｎｈｙｄｒａｔｅかβ，β
−ｄｉｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｅ ｄｉａｎｈｙｄ
ｒａｔｅか不明であるが、β，β−ｄｉｆｒｕｃｔｏｆ
ｕｒａｎｏｓｅ ｄｉａｎｈｙｄｒａｔｅと推定される
旨記載されている（３２５頁）が、この化合物は、Ｃ−
ＮＭＲが本願の参考例１で得られたα−ＤＦＡと実質上
一致し、α，α−ｄｉｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｅ
ｄｉａｎｈｙｄｒａｔｅすなわち、α−ＤＦＡであるこ
とが判明した。

【００４１】水性媒体としては水、緩衝液等が挙げられ
る。緩衝液としては酢酸緩衝液、リン酸カリウム・クエ
ン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、トリス
・塩酸緩衝液等を用いることができる。酵素の使用量に
ついては、特に制限ないが、α−ＤＦＡ１ｇに対し、
０．５〜３０単位、好ましくは１〜１０単位使用するの
が適当である。上記条件下で十分なαＦＦの生成が見ら
れた時点で反応を終了するが、反応は通常１０〜４８時
間で終了する。

【００４２】反応終了後、反応液の加熱による酵素の失
活、ｐＨの低下（塩酸等の酸の添加）による酵素の失活
等の適当な手段で反応を停止させ、活性炭処理、イオン
交換樹脂処理等の単離・精製手段を適宜組み合わせて、
αＦＦを得ることができる。α−ＤＦＡの加水分解によ
るαＦＦの製造の具体例を実施例２に示す。

【００４３】次に、（２）の方法について説明する。こ
の方法で使用する酵素は、 （１）作用として、αＦＦのα−１，２フラクトフラノ
シド結合を加水分解して果糖を生成し、また果糖を縮合
させてαＦＦを生成する作用を有する。

【００４４】上記酵素は詳しくはさらに以下の酵素学的
性質を有する。 （２）基質特異性 イヌロビオースには作用しない。 （３）至適ｐＨ ＭｃＩｌｖａｉｎｅ氏緩衝液（ｐＨ４．５〜８．０）を
用いて反応を行い、相対活性を調べたところ、至適ｐＨ
は６．５〜７．０であった（図４）。 （４）安定ｐＨ範囲 ＭｃＩｌｖａｉｎｅ氏緩衝液（ｐＨ４．５〜８．０）を
用いて４０℃で１時間インキュベートし、残存活性を測
定したところ、本酵素はｐＨ５．０〜７．５で安定であ
った（図４）。

【００４５】（５）至適温度 ２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で各種
温度（３０〜６０℃）で反応を行い、相対活性を調べた
ところ、至適温度は５０℃であった（図５）。 （６）温度安定性 ２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で各種
温度（３０〜６０℃）で１時間インキュベートし、残存
活性を測定したところ、１００％の活性を保持する温度
は４０℃までであった（図５）。

【００４６】（７）分子量 ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐ
ｇ（ファルマシア バイオテク（株））を用いたゲルろ
過クロマトグラフィーにより、各種標準タンパク質との
相対溶出保持時間から分子量を求めた結果、本酵素の分
子量は約４１０，０００であった。また、ＳＤＳゲル電
気泳動により各種標準タンパク質との相対移動度から分
子量を求めた値は約１００，０００であった。上記ゲル
ろ過クロマトグラフィーとＳＤＳゲル電気泳動の結果か
ら、本酵素は４量体を形成しているものと考えられる。 （８）等電点 本酵素をＭｕｌｔｉｐｈｏｒＩＩ電気泳動システム（フ
ァルマシア バイオテク（株））で、等電点測定用のゲ
ルとしてＡｍｐｈｏｌｉｎｅ ＰＡＧ ｐｌａｔｅ（フ
ァルマシア バイオテク（株））を用いて等電点電気泳
動を行い、染色すると共に、ゲルを５ｍｍ間隔で切り出
し、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で抽
出し、活性を測定した。活性が検出された位置と染色さ
れた染色バンドの位置は一致し、等電点は４．８と測定
された。

【００４７】なお、本発明のαＦＦ分解酵素はαＦＦの
フラクトフラノシド結合のみならず他のα−Ｄ−フラク
トフラノシル−Ｄ−フラクトースのフラクトフラノシド
結合をも加水分解する可能性がある。

【００４８】なお、上記酵素学的性質の決定に当り、本
発明のαＦＦ分解酵素の活性は以下のようにして測定し
た。１ｗ／ｖ％αＦＦ（２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７．０）中）０．５ｍｌと酵素液０．５ｍｌとを
混合し、４０℃で３０分反応させた後、沸騰水浴中で３
分処理して反応を停止した。この溶液をＨＰＬＣで分析
してαＦＦの分解量を測定した。酵素１単位は１分間に
１μｍｏｌのαＦＦを加水分解する酵素量とした。ＨＰ
ＬＣ条件を以下に示す。 （ＨＰＬＣ条件） カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＱ（４．６×２
５０ｍｍ）（（株）ワイエムシイ製） 移動相：蒸留水 流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ 検出：ＲＩ。

【００４９】本発明のαＦＦ分解酵素は、αＦＦ分解酵
素産生能を有するバチルス属またはシュードモナス属細
菌を栄養培地に培養し、培養物から生成したαＦＦ分解
酵素を採取することにより製造することができる。

【００５０】製造に使用される微生物としてはバチルス
属またはシュードモナス属に属し、αＦＦ分解酵素産生
能を有する微生物であればいずれの微生物でもよい。具
体的には本発明者らが土壌より分離した、前出のＡ１
株、すなわちバチルス・ブレビスＡ１ ＦＥＲＭ Ｐ−
１６３４２と１２Ｌ株が挙げられる。

【００５１】１２Ｌ株の菌学的性質は表４および表５に
示す通りである。これらの性質により、「バージェース
・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロ
ジー」ＶＯＬ１（１９８４）に基づき、１２Ｌ株をシュ
ードモナス・プチダ（）１２Ｌと命名した。１２Ｌ株
は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１６３４４として寄託されている。本発明で
使用する微生物は野生株に限らず、野生株例えば上記野
生株を紫外線、エックス線、放射線、薬品［ＮＴＧ（Ｎ
−メチル−Ｎ´−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）、
ＥＭＳ（エチル メタンスルホネート）等］等を用いる
既知の人工的変異手段で変異した変異株も、αＦＦ分解
酵素遺伝子を導入した微生物も、αＦＦ分解酵素産生能
を有する限り使用できる。

【００５２】

【表４】

【００５３】

【表５】

【００５４】αＦＦ分解酵素産生能を有する微生物を培
養するための栄養培地および培養法としては、前記α−
ＤＦＡ分解酵素産生能を有する微生物を培養するための
栄養培地および培養法と同様の栄養培地および培養法を
用いることができる。また、得られた培養物から本発明
のαＦＦ分解酵素の採取もα−ＤＦＡ分解酵素の場合と
同様にして行うことができる。本発明のαＦＦ分解酵素
の製造の具体例を実施例３に示す。

【００５５】果糖に、αＦＦ分解酵素を作用させること
によりαＦＦを製造することができる。さらに詳しく
は、果糖に、上記αＦＦ分解酵素を、水性媒体中で、３
０〜５０℃、ｐＨ５．０〜７．５で作用させることによ
りαＦＦを製造することができる。

【００５６】このαＦＦの製造に利用する該αＦＦ分解
酵素としては、精製酵素であっても、αＦＦの製造に悪
影響を及ぼさない他の酵素を含有していても良い粗酵素
であっても良い。粗酵素としては上記培養液画分等のα
ＦＦ分解酵素含有画分から塩析または溶媒沈殿により沈
殿させた粗酵素、またはこれをさらに前記のような精製
手段で精製した精製途中段階の粗酵素が挙げられる。さ
らにこれらの酵素を常法により担体に固定化した固定化
酵素を用いることも可能である。

【００５７】水性媒体、酵素の使用量、反応時間、およ
び反応終了液からのα−ＦＦの単離・精製は、α−ＤＦ
Ａ分解酵素を用いるαＦＦの製造の場合と同様にして行
うことができる。果糖の縮合によるαＦＦの製造の具体
例を実施例４に示す。

【００５８】

【実施例】次に本発明を実施例および参考例により具体
的に説明する。以下の実施例および参考例において濃度
を示す％は、別に規定する場合を除き、ｗ／ｖ％を表わ
す。 実施例１ α−ＤＦＡ分解酵素の製造 バチルス・ブレビスＡ１ ＦＥＲＭ Ｐ−１６３４２を
０．３％α−ＤＦＡ、０．２％酵母エキス、０．０２％
ポリペプトン、０．１％硝酸ナトリウム、０．０５％リ
ン酸一カリウム、０．０２％硫酸マグネシウム、ｐＨ
７．０の培地（１００ｍｌ／５００ｍｌフラスコ×３
本）で３０℃で２０時間振盪培養し、菌体を遠心分離で
回収し、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
１５ｍｌに懸濁し、超音波処理で菌体を破砕し、菌体抽
出液を得た。菌体抽出液のα−ＤＦＡ分解酵素活性は全
体で２０単位であった。これを硫安分画、ＨｉＬｏａｄ
１６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（ファルマシ
ア・バイオテク（株））によるゲルろ過、ｍｏｎｏＱ５
／５（同社）による陰イオン交換クロマトグラフィーに
付して、１０％の回収率で電気泳動的に単一に精製し
た。得られた精製α−ＤＦＡ分解酵素の酵素学的性質は
既述の通りである。

【００５９】実施例２ α−ＤＦＡの加水分解によるα
ＦＦの製造 参考例１のようにして調製したα−ＤＦＡ５ｇを２０ｍ
Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍｌに溶
解し、実施例１で示した方法で調製した精製α−ＤＦＡ
分解酵素５単位を添加し、４０℃で３０時間反応させ
た。反応液をＨＰＬＣで分析したところ、αＦＦが全糖
質中の２５ｗ／ｗ％生成していた。反応液を逆相クロマ
トグラフィー用カラム（（株）ワイエムシイ製ＹＭＣ−
ＰａｃｋＯＤＳ−ＡＱ、１０×１００ｃｍ×２本）によ
り分画分取し、得られた水溶液を減圧濃縮して９８％純
度のαＦＦの７５ｗ／ｗ％水溶液（シロップ）１．６ｇ
を得た。さらにこの水溶液を８０ｗ／ｗ％程度に濃縮
後、４℃静置することで結晶化させ、９９％以上の純度
のαＦＦの結晶０．５ｇを得た。得られた結晶αＦＦの
比旋光度は既述の通りであり、Ｃ−ＮＭＲスペクトルを
図１に示す。また、得られたαＦＦの甘味度は既述の表
１に示した通りである。

【００６０】実施例３ αＦＦ分解酵素の製造 シュードモナス・プチダ１２Ｌ ＦＥＲＭ Ｐ−１６３
４４を０．３％αＦＦ、０．２％酵母エキス、０．０２
％ポリペプトン、０．１％硝酸ナトリウム、０．０５％
リン酸一カリウム、０．０２％硫酸マグネシウム、ｐＨ
７．０の培地（１００ｍｌ／５００ｍｌフラスコ×３
本）で３０℃で２０時間振盪培養し、菌体を遠心分離で
回収し、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
１５ｍｌに懸濁し、超音波処理で菌体を破砕し、菌体抽
出液を得た。菌体抽出液のαＦＦ分解酵素活性は全体で
１０単位であった。これを硫安分画、ＨｉＬｏａｄ１６
／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（ファルマシア・
バイオテク（株））によるゲルろ過、ｍｏｎｏＱ５／５
（同社）による陰イオン交換クロマトグラフィーに付し
て、１０％の回収率で電気泳動的に単一に精製した。得
られた精製αＦＦ分解酵素の酵素学的性質は既述の通り
である。

【００６１】実施例４ 果糖の縮合によるαＦＦの製造 結晶果糖５ｇを２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）２ｍｌに溶解し、実施例３で示した方法で調製
した精製αＦＦ分解酵素５単位を添加し、４０℃で７２
時間反応させた。反応液をＨＰＬＣで分析したところ、
αＦＦが全糖質中の５ｗ／ｗ％生成していた。反応液を
逆相クロマトグラフィー用カラム（（株）ワイエムシイ
製ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＱ、１０×１００ｃｍ
×２本）により分画分取し、得られた水溶液を減圧濃縮
して９８％純度のαＦＦの７５ｗ／ｗ％水溶液（シロッ
プ）０．３ｇを得た。さらにこの水溶液を８０ｗ／ｗ％
程度に濃縮後、４℃静置することで結晶化させ、９９％
以上の純度のαＦＦの結晶０．１ｇを得た。得られたα
ＦＦの比旋光度およびＣ−ＮＭＲケミカルシフトは実質
上実施例２で得られたαＦＦと一致した。

【００６２】実施例５ αＦＦの各種消化酵素による分
解性 １．α−アミラーゼ １％αＦＦ（１ｍＭ ＣａＣｌを含有する５０ｍＭマレ
イン酸緩衝液；唾液アミラーゼ試験ではｐＨ６．０、膵
液アミラーゼ試験ではｐＨ６．９）１ｍｌにヒト唾液ア
ミラーゼ（シグマ社製）、ブタ膵液アミラーゼ（シグマ
社製）をそれぞれ１単位添加し、３７℃で２時間反応さ
せた後、残存αＦＦをＨＰＬＣで分析した（ＨＰＬＣ条
件はαＦＦ分解酵素の活性の測定で既述したＨＰＬＣ条
件と同じ）。どちらの酵素を使用した場合にもαＦＦは
９８％残存していた。 ＊１単位は１％可溶性デンプンを基質として３７℃で反
応させたとき、１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の
還元力を生成する酵素量を意味する。

【００６３】２．小腸粘膜局在酵素 ラット小腸アセトン粉末（シグマ社製）を生理食塩水に
懸濁（１００ｍｇ／ｍｌ）し、ホモジナイズ後、遠心分
離した上清を酵素液として使用した。１％αＦＦ（２５
ｍＭマレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０））に酵素液を１単
位添加し、３７℃で４時間反応させた。αＦＦは９５％
残存していた。 ＊１単位は１％マルトースを基質として３７℃で反応さ
せたとき、１分間に１μｍｏｌのマルトースを分解する
酵素量を意味する。

【００６４】実施例６ αＦＦの腸内細菌による資化性 寒天培地で培養した新鮮な菌を、各糖液０．５％を含有
するペプトン−イースト−フィールドソリューション
（ＰＹＦ）培地に各菌株が各々１０ＣＦＵ／チューブに
なるように接種し、嫌気条件下に３７℃で４８時間培養
し、対照として用いたグルコース添加培地に対する発育
度で資化性を判定した。その結果を表６および表７に示
す。表６および表７から明らかなごとく、αＦＦは調べ
た全ての菌株に資化されなかった。

【００６５】

【表６】

【００６６】

【表７】

【００６７】実施例７ 甘味剤製剤例１ 実施例２の方法で調製したαＦＦシロップ（水分２５ｗ
／ｗ％）５０ｇと高純度果糖水溶液（水分２５ｗ／ｗ
％）５０ｇとを混合して液状甘味剤を調製した。本甘味
剤はショ糖と同程度の甘味度（固形分当り）であった
が、非常にすっきりとした後味が残らない味質であっ
た。 実施例８ 甘味剤製剤例２ 実施例２の方法で調製したαＦＦ結晶２０ｇと結晶キシ
リトール１０ｇとを粉砕混合して粉末甘味剤を調製し
た。本甘味剤は甘味度約５０であり、さっぱりした味質
であった。

【００６８】実施例９ 飲食品への添加例１（サイダー
への利用） 水５００ｍｌに実施例７に示した甘味剤５０ｇ、クエン
酸０．１ｇ、リンゴ酸０．２５ｇ、フマル酸ナトリウム
０．０５ｇおよびライムフレーバー０．５ｍｌを添加
し、ミキサーで十分撹拌した後、ミクロフィルターでろ
過し、６５℃で３０分殺菌し、ついでガス充填、瓶詰め
を行った。本品は後味がほとんど無い、すっきりとした
甘味のサイダーであった。 実施例１０ 飲食品への添加例２（シャーベットへの利
用） オレンジ果汁１７５ｇ、実施例７に示した甘味剤７０
ｇ、アスパルテーム０．２ｇ、アルギン酸ナトリウム１
ｇ、カラギーナン０．５ｇ、ペクチン０．７ｇ、ゼラチ
ン０．５ｇおよび水２５２．１ｇを混合して溶液とし、
６５℃で３０分殺菌し、冷却後、−２０℃でフリージン
グして製品とした。オレンジ風味は良く効いているが、
さっぱりとした後味のほとんど残らない甘味のシャーベ
ットであった。

【００６９】実施例１１ 薬品への添加例（歯磨剤への
利用） リン酸カルシウム２水和物５０ｇ、グリセリン１０ｇ、
実施例８で調製した甘味剤１３ｇ、ラウリル硫酸ナトリ
ウム２．５ｇ、スペアミントオイル１．５ｇ、トラガカ
ントガム１．０ｇおよび水２２ｇを混合して製品とし
た。本品はミントフレーバーとすっきりとした甘味とが
マッチしていた。

【００７０】参考例１ α−ＤＦＡの製造 果糖１５０ｇを４０ｇの水に溶解し、１０％クエン酸水
溶液０．６ｍｌを添加した。これをミキサーで攪拌しな
がら、電熱器で加熱し、水分を蒸発させながら１３０℃
〜１４０℃で２０分反応させた。反応物を糖濃度５０ｗ
／ｗ％程度になるように水で希釈し、塩酸でｐＨ２に調
整した後、沸騰水浴中で３０分処理してＤＦＡ（ジフラ
クトースジアンヒドリド）以外の縮合物を加水分解し
た。これをＮａ型強酸性陽イオン交換樹脂（三菱化学
（株）製ＵＢＫ−５３０、樹脂量１１．８Ｌ）により分
離し、α−ＤＦＡ含有（１９ｗ／ｗ％）画分を固形分と
して４０ｇ得た。ついで、この溶液を５０ｗ／ｗ％濃度
に濃縮し、７ｇずつ逆相クロマトグラフイー用カラム
（（株）ワイエムシイ製ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ
Ｑ、１０×１００ｃｍ×２本）に負荷し、移動相として
脱塩水を用い、２５０ｍｌ／分の流速で通液し、分画分
取を行い、得られた水溶液を減圧濃縮して９８％純度の
α−ＤＦＡの７５ｗ／ｗ％水溶液（シロップ）８．８ｇ
を得た。さらにこの水溶液を８０ｗ／ｗ％程度に濃縮
後、４℃静置することで結晶化させ、９９％以上の純度
のα−ＤＦＡの結晶２．５ｇを得た。得られたα−ＤＦ
Ａの比旋光度［α］は＋１４６であり、Ｃ−ＮＭＲケミ
カルシフトは６１．２（Ｃ−１）、１０３．９（Ｃ−
２）、８３．１、８０．２、７７．０（以上Ｃ−３、Ｃ
−４、Ｃ−５のいずれかに該当）、６１．２（Ｃ−６）
であった。

【００７１】

【発明の効果】本発明のαＦＦは、ショ糖よりすっきり
とした甘味を有し、後味が残らないという特徴を有する
果糖のホモビオースである。また本発明によって、α−
ＤＦＡの一方のα１，２フラクトフラノシド結合を加水
分解する酵素およびそれを用いるαＦＦの工業的製法、
および果糖を縮合させてαＦＦを生成する酵素およびそ
れを用いるαＦＦの工業的製法が提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】αＦＦのＣ−ＮＭＲスペクトルを示す。

【図２】本発明で得られたα−ＤＦＡ分解酵素の至適ｐ
Ｈおよび安定ｐＨ範囲を示す。

【図３】本発明で得られたα−ＤＦＡ分解酵素の至適温
度および温度安定性を示す。

【図４】本発明で得られたαＦＦ分解酵素の至適ｐＨお
よび安定ｐＨ範囲を示す。

【図５】本発明で得られたαＦＦ分解酵素の至適温度お
よび温度安定性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 弥武 経也 千葉県船橋市日の出２−20−２昭和産業株 式会社総合研究所内

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 １−Ｏ−α−Ｄ−フラクトフラノシル−
   Ｄ−フラクトース（以下、特許請求の範囲の記載におい
   てαＦＦという）。
2. 【請求項２】 αＦＦを有効成分として含有する甘味
   剤。
3. 【請求項３】 ジ−α−Ｄ−フラクトフラノース１，２
   ´：２，１´ジアンヒドリド（以下、特許請求の範囲の
   記載においてα−ＤＦＡという）に、α−ＤＦＡの一方
   のα１，２フラクトフラノシド結合を加水分解する酵素
   を作用させることを特徴とするαＦＦの製造方法。
4. 【請求項４】 果糖に、果糖を縮合してαＦＦを生成す
   る酵素を作用させることを特徴とするαＦＦの製造方
   法。
5. 【請求項５】 α−ＤＦＡの一方のα１，２フラクトフ
   ラノシド結合を加水分解する酵素。
6. 【請求項６】 さらに以下の酵素学的性質を有する請求
   項５記載の酵素： （２）基質特異性 α−Ｄ−フラクトフラノースβ−Ｄ−フラクトフラノー
   ス１，２´：２，１´ジアンヒドリド（ＤＦＡＩ）およ
   びα−Ｄ−フラクトフラノースβ−Ｄ−フラクトフラノ
   ース１，２´：２，３´ジアンヒドリド（ＤＦＡＩＩ
   Ｉ）には作用しない。イヌロビオースを分子内縮合させ
   てＤＦＡＩを生成する。 （３）至適ｐＨ ６．０〜６．５ （４）安定ｐＨ範囲 ５０℃、１時間の処理で５．０
   〜７．５である。 （５）至適温度 ５５℃ （６）温度安定性 ｐＨ６．０、１時間の処理で１００％の活性を保持する
   温度は５０℃までである。 （７）分子量 ゲルろ過クロマトグラフィーにより測定した値は約２１
   ０，０００であり、ＳＤＳゲル電気泳動により測定した
   値は約５１，０００である。 （８）等電点 ５．０
7. 【請求項７】 αＦＦのα−フラクトフラノシド結合を
   加水分解して果糖を生成し、また果糖を縮合してαＦＦ
   を生成する酵素。
8. 【請求項８】 さらに以下の酵素学的性質を有する請求
   項７記載の酵素： （２）基質特異性 イヌロビオースには作用しない。 （３）至適ｐＨ ６．５〜７．０ （４）安定ｐＨ範囲 ４０℃、１時間の処理で５．０
   〜７．５である。 （５）至適温度 ５０℃ （６）温度安定性 ｐＨ７．０、１時間の処理で１００％の活性を保持する
   温度は４０℃までである。 （７）分子量 ゲルろ過クロマトグラフィーにより測定した値は約４１
   ０，０００であり、ＳＤＳゲル電気泳動により測定した
   値は約１００，０００である。 （８）等電点 ４．８